CN110582560A - 具有免疫调节功能的FasL工程化的生物材料 - Google Patents

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Abstract

本文描述了FasL工程化的生物材料，以及制造和使用此类FasL工程化的生物材料的方法，例如用于免疫调节、例如用于诱导免疫抑制和特异性免疫耐受、例如用于预防或降低细胞或组织移植物排斥的风险和/或治疗自身免疫疾病，例如I型糖尿病。在具体的实施例中，FasL工程化的生物材料是与SA‑FasL结合的生物素化的微凝胶。

Description

具有免疫调节功能的FasL工程化的生物材料
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院资助R21EB020107、R21AI113348、R56AI121281和F30AR069472以及青少年糖尿病研究基金会资助2-SRA-2014-287-Q-R的政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月10日提交的美国临时申请62/469,802的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本文描述的是FasL工程化的生物材料和使用它们的方法，例如用于免疫调节，例如用于治疗包括1型糖尿病的自身免疫疾病和预防或降低移植排斥的风险。
背景技术
外来细胞(如骨髓和干细胞)、组织(如胰岛)和器官(如肾、心脏、肝)的移植已经成为患有某些疾病的患者的重要和有效的治疗选择。然而，在基因不同的患者之间移植外来移植物(相同物种成员之间的同种异体移植或不同物种成员之间的异种移植)受到接受者控制移植免疫识别和排斥的能力的限制。即使对于自身移植物(其中移植细胞来源于患者自身的组织，例如通过诱导的多能性得到)，移植的功效将取决于控制对移植物的自身免疫应答。
例如，骨髓(BM)移植已被视为造血和自身免疫病以及某些癌症的非常有希望的治疗。骨髓移植的一个障碍是由宿主的T细胞和NK细胞介导的移植组织排斥的可能性。移植物抗宿主病(GvHD)是骨髓移植的另一种可能的不利后果。移植组织中的供体T细胞可能成立对宿主重要器官的免疫应答，通常导致宿主死亡。因此，宿主抗移植物反应和GvHD限制了骨髓移植的临床应用，否则骨髓移植可能被广泛用于治疗各种疾病和预防外来移植排斥。
1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫疾病，其特征在于，由于对需要CD4+T细胞的β-细胞特异性抗原的协同免疫应答，产生胰岛素的β-细胞团的损失，从而控制血糖。通过同种异体胰岛移植恢复β-细胞团目前是改善严重血糖不稳定患者血糖控制的优选临床干预。即使使用自体β细胞产物，控制对自体细胞的免疫应答对于治疗功效仍将是重要的。同种异体移植的寿命不仅仅受到宿主免疫应答的限制，而且受到由于控制排斥所需的慢性免疫抑制的毒性作用所引起的继发性移植物衰竭的限制。
免疫抑制药理学药剂是控制同种异体移植排斥的主要方案。尽管此类药物能有效降低排斥发作的严重性，但它们是非特异性的，不能创造永久性的移植特异性耐受状态。因此，接受者持续暴露于这些免疫抑制药剂与机会性感染和恶性肿瘤的风险显著增加有关联。另外，这些非特异性免疫抑制药剂可能在宿主中诱导严重和不良的副作用。这些不利作用经常超过患有疾病的患者的益处，在疾病中身体将其自身的某些部分识别为“外来的”，并且发动适应性免疫攻击导致自身免疫，例如在1型糖尿病、关节炎、狼疮和多发性硬化中观察到。
目前的临床实践是施用预防T细胞活性的免疫抑制剂。此类免疫抑制剂在自身免疫疾病的治疗中被长期施用，并且通常在已经接受外来移植物的患者的一生中施用。长期使用免疫抑制剂的需求使得成功的治疗依赖于频繁的医疗监测，并且使患者暴露于来自药剂的严重副作用。
因此，需要用于达到免疫调节，例如用于预防或降低细胞或组织移植物排斥和/或治疗I型糖尿病的风险的组合和方法。还需要用于诱导免疫耐受的组合和方法。
发明内容
在本文中描述的是FasL工程化的生物材料，其中链霉抗生物素蛋白缀合的FasL(SA-FasL)显示在生物相容性材料(例如水凝胶，例如聚乙二醇(PEG)水凝胶)上，以及制造和使用此类FasL工程化的生物材料的方法，例如用于免疫调节，例如用于预防或降低细胞或组织移植物排斥和/或治疗I型糖尿病的风险。
根据一些实施例，提供了被工程化以显示FasL部分的生物材料。根据一些实施例，提供了被工程化以显示FasL部分的水凝胶。根据一些实施例，水凝胶包含嵌合FasL蛋白，所述嵌合FasL蛋白包含FasL部分和经由生物素缀合于水凝胶的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白部分。根据一些实施例，水凝胶是被工程化以显示生物素部分的聚乙二醇(PEG)微凝胶。根据一些实施例，提供了显示FasL部分的聚乙二醇(PEG)水凝胶。在具体的实施例中，水凝胶包含与SA-FasL部分缀合的生物素部分。
根据任何实施例，FasL部分可以是基质金属蛋白酶抗性FasL蛋白。
根据任何实施例，生物材料可以包含免疫抑制药物，例如雷帕霉素。在一些实施例中，FasL工程化的水凝胶进一步包含免疫抑制药物，例如雷帕霉素。在一些实施例中，进一步包含免疫抑制药物的FasL工程化的生物材料或水凝胶提供药物的受控释放。
根据任何实施例，所述生物材料可以包含移植细胞，例如PBMC、骨髓细胞、造血干细胞、干细胞、间充质干细胞、树突细胞、用自身抗原脉冲的树突细胞、人β细胞产物和脾细胞。在一些实施例中，移植细胞被包封在生物材料中。
根据一些实施例，提供了实现免疫调节或诱导免疫耐受的方法，其包含向有需要的受试者施用如在本文中所描述的FasL工程化的生物材料或水凝胶。在一些实施例中，所述方法包含施用有效诱导免疫耐受的量的生物材料。根据一些实施例中，施用是通过移植。
根据任何实施例，受试者可以是人、非人灵长类、猪、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。
在一些实施例中，受试者需要对移植细胞(例如PBMC、骨髓细胞、造血干细胞、干细胞、间充质干细胞、树突细胞、用自身抗原脉冲的树突细胞、人β细胞产物和脾细胞)的免疫耐受性。根据一些实施例，所述方法用于预防或降低细胞或组织移植物排斥和/或治疗1型糖尿病的风险。
根据任何实施例，所述方法可以进一步包含施用移植细胞，例如PBMC、骨髓细胞、造血干细胞、干细胞、间充质干细胞、树突细胞、用自身抗原脉冲的树突细胞、人β细胞产物和脾细胞。在一些实施例中，生物材料包含移植细胞。在一些实施例中，移植细胞被包封在生物材料中。
在一些实施例中，所述受试者需要治疗1型糖尿病，并且所述方法任选地进一步包含向所述受试者施用胰岛细胞。在一些实施例中，受试者需要治疗或预防同种异体移植排斥，并且所述方法任选地进一步包含向受试者施用来自同种异体移植供体的细胞。在一些实施例中，受试者需要治疗或预防异种移植排斥，并且所述方法任选地进一步包含向受试者施用来自异种移植供体的细胞。在一些实施例中，异种移植供体是人、非人灵长类、猪、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。在一些实施例中，受试者需要治疗或预防自体移植排斥，并且所述方法任选地进一步包含向受试者施用自体移植细胞。在一些实施例中，自体移植细胞通过诱导多能性获得。在一些实施例中，受试者需要治疗或预防自身免疫，并且所述方法任选地进一步包含向受试者施用呈递在细胞上的自身抗原，所述细胞选自(i)表达自身抗原的细胞、(ii)用自身抗原修饰的细胞和(iii)用自身抗原脉冲的树突细胞。
根据一些实施例，提供了制造被工程化以显示FasL的生物材料或水凝胶的方法，其包含使生物素化的生物材料或水凝胶与SA-FasL部分接触。
根据一些实施例，提供了被工程化以显示在本文中所描述的FasL蛋白的生物材料，用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受。
根据一些实施例，提供了被工程化以显示在本文中所描述FasL蛋白的生物材料，在制备用于需要的受试者诱导免疫耐受的药物中的用途。
附图说明
图1展示了提供免疫调节蛋白的受控呈递在本文中所描述的微凝胶的产生的图示。图1A以图形方式展示了如何使用流动聚焦微流体从生物素功能化的PEG-4MAL大分子单体生成生物素化的微凝胶。将SA-FasL固定在生物素化的微凝胶上，并将所得免疫调节SA-FasL微凝胶与胰岛在糖尿病小鼠的肾包膜下共移植，诱导移植接纳。图1B展示了具有栓系生物素的微凝胶(左上图，灰色)可以捕获链霉抗生物素蛋白(浅灰色，左下图)，并且没有生物素的微凝胶不捕获链霉抗生物素蛋白(右图)。(比例尺200μm)。图1C展示了生物素化的微凝胶以剂量依赖性方式捕获和显示链霉抗生物素蛋白(SA)，直到在150μg/mL达到饱和。图1D展示了微凝胶上显示的SA-FasL在FasL敏感细胞中保持生物活性并诱导剂量依赖性细胞凋亡。
