MXPA01006304A - Inmunosupresion - Google Patents

Abstract

La invención aquídescrita se refiere a un método para mejorar la tolerancia de un mamífero, preferiblemente un humano, a un xenoinjerto a través de la inmunización de un mamífero receptor con un inmunógeno que comprende tanto un epítope de la célula B derivado de polipéptidos porcinos como un epítope de la célula T;la invención también abarca composiciones inmunogénicas que comprenden dichos inmunogenos y los métodos para monitorear el estado del xenoinjerto.

Description

INMUNOSUPRESION CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la inmunosupresión y, más particularmente, a la inmunosupresión en el contexto de xenotransplante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A pesar de los éxitos establecidos para los transplantes de órganos alogénicos, se debe superar la disparidad en el incremento entre la oferta y la demanda de órganos. Al incrementar la oferta de órganos alogénicos no se ofrece una solución satisfactoria debido a que aun cuando todos los órganos que se pueden usar se transplantaran, lademanda existente no sería satisfecha (1 ,2). Estos ha llevado al surgimiento del interés de los xenotransplantes (los transplantes de órganos entre animales de diferentes especies) como una alternativa viable y atractiva. La investigación sobre xenotransplantes recientemente se ha enfocado en el cerdo como un animal donador adecuado en términos de tamaño, compatibilidad fisiológica y características de cruza (3,4). Sin embargo, hasta hace poco tiempo, los xenotransplantes discordantes se habían limitado por la ocurrencia inevitable de rechazo hiperagudo mediado humoralmente (HAR) el cual rápidamente dispara el rechazo del órgano una vez que se revasculariza. El destino de la mayoría de los órganos entre especies discordantes es HAR. Recientemente, se han hecho avances importantes para entender las bases inmunológicas de HAR, y se han empleado muchos métodos para superarlo. Significativamente, en la actualidad se ha empleado una variedad de estrategias transgénicas incluyendo la expresión de reguladores de la actividad del complemento sobre las células endoteliales porcinas (5). Es fácil prever que la supervivencia de los xenoinjertos de corto plazo se logrará pronto (6). Los avances recientes para sobreponerse a la HAR han resaltado las barreras inmunológicas subsecuentes que deben someterse para capacitar la supervivencia del xenoinjerto a largo plazo. Tanto las armas celulares como humorales de la respuesta inmune parecen jugar un papel en los eventos en cascada sobre el rechazo ¡nmunológico. Claramente el más importante de los cuales es la existencia de una formidable respuesta de rechazo mediada por la células T (7-11 ) Previamente oscurecida por el papel dominante de HAR. In vitro, las células T humanas han demostrado jugar un papel central en el reconocimiento de las células xenogénicas (7,8,12) siguiendo a la sensibilización vía las rutas de activación directas e indirectas de la célula T, la cual ha sido bien documentada por alorreconocimiento y rechazo de aloimplantes (13). El conocimiento de los mecanismos celulares que subyacen el alorrechazo a provisto una base importante para la investigación de la xenorespuesta mediada por la célula T.

Hasta el momento, las terapias principales para prevenir el rechazo mediado por la célula de transplantes de órganos recaen sobre los fármacos inmunosupresores sistémicos o terapia de anticuerpos monoclonaies (Mab) dirigidos en contra de los blancos tales como CD3, CD4, CD25, (14). Siguiendo los reportes de que puede generarse una fuerte xenorespuesta por la célula T in vitro (7,8,12), el control del rechazo de xenoinjertos puede requerir niveles de inmunosupresión mucho mayores que las dosis estándar actuales. Dicha estrategia podría desearse en un contexto de xenoinjertos. Los fármacos deben tomarse de por vida, deprimiendo todo el sistema inmune y resultando en un incremento del riesgo para infección y susceptibilidad del cáncer (14). Para la aplicabilidad de los xenotransplantes a la clínica, las estrategias dirigidas a implantes específicos para la tolerancia de inducción/inmunosupresión podrían ser claramente altamente ventajosas. Mientras que esto ha sido difícil de lograr en un contexto de alotransplantes, los xenotransplantes ofrecen un gran potencial con diferencias entre las especies que proveen la opción para la generación de reactivos que son verdaderamente específicos para el implante. Además, está la oportunidad para la manipulación tanto del órgano del donante porcino, como del sistema inmune del recipiente humano, antes del transplante (1 ).

