KR20230116844A - 면역 체크포인트 분자로 기능화된 조작된 세포 및 이의용도 - Google Patents

면역 체크포인트 분자로 기능화된 조작된 세포 및 이의용도 Download PDF

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킨 만 아우
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더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
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Abstract

세포 표면 또는 세포 표면에 부착된 나노입자에 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함하는 기능화된 세포, 및 기능화된 세포를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 기능화된 세포(들) 및 탈세포화된 췌장-유래 단백질(들)을 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스가 또한 기술된다. 기능화된 세포 및 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 대상체에 투여함으로써 질환을 치료하는 방법이 또한 기술된다. 본원에 기술된 기능화된 세포 및 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 제조하는 방법이 또한 기술된다.

Description

면역 체크포인트 분자로 기능화된 조작된 세포 및 이의 용도
정부 지원 성명서
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여한 보조금 번호 CA198999에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 11월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 63/119,357에 대한 우선권을 주장하며, 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
면역 체계는 자가 면역을 피하기 위해 자가 항원을 용인하면서 외부 항원에 대해 강력한 면역 반응을 진화시켰다14,15. 조절 T (Treg) 세포는 항상성을 조절하고 면역관용을 유지한다28. 면역관용을 유지하지 못하면 자가면역질환이 발생한다14, 29, 30. 전신 면역억제를 유도하지 않고 자가 반응성 T 세포를 조절하는 능력은 자가면역 질환을 치료하기 위한 새로운 전략을 개발하는 주요 과제이다.
면역 체크포인트는 자기-관용을 유지하는 데 도움이 되는 면역 체계의 핵심 조절기이다.11-15, 37, 38 예를 들어, 암세포는 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4), 및 활성화된 T 세포에서 T 세포 면역글로불린 뮤신 3 (TIM-3) 신호전달과 같은 공동 억제 체크포인트 분자를 자극함으로써 면역 감시에서 벗어난다.11-15 여러 연구는 β 세포에서 면역 체크포인트 분자 예를 들어 PD-L1 (PD-1에 대한 리간드),5, 16, 17 CD86 (활성화된 T 세포에서 CTLA-4에 대한 리간드),18 및 갈렉틴-9 (Gal-9, TIM-3에 대한 리간드)19의 결핍이 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (제1형 당뇨병, T1D라고도 함)의 발병과 관련이 있음을 밝혔다. 또한, 연구는 프로그램된 사멸 1 (PD1)-PD 리간드 1 (PD-L1)37-39, 및 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4)-분화 클러스터 86 (CD86)37, 38, 40과 같은 공동억제 면역 체크포인트 경로가 미엘린 특이적 유도 Treg 세포의 발달 및 유지를 직접적으로 조절함을 발견했다 41.
최근 연구는 PD-L1 유전적 과발현 β 세포의 전신 투여가 생체 내에서 조기 발병 고혈당 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스를 역전시킬 수 있음을 입증했다.5, 16 그러나 유전적으로 조작된 β 세포를 사용하려면 상당한 유전자 조작이 필요하며, 이는 비용이 많이 들 뿐만 아니라 상당한 규제를 받아야 한다.
다발성 경화증 (MS)의 경우, 자가 반응성 T 세포가 중추신경계 (CNS)의 미엘린을 공격하여, 자가면역 신경계 장애인 다발성 경화증 (MS)을 유발하여, 뇌와 말초 시스템 간의 통신을 방해한다29, 31. 전 세계적으로 최소 250만 명이 MS의 영향을 받는다. 대부분의 환자는 초기에 가역적 신경학적 결손의 에피소드를 경험하고, 만성 신경학적 악화가 중증의 비가역적 장애로 이어지기 전에 관해가 이어진다31. 불행하게도, 이용 가능한 면역조절 요법이 항원 특이적 면역관용을 유도하여 MS 재발의 빈도와 중증도를 감소시켜32-34, 따라서 장애 축적을 지연시키기는 하지만, MS는 완전히 완치될 수 없다. 새로운 치료 전략은 염증성 병원균을 억제하고 전신 면역억제를 유발하지 않으면서 말초 면역관용을 회복시키는 항원 특이적 Treg 세포35, 36의 유도를 포함한다.
자가면역 질환의 발병을 치료하거나 지연시키고 면역 체크포인트 분자를 전신적으로 투여하기 위한 치료제에 대한 필요성이 남아 있다.
표면에 부착된 면역 체크포인트 분자를 갖는 기능화된 세포를 포함하는 조성물 및 이를 만들고 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 다음 일반 구조 중 하나를 갖는 기능화된 세포에 관한 것이다:
.
여기서, X는 1 내지 50의 정수이고, y는 1 내지 20의 정수이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하고, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 백신에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 및 약학적으로 허용 가능한 액체 비히클을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 대상체에게 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하거나 개시를 지연시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하고, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자, 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 또는 기능화된 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 대상체에게 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 조기 발병 1형 당뇨병을 역전시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하고, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자, 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 또는 기능화된 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 대상체에게 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Treg:Teff 비율을 조절하는 방법에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하고, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자, 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 또는 기능화된 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 대상체에게 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가 반응성 이펙터 T-세포를 고갈시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하고, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자, 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 또는 기능화된 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 대상체에게 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 베타 세포를 보호하는 방법에 관한 것이며, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자; 또는 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포를 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하고, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자, 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질; 또는 기능화된 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 기능화된 세포를 제조하기 위해, 아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티 또는 테트라진 모이어티를 포함하는 당조작된 모이어티를 발현하기 위해 세포를 당조작하는 단계; 및 아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티 또는 테트라진 모이어티를 통해 면역 체크포인트 분자를 공유적으로 연결하는 단계를 포함하는, 기능화된 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 기능화된 세포를 제조하기 위해 티올-말레이미드 접합을 통해 면역 체크포인트 분자를 공유 부착시키는 단계를 포함하는, 기능화된 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 세포 표지제, 예컨대 아지드 함유 시알산 유사체를 유리 약물로서 또는 나노입자 제형으로 투여한 후, 유리 체크포인트 리간드 또는 나노입자 제형으로서 세포 표지제에 접합할 수 있는 반응기를 포함하는 단일 또는 다중 면역 체크포인트 리간드를 투여하는 단계를 포함하는, 기능화된 세포를 제조하는 생체 내 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 Ac4ManNAz를 표적 세포 (예를 들어, β 세포)에 직접 전달할 수 있는 표적 전달 비히클을 투여하여, 세포 표면이 아지드 변형되는 단계; 및 아지드 변형 표면에 결합하는 DBCO-기능화 이펙터 성분 (예를 들어, DBCO-기능화 PD-L1-Ig)을 투여하는 단계로서, 여기서 표적 세포는 기능화되는 단계를 포함하는, 2-단계 사전 표적화 방법을 통해 표적 세포의 생체 내 기능화를 위한 생체 내 방법에 관한 것이다.
추가적인 양태가 또한 본원에 기술된다.
일반적인 용어로 본 발명을 설명하였으므로 이제 반드시 일정한 축척으로 도시되지 않은 첨부 도면을 참조할 것이다.
도 1은 PD-L1/CD86/Gal-9-삼중-기능화된 β 세포가 자가 반응성 T 세포를 무력화시키고 조기 발병 고혈당증을 역전시키는 의도된 메커니즘을 보여준다. (MHC는 주요 조직적합성 복합체를 표시하고; AG = 항원; TCR = T 세포 수용체.)
도 2는 대사 당조작 및 이중직교 클릭 반응을 통한 NIT-1/ β 세포의 기능화를 예시한다.
도 3a-b는 (a) 4일 동안 완전 배지에서 상이한 농도의 Ac4ManNAz로 배양한 후 NIT-1 세포의 상대적 생존력. (b) 4일 동안 배양 후 측정된 상이한 기능화된 NIT-1 세포의 상대적 생존력을 예시한다. 생존력은 비변형 NIT-1 세포의 생존력과 관련이 있었다.
도 4는 37℃에서 1시간 동안 햄의 F12 영양 혼합물 배지에서 상이한 DBCO-기능화된 A488로 배양한 후 아지드-기능화된 NIT-1 세포의 FACS 히스토그램을 예시한다.
도 5a-b는 (a) DBCO-기능화된 PD-L1 및 (b) PD-L1-Dend로 아지드-변형된 NIT-1 세포의 기능화를 예시한다.
도 6a-b는 (a) DBCO와 PD-L1의 기능화. (b) 아민-NHS 에스테르 화학 및 SPACC를 통한 아지드를 예시한다.
도 7a-c는 기능화되지 않은 및 상이한 기능화된 (a) PD-L1, (b) CD86, 및 (c) Gal-9의 크기 배제 크로마토그래프를 예시한다.
도 8a-b는 DBCO-기능화된 PAMAM G5의 제조 및 특성화를 예시한다. (a) 아민-NHS 화학을 통한 DBCO-PAMAM G5의 제조. PAMAM G5에서 반응하지 않은 1차 아민은 과량의 아세트산 무수물과 반응했다. (b) (i) 비변형 PAMAM G5 및 (ii) DBCO-기능화된 PAMAM의 1H NMR (400 MHz, D2O) 스펙트럼.
도 9는 비-기능화된 NIT-1 세포 및 상이한 TR-PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 형광 이미지를 예시한다.
도 10은 FACS 방법을 통해 기능화 후 상이한 시간에 결정된 비-기능화된 및 상이한 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 PD-L1 발현을 예시한다.
도 11은 기능화 후 상이한 시간에 기록된 상이한 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 CLSM 이미지를 예시한다. 세포를 PE 표지된 PD-L1 항체로 염색하였다.
도 12는 FACS 방법을 통해 정량화된 기능화 후 상이한 시간에 기록된 비-기능화된 NIT-1 세포 및 상이한 단일-/삼중-기능화된 NIT-1 세포의 PD-L1, CD86 및 Gal-9 발현을 예시한다.
도 13은 기능화 후 상이한 시간에 기록된 비-기능화된 NIT-1 세포 및 상이한 단일-/삼중-기능화된 NIT-1 세포의 CLSM 이미지를 예시한다.
도 14a-f는 상이한 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여가 NOD 마우스에서 조기 발병 고혈당증을 역전시키는 것을 예시한다. (a) 치료 일정. (b - d) 상이한 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여 전후에 기록된 NOD 마우스의 (b) 혈당 수준, (c) 신체 상태 지수, 및 (d) 체중 변화. (e) 고혈당 마우스의 혈당 수준은 고혈당증 발병 21일 후에 기록되었다. (f) 상이한 치료를 받은 후 마우스의 생존 곡선. p < 0.05는 통계적으로 유의함을 의미하고, p > 0.05는 통계적으로 유의하지 않음을 의미한다.
도 15a-d는 상이한 단일- 및 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여가 NOD 마우스에서 조기 개시 고혈당증을 역전시키는 것을 예시한다. (a) 치료 일정. (b) 상이한 단일- 및 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여 전후에 기록된 NOD 마우스의 혈당 수준. (c) 고혈당증 발병 후 21일째에 기록된 고혈당 마우스의 혈당 수준. (d) 상이한 치료를 받은 후 마우스의 생존 곡선. p < 0.05는 통계적으로 유의함을 의미하고, p > 0.05는 통계적으로 유의하지 않음을 의미한다.
도 16은 상이한 단일- 및 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여 전후에 기록된 NOD 마우스의 신체 상태 점수를 예시한다.
도 17은 상이한 단일- 및 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여 전후에 기록된 NOD 마우스의 체중 변화를 예시한다.
도 18a-c는 탈세포화된 췌장 ECM의 특성화를 예시한다. (a) 천연 췌장 조직 및 탈세포화된 췌장 ECM의 대표적인 H&E-염색 이미지. (b) 천연 췌장 조직 및 탈세포화된 췌장 ECM의 대표적인 오일 레드 O-염색 이미지. (c) 탈세포화된 췌장 ECM의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지.
도 19a-b는 췌장 ECM의 잠재적 시험관 내 독성을 예시한다. (a) 혈청 함유 배양 배지에서 췌장 ECM의 웰당 40 μg의 존재 및 부재하에 배양된 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 광학 현미경 이미지. (b) MTS 분석에 의해 결정된 바와 같이, 4일 동안 췌장 ECM의 존재 및 부재하에 배양 후 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 상대적 생존력.
도 20a-b는 상이한 농도의 췌장 ECM을 함유하는 무혈청 배지에서 삼중-기능화된 NIT-1의 증식을 예시한다. (a) 무혈청 배양 배지에서 췌장 ECM의 존재하에 배양된 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 광학 현미경 이미지. (b) MTS 분석에 의해 결정된 바와 같이, 4일 동안 췌장 ECM의 존재하에 배양 후 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 상대적 생존력.
도 21은 10 μg/웰의 췌장 ECM 존재하에 배양된 췌장 ECM 및 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 대표적인 SEM 이미지를 예시한다.
도 22a-d는 (a) 건강한 NOD 마우스에서 췌장 림프절에 가까운 부위에 CFSE-표지된 NIT-1 세포의 피하 주사. (b) NIT-1 세포 주입 1주 후에 기록된 무담체 및 상이한 췌장 ECM 제형에서 CFSE-표지된 NIT-1 세포로 피하 주사된 NOD 마우스의 생체 외 형광 이미지. (c) 상이한 NIT-1 세포 이식편의 평균 광자 효율. (d) 상이한 NIT-1 세포 이식편의 대표적인 H&E-염색 이미지를 예시한다.
도 23a-e는 PD-L1/CD86/Gal-9-삼중-기능화된 NIT-1 세포의 피하 투여가 NOD 마우스에서 조기 개시 고혈당증을 역전시키는 것을 예시한다. (a) 치료 일정. (b) 상이한 pan-ECM 제형에서 상이한 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 피하 투여 전후 기록된 NOD 마우스의 혈당 수준. (c) 상이한 pan-ECM 제형에서 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 피하 투여 후 기록된 NOD 마우스의 신체 상태 점수. (d) 상이한 pan-ECM 제형에서 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 피하 투여 후 기록된 NOD 마우스의 체중. (e) 상이한 치료를 받은 후 NOD 마우스의 생존 곡선. p < 0.05는 통계적으로 유의함을 의미하고, p > 0.05는 통계적으로 유의하지 않음을 의미한다.
도 24는 천연 쥐 췌장과 탈세포화 쥐 췌장 사이의 정량적 비교를 보여주는 화산 플롯 (좌측)을 예시한다. 녹색 사각형은 탈세포화 샘플에 유지되는 것으로 간주되는 단백질을 포함한다 (배수 변화 > 1). 표 (우측)는 PAN-ECM에 유지된 매트리솜(matrisome) 단백질을 요약한다 (n = 3 생물학적 반복).
도 25는 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig 이중-기능화 MOG-발현 마우스 슈반(Schwann) 세포 (MSC) 또는 희소돌기아교세포 (MOL)가 MOG-특이적 T 세포를 고갈시키는 것을 예시한다.
도 26은 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig로 MSC의 기능화를 예시한다. MSC는 처음에 Ac4ManNAz로 처리되어 아지드-변형된 MSC가 되었다. 그런 다음 DBCO-기능화된 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig는 SPACC를 통해 아지드-변형된 MSC에 접합되었다.
도 27은 아민-NHS 에스테르 화학을 통한 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig를 사용하는 DBCO-EG13-NHS 에스테르의 기능화를 예시한다. UV-가시 분광법을 통한 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig의 특성화.
도 28은 분광법을 통한 접합 후 아지드-변형된 MSC 상에 보유된 A488-표지 및 DBCO-기능화된 PD-L1 Fc-Ig 및 텍사스 레드-표지된 DBCO-기능화된 CD86 Fc-Ig의 정량화를 예시한다.
도 29는 FACS 방법에 의해 결정된 바와 같이, 비변형 및 상이한 기능화된 MSC의 시간 의존적 PD-L1 및 CD86 발현을 예시한다.
도 30은 예방 치료 (면역화 1일 후)에서 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig 이중-기능화 MSC의 투여가 EAE의 개시를 지연시키고 최대 EAE 임상 점수를 경감시킨다는 것을 예시한다.
도 31은 치료적 치료 (면역화 후 17일)에서 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig 이중-기능화 MSC의 투여가 부분적으로 EAE를 역전시키고 발병 후 EAE 점수를 경감시키는 것을 예시한다.
도 32는 PD-L1- 및 CD86-기능화된 MSC가 마우스에서 활성 EAE를 예방 및 개선함을 예시한다. 설계는 마우스에서 EAE를 예방하고 치료하기 위해 약물이 없고 LEF로 캡슐화된 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 작용 메커니즘을 설명한다. 미엘린 항원이 풍부한 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC는 미엘린 특이적 CD4+ T 세포에 미엘린 항원을 동시에 제시하고 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/CD86 면역 체크포인트 경로를 억제할 수 있다. 예방적 치료에서, i.v. 투여된 기능화된 MSC는 미엘린 특이적 CD4+ T 세포의 활성화 및 이후 병원성 Th1 및 Th17 세포로의 분화를 억제하고, 미엘린 특이적 Treg 세포의 발달을 촉진한다. 치료적 치료에서, 기능화된 MSC는 미엘린 특이적 CD4+ T 세포의 활성화를 억제하고, 병원성 Th1 및 Th17 세포를 감소시키고, 항원 특이적 Treg 세포의 발달을 촉진한다. 또한, 유도된 Treg 세포 및 i.v. 투여된 MSC는 CNS에 진입하여 병원성 Th1 및 Th17 세포 및 세포독성 T 세포의 활성화를 억제할 수 있다. 추가로, CNS 내부의 캡슐화된 LEF 방출은 자가 반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 직접적으로 억제하고 OL이 손상된 미엘린 수초를 복구하기 위해 덜 전염증성 CNS 미세환경을 생성한다. 항원 특이적 면역 요법은 전신 면역 정지를 효과적으로 예방한다. (AG = 항원, TCR = T 세포 수용체, MCH II = 주요 조직적합성 복합체 클래스 II.)
도 33a-d는 PD-L1 및 CD86 기능화된 MSC의 생체공학을 예시한다. a,(i) 생체공학 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig는 DBCO-기능화된 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig로 대사 당조작에 이어 SPAAC를 통해 MSC를 직접 기능화했다. (ii, iii) 비변형 및 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig의 크기 분포 (ii), PD-L1, 및 CD86 발현 (iii)은 MSC를 직접 기능화했다. b,(i) 무약물 DBCO 및 MTZ 이중-기능화 PEG-PLGA NP (DBCO/MTZ NP) 및 LEF-캡슐화 DBCO/MTZ NP (DBCO/MTZ LEF NP)의 구조. (ii, iii) 무약물 및 LEF-캡슐화 DBCO 및 MTZ 이중-기능화 NP의 TEM 이미지 (ii), 및 강도-평균 직경 (Dh) 분포 (iii). (iv) 과량의 PBS가 존재하는 생리학적 조건에서 LEF-캡슐화 DBCO 및 MTZ 이중-기능화 NP의 약물 방출 프로파일. c,(i) PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig NP-이중-기능화 MSC의 생체공학. 이중-기능화 MSC는 3단계를 통해 조작되었다: 첫째, Ac4ManNAZ의 대사 표지는 아지드-변형된 MSC를 제공했다; 둘째, 생리학적 조건에서 SPAAC를 통해 DBCO/MTZ NP (또는 DBCO/MTZ LEF NP)를 아지드-변형된 MSC에 접합; 마지막으로, 생리학적 조건에서 IEDDA를 통해 TCO-기능화된 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig를 DBCO/MTZ NP-기능화 MSC에 생체접합. (ii-iv) 비변형 및 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig NP-기능화 MSC의 크기 분포 (ii), 주사 전자 현미경(SEM) 이미지 (iii), 및 PD-L1 및 CD86 발현 (iv). 위족은 비변형 및 기능화된 MSC 모두의 SME 이미지에서 식별할 수 있다. SEM 이미지의 빨간색 화살표는 MSC의 표면에 이식된 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP를 강조 표시했다. d, 다양한-기능화된 MSC의 대표적인 CLSM 이미지.
도 34a-e는 PD-L1- 및 CD86-기능화된 MSC가 미엘린 특이적 T 세포에서 PD-1 및 CTLA-4 경로를 상향 조절하고, T 세포 활성화를 하향 조절하고 시험관 내 유도된 조절 T 세포의 발달을 촉진한다는 것을 예시한다. a,b, FACS 분석에 의해 결정된 바와 같이, 48시간 동안 상이한 유형의 PD-L1-Ig- 및/또는 CD86-Ig-기능화된 MSC로 배양한 후 미엘린 특이적 2D2 T 세포의 PD-1 (a), 및 CTLA-4 (b) 발현. 세포는 처음에 CD3+ 세포에서 게이팅되었다. (n = 4) c,d, 상이한 기능화된 MSC로 배양한 후 2D2 CD4+ T 세포에 분비된 INF-감마 (c) 및 IL-17A (d)의 ELISA 분석. ELISA 분석을 위해 배양 48시간 후 상청액을 수집하였다. (n = 4) e, FACS를 통해 48시간 동안 상이한 기능화된 MSC로 배양한 후 2D2 CD4+ T 세포에서 IL-10+ 및 FoxP3+ 집단의 정량화. 세포는 처음에 CD3+ 세포에서 게이팅되었다. (n = 3).
도 35a-e는 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig 직접 기능화된 MSC가 생체 내에서 예방적 및 치료적으로 MOG35-55-유도된 EAE를 억제함을 예시한다. a, MOG35-55 펩티드로 면역화 후 예방적 및 치료적 치료 일정. 2×106개의 비변형 또는 기능화된 MSC를 면역화 후 (p.i.) 1일 (예방적 치료) 또는 17일 (치료적 치료)에 i.v. 투여하였다. 신체 상태를 p.i. 35일까지 매일 모니터링하였다. 마우스를 p.i. 36일 또는 37일에 안락사시켰다. 추가 조직병리학적 연구를 위해 척추를 보존하였다. b, 상이한 예방적 또는 치료적 치료를 받은 후 EAE에 걸린 마우스의 시간 의존적 평균 임상 점수. 치료가 없는 경우, EAE는 부분적 꼬리 마비 (점수 0.5)에서, 완전 꼬리 마비 (점수 1.0), 절뚝거리는 꼬리 및 뒷다리 억제 (점수 1.5), 절뚝거리는 꼬리 및 뒷다리 쇠약 (점수 2.0), 절뚝거리는 꼬리 및 한쪽 다리에 움직임이 없음 (점수 2.5), 완전한 뒷다리 마비 (점수 3.0)로 진행한다. (그룹당 n = 9 마우스.) c, 상이한 치료를 받은 후 EAE에 걸린 마우스의 누적 EAE 점수. d,(i) 직접 기능화된 MSC로 상이한 예방적 및 치료적 치료를 받은 후 건강한 질환이 없는 마우스 및 EAE에 걸린 마우스로부터 보존한 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)-염색된 척수 절편. (ii) 척수의 H&E-염색 이미지로부터 척수 염증의 정량화. (비-치료 그룹의 경우 n = 3; 예방적 치료 그룹 모두의 경우 n = 8; 비-기능화된 MSC로 치료한 치료적 치료 그룹의 경우 n = 7; 기능화된 MSC로 치료한 치료적 치료 그룹의 경우 n = 6.) e,(i) 직접 기능화된 MSC로 상이한 예방적 및 치료적 치료를 받은 후 건강한 질환이 없는 마우스 및 EAE에 걸린 마우스로부터 보존한 대표적인 Luxol fast 블루 (LFB)-염색된 척수 절편. 미엘린 섬유 및 인지질은 파란색에서 녹색으로, 뉴로필은 분홍색으로, 신경 세포는 보라색으로 나타난다. (ii) 척수의 LFB-염색 이미지로부터 탈수초화의 정량화. (비-치료 그룹의 경우 n = 3; 예방적 치료 그룹 모두의 경우 n = 8; 비-기능화된 MSC로 치료된 치료적 치료 그룹의 경우 n = 7; 기능화된 MSC로 치료된 치료적 치료 그룹의 경우 n = 6.)
도 36a-h는 PD-L1- 및 CD86-NP-기능화 MSC가 생체 내에서, 예방적으로, 및 치료적으로 진행성 만성 MOG35-55-EAE 모델 및 재발 완화 PLP178-191-EAE 모델을 효과적으로 억제함을 예시한다. a, MOG35-55 펩티드로 면역화 후 C57BL/6 마우스에서 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용하는 예방적 및 치료적 치료 일정. 비변형 또는 기능화된 MSC를 p.i. 1일 (예방적 치료) 또는 17일 (치료적 치료)에 i.v. 투여하였다. 신체 상태를 p.i. 35일까지 매일 모니터링하였다. 마우스를 p.i. 36일 또는 37일에 안락사시켰고, 척추는 추가적인 조직병리학적 연구를 위해 보존하였다. 대조군 치료 그룹 2, 3, 6, 및 7에서, 유리 또는 NP 접합된 PD-L1 Fc-Ig, 및 CD86 Fc-Ig (플러스 캡슐화되지 않은 LEF)를 비-기능화된 MSC를 20분 전에 i.v. 투여하였다. b, 상이한 예방적 및 치료적 치료를 받은 후 MOG35-55-유도된 EAE에 걸린 마우스의 시간 의존적 평균 임상 점수. (그룹당 마우스 n = 8; 1마리의 비-치료 그룹 마우스는 p.i. 28일에 죽은 것으로 발견됨) c, 상이한 치료를 받은 후 MOG35-55-EAE에 걸린 마우스의 누적 EAE 점수. d,(i) 무약물/LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 상이한 예방적 및 치료적 치료를 받은 후 EAE에 걸린 마우스로부터 보존된 대표적인 H&E-염색된 척수 절편. (ii) 척수의 H&E-염색 이미지로부터 척수 염증의 정량화. (비-치료 그룹의 경우 n = 3; 예방적 치료 그룹 및 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 치료된 치료적 치료 그룹의 경우 n = 6; PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 치료된 치료적 치료 그룹의 경우 n = 7.) e,(i) 무약물/LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 상이한 예방적 및 치료적 치료를 받은 후 EAE에 걸린 마우스로부터 보존된 대표적인 LFB-염색된 척수 절편. (ii) 척수의 LFB-염색 이미지로부터 탈수초화의 정량화. (비-치료 그룹의 경우 n = 3; 예방적 치료 그룹 및 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC 로 치료된 치료적 치료 그룹의 경우 n = 6; PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC 로 치료된 치료적 치료 그룹의 경우 n = 7.) f, PLP178-191 펩티드로 면역화 후 C57BL/6 마우스에서 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용하는 예방적 및 치료적 치료 일정. 비변형 또는 기능화된 MSC를 p.i. 1일 (예방적 치료) 또는 18일 (치료적 치료)에 i.v. 투여하였다. 신체 상태를 p.i. 35일까지 모니터링하였다 g, 상이한 예방적 및 치료적 치료를 받은 후 MOG35-55-유도된 EAE에 걸린 마우스의 시간 의존적 평균 임상 점수. (그룹당 마우스 n = 8, 비변형 MSC를 사용한 치료적 치료 그룹의 경우 제외 n = 7.) h, 상이한 치료를 받은 후 PLP178-191-EAE에 걸린 마우스의 누적 EAE 점수.
도 37a-e는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 MOG35-55-EAE 마우스 모델에서 MOG-특이적 Treg 세포의 발달을 효과적으로 촉진한다는 것을 예시한다. a, 상이한 예방적 치료 3일 후 (p.i. 5일) EAE에 걸린 마우스에서 비장 MOG-특이적 (i) Th1, (ii) Th17, 및 (iii) Treg 세포 집단. (n = 5) b, 상이한 치료적 치료 3일 후 (p.i. 5일) EAE에 걸린 마우스에서 비장 MOG-특이적 (i) Th1, (ii) Th17, 및 (iii) Treg 세포 집단. 상이한 치료적 치료 3일 후 (p.i. 21일) EAE에 걸린 마우스의 척수에서 MOG-특이적 (iv) Th1, (v) Th17 및 (vi) Treg 세포, 및 (vii) 항원 비-특이적 INF-γ+ 세포독성 T 세포 집단. (n = 5) c, 상이한 예방적 및 치료적 치료 후 p.i. 38일 EAE에 걸린 마우스에서 비장 MOG-특이적 Treg 세포 집단. (n = 6) d, p.i. 38일 비-처리된 EAE에 걸린 마우스 및 상이한 처리된 EAE에 걸린 마우스로부터 보존된 척수의 대표적인 항-CD4- 및 항-FoxP3-염색된 면역형광 이미지 e, Treg 세포가 고갈되거나 고갈되지 않은 MOG35-55-면역화된 마우스에서 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 예방적 및 치료적 치료. Treg 세포 고갈을 달성하기 위해 MSC로 치료하기 전후 항-CD25 (주사당 200 μg)의 3회 복강 내 (i.p.) 주사를 받은 Treg 세포 고갈 그룹의 마우스. (iii) 상이한 (i) 예방적 및 (ii) 치료적 치료를 받은 후 MOG35-55-유도된 EAE에 걸린 마우스의 시간 의존적 평균 임상 점수. (iii) Treg 세포가 고갈되거나 고갈되지 않은 상이한 치료를 받은 후 MOG35-55-EAE에 걸린 마우스의 누적 EAE 점수. (n = 6).
