JP2002532115A - 異種移植片に対する寛容の改善 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫原を用いたレシピエント哺乳動物の免疫を介して、異種移植片に対する哺乳動物（特にヒト）の寛容を改善するための方法に関する。この免疫原は、ブタポリペプチド由来のＢ細胞エピトープ、およびＴ細胞エピトープの両方を含む。本発明はまた、上記免疫原を含む免疫原性組成物、および異種移植片の状態をモニターするための方法を包含する。本発明は、免疫抑制、およびより詳細には、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の状況下の免疫抑制に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （１．発明の分野） 本発明は、免疫抑制、およびより詳細には、異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐ
ｌａｎｔａｔｉｏｎ）の状況下の免疫抑制に関する。

【０００２】 （２．発明の背景） 同種異系の器官移植の確立された成功にも関わらず、器官の需要と供給との間
の格差の増加は、克服されなけらばらならない。同種異系器官の供給の増加は、
満足な解決を提供しない。なぜなら、たとえ全ての利用可能な器官が移植された
としても、これはなお、既存の需要に到達しないからである（１、２）。このこ
とが、実行可能かつ魅力的な代替物としての異種移植（異なる種の動物間での器
官の移植）における関心の再起を導いた。

【０００３】 異種移植研究は、最近、サイズ、生理学的適合性および育種特性の点から、適
切な動物ドナーとしてブタに焦点を当てている（３、４）。しかし最近まで、不
調和の異種移植が、血管再生に際して器官拒絶を急速に誘発する体液性媒介超急
性拒絶（ＨＡＲ）の不可避な発生によって制限されてきた。ＨＡＲは、不調和な
種間で移植されたほとんどの器官の運命である。最近、ＨＡＲの免疫学的基礎の
理解により、有意な進歩を生じ、そして多くのアプローチが、ＨＡＲを克服する
ために使用されている。重要なことに、種々のトランスジェニックストラテジー
が現在使用されており、これには、ブタ内皮細胞の補体活性のレギュレーターの
発現が挙げられる（５）。短期間の異種移植片の生存は、直ぐに達成されると予
知される（６）。ＨＡＲの克服における最近の進歩は、長期間の異種移植片の生
存を可能にするよう克服されるなければならない、その後の免疫学的障壁を強調
した。免疫応答の体液性アームおよび細胞性アームの両方は、免疫学的拒絶の下
流の事象において役割を果たすようである。明らかに、強力なＴ細胞媒介性拒絶
応答の存在が最も重要であること（７〜１１）は、ＨＡＲの優性な役割によって
以前は不明であった。インビトロで、ヒトＴ細胞は、直接的および間接的なＴ細
胞活性化経路を介する感作後の異種細胞の認識（７、８、１２）において中心的
役割を果たすことが実証されている。これらの経路は、同種認識（ａｌｌｏｒｅ
ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）および同種移植片拒絶についてよく実証されている（１３
）。同種拒絶（ａｌｌｏｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の根底をなす細胞性機構の知見は
、Ｔ細胞媒介性の異種応答の研究についての重要な基礎を提供した。

【０００４】 現在、器官移植の細胞媒介性拒絶を予防する主要な治療は、全身性の免疫抑制
薬物または標的（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５）に対するモノクローナル
抗体（Ｍａｂ）治療に依存する（１４）。強力なＴ細胞異種応答をインビトロで
生じ得るという報告（７、８、１２）後、異種移植片拒絶の制御は、現在の標準
用量よりも、より大きい免疫抑制のレベルを必要とし得る。このようなストラテ
ジーは、異種移植片の状況下で所望されない。薬物は、生存のために摂取され、
免疫系全体を抑制し、そして感染の危険性および癌に対する感受性の増大を生じ
るはずである（１４）。異種移植の臨床への利用可能性のために、寛容誘導／免
疫抑制のための移植片特異的ストラテジーを標的化することが、明らかに非常に
有利である。これは、同種移植の状況下で達成することは困難であるが、異種移
植は、実際に移植片特異的である試薬の生成についての選択肢を提供して、種間
の差異に伴ってより大きな可能性を提供する。さらに、移植前の、ブタドナー器
官およびヒトレシピエントの免疫系の両方の操作の機会が存在する（１）。

【０００５】 （３．詳細な背景） （３．１ Ｔ細胞の活性化および増殖） Ｔ細胞の最適な増殖は、抗原特異的ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の連結（シグナル１
）を介して開始されるが、さらなる同時刺激シグナル（シグナル２）を必要とし
て（１５、１６、１７）、これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって通常供給さ
れる。シグナル２の存在下でのＴ細胞の抗原性刺激は、Ｔ細胞の活性化および増
殖を誘導するが（１８）、これらの非存在下でのＴ細胞のＭＨＣ抗原複合体への
曝露は、Ｔ細胞増殖の停止およびクローン性アネルギーの発生を導く（１９、２
０）。アルデヒド固定（２０、２１）または熱処理（１９）によるＡＰＣの操作
は、このような細胞が、ＭＨＣ−ＩＩ表面発現のレベルを変更することなく、同
種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）Ｔ細胞を活性化する能力を抑止すること
が実証されている。従って、Ｔ細胞レセプターの占有単独では、Ｔ細胞を十分に
活性化するには不十分である（１７）。アネルギー性Ｔ細胞は、それらのＩＬ−
２産生の欠失、およびそれらの引き続く、その後の抗原に対する曝露の際にＩＬ
−２を産生する不能性によって最良に特徴付けられる（２２）。従って、Ｌａｆ
ｆｅｒｔｙら（２３）によって予測されるような活性化の２つのシグナルモデル
が確認される。所定の抗原性刺激に応答するためのＴ細胞について、複数の活性
化シグナルが、ＡＰＣから要求される（２３）。

【０００６】 二次シグナルの非存在下でのＴ細胞アネルギーのインビボ誘導は、最初、Ｊｅ
ｎｋｉｎｓおよびＳｃｈｗａｒｔｚに１９８６年に実証され（２４）、これは、
ＣＤ４ Ｔヘルパークローンに対して特異的なペプチドを提示するために化学的
に固定化したＡＰＣを使用する。それ以来、多数のインビトロおよびインビボの
データが出されており、これらは、隔離されたシグナル１がＴ細胞を活性化しな
いこと（２２）、および同時刺激シグナル伝達が、可溶性因子を介するよりむし
ろ他の細胞との接触から生じるという仮説を支持する。ヒトクラスＩＩ ＭＨＣ
分子でトランスフェクトしたが、適切なＣＳシグナルを発現しない（シグナル２
を欠失している）線維芽細胞は、クラスＩＩに限定されたＣＤ４ Ｔ細胞クロー
ンに対して効率的に抗原を提示し得るが、これらは、細胞をアネルギー性にして
、抗原特異的Ｔ細胞増殖を生じない。従って、Ｔ細胞が最初に抗原に遭遇する状
況が、その後の免疫応答性に関連して重要である。

【０００７】 従って、同時刺激分子は、Ｔ細胞の活性化および増殖に必須であり、そしてこ
れは、Ｔ細胞上のレセプターとＡＰＣ上で発現されるそれらのリガンドとの間の
相互作用から生じる。しかし、同時刺激シグナル自体は、抗原特異的でなく、Ｍ
ＨＣ拘束性でもない（２５）。近年、同時刺激の媒介に関与する分子相互作用が
、よく特徴付けられている。２つの重要な経路は、（ｉ）Ｂ７−１、Ｂ７−２（
Ｂ７ファミリーのメンバー）および（ｉｉ）ＣＤ４０（ＡＰＣ上で発現される）
、ならびにＴ細胞上でそれぞれ発現されるそれらのカウンターレセプターＣＤ２
８およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を含む。インビボおよびインビトロの
両方での、多くの証拠が、Ｔ細胞の同時刺激におけるＢ７−１、Ｂ７−２および
ＣＤ４０によって果たされる重要な役割を、はっきりと定義する（２６−３６）
。さらに、同種移植の状況下でのＣＤ２８−Ｂ７およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌを
介するシグナル伝達の同時遮断は、同種移植片拒絶の発生を妨げた（３７、３８
）。インビトロにおいて、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用を標的化することは、移植片
抗原に対するＴ細胞感作を妨げ、これによって移植片生存を延長することが示さ
れている（３８、３９）。