ANTECEDENTES DETALLADOS 3.1 Activación y proliferación de las células T La proliferación óptima de las células T, aunque se inicia vía la ligación del complejo específico de antígeno CD3/TCR (señal 1 ) requiere señales coestimulantes adicionales (señal 2) (15,16,17) las cuales usualmente se suplen por la célula presentadora del antígeno (APC). Mientras que la estimulación antigénica de las células T en la presencia de la señal 2 induce la activación de la célula T y la proliferación (18), la exposición de las células T al complejo MHC-antígeno en su ausencia lleva a eliminar la proliferación de la célula T y el desarrollo de anergia clonal (19,20). La manipulación de APC por la fijación con aldehido (20,21 ) o el tratamiento con calor (19) se ha demostrado que anulan la capacidad de dichas células para activar a las células T aloreactivas, sin alterar los niveles de la expresión de MHC-II de superficie. Así la ocupación del receptor de la célula T sólo es insuficiente para activar completamente a la célula T (17). Las células T anérgicas se caracterizan mejor por su ausencia de producción de IL-2 y su continua incapacidad para producir IL-2 sobre la exposición subsecuente al antígeno (22). Así, confirmando los dos modelos de señal de activación pronosticados por Lafferty et al (23). Para que las células T respondan a un estimulo antigénico dado, se requieren señales de activación múltiple a partir de APC La inducción in vivo de la anergia de la célula T en la ausencia de una señal secundaria fue inicialmente demostrada por Jenkins y Schwartz en 1986 (24) usando APC químicamente fijado al péptido especifico presente a CD4 de las clonas de células T de ayuda. Una multitud de datos in vitro y in vitro se han producido apoyando a las hipótesis de que la señal 1 en aislamiento falla para activar las células de T (22), y la señal de coestimulación resulta a partir del contacto con otras células más que día factores solubles. Los fibroblastos transfectados con las moléculas MHC de clase II humano pero que no expresan las señales apropiadas CS (que carecen de la señal 2) pueden eficientemente presentar antígeno a las clonas de células CD4 T restringidas a la clase II, pero estas fallan para causar proliferación de la célula T especifica a antígeno produciendo células anergicas. El contexto en el cual las células T inicialmente se encuentran con el antígeno tiene por lo tanto una importancia sobre la respuesta inmune subsecuente. Así, las moléculas coestimulantes son esenciales para la activación de la célula T y la multiplicación y resultan a partir de las interacciones entre receptores de las células T y sus ligandos expresados en la APC. La señal coestimulante misma, sin embargo no es especifica para antígenos ni restringida a MHC (25). En años recientes se han definido bien las interacciones moleculares implicadas para mediar la coestimulación. Las dos rutas clave implicadas (i) B7-1 , B7-2 (miembros de la familia B7) y (ii) CD40, los cuales expresan sobre APC, y sus receptores de conteo CD28 y el ligando CD40 (CD40L) respectivamente se expresan sobre las células T. Un gran cuerpo de evidencia, tanto in vivo como in vitro, claramente define los papeles cruciales jugados por B7-1 , B7-2 y CD40 para proveer la coestimulación de la célula T (26-36). Además, el bloqueo simultáneo de la vía de señalización CD28-B7 y CD40-CD40L en un contexto de alotransplante previene el inicio del rechazo del aloimplante (37, 38). In vivo, dirige la interacción B7/CD28 que se ha mostrado que previene la sensibilización de la célula T al antígeno de implante, mientras que prolonga la supervivencia del implante (38, 39). Las células T pueden sensibilizarse en contra de los xenoantígenos por una de dos rutas - la ruta directa e indirecta, las cuales son análogas a las rutas bien documentadas de activación de célula T en contra de aloantígenos (figura 1 ). El reconocimiento directo requiere que las células T receptoras reconozcan las xenomoléculas MHC intactas formando un complejo con el péptido en células estimulantes del donador. En contraste, el reconocimiento indirecto requiere que el receptor APC procese el xenoantígeno antes de su presentación a las células T receptoras en el contexto del receptor MHC II. Las células T restringidas al MHC II con especificidad para el xenoantígeno reconocerán el péptido y responderán. A pesar de que la mayoría de los datos reportados es sobre respuestas de xenoreconocimiento indirecto, el rechazo mediado por células por la ruta directa también se ha documentado (7, 8, 9, 11 , 12, 40, 41 , 42). La respuesta vigorosa proliferativa de la célula T humana dirigida en contra de tejidos porcinos in vitro se ha documentado a partir de estudios tanto en el laboratorio de los inventores y en otros. 3.2 Moléculas coestimulantes El papel crucial que juegan las moléculas coestimulantes para determinar el resultado del compromiso del receptor TCR-CD3 con MHC y los péptidos se ha demostrado extensivamente tanto in vivo como in vitro. Las estrategias de la molécula anticoestimulante se dirigen ya sea a los receptores o a sus ligandos y han sido usadas como estrategias terapéuticas para alterar la respuesta inmune. Dichos métodos se han probado en sistemas de transplante modelo para alterar las respuestas mediadas por células y así prevenir el rechazo del implante (14, 37, 38, 43-47). B7-1 (B7/BB1 , CD80) y B7-2 (CD86) pertenecen ambos a la superfamilia de inmunoglobulina y son proteínas transmembranales altamente glucosiladas (25). B7-1 , una molécula de activación de la célula B que se identificó por primera vez en 1989 (27), seguida por B7-2 en 1993 (49). Actualmente se han clonado y caracterizado funcionalmente tanto B7-1 y B7-2 humanos, como los homólogos murinos (25). B7-1 y B7-2 se expresan constitutivamente en células esplénicas y en células dendríticas sanguíneas y se inducen en las células B y en monocitos después de la activación (34,50,). B7-1 y 2 son altamente homólogos y son los ligandos naturales para el antígeno de la célula T CD28 (50). El antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4), una glucoproteína de superficie celular se ha identificado como un receptor secundario para la familia de moléculas B7 (51) y es homologo a CD28 con 31% de identidad de secuencia. Tanto las ¡soformas B7 se unen a CTLA-4 con mayor actividad que a CD28 (30, 50, 52). A pesar de que el compromiso del receptor CD28-B7 resulta en una señal coestimulante derivada de APC está implicada en la producción de antígeno específico IL-2 tanto in vivo e in vitro, 53, 54), CTLA4 parece funcionar como un regulador negativo de la activación de la célula T (55, 56, 57). El entrecruzamiento por los anticuerpos anti CTLA4 se ha demostrado que antagoniza la ligación de CD28 (58) y además, el ratón CTLA4 knock-out muere debido a una proliferación linfocitaria no controlada dentro de las primeras semanas de vida (59). Así, la ligación CTLA4 se cree que es crucial para el mantenimiento y regulación de la respuesta inmune. Los mecanismos que subyacen, sin embargo, no se han definido claramente. Entre las moléculas coestimulantes, la familia B7 parece ser única, puesto que la ligación por CD28 o ya sea B/-1 o B7-2 es tanto necesaria como suficiente para prevenir la inducción de anergia (34). La interacción CD28-B7 se cree que administra señales cruciales para mantener la proliferación de células T activadas. Estas observaciones se apoyan por datos in vitro que muestran que mientras las células deficientes en B7 fallan al estimular una MLR primaria, los transfectantes, que expresen altos niveles de B7 ganan la capacidad para estimular la producción de IL-2 por células T aloreactivas y para coestimular una población policlonal de células T purificadas cultivadas con Mab anti-CD3 inmovilizado (31 ). APC artificial generado por transfección estable de células NIH-3T3 con HLA-DR7, B7 o ambas, claramente demuestra que siguiendo la presentación de toxoide tetánico (TT) para la proliferación óptima de células T y la producción de IL-2 resulta solamente cuando ambas moléculas están presentes. En la ausencia de B7, se obtuvo la energía clonal (58). B7-2 (PoB7-2) de porcino se ha clonado a partir de células endoteliales aórticas (60). Siguiendo la transfección transitoria de B7-2 porcinos, las células endoteliales de la vena umbilical humana coestimulan fuertemente la producción de IL-2 por las células T humanas. Esta coestimulación de las células T humanas por PoB7-2 demostró que es efectiva como señal coestimulante provista por B7-1 humana o B7-2 y puede bloquearse específicamente por huCTLA4lg. Así poB7-2 contribuye fuertemente a la inmunogenicidad del endotelio porcino (60). Aunque las interacciones mediadas por B7-2 y B7-2 parecen centrales para el desarrollo de la inmunidad específica de las células T, existen rutas coestimulantes adicionales de importancia. La más crucial de ellas implica la interacción CD40 y CD40 y ligando (cd40L) (34). CD40 es una glucoproteína de superficie de 50 kDa que pertenece a la superfamilia TNF del receptor. CD40 se expresa en varios APC incluyendo entre otros, monocitos, células dendríticas y macrófagos activados. Otros tipos celulares que incluyen endotelio también expresan CD40 (34). Su contrareceptor CD40L (CD154, gp39, TRAP) es una proteína de membrana integral tipo II de 33 kDa (34, 36) que transitoriamente se expresa sobre las células T activadas CD4. Se ha demostrado que la interacción CD40-CD40L juega un papel importante tanto en las armas humorales y celulares de la respuesta inmune con un papel dominante en la activación de la célula B. mientras que el entrecruzamiento de CD40 en las células B es esencial para el crecimiento de la célula B y el regulador de isotipo, también resulta en la sobrerregulación de la expresión B7 (50). Los niveles de la expresión de B7 (y por lo tanto la capacidad APC) de los monocitos y las células dendríticas claramente no están regulados seguidos a la señalización por CD40 (34). Los datos de los ratones knock-out CD40 demuestran que la señalización de CD40L siguiendo a la ligación por CD40 juega un papel importante en la activación de la célula T (61 ). La transfección de las células de mastocitomas P815 de murino con CD40 (o B7-1 ) capacitan a las células P815 previamente no estimulante para que medien la coestimulación necesaria para la activación de la célula T policlonal y la generación de citocinas (34). Las interacciones CD40-CD40L también se han demostrado que juegan un papel crítico en el rechazo de aloimplantes. (62, 63). Las células B en reposo normalmente no expresan B7-1/B7-2 a altos niveles hasta que se activan (50). La activación de las células B siguiendo al compromiso simultáneo del péptido MHC/TCR y CD40-CD40L lleva a la sobrerregulación de los miembros de la familia B7 en la células B, por lo tanto mejorando la estimulación y activación subsecuente de las células T (34, 36). Así, la interacción CD40-CD40L influye la actividad coestimulante al inducir la expresión de la familia de moléculas B7 y tal vez otras moléculas coestimulantes, de tal modo jugando un papel clave en la activación de la célula T. Los claros efectos sinergísticos de CD40 y B7 indican la importancia de ambas rutas coestimulantes para el inicio y amplificación de la respuesta inmune dependiente de la célula T (38). También se ha visto que las interacciones CD40-CD40I juegan un papel crucial en la generación de la respuesta de linfocito T citotóxico (CTL) al modificar el estado funcional de una célula dendrítica (64,65,66). Estudios extensivos han demostrado la importancia de bloquear B7-CD28 y/o las interacciones CD40-CD40L en el contexto tanto de alotransplantes como de xenotransplantes. Los datos que apoyan fuertemente esto incluyen el uso de CTLA4lg para bloquear la señalización vía CD28-B7 resultando en una supervivencia mejorada del implante y la prevención del rechazo crónico en un modelo de aloimplante cardiaco de rata (44,45) y un modelo de aloimplante de aorta murina (43). En estos modelos, la administración de CTLA4lg ocasiona tolerancia parcial (44) o completa (46) al antígeno del implante al inducir anergia de la célula T. También se ha demostrado que el tratamiento de los alotransplantes de islotes pancreáticas con anti-B7-2 y anticuerpo B7-1 inhibe el rechazo del transplante (14). Resultados similares se obtuvieron en modelos que inhibían la señalización de CD40 en los modelos de alotransplante cardiaco de ratón (37,47,62). Dos estudios detallan el bloqueo simultáneo de la señalización de la vía CD28-B7 y CD40-CD40L que previnieron el inicio del alorrechazo. La inhibición prolongada concurrente de ambas rutas completamente evita el inicio del rechazo crónico en alomodelo de ratón (37) y un alomodelo de piel y corazón (38). En la región del xenotransplante, Lenshow y colegas, han demostrado tolerancia específica al donante de largo plazo de islotes humanas transplantados dentro de ratones con tratamiento concomitante con CTLA41 g (46). La tolerancia específica para implantes se demostró que es una consecuencia directa de la inhibición de la vía de reconocimiento B7 que expresa APC. Además, Tran ef al (67) demostraron una supresión a corto plazo con tratamiento con CTLA4-Fc. Hay datos limitados disponibles sobre el bloqueo de la estimulación de ambas rutas en el contexto de los xenoinjertos, con una supervivencia prolongada de transplantes de piel de rata y de porcino dentro de receptores murinos (63). Los datos in vitro e in vivo han demostrado claramente que la dirección de las interacciones mediadas ya sea por CD28-B7, CD40-CD40L, o por ambas rutas previene la sensibilización de las células T a aloantígenos y xenoantígenos a partir de tejido implantado por lo tanto promoviendo la supervivencia del implante. Como se notó anteriormente, el rechazo del implante mediado por la célula T esta bien documentado. El sistema inmune puede alternar o adicionar mecanismos de rechazo mediados por células. Esto mecanismos se ilustran por la función de varias moléculas expresados por, entre otros, células endoteliales. VCAM es una molécula de adhesión celular, expresada por las células endoteliales, que se piensa que tiene un papel en el reclutamiento de leucocitos a sitio de inflamación. VCAM es un glucoproteína transmembranal inducible que tiene un nivel de expresión basal en las células endoteliales en reposo pero que rápidamente se expresa una vez que se da la exposición a citocina pro-inflamatorias (por ejemplo IL-1 , TNFa). La interacción de VCAM con leucocitos es vía el antígeno 4 muy tardío (VLA-4) expresado en la superficie de las células leucocitarias. Por lo tanto la expresión de las células endoteliales de VCAM funciona para inducir la infiltración de VLA-4 presentes en los leucocitos a sitios de inflamación cuya respuesta al rechazo aumenta a los aloinjertos o xenoinjertos. Se cree que VCAM porcina juega un papel importante al permitir la migración de los leucocitos humanos a través de las monocapas de células endoteliales porcinas. Hay un razonamiento para creer que bloqueando esta interacción tendrá consecuencias beneficiosas sobre la supervivencia de xenoinjertos. La VCAM de cerdo, clonada en 1994, tiene homología significante con VCAM(1 ) humano. Así como los datos presentados en (1 ), hay una gran cantidad de evidencias para otros estudios in vitro que sugieren que VCAM de cerdo interactúa eficientemente con el receptor de la contraexpresión de leucocito humano VLA-4. Por ejemplo, en los ensayos de adhesión estática, los anticuerpos a VCAM significativamente inhiben la unión de NK humano y células T a endotelio de cerdo. Con las células NK, esta alteración inhibe la lisis celular que normalmente resulta después de la adhesión a las monocapas endoteliales porcinas.