도 38은 MSC 및 MOL이 공통 미엘린 항원을 발현함을 예시한다. 항-MOG- 및 항-PLP1-염색된 MSC, MOL, 및 MIN6 세포 (C57BL/6 마우스로부터 분리한 인슐린종 세포)의 대표적인 FACS 히스토그램. 항-MOG 및 항-PLP1 토끼 다클론 항체 둘 다 A488-표지된 염소 항-토끼 IgG를 통해 표지되었다. MIN6 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 39a-d는 소분자 Ac4ManNAz, 소분자 LEF와 함께 배양한 후, 및 생체접합 후에 MSC 및 MOL이 생존 가능하게 남아있음을 예시한다. a, MTS 분석에 의해 정량화된, 상이한 농도의 소분자 Ac4ManNAz와 함께 배양한 후 MSC 및 MOL의 시험관 내 생존력. b, MTS 분석에 의해 정량화된, 상이한 농도의 소분자 LEF와 함께 배양한 후 MSC 및 MOL의 시험관 내 생존력. 소분자 LEF는 MSC에 대해 중등도의 시험관 내 독성 및 MOL에 대해 미미한 독성을 보였다. 이는 LEF가 손상된 미엘린을 복구하기 위해 OL (이미 CNS에 있음)에 영향을 미치지 않을 것임을 시사한다. c, MTS 분석에 의해 결정된 상이한 직접적으로 기능화된 MSC의 상대적 생존력. d, 분석에 의해 결정된 무약물 및 LEF-로딩된 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC 및 MOL, MTS의 상대적 생존력. (n = 8)
도 40a-d는 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 DBCO-기능화된 CD86-Ig의 특성화를 예시한다. a, 도식은 상이한 목표 기능화 정도 (Df, 표적)로 아민-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 커플링 반응을 통한 PD-L1 및 CD86-Ig 융합 단백질에 대한 DBCO-기능화된 에틸렌 글리콜 (EG)의 공유 접합을 예시한다. b, 상이한 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig 융합 단백질 (1 mg/mL)의 UV-가시광선 흡수 스펙트럼. c, PD-L1-Ig 및 CD86-Ig의 실제 기능화 정도의 플롯. 45의 Df, 표적에서 제조된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (8개의 접합된 DBCO를 가짐) 및 DBCO-기능화된 CD86-Ig (9개의 접합된 DBCO를 가짐)를 MSC 및 MOL의 기능화에 사용했다. d, 우측 스펙트럼, TCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig (1 mg/mL)의 UV- 가시광선 흡수 스펙트럼. TCO-기능화된 융합 단백질 모두 45의 목표 기능화 정도로 DBCO-기능화된 융합 단백질과 함께 기능화되었고; 그리고 왼쪽 스펙트럼, 1시간 동안 37℃에서 5몰 당량의 Cy5 테트라진 (프로브)로 반응시킨 후 정제된 TCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig의 UV-가시광선 흡수 스펙트럼 (1 mg/mL로 정규화됨). 반응은 혈청 및 페놀 레드가 없는 DMEM 배지에서 0.5 mg/mL의 단백질 농도에서 수행되었다 (MSC의 기능화에 사용되는 동일한 융합 단백질 농도). 비반응성 염료 및 DMEM을 PD-10 탈염 컬럼을 통해 제거하였다. 덜 접합된 활성 TCO를 함유하는 두 기능화된 융합 단백질을 PD-10 탈염 컬럼을 통해 제거하였다. 기본 접합 조건에서 트랜스-시스 이성질화가 접합된 TCO와 함께 반응하는 배양 배지에서 TCO 리간드 및 티올을 불활성화하기 때문에 DBCO 리간드로 기능화된 것보다 기능화된 융합 단백질 모두 덜 접합된 활성 TCO (융합 단백질당 평균 2개의 2개의 활성 TCO 분자)를 함유한다.
도 41은 A488-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 텍사스 레드-표지된 DBCO-기능화된 CD86-Ig의 특성화를 예시한다. 비-표지된 DBCO-기능화된 융합 PD-L1-Ig, CD86-Ig, A488-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 융합 단백질, 및 텍사스 레드-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 융합 단백질의 대표적인 UV-가시광선 스펙트럼. 기능화된 PD-L1-Ig 융합 단백질은 평균 1개의 접합된 A488 분자를 포함하는 것으로 계산되었다. 기능화된 CD86-Ig 융합 단백질은 평균 2개의 접합된 텍사스 레드 분자를 포함한다.
도 42는 공유적으로 접합된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig가 생리학적 조건에서 단일- 및 이중-기능화 MSC로부터 점진적으로 분리됨을 예시한다. 형광 분광법을 통한 생리학적 조건에서 단일-및 이중-기능화 MSC로부터 A488-표지된 PD-L1-Ig 및 텍사스 레드-표지된 CD86-Ig로부터 분리율의 정량화. 접합된 융합 단백질의 약 절반이 접합 후 24시간 이내에 MSC에서 분리되었다. (n = 8, 웰당 세포 접종 밀도 = 10,000개의 세포.)
도 43은 PD-L1-Ig/CD86-Ig Cy5-표지된 NP가 생리학적 조건에서 MSC로부터 서서히 분리되었음을 예시한다. 형광 분광법을 통한 생리학적 조건에서 MSC로부터 PD-L1-Ig/CD86-Ig-접합된 Cy5-표지된 NP의 분리율의 정량화. 접합된 Cy5-표지된 NP의 약 절반이 기능화 후 48시간 동안 MSC에 유지되었다. (n = 8, 세포 접종 밀도 = 웰당 10,000개 세포.)
도 44a-b는 PD-L1-Ig/CD86-Ig 단일-/이중- 직접 기능화된 MSC의 PD-L1 및 CD86 발현이 점진적으로 감소함을 예시한다. a, 대표적인 FACS 히스토그램은 PE-표지된 PD-L1 및 A488-표지된 CD86으로 염색한 후 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig 단일- 또는 이중- 직접 기능화된 MSC의 PD-L1 및 CD86 발현을 보여준다. PD-L1 및 CD86 발현은 기능화 3일 후 배경 수준으로 감소했다. (n = 3) b, 대표적인 FACS 히스토그램은 생리학적 조건에서 1시간 동안 PD-L1-Ig 및/또는 CD86-Ig 와 함께 배양한 후 PD-L1 및 CD86 발현 비변형 (아지도-없음) MSC를 보여준다. 배양된 세포는 FACS 연구를 위해 항-PD-L1 및 항-CD86 항체로 염색하기 전에 세척했다. FACS 연구는 생체접합 과정이 FcIg 융합 단백질의 유의한 비특이적 결합을 유도하지 않는다는 것을 확인했다.
도 45a-b는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP가 기능화 후 아지드-변형된 MSC의 표면으로부터 서서히 분리됨을 예시한다. a, 대표적인 FACS 히스토그램은 기능화 후 상이한 시간에 기록된 PD-L1-Ig/CD86-Ig Cy5-표지된 NP-기능화 MSC의 Cy5 형광 강도를 보여준다. b, 대표적인 FACS 히스토그램은 PE-표지된 PD-L1 및 A488-표지된 CD86로 염색한 후 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig NP-기능화 MSC의 PD-L1 및 CD86 발현을 보여준다. PD-L1 및 CD86 발현은 기능화 3일 후 배경 수준으로 천천히 감소한다. (n = 3).
도 46은 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP가 기능화 후 아지드-변형된 MOL의 표면으로부터 서서히 분리됨을 예시한다. 대표적인 FACS 히스토그램은 PE-표지된 PD-L1 및 A488-표지된 CD86으로 염색한 후 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig NP-기능화 MOL의 PD-L1 및 CD86 발현을 보여준다. PD-L1 및 CD86 발현은 기능화 3일 후 배경 수준으로 천천히 감소한다. (n = 3).
도 47은 아지드-변형된 MSC의 표면에 대한 PD-L1-Ig 및/또는 CD86-Ig의 성공적인 접합을 예시한다. PE-표지된 항-PD-L1 및 A488-표지된 항-CD86 항체로 염색한 후 비변형 및 기능화된 MSC의 대표적인 CLSM 이미지.
도 48a-b는 PD-L1- 및 CD86-생체조작된 MSC가 배양된 2D2 세포의 PD1 및 CTLA-4 발현을 상향 조절함을 예시한다. a, 48시간 동안 10:1의 효과기:표적 비율 (E/T)로 상이한 기능화된 MSC와 함께 배양한 후 A488-표지된 항-PD-1 염색된 2D2 세포 (MOG-특이적 CD4+ 세포)의 대표적인 FACS 히스토그램. b, 48시간 동안 10:1의 E/T 비율로 상이한 기능화된 MSC와 함께 배양한 후 PE-표지된 항-CTLA-4 염색된 2D2 세포 (MOG-특이적 CD4+ 세포)의 대표적인 FACS 히스토그램.
도 49는 PD-L1-및 CD86-생체조작된 MSC가 항원-특이적 IL10+ FoxP3+ Treg 세포의 발달을 촉진함을 예시한다. 3일 동안 10:1의 E/T 비율로 상이한 기능화된 MSC 와 함께 배양한 후 A488-표지된 항-FoxP3- 및 PE-표지된 항-IL10-세포 내 염색된 2D2 세포의 대표적인 2차원 FACS 플롯. 생체조작된 MSC는 IL10+ 및 FoxP3+ Treg 세포의 발달을 촉진한다. 세포는 처음에 CD3+ 세포에서 게이팅되었다. (n = 3).
도 50a-b는 PD-L1-및 CD86-생체조작된 MOL이 배양된 2D2 세포의 PD1 및 CTLA-4 발현을 상향 조절함을 예시한다. a, 48시간 동안 10:1의 E/T로 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL과 함께 배양한 후 A488-표지된 항-PD-1 염색된 2D2 세포 (MOG-특이적 CD4+ 세포)의 대표적인 FACS 히스토그램. b, 48시간 동안 10:1의 E/T로 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL과 함께 배양한 후 PE-표지된 항-CTLA-4 염색된 2D2 세포 (MOG-특이적 CD4+ 세포)의 대표적인 FACS 히스토그램. (n = 4).
도 51은 PD-L1-및 CD86-생체조작된 MOL이 병원성 CD4+ 세포의 증식을 억제함을 예시한다. ELISA 방법에 의해 정량화된, IFN-γ 및 IL-17A는 48시간 동안 10:1의 E/T로 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL과 함께 배양한 후 2D2 세포로부터 방출된다. (n = 4).
도 52는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL이 항원-특이적 IL10+ FoxP3+ Treg 세포의 발달을 촉진함을 예시한다. A488-표지된 항-FoxP3- 및 PE-표지된 항-IL10- 세포 내 염색된 2D2 세포의 대표적인 2차원 FACS 플롯을 3일 동안 10:1의 E/T로 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL과 배양하였다. 생체조작된 MSC가 IL10+ 및 FoxP3+ Treg 세포의 발달을 촉진한다. 세포는 처음에 CD3+ 세포에서 게이팅되었다.
도 53은 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 항원-비-특이적 거동에서 자극된 세포독성 T 세포의 증식을 억제함을 예시한다. 48시간 동안 1:1의 E: T로 상이한 기능화된 MSC와 함께 배양한 후 CFSE-표지된 CD8+ T 세포 (야생형 C57BL/6 마우스로부터 분리됨)의 CFSE-희석 검정. 세포독성 T 세포를 자극 조건 (즉, 1:1 몰비의 Dynabeads T 세포 활성화 비드의 존재) 하에서 배양하였다. 세포독성 T 세포의 증식은 FACS 방법을 통해 정량화했다. 세포는 처음에 CD8+ 세포에서 게이팅되었다. (n = 4).
도 54a-c는 비변형 MSC 및 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 정맥 내 투여가 장기 부작용을 일으키지 않았음을 예시한다. a, 비변형 MSC 또는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC (2×106 세포/마우스)의 i.v. 투여 후 건강한 미처리 C57BL/6 마우스 (암컷, 약 15주령) 및 건강한 C57BL/6 마우스로부터 수집한 혈액 샘플의 임상 화학. 혈액 샘플은 MSC 투여 5주 후에 수집되었다. b, 비변형 MSC 또는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC (2×106 세포/마우스)의 i.v. 투여 후 건강한 C57BL/6 마우스의 체중 변화. 빨간색 점선은 각 혈액 화학 매개변수의 정상 범위를 나타낸다. c, C57BL/6 마우스 MSC 또는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 i.v. 투여 5주 후 보존된 대표적인 H&E-염색된 심장, 폐, 비장, 신장, 및 간 세션. (n = 6, PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 i.v. 투여한 실험 그룹의 경우만 제외 n = 8.)
도 55a-c는 PD-L1-Ig/CD86-Ig 직접 기능화된 MSC가 예방적 및 치료적으로 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 억제함을 예시한다. a, 비변형 또는 상이한 직접 기능화된 MSC (마우스당 2×106 세포, i.v. 주사를 통함)로 (p.i. 1일에) 예방적 치료를 받은 후 마우스에서 최대 EAE 점수. b, 비변형 또는 상이한 직접 기능화된 MSC로 (p.i. 1일에) 예방적 치료를 받은 후 (p.i. 35일에) MOG-유도된 EAE 마우스의 EAE 점수. c, 비변형 및 직접 기능화된 MSC로 (p.i. 17일에) 치료적 치료를 받은 후 (p.i. 35일에) MOG-유도된 EAE 마우스의 EAE 점수. (n = 9).
도 56은 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 척수 염증을 억제하여 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 효과적으로 예방하고 개선함을 예시한다. 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 예방적 및 치료적 치료 후 건강한 및 EAE에 걸린 마우스의 대표적인 H&E-염색된 척수 단면 (및 해당 염증 점수). 마우스는 p.i. 1일에 예방적 치료를 받았고, p.i. 17일에 치료적 치료를 받았다. 척추를 p.i. 36일 또는 37일에 보존했다.
도 57은 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC 탈수초화를 예방하여 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 효과적으로 예방하고 개선함을 예시한다. 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 예방적 및 치료적 치료 후 건강한 및 EAE에 걸린 마우스의 대표적인 LEF-염색된 척수 단면 (및 해당 염증 점수). 마우스는 p.i. 1일에 예방적 치료를 받았고, p.i. 17일에 치료적 치료를 받았다. 척추를 p.i. 36일 또는 37일에 보존했다.
도 58a-c는 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC가 예방적 및 치료적으로 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 억제함을 예시한다. a, 비변형 또는 상이한 NP 기능화된 MSC (마우스당 2×106 세포, i.v. 주사를 통함)로 (p.i. 1일에) 예방적 치료를 받은 후 마우스에서 최대 EAE 점수. b, 비변형 또는 상이한 NP 기능화된 MSC로 (p.i. 1일에) 예방적 치료를 받은 후 (p.i. 35일에) MOG-유도된 EAE 마우스의 EAE 점수. c, 비변형 또는 상이한 NP 기능화된 MSC로 (p.i. 17일에) 치료적 치료를 받은 후 (p.i. 35일에) MOG-유도된 EAE 마우스의 EAE 점수. (마우스 그룹당 n = 8; 1마리의 비-치료 그룹 마우스가 p.i. 28일에 죽은 것으로 발견됨)
도 59a-e는 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC 가 MOG35-55-유도된 EAE 모델에서 중증 EAE 증상의 발달을 예방하는데 동등하게 효과적이라는 것을 예시한다. a, 예방적 치료 일정. 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC (마우스당 2×106 세포)를 p.i. 24시간에 i.v. 투여하였다 b, 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 예방적 치료 후 시간 의존적 EAE 점수. c, 상이한 예방적 치료 후 최대 EAE. d, 상이한 예방적 치료 후 p.i. 35일에 기록된 EAE 점수. e, 상이한 예방적 치료 후 누적 EAE 점수 (최대 p.i. 35일). (n = 6)
도 60은 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 척수 염증을 억제하여 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 효과적으로 예방하고 개선함을 예시한다. 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 예방적 및 치료적 치료 후 건강한 및 EAE에 걸린 마우스의 대표적인 H&E-염색된 척수 단면 (및 해당 염증 점수). 마우스는 p.i. 1일에 예방적 치료를 받았고, p.i. 17일에 치료적 치료를 받았다. 척추를 p.i. 36일 또는 37일에 보존했다.
도 61은 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 탈수초화를 예방하여 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 효과적으로 예방하고 개선함을 예시한다. 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 예방적 및 치료적 치료 후 건강한 및 EAE에 걸린 마우스의 대표적인 LEF-염색된 척수 단면 (및 해당 염증 점수). 마우스는 p.i. 1일에 예방적 치료를 받았고, p.i. 17일에 치료적 치료를 받았다. 척추를 p.i. 36일 또는 37일에 보존했다.
도 62a-c는 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 치료적 치료의 부스터 용량이 활성 MOG35-55-유도된 EAE를 억제하는데 더 효과적임을 예시한다. a, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC (마우스당 2×106 세포)로 치료적 치료 (p.i. 18일 및 36일) 후 시간 의존적 EAE 점수. b, EAE 점수를 p.i. 35일 (2차 치료 전) 및 50일 (연구 종점)에 기록했다. c, 오른쪽: 1차 치료 후 p.i. 18일에서 36일 사이에 기록된 비-치료 및 치료적 치료 그룹의 누적 EAE 점수; 왼쪽: 2차 치료 후 p.i. 37일에서 50일 사이에 기록된 비-치료 및 치료적 치료 그룹의 누적 EAE 점수. (n = 6. 본 연구에서 보고된 마우스는 기계론적 연구에서 보고된 비-치료 그룹 및 치료적 치료 그룹 (Treg 세포 고갈 없음) 마우스와 동일하였다 (통계 분석은 p.i. 28일에 종료됨).)
도 63은 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC가 예방적 및 치료적으로 활성 PLP178-191-유도된 EAE를 억제함을 예시한다. 비변형 또는 상이한 NP 기능화된 MSC로 예방적 치료 (p.i. 1일) 또는 치료적 치료 (p.i. 18일)를 받은 후 PLP178-191-유도된 EAE 마우스 (p.i. 35일에 기록됨)의 EAE 점수. (그룹당 n = 8 마우스, 비변형 MSC를 사용한 치료적 치료 그룹의 경우만 n = 7.)
도 64a-c는 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC의 치료적 치료의 2차 용량이 활성 PLP178-191-유도된 EAE를 효과적으로 억제함을 예시한다. a, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC (마우스당 2×106 세포)로 치료적 치료 (p.i. 18일 및 35일) 후 시간 의존적 EAE 점수. 플롯의 기울기는 질환의 진행을 나타낸다. 어떠한 치료도 하지 않은 경우, 진행률은 0.0038 day-1였다. 질환 진행률은 1차 치료적 치료 후 0.0402 day-1였다. 질환 진행률은 2차 치료적 치료 후 0.0044 day-1로 떨어졌다. b, 1차 치료 후 p.i. 18일에서 35일 사이에 기록된 비-치료 및 치료적 치료 그룹 EAE에 걸린 마우스의 누적 EAE 점수. c, 2차 치료 후 p.i. 35일에서 70일 사이에 기록된 비-치료 및 치료적 치료 그룹 EAE에 걸린 마우스의 누적 EAE 점수. (n = 8; 치료적 치료 그룹 6 중 1마리의 마우스가 p.i. 37일에 사망한 것으로 발견되었다 (2차 치료 후 1일).)
도 65a-c는 50 Gy X-선 조사가 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사멸시킨다는 것을 예시한다. a, 비-조사 및 50 Gy X-선 조사 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC의 시간 의존적 광학 현미경 이미지. b, 조사 후 상이한 시간에 50 Gy X-선 조사 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC의 상대적 생존력. (n = 8) c, 생리학적 조건에서 10일 동안 배양한 후의 비 조사 및 50 Gy X-선 조사 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC의 디지털 사진. 콜로니는 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다.
도 66a-d는 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL이 MOG35-55-면역화된 EAE 마우스에서 효과적으로 개선됨을 예시한다. a, 치료적 치료 일정. 비변형 MOL 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL (2×106 세포 마우스당)를 p.i. 17시간에 i.v. 투여하였다 b, LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL을 사용한 치료적 치료 후 시간 의존적 EAE 점수. c, 상이한 치료적 치료 후 p.i. 35일에 기록된 EAE 점수. d, 치료적 치료 후 누적 EAE 점수 (최대 p.i. 35일). (n = 7, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MOL을 사용한 치료적 치료 그룹의 경우만 n = 8.)
도 67a-c는 무약물/LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC 및 MOL의 근육 내 투여가 MOG35-55-유도된-유도된 EAE를 효과적으로 개선함을 예시한다. a, p.i. 18일 및 28일에 무약물/LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC 및 MOL의 2회 i.m.으로 상이한 치료적 치료 후 시간 의존적 EAE 점수 b, 1차 치료적 치료 후 누적 EAE 점수. c, 2차 치료적 치료 후 누적 EAE 점수.
도 68a-c는 MOG35-55-유도된 EAE 마우스에서 i.v. 투여된 비-기능화 및 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 VT680-표지된 MSC의 생체분포를 예시한다. a, 생체 외 이미징 일정. EAE에 걸린 마우스를 예방적 연구 (3일째) 또는 치료적 연구 (19일째)에서 상이한 VT680-표지된 MSC의 i.v. 투여 48시간 후 안락사시켰다. b, 비-치료 및 상이한 치료 그룹 마우스로부터 보존된 뇌 (BR), 폐 (LU), 심장 (HE), 간 (LI), 비장 (SP), 신장 (KI), 및 척수 (SC)의 생체 외 형광 이미지. c, i.v. 투여된 VT680-표지된 MSC의 생체분포. (n = 5).
도 69a-c는 MOG35-55-유도된 EAE 마우스에서 i.v. 투여된 비-기능화 및 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 VT680-표지된 MSC의 생체분포를 예시한다. a, 생체 외 이미징 일정. EAE에 걸린 마우스를 예방적 연구 (3일째) 또는 치료적 연구 (19일째)에서 상이한 VT680-표지된 MSC의 i.v. 투여 48시간 후 안락사시켰다. b, 비-치료 및 상이한 치료 그룹 마우스로부터 보존된 뇌 (BR) 및 척수 (SC)의 생체 외 형광 이미지. c, i.v. 투여된 VT680-표지된 MSC의 생체분포. (n = 5)
도 70은 척수 및 비장에서 자가 반응성 CD8+ T 세포 및 상이한 MOG-특이적 CD4+ T 세포 집단을 분석하기 위한 대표적인 FACS 게이팅 전략을 예시한다. 다이어그램은 분리된 척추 림프구에서 IFN-γ+ CD8+ T 세포 (자가 반응성 세포독성 T 세포), MOG-특이적 병원성 Th1 (MOG+ IFN-γ+ CD4+) 및 Th17 (MOG+ IL17A+ CD4+) 세포, 및 억제성 Treg 세포 (MOG+ FoxP3+ CD4+) 분석을 위한 게이팅 전략을 요약한다. 분리된 비장 림프구에서 MOG-특이적 Th1 (MOG+ T-bet+ CD4+), Th17 (MOG+ RORγt+ CD4+), 및 Treg 세포 (MOG+ FoxP3+ CD4+)를 분리하기 위해 동일한 게이팅 전략을 사용하였다.
도 71a-c는 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 심각한 EAE 증상의 발달을 예방하기 위해 비장 MOG-특이적 Treg 세포의 발달을 유도하는 데 동등하게 효과적이라는 것을 설명한다. a, 상이한 치료적 치료 3일 후 비장에서 병원성 MOG+ T-bet+ 헬퍼 T 세포 (Th1 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. b, 상이한 치료적 치료 3일 후 비장에서 병원성 MOG+ RORγt+ 헬퍼 T 세포 (Th17 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. c, 상이한 치료적 치료 3일 후 비장에서 억제성 MOG+ FoxP3+ 헬퍼 T 세포 (Treg 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯.
도 72a-c는 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 심각한 EAE 증상을 개선하기 위해 비장 MOG-특이적 Treg 세포의 발달을 유도하는 데 동등하게 효과적이라는 것을 설명한다. a, 상이한 치료적 치료 3일 후 비장에서 병원성 MOG+ T-bet+ 헬퍼 T 세포 (Th1 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. b, 상이한 치료적 치료 3일 후 비장에서 병원성 MOG+ RORγt+ 헬퍼 T 세포 (Th17 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. c, 상이한 치료적 치료 3일 후 비장에서 억제성 MOG+ FoxP3+ 헬퍼 T 세포 (Treg s)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯.
도 73a-d는 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC가 EAE 증상을 개선하기 위해 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC보다 척수에서 자가 반응성 세포독성 T 세포를 억제하고 척수 MOG-특이적 Treg 세포의 발달을 유도하는데 더 효과적이라는 것을 설명한다. a, 척수에서 상이한 치료적 치료 3일 후 병원성 MOG+ INF-γ+ 헬퍼 T 세포 (Th1 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. b, 척수에서 상이한 치료적 치료 3일 후 병원성 MOG+ IL17A+ 헬퍼 T 세포 (Th17 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. c, 척수에서 상이한 치료적 치료 3일 후 억제성 MOG+ FoxP3+ 헬퍼 T 세포 (Treg 세포)의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. d, 척수에서 상이한 치료적 치료 3일 후 자가 반응성 INF-γ+ 세포독성 T 세포의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯.
도 74는 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 예방적 및 치료적 치료 후 오랫동안 억제성 Treg 세포의 발달을 유도했음을 설명한다. 비장에서 상이한 예방적 및 치료적 치료 p.i. 38일 후 억제성 MOG+ FoxP3+ Treg 세포의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯.
도 75는 조기 발병 T1DM을 역전시키기 위해 β 세포의 생체 내 생체공학을 위한 2-단계, 2-성분 사전표적화 전략을 통한 PD-L1-Ig를 사용하는 β 세포의 생체 내 기능화를 도시한다. β 세포-표적화된 Ac4ManNAz NP의 정맥 내 투여는 췌장에서 β 세포로의 Ac4ManNAz의 전달을 표적으로 한다. 대사 당조작은 세포 내 ManNAz를 세포 표면 단백질의 아지드 시알산 유도체로 변환한다. 아지드-변형된 β 세포는 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 후속적으로 i.v. 투여하여 SPAAC에 대한 스타이를 제공한다. PD-L1-Ig-기능화된 β 세포는 동시에 CD8+ 세포독성 T 세포에 대해 광범위한 항원 (AG)을 제공하고 PD-1/PD-L1 경로를 상향 조절하여, T 세포를 활성화하고 항원-특이적 면역관용을 유도한다 [MHC I = 주요 조직적합성 복합체 클래스 I; TCR = T 세포 수용체].
도 76a-i는 β 세포의 생체 내 기능화를 위한 2-성분 사전표적화 시스템의 제작을 도시한다. a, β 세포-표적화 Ac4ManNAz-캡슐화 NP의 제작. b, 동적 광산란 방법으로 측정된 비오틴-기능화된 Ac4ManNAz-캡슐화 NP, 아비딘-기능화된 Ac4ManNAz-캡슐화 NP, β 세포 표적화 Ac4ManNAz-캡슐화 NP, 아비딘, 및 엑센딘-4에 대해 기록된 강도-평균 직경 분포 곡선. c, 비-표적화 Ac4ManNAz-캡슐화 NP, 비오틴-기능화 Ac4ManNAz-캡슐화 NP, 및 β 세포 표적화 Ac4ManNAz-캡슐화 NP에 대해 기록된 TEM 이미지. d, 시험관 내 Ac4ManNAz 방출 연구를 생리학적 조건하에서 수행하였다. 방출되지 않은 Ac4ManNAz를 LC-MS로 정량화하였다. e, 시험관 내 NP-결합 검정을 NIT-1 및 MIN-6 세포에서 수행하였다. 상이한 농도의 β 세포 표적화 및 비-표적화 Cy5-표지된 NP를 생리학적 조건에서 1시간 동안 완전 세포 배양 배지에서 상이한 β 세포와 함께 배양하였고 형광 이미징 연구 전에 3회 세척하였다 (n = 4; 웰당 2×104 세포, 세포는 시험관 내 결합 연구 24시간 전 접종하였다). f, (i-ii) 당뇨병 NOD 마우스 (혈당 = 300 - 450 mg/dL)에서 β 세포 표적화 및 비-표적화 Cy5-표지된 NP (5 mg/마우스)의 생체 외 생체분포 연구를 Cy5-표지된 NP의 i.v. 투여 3시간 후 수행하였다. 췌장 및 선택된 기관을 Cy5-표지된 NP의 i.v. 투여 3시간 후 생체 외 이미징 연구를 위해 보존하였다. (iii) 상이한 Cy5-표지된 NP로 i.v. 투여된 마우스로부터 보존된 조직병리학적 이미지. β 세포가 풍부한 섬은 항-인슐린 (녹색)으로 염색되었다. g, 아민-NHS 에스테르 화학을 통한 DBCO-EG13 리간드로 PD-L1-Ig의 기능화. 목표 기능화 정도는 60이었다. h, 1 mg/mL의 PD-L1-Ig, DBCO-기능화된 PD-L1-Ig, 및 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig의 UV-가시광선 흡수 스펙트럼. 각각의 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig는 평균 9개의 DBCO 리간드와 결합하는 것으로 계산되었다. TexRed-표지된 PD-L1-Ig는 평균 9개의 DBCO 리간드와 2개의 TexRed 리간드로 기능화되었다. i, SEC-MALS로 측정된 기능화되지 않은 PD-L1-Ig 및 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 숫자 평균 분포 곡선.
도 77a-e는 상이한 사전-표적화 전략을 통해 생체조작된 PD-L1-Ig-기능화된 β 세포가 시험관 내 세포독성 T 세포를 효과적으로 활성화함을 도시한다. a, 도식은 2-단계 사전-표적화 전략을 통한 NIT-1 세포의 시험관 내 기능화를 요약한다. NIT-1 세포를 1시간 동안 상이한 제형의 Ac4ManNAz (50 μM)로 배양하였고 4일 동안 완전 세포 배양 배지에서 배양하기 전에 세척했다. 아지드-변형된 NIT-1 세포를 5 μg DBCO-기능화된 PD-L1-Ig/106 세포의 목표 기능화 정도에서 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 기능화하였다. b, 항-PD-L1 항체로 염색된 후 FACS 방법에 의해 결정된, 상이한 사전-표적화 방법을 통해 기능화된 상이한 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포의 PD-L1 발현. c, 상이한 Ac4ManNAz 제형을 사용하여 생체기능화된 상이한 PE-표지된 항-마우스 PD-L1 항체-염색된 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포의 CLSM 이미지. d, FACS 방법에 의해 결정된, 72시간 동안 10:1의 효과기: 표적 비율로 IGRP206-214 펩티드의 존재하에 상이한 비-기능화 및 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포와 배양된 후 8.3 T 세포의 PD-1 발현. e, FACS 방법에 의해 결정된, 72시간 동안 10:1의 효과기: 표적 비율로 IGRP206-214 펩티드의 존재하에 상이한 비-기능화 및 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포와 배양된 후 8.3 T 세포의 세포 내 IFN-감마 발현.
