CN1194016C - 新的人绒毛膜促性腺激素-促黄体素融合蛋白及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了绒毛膜促性腺激素与促黄体素的融合蛋白(hCG-LH融合蛋白),编码该融合蛋白的DNA序列,含该DNA序列的载体,含该载体的宿主细胞,用基因工程制备该融合蛋白的方法,以及含该融合蛋白的药物组合物。本发明的hCG-LH融合蛋白既具有hCG的抗原性,又具有LHα的免疫刺激活性,可以用于如癌症等疾病的治疗和抗生育。
Description
本发明涉及DNA重组技术和基因工程疫苗领域。更具体地,本发明涉及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,以下简称hCG)β亚基与非人哺乳动物的促黄体素(luteinizing hormone,以下简称LH)α亚基的融合蛋白,编码该融合蛋白的DNA序列,含该DNA序列的载体,含该载体的宿主细胞,用基因工程制备该融合蛋白的方法,以及该融合蛋白在如癌症等疾病治疗和抗生育中的应用。
恶性肿瘤(又称癌)的预防和治疗是当今世界性的难题之一。多年来,各国科学家都致力于研究开发安全有效而副作用小的癌症治疗手段来取代目前普遍采用的化学疗法或放射疗法。由于化疗或放疗在杀伤癌细胞的同时,正常细胞也会受到不同程度的损伤,从而引起较大的副反应,降低了病人的生活质量,也不利于康复。
近年来,国外有不少研究发现许多癌细胞也能表达hCG,并随着癌细胞的进一步增殖、扩散,其表达的hCG的量不断增加,在癌细胞发生转移时达到最高值。并在多种不同组织类型和来源的人癌细胞膜表面可检测到hCG、hCGβ亚基或其特异性的片段相关表位(决定簇),而在健康的非孕个体中则检测不出。Acevedo及其合作者从美国细胞库随机取癌细胞株,研究了52种癌,10种肉瘤,4种白血病,6种淋巴瘤和2种视网膜胚细胞瘤,发现所有的癌细胞都能分泌hCG或hCGβ、或hCGβ羧末端(CTP)、或hCGα抗原决定簇(Acevedo等,Cancer,1992,69:1829-1842)。一些生殖系统癌症病人的外周血淋巴细胞对hCGβ亚基具有特异的增殖反应。这些都提示hCGβ亚基是一种能诱发细胞介导的免疫反应的癌相关抗原。各种证据显示,hCG在细胞转化、肿瘤血管生成、肿瘤转移和免疫逃逸中起重要作用(F.Housseau等,Int.J.Cancer,1995,63:633-638;J.Mora,等,1996,British Journal of Cancer,74:1081-1084;PL.Triozzi和d VC.Stevens,1999,Oncology Reports,6:7-17)。以上研究结果为抗hCG疫苗用于治疗和预防癌症提供了科学依据。
hCG抗癌疫苗则是通过该疫苗刺激患者免疫系统,使其自身产生针对hCG的抗体,从而抑制癌细胞的生长,因此特异性强,不会影响正常细胞的生长,是一种理想的癌症治疗手段。
从理论上讲,所有癌症都能用抗hCG疫苗防治,因为所有的癌细胞都能分泌hCG,但目前首先选择的是发病率较高的前列腺癌、结直肠癌和胰腺癌。据统计,在导致男性死亡的癌症中,前列腺癌是主要死因之一(上海地区发病率为7.1/10万),而前列腺增生症被认为与前列腺癌的诱发有关。我国60岁以上男性中,43%患有阻塞性前列腺增生。目前我国人口已呈老龄化的趋势,前列腺癌的高发病率日益突出,但还没有好的前列腺癌早期诊断手段,一般发现时,已属中晚期。因此,hCG疫苗还可以用于预防前列腺癌。结直肠癌也是人群中最常见的消化道恶性肿瘤,上海地区男性发病率为16.3/10万,名列癌症第5位;女性发病率为13.8/10万,名列癌症第6位。其治疗以手术为主,但术后5年生成率仅在50%左右,约半数病例在术后5年会出现复发和转移。对失去手术机会或转移性结直肠癌患者,目前主要采用以5-氟尿嘧啶(5-FU)为主的化疗法,其副作用很大,对患者的健康带来极大影响。胰腺癌上海地区的发病率为10/10万,名列癌症第8位(Fan Jin,Int.J.Cancer,1999,83:435-440)。而hCG疫苗免疫已被证明能有效抑制癌细胞的转移、生长,且无明显的副作用,显示了它独特的优越性。
此外,膀胱癌、肺癌等大部分恶性肿瘤细胞也都能表达hCG,在进一步研究的基础上也可以用hCG疫苗进行防治。因此,hCG疫苗在恶性肿瘤的防治中有着十分广阔的应用前景,一旦被实际推广应用于相关恶性肿瘤的预防和临床治疗,对我们一个拥有13亿人口的大国来说,必将产生良好的经济效益和社会效应。
美国的AVI Biopharma(AVI)和Immunothreapy Corporation(ITC)公司用化学合成的hCGβ亚基羧端37肽与破伤风类毒素(TT)偶联组成的疫苗hCGβCTP37-TT治疗结直肠癌、前列腺癌和胰腺癌,并分别完成了II/III、II、III期临床试验,结果表明受试病人在注射疫苗后能产生抗hCG抗体,使癌细胞生长停滞或癌细胞坏死,从而使恶性肿瘤变小或消失(Medical/pharmaceutical:Industry[MEDICINE],1998)。目前只有用hCGβCTP37/TT治疗癌症的报道(PL.Triozzi和VC.Stevens,Oncology Reports,1999,6:7-17)。