图2展示了描绘FasL工程化的微凝胶延长体内SA-FasL保持的图像。SA-FasL用近-IR染料标记并植入小鼠肾包膜下并体内成像。图2A展示了SA-FasL在微凝胶上显示时定位到移植部位的代表性图像，与接受游离SA-FasL的动物中测量的扩散信号相反。在相同治疗群组中动物的热图是一致的。第18天和第21天没有展示图像，因为信号可以忽略。图2B展示了描绘体内中的荧光和指数衰减曲线拟合的定量的图，其证明显示SA-FasL的微凝胶与游离SA-FasL相比延长了蛋白保持(p<0.0001；n＝8)。
图3展示与显示SA-FasL的微凝胶共移植的同种异体胰岛移植物的存活。图3A展示了描绘胰岛移植物存活率的图。生物素化的微凝胶用SA-FasL(1μg蛋白/1000微凝胶)工程化，并与未修改的BALB/c胰岛(500/移植)在化学糖尿病C57BL/6接受者的肾包膜下共移植。在指定群组中，从移植当天开始，以0.2mg/kg每天i.p.注射来使用雷帕霉素，持续15个剂量。监测动物的血糖水平，两个连续日≥250mg/dL的读数被视为糖尿病(排斥)(p<0.0001，**p<0.01，***p<0.001)。图3B展示了长期功能健全移植物(>200天)的免疫染色和接受SA-FasL呈递性微凝胶的接受者的受排斥移植物。只有功能健全移植物(上图)展示胰岛素阳性结构(浅灰色区域)和DNA(深灰色)。受排斥移植物(下图)展示没有胰岛素染色。白色箭头表示微凝胶。组织被复染DNA(深灰色)。(比例尺100μm)。图3C展示了描绘移植胰岛移植物与SA-FasL微凝胶和雷帕霉素共移植的小鼠在移植后第200天表现出与具有天然胰岛的小鼠相同的葡萄糖应答的图。
图4展示了描绘免疫监测和CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞在胰岛移植接纳中的作用的图。图4A展示了描绘长期移植物存活者对供体抗原的系统应答的图。来自指定群组的脾细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，并在体外混合淋巴细胞反应试验中用作受辐射的BALB/c供体和C3H第三方刺激物的应答者。在流式细胞术中使用CD4和CD8分子的抗体评估在CD4+和CD8+T细胞中的CFSE染料的稀释度，并绘制为每个细胞群体的分裂百分比。图4B展示了免疫细胞类型的时程分析。在胰岛移植后第3天和第7天，从指定群组的脾、肾和肾引流淋巴结制备的单细胞对细胞表面分子用荧光标记抗体染色，所述细胞表面分子限定CD4+Teff(CD4+CD44hiCD62Llo)、CD8+Teff(CD8+CD44hiCD62Llo)以及Treg(CD4+CD25+FoxP3+)群体，并使用流式细胞术分析。绘制Treg与CD4+Teff和CD8+Teff的比率(平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.005)。图4C展示了描绘Treg细胞的缺失导致已建立的胰岛移植物的急性排斥的图。C57BL/6.FoxP3EGFP/DTR小鼠(n＝5)用BALB/c胰岛移植物和显示SA-FasL的微凝胶在雷帕霉素的短暂覆盖下移植。(施用i.p.每天以0.2mg/kg，15个剂量)。然后在移植后第50天(箭头)，注射给这些小鼠i.p.用50μg/kg白喉毒素以去除Treg细胞。
图5展示了描绘Treg细胞是胰岛移植接纳所需的图。Treg细胞的消耗导致已建立的胰岛移植物的急性排斥。C57BL/6.FoxP3EGFP/DTR小鼠用BALB/c胰岛移植物和SA-FasL呈递性微凝胶在雷帕霉素的短暂覆盖下移植。(施用i.p.每天以0.2mg/kg，15个剂量)。在移植后第50天(箭头),注射给一群小鼠注射i.p.用50μg/kg白喉毒素以去除Treg细胞，而另一群组不处理。
图6显示在附睾脂肪垫中与SA-FasL微凝胶共移植的同种异体胰岛移植物的免疫接受。图6A展示了描绘胰岛移植物存活率的图。生物素化的微凝胶用SA-FasL(1μg蛋白/1000微凝胶)工程化，并与化学糖尿病C57BL/6接受者的附睾脂肪垫中的未修改的BALB/c胰岛(600/脂肪垫，1200总数/接受者)共移植。从移植当天开始，以0.2mg/kg每天i.p.注射来使用雷帕霉素，持续15个剂量。监测动物的血糖水平，两个连续日≥250mg/dL的读数被视为糖尿病(排斥)(p<0.0008)。图6B展示了来自接受SA-FasL微凝胶+雷帕霉素的小鼠的长期功能健全移植物(>60天)的免疫染色图像，展示胰高血糖素和胰岛素阳性结构。DNA染色的DAPI标记胰高血糖素或胰岛素阳性和阴性的细胞。(比例尺50μm)。图6C展示了描述SA-FasL微凝胶和对照组之间血清肝酶水平无差异的图(虚线指示正常的上部酶水平)，并且下面的图展示了组织学切片的图像，其揭示了SA-FasL微凝胶和对照组之间肝酶水平没有差异。
图7展示了描绘SA-FasL以剂量依赖性方式栓系生物素化的微凝胶的图。SA-FasL用AlexaFluor488 NHS酯(Thermo Fisher)标记，通过在Zeba柱(7k MWCO，Thermo Fisher)中脱盐三次以除去游离染料。将生物素化的微凝胶(104)以指定的浓度悬浮在500μL的SA-FasL或仅SA的溶液中1小时。然后通过在PBS中的1％牛血清白蛋白中离心10次来洗涤微凝胶以除去未结合的蛋白。将功能化的微凝胶置于96孔板中，并在Biotek HT340读板器上读数，并从所有值(n＝2(SA)或3(SA-FasL)平均值±SEM)中减去背景信号(空孔)。使用标准曲线将荧光值转化为绝对浓度。
图8展示了描绘SA-FasL与PEG-4MAL大分子单体的直接栓系降低生物活性的图。使不同剂量的SA-FasL与10μL的10％PEG-4MAL大分子单体在溶液中反应1小时。将未处理的可溶性SA-FasL或PEG化的SA-FasL与A20细胞温育过夜，并在用膜联蛋白V-APC和碘化丙啶染色后，通过流式细胞术确定凋亡细胞的数量(n＝2，平均值±SEM)。
图9展示了用显示SA-FasL的微凝胶(1μg蛋白/1000微凝胶)移植的化学糖尿病C57BL/6小鼠中持续葡萄糖耐量的图；而天然BALB/c胰岛移植物(500)仅在雷帕霉素的短覆盖下展示葡萄糖耐量。(施用i.p.每天以0.2mg/kg，15个剂量)。对照包括除了接受不含SA-FasL的微凝胶以外，进行相同方案的小鼠。
图10展示了SA-FasL微凝胶不影响胰岛健康或功能。将大鼠胰岛与SA-FasL微凝胶(1:2胰岛：微凝胶比率)一起培养24小时。图10A展示了描绘游离胰岛或与SA-FasL微凝胶共移植的胰岛中的代谢活性的图。图10B展示了描绘游离胰岛或与SA-FasL微凝胶共移植的胰岛之间葡萄糖刺激的胰岛素分泌没有差异的图。图10C展示了揭示与游离胰岛相比，与SA-FasL微凝胶(SA-FasL-M)共移植的胰岛表现促炎性细胞因子MIP-1和IL6分泌减少，但MCP-1没有减少(*p<0.05，**p<0.01)的图形化描述。图10D展示了活-死染色的图，揭示了游离胰岛或与SA-FasL微凝胶共移植的胰岛之间活细胞和死细胞比率没有差异。图10E展示了胰岛素和胰高血糖素以及用DAPI对DNA进行共染色的免疫染色图像，揭示游离胰岛或与SA-FasL微凝胶共移植的胰岛在胰岛素和胰高血糖素表达方面没有差异。(比例尺50μm)。
图11展示了移植后21天肾包膜中移植的苏木精和伊红染色切片的图像，以证实FasL微凝胶仍然存在于移植部位。白色箭头表示微凝胶的位置。
图12展示了描绘肾切除术使移植有胰岛和SA-FasL微凝胶+雷帕霉素的受试者返回高血糖状态的图。移植后(箭头)第200天，肾被切除。
图13展示了描绘与胰岛共移植的SA-FasL微凝胶移植后，胰岛移植物存活率的图。生物素化的微凝胶用SA-FasL(1μg蛋白/1000微凝胶，除非另有说明)工程化并且与未修改的或SA-FasL工程化的BALB/c胰岛(500/移植物)共移植在化学糖尿病C57BL/6接受者的肾包膜下。在指定群组中，从移植当天开始，以0.2mg/kg每天i.p.注射来使用雷帕霉素，持续15个剂量。监测动物的血糖水平，两个连续日≥250mg/dL的读数被视为糖尿病(排斥)(*p<0.05，**p<0.01)。
图14展示了描绘基于CFSE试验的免疫细胞增殖的流式细胞术图表。从所选的移植接受者群组中收获的脾细胞用CFSE标记，并在标准体外增殖试验中用作来自供体或第三方C3H小鼠的受辐射(2000cGy)脾细胞的应答者。培养4天后，细胞用7AAD和针对CD4和CD8的荧光缀合的Abs染色，并通过使用BD LSR II门控活细胞以分析CFSE稀释。使用Diva软件分析数据。
图15展示了免疫分析来自排斥和长期小鼠(>200天)的脾、肾和肾引流淋巴结的流式细胞术图表。通过温和的机械分散由脾和淋巴结制备单细胞，通过胶原酶消化由含有胰岛的肾制备单细胞。使用细胞表面标记物或细胞内FoxP3的抗体对细胞进行染色。使用BDLSR II收集数据并使用Diva软件分析。
