JPWO2016159181A1 - 免疫用ペプチド、免疫用ペプチドの製造方法、それを含む免疫疾患用医薬組成物、および免疫疾患の治療方法 - Google Patents

免疫用ペプチド、免疫用ペプチドの製造方法、それを含む免疫疾患用医薬組成物、および免疫疾患の治療方法 Download PDF

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Abstract

免疫用ペプチドと生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導できる新たな免疫用ペプチドを提供する。本発明の免疫用ペプチドは、免疫用ペプチドであって、前記免疫用ペプチドは、ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと抗体誘導部とを含み、前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する１以上のアミノ酸配列、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する１以上のアミノ酸配列の少なくとも一方であり、前記免疫用ペプチドは、生体に投与することで、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導することを特徴とする。

Description

本発明は、免疫用ペプチド、免疫用ペプチドの製造方法、それを含む免疫疾患用医薬組成物、および免疫疾患の治療方法に関する。
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子と、それにより提示されているＴ細胞エピトープとの複合体を認識する抗体は、前記複合体に特異的なＴ細胞受容体（以下、「複合体を認識するＴ細胞受容体」ともいい、Ｔ細胞受容体を「ＴＣＲ」ともいう。）による前記複合体の認識を阻害し、免疫疾患の疾患発症等を抑制できることが知られている（非特許文献１）。
前記抗体は、前記Ｔ細胞エピトープの免疫では取得できず、前記Ｔ細胞エピトープと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体（以下、「Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子」ともいう。）の免疫が必要である（非特許文献２−４）。しかしながら、前記ＭＨＣクラスII分子は多数のアリルがあり、さらに、患者ごとに生体内で発現している前記ＭＨＣクラスII分子は異なる。このため、各免疫疾患における各Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子について、前記抗体を医薬として取得する場合、前記抗体を産生する細胞を取得するために、まず、多数の組合せの前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を準備する。そして、多数の前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子について、それぞれ、生体に投与し、前記生体から、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識する抗体産生細胞を単クローンとして採取する必要があった。したがって、膨大な数の組合せの問題から、前記抗体を取得し、前記抗体を治療に使用することは困難という問題があった。
そこで、本発明は、免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導できる新たな免疫用ペプチドの提供を目的とする。
前記本発明の課題を解決するために、本発明の免疫用ペプチドは、免疫用ペプチドであって、
前記免疫用ペプチドは、ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと抗体誘導部とを含み、
前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する１以上のアミノ酸配列、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する１以上のアミノ酸配列の少なくとも一方であり、
前記免疫用ペプチドは、生体に投与することで、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導することを特徴とする。
本発明の免疫用ペプチドの製造方法（以下、「製造方法」ともいう。）は、前記本発明の免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させる工程を含むことを特徴とする。
本発明の免疫疾患用医薬組成物（以下、「医薬組成物」ともいう。）は、前記本発明の免疫用ペプチドを含むことを特徴とする。
本発明の免疫疾患の治療方法は、免疫疾患を治療する方法であって、
生体に前記本発明の免疫用ペプチドおよび前記本発明の免疫疾患用医薬組成物の少なくとも一方を投与することを特徴とする。
本発明の免疫用ペプチドによれば、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導できる。
図１は、実施例１ＡにおけるＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。 図２は、実施例１ＡにおけるＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。 図３は、実施例１Ｂにおける可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示すヒストグラムである。 図４は、実施例１ＢにおけるＩＬ−２の産生量を示すグラフである。 図５は、実施例２ＡにおけるＩｇＧ１抗体の結合量を示すヒストグラムである。 図６は、実施例２Ｂにおける可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示すヒストグラムである。 図７は、実施例３におけるＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。 図８は、実施例４における可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示すヒストグラムである。 図９は、実施例５におけるＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。 図１０は、実施例６におけるＣＤ４５陽性細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の割合を示すグラフである。 図１１は、実施例７における細胞増殖の結果を示すグラフである。 図１２は、実施例７における臨床スコアの結果を示すグラフである。 図１３は、実施例８における臨床スコアの結果を示すグラフである。
本発明の免疫用ペプチドにおいて、前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する３以上のアミノ酸、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する３以上のアミノ酸の少なくとも一方であることが好ましい。
本発明の免疫用ペプチドにおいて、前記産生された抗体が、前記Ｔ細胞エピトープと前記生体のＭＨＣ分子との複合体を認識するＴ細胞受容体の結合を阻害することが好ましい。
本発明の免疫用ペプチドにおいて、前記Ｔ細胞エピトープは、前記Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、Ｔ細胞受容体が認識する１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、前記Ｔ細胞エピトープと前記ＭＨＣ分子との複合体に対して特異的なＴ細胞受容体により、置換されたアミノ酸配列と前記ＭＨＣ分子との複合体が認識されない置換Ｔ細胞エピトープであることが好ましい。
本発明の免疫用ペプチドは、前記ターゲットタンパク質のＢ細胞エピトープを含み、
前記Ｂ細胞エピトープが、下記（１）または（２）の置換Ｂ細胞エピトープであることが好ましい。
（１）前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢ細胞受容体により認識されない置換Ｂ細胞エピトープ
（２）前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して、１００％未満の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢ細胞受容体により認識されない置換Ｂ細胞エピトープ
本発明の免疫用ペプチドにおいて、前記ＭＨＣ分子が、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスII分子の少なくとも一方である。
本発明の免疫用ペプチドにおいて、前記ターゲットタンパク質が、例えば、免疫疾患の抗原タンパク質である。
本発明の免疫用ペプチドにおいて、前記免疫疾患が、例えば、アレルギー疾患または自己免疫疾患である。前記アレルギー疾患が、例えば、食物アレルギー、口腔アレルギー症候群、薬剤アレルギー、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、接触皮膚炎、蕁麻疹、光線過敏症、金属アレルギー、ネコアレルギー、ダニアレルギー、および喘息からなる群から選択された１つである。前記自己免疫疾患が、例えば、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病、橋本病、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、皮膚筋炎、間質性肺炎、肺胞蛋白症、ＡＮＣＡ関連血管炎、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、多発性筋炎、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、抗カルジオリピン抗体、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、習慣性流産、ベーチェット病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、およびナルコレプシーからなる群から選択された１つである。
本発明の免疫疾患用医薬組成物において、前記免疫疾患用医薬組成物は、さらに、アジュバントを含むことが好ましい。
本発明において、「上流」は、タンパク質のアミノ酸配列においてＮ末端方向のことを意味し、「下流」は、タンパク質のアミノ酸配列においてＣ末端方向のことを意味する。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
＜免疫用ペプチド＞
本発明の免疫用ペプチドは、前述のように、免疫用ペプチドであって、前記免疫用ペプチドは、ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと抗体誘導部とを含み、前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する１以上のアミノ酸配列（以下、「上流側抗体誘導部」ともいう。）、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する１以上のアミノ酸配列（以下、「下流側抗体誘導部」ともいう。）の少なくとも一方であり、前記免疫用ペプチドは、生体に投与することで、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体（以下、「免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子」ともいう。）に対する抗体産生を誘導することを特徴とする。本発明の免疫用ペプチドは、前記免疫用ペプチドが、前記ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと前記抗体誘導部とを含み、前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記上流側抗体誘導部、および前記下流側抗体誘導部の少なくとも一方であり、前記免疫用ペプチドは、生体に投与することで、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導することを特徴とし、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の免疫用ペプチドは、前記生体に投与することで抗体産生を誘導できることから、例えば、「抗体産生誘導剤」ということもできる。
一般的に、前記Ｔ細胞エピトープと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体（以下、「Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子」ともいう。）、すなわちペプチドとＭＨＣクラスII分子との複合体（以下、「ペプチド／ＭＨＣクラスII分子」ともいう。）に対する抗体を取得する場合、前記ペプチド／ＭＨＣクラスII分子を作製し、免疫する必要がある。しかしながら、本発明によれば、以下の理由から、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体の誘導にあたり、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子の作製が不要である。すなわち、本発明者らは、鋭意研究の結果、免疫応答時に、前記ＭＨＣクラスII分子は、前記Ｔ細胞エピトープより長いポリペプチド、すなわち免疫用ペプチドを提示していること、および前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体が存在することを見出した。そして、前記免疫用ペプチドを生体に投与することにより、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体産生を誘導できることを確認し、本発明を確立するに至った。このため、本発明では、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体産生の誘導に先立ち、前記先行技術文献のように、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子を作製する必要がないため、例えば、簡便に抗体産生を誘導できる。また、本発明者らは、免疫応答時に、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲを有するＴ細胞が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子を認識すること、および前記免疫用ペプチドで産生される抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記ＴＣＲの結合を阻害できることを見出した。また、免疫用ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体（以下、「免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子」ともいう。）についても同様である。このため、本発明の免疫用ペプチドによれば、前記生体に前記免疫用ペプチドを投与することで、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体産生が誘導でき、これにより、例えば、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子を認識するＴ細胞により惹起される疾患の発症、増悪等をより効果的に抑制できる。
本発明において、前記ターゲットタンパク質は、特に制限されず、例えば、免疫疾患の抗原タンパク質等があげられる。前記免疫疾患は、特に制限されず、例えば、アレルギー疾患、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応等があげられる。前記アレルギー疾患は、例えば、食物アレルギー、口腔アレルギー症候群、薬剤アレルギー、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、接触皮膚炎、蕁麻疹、光線過敏症、金属アレルギー、ネコアレルギー、ダニアレルギー、喘息等があげられる。前記食物アレルギーは、例えば、卵アレルギー、ピーナッツアレルギー、小麦アレルギー、蕎麦アレルギー、大豆アレルギー、牛乳アレルギー、魚アレルギー、果物アレルギー等があげられる。前記花粉症は、例えば、スギ花粉症、ブタクサ花粉症、シラカバ花粉症等があげられる。前記自己免疫疾患は、例えば、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、バセドウ病、橋本病、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、皮膚筋炎、間質性肺炎、肺胞蛋白症、ＡＮＣＡ（antineutrophil cytoplasmic antibody）関連血管炎、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、多発性筋炎、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、抗カルジオリピン抗体、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、習慣性流産、ベーチェット病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ナルコレプシー等があげられる。前記ターゲットタンパク質が、前記アレルギー疾患の抗原タンパク質である場合、前記ターゲットタンパク質は、例えば、「アレルゲン」ということができる。また、前記ターゲットタンパク質が、前記自己免疫疾患の抗原タンパク質である場合、前記ターゲットタンパク質は、例えば、「自己抗原タンパク質」ということができる。具体的に、前記ターゲットタンパク質は、例えば、下記表１および２のターゲットタンパク質があげられる。前記ターゲットタンパク質は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
