CN1414970A - 以转基因方式生产的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种转基因融合蛋白的生产方法。该方法包括下列步骤：提供一种包括可提供所述融合蛋白表达的转基因的转基因动物；使该转基因得到表达；和从所述转基因动物的乳中回收所述融合蛋白。

Description

以转基因方式生严的融合蛋白
                     资金提供
本文所述的工作已经部分使用了来自National CancerInstitute，National Institutes of Health的联邦政府资金，合同号为NO1-CO-60000。
                     相关申请
本申请要求在先提交的临时申请号60/101,083(1998年9月18日提交)的利益，将该文献引入本文作为参考。
                     发明领域
本发明涉及以转基因方式生产的融合蛋白(例如免疫球蛋白-酶融合蛋白)、编码融合蛋白的核酸和融合蛋白和核酸的制备和使用方法。
                     发明背景
正在开发越来越多的重组蛋白用于治疗和诊断的应用。然而，使用常规方法难以生产功能形式和/或所需量的许多这些蛋白质或生产它们的成本昂贵。常规方法包括将生产特定蛋白必不可少的基因插入诸如细菌、酵母或哺乳动物细胞、例如COS细胞这样的宿主细胞且然后使所述细胞在培养基中生长的步骤。接着所培养的细胞合成所需的蛋白质。传统的细菌或酵母系统不能够产生许多功能形式的复合蛋白。尽管哺乳动物细胞可以生产复合蛋白，但是它们一般难以生长且生长的成本昂贵、而通常仅产生mg/L量的蛋白质。使用细菌、酵母或哺乳动物系统的局限在诸如免疫球蛋白-酶融合蛋白这样的复合蛋白的生产中特别是如此，因为它们需要适当的翻译后修饰并装配成功能形式。
                      发明概括
本发明一般涉及转基因融合蛋白、例如免疫球蛋白-酶融合蛋白的生产方法。该方法包括下列步骤：提供一种包括可为所述融合蛋白、例如免疫球蛋白-酶融合蛋白的表达提供的转基因的转基因动物、例如山羊或母牛；使该转基因得到表达；和优选从所述转基因动物的乳中回收所述融合蛋白。(尽管所述的实施方案涉及在乳中表达，但其它启动子、例如其它组织特异性启动子，例如肌肉、毛发、尿、血或卵特异性启动子也可用于在其它组织或产物中产生融合蛋白。)
在一个优选的实施方案中，所述的转基因包括与第二种成分融合的第一种成分。所述的第一种成分可以包括靶向分子的亚单位、例如Ig亚单位、例如对肿瘤抗原(例如癌胚抗原(CEA)、转铁蛋白受体、TAG-72、表皮生长因子受体)具有特异性的Ig亚单位。所述的第二种成分可以是：酶；非Ig亚单位的多肽；或其片段；RNA酶，例如RNA酶A、例如血管生成素；或羧肽酶B酶。
在优选的实施方案中，由转基因哺乳动物、例如反刍动物、例如山羊或母牛的乳腺制备转基因融合蛋白。
在优选的实施方案中，所述转基因融合蛋白分泌入转基因哺乳动物、例如反刍动物、例如产奶动物、例如山羊或母牛的乳中。
在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白分泌入转基因哺乳动物的奶，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。
在优选的实施方案中，在乳腺特异性启动子的调控下制备所述的转基因融合蛋白，所述的启动子例如乳特异性启动子、例如乳清蛋白启动子或酪蛋白启动子。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白具有下列通式：R1-L-R2；R2-L-R1；R2-R1；或R1-R2，其中R1是免疫球蛋白部分；L是肽接头；且R2是酶部分。优选R1和R2共价连接、例如它们直接融合或通过肽接头连接。
在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白进一步包括：
指导融合蛋白分泌的信号序列、例如来自分泌蛋白的信号(例如来自分泌入乳的蛋白质的信号或免疫球蛋白信号)；和
(可选的)编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质或免疫球蛋白的氨基末端编码区的充足部分的序列，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括单克隆抗体亚单位，例如人、鼠(例如小鼠)的单克隆抗体亚单位或其片段、例如其抗原结合片段。单克隆抗体亚单位或其抗原结合片段可以是单链多肽、重链和轻链的二聚体或两条重链和轻链的四聚体。优选所述的单克隆抗体是人抗体或其片段、例如其抗原结合片段。例如，人抗体可以由包括B细胞与永生化细胞融合的杂交瘤产生，所述的B细胞获自转基因的非人动物，例如转基因小鼠，它具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。所述的抗体可以属于不同的同种型，包括：IgG(例如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgA亚组、IgD或IgE。优选所述的抗体是IgG同种型。所述的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或仅包括抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段)。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白的免疫球蛋白亚单位是一种重组抗体，例如嵌合或人源化抗体、亚单位或其抗原结合片段，例如它们带有来源于非人抗体(例如鼠)的可变区或至少是互补性决定区(CDR)，其中剩余部分来源于人。