El efecto de los anticuerpos anti-VCAM sobre las células T que median los mecanismos de rechazo del xenoinjerto es mucho más difícil de predecir. En algunos modelos de alotransplantes en roedores, se han usado los anticuerpos en contra de VCAM para prologar la supervivencia del aloimplante en algunos casos, se ha descrito la supervivencia de largo plazo y la tolerancia específica (2,3), aunque el mecanismo preciso de acción de estos estudios no esta completamente elucidado. 3.5 Estrategia de inmunización peptídica Los estudios previos in vivo usando péptidos sintéticos conjugados con moléculas acarreadoras como inmunógenos han demostrado la capacidad de generar la producción de anticuerpos biológicamente activos (68). Actualmente hay una extensa literatura detallando la estrategia de inmunización por péptidos que demuestran el mejoramiento en la producción de anticuerpos por la presentación del vehículo (68-72) así, los epítopes de la célula T apropiada puede usarse para preparar a las células T para la subsecuente ayuda de las células B. Los datos recientes que se han publicado reportan la producción de IgG por células B auto-reactivas siguiendo a la inmunización con un antígeno auto-reactivo covalentemente acoplado a una molécula acarreadora (70). Demostrando por lo tanto que la tolerancia de las células B a su propia proteína puede ser superada. Como se mencionó anteriormente, con el objeto de ser reconocido por las células T, el antígeno (propio o externo) debe procesarse y presentarse por APC. Las células B pueden actuar como APC altamente potentes siguiendo a la endocitosis del antígeno mediante receptores a IgG. En la presencia de un complemento total de las señales de activación (coestimulación más compromiso de TCR) la activación de la célula T ocurrirá resultando en la generación subsecuente del anticuerpo. Los péptidos de las auto-proteínas se procesan y presentan a las células T de la misma manera que las proteínas externas, pero debido a la tolerancia de la célula T, la presentación de ios auto-péptidos no resultan normalmente en la activación de las células T (70). La ausencia de reconocimiento de las células T puede por lo tanto explicarse, en parte, porque las células B reactivas potencialmente no responden. La capacidad para superar la falta de respuesta de las células B a los auto-péptidos recientemente se ha demostrado por Dalum er al (69). Una respuesta de auto-anticuerpo se generó al proveer células de ayuda T adicionales en la forma de un epítope de la célula T como acarreador externo fuerte. Estudios adicionales han demostrado que los péptidos sintéticos conjugados al acarreador de las moléculas de la célula T son capaces de sobreponerse a la falta de respuesta de la célula B sin números significantes de células B autoreactivas presentándose en el hospedero (69,70). La inserción de un epítope de la única célula T externa dentro de la secuencia de ubiquitina, produce una fuerte producción de autoanticuerpos dirigidos en contra de la molécula nativa (69). En un estudio elegante por Sad, usando GnRH como autoproteína químicamente unida a toxoide de difteria (DT) como el epítope de la célula T sintético, los autoanticuerpos se produjeron con especificidad para GnRH (71 ,72) nativa. Siguiendo a la vacuna inicial, la presencia continua de GnRH nativa in vivo mantuvo la producción de Ab. La producción continua de autoanticuerpos causó la esterilidad en los ratones inmunizados debido a la respuesta mantenida de anticuerpos anti GnRH mantenida por la presencia continua de la molécula nativa en contra de la cual las células B específicas estuvieron produciendo el anticuerpo. El acarreador DT provocó que la respuesta de la célula T de ayuda asistiera a las células B específicas para GnRH y rompiera la tolerancia de la célula B. 4.- ENUNCIADOS DE LA INVENCIÓN En su aspecto más general, la invención se refiere a la inmunización de un mamífero, preferiblemente un humano, con un inmunógeno que resulta en la producción de anticuerpos específicos a epítopes porcinos que se expresan, típicamente, pero no exclusivamente, por células endoteliales porcinas que están implicadas en mediar el rechazo inmune de los xenoinjertos de tejido/órgano. El inmunógeno se construye aquí como cualquier epítope o combinación de epítopes capaces de invocar una respuesta inmune. El epítope puede ser específico de célula T o específico de célula B. en este contexto, el epítope se construye como cualquier polipéptido, péptido, polipéptido modificado, péptido modificado (por ejemplo la modificación puede ser típicamente por glucosilación o fosforilación del epítope). Típicamente, la invención abarca epítopes derivados de moléculas porcinas que se han seleccionado a partir de al menos uno de: CD40; B7.1 ; B7.2; VCAM. Será evidente para un experto en la técnica que la invención provee medios para inmunizar un individuo, idealmente antes del xenotransplante, con un inmunógeno a una parte de la molécula porcina que contiene un epítope de la célula B no presente en el polipéptido de mamífero homólogo para asegurar la producción selectiva de anticuerpos del polipéptido porcino sin el desarrollo de anticuerpos al equivalente funcional del propio paciente y sin el desarrollo de las respuestas de la célula CD4 T evitando por lo tanto el rechazo mediado por la célula. Además el inmunógeno provee anticuerpos de bloqueo generados por el receptor que evitan la actividad de los polipéptidos porcinos que median una respuesta de rechazo. Será aún evidente para un experto en la técnica que la invención tiene ventajas significativas sobre las técnicas antecedentes para inmunosuprimir un sistema inmune del receptor para tejidos/células porcinos. Por ejemplo, WO 97119971 describe el uso de B7.2 o de polipéptidos VCAM para producir anticuerpos diagnósticos y terapéuticos para monitorear el rechazo de transplante y para bloquear el rechazo del xenotransplante. Esto tiene desventajas significativas. El tratamiento de un paciente a ser transplantado con un anticuerpo para, por ejemplo VCAM o B7.2, requiere la administración periódica a través de la vida del paciente para mantener el bloqueo de las propiedades del anticuerpo. Además, el sistema inmune generará finalmente anticuerpos a los anticuerpos terapéuticos (anticuerpos anti-idiotípicos) resultando en su remoción a partir de la circulación del paciente. La presente invención no requiere administración periódica puesto que es el sistema inmune propio del paciente el que es responsable para la producción del bloqueo de anticuerpos para polipéptidos porcinos. El sistema inmune no reconocerá estos anticuerpos como extraños y por lo tanto no resultará en la producción de anticuerpos anti-idiotípico. La presente invención implica el uso de un epítope de las células T extraña para ejercer influencia significativa sobre las respuestas subsecuentes a moléculas conjugadas con ei vehículo. Por dichos medios las respuestas de autoanticuerpo pueden dirigirse en contra de polipéptidos porcinos en un contexto de xenotransplantes. De acuerdo con la presente invención se provee un método para mejorar la tolerancia de un animal, incluyendo un ser humano, a un xenoinjerto, el animal teniendo la inmunidad mediada por las células T, el método comprendiendo el causar al animal que genere un anticuerpo en contra de una xenomolécula implicada en la generación de una respuesta de rechazo en el animal, dicho anticuerpo se genera al inmunizar el animal con un péptido quimérico que comprende un epítope de las células T en contra de la cual el animal tiene inmunidad y un epítope de las células B de dicha xenomolécula. De conformidad, la tolerancia específica para el xenoinjerto se induce en receptores transplantados al dirigir la respuesta directa mediada por las células T mediante el uso de péptidos quiméricos construidos para estimular la generación de anticuerpos que promueven la tolerancia anti-implante específica por el receptor antes del transplante. A manera de ejemplo, los péptidos quiméricos comprenden un epítope de las células T conjugado a secuencias de polipéptidos porcinos, B7-1 , B7-2, CD40, VCAM. La presencia del tejido implantado servirá para mantener y perpetuar la producción de anticuerpos por las células B del receptor. La presente invención también provee un péptido quimérico que comprende un epítope de las células T y un epítope de las células B, dichas células T siendo las de un animal, incluyendo un ser humano de una primera especie y dicha célula B siendo de un animal de una segunda especie, dichas primera y segunda especies tales para xenotransplantes son adecuadas a partir de un animal de dicha segunda especie para un animal de dicha primera especie. Además, la presente invención provee el uso de un péptido quimérico que mejora la tolerancia de un animal, incluyendo un ser humano, a un xenoinjerto, el péptido quimérico siendo como se definió anteriormente. De conformidad con un aspecto adicional de la invención dicha composición inmunogénica comprende al menos un epítope de células T y al menos un epítope de células B caracterizado porque dicho epítope de células B deriva a de un polipéptido porcino implicado para mediar el rechazo de xenoinjerto de dicho epítope de células T derivado a partir de una molécula a la cual el receptor es altamente inmune. En otra modalidad preferida de la invención, dicha composición inmunogénica comprende al menos un antígeno peptídico derivado a de al menos uno de: CD40; VCAM; CD86; CD80 de porcino. Preferiblemente dicho antígeno peptídico deriva del CD40 de porcino. Idealmente dicho péptido deriva del dominio amino terminal de CD40 de porcino, o al menos esa parte del dominio amino terminal que esta expuesta en la superficie celular de una célula porcina que