此外,hCGβ与绵羊促黄体生成素α亚基(oLHα)经体外反应,相互间以非共价键相连后与TT和白喉类毒素(DT)偶联组成疫苗HSD/TT(DT),目前是用作抗生育疫苗,但也可能用作抗癌疫苗。它的抗原性远高于hCGβCTP37/TT(GP.Talwar,Immunology and Cell Biology,1997,75:184-189)。
这两种疫苗的抗原中:hCGβCTP37是化学合成的,成本较高,且组成的疫苗hCGβCTP37/TT的抗原性低于HSD/TT(DT);疫苗HSD/TT(DT)中的hCGβ和oLHα是从天然hCG和oLH经拆分而获得,不仅手续繁,质量难以控制,且十分昂贵。但目前不仅没有用HSD/TT(DT)疫苗治疗恶性肿瘤的报道,更没有用基因工程技术生产半抗原单链嵌合多肽hCGβ-oLHα的报道。
因此,本领域迫切需要开发新的用于治疗恶性肿瘤的药物(尤其是抗癌疫苗)和抗生育疫苗,以及低成本和高效的生产方法。
本发明的目的是提供一种用基因工程方法生产单链嵌合多肽,与载体蛋白偶联组成疫苗。疫苗用于治疗恶性肿瘤,疗效显著而无毒副作用。疫苗也可用于免疫育龄妇女,达到抗生育的作用,抗生育效率高而无副作用。
本发明的一个目的就是提供一种新的可用于治疗恶性肿瘤的药物(尤其是抗癌疫苗)和抗生育疫苗,它是hCG-β和LHα的融合蛋白。
本发明的另一目的是提供编码所述融合蛋白的DNA、含该DNA序列的载体,含该载体的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供一种成本低廉和/或步骤简便的生产所述hCGβ-LHα融合蛋白的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,它包括:人绒毛膜促性腺激素β亚基的氨基酸序列、非人哺乳动物促黄体素α亚基的氨基酸序列、以及位于所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的氨基酸序列和所述促黄体素α亚基氨基酸序列之间的0-20个氨基酸的连接肽序列。较佳地,所述的接头序列含3-10个氨基酸。更佳地,所述的融合蛋白包括SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的DNA分子,它编码本发明的上述融合蛋白。更佳地,所述的DNA分子包括SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。
在本发明第三方面,提供了含有上述DNA分子的载体,以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了一种药物组合物,它包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂,以及有效量的本发明的融合蛋白。
在本发明的第五方面,提供了一种产生本发明的融合蛋白的方法,它包括步骤:
在适合表达所述融合蛋白的条件下,培养上述的宿主细胞,或者培养含所述宿主细胞的动物,从而表达出所述的融合蛋白;和
分离所述的融合蛋白。
在本发明的第六方面,提供了一种疫苗,它含有本发明所述的融合蛋白或编码DNA分子。
在本发明的第七方面,提供了一种抗体,它特异性地结合于本发明的融合蛋白。
附图说明:
图1显示了用PCR法获得hCGβ-oLHα融合蛋白的cDNA序列的流程图。
图2显示了hCGβ和oLHα序列的接头处的DNA序列。
图3是质粒pSV2-dhfr/hCGβ-oLHα的结构图。
图4显示了三株不同的细胞在不同的MTX浓度下的表达量。
图5是质粒pVL1393/hCGβ-oLHα的结构图。
图6显示了对hCGβ-oLHα融合蛋白表达产物的SDS-PAGE银染和Western印迹分析鉴定结果。
图7显示了酵母表达质粒pPIC9K/hCGβ-oLHα的构建过程。
图8显示了对hCGβ-oLHα融合蛋白进行竞争抑制结合试验的结果。
图9显示了本发明一种hCGβ-oLHα融合蛋白的氨基酸序列和DNA序列。其中,带下划线的部分为信号肽。
定义
如本文所用,术语“绒毛膜促性腺激素和促黄体素的融合蛋白”、“hCG-LH融合蛋白”等可互换使用,都指由人绒毛膜促性腺激素β亚基的氨基酸序列和非人哺乳动物促黄体素α亚基氨基酸序列融合而成的蛋白,其中在两者之间可以有或者没有连接肽序列。此外,绒毛膜促性腺激素和促黄体素的融合蛋白包括含有或不含有信号肽,以及含有或不含有起始甲硫氨酸的融合蛋白。
如本文所用,术语融合蛋白中“人绒毛膜促性腺激素氨基酸序列”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列,该序列与天然的或变异的人绒毛膜促性腺激素具有基本上相同的氨基酸序列,并且具有与天然人绒毛膜促性腺激素基本上相同的抗原活性。优选的人绒毛膜促性腺激素氨基酸序列包括:天然的人绒毛膜促性腺激素β亚基的氨基酸序列。另一种优选的绒毛膜促性腺激素氨基酸序列形式是在羧基端额外添加有1-4个hCGβCTP37(即绒毛膜促性腺激素羧基端的37肽片段)的氨基酸序列。
如本文所用,术语融合蛋白中“促黄体素氨基酸序列”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列,该序列与天然的或变异的非人哺乳动物的促黄体素具有基本上相同的氨基酸序列,并且具有与天然促黄体素基本上相同的免疫刺激活性。优选的促黄体素氨基酸序列是选自下列动物的天然促黄体素序列:羊、牛、兔、猪。