图16展示了移植后早期胰岛移植接受者的各种组织中的Teff和Treg细胞的流式细胞术分析。在移植后第3天和第7天，从指定群组的脾、肾和肾引流淋巴结制备的单细胞用针对细胞表面分子的荧光标记抗体CD4+Teff(CD4+CD44hiCD62Llo)、CD8+Teff(CD8+CD44hiCD62Llo)和Treg(CD4+CD25+FoxP3+)细胞进行染色，并使用流式细胞术分析。所展示的为指定组织中细胞的绝对数量(平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)。
图17展示了描绘对FoxP3/DTR小鼠的DT施用消耗Treg细胞的图。使用白喉毒素(50μg/kg体重)注射i.p.小鼠。图17A展示了描绘通过流式细胞术确定的Treg细胞消耗是短暂的图。图17B展示了描绘DT施用FoxP3/DTR小鼠后血糖水平的图。
图18展示了描绘附睾脂肪垫移植的血糖水平的图。在用呈递SA-FasL的微凝胶(1μg蛋白/1000微凝胶)和天然BALB/c胰岛移植物(500)移植的化学糖尿病C57BL/6小鼠上，在雷帕霉素(施用i.p.每天以0.2mg/kg，15个剂量)的短覆盖下读数。
具体实施方式
以下阐述本发明的各种实施例的特定细节以说明某些方面，但不限制本发明的范围。对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离在本发明中所描述的范围的情况下，修改和变化是可能的。在下面的讨论中，描述了本发明不同方面的具体实施例。应理解，即使未明确阐述特定实施例的每个可能的排列和组合，一个方面的任何具体实施例可以与另一个方面的任何具体实施例结合使用。
在本文中所描述的是FasL工程化的生物材料，其可用于例如诱导免疫耐受或免疫抑制，例如在治疗自身免疫疾病或治疗或预防移植排斥的环境中可能被需要。
抗原识别和活化后，T效应细胞上调Fas受体在其表面上并变得对FasL介导的细胞凋亡敏感。重要的是，FasL介导的细胞凋亡对于诱导自身耐受和维持是关键的，因为Fas或FasL的缺乏与人和啮齿动物的大量自身免疫相关。这表明该途径没有补偿机制，进一步强调了其作为免疫调节靶标的重要性。
如在本文中所描述的FasL工程化的生物材料提供体内靶标部位的FasL蛋白的受控负载、呈递和保持，且对免疫调节有效。在一些实施例中，FasL工程化的生物材料与移植(例如与移植细胞或移植组织)共同施用，并诱导对移植物的免疫耐受。在一些实施例中，在本文中所描述的方法在移植部位处实现长期、特异性免疫抑制，避免与非特异性、系统性药理学免疫抑制剂相关联的毒性。这是优于基因疗法的独特优点，因为FasL的不受控制的、连续的表达，所述FasL具有多效性功能和可以由靶标组织(膜结合的或可溶的)差异调节的不同表达模式，可能具有意外的后果。实际上，在移植环境中使用用于免疫调节的基因疗法的FasL的异位表达导致了混合的和相反的结果，一些研究展示FasL表达对移植物存活率的有害影响。在本文中所描述的FasL的局部和持续呈递克服了使用基因疗法在靶标组织中野生型FasL异位表达相关联的并发症。这种局部免疫调节概念还限制了与针对Fas的竞争抗体有关联的免疫调节的潜在毒性。
在本文中所描述的FasL工程化的生物材料为更广泛的临床应用提供现成产品的灵活性。因为这些免疫调节材料可以在移植时制备，并且简单地与移植细胞(例如胰岛)共同混合用于递送，而不需要包封移植细胞或操纵移植细胞呈递蛋白。
CD8+和CD4+T效应细胞，特别是CD4+T细胞在各种自身免疫疾病(包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化)的引发和持续中以及在外来移植排斥(包括同种异体和异种移植的排斥)中发挥关键作用。因此，T效应细胞代表免疫调节的重要靶标以预防和治疗这些疾病。在正常生理条件下，T效应(Teff)细胞被称为T调节(Treg)细胞的另一类T细胞所控制。Treg细胞类似于Teff细胞，跟随炎性提示并渗入排斥移植物中。越来越多的科学证据表明，T效应细胞和T调节细胞之间生理平衡的紊乱有利于T效应细胞是许多自身免疫疾病和外来移植排斥的根本原因。靶向T效应细胞和T调节细胞的方式对于重建自身免疫中的生理平衡和在移植排斥的情况下有利于T调节细胞倾斜平衡具有显著的治疗潜力。
定义
除非另有定义，在本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
出于本申请的目的，以下术语具有以下定义：
如在本文中所使用的“a”或“an”意指一个或多个，除非特别指定意为仅仅一个。
如在本文中所使用的术语“施用”包括直接向另一个自身施用，并且规定或指导在本文中所公开的药剂的施用。如在本文中所使用的术语“施用”涵盖向患者提供物质的所有合适的方法。常用途径包括口服、舌下、经粘膜、经皮、直肠、阴道、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、经由导管、经由植入物等。
如在本文中所使用的“患者”或“受试者”包括任何哺乳动物。在一些实施例中，患者是人。
如在本文中所使用的短语“有效量”和“治疗有效量”分别是指在需要此类治疗的受试者中提供施用活性剂的具体药理作用的受试者中的剂量或血浆浓度。要强调的是，活性剂的有效量将不总是有效治疗在本文中所描述的病症/疾病，即使本领域技术人员认为这样的剂量是有效量。
如在本文中所使用的术语“药物组合物”是指与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起配制的一种或多种活性剂。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，所述化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的医学鉴定范围内适用于体内而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，对应于合理的益处/风险比。
FasL工程化的生物材料
在本文中所描述的FasL工程化的生物材料是被工程化以显示FasL部分的生物材料。如在本文中所使用的“FasL”是指Fas配体。如在本文中所使用的“FasL部分”是指至少FasL的细胞凋亡诱导部分。在一些实施例中，FasL部分包含FasL的细胞外结构域或由FasL的细胞外结构域组成。在一些实施例中，FasL部分包含基质金属蛋白酶(MMP)抗性FasL蛋白或由基质金属蛋白酶(MMP)抗性FasL蛋白组成。如在本文中所使用的基质金属蛋白酶(MMP)抗性FasL蛋白是FasL的形式，其中FasL的细胞外结构域缺乏MMP敏感部位。参见Yolcu等人，《免疫学(Immunity)》17：795-808(2002)。
生物材料可以通过例如通过缀合、结合分子、交联等任何合适的方式工程化以显示FasL。例如可以使用直接化学栓系，通过另一分子(例如生物素、适体、抗体等)捕获、在生物材料内诱捕和受控释放技术。
在一些实施例中，FasL部分通过生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素蛋白(SA)结合显示在生物材料上。例如水凝胶可以被生物素化，并通过链霉抗生物素-生物素结合与FasL-链霉抗生物素蛋白缀合物(或包含FasL部分和链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白部分的嵌合蛋白)结合。与生物素化的水凝胶栓系的SA-FasL保持了有力的凋亡活性。使用在本文中所描述的FasL生物材料可以容易地控制递送至受试者的生物活性SA-FasL的量。
我们先前已经报道了FasL与链霉抗生物素蛋白(SA)，SA-FasL的嵌合形式的构建，其中FasL的胞外结构域缺少MMP敏感部位，被克隆到SA的C-末端，这可用作有效的免疫调节药剂。参见Yolcu等人，《免疫学》17，795-808(2002)。所述蛋白作为四聚体和低聚物存在，对表达Fas的细胞具有强烈的凋亡活性。重要的是，用附着于细胞表面的生物素修改然后用SA-FasL工程化的胰岛获得了免疫优先状态，并且在同种异体移植鼠模型中在缺乏慢性免疫抑制的情况下无限存活。参见Yolcu等人，《免疫学杂志(J Immunol)》187，5901-5909(2011)。
生物素与抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素(“SA”)之间的相互作用在本文中提供了若干优点。例如，生物素对SA(1013M-1)和抗生物素蛋白(1015M-1)都具有极高的亲和力。另外，SA和抗生物素蛋白都是四聚体多肽，每个四聚体多肽结合四个生物素分子。因此，包含SA或抗生物素蛋白的缀合物具有形成四聚体和更高级结构的倾向，并且可以与多个含生物素部分形成复合物。
如在本文中所使用的“生物素”包括能够结合表面(例如细胞表面)的含生物素部分，例如NHS-生物素和EZ-Link㈤磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)。生物素和生物素的蛋白反应形式可商购获得。