本発明において、「Ｔ細胞エピトープ」は、例えば、後述するＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスII分子と複合体を形成した際に、特異的なＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞により認識される最短のペプチドを意味する。本発明において、Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞により認識されるＴ細胞エピトープでもよいし、ＣＤ８陽性Ｔ細胞により認識されるＴ細胞エピトープでもよいし、両者により認識されるＴ細胞エピトープでもよい。前記Ｔ細胞エピトープは、例えば、前記ターゲットタンパク質の公知のＴ細胞エピトープでもよいし、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列、および前記ＭＨＣクラスＩ分子または前記ＭＨＣクラスII分子に基づき、アルゴリズム等により予測されたＴ細胞エピトープでもよい。前者は、例えば、公知のＴ細胞エピトープのライブラリであるImmune Epitope Database (http://www.iedb.org)に登録されたＴ細胞エピトープ等があげられる。また、後者は、例えば、Immune Epitope Databaseにおけるアルゴリズムにより予測されたＴ細胞エピトープ等があげられる。具体的に、前記ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープは、例えば、前記表１のＴ細胞エピトープがあげられる。前記ターゲットタンパク質が複数のＴ細胞エピトープを含む場合、前記免疫用ペプチドは、例えば、１つのＴ細胞エピトープを含んでもよいし、複数のＴ細胞エピトープを含んでもよいし、全てのＴ細胞エピトープを含んでもよい。
本発明において、前記Ｔ細胞エピトープは、前記Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、ＴＣＲが認識する１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子に対して特異的なＴＣＲにより、前記置換されたアミノ酸配列とＭＨＣ分子との複合体が認識されない置換Ｔ細胞エピトープであることが好ましい。前記置換Ｔ細胞エピトープは、例えば、ＭＨＣ分子と複合体を形成した際に、未置換のＴ細胞エピトープとＭＨＣ分子との複合体を認識するＴＣＲを有するＴ細胞により認識される可能性が相対的に低い、または認識されない。このため、前記置換Ｔ細胞エピトープによれば、例えば、生体に投与した際に、前記未置換のＴ細胞エピトープと前記ＭＨＣ分子との複合体を認識するＴＣＲを有するＴ細胞の活性化を低減し、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子に対する抗体産生を誘導できる。したがって、例えば、免疫疾患患者に対して、前記置換Ｔ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドを投与した際に、前記未置換のＴ細胞エピトープと前記ＭＨＣ分子との複合体を認識するＴＣＲを有するＴ細胞により惹起される、前記免疫疾患の発症、増悪等を抑制できる。前記免疫用ペプチドが複数のＴ細胞エピトープを含む場合、１つのＴ細胞エピトープが、前記置換Ｔ細胞エピトープでもよいし、複数のＴ細胞エピトープが、前記置換Ｔ細胞エピトープでもよいし、全てのＴ細胞エピトープが、前記置換Ｔ細胞エピトープでもよい。前記生体については、後述する。
前記ＴＣＲにより、ペプチド／ＭＨＣ分子が認識されないとは、例えば、前記ＴＣＲを発現するＴ細胞の前記ペプチド／ＭＨＣ分子に対する応答性が、前記ＴＣＲに特異的なペプチド／ＭＨＣ分子に対する応答性に比べて有意に低いことを意味する。前記応答性は、例えば、前記ペプチド／ＭＨＣ分子で前記ＴＣＲを発現するＴ細胞を刺激した際の増殖能、ＩＬ−２産生能、ＮＦＡＴレポーター遺伝子の活性化等により測定できる。前記ペプチドは、免疫用ペプチドでもよいし、Ｔ細胞エピトープでもよいし、置換Ｔ細胞エピトープでもよい。
前記Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、アミノ酸が置換される位置は、ＴＣＲが認識する位置のアミノ酸であればよく、例えば、前記Ｔ細胞エピトープに応じて適宜設定できる。前記置換アミノ酸の位置は、例えば、前記Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、前記位置のアミノ酸を置換した置換Ｔ細胞エピトープが、前記ＭＨＣ分子と複合体を形成し、且つ前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子に対して特異的なＴＣＲによる認識が、前記置換により有意に低下するアミノ酸の位置があげられる。前記置換アミノ酸の位置は、具体的には、例えば、前記ＭＨＣ分子のペプチド結合溝上に配置され、且つアンカー残基以外のアミノ酸の位置があげられる。具体例として、前記置換アミノ酸の位置は、前記表１のＴ細胞エピトープのアミノ酸配列において、下線で示したアミノ酸があげられる。前記置換後のアミノ酸は、例えば、前記置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸であり、好ましくは、前記置換前のアミノ酸の側鎖と異なる特性の側鎖を有するアミノ酸である。具体的に、前記ターゲットタンパク質が、ＨＥＬであり、前記Ｔ細胞エピトープが、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記置換アミノ酸の位置は、例えば、６番目のチロシン（Ｙ）（ＨＥＬの５３番目のチロシン）、および９番目のロイシン（Ｌ）（ＨＥＬの５６番目のロイシン）があげられる。また、前記６番目のチロシン（Ｙ）における置換後のアミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）あげられ、前記９番目のロイシン（Ｌ）における置換後のアミノ酸は、例えば、アラニン（Ａ）があげられる。前記ターゲットタンパク質が、ＰＬＰであり、前記Ｔ細胞エピトープが、前記配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記置換アミノ酸の位置は、例えば、３番目のロイシン（Ｌ）（ＰＬＰの１４１番目のロイシン）、６番目のトリプトファン（Ｗ）（ＰＬＰの１４４番目のトリプトファン）、および９番目のヒスチジン（Ｈ）（ＰＬＰの１４７番目のヒスチジン）があげられる。また、前記免疫用ペプチドのアミノ酸配列において、システイン（Ｃ）がセリン（Ｓ）に置換されてもよい。具体的に、前記ターゲットタンパク質が、ＰＬＰであり、前記Ｔ細胞エピトープが、前記配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記置換アミノ酸の位置は、例えば、２番目のシステイン（Ｃ）（ＰＬＰの１４０番目のシステイン）があげられる。
前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記上流側抗体誘導部、および前記下流側抗体誘導部の少なくとも一方である。具体的に、前記免疫用ペプチドは、例えば、前記上流側抗体誘導部を含んでもよいし、前記下流側抗体誘導部を含んでもよいし、両者を含んでもよい。前記免疫用ペプチドが、いずれの前記抗体誘導部を含むかは、例えば、前記ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープに応じて適宜設定できる。前記ターゲットタンパク質が、ＨＥＬであり、前記Ｔ細胞エピトープが、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記免疫用ペプチドは、前記下流側抗体誘導部を含むことが好ましい。前記ターゲットタンパク質が、ＰＬＰであり、前記Ｔ細胞エピトープが、前記配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記免疫用ペプチドは、前記上流側抗体誘導部を含むことが好ましい。
前記免疫用ペプチドが前記上流側抗体誘導部を含む場合、前記上流側抗体誘導部において、連続するアミノ酸の個数は、１以上であればよく、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５以上である。前記連続するアミノ酸の個数の上限は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸より上流の全てのアミノ酸の個数（以下、「Ｎ末端側アミノ酸総数」ともいう。）、Ｎ末端側アミノ酸総数−１、Ｎ末端側アミノ酸総数−２、Ｎ末端側アミノ酸総数−３、Ｎ末端側アミノ酸総数−４、Ｎ末端側アミノ酸総数−５、Ｎ末端側アミノ酸総数−１０、Ｎ末端側アミノ酸総数−１５、Ｎ末端側アミノ酸総数−２０、Ｎ末端側アミノ酸総数−２５、Ｎ末端側アミノ酸総数−３０、Ｎ末端側アミノ酸総数−３５、Ｎ末端側アミノ酸総数−４０、Ｎ末端側アミノ酸総数−４５である。具体例として、前記ターゲットタンパク質がＨＥＬであり、前記Ｔ細胞エピトープが前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記上流側抗体誘導部において、連続するアミノ酸の個数は、例えば、１〜４７個、３〜２３個、５〜１２個である。前記ターゲットタンパク質がＰＬＰであり、前記Ｔ細胞エピトープが前記配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記上流側抗体誘導部において、連続するアミノ酸の個数は、例えば、１〜１３１個、３〜６６個、５〜３３個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
前記免疫用ペプチドが前記下流側抗体誘導部を含む場合、前記下流側抗体誘導部において、連続するアミノ酸の個数は、１以上であればよく、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５以上である。前記連続するアミノ酸の個数の上限は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸より下流の全てのアミノ酸の個数（以下、「Ｃ末端側アミノ酸総数」ともいう。）であり、好ましくは、Ｃ末端側アミノ酸総数−１、Ｃ末端側アミノ酸総数−２、Ｃ末端側アミノ酸総数−３、Ｃ末端側アミノ酸総数−４、Ｃ末端側アミノ酸総数−５、Ｃ末端側アミノ酸総数−１０、Ｃ末端側アミノ酸総数−１５、Ｃ末端側アミノ酸総数−２０、Ｃ末端側アミノ酸総数−２５、Ｃ末端側アミノ酸総数−３０、Ｃ末端側アミノ酸総数−３５、Ｃ末端側アミノ酸総数−４０、Ｃ末端側アミノ酸総数−４５である。具体例として、前記ターゲットタンパク質がＨＥＬであり、前記Ｔ細胞エピトープが前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記下流側抗体誘導部において、連続するアミノ酸の個数は、例えば、１〜６８個、３〜３４個、５〜１７個である。前記ターゲットタンパク質がＰＬＰであり、前記Ｔ細胞エピトープが前記配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドである場合、前記下流側抗体誘導部において、連続するアミノ酸の個数は、例えば、１〜１３１個、３〜６６個、５〜３３個である。
本発明の前記免疫用ペプチドが、前記ターゲットタンパク質のＢ細胞エピトープを含み、前記Ｂ細胞エピトープが、下記（１）または（２）の置換Ｂ細胞エピトープであることが好ましい。
（１）前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢ細胞受容体（以下、「ＢＣＲ」ともいう。）により認識されない置換Ｂ細胞エピトープ
（２）前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して、１００％未満の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢ細胞受容体により認識されない置換Ｂ細胞エピトープ
前記置換Ｂ細胞エピトープは、例えば、未置換のＢ細胞エピトープを認識するＢＣＲを有するＢ細胞により認識される可能性が相対的に低い、または認識されない。このため、前記置換Ｂ細胞エピトープによれば、例えば、生体に投与した際に、前記未置換のＢ細胞エピトープを認識するＢＣＲを有するＢ細胞の活性化を低減し、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子に対する抗体産生を誘導できる。したがって、例えば、免疫疾患患者に対して、前記置換Ｂ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドを投与した際に、前記未置換のＢ細胞エピトープを認識するＢＣＲを有するＢ細胞により惹起される、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制できる。前記置換Ｂ細胞エピトープは、例えば、前記置換Ｔ細胞エピトープと組合せてもよい。
本発明において、「Ｂ細胞エピトープ」は、例えば、特異的なＢ細胞により認識される最短のペプチドを意味する。前記Ｂ細胞エピトープは、例えば、前記ターゲットタンパク質の公知のＢ細胞エピトープでもよいし、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列に基づき、アルゴリズム等により予測されたＢ細胞エピトープでもよい。前者は、例えば、公知のＢ細胞エピトープのライブラリであるImmune Epitope Database (http://www.iedb.org)に登録されたＢ細胞エピトープ等があげられる。また、後者は、例えば、Immune Epitope Databaseにおけるアルゴリズムにより予測されたＢ細胞エピトープ等があげられる。具体的に、前記ターゲットタンパク質のＢ細胞エピトープは、例えば、下記表２のＢ細胞エピトープがあげられる。
前記ターゲットタンパク質が複数のＢ細胞エピトープを含む場合、前記免疫用ペプチドは、例えば、１つのＢ細胞エピトープを含んでもよいし、複数のＢ細胞エピトープを含んでもよいし、全てのＢ細胞エピトープを含んでもよい。前記免疫用ペプチドが複数の前記Ｂ細胞エピトープを含む場合、１つのＢ細胞エピトープが、前記置換Ｂ細胞エピトープでもよいし、複数のＢ細胞エピトープが、前記置換Ｂ細胞エピトープでもよいし、全てのＢ細胞エピトープが、前記置換Ｂ細胞エピトープでもよい。また、前記免疫用ペプチドは、例えば、各Ｂ細胞エピトープにおいて、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列の全部を含んでもよいし、その一部を含んでもよい。
前記（１）において、「１以上」は、例えば、前記（１）が、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢＣＲが認識しない範囲であればよい。前記（１）の「１以上」は、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列において、例えば、１個、２個、１〜３個、１〜５個、１〜９個、１〜１０個、１〜２０個、１〜３０個、１〜４０個、１〜４５個、１〜５０個である。前記「１以上」の上限は、例えば、１００個、９０個、８０個である。
前記（２）において、「同一性」は、例えば、前記（２）が、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢＣＲが認識しない範囲であればよい。前記（２）の同一性は、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して、１００％未満であればよく、例えば、９９％以下、９８％以下、９７％以下、９６％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下である。前記同一性の下限は、特に制限されず、例えば、０％、５％、１０％、２０％、３０％である。前記同一性の範囲は、例えば、０％以上１００％未満、５％以上９５％以下、１０％以上９０％以下である。