绒毛膜促性腺激素氨基酸序列和促黄体素氨基酸序列的连接方式没有特别限制,可以头头相连、头尾相连、或尾尾相连。
如本文所用,术语“连接肽”(linker)指位于绒毛膜促性腺激素氨基酸序列和促黄体素氨基酸序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸,较佳地为3-10个氨基酸。连接肽的长度也可为0,此时绒毛膜促性腺激素氨基酸序列和促黄体素氨基酸序列直接相连。关于连接肽的描述,可参见Paul W.Dempsey等人,Science 271(1996)p.346-350。通常,连接肽不影响或不显著影响绒毛膜促性腺激素氨基酸序列和促黄体素氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于):GlySer(Gly4Ser)GlySer。
另一种广义的连接肽是功能性基因编码的蛋白或其片段,代表性的例子包括(但并不限于):GSF、IL-2、TNFα、各种细胞因子、补体(例如插入1-4个C3d补体片段)等。
编码本发明融合蛋白的DNA序列,可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得绒毛膜促性腺激素和/或促黄体素的编码DNA序列,然后将其拼接在一起,形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后,将其连入合适的表达载体,再转入合适的宿主细胞。最后,培养转化后的宿主细胞,通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用,术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中,可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如,选用市售的载体,然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列,可以形成蛋白表达载体。
如本文所用,“可操作地连于”指这样一种状况,即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如,如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌,那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录,那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时,那么它是可操作地连于编码序列。一般,“可操作地连于”意味着相邻近,而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中,术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞,昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地,该宿主细胞是真核细胞,更佳地是家蚕细胞。
在获得转化的宿主细胞后,可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞,从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
另一方面,本发明还包括对人hCG-LH融合蛋白或其编码DNA具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于hCG-LH融合蛋白或片段。较佳地,指那些能与hCG-LH融合蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hCG-LH融合蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab′或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子;或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的hCG-LH融合蛋白或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达hCG-LH融合蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,
Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,
Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,
In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如hCG-LH融合蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭hCG阳性的细胞(例如肿瘤细胞等)。
多克隆抗体的生产可用hCG-LH融合蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的融合蛋白或抗体有二大治疗和预防用途:
(1)治疗肿瘤
第一种方式是直接将本发明的融合蛋白作为半抗原与TT和/或DT偶联形成疫苗组合物,然后施用于癌症患者。癌症患者经免疫后产生抗体,使癌细胞生长停滞或癌细胞坏死,从而使恶性肿瘤变小或消失,达到治疗恶性肿瘤的目的。
第二种方式是DNA疫苗方式。近年来兴起的DNA疫苗也有着广阔的应用前景,DNA疫苗是通过将编码目的蛋白的基因克隆入适当的载体中,然后注射至肌肉、皮内或皮下,在体内目的基因得以表达,体内会产生抗目的蛋白的抗体从而达到防治疾病的作用。因此,本发明的单链嵌合多肽基因也可克隆入适当的载体,导入机体,在体内表达嵌合肽,进而产生抗体,达到治疗癌症的目的。
第三种方式是将本发明特异性针对hCG-LH融合蛋白的抗体直接施用于癌症患者。
(2)抗生育
第一种方式是直接将本发明的融合蛋白作为半抗原与TT和/或DT偶联形成疫苗组合物,然后施用于育龄妇女。育龄妇女在注射疫苗后,产生抗体,使受精卵不能着床,从而达到抗生育的作用。
第二种方式是DNA疫苗方式施用于育龄妇女。
第三种方式是将本发明特异性针对hCG-LH融合蛋白的抗体直接施用于育龄妇女。
因此,在本发明的另一方面,提供了一种含所述融合蛋白的疫苗。合适的疫苗例子包括(但并不限于):与TT或DT偶联形成的疫苗。上述的hCGβCTP37/TT和HSD/TT(DD)两种疫苗先是作为抗生育疫苗开发研制的,到90年代末分别完成了临床I期和临床II期试验,其效果以后者为好(人类生殖研究、发展和研究培训特别规划署1998年年度技术报告;Talwar,GP等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,91:8532-8536)。因此,本发明中用基因工程方法生产的单链嵌合多肽与TT或DT偶联组成的疫苗hCGβ-oLHα/TT(DT)也可能用作抗生育疫苗。
在本发明的另一方面,还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的新型hCG-LH融合蛋白或其特异性抗体,以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时,通常将活性成分与赋形剂混合,或用赋形剂稀释,或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时,它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此,组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质,以及合适的药剂学赋形剂。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
此外,本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用,其中包括(但并不限于):TNF、IL-2。
本发明的优点在于:采用基因工程方法,一次表达单链嵌合多肽hCGβ-oLHα,不仅简化了生产步骤,而且所述融合蛋白的稳定性高,抗原性强。因此,可以大批量,低成本地生产hCG疫苗半抗原。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
用重叠多聚酶链反应(PCR)构建编码单链嵌合多肽hCGβ-oLHα的cDNA
以合成引物I和II,用含hCGβcDNA的质粒pBS/hCGβ为模板,进行PCR扩增获得hCGβcDNA片段;以合成引物III和反向通用引物,用含oLHαcDNA的质粒pBS/oLHα为模板,进行PCR扩增获得oLHαcDNA片段。最后以合成引物I和反向通用引物,以上述PCR扩增产物为模板,进行PCR扩增获得单链嵌合肽hCGβ-oLHαcDNA(图1)。
单链嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA序列经DNA测序证明,其编码结构是hCGβ5′非翻译区-起始密码-信号肽-成熟hCGβ编码区-成熟oLHα编码区-终止密码-oLHα3′非翻译区。成熟hCGβ羧端最后一个氨基酸(AA)与成熟的oLHα的第一个氨基酸相连,其相连处的DNA序列如图2所示。
hCGβ-oLHα融合蛋白的编码序列如图9所示。由于该融合蛋白带有信号肽(下划线部分),因此编码成熟的hCGβ-oLHα融合蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示,共723个核苷酸(不包括终止密码子);成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,共241个氨基酸。一种带有信号肽的未成熟的hCGβ-oLHα融合蛋白的序列如SEQ ID NO:3所示,共1095个核苷酸;成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,共261个氨基酸。
表1引物序列
引物名称 | 序列 |
引物I | 5′-ATTAACCCTCACTAAAG-3′(SEQ ID NO:5) |
引物II | 5′-CTCTCCATCAGGAAATTGTGGGAGGATCGG-3′(SEQ ID NO:6) |