presenta CD40. Más idealmente aún dicho antígeno peptídico se selecciona de la secuencia peptídica presentada en la SEQ ID. NO: 16. Preferiblemente dicho antígeno peptídico deriva del porcino VCAM. Idealmente dicho péptido deriva del dominio amino terminal de VCAM porcino, o al menos esa parte del dominio amino terminal que esta expuesta en la superficie celular de una célula porcina que presenta VCAM. Más idealmente aún dicho antígeno peptídico se selecciona de la secuencia peptídica presentada en la SEQ ID. NO: 17. Preferiblemente dicho antígeno peptídico deriva del porcino CD86. Idealmente dicho péptido deriva del dominio amino terminal de CD86 porcino, o al menos esa parte del dominio amino terminal que esta expuesta en la superficie celular de una célula porcina que presenta CD86. Más idealmente aún un dicho antígeno peptídico se selecciona de la secuencia peptídica presentada en la SEQ ID. NO: 14. Preferiblemente, dicho antígeno peptídico comprende al menos 9 residuos de aminoácidos. Más idealmente, dicho péptido comprende 10-30 residuos de aminoácidos. De acuerdo con el aspecto adicional de la invención, se provee una composición inmunogénica de conformidad con cualquier aspecto previo o modalidad de la invención en donde dicha composición además comprende al menos un agente capaz de mejorar la respuesta inmune a dicha composición inmunogénica. En una modalidad preferida de la invención dicho agente es un vehículo/adyuvante. Es bien conocido en la técnica que los vehículos/adyuvantes son útiles para promover la respuesta inmune a antígenos selectos. Estos adyuvantes son ya sea entrecruzados o acoplados al antígeno o coadministrados al animal con el antígeno. Los adyuvantes útiles para promover la respuesta inmune se detallan en Vaccine Design: The subunit and Adyuvant Approach Capítulo 7, p141-228, Plenum Press, New York, 1995. Varios vehículos, excipientes o diluyentes están disponibles en los cuales dicha composición inmunogénica puede almacenarse y/o administrarse. Por ejemplo, y no a manera de limitación, la encapsulación de las composiciones inmunogénicas en liposomas es una práctica convencional. Los liposomas son vesículas basadas en fosfolípidos que son útiles como agentes vehículos para las composiciones inmunogénicas y similares. De acuerdo con incluso otro aspecto adicional de la invención se provee un anticuerpo, o al menos la parte efectiva del mismo, dirigido al menos una región o al menos a un polipéptido de porcino de conformidad con la invención. En una modalidad preferida de la invención dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, o al menos la parte efectiva del mismo. Idealmente dicho anticuerpo está marcado. Será aparente a un experto en la técnica que los anticuerpos de conformidad con la invención serán útiles con respecto al monitoreo de la expresión de los polipéptidos porcinos presentes en los tejidos/órganos porcinos. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se provee un método para monitorear el estado inmune de un receptor mamífero de un xenoinjerto. Preferiblemente dicho método de monitoreo es in vitro. De conformidad con otro aspecto adicional de la invención se provee un método para mejorar la tolerancia de un animal a un xenoinjerto que comprende: i) administrar al menos una composición inmunogénica de conformidad con cualquier aspecto previo o modalidad de la invención a un animal; opcionalmente ii) monitorear el estado inmune de dicho animal a dicha composición inmunogénica; iii) transpiantar al menos un tejido/órgano porcino dentro de dicho animal; y, opcionalmente iv) monitorear el animal para una respuesta de rechazo a dicho tejido/órgano porcino. En un método preferido de la invención dicho animal es humano. En un método preferido adicional de la invención dicho xenoinjerto es cualquier implante vascularizado y/o célula/tejido inmunogénico. En un método preferido adicional de la invención dicho xenoinjerto son islotes pancreáticos de porcino. Será evidente para un experto en la técnica que (ii) lo anterior puede conducirse ya sea al monitorear la presencia de anticuerpos a moléculas o estimulantes en suero (por ejemplo por FACS o por análisis de ELISA de células que expresan dichas moléculas o estimulantes), o alternativamente, o en adición monitorear la presencia de las células T citolíticas en la sangre de los animales tratados por los ensayos de lisis de células T convencionales. Los beneficios potenciales del uso de un péptido quimérico de la invención son que ésta evita la necesidad para inyección de anticuerpos que bloquean o proteínas de fusión. Además, la inducción de una respuesta de anticuerpo del receptor evita los problemas más comunes y asociados con la administración de anticuerpos xenogénicos de proteínas de fusión, principalmente la respuesta inmune en contra del reactivo administrado. Una modalidad de la invención ahora se describirá, por ejemplo solamente y con referencia a los siguientes cuadro y figuras; El cuadro 1 representa las regiones de no homología en CD40 humano con respecto a CD40 homólogo porcino; El cuadro 2 representa las regiones de no homología en VCAM humano con respecto a VCAM homólogo porcino; El cuadro 3 representa las regiones de no homología en CD86 humano con respecto a CD86 homólogo porcino; La figura 1a es una representación diagramática del xenoreconocimiento directo y la figura 1 b es una representación diagramática del xenoreconocimiento indirecto; La figura 2 representa la secuencia de ácido nucleico de CD86 de porcino; La figura 3 representa la secuencia de ADNc de CD86 porcino obtenida por transcripción reversa de ARNm de porcino seguido por amplificación mediante PCR; La figura 4 representa una comparación de la secuencia nucleotídica del ADNc en la figura 2 con la secuencia CD86 de porcino publicada; La figura 5 representa una comparación de la secuencia de ADNc en la figura 2 con las secuencias publicadas murino y humano; La figura 6 representa la secuencia de aminoácidos traducidos del ADNc en la figura 2 en comparación con las secuencias de aminoácidos porcinos, humanos y murino; La figura 7 representa la oosición de los iniciadores oligonucleótidos de B7.1 de porcino con respecto a las secuencias de ácido nucleico de B7.1 de humano y murino; La figura 8a representa una comparación de las secuencias de ácido nucleico de CD40 de humano, murino y bovino; la figura 8b representa una comparación de las secuencias de aminoácidos de CD40 de humano, murino y bovino; La figura 9 representa el análisis de FACS de la expresión de CD86 (B7.2) después de la transfección con un vector que codifica CD86 (B7.2) de porcino; La figura 10 representa el análisis FACS de la expresión de CD86 (B7.2) mediante células transitoriamente transfectadas con un vector que codifica CD86 (B7.2) de porcino; La figura 11 representa el análisis de citometría de flujo de las células transfectadas con CD 86(B7.2) de porcino; La figura 12 representa la posición de nueve péptidos derivados de CD 86(B 7.2) en la secuencia CD 86(B 7.2) de porcino; La figura 13 representa una comparación de la proliferación de las células T en respuesta a la ovoalbúmina completa o al péptido de ovoalbúmina Ova323-339; La figura 14a representa la unión diferencial de los péptidos específicos de B7.2 de suero o de suero control de ovoalbúmina mediante ELISA para péptidos; La figura 14b representa el reconocimiento in vitro de ios péptidos 4 y 6 derivados de B7.2 mediante suero inmunizado de ratón con los péptidos 4 ó 6; La figura 15a representa el reconocimiento in vitro del suero peptídico B7.2 y del suero peptídico control ova mediante ELISA para péptidos; La figura 15b representa la inhibición de las respuestas de la célula T dirigida a ratón antiporcina mediante el suero de los péptidos 4 y 6 el cual tampoco muestra inhibición de la coestimulación por CD86 murino; La figura 16 representa la unión diferencial del péptido 4 de suero derivado de B7.2 o el péptido control de suero ova mediante ELISA para péptidos; La figura 17a representa un análisis de citometría de flujo de las células P815 transfectadas con CD86 porcino siguiendo a la tinción con suero a partir del péptido 4 o el control a partir del suero peptídico ova; La figura 17b representa el análisis de las células FACS transfectadas con P815 de porcino o células CD86 transfectadas con CHO murino siguiendo la tinción con suero a partir del suero de ratón derivado del péptido 4 o del péptido 6; La figura 18 representa una preparación de las isletas pancreáticas porcinas aisladas a partir de un cerdo grande blanco; La figura 19 es una representación esquemática de la inmunización del péptido quimérico y del protocolo de transplante; La figura 20 muestra que un antisuero CD86 antiporcino prolonga la supervivencia de los islotes pancreáticos porcinos transplantados; La figura 21 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de CD40 de porcino y de humano (la secuencias subrayadas son péptidos identificados en el cuadro 1 ); La figura 22 es la secuencia de aminoácidos traducidos por CD40 de porcino (la secuencias subrayadas son péptidos identificados en el cuadro 1 ); La figura 23 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de VCAM de porcino y humano (las secuencias subrayadas son péptidos identificados en el cuadro 2); La figura 24 es la secuencia de aminoácidos traducidos por VCAM de porcino (las secuencias subrayadas son péptidos identificados en el cuadro 2); La figura 25 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de CD86 de porcino y humano (las secuencias subrayadas son péptidos identificados en el cuadro 3); y La figura 26 es la secuencia de aminoácidos traducida de CD86 de humano (las secuencias subrayadas son péptidos identificados en el cuadro 3).