도 78a-e는 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP를 통한 사전-표적화 기능화가 생체 내에서 효과적으로 PD-L1-Ig-기능화된 췌장 β 세포를 생체 내 생체조작함을 도시한다. a, 췌장 및 다른 주요 기관의 생체 외 형광 이미지를 건강한 비-당뇨병 NOD 마우스에 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)의 i.v. 투여 48시간 후 기록하였다. DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig를 상이한 Ac4ManNAz 제형 (180 μg/마우스)의 i.v. 투여 3일 후 투여하였다 (n = 4, 그룹 5의 경우만 제외 n = 5). b, 비-당뇨병 NOD 마우스에서 상이한 사전표적화 기능화 전략에 대해 측정된 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig의 생체분포 (n = 4, 그룹 5의 경우만 제외 n = 5). c, DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig로 사전표적화 기능화 후 보존된 췌장 절편의 대표적인 면역형광 이미지. 췌장 절편을 항-인슐린으로 염색하여 β 세포가 풍부한 섬에 표지하였다. d, 당뇨병 NOD 마우스 (혈당 수준 = 300 - 450 mg/dL)에서 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP (마우스당 5 mg NP 또는 180 μg 캡슐화 Ac4ManNAz)의 사전표적화 투여 후 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)의 생체분포. DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig를 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP의 i.v. 투여 3일 후 i.v. 투여하였다. 삽입은 당뇨병 NOD 마우스의 치료되지 않은 그룹 및 사전표적화 그룹으로부터 보존된 췌장의 생체 외 형광 이미지를 보여준다 (n = 4). e, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP로 사전표적화 치료 후 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig로 처리한 미처리 당뇨병 NOD 마우스 및 NOD 마우스로부터 보존된 대표적인 췌장 절편. 췌장은 T1DM의 발병 12일 후 보존되었다 (DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig의 투여 5일 후).
도 79a-d는 생체 내 PD-L1-Ig-기능화된 췌장 β 세포가 조기 발병 T1DM을 효과적으로 역전시키는 것을 도시한다. a, 치료 일정. 치료 그룹의 마우스는 150 μg의 캡슐화 Ac4ManNAz (발병 후 4일) 및/또는 80 μg의 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (발병 후 7일)를 i.v. 꼬리 정맥 주사되었다. 2개의 사전표적화 치료 그룹 (그룹 5)의 마우스는 발병 후 11일째에 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP 및 발병 후 14일째에 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 2차 i.v. 투여를 받았다. b, 상이한 치료 후 NOD 마우스의 시간 의존적 혈당 수준 (그룹 1 내지 3의 경우 n = 7, 그룹 4의 경우 n = 8, 및 그룹 5의 경우 n = 9). c, 발병 후 14일째에 기록된 NOD 마우스의 혈당 수준. d, 상이한 치료를 받은 후 비-치료 및 치료 그룹 마우스의 무진행 생존 곡선.
도 80a-e는 생체 내 PD-L1-Ig-기능화된 췌장 β 세포가 세포독성 T 세포를 활성화하고 항원-특이적 면역관용을 유도하여 조기 발병 T1DM을 역전시키는 것을 도시한다. a, FACS 방법을 통한 T1DM 발병 12일 후 췌장 침윤된 CD4+ 헬퍼 T 세포 및 CD8+ 세포독성 T 세포의 정량화. 치료 그룹의 마우스는 T1DM의 발병 4일째에 Ac4ManNAz NP로 사전표적화 치료를 받은 후, T1DM의 발병 7일째에 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 받았다. b, FACS 방법에 의한 발병 12일 후 췌장 침윤된 IFN-감마-발현 CD8+ T 세포의 정량화. c, 상이한 치료 후 췌장-침윤된 FoxP3-발현 CD4+ Treg 세포의 정량화 (n = 5, 사전표적화 치료 그룹 4의 경우만 제외 n = 6). d, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 사전표적화 치료를 받은 미처리 당뇨병 NOD 마우스 및 당뇨병 NOD 마우스로부터 보존된 대표적인 H&E-염색된 췌장 절편. e, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 사전표적화 치료를 받은 미처리 당뇨병 NOD 마우스 및 당뇨병 NOD 마우스로부터 보존된 항-인슐린/항-CD3 이중-염색된 췌장 절편의 대표적인 면역형광 이미지. T1DM의 발병 12일 후 췌장 절편을 당뇨병 NOD 마우스로부터 보존하였다 (DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 i.v. 투여 5일 후).
도 81은 DLS 방법에 의한 비-표적화 Ac4ManNAz NP (0.1 M PBS에 현탁됨)의 특성화를 도시한다.
도 82는 생체 외 형광 이미징 연구 후 보존된 마우스 췌장 절편의 대표적인 면역형광 이미지를 나타낸다. β 세포가 풍부한 인슐린 생성 섬은 항-인슐린 (녹색)으로 염색되었다.
도 83a-c. a, MTS 분석에 의해 결정된, NIT-1 세포에서 소분자 ("유리") Ac4ManNAz의 시험관 내 독성. NIT-1 세포를 4일 동안 소분자 Ac4ManNAz와 배양하였다 (결합되지 않은 Ac4ManNAz를 제거하지 않음). b, Ac4ManNAz의 상이한 제형으로 배양 후 NIT-1 세포의 상대적 생존력. 세포는 1시간 동안 50 μM of 소분자 또는 NP-캡슐화 Ac4ManNAz로 배양하고, 생리학적 조건에서 4일 동안 배양하기 전 (결합되지 않은 Ac4ManNAz 또는 NP를 제거하기 위해 완전 세포 배양 배지로) 세척했다. 생존력을 MTS 검정으로 결정하고, 미처리 세포의 생존력을 비교하여 계산하였다. c, PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포의 상대적 생존력. NIT-1 세포를 4일 동안 Ac4ManNAz의 상이한 제형으로 배양한 후 배양하고 (초기 배양 후 1시간에 한 번 세척), 완전 세포 배양 배지에서 4일 동안 배양하기 전에 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 기능화시켰다. 생존력을 MTS 검정으로 결정하고, 미처리 세포의 생존력을 비교하여 계산하였다.
도 84는 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 사전표적화된 마우스로부터 보존된 췌장 절편의 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 85a-b는 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 사용한 생체 내 치료가 건강한 BALB/c 마우스에서 유의한 a, 간독성, 및 b, 신독성을 유도하지 않음을 도시한다. (n = 5)
도 86은 TexRed-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 i.v. 투여 5일 후 (T1DM의 발병 12일 후) 당뇨병 마우스로부터 보존된 간 (LI), 신장 (K), 비장 (S), 심장 (H) 및 폐 (LU)의 생체 외 형광 이미지를 나타낸다.
도 87은 상이한 치료 후 당뇨병 NOD 마우스의 생존 곡선을 도시한다. (n = 7, 그룹 4 (G4)의 경우 n = 8, 및 그룹 5 (G5)의 경우 n = 9 제외.)
도 88a-c. a, 췌장 침윤된 CD4+ CD8- 헬퍼 T 세포 및 CD4- CD8+ 세포독성 T 세포의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. b, IFN-감마-발현 췌장 침윤된 CD4- CD8+ 세포독성 T 세포의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯. c, FoxP3-발현 췌장 침윤된 CD4+ CD8- 조절 T 세포의 집단을 나타내는 2차원 FACS 밀도 플롯.
현재 개시된 주제는 이제 이하에서 보다 완전하게 설명될 것이다. 그러나, 본원에 기재된 현재 개시된 주제의 많은 수정 및 다른 구현예는 전술한 설명에서 제시된 교시의 이점을 갖는 현재 개시된 주제가 관련된 기술 분야의 숙련자에게 떠오를 것이다. 따라서, 현재 개시된 주제는 개시된 특정 구현예에 제한되지 않고 변형 및 다른 구현예가 첨부된 특허 청구범위 내에 포함되도록 의도됨을 이해해야 한다. 즉, 여기에 설명된 주제는 모든 대안, 수정 및 등가물을 포함한다. 포함된 문헌, 특허 및 유사한 자료 중 하나 이상이 정의된 용어, 용어 사용, 기술된 기술 등을 포함하되 이에 제한되지 않고 이 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 이 출원이 우선한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 해당 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
I. 개요
위에서 언급한 바와 같이, 면역계는 자가 면역을 피하기 위해 자가 항원을 용인하면서 외래 항원에 대해 강력한 면역 반응을 유도하도록 진화했다14, 15. 말초 면역 관용을 확립하지 못하면 1형 당뇨병에서 MS에 이르는 자가 면역 질환이 발생한다14, 15. Treg 세포는 면역 관용과 항상성을 유지하는 데 필요하다28. 수많은 생체 내 연구 및 임상 시험이 자가면역 질환의 치료를 위해 자극된 벌크 Treg 세포를 이용했지만36, 66; 그러나 항원 특이성이 없으면 전신 면역 정지의 위험이 증가한다 36, 66.
인슐린 의존성 당뇨병 (제1형 당뇨병, T1D라고도 함)은 자가 반응성 T 세포가 인슐린을 생성하는 췌장 베타(β) 세포를 파괴할 때 발생하는 인슐린 결핍을 특징으로 하는 만성 자가면역 질환이다.1-3 매년 전 세계적으로 백만 건 이상의 새로운 T1D 사례가 발생하며 그 중 약 절반은 개인의 성인기에 진단된다.4 T1D는 일반적으로 전증상 단계와 증상 단계로 나눌 수 있는 복잡한 병인을 가지고 있다.1, 2, 5, 6 일단 증상 단계로 진행되면 1년 이내에 전체 β 세포 손실로 빠르게 진행되는 경우가 많다. 1, 2, 5, 6 대부분의 T1D 환자는 하루에 여러 번 인슐린 주사를 사용하거나 인슐린 펌프 요법을 통해 혈당 수치를 유지한다.1-3 여전히 T1D 환자의 1/3 미만이 지속적으로 목표 혈당 수치를 달성한다. 질환 관리 및 치료의 주요 발전에도 불구하고, T1D는 환자가 신경병증, 신병증, 망막병증 및 심혈관 질환과 같은 급성 질환을 발병할 확률이 상당히 높고 일반 인구보다 조기 사망율이 더 높다.1-4 상당한 양의 β 세포가 초기 증상 단계에 여전히 존재하기 때문에 조기 발병 T1D를 지연시키고 심지어 역전시키기 위한 새로운 면역 요법 개발에 상당한 관심이 있다. 이를 통해 환자는 대사 조절을 회복할 수 있다. 최근에, 조기 발병 고혈당증을 역전시키기 위해 프로-인슐린 펩티드- 기반 백신의 사용을 조사한 여러 임상 시험이 있었지만 그 결과는 실망스러웠다.7-10
자가항원-특이적 키메라 항원 수용체 Treg 세포는 MS를 억제하는 데 사용할 수 있지만 35, 자가항원의 빠른 돌연변이와 주입된 Treg 세포의 불충분한 장기 효능으로 인해 임상 결과가 실망스럽다36. 최근 연구는 병원성 헬퍼 T 세포의 개체수 감소 및 항원-특이적 Treg 세포의 유도를 통해 항원-특이적 면역 관용을 유도하기 위해 뇌염 유발 펩티드-접합된 미세입자67 및 뇌염 유발 펩티드- 접합 동종 백혈구68, 69의 투여에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 임상 시험에서 인간 백혈구 항원 일배체형 DR2 또는 DR4를 가진 소수의 MS 환자 그룹만이 이러한 치료로부터 혜택을 받는 것으로 나타났다69. 또한, 이러한 고도의 항원 특이적 치료의 장기 치료 반응은 종종 에피토프 이동 및 자가항원 돌연변이에 의해 손상된다 70.
대사 당조작20, 21 및 이중직교 클릭 화학22-24은 사용 가능한 도구이다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들은 면역 체크포인트 분자의 표적 세포에 대한 독특한 화학적 장식을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 면역 체크포인트 분자 (PD-L1, CD86, 및 Gal-9)는 대사 당조작 및 이중직교 클릭 반응을 통해 β 세포에 장식될 수 있다. 이들 β 세포는 자가 반응성 T 세포에서 면역 관용을 유도하고 조기 발병 고혈당증의 영향을 역전시키는 생세포 백신으로 사용될 수 있다. 면역 체크포인트 분자-장식된 β 세포는 시험관 내에서 T 세포를 효과적으로 고갈시켰다. PD-L1/CD86/Gal-9-삼중-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여는 NOD 마우스에서 조기 발병 고혈당증을 역전시킬 수 있다. PD-L1/CD86/Gal-9-삼중-기능화된 NIT-1 세포 내장된 pan-ECM에 기반한 신규 s.c.-주사용 백신은 조기 발병 고혈당증을 역전시키기 위해 개발되었다. 무세포 pan-ECM은 기능화된 β 세포의 국소화를 위한 스캐폴드로서 기능할 뿐만 아니라 또한, β 세포가 자가 반응성 T 세포와 인터페이스하고 강력한 항원-특이적 Teff 억제를 유발하도록 면역원성 췌장 미세환경을 재생한다 (도 1). 한 구현예에서, 면역에서 내성에 이르기까지 광범위한 Teff 반응을 생성하는 자가면역 질환을 위한 생세포 백신 플랫폼이 본원에 기술되어 있다.
또한, MS를 예방하고 치료하기 위해 PD-L1- 및 CD86-기능화된 SC를 생체공학적으로 처리하기 위한 대사 당조작 및 이중직교 클릭 화학의 용도가 본원에 개시되어 있다. MS에서, 자가 반응성 T 세포는 중추신경계 (CNS)의 미엘린을 공격하여, 뇌와 말초 시스템 간의 통신을 방해한다. 대부분의 환자는 처음에는 가역적 신경학적 결손을 경험한 후 차도가 이어지다가 만성 신경학적 악화가 심각하고 비가역적 장애로 이어진다. 불행하게도, 이용 가능한 면역조절 요법이 항원 특이적 면역관용을 유도하여 MS 재발의 빈도와 중증도를 감소시켜 장애 축적을 지연시키지만, MS는 완전히 완치될 수 없다. 새로운 치료 전략은 염증성 병원균을 억제하고 전신 면역억제를 유발하지 않으면서 말초 면역관용을 회복시키는 항원-특이적 Treg 세포의 유도를 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 다발성 경화증 (MS)의 경우, 자가 반응성 T 세포가 중추신경계 (CNS)의 미엘린을 공격하여, 뇌와 말초 시스템 간의 통신을 방해한다29, 31. 일부 더 새로운 치료 전략은 염증성 병원균을 억제하고 전신 면역억제를 일으키지 않고 말초 면역관용을 회복시키는 항원-특이적 Treg 세포의 유도를 포함한다 35, 36. 그러나, 다른 항원-특이적 MS 치료 전략과 달리, 본원에 기술된 기능화된 SC는 관여된 병원성 헬퍼 T 세포에 광범위한 미엘린 항원을 제시하고, 이들의 활성화를 억제하고, 자가 반응성 면역 세포를 억제하기 위해 미엘린 항원-특이적 Treg 세포의 발달을 유도하도록 설계되었다. 포괄적인 시험관 내 및 생체 내 연구는 면역 체크포인트 리간드-기능화된 SC가 미엘린 특이적 헬퍼 T 세포의 병원성 Th1 및 Th17 세포로의 분화를 효과적으로 억제하고, 항원-특이적 Treg 세포의 발달을 촉진하며 확립된 마우스 EAE 모델에서 염증성 CNS 미세환경을 해결하였음을 나타낸다. 덜 전염증성 미세환경은 OL이 미엘린 손상을 복구하고 EAE 임상 징후를 개선할 수 있게 한다. 여기에 보고된 손쉬운 이중직교 접합 전략은 SC의 주문형 모듈 기반 기능화를 허용한다. 이 가역적 생체접합 전략은 낮은 독성과 관련이 있으며 억제성 면역 체크포인트 경로와 관련된 잠재적인 비가역적 부작용을 예방했다. 본 연구는 MS 치료를 위한 새로운 프레임워크를 제공하고 자가면역 질환의 다른 모델에서 추가 평가를 지원한다.
만성 및 재발-완화 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)의 확립된 마우스 모델에서 다발성 경화증을 예방 및 개선하기 위해 프로그램된 사멸-리간드 1 및 분화 클러스터 86-기능화된 마우스 슈반 세포를 생명공학적으로 처리하는 방법이 본원의 구현예에서 설명된다. 본원의 데이터는 면역 체크포인트 리간드-기능화된 마우스 슈반 세포의 정맥 내 투여가 질환의 과정을 수정하고 EAE를 개선한다는 것을 보여준다. 또한, 이러한 생체조작된 마우스 슈반 세포는 미엘린 특이적 헬퍼 T 세포의 병원성 T 헬퍼 유형 1 및 유형 17 세포로의 분화를 억제하고, 관용원성 미엘린 특이적 조절 T 세포의 발달을 촉진하고 전신 면역억제를 유도하지 않고 염증성 CNS 미세환경을 해결한다.
본원에 제공되는 데이터는 병원성 CD4+ 림프구 T 헬퍼 유형 1 (Th1) 및 유형 17 (Th17) 세포의 활성화를 억제할 뿐만 아니라 미엘린 특이적 Treg 세포의 발달을 촉진하여 조기 발병 MS의 발달을 예방하거나 과정을 역전시키기 위한 동시억제 면역 체크포인트 리간드-생체조작된 아교세포의 정맥 내 (i.v.) 또는 근육 내 (i.m.) 투여에 대해 보고한다 (도 32). 또한, 면역 조절 약물 (예를 들어, 레플루노미드 (LEF)42, 43)을 사용한 국소 공동치료를 통해 덜 전염증성 CNS 미세환경을 생성하면 희소돌기아교세포 (OL)의 미엘린 손상을 복구하고19 MS 증상을 완화하는 능력을 부여할 수 있다 (도 32). 이들 달성하기 위해, 관여된 미엘린 특이적 CD4+ T 세포에서 PD-1 및 CTLA-4 신호전달 경로를 상향 조절하기 위해 PD-L1 및 CD86을 사용하여 기능화된 LEF-캡슐화 나노입자 (NP)를 갖는 생체조작된 슈반 세포 (SC) (말초 신경계의 아교세포) 또는 희소돌기아교세포 (OL)를 개발하였다 (도 32). 구현예에서, SC는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 및 단백지질 단백질 (PLP)와 같은 다양한 미엘린 특이적 항원을 발현하기 때문에 특별한 유용성을 나타낸다 (도 38). 추가로, 자가 SC 이식을 위한 프로토콜이 수립되었다45-47.
추가로, 조기 발병 T1DM을 역전시키기 위해 PD-L1을 췌장 β 세포 상에 장식하는 2단계 번역 가능한 생체 내에서 생체접합 전략이 본원에 기술된다. 2단계, 2-성분 사전표적화 생체접합 전략은 β 세포-표적화, Ac4ManNAz-캡슐화 나노입자 (Ac4ManNAz NP) (사전표적화 성분) 및 디벤질시클로옥틴 (DBCO)-기능화된 PD-L1 면역글로빈 Fc-융합 단백질 (이펙터)을 포함한다 (도 75 참조). β 세포 표적화 엑센딘-4-기능화된 NP는 i.v. 투여 후 Ac4ManNAz를 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체 (GLP-1R)-과발현 β 세포74에 선택적으로 전달한다. GLP-1R에 결합시, 엑센딘-4-기능화된 Ac4ManNAz NP는 β 세포를 신속하게 내재화할 수 있고,75 캡슐화 Ac4ManNAz의 제어 방출을 가능하게 하여, 세포 표면 단백질의 N-연결 글리코실화를 위한 아지도 시알산 유도체로 전환한다.20, 21, 23 아지드-변형된 β 세포는 i.v.-투여된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig와 함께 균주-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 (SPAAC) 부위를 제공한다23,24. 조기 발병 NOD 마우스에서 수행된 포괄적인 시험관 내 및 생체 내 연구는 생체 내 PD-L1-생체조작된 β 세포가 섬-특이적 항원 및 PD-L1을 관여 T 세포에 동시에 제시하고, 자가 반응성 T 세포를 면역결핍화하고, 항원-특이적 면역관용을 유도하고, 장기 전신 면역억제를 유도하지 않으면서 조기 발병 T1DM을 역전시킬 수 있음을 확인하였다 (도 75 참조). 조기 발병 T1DM을 역전시키기 위해 PD-L1-기능화된 췌장 β 세포의 생체 내 생체공학을 위한 번역 가능한 2단계, 2-성분 사전표적화 방법이 본원에 개시되어 있다. 포괄적인 기계론적 연구는 생체 내에서 기능화된 β 세포가 췌장 침윤된 IFN-γ-발현 세포독성 T 세포를 면역결핍화하고13 면역억제성 Treg 세포의 유지를 통해 항원-특이적 면역관용을 유도함으로써28 조기 발병 T1DM를 역전시킬 수 있음을 확인하였다. T1DM에 대한 다른 면역 체크포인트 요법과 달리,76, 5 이 생체 내 생체공학 방법은 장기 비가역적 면역억제를 유도하지 않는다. 또한, 이러한 전략은 사전표적화 성분에서 표적화 모이어티를 변경하여 다른 자가면역 질환에 쉽게 적응할 수 있다.
II. 조성물
기능화된 세포
한 구현예에서, 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장식된 세포 표면"은 면역 체크포인트 분자가 본원에 기재된 것과 같은 화학적 연결 전략을 통해 세포 표면에 공유적으로 부착되는 적어도 하나의 공유 변형을 포함하는 세포를 지칭한다. 공유 변형은 기능화된 세포를 생성한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 주제는 다음 일반 구조 중 하나를 갖는 기능화된 세포에 대한 것이다:
.
여기서, X는 1 내지 100의 정수이고, y는 1 내지 100의 정수이고. 구현예에서, X는 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10; 또는 10 내지 90, 10 내지 70, 또는 10 내지 50의 정수, 예를 들어 1 내지 100의 임의의 정수이다. 구현예에서, Y는 1 내지 80, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10; 또는 10 내지 90, 10 내지 70, 또는 10 내지 50의 정수, 예를 들어 1 내지 100의 임의의 정수이다.
구현예에서, 세포는 베타 세포, 미엘린 수초와 관련된 세포 (예를 들어, 슈반 세포, 희소돌기아교세포), 또는 자가면역 질환의 임의의 표적 세포, 예를 들어 폐세포, 혈소판, 상피 세포, 간세포 또는 활막 세포이다.
구현예에서, 기능화된 세포는 살아있는 세포이다. 구현예에서, 기능화된 세포는 생리학적 조건하에서 약 1일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 4일, 약 5일 내지 약 21일, 또는 약 7일 내지 약 14일 동안 생존할 수 있다. 구현예에서, 기능화된 세포는 생리학적 조건하에서 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 10일, 약 12일, 약 14일, 약 16일, 약 18일, 또는 약 21일 동안 생존할 수 있다.
구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-L1, CD86, Gal-9, PD-L2, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TNFR1, VISTA, BTLA, NKG2A, CTLA-4, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, B7-H7, ICOS, NKp30, LAG3, CD137, 또는 CD96이다. 한 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-L1, CD86, 또는 Gal-9이다. 한 구현예에서, 기능화된 세포는 적어도 하나의 PD-L1, 적어도 하나의 CD86, 및 적어도 하나의 Gal-9를 포함한다. 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 융합 단백질일 수 있으며, 예를 들어, PD-L1은 PD-L1-Ig일 수 있다.
PD-L1, 프로그램된 사멸-리간드 1 (Uniprot: Q9NZQ7)은 40kDa 유형 1 막관통 단백질이다. PD-L1은 PD-1에 대한 리간드이다. PD-L1은 또한 B7-H1 (B7 동족체 1)이라고도 한다.
CD86, T-림프구 활성화 항원 CD86 (Uniprot: P42081)은 유형 I 막 단백질. CD86은 활성화된 T 세포에서 CTLA-4에 대한 리간드이다. CD86 (CD80과 함께)은 T-세포 활성화 및 생존에 필수적인 동시자극 신호를 제공한다.
Gal-9, 갈렉틴 9 (Uniprot: O00182)은 36 kDa 베타-갈락토시드 렉틴 단백질이다. Gal-9은 TIM-3에 대한 리간드이다.
구현예에서, 본원에 기재된 주제는 다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티를 포함하는 기능화된 세포에 대한 것이다: (막횡단 당단백질)―(아지드 함유 분자의 잔기)―(시클로옥틴의 잔기)―(링커 1)―(기능화된 덴드리머의 잔기)q―(면역 체크포인트 분자의 잔기), 여기서, q는 1 또는 0이고; 대시는 공유 결합을 나타낸다. 한 구현예에서, 기능화된 세포는 다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티를 포함한다: (막횡단 당단백질)―(시클로옥틴 -함유 분자의 잔기)―(아지드의 잔기)―(링커 1)―(기능화된 덴드리머의 잔기)q―(면역 체크포인트 분자의 잔기), 여기서, q는 1 또는 0이고; 대시는 공유 결합을 나타낸다. q가 1이면, 덴드리머가 존재한다. q가 0일때, 덴드리머가 없어 DBCO 직접 접합 전략이 된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "잔기" 또는 화학 모이어티"의 잔기"는 분자에 결합된 화학적 모이어티를 지칭하며, 이로써 결합을 통해, 적어도 하나의 공유 결합이 원래의 화학 잔기의 적어도 하나의 원자를 대체하여, 분자에서 화학 모이어티의 잔기를 초래한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티를 포함하는 기능화된 세포에 관한 것이다: (막횡단 당단백질)―(아지드 함유 분자의 잔기)―(시클로옥틴의 잔기)―(링커 1)―(면역 체크포인트 분자 FcIg 융합 단백질), 여기서, 대시는 공유 결합을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티를 포함하는 기능화된 세포에 관한 것이다: (막횡단 당단백질)―(시클로옥틴 -함유 분자의 잔기)―(아지드의 잔기)―(링커 1)―(면역 체크포인트 분자 FcIg 융합 단백질), 여기서, 대시는 공유 결합을 나타낸다. 구현예에서, 면역 체크포인트 분자/면역 체크포인트 분자 FcIg 융합 단백질은 아민-NHS 에스테르 화학, 또는 티오-말레이미드 화학을 통해 접합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티를 포함하는 기능화된 세포에 관한 것이다: ((막횡단 당단백질)―(아지드 함유 분자의 잔기)―(시클로옥틴의 잔기)―(나노입자)―((링커, 예를 들어 링커 1)―(면역 체크포인트 분자))y)x, 여기서, 대시는 공유 결합을 나타내고 x 및 y는 본원에 기재된 바와 같다.
구현예에서, 티올-말레이디드 클릭 화학을 사용하여 세포 표면을 변형할 수 있다 표면. 일반적으로, 표면의 유리 티올 그룹은 안정적인 티오에스테르 결합을 통해 말레이미드-기능화된 생체분자와 반응하여 안정한 기능화된 세포를 형성할 수 있다. 말레이미드-기능화된 생체분자는 원하는 생체분자와 NHS-말레이미드 가교제 (예를 들어, 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이드 (술포-SMCC)) 사이의 아민-NHS 반응에 의해 제조될 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 주제는 기능화된 세포에 관한 것이며, 여기서 기능화된 덴드리머의 잔기는 다음 구조를 갖는다: ―(덴드리머)―(링커 2)―(시클로옥틴의 잔기)―(아지드 함유 분자의 잔기)―. 한 구현예에서, 링커 2는 하기 구조를 갖는다:
여기서, z는 0 내지 10의 정수이다.
구현예에서, z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 구현예에서, z는 3이다. 한 구현예에서, z는 0 내지 100,000의 정수이다. 한 구현예에서, z는 0 내지 10, 0 내지 100, 0 내지 1,000, 0 내지 5,000, 또는 0 내지 10,000의 정수이다. 한 구현예에서, z는 10 내지 100,000, 100 내지 100,000, 1,000 내지 100,000, 5,000 내지 100,000, 또는 10,000 내지 100,000의 정수이다.
한 구현예에서, 기능화된 세포는 약 백만개의 기능화된 세포당 약 0.5 μg 내지 약 100 μg의 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 기능화된 세포는 약 백만개의 기능화된 세포당 약 0.5 μg 내지 약 100.0 μg, 약 0.5 μg 내지 약 75.0 μg, 약 1 μg 내지 약 60.0 μg, 약 1 μg 내지 약 50.0 μg, 약 10 μg 내지 약 50.0 μg, 약 20 μg 내지 약 50.0 μg, 약 30 μg 내지 약 50.0 μg, 약 40 μg 내지 약 50.0 μg, 약 0.5 μg 내지 약 40.0 μg, 약 0.5 μg 내지 약 30.0 μg, 약 0.5 μg 내지 약 20.0 μg, 또는 약 0.5 μg 내지 약 10.0 μg의 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 기능화된 세포는 약 백만개의 기능화된 세포당 약 0.5 μg, 약 1 μg, 약 10.0 μg, 약 20.0 μg, 약 30.0 μg, 약 40.0 μg, 약 50.0 μg, 약 60.0 μg, 또는 약 75.0 μg의 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함한다. 면역 체크포인트 분자의 총량은 예를 들어, (형광 표지된 단백질을 통한) 형광 분광분석 또는 정량적 웨스턴 블롯 (예를 들어, AutoWest)에 의해 정량화될 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 주제는 아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티, 또는 테트라진 모이어티를 포함하는 당조작된 모이어티에 관한 것이다.
구현예에서, 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자는 당조작된 모이어티를 통해 부착된다. 구현예에서, 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자는 면역 체크포인트 분자-기능화된 나노입자 또는 중합체이다. 구현예에서, 공유 부착은 세포 상의 티올 기에 접합을 통해 이루어진다.
구현예에서, 당조작된 모이어티는 만노사민 또는 갈락토사민의 아미드 잔기를 포함한다. 구현예에서, 당조작된 모이어티는 만노사민 또는 갈락토사민의 아미드의 잔기에 공유 부착된 아지드, 디벤조시클로옥틴, 또는 테트라진의 잔기를 추가로 포함한다. 구현예에서, 디벤조시클로옥틴이 DBCO이다.
또 다른 구현예에서, 당조작된 모이어티는 덴드리머, 선형 중합체, 나노입자, 또는 Fc 융합 단백질의 잔기를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 나노입자는 덴드리머, 리포좀, 무기 나노입자, 또는 중합체 나노입자이다. 한 구현예에서, 나노입자는 약 2nm 내지 약 10nm, 약 10nm 내지 약 100nm, 또는 약 100nm 내지 약 1000nm이다. 구현예에서, 나노입자는 약 2nm 내지 약 1000nm, 약 2nm 내지 약 750nm, 약 2nm 내지 약 500nm, 약 2nm 내지 약 250nm, 약 2nm 내지 약 200nm, 약 2nm 내지 약 100nm, 또는 2nm 내지 약 50nm이다. 구현예에서, 나노입자는 약 10nm 내지 약 1000nm, 약 25nm 내지 약 1000nm, 약 50nm 내지 약 1000nm, 약 100nm 내지 약 1000nm, 약 200 내지 약 1000nm, 약 500nm 내지 약 1000nm, 또는 750nm 내지 약 1000nm이다. 구현예에서, 나노입자는 약 2nm, 약 5nm, 약 10nm, 약 50nm, 약 100nm, 약 200nm, 약 300nm, 약 400nm, 약 500nm, 약 600nm, 약 700nm, 약 800nm, 약 900nm, 또는 약 1000nm이다. 구현예에서, 나노입자는 링커를 통해 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 면역 체크포인트 분자에 추가로 공유 부착된다. 한 구현예에서, 덴드리머는 다가 덴드리머이다. 한 구현예에서, 다가 덴드리머는 폴리아미도아민 덴드리머이다. 구현예에서, 나노입자는 페길화 나노입자 (예를 들어, DBCO-기능화된 PEG-PLG나노입자)이다. 구현예에서, 페길화 나노입자는 직경이 200nm 미만이다.