前記ＢＣＲにより、前記Ｂ細胞エピトープが認識されないとは、例えば、前記ＢＣＲを発現するＢ細胞の前記Ｂ細胞エピトープに対する結合能が、例えば、前記ＢＣＲに特異的なＢ細胞エピトープに対する結合能に比べて有意に低いことを意味する。前記結合能は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、分子間相互作用解析等により測定できる。
前記免疫用ペプチドは、生体に投与することで、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子に対する抗体産生を誘導する。前記抗体は、例えば、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子に対する抗体でもよいし、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体でもよいし、両者に対する抗体でもよい。前記免疫用ペプチドは、例えば、１種類の前記免疫用ペプチドであってもよいし、２種類以上の前記免疫用ペプチドの混合物であってもよい。前記生体（以下、「投与対象」ともいう。）は、特に制限されず、例えば、ヒトおよびヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、モルモット、ネコ等があげられる。
前記免疫用ペプチドの投与量は、特に制限されず、例えば、前記投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜設定できる。具体例として、ヒトに投与する場合、１回あたりの前記免疫用ペプチドの投与量は、例えば、０．８〜３０ｍｇ、１０〜３０ｍｇである。前記免疫用ペプチドの投与回数は、特に制限されず、例えば、１〜３回である。
前記免疫用ペプチドの投与方法は、特に制限されず、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、皮内投与、経皮投与、直腸投与、腹腔内投与、局所投与、経鼻投与、舌下投与等があげられる。
前記免疫用ペプチドは、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、アジュバント、保存剤、抗酸化剤、キレート剤等があげられる。前記アジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＣｐＧオリゴヌクレオチド等を含むＴｏｌｌ様受容体刺激剤等の公知のアジュバントがあげられる。前記保存剤は、例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール等があげられる。前記キレート剤は、例えば、エチレンジアミン４酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸等があげられる。
前記ＭＨＣ分子は、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスII分子の少なくとも一方である。前記免疫用ペプチドがＣＤ８陽性Ｔ細胞により認識されるＴ細胞エピトープを含む場合、前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子であることが好ましい。また、前記免疫用ペプチドがＣＤ４陽性Ｔ細胞により認識されるＴ細胞エピトープを含む場合、前記ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスII分子であることが好ましい。
前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、α鎖およびβ鎖の複合体であり、それぞれの種類は特に制限されず、これらをコードする遺伝子のハプロタイプは、特に制限されない。
前記ＭＨＣクラスII分子がヒト由来である場合、前記ＭＨＣクラスII分子のα鎖は、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱＡ遺伝子座またはＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスII分子のα鎖があげられ、前記ＭＨＣクラスII分子のβ鎖は、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＢ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱＢ遺伝子座またはＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスII分子のβ鎖があげられる。前記各遺伝子座におけるＭＨＣクラスII分子のα鎖およびβ鎖のハプロタイプは、特に制限されない。前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、α鎖およびβ鎖のいずれか一方を含む分子であり、α鎖およびβ鎖の両方を含む分子であることが好ましい。
前記ＭＨＣクラスII分子は、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ等が好ましく、特に、前記表１に記載した前記Ｔ細胞エピトープを提示するＭＨＣクラスII分子が例示できる。
前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１２、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲ５２、ＨＬＡ−ＤＲ５３等があげられる。前記ＨＬＡ−ＤＲは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＲＡ１等のＨＬＡ−ＤＲＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４またはＨＬＡ−ＤＲＢ５等のＨＬＡ−ＤＲＢとを含む分子があげられ、具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１等のアリル、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１等のアリルがあげられる。
前記ＨＬＡ−ＤＱは、例えば、ＨＬＡ−ＤＱ１、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ３、ＨＬＡ−ＤＱ４、ＨＬＡ−ＤＱ５、ＨＬＡ−ＤＱ６、ＨＬＡ−ＤＱ７、ＨＬＡ−ＤＱ８等があげられる。前記ＨＬＡ−ＤＱは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＱＡ１等のＨＬＡ−ＤＱＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＱＢ１等のＨＬＡ−ＤＱＢとを含む分子があげられ、具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０６、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６等のアリルがあげられる。
前記ＨＬＡ−ＤＰは、例えば、ＨＬＡ−ＤＰ１、ＨＬＡ−ＤＰ２、ＨＬＡ−ＤＰ３、ＨＬＡ−ＤＰ４、ＨＬＡ−ＤＰ５等があげられる。前記ＨＬＡ−ＤＰは、例えば、α鎖としてＨＬＡ−ＤＰＡ１等のＨＬＡ−ＤＰＡと、β鎖としてＨＬＡ−ＤＰＢ１等のＨＬＡ−ＤＰＢとを含む分子があげられ、具体的には、α鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０４等、β鎖として、例えば、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９等のアリルがあげられる。
前記ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、α鎖およびβミクログロブリンの複合体であり、α鎖の種類は、特に制限されず、コードする遺伝子のハプロタイプは、特に制限されない。
前記ＭＨＣクラスＩ分子がヒト由来である場合、前記ＭＨＣクラスＩ分子のα鎖は、例えば、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座またはＨＬＡ−Ｃ遺伝子座にコードされているＭＨＣクラスＩ分子のα鎖があげられる。前記各遺伝子座におけるＭＨＣクラスＩ分子のα鎖のハプロタイプは、特に制限されない。前記ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、α鎖およびβミクログロブリンのいずれか一方を含む分子であり、α鎖およびβミクログロブリンの両方を含む分子であることが好ましい。
前記ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ等が好ましい。
前記ＨＬＡ−Ａは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２:０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１８、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０４、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０８、ＨＬＡ−Ａ＊２４：２０、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０３、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０４、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０５、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０６等のアリルがあげられる。
前記ＨＬＡ−Ｂは、例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：１１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：１８、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：２７、ＨＬＡ−Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３９：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３９：０４、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０６等のアリルがあげられる。
前記ＨＬＡ−Ｃは、例えば、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１：０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０２：０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３：０２、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３：０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３：０７、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０４：０１、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０５：０１、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０８：０１等のアリルがあげられる。
前記産生された抗体は、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子に結合できればよく、その他のタンパク質等に結合してもよい。前記産生された抗体は、例えば、投与した前記免疫用ペプチドが短縮化した短縮化ペプチドと前記ＭＨＣ分子との複合体に結合してもよい。前記短縮化免疫用ペプチドは、例えば、前記Ｔ細胞エピトープより長く、且つ前記投与した免疫用ペプチドにおける前記抗体誘導部の露出末端のアミノ酸から１以上の連続するアミノ酸が欠失したペプチドがあげられる。
前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子における、前記免疫用ペプチドと前記ＭＨＣ分子との組合せは、特に制限されず、例えば、投与した前記免疫用ペプチドと、投与した前記生体で発現しているＭＨＣ分子との組合せがあげられる。具体的には、前記組合せは、例えば、前記表１における前記Ｔ細胞エピトープを含む前記免疫用ペプチドと前記ＭＨＣ分子との組合せ等があげられる。前記組合せは、例えば、前記表１における１種類の組合せでもよいし、２種類以上の組合せでもよい。
前記産生された抗体が、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することが好ましく、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子を認識するＴＣＲの前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子への結合を阻害することがより好ましい。前記阻害は、例えば、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスＩ分子を認識するＴＣＲの結合の阻害でもよいし、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合の阻害でもよい。前者の場合、前記産生された抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子への結合を阻害することが好ましい。後者の場合、前記産生された抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子への結合を阻害することが好ましい。また、前記阻害は、前者および後者の両者の阻害でもよい。前述のように、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子を認識するＴＣＲは、例えば、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子も認識する。このため、前記産生された抗体は、例えば、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子を認識するＴＣＲの結合を阻害するということもできる。また、前記産生された抗体が、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することで、例えば、前記投与対象において、前記ＴＣＲを有するＴ細胞の活性化をより低減できる。このため、例えば、前記生体に前記免疫用ペプチドを投与することで、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ分子を認識するＴ細胞により惹起される、前記免疫疾患の発症、増悪等をより効果的に抑制できる。