. MODALIDADES ESPECIFICAS 5.1 Clonación de moléculas co-estimulantes porcinas 5.1.1 Clonación de B7-2 porcino El ARN se extrajo de células porcinas primarias y transformadas usando un protocolo estándar, el ARNm fue entonces retrotranscrito y el B7-2 (poB7-2) porcino se amplificó a partir del ADNc por 35 ciclos de PCR a 56°C con magnesio 1.5 mM. Los iniciadores 5' y 3' GCATGGATCCATGGGACTGAGTAACATTCTCTTTG y GCATGTCGACTTAAAAATCTGTAGTACTGTTGTC respectivamente se diseñaron con base en la secuencia publicada poB7-2 (60) para extenderse sobre los codones de inicio y de paro (figura 2). Un fragmento de 956 pares de bases se generó y sé subclonó dentro del sitio de restricción BamHI y Salí de pbluescript. La secuencia nucleotídica se determinó usando los iniciadores estándar hacia delante m13 y reversos. La secuencia de una sola clona, CD86(i) se ilustra en la figura 3, con comparación a la secuencia publicada de B7- de porcino (figura 4), de humano y murino (figura 5). Una diferencia en los pares de bases se detectó entre la clona, CD86(i) y la secuencia publicada en el extremo del iniciador 3'. Sin embargo, ésta es una diferencia probablemente poco importante con respecto ya sea a la expresión de poB7-2 o a la unión al ligando. La secuencia de aminoácidos pronosticada de CD86(i), se compara a la de B7-2 de porcino, humano y ratón y se muestra en la figura 6. .1.2 Clonación de B7-1 y CD40 de porcino El ARN se extrajo de la fitohemagiutinina (PHA) o del estimulante porcino (PMW) del mitogéno de la fitolaca PBMC y las células endoteliales porcinas transformadas se usaron para amplificar el ADNc que codifica las moléculas B7-1 y CD40 coestimulantes. Los iniciadores de B7-1 se diseñaron con base en las áreas conservadas siguiendo a la comparación de la secuencias murinas y humanas (29,49). Los iniciadores externos (que se sobreponen fuera de la región de codificación) AGACCGTCTTCCTTTAG (3'i), TTGGATCCTCCATGTTATCCC (3'ii) y AGCATCTGAAGC (5') y el interno (dentro de la región codificante) ATGGATCCTCCATTTTCCAACC (3') Y TTGTCGACATCTACTGGC (5') habían sido diseñados y demostrados en la figura 7. La generación de los dos iniciadores 3' se debe a diferencias importantes entre la secuencia de humano y murino en las regiones de codificación terminal. Los fragmentos de PCR resultantes serán subclonados como se describió anteriormente usando los sitios de restricción BamHI y Salí contenidos dentro de la secuencia promotora. Las construcciones se enviarán para confirmación de secuencia. Los iniciadores CD40 se diseñaron de manera similar siguiendo el alineamiento de la secuencia de la secuencia CD40 publicada para humano, ratones y ganado (73,74,75) como se ilustra en las figuras 8A y B. La secuencia de iniciadores 5' y 3' son GGATCCTCACTGTCTCTCCTGCACTGAGATGCGACTCTCCTCTTTGCCGT CCGTCCTCC y GAATTCATGGTTCTGTTGCCTCTGCAGTG respectivamente conteniendo los sitios de restricción BamHI y EcoRI. 5.2 Generación de células transfectadas gue expresan moléculas coestimulantes porcinas La molécula poB7-2 (CD869(i) ha sido subclonada dentro del vector de expresión eucarionte pci.neo que lleva el marcador de selección de fármaco neomicina. Este se ha usado para transfectar las líneas celulares de murino transformadas M1 y M1.DR1 usando un método de precipitación de fosfato de calcio estándar. Las células que expresan pci.neo resistentes a dynabead se seleccionaran usando la purificación por G418 y las clonas de alta expresión se seleccionan mediante dilución limitante. Los transfectantes estables poB7-2 M1 y P815 se han generado mediante este método usando las construcciones poB7-2 DNA suplementadas por Maher et al (figura 9). Las transfecciones transitorias de las células M1 y P815 han sido generadas usando la construcción CD86(i) (figura 10). Tres ensayos particulares se hicieron usando las células transfectadas CD86(i). (I) función coestimulante comparativa de poB7-2 con B7-1 de humano en el contexto de la restricción MHC; (II) análisis de citometría de flujo del anticuerpo específico anti-poB7-2 en el suero de ratones inmunizados; y (lll) generación de anticuerpos monoclonales específicos anti-poB7-2. (I) análisis comparativo in vitro llevado a cabo para determinar la función coestimulante de poB7-2 o poB7-1 en el contexto de la molécula HLA-DR1 MHC II humano de la clase, con la de humano B7-1 o B7-2 en el contexto de DRI, en ensayos de proliferación con elementos de respuesta humanos o porcinos. (II) las células P815 transfectadas son reactivos cruciales para la detección del anticuerpo anti-B7-2 porcino en el suero de ratones inmunizados que han llevado a cabo el régimen de inmunización con péptido quimérico. Los análisis de citometría de flujo con las células poB7-2 transfectadas con p815 o control, reflejan la especificidad del suero para B7-2. Los estudios preliminares con ratones inmunizados con C57BL-6 con un grupo de nueve péptidos B7-2 demostraron la unión preferencial del suero al péptido B7-2 de las células P815 transfectadas con B7-2 porcinas (figura 11 a y 11 b). (III) Mab con especificidad para poB7-2 se genera mediante inmunización de ratones Balb/c con células P815 que expresan poB7-2. Los bazos de ratones inmunizados se fusionaron con el patrón de fusión NSO y se seleccionó la fusión exitosa en virtud de la selección HAT. La tinción de citometría de flujo de los transfectantes poB7-2 P815 con los sobrenadante de cultivo capacitaron la identificación de las células que secretan Mab. Las células se crecen en cultivo y el medio se cosecha para purificación de anticuerpos al pasarlos sobre una columna de precipitación de sulfato de amonio mediante proteínas G. Las técnicas para la preparación de anticuerpos monoclonales son bien conocidas en la técnica y con referencia a ias publicaciones tales como Harlow and Lañe Antibodies; A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratories. Los Mab con especificidad para B7-1 y CD40 se generaron usando el mismo protocolo. Estos Mab proveerán reactivos valiosos para caracterización adicional de la expresión de las moléculas CS sobre tejidos porcinos relevantes. .3 Diseño y síntesis de construcciones peptídicas Quiméricas B7-2/OVA Nueve péptidos diferentes derivados de la secuencia de poB7-2 se seleccionaron inicialmente para síntesis. Los péptidos B7-2 porcino, 6-22mer de tamaño, se seleccionaron y determinaron por el tamaño pronosticado en un epítope de la célula B. Los péptidos se seleccionaron para síntesis en combinación con un epítope de la célula T OVA 323-339. Los péptidos B7-2 se seleccionaron con base en el modelo 3D de computadora (en colaboración con Paul Travers) y con base en la antigenicidad pronosticada e hidrofilicidad usando el paquete de software SeqAid II para computadora. Los nueve péptidos reflejaron epitopes lineales. Se indican las posiciones de los nueve péptidos en la secuencia clonada poB7-2 (figura 12). La secuencia peptídica sintética se detalla en el cuadro 1.