한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 500 내지 약 1,000,000의 MW를 갖는다. 한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 1000 내지 약 1,000,000, 약 5000 내지 약 1,000,000, 약 10,000 내지 약 1,000,000, 약 15,000 내지 약 1,000,000, 약 20,000 내지 약 1,000,000, 약 500 내지 약 100,000, 약 500 내지 약 50,000, 또는 약 500 내지 약 35,000의 MW를 갖는다.
한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 20,000 내지 약 35,000의 MW를 갖는다. 한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 20,000 내지 약 30,000의 MW를 갖는다. 한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 25,000 내지 약 30,000의 MW를 갖는다.
한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 20,000, 약 21,000, 약 22,000, 약 23,000, 약 24,000, 약 25,000, 약 26,000, 약 27,000, 약 28,000, 약 29,000, 약 30,000, 약 31,000, 약 32,000, 약 33,000, 약 34,000, 또는 약 35,000의 MW를 갖는다. 한 구현예에서, 폴리아미도아민 덴드리머는 약 28,000의 MW를 갖는다.
이 구현예의 특정 양태에서, 본원에 기재된 주제는 유기체에서 기능화된 세포를 제조하는 생체 내 방법에 의해 제조된 기능화된 세포에 관한 것으로, 방법은 유기체에 리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및 리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제를 임의의 순서로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 기능화된 세포는 생체 내에서 제조된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전신 면역억제"는 면역계의 활성화 또는 효능의 감소를 지칭한다. 본원에서 사용되는 어구 "장기적인 광범위한 전신 면역억제 없음" 등은 면역억제 요법의 지속적인 투여와 관련될 수 있는 임상적으로 관련된 전신 면역억제의 결여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가 반응성 T 세포"는 HLA 분자를 제시하는 숙주의 항원과 관련하여 그들에게 제시된 항원성 펩티드를 인식하고 적절한 신호가 제공되면 활성화되는 T 세포를 지칭하며, 이에 의해 자가 반응성 T 세포는 "외래" 단백질, 병원균 등과 반대로 "자기"를 제시하는 펩티드에 대해 특이적이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역결핍(anergy)" 및 "면역결핍화된" 등은 외부 물질에 대한 신체의 방어 기전이 반응하지 않는 과정 또는 결과를 지칭하고 말초 림프구 내성의 직접적인 유도로 구성된다. 면역결핍 상태의 세포는 특이적　항원, 일반적으로 자가 항원에 대해 정상적인 면역 반응을 일으킬 수 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생리학적 조건"은 살아있는 인간 신체의 조직 내에서 일반적으로 접하게 되는 온도, pH 및 긴장도 (또는 삼투질농도)의 조건 범위를 지칭한다.
용어 "시험관 내"는 인공 환경 및 인공 환경 (예를 들어, 시험관) 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 지칭한다.
용어 "생체 내"는 자연 환경 (예를 들어, 세포 또는 유기체 또는 신체) 및 자연 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 지칭한다.
값 범위의 지정에는 범위 내에 있거나 범위를 정의하는 모든 정수와 범위 내의 정수로 정의되는 모든 하위 범위가 포함된다.
문맥상 달리 명백하지 않은 한, 용어 "약"은 명시된 값의 표준 측정 오차 범위 (예를 들어, SEM) 내의 값 또는 특정 값으로부터 ± 0.5%, 1%, 5%, 또는 10%의 편차를 포함한다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 또는 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함" 또는 "포함"하는 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 함께 함유할 수 있다.
단수형 관사 "a," "an," 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "항원" 또는 "적어도 하나의 항원"은 이들의 혼합물을 포함하여 복수의 항원을 포함할 수 있다.
통계적으로 유의하다는 것은 p ≤0.05를 의미한다.
무세포 세포외 매트릭스
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 기능화된 세포; 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질을 포함하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스가 본원에 개시된다. 탈세포화된 췌장 유래 단백질의 예는 도 24에 열거되어 있다. 또 다른 구현예에서, 기능화된 세포는 3차원 구상체 콜로니를 형성한다.
또 다른 구현예에서, 무세포 췌장 세포외 매트릭스는 주사제의 형태이다. 한 구현예에서, 무세포 췌장 세포외 매트릭스는 겔이 아닌 주사제의 형태이다. 한 구현예에서, 무세포 췌장 세포외 매트릭스는 겔인 주사제의 형태이다. 한 구현예에서, 무세포 췌장 세포외 매트릭스는 열 반응성 하이드로겔이 아닌 겔인 주사제의 형태이다.
약학 조성물
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 기능화된 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 무세포 췌장 세포외 매트릭스, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 기능화된 세포 또는 본원에 기재된 바와 같은 무세포 췌장 세포외 매트릭스, 및 약학적으로 허용 가능한 액체 비히클을 포함하는 백신이 본원에 기재된다.
용어 "백신"은 면역 반응을 유발하고 대상체가 질환 또는 병태에 걸리거나 발병하는 것을 예방할 수 있는 조성물 및/또는 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 치료적일 수 있는 백신을 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제"는 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스에 심각한 역효과 없이 그리고 유해한 영향을 미치지 않으면서 대상체에 도입될 수 있는 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스를 함유하는 비히클을 지칭한다. 즉, "약학적으로 허용 가능한"은 안전하고, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 유효량의 적어도 하나의 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스의 원하는 투여 경로에 대한 적절한 전달을 제공하는 임의의 제형을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 잘 알려져 있다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체 및 이들의 선택에 관련된 인자에 대한 설명은 예를 들어, 모든 목적을 위해 전문이 참조로 여기에 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., 1990과 같은 쉽게 입수 가능한 다양한 출처에서 찾을 수 있다. 이러한 담체는 임의의 투여 경로 (예를 들어, 비경구, 경장 (예를 들어, 경구), 또는 국소 적용)에 적합할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 완충될 수 있으며, 예를 들어, pH는 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스 및 투여 경로의 안정성에 따라 pH 4.0 내지 pH 9.0 범위의 특정한 원하는 값으로 유지된다.
적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 식염수와 같은 염 용액, 글루코스, 인산염 완충 용액 또는 중탄산염 완충 용액과 같은 완충 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 오일, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물 (예를 들어, 락토스, 아밀로오스 또는 전분), 스테아린산 마그네슘, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 백색 파라핀, 글리세롤, 알지네이트, 히알루론산, 콜라겐, 향유, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등을 포함한다. 약학 조성물 또는 백신은 또는 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스와 유해하게 반응하지 않는 예를 들어, 희석제, 안정화제 (예를 들어, 당 및 아미노산), 방부제, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 점도 향상 첨가제, 윤활제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 비타민, 착색제, 향료, 방향성 물질 등을 포함하는 보조제를 포함할 수 있다.
액체 제형의 경우, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 오일일 수 있다. 비수성 용매는 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 수성 담체는 예를 들어, 물, 알코올성/수성 용액, 염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 오일의 예로는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 올리브유, 해바라기유 및 어간유가 포함된다. 고체 담체/희석제는 예를 들어, 검, 전분 (예를 들어, 옥수수 전분, 전젤탄화 전분), 당 (예를 들어, 락토스, 만니톨, 수크로스 또는 덱스트로스), 셀룰로오스 물질 (예를 들어, 미정질 셀룰로오스), 아크릴레이트 (예를 들어, 폴리메틸아크릴레이트), 탄산칼슘, 산화마그네슘, 활석 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
임의로, 지속 또는 지시 방출 약학 조성물 또는 백신이 제형화될 수 있다. 이는 활성 화합물이 차별적으로 분해가능한 코팅 (예를 들어, 마이크로캡슐화, 다중 코팅 등에 의해)으로 보호되는 리포좀 또는 조성물의 사용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 조성물은 즉시 또는 서방성을 위해 제형화될 수 있다. 조성물을 동결 건조시키고 얻어진 동결건조물을 사용하는 것 (예를 들어, 주사용 제품의 제조를 위해)이 또한 가능하다.
III. 치료 방법
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 본원에 기술된 기능화된 세포 또는 본원에 기술된 무세포 세포외 매트릭스를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하거나 발병을 지연시키는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 대상체는 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 투여받는다.
구현예에서, 본원에 기재된 주제는 본원에 기재된 기능화된 세포 또는 무세포 세포외 매트릭스를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 결장염, 관절염, 루푸스 또는 건선을 치료하거나 발병을 지연시키는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 자가면역 결장염은 궤양성 대장염 또는 크론병이다. 구현예에서, 관절염은 류마티스 관절염이다.
구현예에서, 1형 당뇨병은 조기 발병 1형 당뇨병 또는 조기 발병 고혈당증이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 기능화된 베타 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 이를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 조기 발병 1형 당뇨병을 역전시키는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 본원에 기재된 주제는 기능화된 베타 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 약학 조성물 또는 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 베타 세포를 보호하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본원에 기재된 주제는 리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및 리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제를 임의의 순서로 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서 기능화된 세포는 생체 내에서 제조되고, 자가면역 질환이 치료된다. 구현예에서, 자가면역 질환은 1형 진성 당뇨병이다.
구현예에서, 본원에 기재된 주제는 다음을 포함하는 대상체에서 자가 반응성 면역 세포를 면역결핍화하는 방법에 관한 것이다: 자가 반응성 면역 세포를 기능화된 세포와 접촉시키는 단계, 여기서 기능화된 세포는 리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및 리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제를 임의의 순서로 대상체에 투여함으로써 제조되고: 여기서 기능화된 세포는 생체 내에서 제조되고, 여기서 기능화된 세포는 자가 반응성 면역 세포와 접촉하고, 자가 반응성 면역 세포가 면역결핍화된다. 구현예에서, 자가 반응성 면역 세포가 면역결핍되고 전신 면역억제가 유도되지 않는다. 구현예에서, 발생하지 않는 전신 면역억제는 장기적으로 광범위한 전신 면역억제이다. 구현예에서, 발생하지 않는 전신 면역억제는 장기적으로 광범위한 전신 면역억제이며 비가역적이다. 구현예에서, 자가 반응성 면역 세포는 자가 반응성 T-세포이다.
구현예에서, 대상체는 당뇨병이 발병할 위험이 있거나 당뇨병이 있거나, 대상체가 다발성 경화증이 발병할 위험이 있거나 다발성 경화증이 있다.
구현예에서, 자가면역 질환을 치료하는 것은 자가면역 질환의 증상의 중증도를 감소시키는 것이다. 한 구현예에서, 다발성 경화증을 앓는 대상체를 치료하는 것은 다발성 경화증 증상의 중증도를 감소시키는 것이다.
구현예에서, 기능화된 베타 세포 또는 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 이를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 Treg:Teff 비율을 조절하는 방법 또는 대상체에서 자가 반응성 이펙터 T-세포를 고갈시키는 방법.
따라서, 치료는 기존 질환 증상의 개선 또는 악화 방지, 추가 증상 발생의 예방, 증상의 근본적인 대사 원인을 개선 또는 예방, 장애 또는 질환의 억제, 예를 들어, 장애 또는 질환의 발달 저지, 장애 또는 질환의 완화, 장애 또는 질환의 퇴행 유발 질환 또는 장애로 인한 상태 완화, 또는 질환 또는 장애의 증상 중지를 포함한다.
용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 자가면역 질환의 증상의 중증도를 예방하거나 경감시키거나 감소시키는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료는 자가면역 질환에 직접적인 영향을 미치거나 치유, 억제, 억제, 예방, 중증도 감소, 발병 지연, 진행 지연, 진행 안정화, 관련된 증상 감소/개선, 또는 이의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 용어 "중증도 감소"는 치료 후 표시 또는 증상의 감소에 대한 임상적 또는 주관적 결정을 지칭한다.
용어 "대상체"는 자가면역 질환에 대한 치료가 필요하거나 발병하기 쉬운 포유동물 (예를 들어, 인간)을 지칭한다. 용어 대상체는 또한 예방적 또는 치료적 치료를 받는 포유동물 (예를 들어, 인간)을 지칭한다. 대상체는 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 쥐, 생쥐, 비인간 포유류 및 인간을 포함할 수 있다. 용어 "대상체"는 모든 면에서 건강하고 자가면역 질환의 징후를 나타내지 않거나 나타내지 않는 개인을 반드시 배제하는 것은 아니다.
본원에 사용된, 용어 "유기체"는 인간, 상기 언급된 것과 같은 비인간 영장류 및 이들의 임의의 형질전환 종을 포함하지만 이에 제한되지 않으며 임의의 살아있는 진학 생물을 추가로 포함한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 양의 조성물을 지칭한다. 그 결과는 질환이나 의학적 상태의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화 또는 생물학적 시스템의 기타 원하는 변경일 수 있다. 예를 들어, 치료적 사용을 위한 "유효량"은 질환 상태, 증상 또는 의학적 상태에서 임상적으로 관련된 변화를 제공하는 데 필요한 조성물의 양이다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "유효"량은 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, "유효량"이라는 표현은 일반적으로 활성 물질이 치료상 원하는 효과를 갖는 양을 지칭한다. 구현예의 조성물의 유효량 또는 용량은 일상적인 요인, 예를 들어 투여 방식 또는 경로 또는 약물 전달, 약제의 약동학, 감염의 중증도 및 경과, 피험자의 건강 상태, 상태 및 체중, 및 치료 의사의 판단을 고려하여 모델링, 용량 증량 또는 임상 시험과 같은 일상적인 방법에 의해 확인될 수 있다. 예시적인 투여량은 1일 대상체의 체중 킬로그램당 약 1 μg 내지 10 mg의 활성제 범위이다. 총 용량은 단일 또는 분할 용량 단위 (예를 들어, BID, TID, QID)로 제공될 수 있다. 환자의 질환이 호전되면 예방 또는 유지 치료를 위해 용량을 조정할 수 있다. 예를 들어, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는 원하는 치료 또는 예방 효과가 유지되는 수준까지 증상의 함수로서 감소될 수 있다. 물론 증상이 적절한 수준으로 완화되면 치료를 중단할 수 있다. 그러나, 환자는 증상의 재발에 따라 장기적으로 간헐적 치료가 필요할 수 있다. 환자는 장기간에 걸친 만성 치료가 필요할 수도 있다.
IV. 제조 방법
한 구현예에서, 당조작된 모이어티를 발현하도록 세포를 당조작하는 것을 포함하는 기능화된 세포를 제조하는 방법이 본원에 기술되고, 이는 만노사민 또는 갈락토사민의 아미드 잔기를 포함할 수 있고, 아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티, 또는 테트라진 모이어티를 추가로 포함할 수 있고; 기능화된 세포를 제조하기 위해 당조작된 모이어티를 통해 면역 체크포인트 분자를 공유적으로 연결한다. 한 구현예에서, 방법은 당조작 전에 대상체로부터 세포를 수확하는 것을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 연결 후 기능화된 세포를 보존하는 것을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 기능화된 세포는 제자리에서 제조된다. 생체 내 제조의 비제한적 예는 실시예 18에 기술되어 있다. 이 구현예의 특정 양태에서, 본원에 기재된 주제는 유기체에 기능화된 세포를 제조하는 생체 내 방법에 관한 것이며, 이는 다음을 임의의 순서로 유기체에 투여하는 것을 포함한다: 리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및 리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제, 여기서 기능화된 세포는 생체 내에서 제조된다. 특정 양태에서, 리간드 반응기는 아지드 모이어티를 포함한다. 특정 양태에서, 세포는 베타 세포, 슈반 세포, 희소돌기아교세포, 폐세포, 혈소판, 상피 세포, 간세포, 또는 활막 세포이다. 이 구현예의 양태에서, 생체 내 방법은 시알산 유사체를 함유하는 아지드와 같은 세포 표지제를 유리 약물 또는 나노입자 제형으로서 투여시킨 다음, 자유 체크포인트 리간드 또는 나노입자 제형으로서 세포 표지제에 접합할 수 있는 반응기를 함유하는 단일 또는 다중 면역 체크포인트 리간드의 투여하는 것을 포함하는, 2단계, 2성분 사전표적화 생체접합 전략을 활용한다. 바람직하게는, 투여는 i.v. 투여이다. 이 구현예의 양태에서, β 세포 표적화 엑센딘-4-기능화된 NP는 i.v. 투여 후 Ac4ManNAz를 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체 (GLP-1R)-과발현 β 세포에 선택적으로 전달한다. GLP-1R에 결합할 때, 엑센딘-4-기능화된 Ac4ManNAz NP는 β 세포를 신속하게 내재화할 수 있고, 캡슐화 Ac4ManNAz의 제어 방출을 가능하게 하고, 이는 세포 표면 단백질의 N-연결 글리코실화를 위해 아지도 시알산 유도체로 전환된다. 아지드-변형된 β 세포는 i.v.-투여된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig와 함께 균주-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 (SPAAC)를 위한 부위를 제공한다.
모든 제조 방법에서, 세포를 당조작은 세포를 화합물, 예를 들어 N-아지도아세틸만노사민테트라아세레이트, N-아지도아세틸만노사민, 아세틸화, N-아지도아세틸 갈락토사민-테트라아실화, 또는 N-아지도아세틸글루코사민, 아세틸화와 접촉시켜 세포 표면 상의 아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티, 또는 테트라진 모이어티, 또는 이의 혼합물 (각 경우 당조작된 모이어티로 지칭됨)을 갖는 세포를 제조하는 것을 포함한다.
세포 상의 모이어티를 면역 체크포인트 분자에 공유 결합시키는 것은 본원에 기술된 전략 중 하나에 의해 세포 표면 상의 당조작된 모이어티를 통해 면역 체크포인트 분자를 부착시키는 것을 포함한다.
세포를 수확하고 보존하는 것은 당업계에 알려져 있다. 수확된 세포를 얻고 세포를 보존하기 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다.
개시된 주제는 다음의 비제한적 실시예에서 추가로 설명된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만 단지 예시로서 제공된 것임을 이해해야 한다.
실시예
재료
N-아지도아세틸만노사민 테트라아실화 (Ac4ManNAz), 디벤조시클로옥틴-기능화된 올리고에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (DBCO-PEG13-NHS 에스테르; 95%), 및 트랜스-시클로옥텐-기능화된 올리고에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (TCO-PEG4-NHS 에스테르, ≥ 95%)를 Click Chemistry Tools (Scottsdale, AZ)에서 구입했다. 레플루노미드 (Pharmaceutical Secondary Standard), 물 (BioReagent), 아세토니트릴 (HPLC 등급, ≥ 99%), 디메틸 술폭시드 (무수, ≥ 99.9%), 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLGA, 에스테르 종결됨; Mw = 50 kDa - 70 kDa), 및 포름알데히드 용액 (4%, 완충, pH 6.9)을 Sigma (St Louis, MO)에서 구입했다.
폴리(락타이드-코-글리코라이드)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)-디벤조시클로옥틴 말단캡(DBCO-PEG-PLGA; Mw = (5 + 10) kDa = 15 kDa)을 Nanosoft Polymers (Winston-Salem, NC)에서 구입했다. 폴리(락타이드)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)-메틸테트라진 말단캡(MTZ-PEG-PLA; AI150; Mw = (16 + 5) kDa = 21 kDa), 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(D,L-락틱-코-글리콜)산 공중합체 (mPEG-PLGA; AK10; Mw = (3 + 20) kDa = 23 kDa), 및 폴리(락타이드-코-글리코라이드)-시아닌 5 (Cy5-PLGA; AV034, Mw = 30 - 55 kDa)을 Akina, Inc (West Lafayete, IN)에서 구입했다.
Alexa Fluor 488 NHS 에스테르, 텍사스 레드-X NHS 에스테르 (이성질체 혼합물), Zeba Spin 7K MWCO 탈염 컬럼 (Thermo Fisher), VivoTack 680 NIR 형광 이미징 제제 (Perkin Elmer LLC), 술포-시아닌 5 테트라진 (Lumiprobe), DynabeadsTM 마우스 T-활성화제 CD3/CD28 T 세포 활성화 비드 (Gibco), EasySepTM 마우스 CD4+ T 세포 분리 키트 (STEMCELL Technologies), EasySepTM 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트 (STEMCELL Technologies), 재조합 마우스 IL-2 (R&D Systems) 및 CellTiter96® AQueous MTS 파우더 (Promega)를 Fisher Scientific (Hampton, NH)에서 구입했다. 명시되지 않는 한, 유세포 분석 연구를 위한 모든 항체는 Fisher Scientific (Hampton, NH)에서 구입했다.
재조합 마우스 PD-L1-Ig 융합 단백질 (PD-L1-Ig; 분자량 = 102 kDa; PR00112-1.9), 및 재조합 마우스 CD86-Ig 융합 단백질 (CD86-Ig; 분자량 = 103 kDa; PR00226-1.9)을 Absolute Antibody NA (Boston, MA)에서 구입했다. 두 융합 단백질 모두 멸균된 1X PBS에 공급되었다. 마우스 인터페론 감마 ELISA 키트 (ab100689) 및 마우스 IL-17A ELISA 키트 (ab199081)를 Abcam PLC (Cambridge, MA)에서 구입했다.
항-CD25 항체 (InVivoMAb, 클론: PC-61.5.3, 카탈로그 번호: BE0012)를 BioXCell (Lebanon, NH)에서 구입했다.
EAE 유도 키트 (MOG35-55/CFA 에멀젼 (1 mg/mL의 MOG35-55를 함유) 및 맞춤형 PLP178-191/CFA 에멀젼 (0.25 mg/mL의 PLP178-191를 함유)64) Hooke Laboratories, Inc (Lawrence, MA)에서 구입했다.
방법
PD-L1-Ig 및 CD86-Ig 융합 단백질의 기능화: PD-L1-Ig 및 CD86-Ig 융합 단백질은 아민-NHS 에스테르 커플링 화학을 통해 기능화되었다51, 71. DBCO-기능화된 융합 단백질은 pH 8.0 (20℃)에서 2시간 동안 합 단백질과 DBCO-PEG13-NHS 에스테르 사이 아민-NHS 에스테르 커플링 반응을 통해 기능화되었다. 파일럿 기능화 연구에 대한 목표 기능화 정도는 15, 30, 및 45였으며, 목표 정도 45 (실제 기능의 정도는 약 9로 이어짐)를 후속 기능화 연구에 사용하였다. 기능화된 융합 단백질은 제조업체의 프로토콜에 따라 Zeba Spin 7K MWCO 탈염 컬럼으로 정제하였다. 상이한 정제된 DBCO-접합된 융합 단백질의 DBCO 혼입의 농도 및 정도는 제조업체의 지침에 따라 310 nm에서 DBCO의 흡수 계수 (εDBCO,310nm) = 12,000 M-1 L cm-1, 280 nm에서 마우스 면역글로불린의 흡수 계수 (ε280nm) = 1.26 mg-1 mL cm-1 (PD-L1-Ig의 경우)/1.34 mg-1 mL cm-1 (CD86-Ig의 경우), 및 280 nm에서 DBCO 보정 인자 (CFDBCO,280nm) = 1.089를 사용하여 분광학적으로 결정되었다. TCO-기능화된 융합 단백질을 목표 기능화 정도 45로 동일한 방법을 통해 제조하였다. A488-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 텍사스 레드 (TexRed)-표지된 DBCO-기능화된 CD86-Ig를 각각 목표 기능화 정도 45 및 5로 동일한 방법을 통해 제조하였다. 정제된 염료-표지된 융합 단백질의 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher)를 통해 정량화되었다. 알려진 농도의 융합 단백질에 속하는 접합 염료 분자의 수는 접합된 A488 염료에 대해 71,000 M-1 L cm-1 (495 nm에서) 또는 접합된 텍사스 레드에 대해 80,000 M-1 L cm-1 (595 nm에서)의 흡수 계수를 사용한 해당 UV-가시광선 흡수 스펙트럼으로 계산하였다.
무약물/LEF-캡슐화 DBCO/MTZ-기능화된 PEG-PLGA NP의 제조: 무약물 DBCO/MTZ-기능화된 PEG-PLGA NP (DBCO/MTZ NP)는 나노침전 방법을 통해 제조하였다 71. 30 mg의 DBCO/MTZ NP를 제조하기 위해, 9 mg의 DBCO-PEG-PLGA, 9 mg의 MTZ-PEG-PLA, 12 mg의 mPEG-PLGA, 및 6 mg PLGA (페이로드로 간주)를 3 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. 그런 다음 중합체 블렌드를 일정하게 교반하면서 (1,000 rpm) 12 mL의 탈이온수에 천천히 첨가하였다 (1 mL/분). 혼합물을 감압 하에서 2시간 동안 교반한 후 제조업체의 프로토콜에 따라 Amicron Ultra 한외여과 막 필터 (MWCO 100,000)를 통해 3회 정제하였다. 비-기능화된 PLGA 대신 Cy5-표지된 PLGA를 사용하는 것을 제외하고 동일한 방법을 통해 Cy5-표지된 DBCO/MTZ NP를 제조했다.
LEF-캡슐화 DBCO/MTZ-기능화된 PEG-PLGA NP (DBCO/MTZ LEF NP)는 NP를 제조하기 위한 중합체 블렌드에 7.25 wt/wt%의 LEF를 첨가하여 동일한 나노 침전 방법을 통해 제조되었다. 이전에 보고된 바와 같이, 정제된 NP의 LEF 부하는 형광 분광분석 (여기 파장 = 280 ± 20 nm; 방출 파장 = 410 ± 20 nm)을 통해 정량화되었다. 시험관 내 약물 방출 연구는 37℃ (암실)에서 과량의 1X PBS의 존재하에 Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치 (20K MWCO, Thermo Fisher)를 통해 수행되었다. NP에서 방출되지 않은 LEF는 형광 분광분석을 통해 정량화되었다53.
1X PBS에 현탁된 무약물 및 LEF-캡슐화 NP는 투과 전자 현미경 (TEM) 및 동적 광산란 방법으로 특성화되었다. TEM 이미지는 UNC 의과대학 현미경 서비스 연구소 (MSL)의 JEOL 1230 투과 전자 현미경에 기록되었다. 이미징 연구 전에, 탄소 코팅 구리 그리드를 글로우 방전시키고, 샘플을 텅스텐 아세테이트 (pH 7)로 음성 염색했다. 정제된 두 NP (1X PBS에 현탁됨)의 강도 평균 직경을 Zetasizer Nano ZSP 동적 광산란 기기 (Malvern)로 측정했다.
시험관 내 연구
세포주. C57BL/6 마우스로부터 분리한 마우스 슈반 세포 (MSC, 카탈로그 번호: T0295)를 Applied Biological Materials Inc. (ABM Inc.; Richmond, BC)에서 구입했다. MSC는 Prigow III 배지 (카탈로그 번호 TM003; ABM Inc.)에서 G422 Applied Cell 세포외 매트릭스-코팅된 세포 배양 플래시 (카탈로그 번호: G422; ABM Inc.)에서 배양했다. 이는 제조업체의 프로토콜에 따라 10% FBS (Sigma)로 보충되었다.
C57BL/6 마우스로부터 분리한 마우스 희소돌기아교세포 (MOL, 카탈로그 번호: 11004-02)를 Celprogen, Inc. (San Pedro, CA)에서 구입했다. MOL은 제조업체의 프로토콜에 따라 혈청이 있는 (카탈로그 번호: M11004-25; Celprogen, Inc) 마우스 희소돌기아교세포 1차 세포 배양 완전 배지에서 G422 Applied Cell 세포외 매트릭스-코팅된 세포 배양 플래시 (카탈로그 번호: G422; ABM Inc.)에서 배양되었다.
MSC 및 MOL의 MOG 및 PLP 발현은 항-미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 항체 (카탈로그 번호: A3992, ABclonal) 및 항-PLP1 다클론 항체 (카탈로그 번호: A20009, Abclonal)로 염색한 후 FACS 방법을 통해 별도로 정량화되었다. 비-표지된 토끼 항체 모두 A488-표지된 항-토끼 IgG (H+L) 교차 흡착 항체 (카탈로그 번호: A-11008, Invitrogen)로 가시화되었다. 인슐린종 세포주에 의해 확립되고 C57BL/6 마우스로부터 분리된 MIN-6 세포 (ATCC)를 두 항체 모두에 대한 음성 대조군으로 사용하였다.
MOG-특이적 CD4+ T 세포 (2D2 세포)를 이전에 보고된 바와 같이 2D2 마우스로부터 분리했다56. 간략하게, CD4+ T 세포는 주어진 제조업체의 규칙에 따라 EasySepTM 마우스 CD4+ T 세포 분리 키트 (STEMCELL Technologies)를 통한 면역자기 음성 선택 방법을 사용하여 2D2 마우스 (C57BL/6-Tg (Tcra2D2, Tcrb2D2) 1Kuch/J; 암컷, 7-8주령, 스톡 번호: 006912, The Jackson Laboratory)의 비장세포로부터 분리했다.
CD8+ T 세포는 EasySepTM 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트 (STEMCELL Technologies)를 통한 면역자기 음성 선택 방법을 사용하여 야생형 C57BL/6 마우스 (암컷, 약 8주령; Charles River Laboratories)의 비장세포로부터 분리했다. 분리 후, CD8+ T 세포를 2 mL 배지로 웰당 2×106 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하였다. T 세포는 항-CD3/항CD28 항체-접합된 비드 (Life Technologies, Grand Island, NY)와 추가 연구 전 48시간 동안 10% v/v 소 태아 혈청 (FBS, Seradigm), 2mM GlutaMAX 보충제 (Gibco), 및 항생제-항진균제 (항-항; 100 단위의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 및 0.25 μg/mL의 암포테리신 B; Gibco)로 보충된 완전 RPMI 1640 (Gibco) 배지에서 2,000 IU/mL의 재조합 마우스 IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN)의 존재 하에 2:1의 비드- 대-세포 비율로 확장되었다.
Ac4ManNAz 및 LEF의 시험관 내 독성, 및 기능화된 MSC 및 MOL의 생존력: MSC 및 MOL에 대한 Ac4ManNAz 및 LEF의 시험관 내 독성, 및 기능화된 MSC 및 MOL의 생존력을 MTS 분석으로 정량화하였다. 간략하게, 처리된/기능화된 세포를 완전 배지에서 4일 동안 배양하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 MTS 분석을 통해 생존력을 정량화하기 전에 페놀 레드 배지를 페놀 레드가 없는 DMEM (10% FBS로 보충됨)으로 교체되었다. 96-웰 플레이트에서 MSC는 웰당 2×104 세포의 밀도로 접종되었고 MOL은 웰당 1×104 세포의 밀도로 접종되었다.