【０００８】 Ｔ細胞は、２つの経路（直接経路および間接経路）のうちの一方を介して異種
抗原に対して感作され得、これらの経路は、同種抗原に対するよく実証されたＴ
細胞活性化経路に類似する（図１）。直接認識は、レシピエントＴ細胞が、ドナ
ー刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）上のペプチドと複合体化したイ
ンタクトな異種ＭＨＣ分子を認識することを必要とする。対照的に、間接認識は
、レシピエントＡＰＣが、レシピエントＭＨＣ ＩＩの状況下でのレシピエント
Ｔ細胞に対する提示前に、異種抗原を処理することを必要とする。異種抗原に対
する特異性を有する自己ＭＨＣ ＩＩ拘束性Ｔ細胞は、このペプチドを認識し、
そして応答する。報告された大部分のデータは、間接的異種認識応答のものであ
るが、直接経路を介する細胞媒介性拒絶もまた、実証されている（７、８、９、
１１、１２、４０、４１、４２）。インビトロでのブタ組織に対する強力なヒト
Ｔ細胞増殖応答が、本実験室および他の両方における研究から実証されている。

【０００９】 （３．２ 同時刺激分子） ＭＨＣおよびペプチドとのＴＣＲ−ＣＤ３レセプター結合の結果の決定におけ
る、同時刺激分子によって果たされる重要な役割が、インビボおよびインビトロ
の両方において広範に実証されている。レセプターまたはそれらのリガンドのい
ずれかに向けられる抗同時刺激分子ストラテジーは、免疫応答を変更するための
治療ストラテジーとして使用されている。このようなアプローチは、細胞媒介性
応答を変更し、それによって移植片拒絶を妨げるための、モデル移植系において
試験されている（１４、３７、３８、４３−４７）。

【００１０】 Ｂ７−１（Ｂ７／ＢＢ１、ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）の両方は、
免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そして高度にグリコシル化された膜
貫通タンパク質である（２５）。Ｂ７−１（Ｂ細胞活性化分子）は、１９８９年
に最初に同定され（２７）、その後Ｂ７−２が１９９３年に同定された（４９）
。ヒトＢ７−１およびＢ７−２の両方、ならびにマウスホモログが、現在クロー
ン化されており、そして機能的に特徴付けられている（２５）。Ｂ７−１および
Ｂ７−２は、脾臓および血液の樹状細胞上で同時刺激的に発現され、そして活性
化の際にＢ細胞および単球上で誘導される（３４、５０）。Ｂ７−１およびＢ７
−２は、非常に相同性であり、そしてＴ細胞抗原ＣＤ２８についての天然のリガ
ンドである（５０）。細胞表面糖タンパク質である、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原
−４（ＣＴＬＡ−４）は、Ｂ７ファミリーの分子に対する第２のレセプターとし
て同定され８５１）、そしてＣＤ２８に対して相同性であり、３１％の配列同一
性を有する。両方のＢ７アイソフォームは、ＣＤ２８に対してよりも、より高い
親和性でＣＴＬＡ−４に結合する（３０、５０、５２）。ＣＤ２８−Ｂ７レセプ
ター結合は、ＡＰＣ誘導性同時刺激シグナルを生じ、これは、インビボおよびイ
ンビトロの両方において抗原特異的ＩＬ−２産生に関与する（５３、５４）が、
ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化の負の調節因子として機能するようである（５５、
５６、５７）。抗ＣＴＬＡ４抗体による架橋は、ＣＤ２８結合を拮抗することが
実証されており（５８）、そしてさらに、ＣＴＬＡ４ノックアウトマウスは、制
御されないリンパ球増殖に起因して数週間以内に死亡する（５９）。従って、Ｃ
ＴＬＡ４結合は、免疫応答の維持および調節に重要であると考えられる。しかし
、その根底をなす機構は、はっきりと定義されていない。

【００１１】 同時刺激分子の間で、Ｂ７ファミリーは、独特であるようである。なぜなら、
Ｂ７−１またはＢ７−２のいずれかのＣＤ２８による結合は、アネルギーの誘導
を妨げるのに、必要かつ十分であるからである（３４）。ＣＤ２８−Ｂ７相互作
用は、活性化Ｔ細胞の増殖を持続するための重要なシグナルを送達すると考えら
れる。これらの観察は、インビトロのデータによって支持され、これらのデータ
は、Ｂ７欠損の細胞が、主要ＭＬＲを刺激しないが、高レベルのＢ７を発現する
トランスフェクタントが、同種反応性Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生を刺激し、か
つ固定化された抗ＣＤ３Ｍａｂと共に培養された精製Ｔ細胞のポリクローナル集
団を同時刺激する能力を獲得したことを示す（３１）。ＨＬＡ−ＤＲ７、Ｂ７ま
たは両方でＮＩＨ−３Ｔ３細胞を安定にトランスフェクトすることによって生成
された人工ＡＰＣは、両方の分子が存在する場合にのみ、破傷風トキソイド（Ｔ
Ｔ）の提示後に最適なＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生を生じることを、明らかに
実証した。Ｂ７の非存在下では、クローン性アネルギーを生じた（５８）。

【００１２】 ブタＢ７−２（ＰｏＢ７−２）は、大動脈内皮細胞からクローン化されている
（６０）。ブタＢ７−２の一過的なトランスフェクション後、ヒト臍静脈内皮細
胞は、ヒトＴ細胞によるＩＬ−２産生を強力に同時刺激した。ｐｏＢ７−２によ
るヒトＴ細胞のこの同時刺激は、ヒトＢ７−１またはＢ７−２によって提供され
る同時刺激シグナルと同じぐらい効果的であることが示され、そしてｈｕＣＴＬ
Ａ４Ｉｇによって特異的にブロックされ得た。従って、ｐｏＢ７−２は、ブタ内
皮の免疫原性に強力に寄与する（６０）。

【００１３】 Ｂ７−１およびＢ７−２媒介性相互作用は、Ｔ細胞特異的免疫の発生に対して
中心的であるようであるが、重要なさらなる同時刺激経路が存在する。これらの
最も重要なものは、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）との相互作用を
含む（３４）。

【００１４】 ＣＤ４０は、ＴＮＦ−レセプタースーパーファミリーに属する５０ｋＤａの表
面糖タンパク質である。ＣＤ４０は、種々のＡＰＣ（とりわけ、単球、樹状細胞
および活性化マクロファージを含む）上で発現される。内皮を含む他の細胞型も
また、ＣＤ４０を発現する（３４）。そのカウンターレセプターＣＤ４０Ｌ（Ｃ
Ｄ１５４、ｇｐ３９、ＴＲＡＰ）は、３３ｋＤａのＩＩ型完全膜タンパク質であ
り（３４、３６）、これは、活性化ＣＤ４ Ｔ細胞上で一過的に発現される。Ｃ
Ｄ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、Ｂ細胞活性化における優性な役割と共に、免疫
応答の体液性アームおよび細胞性アームの両方において重要な役割を果たすこと
が実証されている。Ｂ細胞上のＣＤ４０の架橋は、Ｂ細胞の増殖およびアイソタ
イプスウィッチングに必須であるが、これはまた、Ｂ７発現の上方調節を生じる
（５０）。単球および樹状細胞のＢ７発現のレベル（および、従ってＡＰＣ能力
）は、ＣＤ４０シグナル伝達後では明らかに調節されない（３４）。ＣＤ４０ノ
ックアウトマウスからのデータは、ＣＤ４０による結合後のＣＤ４０Ｌシグナル
伝達は、Ｔ細胞活性化において重要な役割を果たすことを実証した（６１）。マ
ウスＰ８１５肥満細胞腫細胞のＣＤ４０（またはＢ７−１）でのトランスフェク
ションは、それまで非同時刺激性であるＰ８１５細胞が、ポリクローナルＴ細胞
活性化およびサイトカインの生成に必要な同時刺激を媒介するのを可能にした（
３４）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用はまた、同種移植片拒絶において重要な
役割を果たすことが実証されている（６２、６３）。