前記免疫用ペプチドの製造方法は、特に制限されず、例えば、化学的合成、前記ターゲットタンパク質の分解、組換えＤＮＡ技術を使用した合成等があげられる。前記化学的合成方法の場合、前記免疫用ペプチドは、例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、tert-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）等の保護基を用いた公知の有機合成方法により製造できる。前記ターゲットタンパク質の分解による場合、前記免疫用ペプチドは、例えば、前記ターゲットタンパク質を、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等の公知のタンパク質分解酵素で分解することにより製造できる。前記ターゲットタンパク質の分解条件は、例えば、前記ターゲットタンパク質の種類、前記タンパク質分解酵素の基質特異性等に応じて適宜設定できる。前記組換えＤＮＡ技術を使用する場合、前記免疫用ペプチドは、例えば、前記免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製する。そして、前記免疫用ペプチドの発現系を作製し、発現した前記免疫用ペプチドを作製することにより製造できる。前記発現系は、例えば、前記発現ベクターを宿主に導入することで作製できる。前記宿主は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌等の公知の宿主があげられる。また、前記組換えＤＮＡ技術を使用する場合、前記免疫用ペプチドは、例えば、前記免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、公知の無細胞翻訳系とを使用し、作製してもよい。そして、前記無細胞翻訳系により、前記ポリヌクレオチドから翻訳された前記免疫用ペプチドを単離することにより製造できる。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明の免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明の免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の免疫用ペプチドの遺伝子工学的手法による合成に有用である。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の免疫用ペプチドの説明を援用できる。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記免疫用ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記免疫用ペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、生体に投与することで、投与されたポリペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよいし、前記免疫用ペプチドのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、生体に投与することで、投与されたポリペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよい。前記アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記免疫用ペプチドのアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜９個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。前記アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記免疫用ペプチドのアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
本発明において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
＜免疫用ペプチドの発現ベクター＞
本発明の免疫用ペプチドの発現ベクター（以下、「発現ベクター」ともいう。）は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の免疫用ペプチド、ポリヌクレオチド等の説明を援用できる。
本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドがコードする免疫用ペプチドを発現可能なように、前記本発明のポリヌクレオチドを含んでいればよく、その構成は何ら制限されない。
本発明の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記本発明のポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター、ｐＱＥ−８０ＬベクターおよびｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、例えば、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる。
前記本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの発現および前記本発明のポリヌクレオチドがコードする前記本発明の免疫用ペプチドの発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記本発明の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記本発明の免疫用ペプチドの発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
前記本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカー、タンパク質タグ等のコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。前記タグは、例えば、ヒスチジンタグ等の公知のタンパク質タグがあげられる。
＜免疫用ペプチドの製造方法＞
本発明の免疫用ペプチドの製造方法は、前述のように、前記本発明の免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させる発現工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、前記本発明の免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させる工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法は、前記本発明の免疫用ペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター等の説明を援用できる。
前記本発明のポリヌクレオチドの発現は、例えば、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。
前記本発明のポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
前者の場合、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記本発明のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記本発明のポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明の免疫用ペプチドを合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、前記免疫用ペプチドを合成できる。
前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。前記微生物は、例えば、原核生物、真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
前記本発明のポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより導入されてもよい。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等を介する方法が好ましい。
後者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記本発明のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記本発明のポリヌクレオチドの発現には、前記本発明の発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的の免疫用ペプチドのポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
本発明の製造方法は、例えば、前記発現工程に代えて、前記本発明の免疫用ペプチドのアミノ酸配列を合成する工程、またはターゲットタンパク質を分解することにより、前記本発明の免疫用ペプチドを生成する工程を含んでもよい。前記合成工程および前記生成工程は、例えば、前記本発明の免疫用ペプチドの説明を援用できる。
本発明の製造方法は、例えば、前記免疫用ペプチドを精製する工程を含んでもよい。前記免疫用ペプチドの精製方法は、特に制限されず、例えば、ゲル濾過、ＨＰＬＣ等の公知の精製方法があげられる。
＜免疫疾患用医薬組成物＞
本発明の免疫疾患用医薬組成物は、前述のように、前記本発明の免疫用ペプチドを含むことを特徴とする。本発明の医薬組成物は、前記本発明の免疫用ペプチドを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の医薬組成物によれば、例えば、前記免疫疾患を治療できる。本発明の医薬組成物は、生体に投与することで、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子に対する抗体産生を誘導できる。このため、本発明の医薬組成物は、例えば、「ワクチン」ということもできる。本発明の医薬組成物は、例えば、前記本発明の免疫用ペプチドの説明を援用できる。
本発明の医薬組成物は、前記免疫用ペプチドに代えて、または加えて、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記発現ベクターの少なくとも一方を含んでもよい。この場合、前記本発明の医薬組成物は、例えば、「核酸ワクチン」ということもできる。
本発明の医薬組成物は、例えば、前記免疫用ペプチドの前記ターゲットタンパク質が関与している免疫疾患に使用することが好ましい。前記ターゲットタンパク質と前記免疫疾患との組合せは、例えば、前記表１および２の組合せがあげられる。具体例として、前記ターゲットタンパク質がＨＥＬである場合、前記免疫疾患は、卵アレルギーがあげられる。
＜免疫用ペプチドの設計方法＞
本発明の免疫用ペプチドの設計方法は、ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと抗体誘導部とを含み、前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する１以上のアミノ酸配列、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する１以上のアミノ酸配列の少なくとも一方であるペプチドを免疫用ペプチドとする設計工程を含むことを特徴とする。本発明の免疫用ペプチドの設計方法によれば、例えば、前記本発明の免疫用ペプチドを設計できる。
本発明の設計方法は、ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと抗体誘導部とを含み、前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する１以上のアミノ酸配列、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する１以上のアミノ酸配列の少なくとも一方であるペプチドを免疫用ペプチドとすることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の設計方法は、例えば、前記本発明の免疫用ペプチドの説明を援用できる。
＜免疫疾患の治療方法＞
本発明の免疫疾患の治療方法は、前述のように、免疫疾患を治療する方法であって、生体に前記本発明の免疫用ペプチドおよび前記本発明の免疫疾患用医薬組成物の少なくとも一方を投与する投与工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、前記生体に、前記本発明の免疫用ペプチドおよび前記本発明の免疫疾患用医薬組成物の少なくとも一方を投与することを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の治療方法によれば、例えば、前記免疫疾患を治療できる。本発明の免疫疾患の治療方法は、例えば、前記本発明の免疫用ペプチド等の説明を援用できる。
本発明の治療方法は、前記免疫用ペプチドおよび前記医薬組成物に代えて、または加えて、前記本発明のポリヌクレオチドおよび前記発現ベクターの少なくとも一方を投与してもよい。
＜抗体の誘導方法＞
本発明の抗体の誘導方法は、生体に前記本発明の免疫用ペプチドおよび前記本発明の免疫疾患用医薬組成物の少なくとも一方を投与することにより、免疫用ペプチドと生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導する抗体誘導工程を含むことを特徴とする。本発明の抗体の誘導方法は、前記生体に、前記本発明の免疫用ペプチドおよび前記本発明の免疫疾患用医薬組成物の少なくとも一方を投与することを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の抗体の誘導方法によれば、例えば、前記生体内で免疫用ペプチド／ＭＨＣ分子に対する抗体を簡便に誘導できる。本発明の抗体の誘導方法は、例えば、前記本発明の免疫用ペプチド、治療方法等の説明を援用できる。
＜免疫用ペプチドおよび免疫疾患用医薬組成物の使用＞
本発明は、免疫疾患を治療するための免疫用ペプチドの使用である。また、本発明は、免疫疾患用医薬の製造のための免疫用ペプチドの使用である。本発明は、免疫疾患を治療するための免疫疾患用医薬組成物の使用である。また、本発明は、免疫疾患用医薬の製造のための免疫疾患用医薬組成物の使用である。本発明の免疫用ペプチドおよび免疫疾患用医薬組成物の使用は、例えば、前記本発明の免疫用ペプチド等の説明を援用できる。
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
ＨＥＬタンパク質を免疫し、前記ＨＥＬタンパク質におけるＴ細胞エピトープより長いペプチドと生体のＭＨＣクラスII分子との複合体に対する抗体産生が誘導されること、および前記抗体が、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することを確認した。
（実施例１Ａ）
ＨＥＬタンパク質を免疫し、前記ＨＥＬタンパク質におけるＴ細胞エピトープより長いペプチドと生体のＭＨＣクラスII分子との複合体に対する抗体産生が誘導されることを確認した。
（１）ＨＥＬペプチド提示細胞の調製
マウス脾臓ｃＤＮＡから、下記のマウスＭＨＣクラスII分子（I-Ak）のα鎖およびβ鎖をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングし、マウスＭＨＣクラスII分子（I-Ak）α鎖発現ベクター（Ｉ−Ａｋα発現ベクター）およびマウスＭＨＣクラスII分子（I-Ak）β鎖発現ベクター（Ｉ−Ａｋβ発現ベクター）を作製した。また、ＧＦＰ発現ベクターは、ｐＭＸ−ＧＦＰ（東京大学医科学研究所先端医療研究センター細胞療法分野から入手）を使用した。
マウスＭＨＣクラスII分子（I-Ak）α鎖（配列番号１１）
ATGCCGCGCAGCAGAGCTCTGATTCTGGGGGTCCTCGCCCTGACCACCATGCTCAGCCTCTGCGGAGGTGAAGACGACATTGAGGCCGACCACGTAGGCTCCTATGGTATAACTGTATATCAGTCTCCTGGAGACATTGGCCAGTACACATTTGAATTTGATGGTGATGAGTTGTTCTATGTGGACTTGGATAAGAAGGAGACTGTCTGGATGCTTCCTGAGTTTGCTCAACTGAGAAGATTTGAGCCCCAAGGTGGACTGCAAAACATAGCTACAGGAAAACACAACTTGGAAATCTTGACTAAGAGGTCAAATTCCACCCCAGCTACCAATGAGGCTCCTCAAGCGACTGTGTTCCCCAAGTCTCCTGTGCTGCTGGGTCAGCCCAACACCCTTATCTGCTTTGTGGACAACATCTTCCCTCCTGTGATCAACATCACATGGCTCAGAAATAGCAAGTCAGTCACAGACGGCGTTTATGAAACCAGCTTCTTCGTCAACCGTGACTATTCCTTCCACAAGCTGTCTTATCTCACCTTCATCCCTTCTGACGATGACATTTATGACTGCAAGGTGGAGCACTGGGGCCTGGAGGAGCCGGTTCTGAAACACTGGGAACCTGAGATTCCAGCCCCCATGTCAGAGCTGACAGAGACTGTGGTGTGTGCCCTGGGGTTGTCTGTGGGCCTTGTGGGCATCGTGGTGGGCACCATCTTCATCATTCAAGGCCTGCGATCAGGTGGCACCTCCAGACACCCAGGGCCTTTATGA
マウスＭＨＣクラスII分子（I-Ak）β鎖（配列番号１２）
ATGGCTCTGCAGATCCCCAGCCTCCTCCTCTTGGCTGCTGTTGTGGTGCTGACGGTGCTGAGCAGCCCAGGGACTGAGGGCGGAAACTCCGAAAGGCATTTCGTGCACCAGTTCCAGCCCTTCTGCTACTTCACCAACGGGACGCAGCGCATACGGCTTGTGATCAGATACATCTACAACCGGGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGCGAGTACCGCGCGGTGACCGAGCTGGGGCGGCCAGACGCCGAGTACTGGAATAAGCAGTACCTGGAGCGAACGCGGGCCGAGCTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACGAGAAGACGGAGACCCCCACCTCCCTGCGGCGGCTTGAACAGCCCAGTGTCGTCATCTCCCTGTCCAGGACAGAGGCCCTCAACCACCACAACACGCTGGTCTGCTCAGTGACAGATTTCTACCCAGCCAAGATCAAAGTGCGCTGGTTCCGGAATGGCCAGGAGGAGACGGTGGGGGTCTCGTCCACACAGCTTATTAGGAATGGGGACTGGACCTTCCAGGTCCTGGTCATGCTGGAGATGACCCCTCGGCGGGGAGAGGTCTACACCTGCCATGTGGAGCATCCCAGCCTGAAGAGTCCCATCACCGTGGAGTGGCGGGCACAGTCCGAGTCTGCCCGGAGCAAGATGTTGAGCGGCATCGGTGGCTGCGTGCTTGGGGTGATCTTCCTCGGGCTTGGCCTTTTCATCCGTCACAGGAGTCAGAAAGGACCTCGAGGCCCTCCTCCAGCAGGGCTCCTGCAGTGA