아지드-변형된 MSC 및 MOL의 제조: 아지드-변형된 MSC 및 MOL은 4일 동안 50 μM의 Ac4ManNAz를 함유하는 완전 성장 배지에서 배양하여 생성되었다. Ac4ManNAz-함유 배양 배지는 48시간마다 교체되었다. 아지드-변형된 세포는 후속 연구를 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 TrypLETM Express 효소 (Gibco)를 통해 분리되었다. Ac4ManNAz-함유 배양 배지는 48시간마다 교체되었다.
PD-L1-Ig 및 CD86-Ig를 사용한 아지드-변형된 MSC 및 MOL의 기능화: MSC 및 MOL을 기능화하기 위해 두 가지 생체접합 방법을 조사했다.
직접 생체접합 방법에서, DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 및/또는 CD86-Ig는 1시간 동안 37℃에서 SPAAC를 통해 아지드-변형된 MSC 또는 MOL에 접합되었다. 목표 기능화 정도는 100만 세포당 5 μg 융합 단백질이었다. 생체접합은 mL당 2천만 세포에서 수행되었다. 기능화된 MSC 또는 MOL은 원심분리 (300 g, 3 - 4분, 3회)를 통해 정제하고 후속 시험관 내 연구를 위해 완전 배지 또는 후속 생체 내 연구를 위해 1X PBS에 재현탁되었다.
NP-사전 앵커링 방법에서, DBCO/MTZ NP는 먼저 1시간 동안 37℃에서 SPAAC를 통해 아지드-변형된 MSC 또는 MOL에 접합되었다. 목표 기능화 정도는 100만 세포당 500 μg의 DBCO/MTZ NP (세포 농도: mL당 2천만 세포)였다. NP-기능화 MSC 또는 MOL는 원심분리 (300 g, 3 - 4분, 3회)를 통해 정제되었다. TCO-기능화된 PD-L1-Ig 및/또는 CD86-Ig는 1시간 동안 37℃에서 IEDDA를 통해 NP-기능화 MSC/MOL에 첨가되었다. 첫 번째 생체접합 방법과 마찬가지로, 목표 기능화 정도는 백만 세포당 5 μg 융합 단백질(들)이었다. 기능화된 MSC 또는 MOL은 원심분리 (300 g, 3 - 4분, 3회)를 통해 정제되고 후속 시험관 내 연구를 위해 완전 배지 또는 후속 생체 내 연구를 위해 1X PBS에 재현탁되었다. 선택된 생체 내 실험적 그룹의 경우, 기능화된 MSC를 EAE 마우스에 투여하기 전 100 Gy X-선 조사 (160 kV 및 24 mA에서 작동하는 RS2000 생물학적 조사기를 통해)를 적용했다.
접합된 융합 단백질(들)의 양은 생체접합을 위해 A488-표지된 PD-L1-Ig (여기 파장 = 480 ± 20 nm; 방출 파장 = 525 ± 20 nm) 또는 텍사스 레드-표지된 CD86-Ig (여기 파장 = 550 ± 20 nm; 방출 파장 = 640 ± 20 nm)를 사용하여 형광 분광분석을 통해 정량화하였다. MSC- 및 MOL-접합된 NP의 양은 생체접합을 위해 Cy5-표지된 DBCO/MTZ NP (여기 파장 = 640 ± 20 nm; 방출 파장 = 780 ± 20 nm)를 사용하여 형광 분광분석 방법을 통해 정량화하였다. 기능화된 염료-표지된 세포를 형광 분광 측정 전에 PBS로 교환했다. 염료-표지된 융합 단백질 및 NP의 분리를 형광 분광분석을 통해 모니터링했다.
비변형 및 기능화된 MSC 및 MOL의 PD-L1 및 CD86 발현을 정량화하기 위해 시간 의존적 FACS 연구를 사용했다. 원하는 시점에 세포를 분리하고 랫트 항-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록; BD Bioscience)로 차단한 후 PE-표지된 항-마우스 PD-L1 항체 (클론: MIH5, 카탈로그 번호: 12-5982-82; Invitrogen) 및 FITC-표지된 항-마우스 CD86 항체 (클론: GL1; 카탈로그 번호: 11-0862-82; Invitrogen)로 염색했다. 그런 다음 염색된 세포를 4% 파라포름알데히드 (4% PFA; Sigma)로 고정하고 추가 FACS 연구 전에 4℃에서 암실에 보관했다. 상이한 기능화된 MSC의 PD-L1 및 CD86 발현은 PE-표지된 항-마우스 PD-L1 항체 (클론: MIH5, 카탈로그 번호: 12-5982-82; Invitrogen) 및 FITC-표지된 항-마우스 CD86 항체 (클론: GL1; 카탈로그 번호: 11-0862-82; Invitrogen)로 염색한 후 CLSM 방법으로 추가로 평가하였다.
CLSM 연구의 경우, MSC를 12-웰 플레이트에서 G422 Applied 세포 세포외 매트릭스-코팅 현미경 커버슬립 (1 cm 직경)에 접종했다. 세포는 4일 동안 50 μM의 Ac4ManNAz로 배양한 후, DBCO-기능화된 PD-L1-Ig 및/또는 CD86-Ig, 또는 DBCO/MTZ NP에 이어 TCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig로 기능화했다. 다음으로, MSC를 PE-표지된 항-PD-L1로 염색하고, FITC-표지된 항-CD86을 Zeiss LSM 710 스펙트럼 공초점 레이저 스캐닝 현미경에서 기록하였다.
전계-방출 주사 전자 현미경연구의 경우, MSC를 12-웰 플레이트에서 G422 Applied 세포 세포외 매트릭스-코팅 현미경 커버슬립 (1 cm 직경)에 접종했다. 세포는 4일 동안 50 μM의 Ac4ManNAz로 배양한 후, DBCO/MTZ NP에 이어 TCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig로 기능화했다. 그런 다음 기능화 후, MSC는 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하기 전에 10 mM 염화마그네슘 함유 1X PBS로 3회 세척되었다. FE-SEM 이미지는 UNC 의과대학 MSL에서 Zeiss Supra 25 FESEM 현미경을 사용하여 기록되었다.
미엘린 특이적 CD4 T 세포 시험관 내 활성화: 활성화된 미엘린 특이적 2D2 세포로부터 분비된 마우스 IFN-γ 및 마우스 IL-17A를 이전에 보고된 바와 같이 ELISA 검정으로 정량화하였다56. 미엘린 특이적 2D2 세포의 PD-1 및 CTLA-4 발현은 FACS 방법을 통해 정량화하였다. 간략하게, 2D2 세포 (이펙터 세포 (E))는 48시간 동안 10:1의 E:T 비율로 상이한 비-기능화 및 기능화된 MSC 및 MOL (표적 세포 (T): 2D2 세포와 공동 배양 전 4시간 동안 접종된 6-웰 플레이트에서 웰당 5×104 세포)와 배양되었다. 세포 배양 배지 (주로 2D2 세포를 함유)를 보존하였다. 2D2 세포는 10분 동안 1,000g에서 원심분리를 통해 배양된 배지로부터 수집되었다. 상청액에서 마우스 IFN-γ 및 마우스 IL-17A 농도는 제조업체의 지침에 따라 마우스 IFN-γ ELISA 키트 (ab100689; Abcam, Cambridge, MA) 및 마우스 IL-17A ELISA 키트 (ab199081; Abcam, Cambridge, MA)를 통해 정량화되었다. 분리된 2D2 세포의 PD-1 및 CTLA-4 발현은 A488-표지된 항-마우스 PD-1 항체 (클론: MIH4, 카탈로그 번호: 53-9969-42, Invitrogen), PE-표지된 항-마우스 CTLA-4 항체 (클론: UC10-4B9, 카탈로그 번호: 50-106-52, Invitrogen), 및 eFluor 660-표지된 항-마우스 CD3 항체 (클론: 17A2, 카탈로그 번호: 50-0032-82, Invitrogen) 로 염색한 후 FACS 방법을 통해 정량화되었다56. 염색된 세포는 4% 파라포름알데히드 (4% PFA; Sigma)로 고정하고 추가 FACS 연구 전에 4℃에서 암실에 보관했다.
나이브 2D2 세포의 IL10+ FoxP3+ Treg 세포로의 분화는 이전에 보고된 바와 같이 FACS에 의해 정량화되었다56. 2D2 세포는 72시간 동안 10:1의 E:T 비율로 상이한 비-기능화 및 기능화된 MSC 및 MOL (2D2 세포와 공동 배양 전 4시간 동안 접종된 6-웰 플레이트에서 웰당 5×104 세포)과 간단히 배양되었다. 2D2 세포는 10분 동안 1,000g에서 원심분리를 통해 배양 배지로부터 수집되었다. 분리된 세포를 먼저 eFluor 660-표지된 항-마우스 CD3 항체 (클론: 17A2, 카탈로그 번호: 50-0032-82, Invitrogen)로 염색하였다. 그런 다음 세포 내 염색 투과 세척 완충액 (Biolegend)을 사용하여 투과 전에 4% PFA로 고정했다. 또한, FACS 연구를 위해 A488-표지된 항-마우스 FoxP3 항체 (클론: MF23, 카탈로그 번호: 560403, BD Bioscience) 및 PE-표지된 항-마우스 IL10 항체 (클론: JES5-16E3, 카탈로그 번호: 561060, BD Bioscience)로 염색하였다.
항원-비-특이적 세포독성 T 세포 거주의 정량화: 기능화된 MSC가 세포독성 T 세포 활성화를 억제하는 능력을 CellTrace CFSE 세포 증식 분석 (Thermo Fisher)으로 정량화했다. 간략하게, CFSE-표지된 확장된 CD8+ T 세포 (야생형 C57BL/6 마우스로부터 분리됨)를 1몰 당량 (대 CD8+ T 세포)의 DynabeadsTM 마우스 T-활성화제 CD3/CD28 T 세포 활성화 비드 (Gibco)의 존재하에 48시간 동안 10:1의 E:T 비율로 접종된 비변형/ 기능화된 MSC와 배양하였다72. CFSE-표지된 CD8+ T 세포의 증식을 FACS를 통해 정량화하였다.
생체 내 연구
동물은 노스캐롤라이나 대학의 무균 환경에서 비교 의학부 (AAALAC-인증 실험 동물 시설)에서 유지되었다. 실험 동물과 관련된 모든 절차는 노스캐롤라이나 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (NIH 간행물 번호 86-23, 1985 개정)를 준수했다.
i.v. 투여된 비변형 및 PD-L1-Ig/CD96 FcIg NP-기능화 MSC의 생체 내 독성: i.v. 투여된 MSC 및 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC (2백만 세포/마우스)의 장기 생체 내 독성을 건강한 C56BL/6 마우스 (15주령, 암컷, Charles River Laboratories)에서 평가하였다. 투여 후 매주 마우스의 체중을 모니터링하였다. 5주 후, 마우스를 케타민 과다복용을 통해 안락사시켰다. 전혈 및 주요 장기는 임상 화학 및 조직병리학적 연구를 위해 보존되었다.
EAE 유도 및 임상 평가: 광폭형 C57BL/6 마우스 (암컷, 15-16주령)에서 활성 면역화 방법을 통해 EAE를 유도하였다. C56BL/6 마우스에서 MOG35-55 EAE의 유도를 위해, 200 μl의 MOG35-55/CFA 에멀젼 (200 μg의 MOG35-55 및 약 0.8 mg의 열 사멸 결핵균 함유; Hooke Laboratories, Lawrence, MA)을 각각의 C56BL/6 마우스에 피하 투여하였다. C56BL/6 마우스에서 PLP178-191 EAE의 유도를 위해, 200 μl의 PLP178-191/CFA 에멀젼 (50 μg의 PLP178-191 및 약 0.8 mg의 열 사멸 결핵균 함유; Hooke Laboratories, Lawrence, MA)을 각각의 C56BL/6 마우스에 피하주사하였다. EAE 유도를 위해 백일해 독소를 투여하지 않았다. 체중 및 임상 징후를 면역화 후 매일 모니터링하였다. EAE 임상 징후는 다음과 같이 0 내지 5.0 척도로 점수화하였다: 점수 0: 정상 마우스; 점수 0.5: 부분적 꼬리 마비; 점수 1.0: 완전 꼬리 마비; 점수 1.5: 절뚝거리는 꼬리 및 뒷다리 억제; 점수 2.0: 절뚝거리는 꼬리 및 뒷다리 쇠약; 점수 2.5: 절뚝거리는 꼬리 및 한쪽 다리에 움직임이 없음; 점수 3.0: 완전 뒷다리 마비; 점수 4.0: 뒷다리 마비 및 앞다리 쇠약; 점수 5.0: 빈사상태. 마비된 쥐는 음식과 물에 더 쉽게 접근할 수 있었다. 명시되지 않는 한, MSC 및 MOL은 꼬리 정맥 i.v. 주사를 통해 투여되었다. 예방적 연구를 위해, 비변형 MSC 또는 기능화된 MSC (마우스당 2백만 세포)를 면역화 후 1일에 투여했다. 치료적 치료 연구를 위해, EAE에 걸린 마우스가 심각한 EAE 증상 (EAE 점수 * 2.0)을 나타낼 때 비변형 MSC 또는 기능화된 MSC (마우스당 2백만 세포)를 p.i. 17일 또는 18일에 투여했다. 선택된 연구의 경우, 기능화된 MSC의 부스터 용량을 p.i. 28일 또는 35일에 i.v. 투여했다. 선택된 생체 내 연구에서, 기능화된 MSC 및 MOL을 뒷다리의 경직된 근육에 근육 내 투여했다. 명시되지 않는 한, 마우스를 안락사시켰고, 척추는 추가 조직병리학적 연구를 위해 전신 관류 방법을 통해 p.i. 36일 또는 37일째에 보존했다. 보존된 척추는 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), Luxol fast 블루 (LFB), 및 항-CD4 및 항-FoxP3 면역조직화학 염색을 위해 UNC 의과대학 동물 조직병리학 및 실험실 의학 코어에서 처리되었다. H&E- 및 LFB-염색 슬라이드는 ScanScope AT2 (Leica Biosystems) 병리학 슬라이드 스캐너를 통해 이미지화되었다. 척수 염증은 대표적인 H&E-염색 절편에서 정량화되었다73. 항-CD4 및 항-FoxP3 면역형광-염색 슬라이드는 ScanScope FL (Leica Biosystems) 병리학 슬라이드 스캐너를 통해 이미지화되었다.
Treg 세포 고갈 연구: Treg 세포 고갈 연구를 MOG35-55 EAE에 걸린 마우스에서 수행하여 생체조작된 MSC에 의해 유도된 Treg 세포가 면역관용을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 입증했다. Treg 세포는 이전에 보고된 바와 같이 750 μg의 항-CD25 항체 (InVivoMAb, 클론: PC-61.5.3, 카탈로그 번호: BE0012; BioXCell)의 i.p. 투여로 고갈되었다. 예방적 연구를 위해, 항-CD25 항체는 p.i. 1, 3, 및 5일에 투여되었다 (3×250 μg의 항-CD25)65. PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 p.i. 2일에 i.v. 투여하였다. 치료적 연구를 위해, 항-CD25 항체를 p.i. 17, 19, 및 21일에 투여하였다 (3×250 μg의 항-CD25). 마우스의 평균 임상 점수가 2.0일 때, PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 p.i. 18일에 i.v. 투여하였다. 체중 및 임상 징후를 면역화 후 매일 모니터링하였다. 대조군 그룹 EAE에 걸린 마우스는 기능화된 MSC로 치료 전후에 항-CD25의 i.p. 주사를 받지 않았다.
MOG35-55 EAE에 걸린 마우스에서 i.v. 투여된 MSC의 생체 내 생체분포 연구: i.v. 투여된 MSC의 생체분포를 생체 외 NIR 형광 이미징 방법으로 측정하였다. 생체분포 연구를 위해, 비-기능화된 또는 아지드-기능화된 MSC를 제조업체의 프로토콜에 따라 먼저 VivoTag 680 (VT680) 형광 염료 (Perkin Elmer)로 표지하였다. VT680-표지된 아지드-변형된 MSC는 비-표지된 MSC와 동일한 방법을 통해 기능화되었다. 예방적 이미징 그룹의 경우, 상이한 VT680-표지된 MSC를 p.i. 1일 i.v. 투여하였다. MSC 투여 48시간 후 마우스를 안락사시켰고, 주요 기관은 UNC 의과대학의 생물 의학 연구 이미징 센터에서 AMI HT 광학 이미징 시스템 생체 외 이미징 연구를 위해 보존했다 (여기 파장 = 675 ± 25 nm, 방출 파장 = 730 ± 25 nm, 노출 시간 = 30 s, 여기 전력 = 40%). 치료적 이미징 그룹의 경우, 상이한 VT680-표지된 MSC를 p.i. 17일에 i.v. 투여하였다. 마우스를 표지된 MSC의 투여 48시간 후 안락사시켰다. 주요 기관은 UNC 의과대학의 생물 의학 연구 이미징 센터에서 AMI HT 광학 이미징 시스템 생체 외 이미징 연구를 위해 보존했다 (여기 파장 = 675 ± 25 nm, 방출 파장 = 730 ± 25 nm, 노출 시간 = 30 s, 여기 전력 = 40%). 각 기관에 축적된 VT-680-표지된 MSC의 주사 용량 백분율 (% ID)는 상이한 표준 VT680-표지된 MSC 샘플의 형광 강도를 비교하여 계산되었다.
생체 내 기계론적 연구: MOG35-55 EAE에 걸린 마우스에서 기계론적 연구를 수행했다. 예방적 치료 그룹의 경우, 마우스는 p.i. 2일에 비변형/기능화된 MSC의 i.v. 투여를 받았다. 마우스를 p.i. 5 또는 38일에 안락사시켰고, 비장은 추가 기계론적 연구를 위해 보존되었다. 한편, 치료적 치료 그룹의 마우스는 p.i. 18일차에 비변형/기능화된 MSC의 i.v. 투여를 받은 다음 처리된 마우스는 p.i. 21 또는 38일에 안락사되었고, 비장 및 척수는 추가 기계론적 연구를 위해 보존되었다.
모든 세포 기반 분석은 비장과 척수의 단일 세포 현탁액에서 수행되었다. 비장 세포의 분리를 위해 갓 보존된 비장을 HBBS 완충액에서 세포 스트레이너 (70 μm; Fisher)를 통해 으깨었다. 제조업체의 프로토콜에 따라 ACK 용해 완충액 (Gibco)으로 적혈구를 제거했다. 분리된 비장세포를 먼저 T-Select I-Ab MOG35-55 테트라머 PB (카탈로그 번호: TS0M704-1; MBL International, Woburn, MA)로 염색했다. 결합되지 않은 테트라머를 제거한 후, 세포를 Fixable Viability Stain 510 (카탈로그 번호: 564406; BD Bioscience)로 염색한 다음, A488-표지된 항-마우스 CD4 항체 (클론: GK1.5; Invitrogen)로 염색했다. 그런 다음 세포를 세포 내 염색 투과화 세척 완충액 (Biolegend)을 사용하여 투과화하기 전에 4% PFA (Sigma)로 고정시켰다. 그런 다음 이들을 FACS 연구를 위해 DyLight 650 항-마우스 FoxP3 다클론 항체 (카탈로그 번호: PA5-22773, Invitrogen), PE-시아닌 7-표지된 항-마우스 ROR-γ 항체 (클론: B2D; 카탈로그 번호: 25-6981-82, Invitrogen), 및 PE-시아닌 5-표지된 항-마우스 T-베타 항체 (클론: 4B10; 카탈로그: 15-5825-82)로 염색했다.
CNS-침윤된 림프구는 이전에 보고된 바와 같이 신선하게 보존된 척수로부터 분리되었다. 분리된 척수를 작은 조각으로 절단하고 37℃에서 20분 동안 콜라게나제 D (1 mg/mL; Roche) 및 DNase I (0.1 mg/mL, Roche)을 함유하는 완충액에서 소화시켰다. 세포 스트레이너 (70 μm; Fisher)를 통해 조직을 으깨어 단일 세포를 수집하였다. 이전에 보고된 바와 같이 원심분리 방법을 통해 Percoll 구배 (GE Healthcare)를 사용하여 (37%와 70% Percoll 구배 사이 계면에서) 림프구를 분리했다. 분리된 림프구를 2개의 절반으로 나누었다. 림프구의 절반을 먼저 Fixable Viability Stain 510 (카탈로그 번호: 564406; BD Bioscience)으로 염색한 다음, A488-표지된 항-마우스 CD8a 항체 (클론: 53-6.7; 카탈로그: 53-0081-82, Invitrogen)로 염색했다. 그런 다음 세포를 세포 내 염색 투과화 세척 완충액 (Biolegend)을 사용하여 투과화 전 4% PFA (Sigma)로 고정시켰고, FACS 연구를 위해 PE-시아닌 7 항-마우스 IFN-감마 항체 (클론: XMG1.2; 카탈로그 번호: 25-7311-41, Invitrogen)로 염색하였다. 분리된 림프구의 나머지 절반에 대해, 제조업체의 프로토콜에 따라 세포는 먼저 T-Select I-Ab MOG35-55 테트라머 PB (카탈로그 번호: TS0M704-1; MBL International, Woburn, MA)로 염색되었다. 결합되지 않은 테트라머를 제거한 후, 세포는 Fixable Viability Stain 510 (카탈로그 번호: 564406; BD Bioscience) 및 A488-표지된 항-마우스 CD4 항체 (클론: GK1.5; Invitrogen)로 염색되었다. 이전 단계와 유사하게, 세포는 세포 내 염색 투과화 세척 완충액 (Biolegend)을 사용하는 투과화 전 4% PFA (Sigma)로 고정시켰다. 마지막으로, FACS 연구를 위해 이들을 DyLight 650 항-마우스 FoxP3 다클론 항체 (카탈로그 번호: PA5-22773, Invitrogen), PE-시아닌 7 항-마우스 IFN-감마 항체 (클론: XMG1.2; 카탈로그 번호: 25-7311-41, Invitrogen), 및 PE-eFluor 610-표지된 항-마우스 IL-17A 항체 (클론: 17B7; 카탈로그 번호: 61-7177-82, Invitrogen)로 염색하였다.
통계 분석: 실험의 샘플 크기를 미리 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않았다. 정량적 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표현되었다. 분산 분석은 Graph Pad Prism 6 소프트웨어 팩의 양측 t-테스트를 사용하여 완료되었다. * P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 1: NIT-1 세포의 기능화
대사 당조작 및 이중직교 클릭 화학이 면역 체크포인트 분자로 NIT-1 세포 (당뇨병전 NOD 마우스로부터 분리된 췌장 β 세포)의 기능화를 촉진한다는 것을 입증하기 위해, PD-L1을 아지드-변형된 NIT-1 세포에 대한 두 가지 균주-촉진된 알킨-아지드 고리첨가 (SPACC) 기능화 전략을 시험하기 위해 모델 리간드로 사용하였다 (도 2). 아지드-변형된 NIT-1 세포는 4일 동안 20 μM의 N-아지도아세틸만노스아민-테트라아실화 (Ac4ManNAz)로 시험관 내 배양하여 얻었다 (도 3(a)). Ac4ManNAz의 대사는 ManNAz를 NIT-1 세포의 세포막에 있는 뮤신-유형 O-연결된 당단백질로 통합한다. 변형된 NIT-1 세포 상의 아지드 그룹의 존재는 Alexa Fluor 488 (A488)-기능화된 디벤조시클로옥틴 (DBCO)에 의한 라벨링을 사용하여 확인되었다 (도 4).
두 가지 상이한 기능화 전략의 접합 효율을 조사했다 (도 5). 한 가지 전략은 2가 DBCO-기능화된 PD-L1 (PD-L1-DBCO)를 사용했다 (도 5(a)). 다른 전략은 다가 DBCO-기능화된 덴드리머-접합된 PD-L1 (PD-L1-Dend)을 사용했다 (도 5(b)). PD-L1-DBCO 리간드는 아민-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 커플링 반응을 통해 접합된 평균 2개의 DBCO 리간드로 기능화되었다 (도 6(a) 및 7(a)). PD-L1-Dend는 DBCO-기능화된 폴리아미도아민 덴드리머 G5 (평균 15개의 DBCO 분자로 기능화; 도 8)과 몰 당량의 아지드-기능화된 PD-L1 사이 SPACC를 사용하여 제조되었다 (도 6(b) 및 7(a)). 기능화된 PD-L1 리간드는 백만 세포당 10 μg의 기능화된 PD-L1의 표적 로딩에서 이중직교 SPACC를 통해 아지드-변형된 NIT-1 세포에 접합되었다 (도 5). 라벨링 연구에서 텍사스 레드-표지된 PD-L1 (TR-PD-L1)을 사용하여, 100만 개의 NIT-1 세포의 각각의 배치는 1.4 μg의 TR-PD-L1-DBCO 또는 4.4 μg의 TR-PD-L1-Dend로 기능화된 것을 측정했다 (도 9). TR-PD-L1-Dend에 대해 기록된 더 높은 접합 효율은 덴드리머에 의해 유발된 다가 효과로 설명될 수 있다.
또한, 유세포 분석법 (FACS; 도 10) 및 공초점 형광 현미경 (CLSM; 도 11) 연구는 준비된 PD-L1-Dend-기능화된 NIT-1 세포가 DBCO를 통해 기능화된 것보다 NIT-1 세포의 표면에서 약 26배 더 많은 활성 PD-L1을 함유하고 있음이 밝혀졌다. 이것은 접합된 PD-L1-DBCO 분자의 상당수가 NIT-1 세포에 접합된 후 잘못 배향되었음을 시사한다.
추가 시간 의존적 연구는 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 PD-L1 발현이 접합 후 유사분열 및 글리칸/막 재순환으로 인해 점차 감소하는 것으로 나타났다. PD-L1-DBCO-기능화된 NIT-1 세포의 PD-L1 발현은 접합 후 3일 내에 배경 수준으로 떨어졌지만, PD-L1-Dend-기능화된 NIT-1 세포는 적어도 5일 동안 일정 수준의 PD-L1을 유지했다 (도 10). 이는 다가 덴드리머-기반 기능화 접근법이 보다 효과적인 접합을 촉진하고 접합된 생체 분자의 기능을 더 오랜 기간 동안 유지할 수 있음을 나타낸다. 추가 시험관 내 독성 연구는 대사 라벨링 방법이 조작된 NIT-1 세포의 증식에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인했다 (도 3(b)). 따라서, 덴드리머-기반 접합 전략을 사용하여 CD86- 및 Gal-9-단일-기능화 NIT-1 세포를 PD-L1/CD86/Gal-9-삼중-기능화된 NIT-1 세포와 함께 조작했다. FACS 및 CLSM 연구는 NIT-1 세포에 대한 다가 면역 체크포인트 분자(들)의 성공적인 장식을 확인했다 (도 3(b), 12 및 13).
실시예 2: PD-L1-기능화된 NIT-1 세포는 자가 반응성 T 세포에서 면역학적 관용을 유도하고 조기 발병 고혈당증을 역전시킨다
PD-L1-기능화된 NIT-1 세포가 자가 반응성 T 세포에서 면역학적 관용을 유도하고 NOD 마우스에서 조기 발병 고혈당증 (혈당증 > 250 mg/dl)을 역전시킬 수 있음을 입증하기 위해, PD-L1-기능화된 NIT-1 세포를 조기 발병 고혈당증 마우스에 췌장 내로 투여하여 기능화된 β 세포가 자가 반응성 T 세포와 직접 인터페이스할 수 있도록 하였다 (도 14). PD-L1-Dend-기능화된 NIT-1 세포로 처리된 마우스의 2/3는 처리에 대한 초기 반응을 나타냈고 (즉, 처리 후 적어도 3주 동안 정상혈당이 되었음; 도 14(b-e)), 그들은 유의하게 연장된 생존을 가졌다 (생존 중앙값, MS = 77일; 도 14(f)). 아지드-변형된 NIT-1 세포 및 접합되지 않은 ("유리") PD-L1로 처리된 마우스는 MS = 35일을 가졌다 (p = 0.0242 대 비-치료 그룹; 도 14(f)). 한편, PD-L1-DBCO-기능화된 NIT-1 세포로 처리된 마우스의 1/3만이 처리에 대한 초기 반응을 보였고 (도 14(b-e)), 비-기능화된 NIT-1 세포로 처리된 것과 비교하여 치료는 MS를 약간만 연장했다 (MS = 25일; 도 14(f)). DBCO 직접 접합 전략에 대해 관찰된 더 약한 면역 반응은 접합된 PD-L1의 빠른 해리 때문이었다. 따라서, 추가 다가 덴드리머를 통해 간접적으로 기능화된 β 세포의 치료 반응에 대한 추가 조사가 수행되었다.
실시예 3: PD-L1, CD86, 및 Gal-9로 공동-기능화된 NIT-1 세포
새로 발병한 고혈당증을 역전시키는 데 있어 상이한 면역 체크포인트 분자-기능화된 NIT-1 세포의 효율을 비교하기 위한 추가 상관 연구가 수행되었다. 기능화된 β 세포는 기능화된 β 세포와 자가 반응성 T 세포 사이에 직접 인터페이스할 수 있도록 췌장 내로 투여되었다 (도 15(a)). 또한, 비변형 NIT-1 세포 단독은 고혈당증을 역전시키거나 생존을 연장시키지 않았다 (MS = 28일 대 비-치료 그룹에 대해 기록된 28일; p = 0.3162; 도 15(b)-(d), 16 및 17). PD-L1-Dend-기능화된 NIT-1 세포로 치료된 마우스의 4분의 3은 치료에 부분적으로 반응했으며, 절반 이상이 치료 후 적어도 50일 동안 당뇨병이 없는 상태를 유지했다 (MS = 61일; p = 0.0003 대 비변형 NIT-1 세포로의 치료; 도 15(b)-(d), 16 및 17). CD86 및 Gal-9이 면역 관용을 유도하는 데 중요한 역할을 하지만, 대부분의 조기 발병 고혈당증 마우스 CD86- 및 Gal-9-기능화된 NIT-1 세포를 사용한 치료에 잘 반응하지 않았다. CD86-기능화된 세포를 사용한 치료는 단지 질환의 진행을 늦추었고 생존을 약간 연장시켰다 (MS = 46일; p = 0.0039 대 비-기능화된 NIT-1 세포로의 치료; 도 15(b)-(d), 16 및 17). Gal-9-기능화된 세포로 치료된 마우스의 4분의 1은 약 60일 동안 고혈당증을 부분적으로 역전시켰지만, 치료는 MS를 약 44일로 약간만 증가시켰다 (p = 0.00295 대 비-기능화된 NIT-1 세포로의 치료; 도 15(b)-(d), 16 및 17). 상이한 치료 반응은 상이한 체크포인트 분자의 상이한 거주 메커니즘에 의해 설명될 수 있다. 또한, T1D의 이질성. PD-L1-기능화된 NIT-1 세포는 자가 반응성 이펙터 T 세포를 직접 소진하기 때문에 고혈당증을 되돌리는 데 가장 효과적이다.