CUADRO 1 La secuencia peptídica y las posiciones de aminoácidos para los péptidos 1-10 se refiere a la posición de la secuencia peptídica de B7-2 con B7-2 porcino. La posición de aminoácidos para la secuencia ova solamente se indica para el péptido Ova. Un péptido de 17 aminoácidos a partir de la albúmina de huevo de pollo (ovoalbúmina) se seleccionó como el epítope de las células T, OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR). Este epítope se seleccionó con base en los reportes publicados para la generación de la respuesta de las células T restringida a H-2b (76.77). Los inventores han demostrado la capacidad del ratón C57BL-6 (haplotipo H-2b) para montar una respuesta proliferativa tanto de la molécula nativa y para el péptido OVA 323- 339 siguiendo a la inmunización con ovoalbúmina completa (figura 13). Los péptidos se generaron en un sintetizador peptídico (Genosys) y los péptidos crudos se purificaron por CLAR mayor a 70% de pureza. El suero de los ratones inmunizados control de OVA idealmente no debería reconocer la secuencia 323-339, indicando que el epítope de células T carece de determinantes de células T. .4 Inducción de la tolerancia 5.4.1 Estrategia de inducción de tolerancia in vivo Los ratones C57BL-6 son inmunizados con ovoalbúmina completa en CFA, seguida por ya sea el péptido control (péptido OVA) o los péptidos CS (construcciones OVA-B7-2) para tres inmunizaciones semanales. La sangre se colecta siguiendo al sacrificio y el suero se prepara usando una técnica estándar. La presencia de IgG específica para ratón anti B7-2 de porcino y/o Ab IgM se detecta por una de dos estrategias. Se usa ELISA para péptidos con el fin de seleccionar la presencia de anticuerpos antipéptidos en el suero. Los péptidos se aplican a placas en virtud de uniones aldehido para permitir el libre acceso de Ab al péptido (78). Las placas se cubren con péptidos individuales o con el péptido control ova para capacitar la identificación de los péptidos específicos de interés. Para detectar radioactividad del suero con la molécula B7-2 nativa expresada sobre la superficie de las células P815 transfectadas con PoB7-2, la citometría del flujo se lleva a cabo siguiendo a la tinción superficial. Habiendo identificado el péptido CS de interés (péptido positivo a ELISA y B7-2 nativa reconocida) el suero se usa para inhibir la respuesta proliferativa de la célula T in vitro. Esto determina si el anticuerpo es un anticuerpo de bloqueo. i Los estudios in vivo se llevan a cabo usando el sistema de transplante de isletas. Los anticuerpos que reconocen la molécula nativa pero que fallan al bloquear una respuesta proliferativa son reactivos de anticuerpos policlonales útiles. En las inmunizaciones se implica a los dos grupos de ratones, uno recibiendo un juego de los nueve péptidos B7-2, y el otro recibiendo el péptido control ova. El suero cosechado se seleccionó por ELISA para péptidos (figura 14a ó 14b) la cual capacita la identificación de los péptidos de interés. El antisuero a los péptidos 2, 4 y 6 claramente demuestra la unión preferencial del péptido B7 en lugar del control ova. El suero tiene que demostrar unión mejorada a células transfectadas con poB7-2 (figura 11 ). Los péptidos 4 y 6 se seleccionaron como péptidos candidatos y se usaron en protocolos subsecuentes de inmunización. La inmunización con el péptido 4 ó 6 claramente produjo un nivel significante de IgG con especificidad para los péptido 4 y 6 en el suero de ratones inmunizados (15a y 15b). La especificidad del suero para el péptido 4 y no para el control ova se demuestra en la figura 16. La capacidad del suero a partir de los ratones inmunizados con el péptido 4 y 6 para reconocer específicamente las moléculas B7-2 nativas porcinas expresadas sobre la superficie de las células P815 transfectadas con B7-2 porcino se ilustra en la figura 17a y 18b. Las células P815 control no transfectadas no se tiñen con el suero del péptido 4 ó 6, ni con el control con las células transfectadas incubadas con el suero peptídico ova. Protocolos similares se seguirán con el péptido 2. Estos datos claramente demuestran la capacidad de esta técnica para generar anticuerpos anti-péptido dirigidos en contra de una secuencia de aminoácidos, en virtud de un epítope de célula T acarreadora. Una estrategia idéntica se seguirá con los péptidos diseñados con base en el CD40 de porcino y en el B7-1 de porcino una vez que la secuencia de ADN que codifica estas moléculas sea elucidada. .4.2 Evaluación funcional; prolongación de la supervivencia de los xenoinjertos de islotes pancreáticos Los xenoinjertos de islotes que no son vasculares se rechazan solamente por mecanismos mediados por las células T (79,80), en donde se provee un sistema ideal para estudiar la modulación de las reacciones mediadas por las células T, por favor ver figura 18. Un papel muy claro para el rechazo mediado por las células de los islotes se ha demostrado y se reporta que es mayor que la alorespuesta comparable (80). El transplante de las islotes pancreáticos porcinos es un procedimiento establecido, el cual está bien documentado en la literatura (80, 83). Los estudios dentro del laboratorio de los inventores han demostrado una disminución de la hiperglucemia (figura 18) siguiendo al transplante de islotes pancreáticos a partir de cerdos blancos grandes bajo la cápsula renal de ratones C57BL-6 que se vuelven diabéticos por administración intraperitoneal de estreptozotocina (por favor ver figura 19 y 20). La optimización adicional del procedimiento de aislamiento (84,85) se requiere para capacitar la purificación de isletos funcionales completamente.