【００１５】 休止Ｂ細胞は、それらが活性化されるまで、通常、高レベルでＢ７−１／Ｂ７
−２を発現しない（５０）。ＭＨＣ−ペプチド／ＴＣＲおよびＣＤ４０−ＣＤ４
０Ｌの同時結合後のＢ細胞の活性化は、Ｂ細胞上のＢ７ファミリーメンバーの上
方調節を導き、それによって、Ｔ細胞の刺激およびその後の活性化を増強する（
３４、３６）。従って、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、Ｂ７ファミリーの分
子およびおそらく他の同時刺激性分子の発現を誘導することによる同時刺激活性
に影響し、これによって、Ｔ細胞活性化において重要な役割を果たす。ＣＤ４０
およびＢ７の明らかな相乗効果は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始および増幅につ
いての、両方の同時刺激経路の重要性を示す（３８）。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相
互作用はまた、樹状細胞の機構的状態を改変することによって、細胞傷害性Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）応答の生成に重要な役割を果たすことが示されている（６４、
６５、６６）。

【００１６】 広範な研究が、同時移植および異種移植の状況下での、Ｂ７−ＣＤ２８および
／またはＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用のブロックの重要性を実証している。こ
れを強力に支持するデータは、移植片生存の増強を生じるＣＤ２８−Ｂ７を介す
るシグナル伝達をブロックするためのＣＴＬＡ４Ｉｇの使用、ならびにラット心
臓同種移植片モデル（４４、４５）およびマウス大動脈同種移植片モデル（４３
）における慢性拒絶の予防を含む。これらのモデルにおいて、ＣＴＬＡ４Ｉｇの
投与は、Ｔ細胞アネルギーを誘導することによって移植片抗原に対する、部分的
寛容（４４）または完全な寛容（４６）を生じた。同種膵島移植片の抗Ｂ７−２
抗体および抗Ｂ７−１抗体での処置もまた、移植片拒絶を阻害することが実証さ
れている（１４）。同様の結果は、マウス心臓同種移植片モデルにおける、ＣＤ
４０シグナル伝達を阻害するモデルにおいて得られた（３７、４７、６２）。２
つの研究が、ＣＤ２８−Ｂ７およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌを介するシグナル伝達
の同時遮断が、同種拒絶の発生を予防したことを詳述する。両方の経路の同時発
生的な長期の阻害は、マウス同種モデル（３７）ならびに皮膚および心臓の同種
モデル（３８）における、慢性拒絶の発生を完全に抑制した。

【００１７】 異種移植の分野において、Ｌｅｎｓｈｏｗおよび共同研究者は、ＣＴＬＡ４Ｉ
ｇでの同時処置による、マウスに移植されたヒト島の長期間のドナー特異的寛容
を実証した（４６）。移植片特異的寛容は、ＡＰＣを発現するＢ７を介する認識
の阻害の直接的な結果であることが実証された。さらに、Ｔｒａｎら（６７）は
、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ処置による短期間の抑制を実証した。マウスレシピエントに
移植されたラットおよびブタの皮膚の長期間の生存（６３）を含む、異種移植の
状況下での両方の経路の同時遮断についての利用可能なデータは限定されている
。

【００１８】 インビトロおよびインビボのデータは、ＣＤ２８−Ｂ７、ＣＤ−４０−ＣＤ４
０Ｌ、またはその両方の経路のいずれかによって媒介される相互作用の標的化が
、移植された組織由来の同種異系抗原および異種抗原に対するＴ細胞の感作を防
ぎ、それにより移殖片の存在を延長していることを、明確に示した。

【００１９】 上記のように、Ｔ細胞媒介性移植片拒絶は、十分に実証されている。免疫系は
、代替的な細胞媒介性拒絶機構、またはさらなる細胞媒介性拒絶機構を、開始し
得る。これらの機構は、特に内皮細胞によって発現される種々の分子の機能によ
って説明されている。ＶＣＡＭは、細胞接着分子であり、内皮細胞によって発現
し、この分子は、炎症部位における白血球増化における役割を有すると考えられ
ている。ＶＣＡＭは、誘導性の膜貫通糖タンパク質であり、休止内皮細胞中での
基礎発現量を有するが、プロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦα
）に対する曝露の際に迅速に発現する。ＶＣＡＭと白血球との相互作用は、白血
球細胞表面において発現するＶＬＡ抗原４（ＶＬＡ４）を介してである。従って
、内皮細胞のＶＣＡＭ発現は、ＶＬＡ−４提示白血球の、炎症部位への浸潤を誘
導するように機能し、同種異系移植片または異種移植片に対する拒絶応答を増強
する。

【００２０】 ブタのＶＣＡＭが、ヒト白血球がブタ内皮細胞単層を横切る移動を可能にする
ことにおいて重要な役割を担うと考えられる。この相互作用をブロックすること
が、異種移植片生存における有利な結果を有すると考える合理的な理由がある。
１９９４年にクローニングされたブタＶＣＡＭは、ヒトＶＣＡＭと有意な相同性
を有する（１）。（１）において示されたデータとともに、ブタＶＣＡＭは、ヒ
トの白血球で発現するカウンターレセプター（ｃｏｕｎｔｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ）であるＶＬＡ−４と効率的に相互作用することを示唆する、インビトロ研究
における他の研究者の豊富な証拠が存在する（例えば、静的接着アッセイにおい
て、ＶＣＡＭに対する抗体は、ブタ内皮に対するヒトＮＫ細胞およびＴ細胞の結
合を有意に阻害する）。ＮＫ細胞とともに、この破壊は、ブタ内皮単層への接着
後に通常生じる細胞溶解を阻害する。

【００２１】 Ｔ細胞媒介性の異種移植片拒絶機構に対する抗ＶＣＡＭ抗体の影響を予測する
ことは、より困難である。げっ歯類のいくつかの同種移植モデルにおいて、ＶＣ
ＡＭに対する抗体を使用して、同種移植の生存を延長した。いくつかの例におい
て、長期の生存期間および特異的寛容が、記載されている（２，３）が、これら
の研究の作用の正確な機構は、十分には解明されていなかった。

【００２２】 （３．５ ペプチド免疫ストラテジー） 免疫原としてのキャリア分子と結合した合成ペプチドを使用する以前のインビ
ボ研究は、生物学的に活性な抗体の産生を生じる能力を実証した（６８）。現在
、キャリアの提示によって抗体産生の増強を実証する、ペプチド免疫ストラテジ
ーを詳述する広範な文献が存在する（６８〜７２）。従って、適切なＴ細エピト
ープを使用して、その後にＢ細胞を補助するためにＴ細胞をプライムし得る。キ
ャリア分子と共有結合した自己反応性抗原を用いた免疫後の、自己反応性Ｂ細胞
によるＩｇＧ産生を報告する最近のデータが、公開された（７０）。これによっ
て、自己タンパク質に対するＢ細胞の寛容が克服され得ることを実証する。

【００２３】 上記のように、Ｔ細胞によって認識されるために、抗原（自己抗原または外来
抗原）は、ＡＰＣによって、プロセシングされ、そして提示されなければならな
い。Ｂ細胞は、ＩｇＧレセプターを介する抗原のエンドサイトーシスの後に、非
常に強力なＡＰＣとして作用し得る。活性化シグナルの十分な補体の存在下（Ｔ
ＣＲのかみ合いおよび同時刺激）において、その後の抗体の産生を生じるＴ細胞
活性化が起こる。

【００２４】 自己タンパク質由来のペプチドは、外来タンパク質と同様の様式において、プ
ロセシングされ、そしてＴ細胞に提示されるが、Ｔ細胞寛容のために、自己ペプ
チドの提示は、通常Ｔ細胞活性化を生じない（７０）。従って、Ｔ細胞認識の不
存在は、部分的に、なぜ潜在的に反応性のＢ細胞が応答しないかを説明し得る。