也可以使用分别保持对生物素的基本结合活性，例如天然SA或抗生物素蛋白的结合亲和力的至少50％或更高的SA或抗生物素蛋白片段。这样的片段包括“核心链霉抗生物素蛋白”(“CSA”)，全长链霉抗生物素蛋白多肽的截断版本，其可以包括链霉抗生物素蛋白残基13-138、14-138、13-139或14-139。参见例如Pahler等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，262：13933-37(1987)。也可以使用保持与生物素强结合的链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的其它截断形式。参见例如Sano等人，《生物化学杂志(J BiolChem.)》270(47):28204-09(1995)(描述核心链霉抗生物素蛋白变体16-133和14-138)(美国专利第6,022,951号)。也可以使用链霉抗生物素蛋白的突变体和链霉抗生物素蛋白的核心形式，其保持基本的生物素结合活性或增加的生物素结合活性。参见例如Chilcoti等人，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)》，92(5)：1754-58(1995)，Reznik等人，《自然·生物技术(Nat Biotechnol)》，14(8)：1007-11(1996)。例如可以使用降低免疫原性的突变体，例如通过定点诱变突变以除去潜在的T细胞表位或淋巴细胞表位的突变体。参见Meyer等人，《蛋白质科学(Protein Sci.)》，10：491-503(2001)。同样也可以使用抗生物素蛋白突变体和核心形式的抗生物素蛋白，它们保持了基本的生物素结合活性或增加的生物素结合活性。参见Hiller等人，《生化杂志(J Biochem)》，278：573-85(1991)；和Livanh等人，《美国国家科学院院刊Proc Natl Acad Sci USA)》90：5076-80(1993)。为了方便起见，在本文的讨论中，术语“抗生物素蛋白”和“链霉抗生物素蛋白”(或“SA”)涵盖了这些分子的片段、突变体和核心形式。
抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可向供应商购买。此外，编码链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的核酸序列以及链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白氨基酸序列是已知的。参见例如GenBank登录号X65082；X03591；NM_205320；X05343；Z21611；和Z21554。
生物材料可以是任何药学上可接受的生物材料，其适于施用至靶标受试者并且顺从工程化以显示FasL。在一些实施例中，生物材料是水凝胶。如在本文中所使用的“水凝胶”是指尺寸远大于细胞(例如>500μm)的水溶胀聚合物材料，例如水溶胀聚合物网络。如在本文中所使用的“微凝胶”是指具有较小尺寸(例如约10s或100sμm)的水凝胶。水凝胶可以是适于施用到靶标受试者中的任何药学上可接受的水凝胶。当有机聚合物(天然或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联以创造俘获水分子以形成凝胶的三维开放晶格结构时，通常形成水凝胶。可用于形成水凝胶的材料的实例包括使用不同交联方法(例如Michael-型加成、硫醇-烯、点击反应等)组装的基于大分子单体的材料(包括PEG大分子单体)、多糖(例如藻酸盐)、聚磷嗪、聚丙烯酸酯、或嵌段共聚物(例如PluronicsTM或TetronicsTM)，分别通过温度交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物、游离基聚合、点击反应或pH。
在具体实施例中，生物材料是聚乙二醇(PEG)水凝胶或微凝胶。在进一步的具体实施例中，水凝胶由马来酰亚胺-封端的4-臂聚乙二醇(PEG-4MAL)大分子单体合成，例如通过微流体聚合。参见Headen等人，《先进材料(Advanced Materials)》，26：3003-3008(2014)。PEG-4MAL平台使得能够化学计量，共价并入含硫醇分子，并为形成结构上限定的水凝胶提供改善的交联效率。参见Phelps等人，《先进材料》，24：64-70，62(2012)。PEG-4MAL在体内表现出最小的毒性，并且它在尿中快速地排泄，这是临床应用的重要考虑因素。
生物素化的水凝胶或微凝胶可以通过使生物素-PEG-硫醇与PEG-4MAL大分子单体反应，并通过微流体聚合生成150μm直径的与二硫苏糖醇(DTT)交联的微凝胶来产生。参见例如图1A。所得微凝胶展示能够以高亲和力捕获SA的共价栓系的生物素。参见例如图1B。
在一些实施例中，所述生物材料包含或与另外的治疗剂，例如免疫抑制剂一起配制(例如与另外的治疗剂混合或掺合)。合适的免疫抑制药物的实例包括雷帕霉素、环磷酰胺白消安、氟达拉滨、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羟氯喹、硫唑嘌呤、托珠单抗、依那西普、阿达木单抗、阿那白滞素、阿巴西普、利妥昔单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗、环孢菌素、地塞米松、甲基泼尼松龙、泼尼松、他克莫司和氟羟氢化泼尼松。在一些实施例中，免疫抑制药物是雷帕霉素。
免疫耐受诱导的方法
根据一些实施例，提供了实现免疫调节的方法，其包含向有需要的受试者施用如在本文中所描述的FasL工程化的生物材料。根据一些实施例，所述方法用于预防或降低细胞或组织移植排斥和/或治疗I型糖尿病的风险。
如上所述，在本文中所描述的FasL生物材料可用于诱导免疫抑制。因此，根据一些实施例，提供了在有需要的受试者中诱导免疫抑制的方法，其包括以有效诱导免疫耐受的量向受试者施用FasL生物材料。
如上所述，在本文中所描述的FasL生物材料还可用于诱导特异性免疫耐受。例如，和移植一起施用FasL生物材料(例如移植细胞)可以诱导对移植细胞的特异性免疫耐受。因此，根据一些实施例，提供了在有需要的受试者中诱导特异性免疫耐受的方法，其包含以有效诱导对移植细胞的免疫耐受的量向受试者施用移植细胞FasL生物材料。
如在本文中所使用的“移植细胞”是指施用有需要的受试者的供体细胞(或包含细胞的组织或器官)。移植细胞的类型包括胰岛细胞(例如胰岛细胞)、脾细胞、PBMC、骨髓细胞、间充质干细胞、造血干细胞、干细胞、诱导多能干细胞、人β细胞产物、肝细胞、树突细胞、巨噬细胞、内皮细胞、心肌细胞、血管细胞以及免疫细胞，包括T细胞等，这取决于所治疗的病症。根据这些方法，FasL水凝胶诱导对移植细胞的特异性免疫耐受。
为了说明，可以向受试者施用胰岛细胞以治疗糖尿病。根据在本文中所描述的方法，可以施用受试者胰岛细胞和被工程化以显示FasL的水凝胶(“FasL水凝胶”)，以便特异性诱导对胰岛细胞的免疫耐受。在另一个实例中，可以施用受试者肝细胞以治疗急性肝衰竭或基于肝的代谢紊乱。根据在本文中所描述的方法，可以施用受试者肝细胞和FasL水凝胶以诱导对肝细胞的免疫耐受。
在任何实施例中，移植细胞可以作为分离细胞的制备或作为组织或器官的一部分施用。
在一些实施例中，移植细胞是同种异体的。在一些实施例中，所述移植细胞是异种的。在一些实施例中，所述移植细胞来自人、非人灵长类、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。
在一些实施例中，移植细胞是自体的或自生的(来自被治疗的受试者)。例如自体移植细胞可以通过诱导多能性并将诱导多能细胞分化为所需自体移植细胞而衍生自自体组织。在一些实施例中，来自受试者的细胞用于诱导对自身免疫耐受，所述自身免疫耐受已经在自身免疫性疾病中被中断。适用于这些实施例的示例性细胞包括动员的造血干细胞、PBMC、树突细胞等。在一些实施例中，所述细胞选自那些自然表达自身抗原的细胞，所述自身抗原靶向自身免疫疾病。例如I型糖尿病是自身免疫疾病，其中身体反应并排斥胰岛(β)细胞。在糖尿病的早期阶段，在所有胰岛细胞受排斥之前，可以诱导对胰岛细胞的耐受，从而预防糖尿病的进展。
因此，在一些实施例中，受试者需要对移植细胞的免疫耐受，并且诱导免疫耐受的方法包含施用如在本文中所描述的FasL水凝胶和移植细胞。在这些实施例中，基于待治疗的条件选择移植细胞。例如当受试者需要治疗或预防1型糖尿病时，移植细胞可以是胰岛细胞。当受试者需要治疗或预防同种异体移植排斥时，移植细胞可以是来自同种异体移植供体的细胞，例如同种异体移植骨髓细胞、同种异体移植心肌细胞、同种异体移植血管细胞或来自上述同种异体移植供体的其它细胞。当受试者需要治疗或预防异种移植排斥时，移植细胞可以是来自异种移植供体的细胞，例如异种移植骨髓细胞、异种移植心肌细胞、异种移植血管细胞或如上所述来自异种移植供体的其它细胞。当受试者需要治疗或预防自体排斥时，移植细胞可以是自体细胞，例如通过诱导多能性和诱导多能性细胞的分化衍生自自体组织的细胞。