Los islotes transplantados usualmente sobreviven entre 6-10 días en la ausencia de cualquier inmunosupresor. La modulación exitosa del xenorechazo directo mediado por la célula T será monitoreado por la prolongación de la supervivencia de los islotes más allá del día 10, en comparación con los controles apropiados. Los resultados obtenidos con B7-2 hasta la fecha, demuestran la capacidad de los péptidos B7-2 sintéticos conjugados a un epítope de la célula T de ayuda conocida para generar la producción de un anticuerpo anti B7-2 porcino in vivo. Estos anticuerpos si se dirigen hacia el sitio de unión entre las isoformas B7 y CD28, en asociación con los anticuerpos dirigidos en contra de CD40-CD40L bloquearán la coestimulación de las células T humanas con la xenoreactividad anti-cerdo dirigida mediante la prolongación de la supervivencia de las islotes en un contexto de xenotransplante. Habiendo establecido la adecuación de dicho método en un islote de cerdo a un modelo de ratón in vivo, los estudios progresarían a sistemas de transplante de cerdo a primate antes de los ensayos clínicos. .5 Adaptación del uso clínico de estas estrategias Para la aplicación clínica los siguientes requerimientos son necesarios: (I) selección de una epítope de una célula T adecuada para reemplazar OVA. Una molécula candidato es toxoide tetánico (TT) el cual es un antígeno ampliamente usado para uso en estrategias en inmunización humana (68, 86). Las inmunizaciones anteriores a la mayoría de los adultos con TT es un beneficio adicional a esta estrategia como memoria de las células T y fácilmente se presenta en la circulación, (ii) Un método eficiente y rápido para seleccionar se usa para detectar la presencia de anticuerpos anti B7-2 donador (cerdo) en la ausencia de una respuesta de las células T dirigidas contra B7-2 específico generada por el receptor el cual puede acelerar el rechazo del implante. 6.- RESUMEN DE LAS MODALIDADES ESPECIFICAS Los ejemplos anteriores se refieren a una estrategia novedosa para inhibir la coestimulación por células porcinas de células T humanas que dirigen la xenoreactividad anti-cerdo. Esta es de particular importancia en el contexto de los xenotransplantes de órganos porcinos debido a la expresión de moléculas coestimulantes sobre células endoteliales porcinas, así como en células presentadoras del antígeno derivadas de la médula ósea. Los receptores se inmunizan con péptidos sintéticos híbridos que comprenden un epítope de la célula T conjugado con secuencias de moléculas coestimulantes porcinas, CD80, CD86 y CD40. Los péptidos que inducen los péptidos específicos para las regiones de las moléculas coestimulantes implicadas en la unión a sus receptores contrarios en las células humanas (CD28 y CD154) son por lo tanto capaces de bloquear la administración de coestimulación. Una vez que se ha inducido la respuesta de anticuerpos, el órgano transplantado llamará a su respuesta debido a la expresión de las moléculas coestimulantes, sosteniendo así esta respuesta, y proveyendo un mecanismo endógeno de bloqueo coestimulante. 7.- BIBLIOGRAFÍA 1.- Dorling, A. et al. Clinical Xenotransplantation. Lancet. (1997). 349:867-71. 2.- Cooper, D.K.C. Xenografting: how great is the clinical need. Xeno. (1995). 1 :25-26 3.- Advisory Group on the Ethics of Xenotransplantation. Animal Tissue into Humans. 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CD86 (B7-2) Las secuencias de la proteína CD86 humana y porcina se alinean y las regiones de no homología se identifican. Los inventores pronostican que la secuencias peptídicas derivarán a partir de aquellas regiones listadas a continuación o a partir de cualquier región que se sobrepongan entre cualquiera de estos péptidos. Las secuencias pronosticadas de interés para que contengan epítopes de anticuerpos potenciales se han seleccionado con base en menos de 75% de identidad de secuencia.

