CN1202200A - Fas配体融合蛋白 - Google Patents

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CN1202200A CN96198369A CN96198369A CN1202200A CN 1202200 A CN1202200 A CN 1202200A CN 96198369 A CN96198369 A CN 96198369A CN 96198369 A CN96198369 A CN 96198369A CN 1202200 A CN1202200 A CN 1202200A
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Abstract

一种蛋白质,包含:－人Fas配体蛋白(hFasL)或缩短的人Fas配体蛋白,或其功能相当的变体,它们保持了hFasL与Fas受体结合、导致细胞凋亡的特性,而且直接或间接地在其C－端连接－糖磷脂。它可以用于预防或治疗组织或器官的移植物排斥反应。

Description

Fas配体融合蛋白
本项发明涉及一种Fas配体蛋白-糖磷脂融合蛋白以及它的应用，例如用于预防组织或器官移植物排斥反应。
Fas配体(FasL)是一种分子量为40kDa的II型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子受体家族，在未成熟的胸腺细胞、激活的T细胞和肝脏、卵巢、心脏等的非淋巴细胞中表达。T.Suda等公开了大鼠FasL cDNA的核苷酸序列和推定的氨基酸序列〔《细胞》(Cell)，1993年12月17日，75卷(6)期，1169-1178页〕。第1号序列(SEQID NO.1)列出了人类FasL的氨基酸序列〔Takahashi等，《国际免疫学》(Intl.Immunol)，第6卷，1567-1574页，1994年〕。完整蛋白质的氨基酸序列按照第1至281顺序进行了编号。
已知FasL与某些组织细胞表面表达的Fas受体结合后，导致这些表达Fas抗原(有时也称为Fas受体)的细胞凋亡。Mark.R.Alderson等指出活化的成熟的T细胞表面表达Fas抗原〔《实验医学杂志》(《J.Exp.Med》)，1995年1月，第181期，71-76页〕。
而且，已知表面表达人FasL的内皮细胞通过与细胞毒T淋巴细胞(CTL)的Fas抗原相作用，导致这些T细胞凋亡。T细胞参与器官的移植物排斥反应，因此希望使侵犯移植器官或组织的T细胞特异地凋亡。
根据本项发明的一些特别发现，本发明首先提供了：1.一种hFas配体蛋白-糖磷脂融合蛋白
这种蛋白将其脂类尾部与细胞(如内皮细胞)膜表面结合，由此将FasL蛋白呈递在细胞膜表面，如与存在于其它细胞上的Fas受体结合，从而导致这些细胞的凋亡。
这里所说的名词“hFasL蛋白”包括全长的人Fas配体蛋白，即膜结合蛋白(由胞质区、跨膜区、细胞外区组成)，及保持了人Fas配体的Fas受体结合特性和凋亡诱导特性的缩短的人Fas配体蛋白和其功能相当的变体。
hFasL蛋白特征性地至少包括了人FasL配体的细胞外区。因此，hFasL蛋白优选包含第2号序列(SEQID NO.2)或其功能相当的变体所示的氨基酸序列中第103至281位(包括端值)，更优选第106至281位，最优选第136至281位氨基酸序列组成的多肽，或其功能相当部分、或其功能相当变体。
在本说明书中，人Fas配体的功能相当蛋白指满足下列条件者：(i)它具有与全长人Fas配体蛋白或下文实施例中叙述的hFasL-GPI融合蛋白相似的与人Fas受体结合的特性；(ii)当存在于hFasL-糖磷脂融合蛋白中时，在例如实施例3叙述的体外试验中，它能够以与下文实施例中叙述的hFasL-GPI融合蛋白相似的程度，诱导携带Fas受体的细胞凋亡，如淋巴瘤L1210-Fas细胞。
同样在本说明书中，人Fas配体蛋白或其部分蛋白的变体是指与第1号序列的第1至281位中的人Fas配体氨基酸序列或其相应部分至少具有70％同源性的蛋白质，优选至少80％，或更优选至少90％，尤其是至少具有95％的同源性。此处，氨基酸序列与另一氨基酸序列之间至少有70％的同源性是指当两个序列最佳排列对比、将氨基酸序列中的空缺、插入、或非保守性替代记为非一致/非保守替代残基时，其在相似位置具有至少70％的一致或保守替代的氨基酸残基。
进一步在本说明书的上下文中，保守性替代可以在下列几组氨基酸组内进行：(i)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；(ii)谷氨酸和天冬氨酸；(iii)精氨酸和赖氨酸；(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺；(v)异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸；(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
然而，应认识到保守性替代可在序列的重要区域进行，如活性位点、结合位点和起始密码子编码的蛋氨酸部位。
根据本发明，hFasL蛋白通过C-端直接或间接与糖磷脂共价结合，优选是一种磷脂酰肌醇的糖基化形式，称为“糖基-磷脂酰肌醇”(下文中称为“GPI”)，如M.P.Lisanti等在《膜生物学杂志》(J.Membrane Biol.)，117卷，1-10页，1990年中所述。
在一具体实施方案中，hFasL蛋白的C-端氨基酸直接或经过一个连接子通过酰胺键与乙醇胺连接，而乙醇胺则通过磷酸二酯键与不同组分和结构的寡糖结合。这个聚糖的末端单糖是非N端乙酰化的葡糖胺，其在C-1位与磷脂酰肌醇的肌醇环上C-6位羟基连接。这个分子可进一步包含一个甘油脂残基作为膜结合区。