【００２５】 自己ペプチドに対するＢ細胞の非応答性を克服する能力が、近年、Ｄａｌｕｍ
らによって実証された（６９）。自己抗体応答が、強力な外来キャリアＴ細胞エ
ピトープの形態におけるさらなるＴ細胞補助の提供によって生成された。さらな
る研究は、かなりの数の自己反応性Ｂ細胞が宿主に存在する場合、Ｔ細胞キャリ
ア分子に結合した合成ペプチドが、Ｂ細胞非応答性を克服し得ることを実証した
（６９，７０）。ユビキチン配列内への、単一の外来Ｔ細胞エピトープの挿入は
、ネイティブ分子に対する強力な自己抗体産生を誘発した（６９）。合成Ｔ細胞
エピトープとしてのジフテリアトキソイド（ＤＴ）と化学的に結合した、自己タ
ンパク質としてのＧｎＲＨを使用する、Ｓａｄによる洗練された研究において、
ネイティブのＧｎＲＨに対する特異性を有する自己抗体が、産生された（７１，
７２）。最初のワクチン接種後に、インビボにおけるネイティブＧｎＲＨの継続
する存在が、抗体の産生を維持した。連続する抗体の産生は、ネイティブな分子
（特異的なＢ細胞は、そのネイティブな分子に対する抗体を産生する）の連続す
る存在によって維持される、持続した抗ＧｎＲＨ抗体応答に起因して、免疫され
たマウスにおける生殖不能を生じた。ＤＴキャリアは、ヘルパーＴ細胞応答を誘
発して、ＧｎＲＨ特異的Ｂ細胞を補助し、そしてＢ細胞寛容を破壊した。

【００２６】 （４．発明の記載） 最も広範な局面において、本発明は、異種移植組織／器官免疫拒絶の媒介に関
与する、代表的に（しかし、排他的ではないが）ブタ内皮細胞によって発現され
るブタエピトープに特異的な抗体の産生を生じる免疫原を用いる、哺乳動物（好
ましくはヒト）の免疫に関する。

【００２７】 本明細書において、免疫原とは、免疫応答をもたらし得る、任意のエピトープ
またはエピトープの組合せを意味する。このエピトープは、Ｔ細胞特異的であっ
ても、Ｂ細胞特異的であってもよい。この文脈において、エピトープとは、任意
のポリペプチド、ペプチド、修飾ポリペプチド、修飾ペプチド（例えば、代表的
な修飾は、エピトープのグリコシル化またはリン酸化によるものであり得る）を
意味する。

【００２８】 代表的には、本発明は、少なくとも、ＣＤ４０；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＶＣＡ
Ｍの１つから選択されたブタ分子由来のエピトープを包含する。

【００２９】 本発明が、相同な哺乳動物ポリペプチドに存在しないＢ細胞エピトープを含有
するブタ分子の一部に対する免疫原を用いて、患者自身の機能的等価物に対する
抗体を生じることなく、そしてＣＤ４ Ｔ細胞応答を生じることなく、ブタポリ
ペプチドに対する抗体の選択的な産生を確実にし、それによって細胞媒介性拒絶
を防ぐ、個体（理想的には、異種移植前）の免疫手段を提供することが、当業者
に明らかである。さらに、免疫原は、拒絶応答を媒介するブタポリペプチドの活
性を取り除く、レシピエントによって生成される遮断抗体を提供する。

【００３０】 本発明が、ブタ細胞／組織に対するレシピエントの免疫系を免疫抑制すること
を意図する先行技術に対して、顕著な利点を有することが、なおさらに当業者に
は明らかである。例えば、ＷＯ９７１１９９７１は、移植拒絶をモニターするた
め、および異種移植片拒絶をブロックするための、診断抗体および治療抗体の産
生のための、Ｂ７．２またはＶＣＡＭポリペプチドを使用を開示する。

【００３１】 これは、顕著な不利な点を有する。例えば、ＶＣＡＭまたはＢ７．２に対する
抗体を用いる移植患者の処置は、その抗体のブロック特性を維持するために、患
者の生涯を通じての定期的な投与を必要とする。さらに、免疫系は、最終的に治
療抗体に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を惹起し、患者の循環からその抗
体の除去を生じる。

【００３２】 ブタポリペプチドに対する遮断抗体の産生の原因となるのは、患者自身の免疫
系であるので、本発明は、定期的な投与を必要としない。この免疫系は、これら
の抗体を外来のものとして認識せず、従って、抗イディオタイプ抗体の産生を生
じない。

【００３３】 本発明は、キャリアと結合した分子に対するその後の応答に対して有意な影響
を及ぼす、外来Ｔ細胞エピトープの使用を含む。そのような手段によって、自己
抗体応答は、異種移植片の状況において、ブタポリペプチドに対して向けられ得
る。

【００３４】 本発明に従って、異種移植片に対する動物（ヒトを含む）の寛容を改善する方
法を提供し、この動物はＴ細胞媒介免疫を有し、この方法はその動物における拒
絶応答の生成に関与する異種分子に対する抗体の惹起をその動物に生じさせる工
程を包含し、その抗体はその動物が免疫を有するＴ細胞エピトープおよびその移
植異種分子のＢ細胞エピトープを含有する、キメラペプチドを用いてその動物を
免疫することによって惹起される。

【００３５】 従って、異種移植片特異的寛容は、キメラペプチド構築物の使用により直接的
Ｔ細胞媒介性応答を標的化し、移植前のレシピエントによる特異的抗移植片寛容
促進抗体の生成を刺激することによって、移植レシピエントにおいて誘導される
。例として、キメラペプチドは、ブタポリペプチドである、Ｂ７−１、Ｂ７−２
、ＣＤ４０、ＶＣＡＭの配列と結合した、Ｔ細胞エピトープを含有する。次に、
移植された組織の存在は、レシピエントのＢ細胞による抗体の産生を維持しそし
て永続させるように作用する。

【００３６】 本発明はまた、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープを含有するキメラペ
プチドを提供し、そのＴ細胞は、第１の種の動物（ヒトを含む）のＴ細胞であり
、そしてそのＢ細胞は、第２の種の動物のＢ細胞であり、その第１および第２の
種は、その第２の種の動物から第１の種の動物への異種移植に適切である。

【００３７】 さらに、本発明は、動物（ヒトを含む）の、異種移植片に対する寛容を改善す
るキメラペプチド（上記において規定されるキメラペプチド）の使用を提供する
。

【００３８】 本発明のさらなる局面に従って、免疫原性組成物は、Ｂ細胞エピトープが移植
片拒絶の媒介に関与する少なくとも１つのブタポリペプチドに由来し、そしてＴ
細胞エピトープはレシピエントが既に免疫されている分子由来であることによっ
て特徴付けられる、少なくとも１つのＴ細胞エピトープおよび少なくとも１つの
Ｂ細胞エピトープを含有する。

【００３９】 なおさらなる好ましい本発明の実施形態において、その免疫原性組成物は、少
なくとも１つのブタのＣＤ４０；ＶＣＡＭ；ＣＤ８６；ＣＤ８０に由来する、少
なくとも１つのペプチド抗原を含有する。

【００４０】 好ましくは、そのペプチド抗原は、ブタＣＤ４０由来である。理想的には、そ
のペプチドは、ブタＣＤ４０のアミノ末端ドメイン由来であるか、または、ＣＤ
４０を提示するブタ細胞の細胞表面において曝露されるアミノ末端ドメインの少
なくともその一部由来である。より理想的には、ペプチド抗原はさらに、図２２
に示されるペプチド配列から選択される。

【００４１】 好ましくは、そのペプチド抗原は、ブタＶＣＡＭ由来である。理想的には、そ
のペプチドは、ブタＶＣＡＭのアミノ末端ドメイン由来であるか、または、ＶＣ
ＡＭを提示するブタ細胞の細胞表面において曝露されるアミノ末端ドメインの少
なくともその一部由来である。より理想的には、ペプチド抗原はさらに、図２４
に示されるペプチド配列から選択される。

【００４２】 好ましくは、そのペプチド抗原は、ブタＣＤ８６由来である。理想的には、そ
のペプチドは、ブタＣＤ８６のアミノ末端ドメイン由来であるか、または、ＣＤ
８６を提示するブタ細胞の細胞表面において曝露されるアミノ末端ドメインの少
なくともその一部由来である。より理想的には、ペプチド抗原はさらに、図２６
に示されるペプチド配列から選択される。

【００４３】 好ましくは、そのペプチド抗原は、少なくとも９つのアミノ酸残基を含有する
。より理想的には、さらに、そのペプチドは、１０〜３０アミノ酸残基を含有す
る。

【００４４】 本発明のさらなる局面に従って、本発明の任意の前記の局面または実施形態に
従う免疫原性組成物が提供され、ここで組成物は、その免疫原性組成物に対する
免疫応答を増強し得る少なくとも１つの薬剤をさらに含有する。