因此，在一些实施例中，受试者需要对移植细胞的免疫耐受。在一些实施例中，所述移植细胞选自PBMC、骨髓细胞、造血干细胞、干细胞、间充质干细胞、树突细胞、用自身抗原脉冲的树突细胞、人β细胞产物和脾细胞。例如当受试者需要治疗或预防1型糖尿病时，移植细胞可以是胰岛细胞，或另外或替代地，如上所述的其它细胞。当受试者需要治疗或预防同种异体移植排斥时，移植细胞可以是来自同种异体移植供体的细胞，例如选自由同种异体移植骨髓细胞、同种异体移植心肌细胞和同种异体移植血管细胞组成的群组的细胞或如上所述来自同种异体移植供体的其它细胞。当受试者需要治疗或预防异种移植排斥时，移植细胞可以是来自异种移植供体的细胞，例如选自由异种移植骨髓细胞，异种移植心肌细胞和异种移植血管细胞组成的群组的细胞或如上所述来自异种移植供体的其它细胞。当受试者需要治疗或预防自身免疫时，移植细胞可以是(i)表达自身抗原的细胞、(ii)用自身抗原修饰的细胞和(iii)用自身抗原脉冲的树突细胞。
根据这些方法，FasL生物材料(例如FasL水凝胶)和移植细胞可以在同一组合物中施用，或可以单独施用。在一些实施例中，移植细胞被FasL生物材料包封。例如，移植细胞可以包埋在水凝胶或微凝胶生物材料中。在一些实施例中，FasL生物材料(例如FasL水凝胶)和移植细胞被施用到受试者的同一部位，例如通过局部注射来施用到大约同一部位中。在一些实施例中，将FasL生物材料(例如FasL水凝胶)和移植细胞移植到受试者的同一部位中(例如共移植)。根据这些实施例中的任一个，所述方法可以在移植部位实现长期的特异性免疫抑制。
因此，根据一些实施例，施用是通过移植。在一些实施例中，同种异体胰岛移植接纳是通过将未修改的胰岛和FasL呈递性生物材料一起进行简单共移植，而不进行长期免疫抑制来实现的。
在一些实施例中，FasL生物材料(例如FasL水凝胶)与另外的治疗药剂(例如免疫抑制药物、例如雷帕霉素或上述任何其它治疗剂)一起施用。在这样的实施例中，FasL生物材料(例如FasL水凝胶)和免疫抑制药物可以一起配制(例如水凝胶可以包含免疫抑制药物)，或者它们可以以单独组合物的形式同时或以任何顺序依次施用。在一些实施例中，可能需要的免疫抑制药物疗程比没有施用FasL生物材料时更短。
在一些实施例中，包含免疫抑制药物的FasL生物材料(例如FasL水凝胶)提供药物的受控释放。在一些实施例中，包含免疫抑制药物的FasL生物材料(例如FasL水凝胶)提供药物在移植微环境中的受控释放，或含有用这些免疫调节分子(FasL)工程化的胶囊形式的移植。
在一些实施例中，与免疫抑制药物一起施用在本文中所描述的FasL生物材料(例如FasL水凝胶)实现协同免疫抑制作用。例如，在一些实施例中，免疫抑制药物(例如雷帕霉素)与FasL协同工作以特异性消除致病性T效应细胞，同时扩增T调节细胞，从而使免疫应答的平衡偏向保护。不受理论的约束，这种协同作用可以通过FasL部分活化T效应细胞中死亡受体介导的外来性细胞凋亡来实现，而免疫抑制药物(例如雷帕霉素)活化线粒体介导的内在细胞凋亡。参见例如Ju等人，《自然(Nature)》373(6513)：444-448(1995)；和Yellen等人，《细胞周期(Cell Cycle)》，10(22)：3948-3956(2011)。
在一些实施例中，与免疫抑制药物一起施用在本文中所描述的FasL生物材料(例如FasL水凝胶)不会损害系统免疫应答，并且可以增加T调节细胞与T辅助细胞的比率。T调节细胞在调节免疫应答中起重要作用，并且它们是炎性提示并且渗入到排斥移植中。
如上所述，FasL生物材料(例如FasL水凝胶)可以以有效诱导免疫抑制或诱导特异性免疫耐受的量施用。FasL的有效量将根据所治疗的受试者、施用途径和所治疗条件的性质和严重性而变化。在以下实例中使用的FasL的量是说明性的，并且基于下表，可以转化为用于其它受试者的剂量：
仅仅作为说明，基于FasL部分，FasL的有效剂量可以为小于约0.2μg/kg/天至至少约10μg/kg/天或更高。例如，在本文中所描述的方法可以使用FasL的每天剂量以小于约0.2μg/kg/天，约0.2μg/kg/天，约0.5μg/kg/天，约1μg/天/kg/天，约1.5μg/kg/天，约2μg/kg/天，约2.5μg/kg/天，约3μg/kg/天，约3.5μg/kg/天，约4μg/kg/天，约4.5μg/kg/天，约5μg/kg/天或更多来实施。
1型糖尿病
1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫疾病，其特征在于由于针对需要CD4+T细胞的β-细胞特异性抗原的协调免疫应答，胰岛素产生β-细胞块损失，从而控制血糖。通过同种异体胰岛移植恢复β-细胞团目前是改善严重血糖不稳定患者血糖控制的优选临床干预。然而，同种异体移植的寿命不仅受到宿主免疫应答的限制，而且受到由于控制排斥所需的慢性免疫抑制的毒性作用引起的继发性移植衰竭的限制。致病性T效应细胞(Teff)是胰岛同种异体移植破坏的主要元凶。因而，不需要长期免疫抑制而增加胰岛同种异体移植的功能寿命的有希望的策略包含靶向Teff细胞以消除、减轻其致病功能的新疗法。
在活化时，T细胞上调Fas并变得对FasL介导的细胞凋亡敏感，这是在活化诱导的细胞死亡(AICD)和对自身抗原的耐受中起关键作用的过程。Fas或FasL的缺乏导致啮齿动物和人的大量淋巴细胞增生和自身免疫病变，证明缺乏补偿机制和该途径对于免疫调节的重要性。认识到该途径的免疫调节潜力，几个群组已经成功地使用FasL基因疗法来减轻同种异体免疫应答，用于实验动物模型中的移植接纳。尽管这些干预展示出功效，但FasL在靶标组织中持续异位表达的未知安全特征以及基因疗法的技术和调节挑战限制了它们的临床潜力。另外，FasL仅仅对膜结合的低聚物形式的AICD有贡献。基质金属蛋白酶(MMP)可以将FasL切割成抑制细胞凋亡的细胞外可溶形式，并作为中性粒细胞的化学引诱剂，加速同种异体移植的破坏。
胰岛移植是对1型糖尿病有希望的疗法。然而，控制同种异体胰岛排斥的慢性免疫抑制诱导病态并损害胰岛功能。
T-效应细胞负责胰岛同种异体移植排斥并在活化后表达Fas死亡受体，对Fas介导的细胞凋亡变得敏感。然而，如在本文中所描述的使用呈递凋亡形式的Fas配体(SA-FasL)的微凝胶的局部免疫调节导致同种异体胰岛移植物的延长存活，如糖尿病小鼠中所展示。此外，雷帕霉素治疗的短疗程可以增强SA-FasL-微凝胶的免疫调节功效，导致所有同种异体移植在较长的时间段内接受并发挥功能，例如在下面报道的实验中为200天。此外，治疗的受试者可能表现出对供体抗原的正常系统应答，暗示移植的免疫特权，以及在移植和引流淋巴结中CD4+CD25+FoxP3+T调节细胞增加。在下面报道的实验中，T调节性细胞的缺失导致建立的胰岛同种异体移植的急性排斥。
这些结果与FasL在所选组织如眼前房和睾丸的生理免疫特权中的建立的作用一致。Zeiser等人，《血液(Blood)》111(1)：453-462(2008)；Battaglia等人，《血液》，105(12)：4743-4748(2005)；Basu等人，《免疫学杂志》180(9)：5794-5798(2008)。所观察到的针对排斥的保护作用需要Treg细胞并局限于移植物上，只要长期接受者对供体抗原产生正常的系统应答，暗示免疫特权。这与证明转染表达FasL的原代成肌细胞赋予共移植的同种异体胰岛免疫特权的研究一致。Ju等人，《自然》373(6513)：444-448(1995)。此外，我们先前已经证明，被工程化以在雷帕霉素的短覆盖下在其表面上显示SA-FasL蛋白的同种异体胰岛通过诱导由Treg细胞维持的局限于移植物的耐受和免疫特权克服排斥。Rao等人，《免疫学》，32(1)：67-78(2010)。因此，在本文所描述的局部免疫调节生物材料激活的方法可能为临床胰岛移植提供慢性免疫抑制的替代方案。
因此，根据具体实施例，在本文所描述的是FasL工程化的生物材料，其中链霉抗生物素蛋白缀合的FasL(SA-FasL)显示在生物相容性材料上，例如水凝胶，例如聚乙二醇(PEG)水凝胶。SA-FasL工程化的生物材料可用以于例如免疫调节、例如用于预防或降低细胞或组织移植排斥的风险、例如用于预防或降低外来移植排斥的风险、用于预防或降低胰岛移植排斥的风险、和/或用于预防或降低干细胞、人胰腺β细胞产物(例如可用于治疗1型糖尿病)排斥的风险以及与其它治疗和/或治疗可受益于细胞或组织移植的其它病症相结合。因此，例如在本文所描述的SA-FasL工程化的生物材料可以用于治疗自身免疫性疾病，例如I型糖尿病、预防细胞和组织移植排斥，例如干细胞、胰岛、造血干细胞、肝细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、衍生自干细胞的人β细胞产物以及通过使用干细胞结合治疗各种造血和免疫缺乏病症。
在本文所描述的特定实施例中使用的链霉抗生物素蛋白缀合的FasL构建体(SA-FasL)本身已经被描述，并且已经展示出在雷帕霉素治疗的短疗程下防止同种异体胰岛的排斥。在本发明特定实施例的上下文中，被工程化以在其表面上显示SA-FasL蛋白的PEG水凝胶已展示在化学糖尿病小鼠中与短程免疫抑制药物雷帕霉素组合使用时有效预防共移植胰岛的排斥。总之，这些研究证明了使用SA-FasL工程化的生物材料治疗外来移植排斥和自身免疫的用途。