根据本发明，GPI可以为自然条件下存在的GPI结合蛋白中存在的任何一种结构，例如水解酶如碱性磷酸酶或乙酰胆碱酯酶、哺乳类动物抗原如Thy-1，Thy-3，Ly-6，CD14或CD16、原生类动物如各种锥体虫表面糖蛋白、细胞粘附分子如LFA-3或者补体分子如DAF中的。
在一具体实施方案中，本项发明的FasL-糖磷脂融合蛋白由下面结构式I表示：
Figure A9619836900071
m是0或1；n是0或1；R是直接健或一个连接子；Ra是直接键或者来自选择的GPI信号的一个或多个氨基酸残基；R1和R2分别独立地为一个脂肪族烃基，优选是C4-24烷基和C4- 24链烯基，更优选C12-22烷基或C12-22链烯基；R3是H或2Manα1；当m是1时，R4是H，
Figure A9619836900072
或者4βGalNAc1当m是0时，R4是Galα1-6Galα1-2Manα1；FasL是人FasL，或其保持Fas结合特性的一个片段或者一个功能相当的变体；Gal是半乳糖，Man是甘露糖，GalNAc是N-乙酰半乳糖胺，GlcNH2则是非N-乙酰化的葡糖胺。
R可以是一个本领域中用来在融合蛋白中将C-端羧基与氨基相连的连接子。选择的连接子最好使蛋白质具有伸展性，特别对于蛋白质的细胞外区。这样的连接子的例子包括如一段非极性氨基酸单位的序列，如3-6个非极性氨基酸单位，优选是甘氨酸和/或丙氨酸单位，如-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-
包含hFasL蛋白与糖磷脂部分间的连接子的本发明融合蛋白包括在下文中表述的“hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白”和“hFasL蛋白-GPI融合蛋白”范围内。
本发明的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，可用化学合成方法制备，任选以适当保护的形式，化学连接hFasL蛋白与糖磷脂部分然后需要时除去保护基团。
然而，较方便的是通过重组DNA技术制备hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白。该方法包括含hFasL蛋白氨基酸序列的蛋白表达和表达蛋白的翻译后修饰生成hFasL蛋白-糖磷脂融合体。在这种方法中，被表达的蛋白质特征性含有一段信号序列，如C-端氨基酸序列，作为被表达蛋白翻译后修饰生成hFasL蛋白-糖磷脂融合体的引发剂和位点。
因此，本发明进一步也提供了一种核苷酸序列，例如DNA序列，它编码含有hFasL蛋白氨基酸序列和蛋白翻译后修饰以得到相应的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白(特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白)的信号序列的蛋白质。
这种DNA序列最好适于在真核细胞或细菌中表达。
因此，本项发明也提供了真核细胞或细菌的表达载体，它包含的DNA序列编码含hFasL蛋白氨基酸序列和蛋白翻译后修饰以得到相应的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白(特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白)的信号序列的蛋白质。
除了编码蛋白质的序列外，典型的表达载体还具有适宜的表达控制序列，包括合适的启动子、操纵基因、核糖体结合位点和其它适当的调节序列。表达载体还包含1个或更多可供选择的标记物。可以通过各种刺激诱导启动子，如暴露于一种化学物质或者改变温度。启动子还具有细胞特异性或者细胞周期的特异性。
启动子可以是大肠杆菌中有活性的任何一种，如噬菌体T7启动子，表达载体可以是质粒。在大肠杆菌中表达可用R1和CO1-E1质粒来源的载体。包含病毒启动子的载体如pXMT2或pXMT3可以用于真核细胞的表达。本发明也提供了用hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白之编码序列或以上叙述的表达载体转化的细菌或真核的宿主细胞。任何合适的细菌宿主都可以使用，最好是大肠杆菌。合适的真核宿主细胞是瞬时表达的COS细胞和稳定表达的CHO细胞。
糖磷脂(如GPI)部分的附加就是翻译后修饰，通常发生于宿主细胞的内质网(EP)。糖磷脂(例如GPI)附加的结果是从新生蛋白羧基端去掉一个疏水序列。这个疏水序列通常是翻译后修饰信号序列的必要部分。一对CAS(裂解/附加部位)，如Ser-Ser，Ser-Gly，Ser-Ala，与疏水的羧基端结合通常提供了糖磷脂(如GPI)附加的必要的最小序列。在FasL蛋白序列和翻译后修饰信号序列之间最好有5-20个，更优选7-14个氨基酸的间隔。疏水功能区在内质网上能够方便地减慢或暂时终止新生蛋白穿过内质网膜，使GPI部分的附加能够进行。
假如被表达的蛋白质包含了一个合适的翻译后修饰信号序列，在大多数的宿主细胞中糖磷脂如GPI的附加都可以进行。
编码含hFasL蛋白氨基酸序列和翻译后修饰信号序列的蛋白质的DNA，可以通过hFasL蛋白编码序列与编码信号序列的DNA序列的适当连接而得到。
在具体实施方案中，hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用包括以下步骤的方法制备：a)通过聚合酶将2个重叠的寡核苷酸补平，产生一个GPI附加信号序列。每个寡核苷酸的5’端和3’端都包含了限制酶切位点。聚合产物克隆到表达载体如pXMT3中。b)以含人Fas-配体cDNA的克隆为模板，扩增人Fas-配体的细胞外区，如包含人Fas-配体序列第136至281位氨基酸的片段。设计的3’寡核苷酸可编码所需的连接子和3’端的限制酶切位点。5’端最好不含有限制酶切位点，但需与人Fas蛋白的信号序列有数个核苷酸如14个核苷酸重叠。人Fas信号序列可通过聚合酶把2个寡核苷酸补平后产生。非编码的寡核苷酸可以数个核苷酸，如10-20个，最好是22个核苷酸与Fas-配体重叠。Fas-配体PCR产物以及补平的Fas信号序列典型地通过重叠PCR技术剪切、消化并克隆到包含GPI信号序列的质粒中。相应的hFasL-GPI构建物如图1所示。
hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白的纯化和分离可采用目前任何已知的方法，只要不引起融合蛋白实质的降解。例如，亲和层析、免疫亲和层析、高压液相层析(HPLC)和快速蛋白液相层析(FPLC)均为适用方法。
本发明的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用于诱导Fas介导的细胞死亡，特别是T淋巴细胞死亡。在移植组织的细胞表面携带了外来的组织相容性抗原时，这些抗原激活受体的细胞毒T细胞，经过连续的激活过程破坏了供体细胞。hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白可用于治疗急性移植物排斥反应。常规治疗急性移植物排斥反应的方法会严重抑制受体的免疫功能。hFasL蛋白-GPI融合蛋白则能够特异性针对激活的T淋巴细胞，而不是免疫系统的所有T淋巴细胞，即针对攻击移植组织或器官上表达Fas抗原的T淋巴细胞进行更特异地治疗。
hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白还可用于治疗慢性移植物排斥反应，包括自体移植和异体移植的排斥反应。
在另一具体实施方案中，本发明提供了：
2、将hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白引入组织或器官的内皮细胞的方法，该方法包括用纯化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注器官，或与组织一起孵育。
3、一种诱导靶组织或器官的内皮细胞Fas介导死亡的方法，包括用纯化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注器官，或与组织一起孵育。
4、一种预防或治疗组织或器官自体或异体移植物排斥反应的方法，包括用纯化的hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白灌注供体的器官，或与供体的组织一起孵育。
根据以上3-4叙述的方法，本发明中的融合蛋白特别适于预止与急性或慢性、器官或组织、自体或异体移植物排斥反应有关的症状，特别是移植的血管病变，如移植物动脉粥样硬化。移植器官包括心脏、肺、心肺、肝脏、肾脏、胰腺(全部或部分的胰腺，如Langerhans岛)、皮肤、角膜和骨髓。
本发明还可提供：
5、hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白在上述2-4叙述的任何方法中的应用；
6、hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白用于制备用于上述2-4叙述的任何方法的药物组合物的应用；
7、用于上述2-4叙述的任何方法的组合物，其中包含hFasL蛋白-糖磷脂融合蛋白，特别是hFasL蛋白-GPI融合蛋白和一种或多种药学上可接受的稀释剂和载体。
下面给出的实施例将进一步说明而不是限制本发明。在本发明的精神内，可以作很多变动。实施例1 编码hFasL-GPI融合蛋白的DNA的质粒构建和克隆
通过Klenow聚合酶将2个重叠的寡核苷酸补平，产生一个来源于人CD16的GPI附加信号序列。5’端包含PstI和SpeI位点，3’端是EcoRI位点。聚合产物磷酸化(通过T4激酶)，凝胶纯化并连接到PstI/EcoRI消化的pXMT3表达载体上。寡核苷酸如下：
                Pst   Spel
GPI5′：GTC ACT AGT TTG GCA GTG TCA ACC ATC TCA TCA TTC TCT
        CCA CCT GGG TAC CAA GTC TCT TTC TGC TTG GTG ATG GTA
        (SEQ ID No.3)
             EcoRI
GPI3″：GTC GAA TTC TCA AAT GTT TGT CTT CAC AGA GAA ATA TAG
        TCC TGT GTC CAC TGC AAA AAG GAG TAC CAT CAC CAA GCA
        GAA (SEQ ID No.4)
以含人Fas-配体cDNA的克隆为模板，扩增人Fas-配体的细胞外区，其中包含了已发现的人Fas-配体序列的第136至281个氨基酸。设计的3’寡核苷酸(Fas4)编码附加的6个甘氨酸基团，3’端还有SpeI位点。5’寡核苷酸(Fas3)不含有任何限制酶切位点，但与人Fas蛋白有14个核苷酸重叠。人Fas信号序列通过Klenow聚合酶把2个寡核苷酸(Fas1，Fas2)补平后产生。非编码寡核苷酸有22个核苷酸与Fas-配体重叠。Fas-配体PCR产物以及补平物Fas信号序列通过重叠PCR技术剪切、凝胶纯化、用PstI和SpeI消化并克隆到与上述同样被消化的包含GPI信号序列的质粒中。寡核苷酸如下：
FAS1：TCT CTG CAG ATG CTG GGG ATC TGG (SEQ ID No.5)
FAS2：GGG TGG AGC AAC AGA CGT AAG AAC CAG AGG TAG GAG GGT
      CCA GAT GCC CAG CAT CTG CAG AGA (SEQ ID No.6)