【００４５】 本発明の好ましい実施形態において、その薬剤は、キャリア／アジュバントで
ある。

【００４６】 キャリア／アジュバントが、選択された抗原に対する免疫応答を促進するため
に有用であることが、当該分野において周知である。これらのアジュバントは、
抗原と架橋されるか、または結合されるか、あるいは動物に対して、抗原と同時
投与されるかのいずれかである。免疫応答の促進において有用なアジュバントは
、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕ
ｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｃｈａｐｔｅｒ ７、１４１〜２２８頁、Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５において詳述される。その免
疫原性組成物が、保存および／または投与され得る、種々のキャリア、賦形剤ま
たは希釈剤が、利用可能である。例えば、限定のためではないが、免疫原性組成
物のリポソーム中へのカプセル化は、従来実施されている。リポソームは、免疫
原性組成物などのための輸送剤として有用な、リン脂質ベースのビヒクルである
。

【００４７】 本発明のなおさらなる局面に従って、少なくとも１つの本発明のブタポリペプ
チドの少なくとも１つの領域に指向する抗体（または少なくともその有効な部分
）が提供される。

【００４８】 本発明の好ましい実施形態において、その抗体は、モノクローナル抗体である
か、または少なくともその有効な部分である。理想的には、その抗体は、標識さ
れている。

【００４９】 本発明の抗体が、ブタ組織／器官によって提示されるブタポリペプチドの発現
のモニターに関する有用性を有することが、当業者に明らかである。

【００５０】 本発明のさらなる局面に従って、異種移植片の哺乳動物レシピエントの免疫状
態をモニターする方法が、提供される。好ましいそのモニター方法は、インビト
ロにおいてである。

【００５１】 本発明のなおさらなる局面に従って、異種移殖片に対する動物の寛容を改善す
るための方法が提供される。この方法は、以下を包含する： ｉ）動物に対して、本発明の先の任意の局面または実施形態に従う少なくとも
１つの免疫原性組成物を投与する工程；必要に応じて ｉｉ）この免疫原性組成物に対するこの動物の免疫状態をモニターする工程； ｉｉｉ）この動物中への少なくとも１つのブタ組織／器官の移殖；そして、必
要に応じて ｉｖ）このブタ組織／器官に対する拒絶応答についてこの動物をモニターする
工程。

【００５２】 本発明の好ましい方法において、この動物は、ヒトである。

【００５３】 本発明のさらに好ましい方法において、この異種移殖片は、任意の血管新生化
移植片および／または免疫原性ブタ細胞／組織である。

【００５４】 本発明のさらに好ましい方法において、この異種移殖片は、ブタ膵島である。

【００５５】 上記の（ｉｉ）が、血清における同時刺激分子に対する抗体の存在についてモ
ニターすること（例えば、この同時刺激分子を発現する細胞のＥＬＩＳＡまたは
ＦＡＣＳ分析によって）か、またはあるいは、または加えて、従来のＴ細胞溶解
アッセイによって処理された動物の血液における細胞溶解性Ｔ細胞の存在をモニ
ターすることのいずれかによって実行され得ることは、当業者に明らかである。

【００５６】 本発明のキメラペプチドの使用の潜在的利点は、このキメラペプチドが、遮断
抗体または融合タンパク質の注入の必要性を回避することである。さらに、レシ
ピエントの抗体応答の誘導によって、異種抗体または融合タンパク質の投与と最
も一般的に関係する問題、すなわち、投与された試薬に対する免疫応答が、回避
される。

【００５７】 本発明の実施形態は、ここで、例としてのみ、そして以下の表および図面を参
照して記載される。

【００５８】 表１は、相同なブタＣＤ４０に対するヒトＣＤ４０中の非相同性の領域を示す
。

【００５９】 表２は、相同なブタＶＣＡＭに対するヒトＶＣＡＭ中の非相同性の領域を示す
。

【００６０】 表３は、相同なブタＣＤ８６に対するヒトＣＤ８６中の非相同性の領域を示す
。

【００６１】 （５．特定の実施形態） （５．１ ブタ同時刺激分子のクローニング） （５．１．１ ブタＢ７−２のクローニング） ＲＮＡを、標準的プロトコルを使用して、初代ブタ細胞および形質転換された
ブタ細胞から抽出した。次いで、ｍＲＮＡを逆転写し、そして１．５ｍＭマグネ
シウムとともに５６℃にて３５サイクルのＰＣＲによって、このｃＤＮＡからブ
タＢ７−２（ｐｏＢ７−２）を増幅した。その５’プライマーおよび３’プライ
マーＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴ
ＧおよびＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＧＴＡＣＴＧＴＴＧ
ＴＣを、それぞれ、公開されたｐｏＢ７−２配列（６０）に基づいて、開始コド
ンおよび終止コドンに重ねるように設計した（図２）。９５６塩基対のフラグメ
ントを生成し、そしてｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限
部位中にサブクローニングした。標準的なｍ１３フォワードプライマーおよびリ
バースプライマーを使用して、ヌクレオチド配列を決定した。単一クローンであ
るＣＤ８６（ｉ）の配列を図３に示し、公開されたブタ（図４）、ヒトおよびマ
ウスＢ７−２（図５）由来の配列と比較する。本発明者らのクローンであるＣＤ
８６（ｉ）と公開された配列との間で１塩基対の差異を、３’プライム末端にて
検出する。しかし、これは、ｐｏＢ７−２の発現またはそのリガンドへの結合の
いずれかに関して重要な差異ではないようである。ＣＤ８６（ｉ）の推定アミノ
酸配列を、ブタ、ヒトおよびマウスＢ７−２の推定アミノ酸配列と比較して、図
６に示す。

【００６２】 （５．１．２ ブタＢ７−１およびＣＤ４０のクローニング） フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはアメリカヤマゴボウマイトジェン（Ｐ
ＭＷ）で刺激されたブタＰＢＭＣおよび形質転換されたブタ内皮細胞から抽出し
たＲＮＡを使用して、同時刺激分子Ｂ７−１およびＣＤ４０をコードするｃＤＮ
Ａを増幅する。Ｂ７−１プライマーを、マウスとヒト（２９、４９）の配列を比
較した後に、保存領域に基づいて設計した。外部（コード領域の外側に存在する
）ＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＧ（３’ｉ）、ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡ
ＴＧＴＴＡＴＣＣＣ（３’ｉｉ）およびＡＧＣＡＴＣＴＧＡＡＧＣ（５’）、な
らびに内部（コード領域の内にある）ＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡ
ＡＣＣ（３’）およびＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＣ（５’）プライマ
ーを、図７に示すように設計した。２つの３’プライマーの作製は、末端コード
領域におけるヒト配列とマウス配列との間の有意な差異に起因する。生じるＰＣ
Ｒフラグメントを、プロモーター配列内に含まれる制限部位ＢａｍＨＩおよびＳ
ａｌＩを使用して、上記のようにサブクローニングする。次いで、構築物を、配
列確認に発注する。

【００６３】 ＣＤ４０プライマーを、図８ＡおよびＢに示されるように、ヒト、マウスおよ
びウシ（７３、７４、７５）由来の公開されたＣＤ４０配列を配列整列した後、
類似の様式で設計した。５’プライマー配列および３’プライマー配列は、それ
ぞれ、ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＧＡＴＧＣＧ
ＡＣＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＣＣおよびＧＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＴＧであり、ＢａｍＨＩおよびＥｃ
ｏＲＩの制限部位を含む。

【００６４】 （５．２ ブタ同時刺激分子を発現する細胞トランスフェクタントの作製） ｐｏＢ７−２分子（ＣＤ８６９（ｉ））を、ネオマイシン薬物選択マーカーを
保有する真核生物発現ベクターｐｃｉ．ｎｅｏ中にサブクローニングした。これ
は、Ｍ１およびＭ１．ＤＲ１で形質転換されたマウス細胞株を標準的リン酸カル
シウム沈殿法を使用してトランスフェクトするために使用されている。Ｇ４１８
耐性ｐｃｉ．ｎｅｏ発現細胞を、ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄ）精製を使用
して選択し、そして高度に発現するクローンを、限界希釈によって選択する。