在本发明的上下文中，SA-FasL具有独特的活动机制，其可以使用水凝胶作为递送载体最大限度地利用。鉴于FasL在自身耐受中的关键作用以及当缺乏时没有补偿机制，该分子比用于治疗自身免疫和移植排斥的其它生物制剂和免疫抑制药物具有优势。例如，当活化时，自身反应的和同种异体反应的T细胞上调Fas受体，并因此成为SA-FasL的直接靶标。因此，SA-FasL具有特异性消除自身和同种异体反应的T细胞的潜力，而不知道T细胞全部成分的抗原特异性。该途径尚未靶向治疗目的，因此它是独特的。此外，该概念具有优于工业上用于治疗自身免疫和移植排斥的现有技术的功效和特异性，所述自身免疫和移植排斥不仅仅无效而且具有各种副作用，例如与用于自身免疫和移植排斥的标准免疫抑制相关联的副作用。
外来移植排斥和各种自身免疫疾病(例如I型糖尿病(TI D))是致病性T效应细胞(Teff)和保护性T调节细胞(Treg)之间失衡的最终结果。因此，有效改变致病性Teft：Treg平衡有利于Treg细胞的方法具有预防和逆转自身免疫以及预防外来移植排斥的潜力。识别自体或移植抗原的致病性T细胞被活化并上调其表面上的Fas受体。因为各种抗凋亡基因的表达，这些细胞耐受Fas配体(FasL)的细胞凋亡。
实例
实例1：产生可捕获链霉抗生物素蛋白-FasL的生物素化的微凝胶
生物素化的微凝胶可以通过使生物素-(聚乙二醇(PEG))-硫醇与马来酰亚胺-封端的4-臂聚乙二醇(PEG-4MAL)大分子单体反应，并通过微流体聚合生成150μm直径的与二硫苏糖醇(DTT)交联的微凝胶来制备(图1A)。所得微凝胶显示能够以高亲和力捕获链霉抗生物素蛋白(SA)的共价栓系的生物素(图1B)。SA在微凝胶上的生物素特异性捕获随着栓系溶液中SA的浓度线性变化，直到达到150μg/mL的饱和浓度(图1C)，证明对微凝胶表面上SA呈递的剂量依赖性控制。如所预期的，在生物素化的微凝胶上捕获SA-FasL遵循类似的剂量依赖关系(图7)。重要的是，SA-FasL在微凝胶上的显示诱导A20细胞中的剂量依赖性细胞凋亡(图1D)，其对FasL介导的细胞凋亡敏感。相反，SA-FasL与PEG-4MAL大分子单体的直接共价偶联消除了SA-FasL凋亡活性(图8)，证明生物素固定化对于呈递生物活性SA-FasL的重要性。这些结果展示了栓系到生物素化的微凝胶的SA-FasL保持了有效的凋亡活性，并且使用该方式可以容易地控制递送的生物活性SA-FasL的量。
为了检查功能化材料是否影响正常胰岛健康和功能，将大鼠胰岛与SA-FasL呈递性微凝胶(1:2胰岛：微凝胶比率)一起培养24小时。与SA-FasL呈递性微凝胶共培养的胰岛和游离胰岛(对照)在代谢活性(图10A)、葡萄糖刺激的胰岛素分泌(图10B)、活死染色(图10D)或胰岛素和胰高血糖素表达模式(图10E)方面没有差异。有趣的是，与游离胰岛作为对照相比，与SA-FasL呈递性微凝胶共培养的胰岛具有减少的促炎性细胞因子MIP1a和IL-6而不是MCP-1的分泌(图10C)。总之，这些数据证明SA-FasL呈递性微凝胶不会对胰岛健康或功能产生负面影响。
实例2：在微凝胶上呈递SA-FasL延长了移植物部位的局部SA-FasL递送。
我们还研究了呈递于微凝胶上的SA-FasL在体内的保持。用近红外荧光染料标记的SA-FasL固定在生物素化的微凝胶上，所述微凝胶植入小鼠的肾包膜下。标记的SA-FasL的纵向追踪在体内成像系统上执行21天。荧光信号的图像展示集中的信号局限于接受标记的SA-FasL呈递性微凝胶的小鼠肾周围的区域，而荧光信号对于接受没有微凝胶载体的标记的游离SA-FasL的小鼠是扩散的(图2A)。在仅仅接受标记的SA-FasL而没有微凝胶递送载体的小鼠中，蛋白迅速从移植部位清除，植入后第1天信号减少60％，植入后第7天信号可忽略(图2B)。相反，接受SA-FasL呈递性微凝胶的小鼠显示出SA-FasL水平随着时间显著更高，同时在移植后第7天内，植入部位的升高的水平与第0天信号具有可比性。与游离SA-FasL相比，使用单指数衰减曲线拟合分析保持分布图展示SA-FasL呈递性微凝胶的保持时间显著更长(半衰期3.0±0.8天vs0.70±0.40天，p<0.0001)。此外，曲线下面积计算证明微凝胶栓系的相对于游离蛋白SA-FasL的保持增加(5.25±0.87vs。1.98±0.14，p<0.007)。图11展示了通过组织学确定的，在第21天可以清楚地观察到植入部位的微凝胶。该结果支持以下结论：SA-FasL-微凝胶的荧光信号损失起因于SA-FasL与生物素化的微凝胶的未结合，而不是微凝胶的降解。因此，这种用于在移植部位延长的局部SA-FasL递送的生物材料策略，显著增强了局部作用，同时最小化了这种有效免疫调节蛋白的全身效应的风险。我们预期这种用于在移植部位延长的局部SA-FasL递送的生物材料策略，显著增强了局部作用，同时最小化了这种有效免疫调节蛋白的全身效应的风险。
实例3：同种异体胰岛和SA-FasL工程化微凝胶的共移植恢复长期血糖控制，而不 使用胰岛的慢性免疫抑制或修改。
在同种异体胰岛移植环境中测试呈递SA-FasL的微凝胶的免疫调节功效。将未修改的同种异体(Balb/c)胰岛与微凝胶混合，并将所得混合物移植到链脲佐菌素糖尿病C57BL/6小鼠的肾包膜下。接受未修改的胰岛和对照生物素化的微凝胶的小鼠急性排斥所有移植物(中位存活时间(MST)＝15天；图3A)，而用SA-FasL工程化的微凝胶共移植的胰岛具有显著延长的存活(MST＝31天)，约25％的受试者在牺牲前存活超过200天(图3A)。值得注意地是，当受试者用短疗程的雷帕霉素(在移植后第0天开始，每天0.2mg/kg，15个剂量)治疗时；图3a)，>90％(12/13)的移植物在与未修改的胰岛和SA-FasL呈递性微凝胶共移植的小鼠中，在整个200天观察窗内发挥功能并存活。在第200天时具有功能健全移植物的接受者植入部位的免疫染色揭示胰岛素阳性结构与微凝胶密切相关，而在移植物受排斥的接受者中没有观察到胰岛素阳性结构(图3B)。腹膜内葡萄糖耐受测验证明这些长期移植物与天然小鼠相比具有等同的功能(图3C)；曲线下面积分析展示，天然与长期移植物之间没有差异(P＝0.20)。与其明显相反，使用雷帕霉素注射但不使用SA-FasL工程化的微凝胶的相同方案导致急性排斥(MST＝36天)，具有与SA-FasL呈递性微凝胶群组相似的性能(图3A)。
为了进一步建立胰岛和工程化的SA-FasL的共移植导致糖尿病逆转，在移植接受者中随时间测量血糖水平。图9展示了使用SA-FasL呈递性微凝胶+雷帕霉素或对照微凝胶+雷帕霉素的移植接受者随时间的代表性血糖水平。在移植后第200天在接受胰岛和SA-FasL呈递性微凝胶+雷帕霉素的糖尿病小鼠中进行的肾切除术快速恢复高血糖(图12)，证明这些受试者中的糖尿病逆转是由于移植所致。使微凝胶上SA-FasL的表面密度增加10倍对移植物存活率没有显著改善(图13)。我们还比较了SA-FasL呈递性微凝胶与SA-FasL呈递性胰岛的功能性能，如我们先前所展示的，该策略在促进移植接纳方面是有效的。Yolcu等人，《免疫学杂志》187(11)：5901-5909(2011)。我们观察到在有或没有雷帕霉素的施用下，在SA-FasL呈递于胰岛或微凝胶的表面上之间，SA-FasL的作用没有差异(图14)。然而，基于微凝胶的SA-FasL呈递的主要和显著优点是避免了胰岛的化学修改，这可以克服对胰岛生存力和功能的潜在负面影响，并且还提供了作为现成产品的更好的可转移策略。总之，这些结果展示同种异体胰岛和SA-FasL工程化的微凝胶的简单共移植在不使用慢性免疫抑制或胰岛修改的情况下恢复了长期血糖控制。
实例4：SA-FasL工程化的微凝胶的接受者维持系统免疫能力。
由于免疫调节的局部性质，我们在体外增殖试验中评估了移植接受者对供体抗原的系统应答。来自用SA-FasL工程化的微凝胶处理的长期(>200天)胰岛移植接受者的CD4+和CD8+T细胞展示对供体以及第三方抗原的增殖应答(图4A和图14)。所观察到的应答与使用来自接受未修改的微凝胶加雷帕霉素的排斥小鼠的T细胞获得的应答幅度相似。此结果表明接受SA-FasL工程化的微凝胶的小鼠维持系统免疫能力，并且由SA-FasL工程化的微凝胶给予的保护保持局限于移植物上。
为了进一步阐明移植接纳的机制，在时程研究中使用流式细胞术分析从脾、移植引流淋巴结(LNs)和移植物收集的免疫细胞群，特别关注Teff和T调节性(Treg)细胞作为FasL介导的免疫调节的靶标，如图15所示。如图16所示，我们观察到与接受单独或与雷帕霉素组合的未修饰微凝胶的对照组相比，接受SA-FasL工程化的微凝胶+雷帕霉素的小鼠的组织中CD4+和CD8+Teff细胞数量减少的一般趋势。未修改的微凝胶加雷帕霉素群组展示Treg细胞数量增加的趋势，其在移植后第7天在移植物浸润性淋巴细胞中达到显著性。与接受单独或与雷帕霉素组合的未修改微凝胶的对照小鼠相比，接受SA-FasL工程化的微凝胶和雷帕霉素的小鼠在移植物中Treg与CD4+和CD8+Teff细胞的比率增加(对于Treg:CD8+Teff，p<0.05)并且在移植物引流LN中同样增加(对于两种Treg:Teff群体，p<0.05)(图4B)。