FAS3：TTA CGT CTG TTG CTC CAC CCC CTG AAA AAA AGG AG
      (SEQ ID No.7)
           SpeI
FAS4：CAA ACT AGT GCC ACC ACC GCC TCC ACC GAG CTT ATA TAA
      GCC GAA AAA CG (SEQID No.8)
整个构建物通过Pharmacia Biotech生产的T7测序试剂盒(产品目录号27-168201)测序。实施例2  纯化
重组融合蛋白通过T.Suda和Nagata描述的方法，用Fas-Fc亲和柱(或者抗FasL抗体亲和柱)进行纯化〔《实验医学杂志》(J.Exp.Med)，1994年，179卷，873-879页〕。得到内毒素游离融合蛋白。实施例3  hFasL-GPI在COS细胞中的瞬时表达
9×105个细胞接种于60mm的平皿中，内含DMEM和10％FCS，置于37℃，5％CO2中孵化过夜。通过保护哺乳动物转染系统(Promega公司)，细胞用6μg质粒DNA(hFasL-GPI)进行磷酸钙转染。如图2所示，转染36小时后用抗人Fas-配体第一单克隆抗体(NOK-1系，Pharmingen公司)和藻红素标记的抗鼠IgG第二抗体，通过FACS作细胞分析。pXMT3模拟转染COS细胞作为阴性对照，用包含人Fas-配体cDNA的构建物转染的COS细胞作为阳性对照(图3)。图2 hFasL-GPI表达构建体瞬时转染的COS细胞的FACS分析图3 阳性和阴性对照
使用本发明的hFasL-糖磷脂融合蛋白灌注的或孵育最好在4℃-37℃温度下进行，持续2-20小时完成。可将hFasL-糖磷脂融合蛋白加到通常用于移植前保存供体组织或器官的溶液或制品中，如一种所谓的“威斯康星大学溶液”。另外，融合蛋白还可用在任选缓冲的盐溶液中，如磷酸盐缓冲盐溶液，或者生理盐水中。hFasL-糖磷脂融合蛋白的浓度不一，最好灌注或孵育溶液的浓度是10-40mg/ml。
本发明的hFasL-糖磷脂融合蛋白的实用性例如可按下述方法证明。体外试验
COS细胞瞬时转染实施例1的构建物，或者编码整个hFasL蛋白(没有糖磷脂成分)的对照物构建物。这会导致通过跨膜区与细胞膜的结合并在细胞表面表达。比较上述细胞、天然COS细胞和与纯化的hFasL-GPI一起孵育的COS细胞对Cr标记的淋巴瘤L1210和淋巴瘤L1210-FAS〔淋巴瘤细胞系：SchulzM.等，《欧洲免疫学杂志》，(Eu r.J.Immunol)25：474-480，1995年〕的细胞凋亡效果。由于Fas-L介导的细胞凋亡作用，淋巴瘤L1210-Fas的细胞死亡数比转染实施例1构建物的COS细胞明显地高。体外试验A。小鼠心脏灌注
小鼠心脏用含有25mg/ml hFasL-GPI的威斯康星大学溶液(Eurocollins溶液)37℃下灌注8小时。心脏的石蜡切片用生物素化的hFasL抗体探测，以测定hFasL的包埋。B。血管化的异位心脏移植
供体动物肝素化同时放血以后，切开气管塞入冰块。准备供体的心脏，结扎并且分离供体心脏的上腔静脉、下腔静脉、左肺动脉和右肺静脉。结扎主动脉并且直接分离到在第一叉(右颈总动脉和锁骨下动脉)被分开的支气管干部位。另外，通过支气管残端注入冷的肝素化盐水。用实施例2的重组hFasL-GPI融合蛋白灌注器官。剩余的肺静脉结扎后，心脏移入冷盐水中。
心脏植入到受体的腹腔静脉：用11/0 Ethilon(Ethicon，Norderstedt，德国)连续缝线，从支气管干到主动脉，右肺动脉到下腔静脉施行端-边吻合术。用6/0 Vicryl(Ethicon公司产品)的二块敷料覆盖创面，保暖直到动物完全苏醒。整个缺血时间在40-50分钟内，其中25-35分钟是4℃进行。吻合期间(10-15分钟)，要保持移植物为冷的状态。
移植以后，通过每日心跳的评定(触摸)监控移植物的功能。心脏停跳为完全的移植物排斥反应。在全部试验中，移植物排斥反应通过移植物的组织学检查证实。与对照的动物(移植前未用hFasL-GPI灌注)比较，移植前用hFasL-GPI灌注的心脏功能显著增强。
本发明的融合蛋白用于预防或治疗移植物排斥反应时，可以与免疫抑制治疗合并进行，例如在移植后给受体免疫抑制剂如环胞菌素A、环胞菌素G、FK506、来氟米物或其类似物、咪唑立宾、麦考酚酸、mycophenolate mofetil、免疫抑制性单克隆抗体例如白细胞受体如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、CTLA4、B7、CD45或CD58或它们的配体的单抗。
                               序列表(1)一般资料
(i)申请者人
  (A)名称：Sandoz有限公司
  (B)街道：Lichtstrasse 35
  (C)城市：Basel
  (D)州：BS
  (E)国家：瑞士
  (F)邮政编码：CH-4002
  (G)电话：061-324-2327
  (H)传真：061-322-7532
  (A)姓名：Sandoz专利公司
  (B)街道：Humboldtstrasse 3
  (C)城市：Loerrach
  (E)国家：德国
  (F)邮政编码：D-79539
  (A)名称：Sandoz-Erfindungen Verwaltungs-gesellschaft MBH
  (B)街道：Brunner Strasse 59
  (C)城市：维也纳
  (E)国家：奥地利
  (F)邮政编码：A-1230
  (ii)发明名称：Fas配体融合蛋白
  (iii)序列数：8
(iv)计算机可读形式：
(A)媒介类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.25版(EPO)(2)有关SEQ ID NO：1的资料(i)序列特征：