【００６５】 安定なｐｏＢ７−２ Ｍ１およびＰ８１５トランスフェクタントを、Ｍａｈｅ
ｒらによって本発明者らに供給されたｐｏＢ７−２ ＤＮＡ構築物を使用して、
このアプローチによって作製された（図９）。Ｍ１およびＰ８１５細胞の一過性
トランスフェクションを、本発明者らのＣＤ８６（ｉ）構築物を使用して生成し
た（図１０）。３つの特定のアッセイを、ＣＤ８６（ｉ）でトランスフェクトさ
れた細胞を使用して行う。

【００６６】 （Ｉ）ＭＨＣ拘束の状況におけるヒトＢ７−１と比較したｐｏＢ７−２の同時
刺激機能； （ＩＩ）免疫されたマウスの血清中の特異的な抗ｐｏＢ７−２抗体のフローサ
イトメトリー分析；および （ＩＩＩ）特異的な抗ｐｏＢ７−２モノクローナル抗体の生成。

【００６７】 （Ｉ）ヒトまたはブタ応答動物を用いる増殖アッセイにおいて、ＤＲ１の状況
におけるヒトＢ７−１またはＢ７−２の同時刺激機能とのインビトロでの比較分
析を実施して、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡ−ＤＲ１の状況におけるｐｏＢ
７−２またはｐｏＢ７−１の同時刺激機能を決定する。

【００６８】 （ＩＩ）トランスフェクトされたＰ８１５細胞は、キメラペプチド免疫レジメ
ンを受けた免疫されたマウスの血清中のブタ抗Ｂ７−２抗体の検出のための重要
な試薬である。コントロールまたはｐｏＢ７−２でトランスフェクトされたＰ８
１５細胞を用いるフローサイトメトリー分析は、Ｂ７−２についての血清の特異
性を反映する。９つのＢ７−２ペプチドすべてのプールで免疫されたＣ５７ＢＬ
−６マウスを用いる予備研究は、ブタＢ７−２でトランスフェクトされたＰ８１
５細胞に対するＢ７−２ペプチド血清の優先的結合を示した（図１１ａおよび１
１ｂ）。

【００６９】 （ＩＩＩ）ｐｏＢ７−２についての特異性を有するＭａｂを、ｐｏＢ７−２を
発現するＰ８１５細胞でのＢａｌｂ／ｃマウスの免疫によって生成する。免疫マ
ウス由来の脾臓を、ＮＳ０融合パートナーと融合し、そして首尾よい融合物をＨ
ＡＴ選択によって選択する。培養上清を用いたｐｏＢ７−２ Ｐ８１５トランス
フェクタントのフローサイトメトリー染色によって、ＭＡｂ分泌細胞の同定が可
能になる。細胞を培養で増殖させ、そしてその培地を、硫安沈殿の後にプロテイ
ンＧに通すことによる抗体精製のために収集する。モノクローナル抗体に関する
調製のための技術は、当該分野で、そしてＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのような刊行物を参照して
、周知である。

【００７０】 Ｂ７−１およびＣＤ４０について特異性を有するＭＡｂを、同じプロトコルを
使用して生成する。これらのＭＡｂは、関連するブタ組織上でのＣＳ分子の発現
をさらに特徴付けるための価値ある試薬を提供する。

【００７１】 （５．３ ｐｏＢ７−２／ＯＶＡキメラペプチド構築物の設計および合成） ｐｏＢ７−２の配列由来の９つの異なるペプチドを、最初に合成のために選択
した。ブタＢ７−２ペプチド（サイズは６〜２２マー）を、Ｂ細胞エピトープの
推定サイズによって決定して選択した。Ｔ細胞エピトープＯＶＡ ３２３〜３３
９と組み合わせて、ペプチドを合成のために選択した。Ｂ７−２ペプチドを、３
Ｄコンピューターモデリング（Ｐａｕｌ Ｔｒａｖｅｒｓとの協働）に基づいて
、そしてＳｅｑＡｉｄＩＩコンピューターソフトウェアパッケージを使用して推
定抗原性および親水性に基づいて選択した。この９つのペプチドすべては、直鎖
状エピトープを反映する。クローニングされたｐｏＢ７−２配列中のこの９つの
ペプチドの位置を示す（図１２）。合成ペプチド配列を表１に詳細に記す。

【００７２】

【表１】 ペプチド１〜１０についてのペプチド配列およびアミノ酸位置は、ブタＢ７−
２内のＢ７−２ペプチド配列の位置に関係する。ｏｖａ配列のアミノ酸位置は、
単にそのＯｖａペプチドについて示される。ニワトリ卵アルブミン（オボアルブ
ミン）由来の１７アミノ酸のペプチドを、Ｔ細胞エピトープとして選択した（Ｏ
ＶＡ３２３−３３９（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ））。このエピトー
プは、Ｈ−２^bで制限されたＴ細胞応答の生成について、公開された報告に基づ
いて選択した（７６、７７）。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ−６マウス（Ｈ−２^b
ハプロタイプ）が、オボアルブミン全体を用いて免疫した後にネイティブ分子お
よびＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの両方に対する増殖応答をマウントする能力
を示した（図１３）。ペプチドを、ペプチド合成機（Ｇｅｎｏｓｙｓ）上で生成
し、そして粗ペプチドを、ＨＰＬＣによって７０％より高い純度まで精製した。
ＯＶＡコントロール免疫マウス由来の血清は、理想的には、３２３−３３９配列
を認識しないべきであり、これは、このＴ細胞エピトープがＢ細胞決定因子を欠
くことを示す。

【００７３】 （５．４ 寛容誘導） （５．４．１ インビボ寛容誘導ストラテジー） Ｃ５７ＢＬ−６マウスを、ＣＦＡ中のオボアルブミン全体を用いて免疫し、続
いて、コントロールペプチド（ＯＶＡペプチド）かまたはＣＳペプチド（ＯＶＡ
−Ｂ７−２構築物）のいずれかで週１回の免疫を３回行う。血液を屠殺後に収集
し、そして血清を、標準的な技術を使用して調製する。特定のマウス抗ブタＢ７
−２ ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ Ａｂの存在を、２つのストラテジーのうち
の１つによって検出する。

【００７４】 ペプチドＥＬＩＳＡを使用して、血清中の抗ペプチド抗体の存在についてスク
リーニングする。ペプチドをアルデヒド結合によってプレートにコーティングし
て、このペプチドに対するＡｂの自由な接近を可能にする（７８）。プレートを
、個々のペプチドまたはｏｖａコントロールペプチドでコーティングして、目的
の特定のペプチドの同定を可能にする。ＰｏＢ７−２でトランスフェクトされた
Ｐ８１５細胞の表面上で発現したネイティブＢ７−２分子と血清との反応性を検
出するために、表面を染色した後、フローサイトメトリーを行う。目的のＣＳペ
プチド（ペプチドＥＬＩＳＡ陽性およびネイティブＢ７−２を認識する）を同定
し、その血清を使用して、インビトロにおいてＴ細胞増殖応答を阻害する。これ
は、抗体が遮断抗体であるか否かを決定する。

【００７５】 インビボ研究を、島移植系を使用して実施する。ネイティブ分子を認識するが
増殖応答をブロックできない抗体は、有用なポリクローナル抗体試薬である。

【００７６】 免疫は、２つの群のマウスを含み、一方は、９つ全てのＢ７−２ペプチドのプ
ールを受け、そしてもう一方は、ｏｖａコントロールペプチドを受けた。収集し
た血清を、ペプチドＥＬＩＳＡによってスクリーニングし（図１４ａまたは１４
ｂ）、このＥＬＩＳＡは、目的のペプチドの同定を可能にした。ペプチド２、４
および６に対する抗血清は、ｏｖａコントロールよりもＢ７ペプチドに対する優
先的な結合を明確に示す。この血清はまた、ｐｏＢ７−２でトランスフェクトさ
れた細胞に対する増強した結合を示した（図１１）。ペプチド４および６を、候
補ペプチドとして選択し、引き続く免疫プロトコルにおいて使用した。ペプチド
４および６を用いる免疫は、免疫されたマウスの血清においてペプチド４および
６についての特異性を有するＩｇＧの有意なレベルを、明確に生じた（図１５ａ
および１５ｂ）。ペプチド４についての血清の特異性（ｏｖａコントロールに対
してではなく）を、図１６に示す。ペプチド４および６で免疫されたマウス由来
の血清が、ブタＢ７−２でトランスフェクトされたＰ８１５細胞の表面上で発現
したネイティブブタＢ７−２分子を特異的に認識する能力を、図１７ａおよび１
７ｂに例示する。トランスフェクトされていないコントロールＰ８１５細胞は、
ペプチド４および６の血清で染色せず、ｏｖａペプチド血清とともにインキュベ
ートした、コントロール細胞もトランスフェクトされた細胞も染色しない。類似
のプロトコルは、ペプチド２に従う。これらのデータは、これらの技術がキャリ
アＴ細胞エピトープによってアミノ酸配列に対する抗ペプチド抗体を生成する能
力を、明確に示す。