此外，考虑到Treg与Teff细胞比率增加的趋势，我们进行了消耗研究以直接评估Treg细胞在我们的模型中观察到的移植接纳中的作用。对于这些研究，将BALB/c同种异体胰岛移植到在Foxp3控制下表达人白喉毒素(DT)受体的转基因C57BL/6小鼠中。在这些FoxP3/DTR小鼠中，DT施用短暂消耗Treg细胞几天，然后恢复到正常水平(图17A)。重要的是，DT施用对FoxP3/DTR小鼠的血糖水平没有影响(图17B)。如先前在C57BL/6接受者中看到的，在雷帕霉素的短暂覆盖下，用同种异体胰岛和SA-FasL工程化的微凝胶移植的化学糖尿病转基因小鼠建立了移植接纳，小鼠在移植后第50天维持移植功能(图4C)。在第50天通过施用DT消耗Treg细胞导致在第82天排斥所有移植(图4C，MST＝72天)。与其明显相反，没有DT治疗的对照小鼠在200天实验终点维持移植功能。这些结果证明Treg细胞在接受SA-FasL呈递的微凝胶的小鼠的移植接纳中的主要作用。
实例5：SA-FasL-微凝胶策略在临床相关移植部位改善移植胰岛功能而没有慢性 免疫抑制。
肾包膜是研究细胞递送的实验上适当的移植部位，但其具有临床采用的局限性。因此我们检查了同种异体胰岛移植到鼠附睾脂肪垫中。小鼠的附睾脂肪垫类同于人的网膜。重要的是，网膜代表临床相关的胰岛移植部位。参见Baidal等人，《新英格兰医学杂志(NEngl J Med)》376(19)：1887-1889(2017)；和Berman等人，《糖尿病(Diabetes)》，65(5)：1350-1361(2016).为了将胰岛保持在该部位，将移植物递送到蛋白酶可降解的PEG水凝胶中，所述PEG水凝胶具有改善胰岛移植的受控VEGF释放。参见Weaver等人，《科学进展(SciAdv)》，3(6)：e1700184(2017)。与我们对于肾包膜部位的结果一致，在雷帕霉素治疗的简短覆盖下与SA-FasL-微凝胶共移植的同种异体胰岛与对照相比在糖尿病小鼠中展示出显著改善的存活(p<0.0008，图6A)。该模型中的胰岛移植物也使血糖水平正常化，证明其功能(图18)。在SA-FasL呈递性微凝胶+雷帕霉素群组中具有功能健全胰岛移植物的小鼠中移植部位的免疫染色揭示了许多对胰岛素和胰高血糖素染色阳性的结构(图6B)，而在接受具有对照微凝胶的胰岛的小鼠中没有发现此类胰岛素和胰高血糖素阳性结构。最后，作为SA-FasL-微凝胶治疗的潜在毒性的初步评估，我们测量肝酶的血清水平，并对长期接受者(>60天)(图6C)的肝和肾执行组织学。肝酶水平在正常范围内，SA-FasL呈递性微凝胶和对照之间没有差异。类似地，总的肝或肾组织结构没有差异。总之，这些结果证明SA-FasL-微凝胶策略改善了移植胰岛功能，而在临床相关移植部位没有慢性免疫抑制，具有可接受的安全特征。
材料和方法
微凝胶的合成和表征。含有5％w/v PEG-4MAL(20kDa，Laysan Bio)和1.0mM生物素-PEG-硫醇(1kDa，Nanocs)的微凝胶前体溶液在PBS中反应15分钟。如前所描述，将该前体分散成液滴，随后在含有2％SPAN80(Sigma)和30mg/mL二硫苏糖醇(Sigma)的1:15乳液的矿物油(Sigma)中在微流控芯片上交联。参见Headen等人，《先进材料》，26：3003-3008(2014)。使用该方案还合成了不含生物素-PEG-硫醇的对照微凝胶。通过在PBS中的1％牛血清白蛋白(Sigma)中离心洗涤微凝胶5次后，将104个微凝胶与不同浓度的链霉抗生物素-AlexaFluor488缀合物在500μL PBS中温育30分钟，并通过离心洗涤5次以除去未结合的SA。将来自每个样品的微凝胶置于96孔板中并在板读数器(Perkin Elmer HTS 7000)上测量荧光。生物素和对照微凝胶也用共价结合肽(GRGDSPC)-AlexaFluor594缀合合成，用于胶囊显影，并荧光成像以证实生物素特异性SA固定化。
体外SA-FasL生物活性。104微凝胶，有或没有生物素，在500μL PBS中与含有不同浓度SA-FasL的1％牛血清白蛋白共温育30分钟。离心洗涤微凝胶8次以除去未结合的SA-FasL，并与1.0mL培养基中的106A20细胞温育。18小时后，细胞用早期和晚期细胞凋亡的标记物(膜联蛋白V-APC和碘化丙锭，BD Biosciences)染色。用流式细胞仪(Accuri C6流式细胞仪)分析样品，任一种标记染色阳性的细胞被视为凋亡。执行该实验的三次独立重复。
SA-Fas-L偶联微凝胶的体外细胞相容性。从Lewis雄性供体分离大鼠胰岛，并在进行实验前培养过夜。24小时后，将在完整的CMRL的300μL中的500IEQ与1000SA-FasL缀合的微凝胶额外共培养24小时。然后通过MTT(Promega)分析胰岛的代谢活性；使用生存性/细胞毒性试剂盒(Invitrogen)和蔡司(Zeiss)LSM 710倒置共焦显微镜直视活/死样品。静态葡萄糖刺激的胰岛素释放(GSIR)试验用于评估共培养后胰岛的胰岛素分泌，分别用低(3mM)和高克雷布斯(Krebs)缓冲(11mM)刺激1小时。第二次暴露于基础条件下再执行1小时。大鼠胰岛素ELISA用于定量GSIR样品(Mercodia、Inc.、Winston Salem、NC)。来自共培养物上清液的炎性细胞因子通过基于多重磁性的抗体检测试剂盒(具有IFNg、IL-1b、IL-6、IL-17A、MCP-1、MIP-1a的Milliplex大鼠细胞因子组)按照制造商的说明书进行分析。使用Magpix和Analyst分析软件(Milliplex@5.1、Merck、USA)分析来自三个独立孔的50微升上清液。使用制造商提供的标准物生成每种分析物的标准曲线。通过在10％福尔马林中加固胰岛样品1小时，共培养后执行胰岛素和胰高血糖素的免疫染色分析。对于胰岛素(Dako A0564，1:100)、胰高血糖素(Abcam ab10988，1:50)和DAPI(Invitrogen，1:500)，将整个样品在悬浮液中染色。对胰岛素(黄色)、胰高血糖素(品红色)和DAPI(蓝色)的整装样品成像。
体内SA-FasL跟踪。SA-FasL用AlexaFluor750 NHS酯(Thermo Fisher)标记，通过在Zeba柱(7k MWCO，Thermo Fisher)中脱盐三次除去游离染料。通过温育30分钟，然后5个洗涤步骤，将3.0μg标记的SA-FasL固定到2000生物素微凝胶上。将呈递SA-FasL或游离SA-FasL的微凝胶植入C57Bl/6接受者(n＝8只小鼠/组)的肾包膜下，并使用IVIS SpectrumCT成像系统纵向监测信号强度和分布。将强度测量值标准化为第0天的值。在GraphPad Prism中进行非线性曲线拟合，使用t-检验比较保持时间。另外，计算各群组的曲线下面积，并用Welch's t-检验比较各群组。
胰岛移植。使用Liberase TL作为消化酶(Roche Life Science)分离BALB/c胰岛，并通过先前发布的Ficoll密度梯度纯化。参见Yolcu等人，《免疫学》17：795-808(2002)。为了生物素化胰岛，将过夜培养的胰岛在5μM EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(ThermoScientific)中于室温温育30分钟，用PBS充分洗涤以除去未结合的生物素溶液。生物素化的胰岛和微凝胶用SA-FasL(约150ng/500胰岛和1-10μg/1000微凝胶)工程化。如果需要，将大约500个胰岛与1000微凝胶共移植到链脲霉素糖尿病(200mg/kg i.p.，连续两天证实糖尿病(>250mg/dL))C57BL/6或B6.129(Cg)-Foxp3tm3(DTR/GFP)Ayr/J(C57BL/6.FoxP3EGFP/DTR)接受者中。对于Treg缺失，用白喉毒素(50μg/kg体重)i.p.注射胰岛移植接受者，并在3天后使用流式细胞术证实外周血淋巴细胞中的消耗。从移植当天开始，还以每天0.2mg/kg使用雷帕霉素i.p.处理所选的群组，持续15个剂量。将与未修改的PEG凝胶共移植的未修改的BALB/c胰岛用作对照。监测动物的血糖，并且每天两次连续测量的≥250mg/dL血糖水平被视为受排斥。在移植后第200天，禁食6小时后，使用2g/kg葡萄糖溶液(25％)执行IPGTT。通过注射前尾刺和注射后10、20、30、60、90、120分钟评估血糖水平。使用GraphPad Prism对数据作图，并使用对数秩检验来确定群组间的显著性，p<0.05被视为显著性的。