(A)长度：281个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(vi)来源：
(A)物种：人类
(xi)序列描述：SEQ ID No.1Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp1               5                   10                  15Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
        20                  25                  30Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
    35                  40                  45Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50                  55                  60Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly65                  70                  75                  80Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
            85                  90                  95Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
        100                 105                 110Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
    115                 120                     125Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130                 135                 140Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu145                 150                 155                 160Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
            165                 170                 175Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
        180                 185                 190Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
    195                 200                 205His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210                 215                 220Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala225                 230                 235                 240Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
            245                 250                 255Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
        260                 265                 270Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
    275                 280(2)有关SEQ ID NO：2的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：146个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(vi)来源：
  (A)物种：人类
(xi)序列描述：SEQ ID No.2Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly1               5                   10                  15Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly
        20                  25                  30Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile
    35                  40                  45Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly
50                  55                  60Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn65                  70                  75                  80Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser
            85                  90                  95Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala
        100                 105                 110Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu
    115                 120                 125Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr
130                 135                 140Lys Leu145(2)有关SEQ ID NO：3的资料
(i)序列特征：
  (A)长度：78个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID No.3GTCACTAGTT TGGCAGTGTC AACCATCTCA TCATTCTCTC CACCTGGGTA CCAAGTCTCT       60TTCTGCTTGG TGATGGTA                                                     78(2)有关SEQ ID NO：4的资料(i)序列特征
  (A)长度：81个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID No.4GTCGAATTCT CAAATGTTTG TCTTCACAGA GAAATATAGT CCTGTGTCCA CTGCAAAAAG         60GAGTACCATC ACCAAGCAGA A                                                   81(2)有关SEQ ID NO：5的资料
(i)序列特征
  (A)长度：24个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ IDNo.5TCTCTGCAGA  TGCTGGGGAT  CTGG                                              24(2)有关SEQ ID NO：6的资料(i)序列特征
(A)长度：63个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID No.6GGGTGGAGCA ACAGACGTAA GAACCAGAGG TAGGAGGGTC CAGATGCCCA GCATCTGCAG       60AGA                                                                     63(2)有关SEQ ID NO：7的资料
(i)序列特征
  (A)长度：35个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID No.7TTACGTCTGT TGCTCCACCC CCTGAAAAAA  AGGAG                               35(2)有关SEQ ID NO：8的资料
(i)序列特征
  (A)长度：50个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID No.8CAAACTAGTG CCACCACCGC CTCCACCGAG CTTATATAAG CCGAAAAAACG               50

Claims (10)

1、一种蛋白质，包含：
-人Fas配体蛋白(hFasL)，或缩短的人Fas配体蛋白或其功能相当的变体，它保持了人Fas配体蛋白与Fas受体结合、诱导细胞凋亡的特性，而且直接或间接地在其C-端连接：
-糖磷脂。
2、根据权利要求1的蛋白质，其中的糖磷脂是糖基-磷脂酰肌醇(GPI)。
3、根据权利要求1的蛋白质，其具有以下结构式I：
Figure A9619836900021
m是0或1；n是0或1；R是一直接键或一个连接子；Ra是一直接键或来自选择的GPI信号的氨基酸残基；R1和R2分别是一个脂肪族烃基；R3是H或2Manα1；当m是1时，R4是H， 或4βGalNAc1当m是0时，R4是Galα1-6Galα1-2Manα1；FasL是如权利要求1中所定义的人FasL，Gal是半乳糖，Man是甘露糖，GalNAc是N-乙酰基半乳糖胺，GlcNH2则是非N-乙酰化的葡糖胺。
4、根据以上权利要求中任一项的蛋白质，其中的hFasL是一种含有hFasL第136至281位氨基酸序列的人可溶性多肽。
5、根据以上权利要求中任一项的蛋白质，其中的糖磷脂通过连接子与hFasL的C-端连接。
6、根据权利要求5的蛋白质，其中连接子是-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-。