引物III | 5′-CCGATCCTCCCACAATTTCCTGATGGAGAG-3′(SEQ ID NO:7) |
反向通用引物 | 5′-AACAGCTATGACCATG-3′(SEQ ID NO:8) |
引物IV | 5′-GTGAATTCATGTCCAAGGAGCCGCTTCGG-3′(SEQ ID NO:9) |
实施例2
hCGβ-oLHα的表达
在本实施例中,构建含单链嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA不同的表达载体,在相应的表达系统中进行表达。用免疫亲和柱及其他常规分离纯化技术,从条件培液中纯化重组产物。
(A)、hCGβ-oLHαcDNA在CHO细胞内表达
(i)表达质粒pSV2-dhfr/hCGβ-oLHα的构建
将hCGβ-oLHαcDNA经HindIII酶切后,克隆入真核表达质粒pSV2-dhfr的HindIII位点,得到表达质粒pSV2-dhfr/hCGβ-oLHα(图3)。用限制性内切酶pVUII酶切出现680bp和5.4kb两个片段,表明插入片段方向正确,外源基因是在启动子PSV40E的调控下表达(图3)。
(ii)高效稳定表达细胞株的建立
用磷酸钙共沉淀将表达质粒导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-细胞)中,用氨甲喋呤(MTX)加压,使目的基因的拷贝数增加,最终筛选高表达细胞株(图4)。由于MTX是dhfr的拮抗剂。Dhfr缺陷型细胞在导入dhfr基因,并与细胞染色体DNA整合后,通过不断提高该基因的拷贝数,合成更多的dhfr来抵抗MTX浓度的递增,而dhfr基因的扩增又会带动邻近基因拷贝数的提高,从而在MTX存在下筛选高效稳定表达的克隆细胞株。
图4为三株不同的细胞在不同的MTX浓度下的表达量。结果显示,细胞株1和2随着MTX浓度的增加,表达量明显增加,而细胞株3的表达量增加较少。
(iii)表达产物的分离纯化
由于rhCGβ-oLHα能分泌至培养液中。因此有利于产物的分离纯化。收集的条件培液经4℃,10000转/分钟离心后,直接用偶联有hCGβ单克隆抗体的免疫亲和柱纯化,载体为Bio-Rad公司的Affi-gel 10。免疫亲和柱先用平衡缓冲液(20mMTris-HCl,pH7.4,0.1M NaCl,0.02%NaN3)平衡,上述条件培液流经柱,用5倍柱体积的20mM Tris-HCl,pH7.4,0.5M NaCl,0.02%NaN3溶液洗除非特异吸附物质,最后用5倍柱体积的50mM甘氨酸-HCl(pH3.0)将专一性结合于免疫亲和柱上的重组产物洗脱下来,用1M Tris-HCl pH8.8的溶液将收集的样品液的pH调至7.0,样品对0.1%NH4HCO3透析,透析液每4-6小时调换一次,共四次。样品经冷冻干燥后保存于-20℃冰箱待用。
(B)、hCGβ-oLHαcDNA在昆虫细胞中的表达
hCGβ-oLHαcDNA克隆入昆虫细胞表达载体pVL1393的EcoRI位点,得到质粒pVL1393/hCGβ-oLHα(图5)。采用磷酸钙共沉淀法,以该质粒与Baculo-GoldTM线性化多角体病毒基因组DNA(PharMingen公司产品)共转染昆虫细胞草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9),通过目视法筛选获得重组病毒AcNPV-hCGβ-oLHα。
用重组病毒感染昆虫细胞,表达的重组蛋白rhCGβ-oLHα能分泌到培养基中,表达量为4μg/106cells/3天。收集培液,于4℃,100,000×g离心去除细胞碎片和病毒后,上清液用偶联有hCGβ单抗的免疫亲和柱分离,获得rhCGβ-oLHα。经SDS-PAGE银染和Western印迹分析鉴定,在还原条件下的表观分子量为38.0KDa(图6)。
(C)、单链嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA在酵母中的表达
(i)酵母表达质粒的构建
以单链嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA(图1)为模板,以引物IV(5′-GTGAATTCATGTCCAAGGAGCCGCTTCGG-3′)和反向通用引物作引物,进行PCR反应,获得单链嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA经EcoRI酶切,克隆入酵母分泌型表达质粒pPIC9K的EcoRI位点,获得表达质粒pPIC9K/hCGβ-oLHα(图7)。
(ii)表达hCGβ-oLHα酵母工程细胞株的建立
用电穿孔法,将表达质粒pPIC9K/hCGβ-oLHα导入毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,用G418筛选含高拷贝外源基因的细胞株。在含4mg/ml G 418浓度的培养基中生长的菌应含有40个拷贝外源基因。外源基因拷贝数越高,表达量越高。
将获得的毕赤酵母工程菌于2000年12月26日保藏中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉市),保藏号为CCTCC NO:M2000041。
(iii)单链嵌合多肽的表达