ＧＦＰ（配列番号１３）
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
前記発現ベクターを導入する宿主細胞として、２９３Ｔ細胞（理化学研究所 バイオリソースセンターから入手）を使用した。まず、２４ウェルプレートに、前記２９３Ｔ細胞を、２×１０５細胞／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種した。つぎに、前記２９３Ｔ細胞への前記発現ベクターの導入は、トランスフェクション試薬（PEI max、コスモバイオ社）を２ｍｇ／ｍｌとなるように精製水で溶かしたPEI max溶液を使用した。具体的には、２μＬ PEI max溶液と５０μＬ 無血清培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）、ＧＩＢＣＯ社製）との混合液を、０．２６μｇ Ｉ−Ａｋα発現ベクター、０．２６μｇ Ｉ−Ａｋβ発現ベクターおよび０．２６μg ＧＦＰ発現ベクターを含む５０μＬ 無血清培地に添加後、混和し、トランスフェクション試薬を調製した。そして、前記トランスフェクション試薬を各ウェルに添加し、前記発現ベクターを前記２９３Ｔ細胞に導入した。前記導入後、前記２９３Ｔ細胞は、ＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃、１２時間の培養条件下で培養した。つぎに、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、下記表３のＨＥＬペプチドを、それぞれ、前記ウェルに添加した。さらに、前記培養条件下で２４時間培養し、前記ＨＥＬペプチドを前記２９３Ｔ細胞にパルスした。培養後の前記２９３Ｔ細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体の検出に使用した。なお、本実施例および後述する実施例のＨＥＬペプチドは、スクラム社、ユーロフィンジェノミクス株式会社、またはGenScript社から取得した。また、前記ＨＥＬタンパク質において、前記ＭＨＣクラスII分子であるＩ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープは、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（DGSTDYGILQINSR）である。このため、下記表３のＨＥＬペプチドにおいて、前記免疫用ペプチドは、ＨＥＬペプチド４１−７０である。
（２）抗体の取得
１００μｇのＨＥＬタンパク質（Sigma社製）と完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Sigma社製）とを混合し、マウス（Ｂ１０．Ａ系統）の皮下に投与した。前記投与後２週間において、前記マウスから全血を採取し、さらに、血清を回収した。
（３）抗体の検出
前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清を、HANKS’ BALANCED SALT SOLUTION（ＨＢＳＳ、Sigma社製）により１００倍に希釈し、希釈血清を得た。つぎに、前記（１）で得られた２９３Ｔ細胞に、１０μＬ 希釈血清を添加し、反応させた。さらに、反応後の２９３Ｔ細胞を洗浄後、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（code-number：715-136-150、Jackson ImmunoResearch社製）で染色した。そして、染色後の２９３Ｔ細胞について、フローサイトメトリー（FACSCalibur（商標）、Becton Dickinson社）により解析を行った（ペプチド未添加群）。また、ペプチド添加群は、前記希釈血清に、４０μｍｏｌ／Ｌとなるように、前記表３のＨＥＬペプチドをそれぞれ添加した。そして、前記ＨＥＬペプチドを添加した希釈血清を、添加した前記ＨＥＬペプチドと対応するＨＥＬペプチドをパルスした２９３Ｔ細胞に添加し、反応させた。前記ペプチド添加群は、これらの点以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。
この結果を図１に示す。図１は、ＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。図１において、横軸は、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図１において、各ヒストグラムの上は、前記ＨＥＬペプチドの種類を示す。図１に示すように、前記ペプチド未添加群において、Ｉ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープより長い前記ＨＥＬペプチド４１−７０をパルスした２９３Ｔ細胞に対して、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合が確認された。これに対して、Ｉ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープのみの前記ＨＥＬペプチド４８−６１および前記Ｔ細胞エピトープを含まない前記ＨＥＬペプチド１−３０をパルスした２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合は確認されなかった。また、前記ペプチド添加群においても、同様に、Ｉ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープより長い前記ＨＥＬペプチド４１−７０をパルスした２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合が確認された。そして、Ｉ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープのみの前記ＨＥＬペプチド４８−６１および前記Ｔ細胞エピトープを含まない前記ＨＥＬペプチド１−３０をパルスした２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合は確認されなかった。これらの結果から、前記ＨＥＬタンパク質を免疫することで、前記Ｔ細胞エピトープより長いペプチド、すなわち前記免疫用ペプチド／前記ＭＨＣクラスII分子に対する抗体が誘導できることがわかった。
（４）抗体の結合箇所
前記表３のＨＥＬペプチドに代えて、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、前記ＨＥＬペプチド４８−６１、および下記表４のＨＥＬペプチドを用いた以外は、前記（３）と同様にして、ペプチド未添加群について、フローサイトメトリーにより解析を行った。コントロールは、前記２９３Ｔ細胞に、Ｉ−Ａｋα発現ベクターおよびＩ−Ａｋβ発現ベクターを導入しなかった以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。なお、前記免疫用ペプチドは、ＨＥＬペプチド３２−６１、ＨＥＬペプチド４１−７０、およびＨＥＬペプチド４８−７７である。また、前記ＨＥＬペプチド３２−６１は、前記Ｔ細胞エピトープと前記上流側抗体誘導部とを含むペプチドであり、前記ＨＥＬペプチド４１−７０は、前記Ｔ細胞エピトープと前記上流側抗体誘導部と前記下流側抗体誘導部とを含むペプチドであり、前記ＨＥＬペプチド４８−７７は、前記Ｔ細胞エピトープと前記下流側抗体誘導部とを含むペプチドである。
この結果を図２に示す。図２は、ＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。図２において、横軸は、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図２において、各ヒストグラムの上は、前記ＨＥＬペプチドの種類を示し、実線のヒストグラムは、前記ペプチド未添加群を示し、網掛けのヒストグラムは、コントロールを示す。図２に示すように、ＭＨＣクラスII分子を発現していない２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合は確認されなかった。また、図２に示すように、前記ペプチド未添加群において、Ｉ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープより長い前記ＨＥＬペプチド３２−６１、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、および前記ＨＥＬペプチド４８−７７をパルスした２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合が確認された。これに対して、Ｉ−Ａｋに提示されるＴ細胞エピトープのみの前記ＨＥＬペプチド４８−６１をパルスした２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合は確認されなかった。さらに、下流側抗体誘導部を含む前記ＨＥＬペプチド４８−７７は、上流側抗体誘導部を含む前記ＨＥＬペプチド３２−６１に対して、平均蛍光強度が高かった。これらの結果から、前記ＨＥＬタンパク質を免疫することで、前記Ｔ細胞エピトープおよび前記上流側抗体誘導部を含むペプチドと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体、前記Ｔ細胞エピトープおよび前記下流側抗体誘導部を含むペプチドと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体、ならびに前記Ｔ細胞エピトープ、前記上流側抗体誘導部および前記下流側抗体誘導部を含むペプチドと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体のいずれに対する抗体も誘導できることがわかった。また、前記ＨＥＬタンパク質の場合、前記Ｔ細胞エピトープと前記下流側抗体誘導部とを含む免疫用ペプチドが、前記Ｔ細胞エピトープと前記上流側抗体誘導部とを含む免疫用ペプチドと比較して、高い抗体産生を誘導できることが示唆された。
（実施例１Ｂ）
前記実施例１Ａで産生された抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することを確認した。
（１）可溶型単鎖ＴＣＲの調製
前記Ｔ細胞エピトープである前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドと前記ＭＨＣクラスII分子であるＩ−Ａｋとの複合体を認識するＴＣＲを発現する３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマ（独立行政法人医薬基盤研究所ワクチンマテリアルプロジェクトから入手）から、前記ＴＣＲをクローニングした。具体的には、前記３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡから、下記の３Ａ９ ＴＣＲα鎖およびβ鎖をＧＧＧＧＳリンカーで連結したポリヌクレオチドを、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングし、３Ａ９ ＴＣＲ発現ベクターを作製した。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＣ末端にヒトＩｇＧのＦｃドメインを付加するように設計されている。このため、前記発現ベクターを宿主に導入することで、３Ａ９ ＴＣＲとＦｃとが結合した可溶型単鎖ＴＣＲ（３Ａ９ ｓｃＴＣＲ−Ｆｃ）が発現する。
単鎖３Ａ９ ＴＣＲα、β鎖（配列番号１９）
ATGCTCCTGGCACTCCTCCCAGTGCTGGGGATACACTTTGTCCTGAGAGATGCCCAAGCTCAGTCAGTGACACAGCCCGATGCTCGCGTCACTGTCTCTGAAGGAGCCTCTCTGCAGCTGAGATGCAAGTATTCCTACTCTGGGACGCCTTATCTGTTCTGGTATGTCCAGTACCCGCGGCAGGGGCTGCAGCTGCTCCTCAAGTACTATTCCGGAGACCCAGTGGTTCAAGGAGTGAATGGCTTTGAGGCTGAGTTCAGCAAGAGTAACTCTTCCTTCCACCTGCGGAAAGCCTCCGTGCACTGGAGCGACTCGGCTGTGTACTTCTGTGCTTTAAATTCTGGAGGAAGCAATGCAAAGCTAGCCTTCGGGAAAGGCTCTAAACTCTCTGTTAAATCAAACGGCGGAGGCGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGCGGAGGAGGATCAGCAGTCACCCAAAGCCCAAGAAACAAGGTGGCAGTAACAGGAGGAAAGGTGACATTGAGCTGTAATCAGACTAATAACCACAACAACATGTACTGGTATCGGCAGGACACGGGGCATGGGCTGAGGCTGATCCATTATTCATATGGTGCTGGCAGCACTGAGAAAGGAGATATCCCTGATGGATACAAGGCCTCCAGACCAAGCCAAGAGAACTTCTCCCTCATTCTGGAGTTGGCTACCCCCTCTCAGACATCAGTGTACTTCTGTGCCAGCGGTGATGAATCGGCCCTACCGGAGCTCTACTTTGGTGAAGGCTCAAAGCTGACAGTGCTGGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGAC
つぎに、Ｉ−Ａｋα発現ベクターおよびＩ−Ａｋβ発現ベクターに代えて、前記３Ａ９ ＴＣＲ発現ベクターを導入した以外は、前記実施例１Ａ（１）と同様の培養条件下で、前記２９３Ｔ細胞を９６時間培養した。そして、前記培養後の上清を回収し、可溶型単鎖ＴＣＲとして使用した。
（２）ＨＥＬペプチド提示細胞の調製
２４ウェルプレートに、前記ＭＨＣクラスII分子であるＩ−Ａｋを発現するＬＫ３５．２細胞を、１×１０５細胞／１ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように播種した。つぎに、２００μｇ／ｍＬとなるように、前記ＨＥＬタンパク質を、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、および前記ＨＥＬペプチド４８−６１を、それぞれ、前記ウェルに添加した。さらに、前記培養条件下で、前記ＨＥＬタンパク質添加群は４８時間培養し、前記ＨＥＬペプチド添加群は２４時間培養し、前記ＨＥＬタンパク質または前記ＨＥＬペプチドを前記ＬＫ３５．２細胞にパルスした。培養後の前記ＬＫ３５．２細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体によるＴＣＲ認識の阻害に使用した。
（３）抗体によるＴＣＲ認識の阻害
前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清を、ＨＢＳＳにより１０倍に希釈し、希釈血清を得た。つぎに、前記（２）で得られたＬＫ３５．２細胞に、１０μＬ 希釈血清を添加し、反応させた。さらに、前記（１）で得られた２０μＬ 上清と、１０μＬの１００倍希釈したＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（code number：109-136-098、Jackson ImmunoResearch社製）との２量体を予め形成させ、前記反応後のＬＫ３５．２細胞を前記２量体と反応させた。そして、フローサイトメトリーにより解析を行った。コントロール１は、前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清に代えて、非免疫マウスから採取した血清を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記ＨＥＬタンパク質および前記ＨＥＬペプチドを未添加とした以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。