免疫监测。从排斥和长期小鼠(>200天)收集脾、肾和肾引流淋巴结。通过温和的机械分散由脾和淋巴结制备单细胞，通过胶原酶消化由含有胰岛的肾制备单细胞。使用针对细胞表面标记的抗体(Alexa 700-CD4 Ab、APC-Cy7-CD8Ab、来自Pharmingen、BD的PE-Cy7-CD25 Ab和来自eBioscience的eFlour450-CD44 Ab和PerCP-Cy5.5-CD62L Ab)对细胞进行染色。使用FoxP3转录因子染色缓冲位点(eBioscience)，在加固/透化的细胞上进行胞内FoxP3染色。使用BD LSR II收集数据并使用Diva软件分析。数据使用GraphPad Prism作图，Welch's t检验用于确定群组间的显著性，p<0.05被视为显著性的。
增殖试验。从所选的移植接受者群组中收获的脾细胞用CFSE标记，并在标准体外增殖试验中用作来自供体或第三方C3H小鼠的受辐射(2000cGy)脾细胞的应答者。参见E.S.Yolcu等人，《免疫学杂志》，187：5901-5909(2011)。培养4天后，细胞用7AAD和针对CD4和CD8的荧光缀合的Abs染色，并通过使用BD LSR II门控活细胞以分析CFSE稀释。使用Diva软件分析数据。数据使用GraphPad Prism作图，Welch's t检验用于确定群组间的显著性，p<0.05被视为显著性的。
共聚焦显微镜。在200天的观察期后，通过浸没在干冰上的甲基丁烷(Sigma)中，在OCT化合物(Sakura Tissue-Tek)中快速冷冻长期携带胰岛的肾。使用Bright OTF5000低温切片机(Rose Scientific)将组织切成10μm厚的切片，并置于磨砂的载玻片上用于染色。将载玻片固定在4％多聚甲醛中，在0.5％Triton X-100中温育，并在0.1％牛血清白蛋白、5％山羊血清和大鼠抗小鼠CD16/CD32(BD Pharmingen)中封闭。使用兔抗胰高血糖素mAb(细胞信号传导)和豚鼠抗胰岛素多克隆抗体(Dako)作为第一抗体进行染色，然后洗涤并用AlexaFluor-647-结合的山羊抗兔抗体(Life Technologies)和AlexaFluor-555-结合的抗豚鼠抗体(Invitrogen)染色。Hoechst 33342(Molecular Probes)用于染色DNA。使用LeicaTCS SP5共焦显微镜在10倍放大下获得荧光图像。

Claims (37)

1.一种被工程化以显示FasL蛋白的生物材料。
2.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料是水凝胶。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其中所述水凝胶包含嵌合FasL蛋白，所述嵌合FasL蛋白包含FasL部分和经由生物素缀合于所述水凝胶的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白部分。
4.根据权利要求3所述的水凝胶，其中所述水凝胶是被工程化以显示生物素部分的聚乙二醇(PEG)微凝胶。
5.根据权利要求3所述的水凝胶，其中所述FasL部分是基质金属蛋白酶抗性FasL蛋白。
6.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料进一步包含免疫抑制药物。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其中所述免疫抑制药物是雷帕霉素。
8.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料还包含移植细胞。
9.根据权利要求8所述的生物材料，其在所述移植细胞被所述生物材料包封。
10.一种在有此需要的受试者中诱导免疫耐受的方法，所述方法包含向所述受试者施用生物材料，所述生物材料被工程化以以有效诱导免疫耐受的量显示FasL蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物材料是包含嵌合FasL蛋白的水凝胶，所述嵌合FasL蛋白包含FasL部分和经由生物素缀合于所述水凝胶的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述水凝胶是被工程化以显示生物素部分的聚乙二醇(PEG)微凝胶。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述FasL部分是基质金属蛋白酶抗性FasL蛋白。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者需要对移植细胞的免疫耐受。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包含施用所述移植细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物材料进一步包含所述移植细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述移植细胞被所述生物材料包封。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述移植细胞选自PBMC、骨髓细胞、造血干细胞、干细胞、间充质干细胞、树突细胞、用自身抗原脉冲的树突细胞、人β细胞产物和脾细胞。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者需要治疗1型糖尿病。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述受试者施用胰岛细胞。
21.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者需要治疗或预防同种异体移植排斥。
22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用来自同种异体移植供体的细胞。
23.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者需要治疗或预防异种移植排斥。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用来自异种移植供体的细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述异种移植供体是人、非人灵长类、猪、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。
26.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者需要治疗或预防自体移植排斥。
27.根据权利要求26所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用自体移植细胞。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述自体移植细胞通过诱导多能性获得。
29.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者需要治疗或预防自身免疫。
30.根据权利要求29所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用呈递在细胞上的自身抗原，所述细胞选自(i)表达所述自身抗原的细胞、(ii)用所述自身抗原修饰的细胞和(iii)用所述自身抗原脉冲的树突细胞。
31.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法包含将所述水凝胶移植到所述受试者中。
32.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者是人、非人灵长类、猪、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。
33.根据权利要求1至9中任一项所述的被工程化以显示FasL蛋白的生物材料，其用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受。
34.一种根据权利要求1至9中任一项所述的生物材料的用途，其用以制备用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受的药物。
35.一种根据权利要求1至9中任一项所述的生物材料的制造方法，其包含使生物素化的生物材料与嵌合FasL蛋白接触，所述嵌合FasL蛋白包含FasL部分和链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白部分。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物材料是聚乙二醇(PEG)微凝胶。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述FasL部分是基质金属蛋白酶抗性FasL蛋白。
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