用摇瓶培养酵母菌,通过甲醇诱导,外源基因得到表达,并分泌至培养液中,经过96h-120h培养,其表达量的15mg/升或更高,如采用发酵罐培养,细胞,密度可达200 OD600nm或更高,表达量可提高5-10倍,即达75-150mg/升。
(iv)表达产物的纯化
由于产物被分泌至培养液中,这有利于产物的纯化。采用硫酸铵沉淀、分子筛和免疫亲和柱层析等手段纯化,纯化产物用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western鉴定,纯度达90%,表达产物的表观分子量为44KDa。
实施例3
rhCGβ-oLHα的理化和生物特性
在培养瓶中培养实施例2中获得的表达hCGβ-oLHα的CHO细胞株或酵母细胞株,rhCGβ-oLHα的表达量达5μg/天/106细胞。细胞培养4天后收集细胞培养液,于4℃,10,000转/分钟离心15分钟,吸取上清液,用偶联有hCGβ单克隆抗体的免疫亲和柱进行分离纯化,对纯化的样品进行鉴定分析。
(1)SDS-PAGE银染分析
纯化的样品作还原条件下的SDS-PAGE银染分析。
结果表明,rhCGβ-oLHα的表观分子量为45KDa(还原条件),与预计一致。经免疫亲和柱一步纯化,样品纯度达90%(图6A)。
(2)免疫印迹反应(Western blot)
纯化的样品经SDS-PAGE后,转移至硝基纤维膜上,先与适当稀释的抗hCGβ血清反应,再与偶联碱性磷酸单酯酶的羊抗兔抗体反应,然后加入Nitro BlueTetrazolion和5′-Bromo-4-Chloro-3-incloding phosphate进行显色反应。
结果表明,抗hCGβ抗体能专一性地识别rhCGβ-oLHα,其分子量也为45Kda。而昆虫细胞中表达的hCGβ-oLHα的表观分子量为38.0KDa。这说明CHO细胞中表达的重组产物的糖基化程度高,与天然的相近(图6B)。
(3)竞争抑制结合试验
用人绒毛膜促性腺激素(hCG)放射免疫测试盒作竞争125I-hCG结合抗体试验。即用人绒毛膜促性腺激素(hCG)放射免疫测试盒,以天然hCG、天然hCGβ以及昆虫细胞中表达的单链多肽和CHO细胞中表达的单链多肽进行竞争125I-hCG结合抗体的试验。
结果表明,在CHO细胞中表达的单链多肽的抗体结合活性与天然hCG相比较低,但高于天然hCGβ,与昆虫细胞中表达的单链多肽相差不大(图8)。
(4)表达产物的免疫原性分析
用rhCGβ-oLHα免疫C57BL小鼠,同时分别以hCG和hCGβ免疫小鼠为对照,经三次免疫后(第1次用弗氏完全佐剂,第2,3次用弗氏不完全佐剂)后,放血后,取血清,用ELISA方法测定抗体效价(表1)。
结果表明,rhCGβ-oLHα能有效地产生抗体。以rhCGβ-oLHα,hCGβ,hCG抗原包被,其滴度分别为1∶92万;1∶96万;1∶92万(表1)。
表2 hCGβ-oLHα抗血清的效价及其与hCGβ和hCG的结合活性
ELISA测定包被抗原 | 抗 血 清 | |||
hCGβ-oLHα | hCGβ | hCG | ||
hCGβ- | 1∶192万 | —— | —— | |
hCGβ | 1∶96万 | 1∶192万 | —— | |
hCG | 1∶96万 | —— | 1∶96万 |
分别以对应的抗原包被板,测得的抗体滴度为:虽
hCGβ-oLHα抗血清:1∶192万;
hCGβ抗血清:1∶192万;
hCG抗血清:1∶96万;
以hCG抗原包被,hCGβ-LHα抗血清滴度:1∶96万;
以hCGβ抗原包被,hCGβ-LHα抗血清滴度:1∶96万。
以上结果说明,单链嵌合多肽不仅能有效地诱发抗体的产生,产生的抗体也能有效地与hCG和hCGβ相结合,因此,用CHO细胞表达纯化得到的rhCGβ-oLHα是可以用作半抗原,它进一步与TT或DT偶联组成疫苗hCGβ-oLHα/TT(DT)能在体内产生抗体,达到治疗癌症的目的,疫苗用于育龄妇女,能达到抗生育目的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
(1)一般信息:
(ii)发明名称:新的绒毛膜促性腺激素-促黄体素融合蛋白及其制法和用途
(iii)序列数目:9
(2)SEQ ID NO:1的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:723bp
(B)类型:核酸
(C)链性:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:
GATGTGCGCT TCGAGTCCAT CCGGCTCCCT GGCTGCCCGC GCGGCGTGAA CCCCGTGGTC 240
TCCTACGCCG TGGCTCTCAG CTGTCAATGT GCACTCTGCC GCCGCAGCAC CACTGACTGC 300
GGGGGTCCCA AGGACCACCC CTTGACCTGT GATGACCCCC GCTTCCAGGA CTCCTCTTCC 360
TCAAAGGCCC CTCCCCCCAG CCTTCCAAGC CCATCCCGAC TCCCGGGGCC CTCGGACACC 420
CCGATCCTCC CACAATTTCC TGATGGAGAG TTTACAATGC AGGGTTGTCC TGAATGCAAG 480