この結果を図３に示す。図３は、可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示すヒストグラムである。図３において、横軸は、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図３において、各ヒストグラムの上は、前記ＨＥＬタンパク質および前記ＨＥＬペプチド未添加（No antigen）、前記ＨＥＬタンパク質または前記ＨＥＬペプチドの種類を示し、黒の実線は、コントロール１を示し、グレーの実線は、各免疫マウスの血清を添加した場合を示す。図３に示すように、コントロール２では、可溶型単鎖ＴＣＲの結合は観察されなかった。また、前記ＨＥＬタンパク質または前記ＨＥＬペプチドをパルスしたＬＫ３５．２細胞を、前記非免疫マウスの血清と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合が確認できた。さらに、前記ＨＥＬペプチド４８−６１をパルスしたＬＫ３５．２細胞を、前記ＨＥＬ免疫マウスの血清と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合が確認できた。これに対し、前記ＨＥＬタンパク質または前記ＨＥＬペプチド４１−７０をパルスしたＬＫ３５．２細胞を、前記ＨＥＬ免疫マウスの血清と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合は確認できなかった。これらの結果から、前記ＨＥＬタンパク質を免疫することで、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害する抗体が誘導できることがわかった。
（４）血清中の抗体の精製
前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清から、ＩｇＧ抗体を精製した。具体的には、１００μＬ 血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈したサンプルを、Profinia（Bio Rad社製）を用い、アフィニティークロマトグラフにより精製した。前記アフィニティークロマトグラフでは、プロテインＡを含むカラム（Bil-Scale mini UNO Sphere SUPrA Cartridege、Bio Rad社製）を使用した。そして、前記サンプルを前記カラムに供し、前記血清中のＩｇＧ抗体と前記カラム中のプロテインＡとを反応させた。反応後の前記カラムを、ＰＢＳで、１回洗浄した。そして、０．１ｍｏｌ／Ｌ Glycine-HCl（ｐＨ２．８）を添加し、前記カラムからＩｇＧ抗体を回収した。
（５）精製ＩｇＧ抗体によるＴＣＲ認識の阻害
前記マウスから、常法により、脾臓細胞を調製した。そして、９６ウェルプレートに、１×１０５脾臓細胞、１×１０５ ３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマ、１０μｍｏｌ／Ｌ ＨＥＬペプチド４１−７０、および所定濃度（２．６、７．８または２３．４μｇ／ｍＬ）ＩｇＧ抗体／２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように、前記細胞、前記Ｔ細胞ハイブリドーマ、前記ＨＥＬペプチド、および前記ＩｇＧ抗体を播種した。前記播種後、前記各ウェルは、ＲＰＭＩ培地を使用し、３７℃、２４時間の培養条件下で培養した。そして、前記培養後の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により、前記上清中のＩＬ−２の濃度を測定した。コントロールは、前記ＩｇＧ抗体を未添加とした以外は同様にして、上清中のＩＬ−２の濃度を測定した。前記ＥＬＩＳＡ法において、ＩＬ−２の捕捉抗体は、affinity purified anti-mouse IL-2 (クローン名：JES6.1A12、eBioscience社製)を、ＩＬ−２の検出抗体は、biotin-anti-mouse IL-2 (クローン名：JES6.5H4、eBioscience社製)を使用し、前記検出抗体の結合は、アビジン−ＨＲＰ（SIGMA社製）を用いて検出した。
この結果を図４に示す。図４は、ＩＬ−２の産生量を示すグラフである。図４において、横軸は、前記ＩｇＧ抗体の濃度を示し、縦軸は、ＩＬ−２の濃度を示す。図４に示すように、前記ＩｇＧ抗体の濃度依存的に、ＩＬ−２の濃度が低下した。また、前記ＩＬ−２の濃度は、前記３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化の程度、すなわち前記３Ａ９Ｔ細胞ハイブリドーマの３Ａ９ ＴＣＲが、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子と結合できる程度と相関する。このため、これらの結果から、前記ＨＥＬタンパク質を免疫することで、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害するＩｇＧ抗体が誘導できることがわかった。
［実施例２］
免疫用ペプチドを免疫し、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体産生が誘導されること、および前記抗体が、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することを確認した。
（実施例２Ａ）
免疫用ペプチドを免疫し、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体産生が誘導されることを確認した。
（１）抗体の取得
３０ｎｍｏｌの前記ＨＥＬペプチド４１−７０または前記ＨＥＬペプチド４８−６１と完全フロイントアジュバントとを混合し、それぞれ、前記マウス（Ｂ１０．Ａ系統）の皮下に投与した。前記投与後２週間において、前記マウスから全血を採取し、さらに、血清を回収した。
（２）ＨＥＬペプチド提示細胞の調製
前記ＨＥＬタンパク質、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、および前記ＨＥＬペプチド４８−６１に代えて、前記ＨＥＬペプチド４１−７０または前記ＨＥＬペプチド４８−６１を添加した以外は、前記実施例１Ｂ（２）と同様にして、前記ＨＥＬペプチドを前記ＬＫ３５．２細胞にパルスした。培養後の前記ＬＫ３５．２細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体の検出に使用した。
（３）抗体の検出
前記２９３Ｔ細胞に代えて、前記実施例２Ａ（２）のＬＫ３５．２細胞を、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体に代えて、Ａｌｅｘａ（登録商標）６４７標識抗マウスＩｇＧ１抗体（catalog number：A21240、Invitrogen社製）を用いた以外は、前記実施例１Ａ（３）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った（ペプチド添加群）。コントロール１は、前記ＨＥＬペプチド免疫マウスの血清に代えて、非免疫マウスから採取した血清を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記ＨＥＬペプチドを未添加とした以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った（ペプチド未添加群）。
この結果を図５に示す。図５は、ＩｇＧ１抗体の結合量を示すヒストグラムである。図５において、横軸は、前記血清中のＩｇＧ１抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図５において、各ヒストグラムの上は、前記血清の種類を示し、ヒストグラムの左は、前記ＬＫ３５．２細胞にパルスした前記ＨＥＬペプチドの種類を示す。また、図５において、実線のヒストグラムは、前記ペプチド添加群を示し、網掛けのヒストグラムは、コントロール２（ペプチド未添加群）を示す。図５に示すように、コントロール１（Naive serum）および前記ＨＥＬペプチド４８−６１免疫マウスの血清では、前記ＨＥＬペプチド４１−７０または前記ＨＥＬペプチド４８−６１をパルスしたＬＫ３５．２細胞に対して、前記ＩｇＧ１抗体の結合は観察されなかった。これに対して、前記ＨＥＬペプチド４１−７０免疫マウスの血清では、前記ＨＥＬペプチド４８−６１をパルスしたＬＫ３５．２細胞に対しては、前記ＩｇＧ１抗体の結合は確認されなかったが、前記ＨＥＬペプチド４１−７０をパルスしたＬＫ３５．２細胞に対しては、前記ＩｇＧ１抗体の結合が確認された。これらの結果から、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、すなわち前記免疫用ペプチドを免疫することで、前記免疫用ペプチドと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体に対する抗体が誘導できることがわかった。
（実施例２Ｂ）
前記実施例２Ａで産生された抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することを確認した。
（１）ＨＥＬペプチド提示細胞の調製
前記ＨＥＬタンパク質、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、および前記ＨＥＬペプチド４８−６１に代えて、前記ＨＥＬタンパク質を添加した以外は、前記実施例１Ｂ（２）と同様にして、前記ＨＥＬタンパク質を前記ＬＫ３５．２細胞にパルスした。培養後の前記ＬＫ３５．２細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体によるＴＣＲ認識の阻害に使用した。
（２）抗体によるＴＣＲ認識の阻害
前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清に加え、前記ＨＥＬペプチド４１−７０免疫マウスの血清または前記ＨＥＬペプチド４８−６１免疫マウスの血清を用い、前記実施例１Ｂ（２）で得られたＬＫ３５．２細胞に代えて、前記実施例２Ｂ（１）で得られたＬＫ３５．２細胞を用いた以外は、前記実施例１Ｂ（３）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。コントロール１は、前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清、前記ＨＥＬペプチド４１−７０免疫マウスの血清および前記ＨＥＬペプチド４８−６１免疫マウスの血清に代えて、非免疫マウスから採取した血清を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記ＨＥＬタンパク質を未添加とした以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。
この結果を図６に示す。図６は、可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示すヒストグラムである。図６において、横軸は、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図６において、各ヒストグラムの上は、前記血清の種類を示し、実線のヒストグラムは、前記ＨＥＬタンパク質をパルスしたＬＫ３５．２細胞を使用した場合を示し、網掛けのヒストグラムは、コントロール２を示す。図６に示すように、コントロール２では、いずれの血清においても、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合が確認できなかった。また、コントロール１（Normal Serum）および前記ＨＥＬペプチド４８−６１免疫マウスの血清と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合が確認できた。これに対し、前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清および前記ＨＥＬペプチド４１−７０免疫マウスの血清と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合は確認できなかった。これらの結果から、前記ＨＥＬタンパク質および前記ＨＥＬペプチド４１−７０、すなわち前記免疫用ペプチドを免疫することで、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害する抗体が誘導できることがわかった。
［実施例３］
Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、ＴＣＲが認識するアミノ酸が置換されたＴ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドとＭＨＣクラスII分子との複合体に対し、前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清中のＩｇＧ抗体が結合することを確認した。
（１）ＨＥＬペプチド提示細胞の調製
前記表３のＨＥＬペプチドに代えて、前記ＨＥＬペプチド４８−７７および下記のＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）を用いた以外は、前記実施例１Ａ（１）と同様にして、前記ＨＥＬペプチドを前記２９３Ｔ細胞にパルスした。培養後の前記２９３Ｔ細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体の検出に使用した。なお、前記ＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）は、前記Ｔ細胞エピトープである前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、公知のＴＣＲが認識するアミノ酸である６番目のチロシンをアラニンに、９番目のロイシンをアラニンに置換した置換Ｔ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドである。
（２）抗体の検出
前記実施例１Ａ（１）で得られた２９３Ｔ細胞に代えて、前記実施例３（１）で得られた２９３Ｔ細胞を用いた以外は、前記実施例１Ａ（３）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った（ペプチド添加群）。コントロールは、前記２９３Ｔ細胞に代えて、前記ＨＥＬペプチドをパルスしていないＬＫ３５．２細胞を用いた以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った（ペプチド未添加群）。
図７は、ＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。図７において、横軸は、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図７において、各ヒストグラムの上は、前記２９３Ｔ細胞にパルスした前記ＨＥＬペプチドの種類を示し、網掛けのヒストグラムは、コントロール（ペプチド未添加群）を示し、実線のヒストグラムは、ペプチド添加群を示す。図７に示すように、コントロールでは、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合が確認されなかった。これに対し、前記ＨＥＬペプチド４８−７７および前記ＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）をパルスした２９３Ｔ細胞に対しては、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合が確認された。これらの結果から、前記ＨＥＬタンパク質を免疫することで、前記ＴＣＲが認識するアミノ酸が置換されたＴ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドとＭＨＣクラスII分子との複合体に対する抗体が誘導できることがわかった。
［実施例４］
Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、ＴＣＲが認識するアミノ酸が置換されたＴ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドを免疫し、産生された抗体が、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することを確認した。
（１）抗体の取得
３０ｎｍｏｌの前記ＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）と完全フロイントアジュバントとを混合し、前記マウス（Ｂ１０．Ａ系統）の皮下に投与した。前記投与後２週間において、前記マウスから全血を採取し、さらに、血清を回収した。
（２）ＨＥＬペプチド提示細胞の調製
前記ＨＥＬタンパク質、前記ＨＥＬペプチド４１−７０、および前記ＨＥＬペプチド４８−６１に代えて、前記ＨＥＬタンパク質を添加した以外は、前記実施例１Ｂ（２）と同様にして、前記ＨＥＬタンパク質を前記ＬＫ３５．２細胞にパルスした。培養後の前記ＬＫ３５．２細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体によるＴＣＲ認識の阻害に使用した。
（３）抗体によるＴＣＲ認識の阻害