Región Posición % de identidad de secuencia 18-42 72% 55-73 55% 101-127 63% v 136-165 56% Las regiones (¡ii) y (iv) abarcan aquellas que contienen las secuencias de los péptidos 4 y 6 identificadas en los ratones.

CD40 Las secuencias de la proteína CD40 humana y porcina se alinean y las regiones de no homología se identifican. Los inventores pronostican que las secuencias peptídicas derivarán a partir de aquellas regiones listadas a continuación o a partir de cualquier región que se sobrepongan entre cualquiera de estos péptidos. Las secuencias pronosticadas de interés para que contengan epítopes de anticuerpos potenciales se han seleccionado con base en menos de 75% de identidad de secuencia.

Región Posición % de identidad de secuencia 25-48 63% 49-75 74% ll 93-114 59% V 123-139 63% V 158-176 68% vi 208-227 45% vii 231-248 21 % VCAM-1 Las secuencias de la proteína VCAM-1 humana y porcina se alinean y las regiones de no-homología se identifican. Los inventores pronostican que las secuencias peptídicas derivarán a partir de aquellas regiones listadas a continuación o a partir de cualquier región que se sobrepongan entre cualquiera de estos péptidos. Las secuencias pronosticadas de interés para que contengan epítopes de anticuerpos potenciales se han seleccionado con base en menos de 75% de identidad de secuencia.

Región Posición % de identidad de secuencia 1-15 44% 16-33 63% II 49-65 58% v 74-85 42% v 100-117 50% vi 122-140 56% vii 144-157 64% viii 162-191 47% ix 209-221 62% X 290-301 67% xi 322-342 62% xii 362-379 67% xiii 448-465 67%

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de: i) un epítope de la célula T; y ii) un epítope de la célula B para preparar una composición inmunogénica para mejorar la tolerancia de un xenoinjerto en un mamífero, en donde el epítope de la célula B es un polipéptido porcino que tiene al menos 75% de identidad de secuencia a la región correspondiente del polipéptido humano equivalente.

2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho epítope de la célula B es un péptido derivado de al menos un polipéptido porcino seleccionado de CD40, CD80, CD86 o VCAM.

3.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho péptido se selecciona de al menos un péptido representado para la SEQ ID. NO: 16.

4.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el péptido se selecciona de al menos un péptido representado para la SEQ ID. NO: 17.

5.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el péptido se selecciona de al menos un péptido representado SEQ ID. NO: 14.

6.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el epítope de la célula T se deriva a partir del polipéptido de toxoide tetánico.

7.- Una composición que comprende un inmunógeno caracterizado porque el inmunógeno tiene al menos un epítope de la célula T y un epítope de la célula B en donde el epítope de la célula B se deriva a partir de una región de un polipéptido porcino que tiene menos de 75% de identidad de secuencia a la región correspondiente del polipéptido humano equivalente.

8.- Una composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el polipéptido porcino se expresa por células endoteliales vasculares de dicho xenoinjerto.

9.- Una composición de conformidad con la reivindicación 7 ú 8, caracterizada además porque el epítope de la célula B se deriva de al menos un polipéptido porcino seleccionado de; CD40; CD86; CD80; VCAM.

10.- Una composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el epítope de la célula B se selecciona de al menos un epítope como el representado para la SEQ ID. NO: 16.

11.- Una composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el epítope de la célula B se selecciona de al menos un epítope como el representado en la SEQ ID. NO: 17.

12.- Una composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el epítope de la célula B se selecciona de al menos un epítope como el representado en la SEQ ID. NO: 14.

13.- Una composición de conformidad con la reivindicación 9 ó 12, caractepzada además porque el epítope de la célula B se deriva del dominio extracelular de CD86.

14.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-13, caracterizada además porque el epítope de la célula T deriva de toxoide tetánico.

15.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-14, caracterizada además porque la composición comprende además un vehículo capaz de mejorar la respuesta inmune a dicho inmunógeno

16.- Un anticuerpo, o la parte efectiva del mismo, caracterizado porque dicho anticuerpo es capaz de unirse a una región de un polipéptido porcino que tiene menos de 75% de identidad de secuencia a la región correspondiente del polipéptido humano equivalente.

17.- Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal.

18.- Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado además porque el anticuerpo está modificado con al menos una marca detectable.

19.- Un método para monitorear el estado inmune de un mamífero receptor de un xenoinjerto que comprende: i) remover una muestra a partir de un receptor de xenotransplante a ser probado; ii) poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 16-18; y iii) monitorear la expresión del polipéptido porcino implicado en la mediación del rechazo del xenoinjerto.

20.- El uso de al menos un epítope de la célula B y al menos un epítope de la célula T, para preparar una composición inmunogénica para tratar un mamífero antes de recibir un xenoinjerto, en donde dicho epítope de célula B se deriva de al menos un polipéptido porcino implicado en la mediación del rechazo del xenoinjerto.

21.- El uso de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, en donde el xenoinjerto es de origen porcino y dicho mamífero es humano.

22.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , en donde el xenoinjerto es al menos un injerto vascularizado y/o célula/tejido porcino inmunogénico.

23.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en donde el xenoinjerto es islote pancreático.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho xenoinjerto es de origen porcino y dicho mamífero es humano.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho xenoinjerto es por lo menos un injerto vascularizado y/o célula/tejido inmunogénico porcino.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho xenoinjerto es islote pancreático.