CTAAAAGAAA ACAAATACTT CTCCAAGCCA GATGCTCCAA TTTATCAGTG CATGGGGTGC 540
TGCTTCTCCA GGGCATACCC CACTCCAGCG AGGTCTAAGA AGACAATGTT GGTTCCCAAG 600
AACATCACCT CGGAAGCCAC ATGTTGTGTG GCCAAAGCAT TTACCAAGGC CACAGTGATG 660
GGAAATGTCA GAGTGGAGAA CCACACCGAG TGCCACTGCA GTACTTGTTA TTATCACAAA 720
TCT 723
(2)SEQ ID NO:2的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:241个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:
SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT MTRVLQGVLP 50
ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV SYAVALSCQC ALCRRSTTDC 100
GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQFPDGE 150
FTMQGCPECK LKENKYFSKP DAPIYQCMGC CFSRAYPTPA RSKKTMLVPK 200
NITSEATCCV AKAFTKATVM GNVRVENHTE CHCSTCYYHK S 241
(2)SEQ ID NO:3的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:1095bp
(B)类型:核酸
(C)链性:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:
AGACAAGGCA GGGGACGCAC CAAGGATGGA GATGTTCCAG GGGCTGCTGC TGTTGCTGCT 60
GCTGAGCATG GGCGGGACAT GGGCATCCAA GGAGCCGCTT CGGCCACGGT GCCGCCCCAT 120
CAATGCCACC CTGGCTGTGG AGAAGGAGGG CTGCCCCGTG TGCATCACCG TCAACACCAC 180
CATCTGTGCC GGCTACTGCC CCACCATGAC CCGCGTGCTG CAGGGGGTCC TGCCGGCCCT 240
GCCTCAGGTG GTGTGCAACT ACCGCGATGT GCGCTTCGAG TCCATCCGGC TCCCTGGCTG 300
CCCGCGCGGC GTGAACCCCG TGGTCTCCTA CGCCGTGGCT CTCAGCTGTC AATGTGCACT 360
CTGCCGCCGC AGCACCACTG ACTGCGGGGG TCCCAAGGAC CACCCCTTGA CCTGTGATGA 420
CCCCCGCTTC CAGGACTCCT CTTCCTCAAA GGCCCCTCCC CCCAGCCTTC CAAGCCCATC 480
CCGACTCCCG GGGCCCTCGG ACACCCCGAT CCTCCCACAA TTTCCTGATG GAGAGTTTAC 540
AATGCAGGGT TGTCCTGAAT GCAAGCTAAA AGAAAACAAA TACTTCTCCA AGCCAGATGC 600
TCCAATTTAT CAGTGCATGG GGTGCTGCTT CTCCAGGGCA TACCCCACTC CAGCGAGGTC 660
TAAGAAGACA ATGTTGGTTC CCAAGAACAT CACCTCGGAA GCCACATGTT GTGTGGCCAA 720
AGCATTTACC AAGGCCACAG TGATGGGAAA TGTCAGAGTG GAGAACCACA CCGAGTGCCA 780
CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA AATATTTTGC AGTGGGCCAT GTTGATGATG 840
GTTGATTTGC TCAAAAGGAA AATTAATTTG TCCAGTGTCT ATGCCTTTGT GAGATAAAAC 900
CCTCCTTTTC CTTGCCGTAC ATTTTTAACC TGCTTTGAGA ATATACTGCA GCTTTATTGC 960
TTTTCTCCTT ATCCTACAAT ATAATCAGCA GTCTTGATCT TTTCATTTGG AATGAAATAT 1020
GGCATTTAGC ATGACCATAA AAAACTGGTT CCACTGGAAA TAAAGTCTTT TAAATCATCA 1080
AAAAAAAAAA AAAAG 1095
(2)SEQ ID NO:4的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:261个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:
MEMFQGLLLL LLLSMGGTWA SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN 50
TTICAGYCPT MTRVLQGVLP ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV 100
SYAVALSCQC ALCRRSTTDC GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS 150
PSRLPGPSDT PILPQFPDGE FTMQGCPECK LKENKYFSKP DAPIYQCMGC 200
CFSRAYPTPA RSKKTMLVPK NITSEATCCV AKAFTKATVM GNVRVENHTE 250
CHCSTCYYHK S 261
(2)SEQ ID NO:5的信息
(i)序列特征
(A)长度:17碱基
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(xi)序列描述:SEQ ID NO:5:
ATTAACCCTC ACTAAAG 17
(2)SEQ ID NO:6的信息
(i)序列特征
(A)长度:30碱基
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(xi)序列描述:SEQ ID NO:6:
CTCTCCATCA GGAAATTGTG GGAGGATCGG 30
(2)SEQ ID NO:7的信息
(i)序列特征
(A)长度:30碱基
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(xi)序列描述:SEQ ID NO:7:
CCGATCCTCC CACAATTTCC TGATGGAGAG 30
(2)SEQ ID NO:8的信息
(i)序列特征
(A)长度:16碱基
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(xi)序列描述:SEQ ID NO:8:
AACAGCTATG ACCATG 16
(2)SEQ ID NO:9的信息
(i)序列特征
(A)长度:29碱基
(B)类型:核酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:寡核苷酸
(xi)序列描述:SEQ ID NO:9:
GTGAATTCAT GTCCAAGGAG CCGCTTCGG 29
Claims (11)
1.一种融合蛋白,其特征在于,它具有人绒毛膜促性腺激素β亚基的氨基酸序列、非人哺乳动物促黄体素α亚基的氨基酸序列、以及位于所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的氨基酸序列和所述促黄体素α亚基氨基酸序列之间的0-20个氨基酸的连接肽序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的接头序列含3-10个氨基酸。
3.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的融合蛋白具有SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列。
4.一种分离的DNA分子,其特征在于,它编码权利要求1所述的融合蛋白。
5.如权利要求4所述的DNA分子,其特征在于,它具有SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。
6.一种载体,其特征在于,它含有权利要求4所述的DNA分子。
7.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求6所述的载体。
8.一种药物组合物,其特征在于,包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂,以及有效量的权利要求1所述的融合蛋白。
9.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
在适合表达所述融合蛋白的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞,或者培养含权利要求7所述宿主细胞的动物,从而表达出所述的融合蛋白;和
分离所述的融合蛋白。
10.一种疫苗,其特征在于,它含有权利要求1所述的融合蛋白或权利要求4所述的DNA分子。
11.一种抗体,其特征在于,它特异性地结合于权利要求1所述的融合蛋白。
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CN 00137778 CN1194016C (zh) | 2000-12-29 | 2000-12-29 | 新的人绒毛膜促性腺激素-促黄体素融合蛋白及其制法和用途 |
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
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