【００７７】 同一のストラテジーは、ブタＣＤ４０およびブタＢ７−１（かつてこれらの分
子をコードするＤＮＡ配列が解明されている）に基づいて設計されたペプチドに
従う。

【００７８】 （５．４．２ 機能的評価；膵島異種移植片の生存の延長） 非血管性である島異種移植片は、Ｔ細胞媒介性機構によってもっぱら拒絶され
（７９、８０）、それによってＴ細胞媒介性反応の調節を研究するために理想的
な系を提供する。図１８を参照のこと。島の細胞媒介性拒絶についての役割が非
常に明確に示され、そして匹敵するアロ応答（ａｌｌｏｒｅｓｐｏｎｓｅ）より
も大きいことが報告されている（８０）。ブタ膵島のマウスへの移植は、確立さ
れた手順であり、これは、文献（８０〜８３）で十分に実証されている。この研
究室内での研究は、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）の腹腔
内投与によって糖尿病性にされた、Ｃ５７ＢＬ−６マウスの腎臓カプセル下での
、大きな白ブタ由来の膵島の移植後に、高血糖症における減少を示した（図１８
）。図１９および２０を参照のこと。単離手順のさらなる最適化（８４、８５）
は、十分に機能的な島の精製を可能にすることを必要とする。移植された島は、
通常、任意の免疫抑制剤の非存在下で６〜１０日の間生存する。直接的なＴ細胞
媒介性異種拒絶の首尾よい調節は、適切なコントロールと比較して、１０日を越
える島の生存の延長によってモニターされる。

【００７９】 現在までにＢ７−２を用いて得た結果は、公知のＴ細胞ヘルパーエピトープに
結合体化された合成Ｂ７−２ペプチドが、インビボにおいて抗ブタＢ７−２抗体
の産生を生じる能力を示す。これらの抗体は、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌに対する抗
体と関連して、Ｂ７アイソフォームとＣＤ２８との間の結合部位に指向される場
合、直接的な抗ブタ異種反応性を有するヒトＴ細胞の同時刺激をブロックし、そ
れによって、異種移植の状況において島の生存を延長する。

【００８０】 マウスインビボモデルに対するブタ島におけるこのようなアプローチの適合性
を確立して、研究は、臨床試験の前に、霊長類移植系に対するブタについて進行
させる。

【００８１】 （５．５ これらのストラテジーの臨床的使用についての適応） 臨床的適応性について、以下の要件が必要である： （Ｉ）ＯＶＡを置換するための適切なＴ細胞エピトープの選択。１つの候補分子
は、破傷風トキソイド（ＴＴ）であり、これは、ヒト免疫ストラテジーにおける
使用のために広範に使用される抗原である（６８、８６）。ＴＴを用いる多くの
成体の先行の免疫は、このストラジーに対してさらなる利点である。なぜなら、
記憶Ｔ細胞が循環においてすでに存在するからである。（ｉｉ）移植片拒絶を加
速するレシピエントによって生成される、特定のＢ７−２に指向される特定のＴ
細胞応答の非存在下において、効果的かつ迅速なスクリーニング方法を使用して
、抗ドナー（ブタ）Ｂ７−２抗体の存在を検出する。

【００８２】 （６．特定の実施形態の要約） 上記の実施例は、直接的な抗ブタ異種反応性を有するヒトＴ細胞の、ブタ細胞
による同時刺激を阻害するための新規なストラテジーに関する。これは、ブタ内
皮ならびに骨髄由来の抗原提示細胞上での同時刺激分子の発現に起因して、ブタ
器官の異種移植の状況において特に重要である。

【００８３】 レシピエントは、ブタ同時刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０）の
配列に結合体化されたＴ細胞エピトープを含むハイブリッド合成ペプチドを用い
て免疫される。従って、ヒト細胞（ＣＤ２８およびＣＤ１５４）上でのこれらの
カウンター−レセプターに対する結合に関与する同時刺激分子の領域に特異的な
抗体を誘導するペプチドは、同時刺激の送達をブロックし得る。一旦、抗体応答
が誘導されると、移植された器官は、同時刺激分子の発現に起因して、この応答
を回復し、それによってこの応答を持続し、そして同時刺激遮断の内因性機構を
提供する。

【００８４】 （７．引用文献）

【００８５】

【数１】 （ＣＤ８６（Ｂ７−２）） ヒトＣＤ８６タンパク質配列およびブタＣＤ８６タンパク質配列を整列させ、
そして非相同性の領域を同定した。本発明者らは、それらのペプチド配列が、以
下に列挙された領域由来であるか、またはこれらのペプチドのいずれかの間の任
意の重複領域由来であると推定する。潜在的な抗体エピトープを含む目的の推定
配列は、７５％未満の配列同一性に基づいて選択した。

【００８６】

【数２】 領域（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、マウスにおいて同定されたペプチド４およ
び６の配列を含む領域を包含する。

【００８７】 （ＣＤ４０） ヒトＣＤ４０タンパク質配列およびブタＣＤ４０タンパク質配列を整列させ、
そして非相同性の領域を同定した。本発明者らは、それらのペプチド配列が、以
下に列挙された領域由来であるか、またはこれらのペプチドのいずれかの間の任
意の重複領域由来であると推定する。潜在的な抗体エピトープを含む目的の推定
配列は、７５％未満の配列同一性に基づいて選択した。

【００８８】

【数３】 （ＶＣＡＭ−１） ヒトＶＣＡＭ−１タンパク質配列およびブタＶＣＡＭ−１タンパク質配列を整
列させ、そして非相同性の領域を同定した。本発明者らは、それらのペプチド配
列が、以下に列挙された領域由来であるか、またはこれらのペプチドのいずれか
の間の任意の重複領域由来であると推定する。潜在的な抗体エピトープを含む目
的の推定配列は、７５％未満の配列同一性に基づいて選択した。

【００８９】

【数４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１ａは、直接的異物認識の模式図であり、そして図１ｂは、間接的異物認識
の模式図である。

【図２】 図２は、ブタＣＤ８６核酸配列を示す。

【図３】 図３は、ＰＣＲ増幅の前にブタｍＲＮＡの逆転写によって得られたブタＣＤ８
６ ｃＤＮＡ配列を示す。

【図４】 図４は、公開されたブタＣＤ８６配列との、図２中のｃＤＮＡのヌクレオチド
配列の比較を示す。

【図５】 図５は、公開されたマウスおよびヒトのＣＤ８６配列との、図２中のｃＤＮＡ
配列の比較を示す。

【図６】 図６は、ブタ、ヒトおよびマウスのアミノ酸配列と比較した、図２中のｃＤＮ
Ａの翻訳アミノ酸配列を示す。

【図７】 図７は、ヒトおよびマウスのＢ７．１核酸配列に対するブタＢ７．１オリゴヌ
クレオチドプライマーの位置を示す。

【図８ａ】 図８ａは、ヒト、マウスおよびブタのＣＤ４０核酸配列の比較を示し；図８ｂ
は、ヒト、マウスおよびウシのＣＤ４０アミノ酸配列の比較を示す。

【図８ｂ】 図８ａは、ヒト、マウスおよびブタのＣＤ４０核酸配列の比較を示し；図８ｂ
は、ヒト、マウスおよびウシのＣＤ４０アミノ酸配列の比較を示す。

【図９】 図９は、ブタＣＤ８６（Ｂ７．２）をコードするベクターでのトランスフェク
ション後の、ＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現のＦＡＣＳ分析を示す。