실시예 4: PD-L1, CD86, 및 Gal-9로 공동-기능화된 NIT-1 세포
PD-L1, CD86, 및 Gal-9의 조합이 새로 발병한 고혈당증을 역전시킬 수 있는지에 대한 추가 연구가 수행되었다. 공동-기능화된 PD-L1, CD86, 및 Gal-9로 NIT-1 세포, 또는 세 가지 상이한 단일-기능화 NIT-1 세포의 조합을 동일한 양으로 췌장 내 투여하였다 (도 15(a)). 상이한 단일-기능화 NIT-1 세포를 이식한 당뇨병 마우스의 1/4만이 치료에 대한 초기 반응을 보였고 장기 생존을 달성했다 (MS = 39일; p = 0.0039 대 비-기능화된 NIT-1 세포로의 치료; 도 15(b)-(d), 16 및 17). 한편, 삼중-기능화된 NIT-1 세포로 치료된 당뇨병 마우스의 85% 이상이 치료에 대한 초기 반응을 보였다. 치료받은 쥐의 절반은 적어도 40일 동안 고혈당증을 회복하고 장기 생존을 달성했다 (MS = 90일; p = 0.0017 대 비-기능화된 NIT-1 세포로의 치료, 및 p = 0.0375 대 3가지 상이한 단일-기능화 NIT-1 세포의 조합으로의 치료; 도 15(b)-(d), 16 및 17). 삼중-기능화된 NIT-1 세포의 이식은 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포의 이식에 필적하는 생존 이점을 보였다 (p = 0.9648). 그러나, 삼중-기능화된 세포는 접합된 PD-L1의 1/3만 함유했다. 이들은 PD-L1-기능화된 NIT-1 세포보다 더 높은 초기 반응률을 보였다. 또한, 하나 이상의 면역 체크포인트 경로의 고갈 또는 억제는 치료 결과에 영향을 미치는 하나의 경로의 결핍 또는 돌연변이를 방지했다.
실시예 5: 삼중-기능화된 NIT-1 세포-내장된 pan-ECM
PD-L1/CD86/Gal-9-삼중-기능화된 NIT-1 세포의 췌장 내 투여가 조기 발병 고혈당증을 부분적으로 되돌릴 수 있지만, 이 치료 전략은 인간 대상체에게 적용하기 어렵다. 또한, 반복적인 췌장 내 주사는 수술 관련 합병증을 유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해, β 세포 백신을 위한 조직 특이적 미세환경을 제공하도록 s.c. 주사 가능한 pan-ECM 스캐폴드를 조작했다. 무세포 pan-ECM 스캐폴드는 스핀-데셀 방법을 통해 건강한 쥐의 췌장에서 제조되었다. 분리된 췌장 ECM은 추가 사용 전에 동결건조되고 볼 밀링되었다 (도 18). 단백질체 분석은 스핀-데셀 프로토콜이 췌장 ECM 관련 및 세포 단백질의 생리학적 수준을 보존한다는 것을 밝혔다 (표 1). 이들은 세포 이동을 유도하고, 세포 증식을 자극하고, 세포 반응을 조절하는 데 중요하다.25 삼중-기능화된 NIT-1 세포는 시험관 내 무혈청 배양 배지에서 증식하고 자발적으로 pan-ECM으로 3차원 구상체 콜로니를 형성했다 (도 19, 20 및 21). 대조적으로, NIT-1 세포는 동일한 시험관 내 배양 조건하에서 무혈청 배양 배지에서 생존하지 못했다 (도 20). pan-ECM이 s.c.-주입된 β 세포의 유지를 개선한다는 것을 입증하기 위해, 우리는 담체 없는 CFSE-표지된 NIT-1 세포 및 CFSE-표지된 NIT-1 세포-내장 pan-ECM을 건강한 NOD 마우스에서 췌장 림프에 가까운 부위에 s.c. 접종했다 (도 22(a)). 주사 1주 후에 수행된 생체 외 형광 이미징 연구는 β 세포-내장 pan-ECM이 주사 부위에 유지되었음을 확인하였다 (도 22(b) 및 (c)). 대조적으로, 담체 없는 CFSE-표지된 NIT-1 세포는 주사 부위에서 확인될 수 없었다 (도 22(b) 및 (c)). 6 wt/wt%의 메틸셀룰로오스 (MC)를 pan-ECM 스캐폴드에 첨가하여 β 세포-내장 열 반응성 하이드로겔을 형성하는 것은 CFSE-표지된 NIT-1 세포의 생존을 향상시키지 않았고, 이식률을 감소시켰다 (60%) (도 22(b) 및 (c)). 더 낮은 이식률은 아마도 MC-pan-ECM 제형의 빠른 겔화로 인해 접종 부위에 주입된 생존 세포의 수가 감소했기 때문에 발생했을 것이다.
실시예 6: 백신으로서 삼중-기능화된 NIT-1 세포 내장 pan-ECM은 조기 발병 고혈당증을 역전시킨다
삼중-기능화된 NIT-1 세포 내장 pan-ECM 이 조기 발병 고혈당증을 역전시키는 백신으로 사용될 수 있음을 입증하기 위해, β 세포-내장 pan-ECM을 발병 3일 이내에 고혈당증 NOD 마우스에 s.c. 투여하였다. 초기 치료 2주 후에 부스터를 투여하였다 (도 23(a)). 삼중-기능화된 NIT-1 세포 내장 pan-ECM로 치료된 모든 고혈당증 마우스는 완전한 초기 반응을 보였고, 이들 중 약 60%는 초기 치료 후 50일 이상 동안 당뇨병이 없었다 (도 23(b), (c) 및 (d)). 또한, 치료된 마우스의 60% 이상이 장기 생존을 달성한 반면 (도 23(e)), 비-처리된 마우스의 중간 생존은 단지 39일이었다 (도 23(e)). 대조군 연구는 무담체 삼중-기능화된 NIT-1 세포 및 비-기능화된 NIT-1 세포 내장 pan-ECM의 s.c. 투여가 고혈당증을 회복시키는 유의미한 면역 반응을 제공하지 않는다는 것을 나타내었다 (도 23(b), (c), (d) 및 (e)).
Tian, X., et al., Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cell on tissue-specific decellularized scaffolds. Nat Biomed Eng, 2018. 2: p. 443-452.
실시예 7: PD-L1 및 CD86 이중-기능화 슈반 세포는 실험적 자가면역 뇌척수염을 지연시키고 역전시킨다
PD-L1 Fc 융합 단백질 (PD-L1 Fc-Ig) 및 CD86 Fc 융합 단백질 (CD86 Fc-Ig)- 기능화된 마우스 슈반 세포 (MSC)는 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE, 다발성 경화증 실험적 모델; Mendel, I. et al., A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H―2b mice: Fine specificity and T cell receptor Vβ expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology 1995. 25(7):1951-1959)의 증상을 예방하거나 완화하도록 조작되었다 (도 25). 아지드-변형된 MSC를 Applied Cell 세포외 바이오매트릭스-코팅 조직 배양 플라스크에서 50 μM의 Ac4ManNAz를 함유한 Prigrow III 배지에서 5일 동안 시험관 내 배양으로 얻었다 (도 26). DBCO-기능화된 PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig는 DBCO-EG13-NHS 에스테르와 PD-L1 Fc-Ig 또는 CD86 Fc-Ig 사이 아민-NHS 에스테르 화학을 통해 제조되었다. 목표 기능화 정도는 45이고, 실제 기능화 정도는 약 9였다 (도 27). PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig 단일-/이중-기능화 MSC는 생리학적 조건에서 1시간 동안 아지드-변형된 MSC와 DBCO-기능화된 PD-L1 Fc-Ig 및/또는 CD86 Fc-Ig 사이 SPACC를 통해 제조되었다 (도 26). PD-L1 Fc-Ig 및/또는 CD86 Fc-Ig의 접합은 형광 분광분석 (도 28) 및 FACS 방법 (도 29)에 의해 확인되었다.
EAE는 완전 프로인트 보강제에서 MOG35-55 펩티드 (마우스당 200 μg)의 에멀젼을 사용하는 활성 면역화로 C57BL/6 마우스에서 유도된다. EAE의 임상 징후를 면역화 후 매일 모니터링하고 다음 척도를 사용하여 등급을 매겼다: 0.0 운동 기능의 변화없음, 0.5 절반 꼬리 마비, 1.0 전체 꼬리 마비, 1.5 뒷다리 쇠약, 2.0 꼬리 및 뒷다리 쇠약, 2.5 부분 뒷다리 마비, 3.0 완전 뒷다리 마비. 전형적인 EAE 발병은 면역화 후 10 - 12일이며, 질환의 절정은 각 마우스 발병 후 6 - 8일이다.
예방적 연구는 치료가 EAE의 첫 번째 임상 징후 전후에 질환 경과에 영향을 미치는지 평가한다. 예방적 연구에서, 발병까지의 평균 시간은 민감성이고 최대 EAE 점수는 치료 효능을 측정한다. 예방적 치료에서, 비변형 또는 기능화된 MSC (마우스당 2×106 세포)는 MOG35-55 펩티드로 면역화 1일 후 EAE-유도된 마우스에 정맥 내 투여되었다.
치료적 연구는 치료가 질환 경과를 역전시킬 것인지 또는 EAE로부터의 회복을 개선할 것인지를 평가한다. 치료적 치료에서, 비변형 또는 기능화된 MSC (마우스당 2×106 세포)는 마우스가 최대 EAE 점수를 나타냈을 때 MOG35-55 펩티드로 면역화 17일 후 EAE-유도된 마우스에 정맥 내 투여되었다.
예방 연구에서 (도 30), PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig 이중-기능화 MSC의 투여는 EAE의 발병을 2일까지 지연시켰고 (비-치료 그룹과 비교하여), 2.8 ± 0.1 (비-치료 그룹의 경우)에서 1.3 ± 0.3까지 최대 EAE 점수를 유의하게 감소시켰다. PD-L1 Fc-Ig 단일-기능화 MSC는 또한, EAE 발병을 효과적으로 지연시켰지만 최대 EAE 증상을 줄이는 데는 약간 덜 효과적이었다 (1.7 ± 0.1). CD86 Fc-Ig 단일-기능화 MSC는 EAE의 발병을 지연시키는 데 덜 효과적이었고 PD-L1 Fc-Ig 단일-기능화 MSC보다 최대 EAE 점수를 감소시켰다. PD-L1 Fc-Ig 단일-기능화 MSC와 CD86 Fc-Ig 단일-기능화 MSC의 1:1 조합은 최대 EAE 점수를 감소시키는 데 이중 기능화 MSC만큼 효과적이지 않았다 (2.4 ± 0.3 대 1.3 ± 0.3 이중-기능화 MSC에 대해 기록됨).
치료적 치료에서 (도 31), PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig의 이중-기능화 MSC 투여는 치료 1주 후 비-치료 그룹과 비교하여 평균 EAE 점수를 0.9까지 유의하게 감소시켰다 (P = 0.0131). 반대로, 비-기능화된 MSC의 투여는 평균 EAE 점수를 0.7까지 크게 감소시키지 않았다 (P = 0.1501). 연구 종점 (면역화 후 35일)에서, 이중-기능화 MSC는 비-치료 그룹과 비교하여 1.6까지 평균 EAE 점수를 감소시킨 반면 (1.0 ± 0.1 대2.6 ± 0.2), 비-기능화된 MSC는 비-치료 그룹과 비교하여 0.7까지 평균 EAE 점수를 감소시켰다 (1.9 ± 0.2 대 2.6 ± 0.2).
PD-L1 Fc-Ig 및 CD86 Fc-Ig의 이중-기능화 MSC는 EAE의 임상 증상을 효과적으로 지연 및 완화할 수 있다.
표 1. 천연 뮤린 췌장 및 췌장 ECM의 세포외 및 세포 단백질 구성.
실시예 8: 면역 체크포인트 리간드-기능화된 마우스 세포 (MSC)의 생체공학
면역 체크포인트 리간드-기능화된 MSC는 대사 당조작에 이어 이중직교 클릭 반응을 통해 생체조작되었다48-50. 우리는 MSC를 기능화하기 위해 직접 생체접합 (도 33a) 및 NP 사전-앵커링 접합 (도 33b-c) 전략을 평가했다. 이러한 전략은 N-아지도아세틸만노사민 테트라아실화 (Ac4MaNAz; 도 39)의 준세포독성 농도로 MSC를 배양하여 얻은 아지드-변형된 MSC를 사용했다49. MSC는 ManNAz를 흡수하여 이를 아지드-시알산 유도체로 변환하여 세포 표면 단백질의 N-연결된 글리코실레이트를 얻었다48, 50. 교질 표면 상의 이러한 아지드-시알산 유도체는 이중직교 균주-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 (SPAAC; 도 33a(i))를 위한 부위를 제공한다48, 50. 직접 기능화 방법에서, 디벤조시클로옥틴 (DBCO)-기능화된 PD-L1 Fc-융합 단백질 (PD-L1-Ig) 및 CD86 Fc-융합 단백질 (CD86-Ig)51-52 (도 40a-c)은 100만 세포당 5 μg의 융합 단백질의 목표 접합 정도에서 SPAAC48-50를 통해 아지드-변형된 MSC에 직접 접합되었다 (도 33a). NP 사전-앵커링 접합 전략은 나노침전 방법을 통해 무약물 및 LEF-캡슐화 DBCO- 및 메틸테트라진 (MTZ)-기능화된 NP (DBCO/MTZ NP)의 제조를 포함했다 (도 33b)52. 캡슐화 LEF DBCO/MTZ NP (LEF NP)는 생리학적 조건하에서 방출을 조절하는 3.3 wt/wt%의 LEF53를 사용하여 제조되었다 (반감기 15.0 ± 0.3 h) (도 33b). 다음으로 우리는 100만 세포당 500 μg NP의 목표 접합 정도로 아지드-변형된 MSC SPAAC를 통해 DBCO/MTZ NP에 접합시켰다 (도 33c). 그런 다음 접합된 TCO-기능화된 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig를 직접 기능화된 MSC와 동일한 목표 기능화 정도로 역 전자 요구 디엘스-알더 (IEDDA) 반응54을 통해 NP-기능화 MSC에 접합시켰다 (도 33c, 및 도 40d). PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 마우스 OL (MOL)은 동일한 정도의 기능화 및 LEF 부하로 동일한 방법을 사용하여 생체조작되었다. 생체접합 전략은 MSC 및 MOL의 크기 또는 생존력에 크게 영향을 미치지 않았다 (도 33a-c, 및 도 39).
생체접합을 위해 A488-표지된 PD-L1-Ig 및 텍사스 레드-표지된 CD86-Ig (도 41)를 사용했을 때, 68% 내지 72%의 DBCO-기능화된 융합 단백질이 아지드-변형된 MSC에 직접 접합되었다 (도 42). Cy5-표지된 DBCO/MTZ NP를 사용하여 기능화했을 때, 35 ± 5 μg의 NP가 100만 개의 MSC에 접합되었고 (그리고 따라서 LEF NP-기능화 MSC에 대해 1.16 μg의 캡슐화 LEF; 도 43), 이는 TCO-기능화된 융합 단백질의 정량적 접합을 허용했다 (즉, 백만 세포당 5 μg의 TCO-기능화된 융합 단백질). 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석은 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig가 MSC에 접합되었음을 추가로 확인했다 (도 33a 및 c, 및 도 44). 직접 기능화된 MSC에 의해 발현된 PD-L1 및 CD86의 수준은 세포 증식 및 대사 소실 때문에 NP 사전-앵커링 전략을 통해 기능화된 것보다 훨씬 더 빠르게 감소했다 (도 44 및 45)48, 50. 유사한 현상이 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MOL에서 관찰되었다 (도 46). MSC의 기능화는 A488-표지된 항-PD-L1 및 피코에리트린 (PE)-표지된 항-CD86 항체를 사용한 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 염색에 의해 추가로 확인되었다 (도 33d, 및 도 47). 또한, 주사 전자 현미경은 MSC의 표면에 접합된 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP의 균일한 분포를 나타내었다 (도 33c(iii)).
실시예 9: PD-L1- 및 CD86-기능화된 MSC가 미엘린 특이적 T 세포 활성화를 하향 조절하고 시험관 내 T reg 세포 발달을 촉진한다
항원-특이적 CD4+ T 세포 활성화에 대한 MSC-접합된 PD-L1, CD86, 및 캡슐화 LEF의 효과를 평가하기 위해, 단일- 및 이중-기능화 MSC를 2D2 마우스 (2D2 세포)로부터 분리한 MOG-특이적 CD4+ T 세포와 배양하였고55, 56 2D2 세포에 의해 발현된 PD-1 및 CTLA-4 수준을 정량화했다. 두 유형의 직접적으로 단일기능화된 MSC는 상응하는 면역 체크포인트 경로를 효과적으로 상향 조절했다 (도 34a-b, 및 도 48). 두 단일기능화된 MSC 및 이중-기능화 MSC의 1:1 조합은 2D2 세포에서 두 면역 체크포인트 경로를 동시에 상향 조절했지만 (도 34a-b, 및 도 48), 상향 조절은 동일한 양의 단일기능화된 MSC에서보다 덜 효과적이었다. 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC는 2D2 세포의 PD-1 및 CTLA-4 발현을 상향 조절하기 위해 2개의 직접 기능화된 MSC의 조합만큼 효과적이었다 (도 34a-b, 및 도 48). 이전 연구의 결과와 유사하게57, 소분자 LEF는 MSC에서 CD86 발현을 상향 조절했고 따라서 공동 배양된 2D2 세포에서 CTLA-4의 발현을 증가시켰다 (도 34b, 및 도 48). 따라서, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC는 CTLA-4 경로를 상향 조절하는 데 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC 및 이중 직접 기능화된 MSC보다 더 효과적이었다 (도 34b, 및 도 48). 효소 결합 면역흡착 검정을 통해 2D2 세포에 의해 분비된 인터페론 감마 (IFN-γ, Th1 세포로부터 분비됨)56, 58 및 인터루킨 17A (IL-17A, Th17 세포로부터 분비됨)56, 59를 평가할 때 공동배양된 PD-L1 및 CD86 이중-기능화 MSC에 의한 두 억제 면역 체크포인트 경로의 현저한 상향 조절은 이펙터 분자의 수준을 유의하게 감소시켰다 (도 34c-d). 2D2 세포에서 PD-1 및 CTLA-4 경로의 유사한 상향 조절을 이들을 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MOL로 배양한 후 관찰하였다 (도 50 및 51).
PD-L1- 및 CD86-기능화된 MSC가 항원-특이적 유도된 Treg 세포의 발달을 촉진할 수 있는지 결정하기 위해41, 56, 72시간 동안 상이한 기능화된 MSC로 2D2 세포를 배양한 후 FoxP3+ 및 IL10+ CD4+ T 세포의 집단을 정량화했다. 소분자 LEF의 존재하에 비변형 MSCI와의 배양은 유도된 대략 6%의 2D2 세포를 Treg 세포로 발달하도록 유도하였다 (도 34e, 및 도 49). 8-10%의 CD4+ 발현 세포가 FoxP3+ 및 IL10+ 임을 발견함으로써 지시된 바와 같이, 모든 직접 기능화된 MSC는 유도된 Treg 세포의 발달을 촉진했다 (도 34e, 및 도 49). 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC는 천연 2D2 세포를 유도된 Treg 세포로 발달하도록 촉진하는 데 직접 이중-기능화 MSC만큼 효과적이었다. 대조적으로, LEF-캡슐화 NP-기능화 MSC는 천연 2D2 세포를 유도된 Treg 세포로 전환하는 능력에서 무약물 NP-기능화 MSC보다 42% 더 효과적이었다 (도 34e, 및 도 49). 유사하게, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MOL은 공동배양된 천연 2D2 세포의 미엘린 특이적 Treg 세포로의 발달을 촉진하는 능력과 관련하여 비변형 MOL보다 33.5배 더 효과적이었다 (도 50 내지 52).
PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC가 CD8+ T 세포의 활성화를 직접적으로 억제하여 CNS의 염증을 감소시킬 수 있음을 입증하기 위해, 이들을 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC와 배양한 후 자극된 CD8+ T 세포 (야생형 C57BL/6 마우스로부터 분리됨)의 증식을 정량화하기 위한 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 분석을 수행했다 (도 53). PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC와 공동배양된 CFSE-표지된 CD8+ T 세포의 평균 형광 강도 (MFI)는 비변형 MSC와 배양된 세포보다 5.6배 더 높았다 (도 53). 이러한 결과는 접합된 PD-L160 및 CD8661이 항원과 무관하게 자극된 CD8+ T 세포의 증식을 효과적으로 억제한다는 것을 보여준다. PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC와 공동배양된 CD8+ T 세포의 MFI는 무약물 기능화된 MSC와 배양된 세포의 MFI보다 4.5배 더 높았다 (도 53). 이러한 결과는 NP에서 방출된 캡슐화된 LEF가 시험관 내에서 활성화된 CD8+ T 세포의 증식을 억제한다는 것을 보여준다.
실시예 10: PD-L1 및 CD86 직접 기능화된 MSC는 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)을 예방 및 개선한다
PD-L1- 및 CD86-기능화된 MSC의 i.v. 투여가 CNS 장애를 완화할 수 있는지 결정하기 위해, MS에 대한 치료법을 개발하기 위한 가장 특성화된 모델이기 때문에 단상 만성 MOG35-55-유도된 EAE 모델을 사용했다62. 생체 내 독성 연구를 수행할 때, 비변형 및 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 i.v. 투여 (마우스당 2×106 세포)가 건강한 C57BL/6 마우스에서 검출 가능한 폐 독성, 간독성, 또는 신독성을 유발하지 않는다는 것을 발견했다 (도 54).
예방적 효과를 입증하기 위해, MSC에 면역화 24시간 후 (p.i.) MOG35-55를 i.v. 투여했다. 비변형 MSC의 투여는 질환의 진행이나 중증도에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 35a). 꼬리 및 뒷다리 마비 (EAE 점수 ≥ 2.5)가 p.i. 18일에서 22일 사이에 관찰되었다. PD-L1-Ig 또는 CD86-Ig 직접 단일-기능화 MSC를 사용한 예방적 치료는 질환 발병을 유의하게 지연시키지 않았지만, 두 치료 모두 p.i. 최대 EAE 점수 및 누적 EAE 점수를 각각, 60% 및 40%로 표시된 바와 같이 중증도를 감소시켰다 (도 35b-c, 및 도 55). 이중-기능화 MSC를 사용한 예방적 치료가 EAE의 발달을 완전히 예방하지는 못했지만, 그 중증도는 상당히 감소했다 (처리된 마우스 9마리 중 1마리만이 부분적인 뒷다리 마비를 경험, EAE 점수 ≥ 2.0) (도 35b-c, 및 도 55). EAE가 있는 마우스의 척추 염증 및 탈수초화는 임상 징후의 중증도를 나타내는 마커이다63. 조직학적 연구 (도 35d-e, 및 도 56 및 57)는 PD-L1-Ig/CD86-Ig 직접 이중-기능화 MSC를 사용한 예방적 치료가 연구 종점에서 처리되지 않은 마우스와 비교하여 척추 염증을 평균 81%까지 감소시키고 탈수초를 76%까지 감소시킨다는 것을 밝혔다 (p.i. 36일 또는 37일).
따라서 본 발명자들은 질환 발병 후 PD-L1 및 CD86 이중-기능화 MSC로 EAE 마우스를 치료한 효과를 조사하였다 (도 35b-c, 및 도 55). PD-L1-Ig/CD86-Ig 직접 기능화된 MSC를 사용한 치료적 치료는 누적 EAE 점수를 50%까지 상당히 감소시켰다 (도 35b-c, 및 도 55). 연구 종점 (p.i. 35일)에서, 처리된 마우스 9마리 중 7마리는 더는 검출 가능한 뒷다리 쇠약을 겪지 않은 반면, 처리되지 않은 마우스 중 적어도 하나의 뒷다리는 완전히 마비되었다 (EAE 점수 ≥ 2.5; 도 35b-c, 및 도 55). 조직학적 연구는 이중-기능화 MSC를 사용한 치료적 치료가 p.i. 36일 또는 37일에 종점에서 처리되지 않은 마우스와 비교하여 척수 염증 및 탈수초화를 각각, 81% 및 90% 감소시켰음을 보여주었다 (도 35d-e, 및 도 56 및 57).
실시예 11: LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC는 직접 기능화된 MSC보다 EAE를 예방 및 치료하는데 더 효과적이다
병원성 CD4+ T 세포 활성화를 억제하고 시험관 내 항원-특이적 Treg 세포의 발달을 촉진하는 NP-기능화 MSC의 개선된 능력을 고려하여 (도 34), 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 발달을 방지하고 EAE가 있는 마우스에 대한 치료제 역할을 능력을 추가로 조사했다 (도 36a). 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 예방적 치료는 질환의 발병을 완전히 예방하지는 못했지만, 이러한 치료는 연구 완료시 누적 EAE 점수를 감소시키는 데 PD-L1-Ig/CD86-Ig 직접 기능화된 MSC보다 12% 더 효과적이었다 (8마리 처리된 마우스 중 4마리는 부분적 꼬리 마비를 겪었음 (EAE 점수 = 0.5)) (도 36b-c, 및 도 58). 그러나, LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 예방적 치료는 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC보다 EAE 증상의 중증도를 추가로 감소시키지 않았다 (도 36b-c, 및 도 58). 대조군 예방적 연구는 접합되지 않은 PD-L1-Ig 및 CD86-Ig, 또는 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP와 함께 소분자 LEF의 i.v. 투여에 이어 처리된 마우스에서 비변형 MSC를 투여해도 처리되지 않은 마우스와 비교하여 EAE 발생을 억제하지 않거나 질환의 중증도를 감소시키지 않는 것으로 나타났다 (도 36b-c, 및 도 58). 유사하게, 조직학적 분석은 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 치료는 이중-기능화 MSC를 사용한 치료만큼 효과적이며, 처리되지 않은 마우스와 비교하여 척수 염증을 87%까지 및 탈수초화를 89%까지 감소시키는 것으로 나타났다 (도 36d-e, 및 도 60 및 61).
예방적 연구의 결과와 유사하게, 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 치료적 치료는 EAE의 진행을 억제하고 특정 관련 증상을 역전시키는 데 있어 직접 기능화된 MSC를 사용한 치료만큼 효과적이었다. 대조적으로, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC는 누적 EAE 점수를 감소시키는 데 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC보다 29% 더 효과적이었다 (도 36b-c, 및 도 58). p.i. 35일에, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 처리된 모든 마우스는 뒷다리 힘을 회복했고 (EAE 점수 ≤ 2.0; 도 36b-c, 및 도 58), 처리된 마우스 9마리 중 3마리는 무증상이었다. 이러한 개선된 치료 효율은 캡슐화 LEF가 CNS에서 자가 반응성 T 세포의 증식을 조절하는 데 필요함을 보여준다. 예방적 연구와 일관되게, 소분자 LEF, 접합되지 않은 PD-L1-Ig, 및 CD86-Ig 또는 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP에 이어 비변형 MSC로의 치료는 처리되지 않은 마우스에 대한 결과와 비교하여 유의한 치료적 효과를 달성하지 않았다.
조직학적 분석은 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 치료적 치료가 이중-기능화 MSC를 사용한 치료만큼 p.i. 36일 또는 37일에 척수 염증을 75% 그리고 탈수초화를 87% 감소시키는데 효과적임을 보여주었다 (처리되지 않은 마우스에 대한 결과와 비교하여) (도 36d-e, 및 도 60 및 61). LEF-캡슐화 MSC 추가를 사용한 치료는 처리되지 않은 마우스에 대한 결과와 비교하여 p.i. 36일 또는 37일에 척수 염증을 95% (처리된 마우스 7마리 중 6마리는 검출 가능한 척추 염증을 나타내지 않음) 그리고 탈수초화를 95% (처리된 마우스 7마리 중 2마리는 검출 가능한 탈수초화를 나타내지 않음) 감소시켰다. PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 처리된 EAE 마우스에서 탈수초화 정도는 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 처리된 마우스와 유사했지만 (도 61), LEF-캡슐화 MSC는 무약물 기능화된 MSC와 비교하여 (처리된 마우스 8마리 중 3마리는 검출 가능한 염증을 나타내지 않음) 척수 염증 (처리된 마우스 8마리 중 7마리는 검출 가능한 염증을 나타내지 않음)을 유의하게 감소시켰다 (도 60). 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 치료는 또한 EAE 임상 징후를 감소시켰지만, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 치료보다 척수 염증 및 탈수초화를 덜 효과적으로 감소시켰다. 이러한 발견은 기능화된 MSC가 LEF를 척수로의 치료적 전달을 위한 매개체 역할을 하여, CNS에서 자가 반응성 T 세포의 증식을 감소시킨다는 우리의 가설을 뒷받침한다.
1차 치료적 치료 후 모든 EAE 마우스가 치료되지 않음을 인식하여, p.i. 35일에 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC의 2차 용량을 EAE 마우스에 투여했다. 별도의 치료적 치료 연구에서 (도 62), 6마리 중 4마리의 마우스가 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 2차 치료에 반응했다. 평균 EAE 점수는 2차 치료 후 50%로 유의하게 감소했고 (0.8에서 0.4), 이들 마우스 중 6마리 중 3마리는 연구 종점에 증상이 없었다 (p.i. 50일; 도 62).
PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC가 재발-완화 MS를 치료할 수 있음을 입증하기 위해, PLP178-191-유도된 EAE 모델을 사용했다64 (도 36f). PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 예방적 치료가 이 모델에서 EAE 증상의 발병을 완전히 예방하지는 못했지만, 임상 증상뿐만 아니라 누적 EAE 점수를 유의하게 개선했다 (최대 p.i. 35일에 49%) (도 36g-h, 및 도 63). EAE의 MOG-유도된 모델의 치료 효과와 유사하게, 기능화된 MSC를 사용한 치료적 치료는 누적 EAE 점수를 43% 감소시켰다 (도 36g-h, 및 도 63). MOG35-55-면역화된 모델을 사용한 결과와 유사하게, 1차 치료 17일에 투여된 2차 치료적 치료는 질환 증식을 0.0402 day-1에서 0.0044 day-1로 유의하게 감소시켰다 (89% 감소; 도 64). 이러한 발견은 부스터 용량이 치료의 효율성을 더욱 향상시킨다는 결론을 뒷받침한다. 구현예에서, 부스터는 EAE 점수가 안정되었을 때, 또는 EAE 점수의 비율이 안정화되었을 때 투여될 수 있다.
i.v. 투여된 MSC가 재수초화를 직접적으로 수반하지 않는다는 것을 증명하기 위해, 예방적 및 치료적 치료를 위해 50 Gy X 선 조사 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 투여했다. 죽어가는 X 선 조사 MSC (도 65)는 임상 징후 및 누적 EAE 점수를 감소시키는 데 비조사 MSC만큼 효과적이었으며, 생체조작된 MSC가 미엘린 수복에 직접 관여하지 않음을 나타낸다 (도 36g-h, 및 도 63).
실시예 12: 생체조작된 MOL은 활성 EAE를 효과적으로 개선한다
생체조작된 SC가 MS의 치료에 유용하다는 것이 본원의 다른 곳에서 입증되었다. 생체조작된 MOL을 사용한 MOG35-55-면역화된 EAE 마우스에서 추가 치료적 연구는 항원-특이적 면역관용을 유도하고 활성 MS을 개선하기 위해 미엘린-발현 아교세포를 사용하는 능력을 입증한다. 비변형 MSC와 달리, i.v.에 의해 투여된 비변형 MOL은 투여 후 24시간 이내에 뒷다리 약화 증상을 빠르게 역전시켰지만, EAE 증상은 4일 후에 재발했다 (도 67). 비변형 MOL을 사용한 치료적 치료 치료는 전반적인 임상 징후에 유의미한 영향을 미치지 않았다. PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MOL의 i.v. 투여는 또한 EAE 증상을 빠르게 역전시켰다. 비변형 MOL을 사용한 치료 결과와 달리, 뒷다리 약화 증상 (EAE 점수 = 2.0)은 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MOL로 처리한 8마리 중 6마리에서 완전히 사라졌다 (연구 종점에서 EAE 점수 = 1.3 ± 0.4). 치료적 연구는 활성 MS를 치료하기 위해 생체조작된 미엘린-발현 아교 세포를 사용할 가능성을 확인했다.
실시예 13: 생체조작된 MSC의 근육 내 (i.m.) 투여는 활성 EAE를 개선하기 위해 생체조작된 MSC 및 MOL을 i.v. 투여하는 것만큼 효과적이다
우리의 연구는 기능화된 세포가 순환하는 자가 반응성 T 세포와 직접 관여하고 EAE 증상을 해결하기 위해 CNS에 들어갈 수 있도록 i.v. 투여에 초점을 두었지만, i.m. 투여를 추가로 조사했다. i.v. 투여와 유사하게, 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 1차 i.m. 용량은 처리되지 않은 마우스의 평균 EAE 점수와 비교하여 평균 EAE 점수를 65%까지 감소시켰다 (도 67). 치료받은 모든 쥐는 치료적 치료 10일 후 꼬리 마비 증상만 겪었다. i.v. 투여 방법과 대조적으로, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC의 i.m. 투여는 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC와 비교하여 유의한 치료적 개선을 달성하지 못했다 (도 67). 이러한 발견은 자가 반응성 T 세포의 증식을 억제하는 CNS에 캡슐화된 LEF를 전달하는 i.m.-투여된 MSC의 무능력에 의해 설명될 수 있다. i.v. 투여에 대한 결과와 유사하게, EAE 마우스는 2차 i.m. 치료에 잘 반응하였고 추가로 해결된 EAE 임상 징후를 나타냈다. 연구 종점 (p.i. 38일)에서, 무약물/LEF-캡슐화 LEG NP-기능화 MSC로 처리된 마우스의 6/8 및 5/8은 EAE 증상이 없었다.
기계론적 통찰: 면역 체크포인트 리간드-생체조작된 MSC는 항원-특이적 Treg 세포의 유도를 통해 EAE를 예방하고 치료한다
VivoTag 680 (VT680)-표지된 비변형 및 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC의 i.v. 투여 48시간 후 생체분포를 결정하기 위해 MOG35-55-면역화된 EAE 모델에서 생체 외 이미징 연구를 수행했다 (도 68 및 69). 예방적 이미징 그룹에서, 투여된 MSC의 대부분은 말초 기관에 축적되었으며, MSC의 주사 용량 (ID)의≤ 0.2%가 CNS에서 검출되었고 (도 68 및 69 i.v. 투여된 MSC가 CNS에 침윤된 면역 세포와 상호작용하는 것을 나타낸다. 대조적으로, 각각 대략 MSC의 1.75% ID 및 0.75% ID가 뇌 및 척수에 축적되었다 (도 68 및 69). 투여된 MSC의 대부분이 말초기관에 남았지만, CNS-침윤 MSC는 MOG35-55-면역화된 EAE 마우스에서 CNS-특이적 면역관용을 유지하는 데 필요할 수 있다.
다음으로 무약물 및 LEF-캡슐화 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 i.v. 투여된 예방적 및 치료적 치료 3일 후 MOG35-55-특이적 CD4+ T 세포 집단을 분석했다 (도 70). 두 기능화된 MSC를 사용한 예방적 치료는 MOG35-55-특이적 비장 Treg 세포의 발달을 촉진하는데 동등하게 효과적이었고 (대략 70%의 MOG35-55 + CD4+ 세포가 FoxP3+임) 비장 MOG35-55-특이적 Th1 및 Th17 세포의 수를 약간 감소시켰다 (도 37a, 및 도 71). 유사하게, 두 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 치료적 치료는 MOG35-55-특이적 비장 Treg 세포의 발달을 촉진하는데 동등하게 효과적이었고 (대략 25%의 비장 MOG35-55 + CD4+ 세포가 FoxP3+임) MOG-특이적 비장 Th1 및 Th17 세포의 수를 약간 감소시켰다 (도 37b, 및 도 72). 대조적으로, PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC를 사용한 치료는 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 치료보다 MOG35-55-특이적 척수 CD4+ Treg 세포를 62% 더 유도했다 (도 37b, 및 도 73). 따라서, 척수에 침투한 32.2 ± 7.6%의 CD8+ T 세포가 IFN-감마를 발현한 반면 (도 37b, 및 도 74), 무약물 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 처리되거나 처리되지 않은 마우스의 척수에 침투한 76.7 ± 2.8% 및 67.2 ± 4.4%의 CD8+ T 세포가 각각 IFN-감마를 발현했다. 또한, PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC는 EAE의 발달을 효과적으로 억제하고 MOG35-55-특이적 Treg 세포의 발달을 촉진함으로써 특정 조기 발병 증상을 역전시켰다 (도 37c, 및 도 74). 또한, p.i. 36일 또는 37일에 보존된 척수의 조직병리학적 분석은 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC를 사용한 예방적 및 치료적 치료가 척수에서 억제성 CD4+ FoxP3+ Treg 세포의 발달을 촉진함을 밝혔다 (도 37d).
이러한 발견을 확인하기 위해, MOG35-55-면역화된 마우스에서 CD25-특이적 항체로 Treg 세포 고갈 연구를 수행했다 (도 37e)65. 처리되지 않은 마우스의 결과와 유사하게, Treg 세포-고갈된 마우스는 PD-L1-Ig/CD86-Ig NP-기능화 MSC로 예방적 치료 후 심각한 EAE 증상을 나타냈다 (비-치료 대조군 그룹에서 누적 EAE 점수 = 31 ± 2 대 29 ± 2) (도 37e). T PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC로 처리하기 전 reg 세포의 고갈은 기능화된 MSC의 치료 효율을 상당히 감소시켰고 누적 EAE 점수를 88%까지 증가시켰다 (도 37e). 이러한 발견은 PD-L1-Ig/CD86-Ig LEF NP-기능화 MSC에 의해 유도된 Treg 세포가 MOG35-55-유도된 EAE에 대한 면역관용을 유지하는 데 필요함을 나타낸다.
생체 내 생체공학 - 실시예 14-19
재료: 비오틴-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락타이드-코-글리코라이드) (Bio-PEG-PLGA; 분자량 = 2kDa + 10 kDa; 카탈로그 번호: 909882), 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLGA, 에스테르 종결됨; Mw = 50 - 70 kDa), 아세토니트릴 (HPLC 등급, ≥ 99%), 물 (분자 생물학용, 멸균 여과)을 Sigma에서 구입했다. 메톡시 에틸렌 글리콜)-b-폴리(락타이드-코-글리코라이드) (mPEG-PLGA; 분자량 = 2 kDa + 15 kDa; AK027) 및 폴리(락타이드-코-글리코라이드)-시아닌 5 (Cy5-표지된 PLGA; 분자량 = 30-50 kDa; AV034)를 Akina, Inc. (West Lafayete, IN)에서 구입했다. N-아지도아세틸만노사민 테트라아실화 (Ac4ManNAz) 및 디벤조시클로옥틴-기능화된 올리고에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (DBCO-PEG13-NHS 에스테르; 95%)를 Click Chemistry Tools (Scottsdale, AZ)에서 구입했다. NovexTM 아비딘 (카탈로그 번호: 43-440), 비오틴-엑센딘 4 (AnaSpec; 카탈로그 번호: NC1906171), 및 IGRP 촉매 서브유닛-관련 단백질 (IGRP206-214; Eurogentec)을 Fisher Scientific (Hampton, NH)에서 구입했다. 재조합 마우스 PD-L1-Ig 융합 단백질 (PD-L1-Ig; 분자량 = 102 kDa; PR00112-1.9)을 Absolute Antibody NA (Boston, MA)에서 구입했다. 융합 단백질은 멸균 1X PBS에서 공급되었다.
β 세포의 표적화 NP의 제조: 엑센딘 4-기능화된 β 세포 표적화 NP는 이전에 보고된 바와 같이 2-단계 나노침전 방법에 의해 제조되었다. 1차 단계에서, 비오틴-기능화된 Ac4ManNAz NP는 20 wt/wt% Ac4ManNAz 표적 로딩으로 나노침전을 통해 제조되었다. 20 mg 비오틴-기능화된 Ac4ManNAz NP의 제조를 위해, 9.33 mg의 비오틴-PEG-PLGA, 4.67 mg의 mPEG-PLGA, 6 mg의 PLGA, and 4 mg의 Ac4ManNAz를 2 mL의 아세토니트릴에 용해시키고 7 mL의 교반 중인 탈이온수에 천천히 (1 ml/분) 첨가하고 15시간 동안 감압 하에서 교반 (1,000 rpm)하였다. 나노입자는 제조업체의 프로토콜에 따라 Amicron Ultra 한외여과 막 필터 (MWCO 100,000)를 통해 3회 정제되었다. 정제된 NP (탈이온수에 현탁됨)는 정제 후 40 mg/mL로 농축되었다. 아비딘-코팅 NP를 제조하기 위해, 정제된 Ac4ManNAz NP (20 mg, 40 mg/mL의 농도)는 1분 동안 1,500 rpm에서 와류 혼합에 의해 아비딘 (10 mg, 0.1 M PBS 중 10 mg/mL의 농도)과 혼합한 후 부드럽게 혼합한 후 20℃에서 1시간 동안 배양한다 (진탕기에서 100 rpm). 결합하지 않은 아비딘은 제조사의 프로토콜에 따라 Amicron Ultra 한외여과 막 필터 (MWCO 100,000)를 사용하여 3회 세척을 통해 제거되었다. 정제된 아비딘-기능화된 NP는 정제 후 20 mg/mL (0.1 M PBS에 현탁됨)로 농축되었다. 20 mg의 비오틴-기능화된 엑센딘 4-기능화된 NP의 제조를 위해, 60 μg의 비오틴-기능화된 엑센딘 4 (60 μL, 탈이온수 중 1 mg/mL)를 정제된 아비딘 NP에 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 20℃에서 1시간 동안 배양한다 (진탕기에서 100 rpm). NP는 제조사의 프로토콜에 따라 Amicron Ultra 한외여과 막 필터 (MWCO 100,000)를 통해 2회 세척했다. 정제된 NP (0.1 M PBS에 현탁됨)를 25 mg/mL로 농축하고 추가 연구 전 4℃에서 보관했다.
β 세포 표적화 Cy5-표지된 (Ac4ManNAz-없음) NP는 10 mg의 비-표적화 NP 각각에 대해 0.5 mg의 Cy5-표지된 PLGA를 중합체 블렌드에 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제조하였다.
비-표적화 NP 제조: 비-표적화 Ac4ManNAz NP는 20 wt/wt% Ac4ManNAz 표적 로딩으로 나노침전을 통해 제조되었다. 20 mg 비-표적화 Ac4ManNAz NP의 제조를 위해, 14 mg의 mPEG-PLGA, 6 mg의 PLGA, 및 4 mg의 Ac4ManNAz를 2 mL의 아세토니트릴에 용해시킨 후 7 mL의 교반 탈이온수에 천천히 (1 ml/분) 첨가하였다. 혼합물을 감압에서 15시간 동안 교반하였다 (1,000 rpm). 나노입자는 제조사의 프로토콜에 따라 Amicron Ultra 한외여과 막 필터 (MWCO 100,000)를 통해 3회 정제되었다. 정제된 NP (0.1 M PBS에 현탁됨)를 25 mg/mL로 농축하고 추가 연구 전 4℃에서 보관했다.
비-표적화 Cy5-표지된 (Ac4ManNAz-없음) NP는 10 mg의 비-표적화 NP 각각에 대해 0.5 mg의 Cy5-표지된 PLGA를 중합체 블렌드에 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제조하였다.
NP의 특성화: 정제된 NP는 투과 전자 현미경 (TEM) 및 동적 광산란 방법으로 특성화되었다. TEM 이미지는 UNC 의과대학 현미경 서비스 실험실 (MSL)의 JEOL 1230 투과 전자 현미경에 기록되었다. 이미징 연구 전, 탄소 코팅 구리 그리드를 글로우 방전시키고, 샘플 샘플을 텅스텐 아세테이트 (pH 7)로 음성 염색했다. 정제된 두 NP (1X PBS에 현탁됨)의 강도-평균 직경을 Zetasizer Nano ZSP 동적 광산란 기기 (Malvern)로 측정하였다. 시험관 내 약물 방출 연구를 37℃에서 과량의 1X PBS의 존재하에 Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치 (20K MWCO, Thermo Fisher)를 통해 수행했다. 아세토니트릴 분해된 NP 샘플 (1:9 1X PBS/아세토니트릴; 4℃에서 72시간 동안 배양)로부터의 방출되지 않은 Ac4ManNAz를 Chapel Hill의 UNC에 있는 화학 질량분석법 핵심 실험실에서 액체 크로마토그래피-질량 분석법으로 정량화했다.
DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 제조: DBCO-기능화된 PD-L1-Ig는 이전에 보고된 바와 같이 아민-NHS 에스테르 커플링 반응에 의해 기능화되었다. 목표 기능화 정도는 60이었다. 간략하게, PD-L1-Ig (1 mg/mL)를 60 몰 당량의 DBCO-EG13-NHS 에스테르 (DMSO 중 25 mg/mL)와 함께 20℃에서 2시간 동안 어두운 곳에서 부드럽게 흔들면서 (100 rpm) 배양했다. PD-L1-Ig는 제조업체의 프로토콜에 따라 Zeba Spin 7K MWCO 탈염 컬럼으로 정제했다. 상이한 정제된 DBCO-접합된 융합 단백질의 DBCO 혼입의 농도 및 정도는 제조업체의 지침에 따라 310 nm에서 DBCO의 흡수 계수 (εDBCO,310nm) = 12,000 M-1 mL cm-1, 280 nm에서 마우스 면역글로불린의 흡수 계수 (ε280nm) = 1.26 mg-1 mL cm-1 (for PD-L1-Ig), 및 280 nm에서 DBCO 보정 인자 (CFDBCO,280nm) = 1.089를 사용하여 분광학적으로 측정하였다.
텍사스 레드-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig는 동일한 방법으로 제조되었다. 목표 기능화 정도는 DBCO-EG13-NHS 에스테르의 경우 60이고 텍사스 레드 NHS 에스테르의 경우 5이다. 정제된 PD-L1-Ig의 농도는 PierceTM BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Fisher)로 측정되었고 PD-L1-Ig에 접합된 접합 텍사스 레드의 수는 595 nm에서 80,000 M-1 mL cm-1의 몰 흡수계수를 사용하여 계산되었다.
시험관 내 연구―세포주: NIT-1 세포 (비-당뇨병 NOD/Lt 마우스로부터 확립된 뮤린 β 세포주)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입했다. NIT-1 세포는 10% v/v 소 태아 혈청 (FBS, Seradigm), 2 mM GlutaMAX 보충제 (Gibco), 및 항생제-항진균제 (항-항; 100 단위의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신 및 0.25 μg/mL의 암포테리신 B; Gibco)가 보충된 F-12 배지 (Gibco)에서 배양되었다 MIN6 세포 (비-당뇨병 C57BL/6 마우스로부터 확립된 뮤린 β 세포주)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구했다. MIN6 세포는 15% v/v 소 태아 혈청 (FBS, Seradigm) 및 항생제-항진균제 (항-항; 100 단위의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 및 0.25 μg/mL의 암포테리신 B; Gibco)이 보충된 DMEM (고 글루코스) 배지 (Gibco)에서 배양되었다. 시험관 내 결합 연구를 위한 세포 배양에 페놀 레드가 없는 배지를 사용했다.
시험관 내 결합 검정: NIT-1 및 MIN6 세포는 37℃에서 18시간 동안 (페놀 레드가 없는 배지에서) 플레이트 2×104 세포/웰의 밀도로 검은 색 96-웰에 접종되었다 계산된 양의 표적화 및 비-표적화 Cy5-표지된 NP를 플레이팅된 세포에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 β 세포에 결합하도록 하였다. 세포를 UNC 의과대학의 생물 의학 연구 이미징 센터에서 AMI HT 광학 이미징 시스템 (여기 파장 = 530 ± 25 nm, 방출 파장 = 590 ± 25 nm, 노출 시간 = 60 s)에서 이미징하기 전에 페놀 레드가 없는 배지로 3회 세척했다.
상이한 사전-표적화 전략을 통한 NIT-1 세포의 시험관 내 기능화: NIT-1 세포는 완전 배양 배지에서 1시간 동안 50 μM의 소분자 또는 캡슐화 Ac4ManNAz와 함께 배양한 후 결합되지 않은 Ac4ManNAz 또는 NP를 제거하기 위해 세척되었다. Ac4ManNAz-처리된 NIT-1 세포를 완전 세포 배양 배지에서 4일 동안 배양했다. 효소가 없는 세포 해리 완충액 (Gibco)를 통해 아지드-변형된 NIT-1 세포를 분리한 후, 세포 (밀도 = 10×106 세포/mL)는 37℃에서 1시간 동안 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (또는 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig)와 함께 배양되었다. 결합되지 않은 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 제거한 후, 세포를 추가 FACS 연구에 사용하거나 추가 시간 의존적 연구를 위해 완전 세포 배양 배지에서 배양했다.
NIT-1 세포에서 접합된 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig의 양은 UNC 의과대학의 생물 의학 연구 이미징 센터에서 사용하는 AMI HT 광학 이미징 시스템 (여기 파장 = 530 ± 25 nm, 방출 파장 = 590 ± 25 nm, 노출 시간 = 60 s)를 통해 정량화되었다.
시간 의존적 FACS 연구를 기능화 후 상이한 시점에 (비-표지된) PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포의 표면 상의 PD-L1을 정량화하기 위해 수행했다. 정량화를 위해, 기능화된 NIT-1 세포를 비효소 세포 해리 완충액으로 분리한 후, FACS 연구를 위해 PE-표지된 항-마우스 PD-L1 항체 (클론: MIH5, 카탈로그 번호: 12-5982-82; Invitrogen)로 염색했다.
CLSM 연구를 위해, NIT-1 세포는 세포를 1시간 동안 Ac4ManNAz로 처리하기 전 18시간 동안 Nunc 154526 챔버 슬라이드 시스템 (챔버당 1.5×104 세포; Thermo Fisher)에서 처리한 것을 제외하고 동일한 방법으로 기능화되었다. 처리된 세포를 세척하고 완전 세포 배양 배지에서 4일 동안 배양한 후 생리학적 조건에서 1시간 동안 (비-표지된) DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 기능화했다. 그런 다음 세포 웰을 1X PBS (0.03% 아지드화나트륨, 10 mM의 황산마그네슘, 및 5wt/wt% 소 혈청 알부민 함유)로 세척한 후 0.03% 아지드화나트륨, 10 mM의 황산마그네슘 및 5wt/wt% 소 혈청 알부민을 함유하는 1X PBS에서 PE-표지된 항-마우스 PD-L1 항체 (클론: 10F.9G2; 카탈로그 번호: MABF555; Sigma)로 염색하였다. 세포는 UNC 의과대학의 MSL에서 Zeiss LSM 710 스펙트럼 공초점 레이저 주사 현미경에서 이미지화되기 전에 4% 파라포름알데히드 (4% PFA; Sigma)로 고정되었다.
상이한 제형의 Ac4ManNAz (50 μM) 및 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포와 함께 배양한 후 NIT-1 세포의 생존력을 생리학적 조건에서 배양한 지 4일 후 제조업체의 프로토콜에 따라 MTS 분석 (CellTiter96@ Aqueous MTS Powder; Promega)으로 결정하였다.
T 세포 활성화 검정: 이전에 보고된 바와 같이 IGRP-특이적 8.3 T 세포를 분리하고 확장시켰다. 기술된 방법을 통한 기능화 시, 기능화된 NIT-1 세포를 IGRP206-214 펩티드의 존재하에 (웰당 5 μg) 3시간 동안 24 웰 플레이트 (2×104 세포/웰; 0.25 mL 완전 세포 배양 배지에서)에 접종하였다. 확장된 8.3 T 세포 (2×105 세포/웰; 이펙터:표적 = 10:1; 0.25 mL 완전 T 세포 배양 배지에서)를 접종된 기능화된 NIT-1 세포에 첨가하고, 72시간 동안 배양하였다. 비-접착성 세포는 이전에 보고된 바와 같이 FACS 연구를 위해 수집되었다. 간략하게, 비-접착성 세포는 세포 표면 T 세포 고갈 마커 PD-1 발현을 정량화하기 위해 항-마우스 CD8 항체 (클론: 37006; R&D System) 및 PE-표지된 항-마우스 PD-1 항체 (클론: J43; Invitrogen)로 염색되었다. 세포 표면 마커 염색 후, 세포를 4% PFA로 고정하고 세포 내 염색 투과화 세척 완충액 (Biolegend)을 사용하여 투과화하고, FACS 연구를 위해 Alexa Fluor 750-표지된 항-IFN 감마 항체 (클론: 37895; 카탈로그 번호: IC485S100UG; R&D System)로 염색했다.
생체 내 생체분포 연구―마우스: NOD/ShiLtJ 마우스 (NOD 마우스, 암컷, 약 8주령), 8.3 TCR 알파/베타 형질전환 NOD 마우스 (암컷, 6주령), 및 BALB/c 마우스 (암컷, 약 8주령)을 Jackson Laboratory에서 구입하고 동물 연구 코어, UNC Lineberger 종합 암 센터의 멸균된 클린룸 시설에 보관되었다. CD-1 IGS 마우스 (암컷, 약 8주령)를 Charles River Laboratory에서 구입했다. CD-1 IGS 마우스는 Chapel Hill에 있는 노스캐롤라이나 대학의 무균 환경에서 비교 의학부 (AAALAC-인증 실험 동물 시설)에서 관리되었다. 실험 동물과 관련된 모든 절차는 UNC 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 생체 내 치료적 연구는 UNC Lineberger 종합 암 센터의 동물 연구 코어에서 독립적으로 수행하고 모니터링했다. NOD 마우스의 혈당, 체중, 및 신체 상태 점수는 주 2회 (월요일 오전 및 목요일 오후) 모니터링하였다. 휴대용 혈당 측정기 (OneTouch Ultra 2 혈당 모니터링 시스템)로 혈당을 측정했다.
상이한 사전-표적화 치료 전략의 생체 내 독성: 상이한 사전표적화 치료 전략의 생체 내 독성을 건강한 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 마우스를 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP로 i.v. 투여하였다 (180 μg의 Ac4ManNAz/마우스). DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)를 β 세포의 표적화 Ac4ManNAz NP 투여 3일 후 i.v. 투여하였다. PD-LD1Ig 투여 48시간 후 순환 혈액을 채취하였다. 혈액 샘플은 UNC 의과 대학의 동물 조직 병리학 및 실험실 의학 코어에 의해 분석되었다.
실시예 14: 면역 체크포인트 리간드-기능화된 베타 세포의 생체 내 생체공학
β 세포의 사전-표적화 생체공학을 위한 사전 표적화 및 이펙터 성분의 제조
β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP를 보고된 2단계 비오틴-아비딘-기반 생체접합 방법을 사용하여 제조하였다 (도 76a 참조).77 간략하게, Ac4ManNAz-캡슐화 비오틴-기능화된 폴리(에틸렌글리콜)-폴리(락틱-코-글리콜산) (PEG-PLGA) NP는 20 wt/wt%의 표적 Ac4ManNAz 로딩으로 나노침전을 통해 제조되었다. 아비딘은 과량의 아비딘의 존재하에 강한 비오틴-아비딘 상호작용 및 물리흡착을 통해 정제된 비오틴-기능화된 Ac4ManNAz NP에 접합된다. 결합하지 않은 아비딘의 제거 시, 비오틴-기능화된 엑센딘-4는 1:1 화학량론에서 강한 비오틴-아비딘 상호작용을 통해 정제된 아비딘-기능화된 Ac4ManNAz NP에 접합된다.
바이신코닉산 검정은 46 ± 2 μg (681 ± 30 pmol)의 아비딘이 각 밀리그램의 비오틴-기능화된 PEG-PLGA NP에 접합되어, 각 밀리그램의 PEG-PLGA NP에 대한 3 μg (680 pmol) 비오틴-기능화된 엑센딘-4의 정량적 접합을 허용함을 보여주었다. Ac4ManNAz NP의 강도-평균 직경 (Dh)은 동적 광산란 방법을 사용하여 결정된 바와 같이, 아비딘 및 비오틴-기능화된 엑센딘-4로 기능화 후 129 ± 1 nm (다분산 지수, PDI = 0.072 ± 0.020; 도 76b 참조)에서 172 ± 2 nm (PDI = 0.182 ± 0.020; 도 76b 참조)로 유의하게 증가했다. 단백질 쉘의 형성으로 인해 해당 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지에서 코어-쉘 유사 구조를 관찰할 수 있다 (도 76c 참조). 각 밀리그램의 β 세포의 표적화 Ac4ManNAz NP는 36 ± 6 μg의 Ac4ManNAz로 캡슐화되고 (캡슐화 효율 = 18%, 액체 크로마토그래피-질량 분석법으로 결정), 생리학적 조건하에서 제어 방출을 겪었다 (반감기 = 대략 6 h; 도 76d 참조).
약 50 nm 직경의 비-표적화 Ac4ManNAz NP는 나노침전을 통해 메톡시-기능화된 PEG-PLGA 이중 블록 공중합체로부터 제조되었다 (도 76c 참조; 지원 정보, 도 81). 각 밀리그램의 비-표적화 NP는 54 ± 3 μg의 Ac4ManNAz로 캡슐화되었다 (캡슐화 효율= 27%). β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP와 달리, 모든 캡슐화 Ac4ManNAz는 싱크 조건하에서 3시간 이내에 NP로부터 방출되었다 (도 76d 참조). β 세포 표적화 NP에 대해 기록된 더 느린 Ac4ManNAz 방출 동역학은 접합된 아비딘에 비특이적으로 결합하는 소수성 Ac4ManNAz로 인한 것이다.
Ac4ManNAz-free Cy5-표지된 β 세포 표적화 및 비-표적화 PEG-PLGA NP는 1 wt/wt%의 Cy5-표지된 PLGA가 코어 PEG-PLGA NP를 제작하기 위해 중합체 블렌드에 첨가되는 것을 제외하고 동일한 방법으로 제조되었다.
실시예 15: 제자리-제조된 생체조작된 면역 체크포인트 리간드-기능화된 베타 세포의 시험관 내 검정
NIT-1 세포 (NOD 마우스로부터 분리된 인슐린종 세포78) 및 MIN-6 세포 (C57BL/6 마우스로부터 분리된 인슐린종 세포79)를 사용하여 수행된 시험관 내 결합 검정은 β 세포 표적화 Cy5-표지된 NP가 농도- 의존 방식으로 인슐린-생산 β 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 확인했다 (도 76e 참조). 비-표적화 NP에 대해 미미한 비-특이적 결합이 관찰되었다. 당뇨병 NOD 마우스 (혈당 수준 = 300 - 450 mg/dL)에서 수행된 생체 외 생체분포 연구는 i.v. 투여된 β 세포 표적화 NP의 3.7±1.4% 주사 용량 (ID)이 투여 3시간 후 췌장에서 축적됨을 밝혔고 (도 76f(i),(ii) 참조), 이는 췌장에서 축적된 비-표적화 NP의 양보다 16.5배 더 많았다 (도 76f(i),(ii) 참조). 추가 조직병리학적 연구는 β 세포 표적화 NP가 주로 β 세포-풍부 섬에 축적됨을 확인하였다 (도 76f(iii) 참조; 지원 정보, 도 82). 생체 외 생체분포 연구는 또한 β 세포 표적화 NP를 기능화하기 위해 더 많은 면역원성 아비딘80을 사용하면 단핵 식세포 시스템 (예를 들어, 간)을 통한 신속한 제거가 가능함을 확인했다.81 이 생체접합 전략은 캡슐화 Ac4ManNAz를 비특이적으로 방출하는 순환 시스템에서 NP의 장기간 체류를 효과적으로 방지했다.