7、编码含hFasL蛋白的氨基酸序列和蛋白翻译后修饰以得到权利要求1的蛋白质的信号序列的蛋白质的一段核苷酸序列。
8、制备权利要求1蛋白质的方法，包括：
a)任选以被保护的形式，化学连接hFasL蛋白与糖磷脂部分，如果需要则去除保护性基团，或者
b)重组DNA方法，包括含hFasL蛋白氨基酸序列的蛋白表达和所表达蛋白的翻译后修饰。
9、根据权利要求1的蛋白质用于制备一种预防或治疗组织或器官自体或异体移植物排斥反应的药物组合物的应用。
10、一种药物组合物，包含权利要求1的蛋白质和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582560A (zh) * 2017-03-10 2019-12-17 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 具有免疫调节功能的FasL工程化的生物材料

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6544523B1 (en) * 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
GB9705744D0 (en) * 1997-03-20 1997-05-07 Davies Alison M Methods for selecting cells and their uses
US6972323B1 (en) 1997-04-01 2005-12-06 Sankyo Company, Limited Anti-Fas antibodies
IL123888A0 (en) * 1997-04-01 1998-10-30 Sankyo Co Anti-fas antibodies
US6451759B1 (en) * 1998-01-14 2002-09-17 The Regents Of The University Of California Noncleavable Fas ligand
AU2880400A (en) * 1999-02-12 2000-08-29 Amgen, Inc. Tnf-related proteins
GB9905503D0 (en) 1999-03-10 1999-05-05 Adprotech Plc Novel compound formulations and methods of delivery
EP1248645B1 (en) * 2000-01-03 2007-04-18 Tr Associates, L.L.C. Novel chimeric proteins and their use
US7927602B2 (en) 2002-07-23 2011-04-19 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Fas ligand-avidin/streptavidin fusion proteins
DE60143074D1 (de) * 2000-01-24 2010-10-28 Univ Louisville Res Found Immunmodulation mit rezeptorinduziertem tod durch apoptosis
AU2002216763B2 (en) 2000-06-30 2007-03-01 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Alteration of cell membrane
EP2621514B1 (en) 2010-09-28 2016-09-21 KAHR Medical (2005) Ltd Compositions and methods for treatment of hematological malignancies
KR102595249B1 (ko) * 2017-02-17 2023-10-27 퍼듀 리서치 파운데이션 세포 치료를 위한 표적화된 리간드-페이로드 기반의 약물 전달

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6237145U (zh) * 1985-08-23 1987-03-05
US5223408A (en) * 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
JPH0590011A (ja) * 1991-09-26 1993-04-09 Anritsu Corp 感温抵抗体及びその製造方法
JPH05332845A (ja) * 1992-06-03 1993-12-17 Kobe Steel Ltd 温度検出器の出力変換方法および同装置
DE69535719T2 (de) * 1994-01-07 2009-03-19 Mochida Pharmaceutical Co. Ltd. Fas-antigenbindender ligand

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582560A (zh) * 2017-03-10 2019-12-17 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 具有免疫调节功能的FasL工程化的生物材料

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Publication number Publication date
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