【図１０】 図１０は、ブタＣＤ８６（Ｂ７．２）をコードするベクターで一過性トランス
フェクトされた細胞による、ＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現のＦＡＣＳ分析を示す
。

【図１１】 図１１は、ブタＣＤ８６（Ｂ７．２）でトランスフェクトされた細胞のフロー
サイトメトリー分析を示す。

【図１２】 図１２は、ブタＣＤ８６（Ｂ７．２）配列中のＣＤ８６（Ｂ７．２）由来の９
つのペプチドの位置を示す。

【図１３】 図１３は、オボアルブミン全体またはオボアルブミンペプチドＯｖａ₃₂₃〜₃₃₉ に対するＴ細胞増殖応答の比較を示す。

【図１４ａ】 図１４ａは、ペプチドＥＬＩＳＡによる、Ｂ７．２特異的ペプチド血清または
オボアルブミンコントロール血清の示差的結合を示す。

【図１４ｂ】 図１４ｂは、ペプチド４または６で免疫されたマウス血清による、Ｂ７．２由
来のペプチド４および６のインビトロでの認識を示す。

【図１５ａ】 図１５は、ペプチドＥＬＩＳＡによる、Ｂ７．２ペプチド血清およびコントロ
ールｏｖａペプチド血清のインビトロでの認識を示す。

【図１５ｂ】 図１５ｂは、ペプチド４および６血清による、直接のマウス抗ブタＴ細胞応答
の阻害を示し、これはまた、マウスＣＤ８６による同時刺激の阻害が存在しない
こと示す。

【図１６】 図１６は、ペプチドＥＬＩＳＡによる、Ｂ７．２由来のペプチド４血清または
ｏｖａコントロールペプチド血清の示差的結合を示す。

【図１７ａ】 図１７ａは、ペプチド４由来の血清またはコントロールｏｖａペプチド血清で
染色した後の、ブタＣＤ８６でトランスフェクトされたＰ８１５細胞のフローサ
イトメトリー分析を示す。

【図１７ｂ】 図１７ｂは、ペプチド４またはペプチド６に由来するマウス血清からの血清で
染色した後の、ブタＣＤ８６でトランスフェクトされたＰ８１５細胞またはマウ
スＣＤ８６でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。

【図１８】 図１８は、大きな白いブタから単離されたブタ膵島の調製を示す。

【図１９】 図１９は、キメラペプチド免疫および移植プロトコルの模式図である。

【図２０】 図２０は、抗ブタＣＤ８６抗血清が、移殖されたブタ膵島の生存を延長するこ
とを示す。

【図２１】 図２１は、ブタとヒトのＣＤ４０のアミノ酸配列の比較である（下線の配列が
、表１にて同定されるペプチドである）。

【図２２】 図２２は、ブタＣＤ４０の翻訳アミノ酸配列である（下線の配列が、表１にて
同定されるペプチドである）。

【図２３】 図２３は、ブタとヒトのＶＣＡＭのアミノ酸配列の比較である（下線の配列が
、表２にて同定されるペプチドである）。

【図２４】 図２４は、ブタＶＣＡＭの翻訳アミノ酸配列である（下線の配列が、表２にて
同定されるペプチドである）。

【図２５】 図２５は、ブタとヒトのＣＤ８６のアミノ酸配列の比較である（下線の配列が
、表３にて同定されるペプチドである）。

【図２６】 図２６は、ヒトＣＤ８６の翻訳アミノ酸配列である（下線の配列が、表３にて
同定されるペプチドである）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドーリング， アンソニー イギリス国 エヌ10 １エイチエス ロン ドン， マスウェル ヒル， コールドフ ォール アベニュー 28 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA15 BA31 BA41 CA04 DA02 EA04 GA03 GA11 HA01 HA11 4B064 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4C085 AA02 BB11 CC04 DD22 DD61 EE06 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA22 EA54 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブタ異種移植片に対する寛容を改善する方法であって、以下
   ： ｉ）Ｔ細胞エピトープ；および ｉｉ）Ｂ細胞エピトープであって、該Ｂ細胞エピトープは、異種移植片拒絶を媒
   介することに関与し、そしてブタポリペプチドの領域由来のブタポリペプチドで
   あって、該ブタポリペプチドの領域は、等価なヒトポリペプチドの対応する領域
   に対する７５％未満の配列同一性を有する、ブタポリペプチドであることを特徴
   とする、Ｂ細胞エピトープ を含む免疫原を用いて、哺乳動物を免疫する工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記Ｂ細胞エピトープが、ＣＤ４０；ＣＤ８０；ＣＤ８６ま
   たはＶＣＡＭから選択される少なくとも１つのブタポリペプチド由来のペプチド
   である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ペプチドが、図２２に示される少なくとも１つのペプチ
   ドから選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ペプチドが、図２４に示される少なくとも１つのペプチ
   ドから選択される、請求項１または２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ペプチドが、図２６に示される少なくとも１つのペプチ
   ドから選択される、請求項１または２に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記Ｔ細胞エピトープが、破傷風トキソイドポリペプチド由
   来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 免疫原を含む組成物であって、該免疫原は、Ｔ細胞エピトー
   プおよびＢ細胞エピトープを有し、ここで、該Ｂ細胞エピトープは、ブタポリペ
   プチドの領域由来であり、該ブタポリペプチドの領域は、等価なヒトポリペプチ
   ドの対応する領域に対する７５％未満の配列同一性を有する、免疫原であること
   を特徴とする、組成物。
8. 【請求項８】 前記ブタポリペプチドが、異種移植片の血管内皮細胞によっ
   て発現される、請求項７に記載の組成物。
9. 【請求項９】 前記Ｂ細胞エピトープが、ＣＤ４０；ＣＤ８６；ＣＤ８０；
   ＶＣＡＭから選択される少なくとも１つのブタポリペプチド由来である、請求項
   ７または８に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 前記Ｂ細胞エピトープが、図２２に示される少なくとも１
    つのペプチドから選択される、請求項９に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 前記Ｂ細胞エピトープが、図２４に示される少なくとも１
    つのペプチドから選択される、請求項９に記載の組成物。
12. 【請求項１２】 前記Ｂ細胞エピトープが、図２６に示される少なくとも１
    つのペプチドから選択される、請求項９に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 前記Ｂ細胞エピトープが、ＣＤ８６の細胞外ドメイン由来
    である、請求項９または１２に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 前記Ｔ細胞エピトープが、破傷風トキソイド由来である、
    請求項７〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 【請求項１５】 前記組成物が、前記免疫原に対する免疫応答を増強し得る
    キャリアをさらに含む、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 抗体、またはその有効な部分であって、該抗体は、ブタポ
    リペプチドの領域に結合し得、該ブタポリペプチドの領域は、等価なヒトポリペ
    プチドの対応する領域に対する７５％未満の配列同一性を有する、抗体であるこ
    とを特徴とする、抗体、またはその有効な部分。
17. 【請求項１７】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載
    の抗体。
18. 【請求項１８】 前記抗体が、少なくとも１つの検出可能な標識で改変され
    る、請求項１６または１７に記載の抗体。
19. 【請求項１９】 異種移植片の哺乳動物レシピエントの免疫状態をモニター
    する方法であって、以下： ｉ）試験されるべき異種移植片レシピエントからサンプルを取り出す工程； ｉｉ）該サンプルを請求項１６〜１８に記載の抗体と接触させる工程；および ｉｉｉ）異種移植片拒絶を媒介することに関与するブタポリペプチドの発現をモ
    ニターする工程 を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 異種移植片を受ける前に哺乳動物を処置する方法であって
    、以下： ｉ）請求項７〜１５に記載の組成物を用いて哺乳動物を免疫する工程； ｉｉ）該免疫原性組成物に対する該哺乳動物の免疫状態を評価する工程； ｉｉｉ）レシピエント哺乳動物へ該異種移植片組織／器官を移植する工程；およ
    び ｉｖ）該異種移植片に対する拒絶応答をモニターする工程 を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 前記異種移植片がブタ起源であり、そして前記哺乳動物が
    ヒトである、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記異種移植片が、少なくとも１つの血管化された移植片
    および／または免疫原性ブタ細胞／組織である、請求項１９〜２１のいずれか１
    項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記異種移植片が膵島である、請求項１９〜２２のいずれ
    か１項に記載の方法。