前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清に加え、前記ＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）免疫マウスの血清を用い、前記実施例１Ｂ（２）で得られたＬＫ３５．２細胞に代えて、前記実施例４（２）で得られたＬＫ３５．２細胞を用いた以外は、前記実施例１Ｂ（３）と同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。コントロールは、前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清および前記ＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）免疫マウスの血清に代えて、非免疫マウスから採取した血清を用いた以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った。
この結果を図８に示す。図８は、可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示すヒストグラムである。図８において、横軸は、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図８において、各ヒストグラムの上部は、前記血清の種類を示す。図８に示すように、前記コントロール（非免疫マウスの血清）と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合が確認できた。これに対し、前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清および前記ＨＥＬペプチド４８−７７（Ｙ５３Ａ Ｌ５６Ａ）免疫マウスの血清と反応させた場合、前記可溶型単鎖ＴＣＲの結合は確認できなかった。これらの結果から、前記Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、ＴＣＲが認識するアミノ酸が置換されたＴ細胞エピトープを含む免疫用ペプチドを免疫することで、前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害する抗体が誘導できることがわかった。
［実施例５］
免疫用ペプチドを免疫し、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する抗体産生が誘導されることを確認した。
（１）ＰＬＰペプチド提示細胞の調製
マウス脾臓ｃＤＮＡから、下記のマウスＭＨＣクラスII分子（I-As）のα鎖およびβ鎖をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ、ｐＭＥ１８Ｓベクターにクローニングし、マウスＭＨＣクラスII分子（I-As）α鎖発現ベクター（Ｉ−Ａｓα発現ベクター）およびマウスＭＨＣクラスII分子（I-As）β鎖発現ベクター（Ｉ−Ａｓβ発現ベクター）を作製した。
マウスＭＨＣクラスII分子（I-As）α鎖（配列番号２２）
ATGCCGCGCAGCAGAGCTCTGATTCTGGGGGTCCTCGCCCTGACCACCATGCTCAGCCTCTGTGGAGGTGAAGACGACATTGAGGCCGACCACGTAGGCGTCTATGGTACAACTGTATATCAGTCTCCTGGAGACATTGGCCAGTACACACATGAATTTGATGGTGATGAGTGGTTCTATGTGGACTTGGATAAGAAGGAGACTATCTGGATGCTTCCTGAGTTTGGCCAATTGACAAGCTTTGACCCCCAAGGTGGACTGCAAAACATAGCTACAGGAAAATACACCTTGGGAATCTTGACTAAGAGGTCAAATTCCACCCCAGCTACCAATGAGGCTCCTCAAGCGACTGTGTTCCCCAAGTCCCCTGTGCTGCTGGGTCAGCCCAACACCCTTATCTGCTTTGTGGACAACATCTTCCCTCCTGTGATCAACATCACATGGCTCAGAAATAGCAAGTCAGTCACAGACGGCGTTTATGAGACCAGCTTCCTTGTCAACCGTGACCATTCCTTCCACAAGCTGTCTTATCTCACCTTCATCCCTTCTGACGATGATATTTATGACTGCAAGGTGGAGCACTGGGGCCTGGAGGAGCCGGTTCTGAAACACTGGGAACCTGAGATTCCAGCCCCCATGTCAGAGCTGACAGAGACTGTGGTGTGTGCCCTGGGGTTGTCTGTGGGCCTTGTGGGCATCGTGGTGGGCACCATCTTCATCATTCAAGGCCTGCGATCAGGTGGCACCTCCAGACACCCAGGGCCTTTATGA
マウスＭＨＣクラスII分子（I-As）β鎖（配列番号２３）
ATGGCTCTGCAGATCCCCAGCCTCCTCCTCTCGGCTGCTGTGGTGGTGCTGATGGTGCTGAGCAGCCCAGGGACTGAGGGCGGAGACTCCGAAAGGCATTTCGTGTTCCAGTTCAAGGGCGAGTGCTACTTCACCAACGGGACGCAGCGCATACGATCTGTGGACAGATACATCTACAACCGGGAGGAGTACCTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGCGAGTACCGCGCGGTGACCGAGCTGGGGCGGCCAGACCCCGAGTACTACAATAAGCAGTACCTGGAGCAAACGCGGGCCGAGCTGGACACGGTGTGCAGACACAACTACGAGGGGGTGGAGACCCACACCTCCCTGCGGCGGCTTGAACAGCCCAATGTCGTCATCTCCCTGTCCAGGACAGAGGCCCTCAACCACCACAACACTCTGGTCTGCTCAGTGACAGATTTCTACCCAGCCAAGATCAAAGTGCGCTGGTTCCGGAATGGCCAGGAGGAGACGGTGGGGGTCTCATCCACACAGCTTATTAGGAATGGGGACTGGACCTTCCAGGTCCTGGTCATGCTGGAGATGACCCCTCGGCGGGGAGAGGTCTACACCTGCCACGTGGAGCATCCGAGCCTGAAGAGCCCCATCACTGTGGAGTGGAGGGCACAGTCTGAGTCTGCCCGGAGCAAGATGTTGAGCGGCATCGGGGGCTGCGTGCTTGGGGTGATCTTTCTCGGGCTTGGCCTTTTCATCCGTCACAGGAGTCAGAAAGGACCTCGAGGCCCTCCTCCTGCAGGGCTCCTGCAGTGA
つぎに、前記Ｉ−Ａｋα発現ベクターおよび前記Ｉ−Ａｋβ発現ベクターに代えて、前記Ｉ−Ａｓα発現ベクターおよび前記Ｉ−Ａｓβ発現ベクターを用いた以外は、前記実施例１Ａ（１）と同様にして、前記発現ベクターを前記２９３Ｔ細胞に導入した。さらに、前記ＨＥＬペプチドに代えて、下記表５のＰＬＰ（myelin proteolipid protein）ペプチド１３６−１５１またはＰＬＰペプチド１３９−１５１を添加した以外は、前記実施例１Ａ（１）と同様にして、前記ＰＬＰペプチドを前記２９３Ｔ細胞にパルスした。なお、以下で使用するＰＬＰペプチドでは、前記配列番号７のアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープの２番目のアミノ酸であるシステインをセリンに置換した下記表５のＰＬＰペプチド１３９−１５１（配列番号２０）をＴ細胞エピトープとして、使用している。また、ＰＬＰペプチド１３６−１５１（配列番号２１）では、表５において下線で示すように、上流側抗体誘導部において、Ｎ末端から３番目のアミノ酸をシステインからセリンに置換している。前記培養後の前記２９３Ｔ細胞について、前記ウェルから回収後、後述する抗体の検出に使用した。なお、本実施例のＰＬＰペプチドは、ユーロフィンジェノミクス株式会社またはGenScript社から取得した。また、前記ＰＬＰタンパク質において、前記ＭＨＣクラスII分子であるＩ−Ａｓに提示されるＴ細胞エピトープは、下記表５のＰＬＰペプチド１３９−１５１である。このため、前記表５のＰＬＰペプチドにおいて、前記免疫用ペプチドは、ＰＬＰペプチド１３６−１５１である。
（２）抗体の取得
前記ＨＥＬタンパク質に代えて、３０ｎｍｏｌのＰＬＰペプチド１３９−１５１またはＰＬＰペプチド１３６−１５１を使用し、前記マウス（Ｂ１０．Ａ系統）に代えて、マウス（Ｂ１０．Ｓ系統またはＳＪＬ）に投与した以外は、前記実施例１Ａ（２）と同様にして血清を回収した。
（３）抗体の検出
前記ＨＥＬタンパク質免疫マウスの血清に代えて、ＰＬＰペプチド１３９−１５１免疫マウスの血清またはＰＬＰペプチド１３６−１５１免疫マウスの血清を使用し、前記実施例１Ａ（１）で得られた２９３Ｔ細胞に代えて、前記実施例５（１）で得られた２９３Ｔ細胞を用いた以外は、前記実施例１Ａ（３）と同様にして、前記フローサイトメトリーにより解析を行った（ペプチド添加群）。また、コントロールは、前記２９３Ｔ細胞に前記ＰＬＰペプチドをパルスしなかった以外は同様にして、フローサイトメトリーにより解析を行った（ペプチド未添加群）。
この結果を図９に示す。図９は、ＩｇＧ抗体の結合量を示すヒストグラムである。図９において、横軸は、前記血清中のＩｇＧ抗体の結合量を示し、縦軸は、細胞のカウント数を示す。また、図９において、各ヒストグラムの上は、前記血清の種類を示す。また、図９において、実線のヒストグラムは、前記ペプチド添加群を示し、網掛けのヒストグラムは、コントロール（ペプチド未添加群）を示す。図９に示すように、ペプチド未添加群（コントロール）では、いずれの血清においても、ＩｇＧ抗体の結合は観察されなかった。また、前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１免疫マウスの血清では、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１または前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１をパルスした２９３Ｔ細胞に対して、前記ＩｇＧ抗体の結合は確認されなかった。これに対して、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１免疫マウスの血清では、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１をパルスした２９３Ｔ細胞および前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１をパルスした２９３Ｔ細胞に対して、前記ＩｇＧ抗体の結合が確認された。これらの結果から、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１、すなわち前記免疫用ペプチドを免疫することで、前記免疫用ペプチドと前記ＭＨＣクラスII分子との複合体に対する抗体が誘導できることがわかった。
［実施例６］
免疫用ペプチドを免疫することで得られた抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することを確認した。
（１）ＰＬＰペプチド提示細胞の調製
前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した以外は、前記実施例５（１）と同様にして、前記ＰＬＰペプチドをパルスした前記２９３Ｔ細胞を調製した。
（２）ＩｇＧ抗体の取得
前記ＨＥＬタンパク質に代えて、３０ｎｍｏｌのＰＬＰペプチド１３６−１５１を使用し、前記マウス（Ｂ１０．Ａ系統）に代えて、マウス（ＳＪＬ／Ｊ系統）を用い、前記投与後１４−３０日目において、前記マウスから全血を採取した以外は、前記実施例１Ａ（２）と同様にして、血清を回収した。得られた血清について、プロテインＡおよびプロテインＧ（Bio-rad社製）を用い、添付のプロトコルに基づき、ＩｇＧ抗体を精製した。
（３）レポーターＴ細胞の作製
Ｔ細胞エピトープであるＰＬＰペプチド１３９−１５１と、ＭＨＣクラスII分子であるＩ−Ａｓとの複合体を認識するＴＣＲ（２Ｅ５ ＴＣＲ）を発現し、ＴＣＲ刺激によりＧＦＰを発現するレポーターＴ細胞は、以下の手順で作製した。
まず、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins）システムを用いて、下記参考文献の４３−１細胞株のＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子を欠失させた細胞を、フローサイトメトリーで採取した。前記採取後の細胞を限界希釈し、ＴＣＲの細胞表面発現が陰性のクローンを選抜した（第１選抜細胞）。前記第１選抜細胞に対し、ＴＣＲα鎖遺伝子またはＴＣＲβ鎖遺伝子を単独で導入してもＴＣＲが細胞表面に発現せず、ＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子の両方を導入するとＴＣＲが細胞表面に発現するクローンを選抜した（第２選抜細胞）。そして、ＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子を導入し、ＴＣＲを細胞表面に発現させた状態で、固相化抗ＣＤ３抗体（クローン名：2C11、固相化濃度：10ug/ml）により刺激すると、レポータータンパク質であるＧＦＰが良く発現するクローンを選抜し、これをＴＣＲ欠失４３−1細胞として使用した。
参考文献：Makoto Ohtsuka et.al., “NFAM1, an immunoreceptor tyrosine-based activation motif-bearing molecule that regulates B cell development and signaling”, PNAS, 2004, vol.101, No.21, pages 8126-8131
つぎに、ＮＣＢＩアクセッション番号 ＮＭ＿０１３４８８．２で登録されているマウスＣＤ４分子 ｍＲＮＡの１７０〜１５４３番目の塩基配列（終止コドンを含む）を、ｐＭＸｓベクター（東京大学医科学研究所 北村俊雄博士より分与）にクローニングしＣＤ４発現ベクターを作製した。前記ＣＤ４発現ベクターをＰｌａｔＥ細胞にトランスフェクションし、レトロウイルスを作製した。前記ＴＣＲ欠失４３−1細胞に前記レトロウイルスを感染させ、マウスＣＤ４を安定的に発現するＣＤ４発現４３−１細胞を作製した。さらに、２Ｅ５ ＴＣＲα鎖遺伝子（配列番号２４、終止コドンを含む）および２Ｅ５ ＴＣＲβ鎖遺伝子（配列番号２５、終止コドンを含む）をｐＭＸｓベクターにクローニングし、２Ｅ５ ＴＣＲ発現ベクターを作製した。そして、前記ＣＤ４発現ベクターに代えて、前記２Ｅ５ ＴＣＲ発現ベクターを用い、前記ＴＣＲ欠失４３−1細胞に代えて、ＣＤ４発現４３−１細胞を用いた以外は同様にして、レトロウイルスを作製し、２Ｅ５ ＴＣＲを安定的に発現する２Ｅ５レポーターＴ細胞を作製した。
２Ｅ５ ＴＣＲα鎖遺伝子（配列番号２４）
ATGAAGACATCCCTTCACACTGTATTCCTATTCTTGTGGCTGTGGATGGACTGGGAAAGCCATGGAGAGAAGGTCGAGCAACACCAGTCTACACTGAGTGTTCGAGAGGGAGACAGCGCTGTCATCAACTGCACTTACACAGATACTGCCTCATCATACTTCCCTTGGTACAAGCAAGAAGCTGGAAAGAGTCTCCACTTTGTGATAGACATTCGTTCAAATGTGGACAGAAAACAGAGCCAAAGACTTACAGTTTTATTGGATAAGAAAGCCAAACGATTCTCCCTGCACATCACAGCCACACAGCCTGAAGATTCAGCCATCTACTTCTGTGCAGCAAGCCCGGGAGCTAACACTGGAAAGCTCACGTTTGGACACGGCACCATCCTTAGGGTCCATCCAAACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGTTGA
２Ｅ５ ＴＣＲβ鎖遺伝子（配列番号２５）
ATGGGTGCAAGACTGCTCTGCTGTGTAGCAGTTTGTCTGCTTGGGGCAGGCTCTTTTGTTGCTGGAGTAACCCAGACTCCACGATACCTGGTCAAAGAGGAAGGACAGAAAGCACACATGAGTTGTAGTCCTGAAAAAGGGCACACTGCCTTTTACTGGTATCAACAGAACCAGAAACAAGAACTTACATTTTTGATTAACTTTCGGAATGAAGAAATTATGGAACAAACAGACTTGGTCAAGAAGAGATTCTCAGCTAAGTGTTCCTCGAACTCACAGTGCATCCTGGAAATCCTATCCTCTGAAGAAGACGACTCAGCACTGTACCTCTGTGCCAGCAGCCTTGTACGAGGGAACTCCGACTACACCTTCGGCTCAGGGACCAGGCTTTTGGTAATAGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGAAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGAATCACTTCAGCATCCTATCATCAGGGGGTTCTGTCTGCAACCATCCTCTATGAGATCCTACTGGGGAAGGCCACCCTATATGCTGTGCTGGTCAGTGGCCTAGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAAAAAAAATTCCTGA
（４）抗体によるＴＣＲ認識の阻害
前記実施例６（１）で得られたＰＬＰペプチドをパルスした２９３Ｔ細胞に、２×１０４細胞の前記２Ｅ５レポーターＴ細胞と、１ｍｇ／ｍＬとなるように、前記（２）で取得したＩｇＧ抗体とを添加し、３７℃、１日の培養条件下で培養した。前記培養後、細胞を回収し、前記２Ｅ５レポーターＴ細胞を、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体（クローン名：３０−Ｆ１１、eBioscience社製）で染色した。そして、前記フローサイトメトリーを用い、前記染色後の２Ｅ５レポーター細胞について、ＣＤ４５陽性細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の割合について、解析を行った。コントロール１は、前記ＩｇＧ抗体に代えて、前記培地を添加した以外は、同様にして、コントロール２は、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１を添加せずに免疫したマウス（ＣＦＡ免疫マウス）由来の血清から精製したＩｇＧ抗体を用いた以外は、同様にして、ＣＤ４５陽性細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の割合について、解析を行った。
これらの結果を図１０に示す。図１０は、ＣＤ４５陽性細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の割合を示すグラフである。図１０において、横軸は、サンプルの種類を示し、縦軸は、ＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。図１０に示すように、前記コントロール２（前記ＣＦＡ免疫マウス由来の血清から精製したＩｇＧ抗体）は、前記コントロール１と同程度のＧＦＰ陽性細胞が存在し、前記２Ｅ５レポーター細胞の２Ｅ５ ＴＣＲが、Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子と結合し、前記２Ｅ５レポーター細胞が活性化していた。これに対し、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１免疫マウスの血清から精製したＩｇＧ抗体を添加した場合、前記コントロール１および２に対して、ＧＦＰ陽性細胞の割合が著しく低下した。すなわち、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１免疫マウスの血清から精製したＩｇＧ抗体により、前記２Ｅ５レポーター細胞の２Ｅ５ ＴＣＲと、Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子との結合が阻害され、前記２Ｅ５レポーター細胞の活性化が阻害されていた。これらの結果から、免疫用ペプチドを免疫することで得られた抗体が、前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子に対する前記Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴＣＲの結合を阻害することがわかった。
［実施例７］
免疫用ペプチドを免疫することで得られた抗体が、生体において前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴ細胞（特異的Ｔ細胞）の活性化を阻害することを確認した。
（１）ＩｇＧ抗体の取得
前記実施例６（２）と同様にして、ＩｇＧ抗体を精製した。
（２）生体における特異的Ｔ細胞の活性化
３０ｎｍｏｌの前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１とＣＦＡとを混合し、マウス（ＳＪＬ／Ｊ系統）の皮下に免疫した。また、前記免疫後０および２日目に、２ｍｇの前記実施例７（１）で取得したＩｇＧ抗体を、前記マウスの腹腔内に投与した。前記免疫後１１日目に、前記マウスのリンパ節から、抗ＣＤ４抗体（クローン名：ＧＫ１．５、eBioscience社製）およびセルソーター（Sony cell sorter SH800Z、Sony社製）を用い、ＣＤ４陽性細胞を精製した。
また、非免疫マウス（ＳＪＬ／Ｊ系統）の脾臓をホモジェナイズして単一細胞浮遊液を調製後、ＡＣＫ溶血緩衝液で赤血球を溶血することにより、脾臓細胞を調製した。そして、１×１０５細胞の前記ＣＤ４陽性細胞、および４×１０５細胞の前記脾臓細胞を混合後、所定濃度（０、２、２０または２００μｍｏｌ／Ｌ）となるように、ＰＬＰペプチド１３６−１５１を添加し、３７℃、４日の培養条件下で培養することにより、ＣＤ４陽性細胞を刺激し、増殖を誘導した。前記培養は、ＲＰＭＩ培地を用い、実施した。そして、前記培養後の細胞について、細胞増殖測定キット（Cell proliferation ELISA kit、Roche社製）を用いて測定した（ＩｇＧ抗体投与群）。コントロールは、前記ＩｇＧ抗体を投与しなかった前記マウスから精製したＣＤ４陽性細胞を用いた以外は、同様にして測定した（ＩｇＧ抗体非投与群）。
これらの結果を図１１に示す。図１１は、細胞増殖の結果を示すグラフである。図１１において、横軸は、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１の濃度を示し、縦軸は、細胞増殖能（ｒｌｕ／ｓ）を示し、図中の四角（□）は、前記ＩｇＧ抗体を投与したマウス由来のＣＤ４陽性細胞を用いた結果を示し、菱形（◆）は、コントロールの結果を示す。図１１に示すように、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１を添加していない場合、すなわち、前記ＣＤ４陽性細胞を刺激していない場合、前記ＩｇＧ抗体投与群と、前記ＩｇＧ抗体非投与群との間で、前記ＣＤ４陽性細胞の細胞増殖能に差はなかった。これに対し、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１が２、２０、または２００μｍｏｌ／Ｌの場合、前記ＩｇＧ抗体投与群は、前記ＩｇＧ抗体非投与群に対して、前記ＣＤ４陽性細胞の細胞増殖能が著しく低下していた。これらのことから、免疫用ペプチドを免疫することで得られた抗体が、生体において前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴ細胞の活性化を阻害することがわかった。
（３）養子移入を用いた特異的Ｔ細胞の活性化の評価
前記実施例７（２）と同様にして、前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１の免疫および前記ＩｇＧ抗体の投与を行なった。そして、前記免疫後１２日目に、前記マウスのリンパ節をホモジェナイズして単一細胞浮遊液を調製することにより、リンパ節細胞を調製した。そして、前記リンパ節細胞に、５０μｇ／ｍＬとなるように前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１を添加し、３７℃、４日の培養条件下で培養した。前記培養後、前記リンパ節細胞を回収し、９×１０６細胞／マウスとなるように、非免疫マウス（ＳＪＬ／Ｊ系統）に静脈内投与した。そして、前記投与後の所定日（０、３、５、８、１０、１２、１４、１７、１９、２２、２５、２８、３２および３６日）に、以下の自己免疫性脳脊髄炎の評価基準により、臨床スコア（ＥＡＥ Ｓｃｏｒｅ）を算出した（ＩｇＧ抗体投与群）。コントロールは、前記ＩｇＧ抗体を投与しなかったマウスから調製したリンパ節細胞を用いた以外は、同様にして臨床スコアを算出した（ＩｇＧ抗体非投与群）。
（自己免疫性脳脊髄炎の評価基準）
スコア：症状
１ ： 尾の弛緩（尾を持つと垂れたままの状態）
２ ： 部分的な後肢の麻痺（歩行の異常）
３ ： 完全な後肢の麻痺
４ ： 後肢および下半身の麻痺
５ ： 後肢、下半身および前肢の麻痺
６ ： 死亡
これらの結果を図１２に示す。図１２は、臨床スコアの結果を示すグラフである。図１２において、横軸は、前記リンパ節細胞投与後の日数を示し、縦軸は、臨床スコアを示し、図中の破線は、前記ＩｇＧ抗体投与群の結果を示し、実線は、前記ＩｇＧ抗体非投与群の結果を示す。図１２に示すように、前記ＩｇＧ抗体投与群は、前記ＩｇＧ抗体非投与群より、自己免疫性脳脊髄炎の発症が遅く、また発症した場合においても、症状が有意に低減されていた。これらの結果から、前記免疫用ペプチドを免疫することで得られた抗体が、生体において前記免疫用ペプチド／ＭＨＣクラスII分子を認識するＴ細胞の活性化を阻害することがわかった。
［実施例８］
免疫用ペプチドを免疫することで、自己免疫疾患である実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症および症状を抑制できることを確認した。
３０ｎｍｏｌの前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１とＣＦＡとを混合し、マウス（ＳＪＬ／Ｊ系統）の皮下に免疫した。前記免疫後８週目に、５０ｎｍｏｌの前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１とＣＦＡとを混合し、前記マウスに免疫した。さらに、前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１の免疫後０および２日目に、１００ｎｇの百日咳毒素を前記マウスに静脈内投与することにより、ＥＡＥを誘導した。そして、前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１免疫後の所定日（０、３、７、９、１１、１２、１４、１７、１９、２０、２２、２４、２７、３０、３２、３４、および３６日）に、以下の自己免疫性脳脊髄炎の評価基準により、臨床スコア（ＥＡＥ Ｓｃｏｒｅ）を算出した（免疫ペプチド投与群）。コントロールは、１回目の免疫時に、前記ＰＬＰペプチド１３６−１５１に代えて、前記ＰＬＰペプチド１３９−１５１を用いた以外は、同様にして臨床スコアを算出した（Ｔ細胞エピトープ投与群）。
これらの結果を図１３に示す。図１３は、臨床スコアを示すグラフである。図１３において、横軸は、２回目の免疫後の日数を示し、縦軸は、臨床スコアを示し、図中の破線は、前記免疫ペプチド投与群の結果を示し、実線は、前記Ｔ細胞エピトープ投与群の結果を示す。図１３に示すように、前記免疫用ペプチド投与群は、前記Ｔ細胞エピトープ投与群と比較して、自己免疫性脳脊髄炎の発症が遅く、また発症した場合においても、症状が極めて低減されていた。これらの結果から、前記免疫用ペプチドを免疫することで、自己免疫疾患の発症および症状を抑制できることがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１５年３月３０日に出願された日本出願特願２０１５−０６８０４３を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
本発明の免疫用ペプチドによれば、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導できる。このため、本発明は、例えば、臨床分野等において極めて有用である。

Claims (14)

  1. 免疫用ペプチドであって、
    前記免疫用ペプチドは、ターゲットタンパク質のＴ細胞エピトープと抗体誘導部とを含み、
    前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する１以上のアミノ酸配列、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する１以上のアミノ酸配列の少なくとも一方であり、
    前記免疫用ペプチドは、生体に投与することで、前記免疫用ペプチドと前記生体のＭＨＣ分子との複合体に対する抗体産生を誘導することを特徴とする、免疫用ペプチド。
  2. 前記抗体誘導部は、前記ターゲットタンパク質のアミノ酸配列において、前記Ｔ細胞エピトープのＮ末端アミノ酸から上流側に連続する３以上のアミノ酸、および前記Ｔ細胞エピトープのＣ末端アミノ酸から下流側に連続する３以上のアミノ酸の少なくとも一方である、請求項１記載の免疫用ペプチド。
  3. 前記産生された抗体が、前記Ｔ細胞エピトープと前記生体のＭＨＣ分子との複合体を認識するＴ細胞受容体の結合を阻害する、請求項１または２記載の免疫用ペプチド。
  4. 前記Ｔ細胞エピトープが、前記Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列において、Ｔ細胞受容体が認識する１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、前記Ｔ細胞エピトープと前記ＭＨＣ分子との複合体に対して特異的なＴ細胞受容体により、置換されたアミノ酸配列と前記ＭＨＣ分子との複合体が認識されない置換Ｔ細胞エピトープである、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫用ペプチド。
  5. 前記免疫用ペプチドが、前記ターゲットタンパク質のＢ細胞エピトープを含み、
    前記Ｂ細胞エピトープが、下記（１）または（２）の置換Ｂ細胞エピトープである、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫用ペプチド。
    （１）前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢ細胞受容体により認識されない置換Ｂ細胞エピトープ
    （２）前記Ｂ細胞エピトープのアミノ酸配列に対して、１００％未満の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記Ｂ細胞エピトープに対して特異的なＢ細胞受容体により認識されない置換Ｂ細胞エピトープ
  6. 前記ＭＨＣ分子が、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスII分子の少なくとも一方である、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫用ペプチド。
  7. 前記ターゲットタンパク質が、免疫疾患の抗原タンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫用ペプチド。
  8. 前記免疫疾患が、アレルギー疾患または自己免疫疾患である、請求項７記載の免疫用ペプチド。
  9. 前記アレルギー疾患が、食物アレルギー、口腔アレルギー症候群、薬剤アレルギー、花粉症、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、接触皮膚炎、蕁麻疹、光線過敏症、金属アレルギー、ネコアレルギー、ダニアレルギー、および喘息からなる群から選択された１つである、請求項８記載の免疫用ペプチド。
  10. 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病、橋本病、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、強皮症、皮膚筋炎、間質性肺炎、肺胞蛋白症、ＡＮＣＡ関連血管炎、リウマチ性多発筋痛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、多発性筋炎、シェーグレン症候群、ＩｇＧ４関連疾患、血管炎症候群、混合性結合組織病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、膜性腎症、ＩｇＡ腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、尋常性白斑、サットン後天性遠心性白斑・サットン母斑、原田病、自己免疫性視神経症、抗カルジオリピン抗体、自己免疫性内耳障害、特発性無精子症、習慣性流産、ベーチェット病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、およびナルコレプシーからなる群から選択された１つである、請求項８記載の免疫用ペプチド。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させる工程を含むことを特徴とする、免疫用ペプチドの製造方法。
  12. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫用ペプチドを含むことを特徴とする、免疫疾患用医薬組成物。
  13. 前記免疫疾患用医薬組成物が、さらに、アジュバントを含む、請求項１２記載の免疫疾患用医薬組成物。
  14. 免疫疾患を治療する方法であって、
    生体に請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫用ペプチドおよび請求項１２または１３記載の免疫疾患用医薬組成物の少なくとも一方を投与することを特徴とする、免疫疾患の治療方法。

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