치료적 이펙터의 생리적 안정성을 향상시키기 위해, 사전표적화 연구를 위해 PD-L1 면역글로빈 Fc-융합 단백질 (PD-L1-Ig)을 사용했다. 이전에 보고된 바와 같이 DBCO-기능화된 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 아민-N-히드록시숙신이미드 에스테르 커플링 반응을 통해 PD-L1-Ig의 1차 아민-풍부 Fc 성분에 접합시켰다 (도 76g 참조).82 UV-가시광선 분광분석은 평균 9개의 DBCO 리간드에 접합된 각각의 PD-L1-Ig (도 76h 참조), 및 텍사스 레드 (TexRed)-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig가 2개의 추가적인 접합된 TexRed 분자를 포함함을 확인했다 (도 76h 참조). 크기 배제 크로마토그래피-다각 광 산란 (SEC-MALS) 연구는 융합 단백질이 기능화 후에 균일한 크기 분포를 유지함을 확인했다 (도 76i 참조).
당뇨병 NOD 마우스 (혈당 = 300 - 450 mg/dL)에서 β 세포 표적화 Cy5-표지된 NP 및 비-표적화 Cy5-표지된 NP의 생체분포를 생체 외 형광 이미징 방법으로 정량화했다. 간략하게, β 세포 표적화 및 비-표적화 Cy5-표지된 NP를 당뇨병 NOD 마우스에 i.v. 투여하였다 (5 mg의 NP/마우스). 3시간 후, 마우스를 안락사시켰다. 췌장 및 기타 주요 기관 (간, 신장, 비장, 심장, 및 폐)은 UNC 의과대학의 생물 의학 연구 이미징 센터에서 AMI HT 광학 이미징 시스템에서 (여기 파장 = 530 ± 25 nm, 방출 파장 = 590 ± 25 nm, 노출 시간 = 60 s) 생체 외 이미징 연구를 위해 보존되었다. 각 기관의 ID%는 상이한 농도의 표준 Cy5-표지된 NP의 형광 효율을 비교하여 계산되었다. 보존된 췌장 샘플은 병리학적 연구를 위해 UNC 의과대학의 UNC Lineberger 병리학 서비스 코어에 제출되었다. 항-인슐린-염색된 췌장 절편을 Scan Scope FL (Leica Biosystems)에서 이미지화했다.
실시예 16: 시험관 내 생체공학 β 세포에 대한 상이한 사전-표적화 전략의 평가
2단계 2-성분 PD-L1 장식 전략을 검증하기 위해, NIT-1 세포의 시험관 내 기능화 연구를 수행했다 (도 77a). 먼저 NIT-1 세포를 소분자 Ac4ManNAz 또는 상이한 Ac4ManNAz NP (50 μM; 지원 정보, 도 83a,b 참조)와 함께 생리학적 조건에서 1시간 동안 배양했다 (도 77a 참조). NIT-1 세포를 세척하여 결합되지 않은 Ac4ManNAz를 제거한 후 완전 세포 배양 배지에서 4일 동안 배양하여 세포의 표면 단백질에서 세포 내 ManNAz가 아지드 시알산 유도체로 전환되도록 했다 (도 77a 참조). 그런 다음 아지드-변형된 NIT-1 세포를 1×106 세포당 5 μg 융합 단백질의 목표 기능화 정도에서 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig와 함께 생리학적 조건에서 1시간 동안 배양하여 세포막-결합 아지드와 PD-L1-Ig 상의 접합된 DBCO 사이에 SPAAC를 허용하였다 (도 77a 참조). 생체기능화를 위해 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig를 사용하여, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP와 배양된 NIT-1 세포는 1×106 세포당 최대 4.3 ± 0.2 μg의 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 기능화된 반면, 소분자 Ac4ManNAz NP 및 비-표적화 Ac4ManNAz NP로 처리된 세포는 1×106 세포당 1 μg의 PD-L1-Ig 미만으로 기능화되었다. 시험관 내 기능화는 NIT-1 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았다 (지원 정보, 도 83b,c 참조). 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용한 추가 연구는 모든 3가지 2단계 사전표적화 기능화 방법이 NIT-1 세포에서 PD-L1 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다 (도 77b 참조). 보다 특이적으로, PD-L1 발현은 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 기능화된 직후 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP로 사전 처리된 NIT-1 세포가 소분자 Ac4ManNAz로 사전 처리된 세포보다 4배 및 비-표적화 Ac4ManNAz NP로 사전 처리된 세포보다 5.8배 높았다 (도 77b 참조). 더 높은 초기 접합 효율은 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP로 전처리를 통해 NIT-1 세포에 더 많은 아지드 그룹이 장식됨으로써 설명될 수 있다. 모든 3가지 상이한 사전표적화 기능화 전략을 사용하여 기능화된 NIT-1 세포의 PD-L1 발현은 세포 증식 및 대사 재활용으로 인해 기능화 후 시간이 지남에 따라 감소한다.21 NIT-1 세포 상의 PD-L1-Ig의 기능화는 피코에리트린 (PE)-표지된 항-PD-L1 항체로 염색한 후 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 연구에 의해 확인되었다 (도 77c 참조).
다음으로 섬-특이적 T 세포 활성화 및 세포 사멸을 억제하는 측면에서 상이한 사전표적화 전략이 기능화된 NIT-1 세포에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 섬-특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매 소단위 관련 단백질 (IGRP)-특이적 세포독성 T 세포 (8.3 T 세포) 검정을 수행했다 (도 77d,e 참조)49, 83. β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 기능화된 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포는 소분자 Ac4ManNAz 및 비-표적화 Ac4ManNAz NP를 사용한 사전표적화 접합보다 더 효과적이었다. 보다 구체적으로, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP를 통해 기능화된 PD-L1-Ig-기능화된 NIT-1 세포는 공동 배양된 8.3 T 세포에서 PD-1 발현 (T 세포 활성화 마커)84을 80%까지 증가시키고 (도 77d 참조) 비-기능화된 NIT-1 세포와 비교하여 (8.3 T 세포에서 세포 내 IFN-감마 발현의 감소에 의해 평가됨) 항원-특이적 T 세포 활성화를 90% 감소시켰다 (도 77e 참조).
실시예 17: 생체공학 췌장 β 세포에 대한 상이한 사전-표적화 전략의 생체 내 평가
2단계, 2-성분 사전-표적화 전략이 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig가 생체 내에서 인슐린-생산 β 세포에 장식할 수 있음을 입증하기 위해, DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig의 축적을 정량화하기 위한 비-당뇨병 NOD 마우스에서 생체 외 생체분포 연구를 수행했다 (도 78a 참조). 사전-표적화 생체분포 연구에서, DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)를 상이한 Ac4ManNAz 제형 (180 μg/마우스)의 투여 3일 후 i.v. 투여하였다. 생체 외 이미징 연구를 PD-L1-Ig의 투여 48시간 후 수행하였다. 소분자 Ac4ManNAz 및 비-표적화 Ac4ManNAz NP를 사용한 사전표적화 기능화는 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig i.v. 투여된 대조군 그룹과 비교하여 췌장에서 TexRed-표지된 PD-L1-Ig의 축적에 유의한 영향을 미치지 않았다 (췌장에서 축적된 0.5% ID 미만; 도 78a 참조). 그러나, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP를 사용한 사전표적화 기능화는 췌장에서 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 축적을 약 10배까지 유의하게 증가시켰다 (비-표적화 Ac4ManNAz NP 투여된 마우스와 비교하여; 도 78a 참조). 추가 조직병리학적 연구는 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP로 사전표적화 전략을 사용하여 투여된 대부분의 PD-L1-Ig가 β 세포-풍부 섬에 축적되었음을 확인하였다 (도 78b; 지원 정보, 도 84 참조). 비-표적화 및 사전표적화 전략 중 어느 것도 비장 및 간에서 축적된 TexRed-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 양에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 건강한 BALB/c 마우스에서 수행된 추가 독성 연구는 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 사용한 사전표적화 전략은 유의한 간독성 및 신독성을 유도하지 않았지만 (지원 정보, 도 85 참조), 대부분 β 세포의 표적화 Ac4ManNAz NP (및 따라서 Ac4ManNAz) 및 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig가 간에서 축적되었음을 확인하였다.
우리는 다음으로 당뇨병 NOD 마우스에서 사전표적화 성분으로서 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP를 사용하는 사전표적화 전략을 조사하는 데 초점을 맞췄다 (도 78c 참조). 비-당뇨병 NOD 마우스에서 수행된 생체 분포 연구에서와 같이, 대부분의 i.v. 투여된 TexRed-표지된 PD-L1-Ig는 투여 5일 후 당뇨병 NOD 마우스의 간 및 비장에 축적되었다. 대략 1.7 ± 0.2% ID의 투여된 TexRed-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig가 투여 5일 동안 췌장에 남아 있었다 (도 78c; 지원 정보, 도 86 참조). 췌장에 축적된 PD-L1의 양이 적은 것은 세포 증식 및 대사 재활용으로 인해 생체 내에서 접합된 PD-L1의 분리로 설명할 수 있다. 조직병리학적 연구는 보존된 췌장의 섬이 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP로 사전표적화 치료에 이어 비-처리된 당뇨병 마우스보다 더 높은 수준의 PD-L1을 발현하는 TexRed-표지된 PD-L1-Ig를 받았다는 것을 확인했다 (도 78d 참조).
비-당뇨병 (9주령, 혈당 < 200 mg/mL) 및 당뇨병 NOD 마우스 (혈당 = 350 - 450 mg/dL)에서 β 세포-사전표적화 TexRed-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 생체분포를 생체 외 형광 이미징 방법으로 정량화했다. 간략하게, 마우스는 상이한 제형의 Ac4ManNAz (180 μg의 Ac4ManNAz/마우스)가 꼬리-정맥 정맥 내 투여되었다. 소분자 Ac4ManNAz는 i.v. 주사를 위해0.1 M PBS로 0.9 mg/mL로 희석되기 전에 Tween 20에 25 mg/mL의 농도로 먼저 용해시켜 Tween 20 제형으로서 투여했다. TexRed-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)는 Ac4ManNAz의 투여 3일 후 i.v. 투여되었다. 마우스는 TexRed-표지된 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 투여한 지 48시간 후에 수확되었다. 췌장 및 기타 주요 기관 (간, 신장, 비장, 심장, 및 폐)은 UNC 의과대학 생물 의학 연구 이미징 센터에서 사용되는 AMI HT 광학 이미징 시스템 (여기 파장 = 530 ± 25 nm, 방출 파장 = 590 ± 25 nm, 노출 시간 = 60 s)에서 생체 외 이미징 연구를 위해 보존되었다. 각 기관의 ID%는 상이한 농도의 표준 DBCO-기능화된 TexRed-표지된 NP의 형광 효율을 비교하여 계산되었다. 보존된 췌장 샘플은 병리학적 연구를 위해 UNC 의과대학의 UNC Lineberger에 있는 병리학 서비스 코어에 제출되었다. 항-인슐린-염색된 췌장 절편은 Scan Scope FL (Leica Biosystems)에서 이미지화했다.
실시예 18: NOD 마우스에서 조기 발병 T1DM을 역전시키는 상이한 사전-표적화 전략의 생체 내 평가
이러한 결과에 따라, NOD 마우스 (혈당 수준 > 250 mg/dL)에서 조기 발병 고혈당증의 치료적 효능 치료 연구를 수행하여 제안된 사전표적화 전략이 조기 발병 T1DM을 역전시킬 수 있음을 입증했다. 치료적 연구에서, DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)눈 상이한 Ac4ManNAz NP (180 μg의 Ac4ManNAz/마우스)의 투여 3일 후 i.v. 투여되었고, 이는 T1DM의 발병 4일 후 투여되었다 (도 79a 참조). 생체분포 연구에서 관찰된 결과와 유사하게, 비-표적화 Ac4ManNAz NP를 사용한 사전표적화 치료는 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig가 투여된 비-처리된 마우스 및 대조군 그룹 당뇨병 마우스와 비교하여 치료 후 혈당 수준에 유의하게 영향을 미치지 않았다 (무진행 생존 (MPFS) 중앙값 = 4일; 도 79b-d). 그러나, 8마리의 처리된 마우스 중 6마리는 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP를 사용한 사전-표적화 치료에 대해 초기 반응을 보였고, 치료는 MPFS는 11일로 약간만 증가했지만 (도 79b,d 참조), 생존 (MS) 중앙값을 18일 (비-치료 그룹의 경우)에서 42일 (지원 정보, 도 87 참조)로 유의하게 연장했다. 생체 내 접합된 PD-L1-Ig의 분리로 인해 단일 치료적 치료로는 강력한 면역관용을 유도하기에 충분하지 않을 수 있음을 인식하고, 사전표적화 치료의 첫 번째 주기 4일 후 사전표적화 치료의 두 번째 주기를 받은 마우스에서 이중 사전표적화 치료 연구를 수행했다 (도 79a 참조). 단일 사전표적화 치료의 결과와 대조적으로, 처리된 9마리의 마우스 중 7마리는 사전표적화 치료의 두 번째 주기 후 지속된 반응을 보였다. 2회의 사전표적화 치료를 받은 마우스의 MPSF는 11일 (단일 사전표적화 치료를 받은 마우스의 경우)에서 46일 (도 579 참조)로 유의하게 증가했다. 연구의 종점 (T1DM의 발병 후 60일)에서, 2주기의 사전표적화 치료를 받은 모든 NOD 마우스는 생존했고 (지원 정보, 도 87 참조), 처리된 마우스 9마리 중 3마리는 정상혈당 상태를 유지했다.
생체 내 치료적 치료를 조기 발병 T1DM NOD 마우스 (혈당 = 250 - 300 mg/dL; 암컷)에서 수행했다. 사전표적화 치료 그룹의 마우스는 T1DM의 발병 4일 후 β 세포 표적화 또는 비-표적화 Ac4ManNAz NP (180 μg의 Ac4ManNAz/마우스)의 i.v. 투여를 받았다. DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)는 Ac4ManNAz NP의 투여 후 3일 (T1DM의 발병 후 7일)에 i.v. 투여되었다. 대조군 치료 그룹의 마우스는 T1DM의 발병 후 7일에 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)의 단일 i.v. 투여를 받았다. 2주기의 사전표적화 치료를 받은 마우스는 T1DM의 발병 후 11일에 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP 및 T1DM의 발병 후 14일에 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 2차 i.v. 투여를 받았다. 당뇨병 마우스의 혈당 수준은 원하는 실험 종점 (사망, 7일 이내 10 % 체중 손실, 신체 상태 점수 2.0 이하 감소, 또는 60 T1DM의 발병 후 60일)에 도달할 때까지 일주일에 두 번 (화요일 오전 및 금요일 오후) 측정되었다.
실시예 19: 췌장-침윤된 T 세포 집단의 분석
생체 내 기능화된 β 세포의 치료 효과에 대한 더 나은 통찰력을 얻기 위해, 사전-표적화 치료 후 5일 (또는 T1DM의 발병 후 12일)에 췌장 침윤된 T 세포 집단을 분석했다. 처리되지 않은 당뇨병 NOD 마우스는 비슷한 연령의 비-당뇨병 NOD 마우스와 비교하여 췌장에서-침윤된 CD8+ T 세포 (그 중 약 20%가 IFN-γ+)에서 6.5배 증가를 나타냈다 (도 80a,b; 지원 정보, 도 88a,b 참조). 비-표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 사전-표적화 치료를 받은 마우스는 췌장 침윤된 CD8+ T 세포의 수가 약간 감소하였고, IFN-γ-발현 췌장 침윤된 CD8+ T 세포의 수는 건강한 마우스의 수와 유사하였다 (도 80b; 지원 정보, 도 88a,b 참조). 생체 내 생체접합된 PD-L1-Ig의 양이 증가하고, 따라서, T 세포 고갈이 더 강해지기 때문에, β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 처리된 마우스는 정상 양의 췌장 침윤된 CD8+ T 세포의 (및 정상 수준의 IFN-γ-발현 췌장 침윤된 CD8+ T 세포)를 가졌다 (도 80b; 지원 정보, 도 88a,b 참조). 처리되지 않은 당뇨병 마우스와 처리된 모든 NOD 마우스는 건강한 마우스의 수와 유사한 CD4+ 헬퍼 T 세포의 수를 가졌지만, 처리되지 않은 당뇨병 마우스 및 비-표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 처리된 마우스는 건강한 NOD 마우스 및 β 세포 표적화 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig로 처리된 마우스와 비교하여 약 50% 더 적은 FoxP3+ CD4+ Treg 세포를 가졌다 (도 80a,c; 지원 정보, 도 88a,c 참조). 추가로, 병원성 헬퍼 T 세포 (예를 들어, IFN-γ+ CD4+ T 세포)는 당뇨병 NOD 마우스 및 비-표적화 사전표적화 치료를 받은 마우스의 췌장에서 Treg 세포와 공존했다. 추가 조직병리학적 연구는 Ac4ManNAz NP에 이어 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig를 사용한 사전표적화 치료는 췌장 침윤된 T 세포의 수를 유의하게 감소시키고 (도 80d 참조) 인슐린-생산 섬을 보유함을 확인하였다 (도 80e 참조).
이전에 보고된 바와 같이, 췌장 침윤된 T 세포 집단은 FACS 방법으로 분석되었다. 간략하게, 당뇨병 NOD 마우스는 T1DM의 발병 4일 후 β 세포 표적화 또는 비-표적화 Ac4ManNAz NP (180 μg의 Ac4ManNAz/마우스)로 치료받았다. DBCO-기능화된 PD-L1-Ig (80 μg/마우스)는 Ac4ManNAz NP의 투여 후 3일 (T1DM의 발병 후 7일)에 i.v. 투여되었다. 마우스를 기계론적 연구를 위해 DBCO-기능화된 PD-L1-Ig의 투여 5일 후 (T1DM의 발병 후 12일)에 안락사시켰다. 비-치료 그룹 마우스를 T1DM의 발병 후 12일에 안락사시켰다. 비슷한 연령의 건강한 비-당뇨병 NOD 마우스를 대조군 연구를 위해 사용했다. 신선하게 보존된 췌장 샘플을 콜라게나제 (HBBS 완충액 중 2.5 mg/mL, 췌장당 5 mL; 클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라게나제; 카탈로그 번호: C9407; Sigma)로 37℃에서 15분 동안 소화시켰고, 그동안 췌장 현탁액을 4~5분 간격으로 10회 진탕시켰다. 10% FBS로 소화를 정지시키고 분리된 세포는 세포 스트레이너 (70 μm, Fisher)를 통해 으깨었다. 세포를 HBBS 완충액으로 1회 세척한 후, 적혈구를 ACK 용해 완충액 (Gibco)로 용해시키고 FACS 연구 전에 세척했다. 분리된 세포 (1X PBS에 현탁됨)를 먼저 Fixable Viability Stain 510 (카탈로그 번호: 564406; BD Bioscience), 이어서 A488-표지된 항-마우스 CD8 항체 (클론: 37006; 카탈로그 번호: FAB1509G100; R&D System) 및 PE-표지된 항-마우스 CD4 항체 (클론: CT-CD4; 카탈로그 번호: PIMA517450; Invitrogen)로 염색했다. 그런 다음 세포를 4% PFA로 고정하고, 투과화하고, FACS 연구 전 PE-시아닌 7-표지된 항-IFN-γ 항체 (클론: XMG1.2; 카탈로그 번호: 25-7311-41, Invitrogen) 및 DyLight 650 항-마우스 FoxP3 다클론 항체 (카탈로그 번호: PA5-22773, Invitrogen)로 염색했다. UNC 의과대학의 유세포 분석 핵심 시설의 Thermo Fisher Attune NxT 분석기 또는 Intellicyt iQue Screener PLUS 분석기를 사용하여 데이터를 수집했다.
본원에 제시된 본 발명의 많은 변형 및 다른 구현예는 상기 설명 및 관련 도면에 제시된 교시의 이점을 갖는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에게 떠오를 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구현예에 제한되지 않고 변형 및 다른 구현예가 첨부된 청구 범위 내에 포함되는 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 본원에서 특정 용어가 사용되더라도, 이들은 일반적이고 설명적인 의미로 사용되며 제한의 목적으로 사용되지 않는다.
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Claims (76)

  1. 장식된 세포 표면을 포함하는 세포를 포함하는 기능화된 세포로서, 여기서 장식된 세포 표면은 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함하는 기능화된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 분자는 PD-L1, CD86, Gal-9, PD-L2, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TNFR1, VISTA, BTLA, NKG2A, CTLA-4, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6, B7-H7, ICOS, NKp30, LAG3, CD137, 및 CD96으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능화된 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 베타 세포, 슈반(Schwann) 세포, 희소돌기아교세포, 폐세포, 혈소판, 상피 세포, 간세포, 또는 활막 세포인 기능화된 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자는 당조작된 모이어티를 통해 또는 티올-말레이미드 접합을 통해 부착되는 기능화된 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자는 면역 체크포인트 분자-기능화된 나노입자 또는 중합체인 기능화된 세포.
  6. 제4항에 있어서, 상기 당조작된 모이어티는 만노사민 또는 갈락토사민의 아미드 잔기를 포함하는 기능화된 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 당조작된 모이어티는 만노사민 또는 갈락토사민의 아미드 잔기에 공유 부착된 아지드, 디벤조시클로옥틴, 또는 테트라진의 잔기를 추가로 포함하는 기능화된 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 디벤조시클로옥틴은 DBCO인 기능화된 세포.
  9. 제4항, 제6항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 당조작된 모이어티는 덴드리머, 선형 중합체, 나노입자, 또는 Fc 융합 단백질의 잔기를 추가로 포함하는 기능화된 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 덴드리머는 다가 덴드리머인 기능화된 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 다가 덴드리머는 폴리아미도아민 덴드리머인 기능화된 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리아미도아민 덴드리머는 약 500 내지 약 1,000,000의 MW를 갖는 기능화된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리아미도아민 덴드리머는 약 25,000 내지 약 30,000의 MW를 갖는 기능화된 세포.
  14. 제1항에 있어서, 약 1 백만개의 기능화된 세포당 0.5 μg 내지 약 50.0 μg의 적어도 하나의 공유 부착된 면역 체크포인트 분자를 포함하는 기능화된 세포.
  15. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 PD-L1, 적어도 하나의 CD86, 및 적어도 하나의 Gal-9를 포함하는 기능화된 세포.
  16. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 PD-L1 및 적어도 하나의 CD86을 포함하는 기능화된 세포.
  17. 제5항에 있어서, 하기 구조 중 하나를 갖는 기능화된 세포:
    .
  18. 제17항에 있어서, 상기 나노입자는 카고를 포함하는 기능화된 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 카고는 면역억제제인 기능화된 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역억제제는 레플루노미드 아자티오프린, 레날리도미드, 포말리도미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 탈리도미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능화된 세포.
  21. 제2항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 분자는 PD-L1, CD86, 및 Gal-9로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능화된 세포.
  22. 제1항에 있어서, 상기 세포는 생리학적 조건하에서 약 1일 내지 약 7일 동안 생존 가능한 기능화된 세포.
  23. 제1항에 있어서, 상기 세포는 생리학적 조건하에서 약 2일 내지 약 6일 동안 생존 가능한 기능화된 세포.
  24. 제1항에 있어서, 상기 세포는 생리학적 조건하에서 약 3일 내지 약 4일 동안 생존 가능한 기능화된 세포.
  25. 제1항에 있어서, 상기 세포는 생리학적 조건하에서 약 5일 내지 약 21일 동안 생존 가능한 기능화된 세포.
  26. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 기능화된 세포:
    다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티: (막횡단 당단백질)―(아지드 함유 분자의 잔기)―(시클로옥틴의 잔기)―(링커 1)―(기능화된 덴드리머의 잔기)q―(면역 체크포인트 분자의 잔기),
    여기서,
    q는 1 또는 0이고;
    대시는 공유 결합을 나타냄.
  27. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 기능화된 세포:
    다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티: (막횡단 당단백질)―(시클로옥틴 함유 분자의 잔기)―(아지드의 잔기)―(링커 1)―(기능화된 덴드리머의 잔기)q―(면역 체크포인트 분자의 잔기),
    여기서,
    q는 1 또는 0이고;
    대시는 공유 결합을 나타냄.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 q는 1인 기능화된 세포.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 q는 0인 기능화된 세포.
  30. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 기능화된 세포:
    다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티: (막횡단 당단백질)―(아지드 함유 분자의 잔기)―(시클로옥틴의 잔기)―(링커 1)―(면역 체크포인트 분자 FcIg 융합 단백질),
    여기서, 대시는 공유 결합을 나타냄.
  31. 제4항에 있어서, 하기를 포함하는 기능화된 세포:
    다음 구조를 갖는 당조작된 모이어티: (막횡단 당단백질)―(시클로옥틴 함유 분자의 잔기)―(아지드의 잔기)―(링커 1)―(면역 체크포인트 분자 FcIg 융합 단백질),
    여기서, 대시는 공유 결합을 나타냄.
  32. 제26항에 있어서, 상기 기능화된 덴드리머의 잔기는 다음 구조를 갖는 기능화된 세포: ―(덴드리머)―(링커 2)―(시클로옥틴의 잔기)―(아지드 함유 분자의 잔기)―.
  33. 제32항에 있어서, 상기 링커 2는 다음 구조를 갖는 기능화된 세포:

    여기서, z는 0 내지 10의 정수임.
  34. 제33항에 있어서, 여기서 z는 3인 기능화된 세포.
  35. 제1항의 기능화된 세포; 및 탈세포화된 췌장 유래 단백질을 포함하는, 무세포 췌장 세포외 매트릭스.
  36. 제35항에 있어서, 상기 기능화된 세포는 3차원 구상체 콜로니를 형성하는 무세포 췌장 세포외 매트릭스.
  37. 제35항에 있어서, 상기 무세포 췌장 세포외 매트릭스는 주사제의 형태인 무세포 췌장 세포외 매트릭스.
  38. 제37항에 있어서, 상기 무세포 췌장 세포외 매트릭스는 겔이 아닌 주사제의 형태인 무세포 췌장 세포외 매트릭스.
  39. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  40. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스, 및 약학적으로 허용 가능한 액체 비히클을 포함하는 백신.
  41. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 제39항의 약학 조성물 또는 제40항의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환을 치료하거나 발병을 지연시키는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 결장염, 관절염, 루푸스, 또는 건선인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 자가면역 결장염은 궤양성 대장염 또는 크론병인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 조기 발병 1형 당뇨병 또는 조기 발병 고혈당증인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 기능화된 세포는 베타 세포인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 대상체는 당뇨병 발병 위험이 있거나 당뇨병을 갖는 방법.
  48. 제41항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 기능화된 세포는 미엘린 수초와 연관된 세포인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 대상체는 다발성 경화증이 발병할 위험이 있거나 다발성 경화증을 갖는 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 대상체는 재발성 다발성 경화증을 갖는 방법.
  52. 제41항에 있어서, 자가면역 질환을 치료하는 것은 자가면역 질환의 증상의 중증도를 감소시키는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 다발성 경화증이 있는 대상체를 치료하는 것은 다발성 경화증 증상의 중증도를 감소시키는 것인 방법.
  54. 제41항에 있어서, 부스터 용량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  55. 대상체에게 제5항의 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 CNS로 카고를 전달하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 투여는 정맥 내인 방법.
  57. 대상체에게 제5항의 기능화된 세포를 투여하는 것을 포함하는, CNS 미세환경에서 염증을 감소시키는 방법으로서, 여기서 전신 면역억제는 유도되지 않는 방법.
  58. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 제39항의 약학 조성물 또는 제40항의 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 조기 발병 1형 당뇨병을 역전시키는 방법.
  59. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 제39항의 약학 조성물 또는 제40항의 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Treg:Teff 비율을 조절하는 방법.
  60. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 제39항의 약학 조성물 또는 제40항의 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 자가 반응성 이펙터 T-세포를 고갈시키는 방법.
  61. 제1항의 기능화된 세포 또는 제35항의 무세포 췌장 세포외 매트릭스 또는 제39항의 약학 조성물 또는 제40항의 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 췌장 베타 세포를 보호하는 방법.
  62. 제42항, 제59항, 제60항, 또는 제61항에 있어서, 투여 후 일정 기간에 2차 투여를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제1항의 기능화된 세포를 제조하는 방법으로서, 기능화된 세포를 제조하기 위해,
    아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티, 또는 테트라진 모이어티를 포함하는 당조작된 모이어티를 발현하도록 세포를 당조작하는 단계; 및
    아지드 모이어티, 시클로옥틴 모이어티, 또는 테트라진 모이어티를 통해 면역 체크포인트 분자를 공유적으로 연결하는 단계
    를 포함하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 당조작 단계 전에, 대상체로부터 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 연결 후 기능화된 세포를 보존하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제1항에 있어서, 상기 세포는 살아있는 세포인 기능화된 세포.
  67. 기능화된 세포를 제조하기 위해 티올 말레이미드 접합을 통해 면역 체크포인트 분자를 공유적으로 부착하는 단계를 포함하는, 기능화된 세포를 제조하는 방법.
  68. 유기체에서 기능화된 세포를 제조하는 생체 내 방법으로서,
    상기 유기체에 임의의 순서로
    리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및
    리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제를 투여하며,
    여기서 상기 기능화된 세포는 생체 내에서 제조되는 단계
    를 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 리간드 반응기는 아지드 모이어티를 포함하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 세포는 베타 세포, 슈반 세포, 희소돌기아교세포, 폐세포, 혈소판, 상피 세포, 간세포, 또는 활막 세포인 방법.
  71. 대상체에서 자가면역 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에 임의의 순서로
    리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및
    리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제를 투여하는 단계를 포함하며,
    여기서 기능화된 세포가 생체 내에서 제조되고, 상기 자가면역 질환이 치료되는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 1형 진성 당뇨병인 방법.
  73. 대상체에서 자가 반응성 T-세포를 면역결핍화하는 방법으로서,
    자가 반응성 T-세포를 기능화된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 기능화된 세포는 대상체에게 임의의 순서로
    리간드 반응기를 포함하는 세포 표지제, 및
    리간드 반응기와 반응하는 공유 결합된 리간드를 포함하는 하나 이상의 활성제를 투여함으로써 제조되며, 여기서 기능화된 세포가 생체 내에서 제조되고, 상기 기능화된 세포가 자가 반응성 T-세포와 접촉하고, 상기 T-세포가 면역결핍화되는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 T-세포가 면역결핍화되고 전신 면역억제가 유도되지 않는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 전신 면역억제가 장기간인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 전신 면역억제가 장기간이고 비가역적인 것인 방법.
KR1020237021633A 2020-11-30 2021-11-23 면역 체크포인트 분자로 기능화된 조작된 세포 및 이의용도 KR20230116844A (ko)

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