在优选的实施方案中，所述的融合蛋白的免疫球蛋白亚单位是单价的(例如它包括一对重链和轻链或其抗原结合部分)。在其它实施方案中，所述的融合蛋白是二价抗体(例如它包括两对重链和轻链或其抗原结合部分)。
在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白包括免疫球蛋白重链或其片段、例如其抗原结合片段。优选所述的免疫球蛋白重链或其片段(例如其抗原结合片段)与酶连接，例如通过肽接头与酶连接或直接与之融合。优选所述的免疫球蛋白重链-酶融合蛋白能够装配成功能性复合体、例如具有酶活性的二聚化、三聚化、四聚化或多聚化复合体。
在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白包括免疫球蛋白重链或其片段(例如其抗原结合片段)和轻链或其片段(例如其抗原结合片段)。优选所述的免疫球蛋白重链与酶连接，例如通过肽接头与酶连接或直接与之融合。优选所述的免疫球蛋白重链-酶融合蛋白能够装配成功能性复合体，例如具有酶活性的二聚化、三聚化、四聚化或多聚化复合体。
在优选的实施方案中，所述融合蛋白中的酶是：RNA酶，例如RNA酶A、例如血管生成素；或羧肽酶B酶。就诊断应用而言，所述的酶可以是辣根过氧化物酶。
在一个优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白包括肽接头，且该肽接头具有下列特征中的一种或多种：a)它使得免疫球蛋白和酶蛋白彼此相对旋转；b)它耐受蛋白酶的消化；c)它不与所述的免疫球蛋白或所述酶发生相互作用；d)它能使所述的融合蛋白形成保持酶活性的复合体(例如二聚化复合体、三聚化复合体、四聚化复合体或多聚化复合体)；和e)它促进所述融合蛋白折叠和/或装配成活性复合体。
在一个优选的实施方案中：所述的转基因融合蛋白包括肽接头，且该肽接头具有5-60个氨基酸的长度、更优选具有10-30个氨基酸长度；该肽接头的长度为20个氨基酸；该肽接头的长度为17个氨基酸；该肽接头中的每个氨基酸选自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala组成的组；该肽接头包括Gly-Ser成分。
在一个优选的实施方案中，所述的融合蛋白包括肽接头，且该肽接头包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的序列，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。优选所述的肽接头包括具有通式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3的序列。优选所述的肽接头包括具有通式((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro)的序列。
在优选的实施方案中，所述的转基因融合蛋白装配成二聚体、三聚体、四聚体或四聚化以上的多聚化复合体。
在优选的实施方案中，编码所述转基因融合蛋白的转基因是一种核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如来自乳特异性蛋白的信号；
(d)可选的，编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质的氨基末端编码区充足部分的核苷酸序列，该部分足以使非分泌蛋白质在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码所述融合蛋白、例如免疫球蛋白-酶融合蛋白、例如本文所述的蛋白质的一种或多种核苷酸序列；和
(f)可选的，来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如乳蛋白基因)的3’非翻译区。
在优选的实施方案中，所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自同一基因；所述转基因的元件a(如果存在)、b、c、d(如果存在)和f来自两种或多种基因。例如，信号序列、启动子序列和3’非翻译序列可以来自乳腺上皮特异性基因，例如乳清蛋白或酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)。优选信号序列、启动子序列和3’非翻译序列来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述转基因的启动子是乳腺上皮特异性启动子，例如乳清蛋白或酪蛋白启动子(例如β酪蛋白启动子)。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，由所述转基因编码的信号序列是使蛋白质的表达定向于细胞外部或使其进入细胞膜的氨基末端序列。优选所述的信号序列来自分泌入乳、例如转基因动物的乳中的蛋白质。
在优选的实施方案中，所述转基因的3’非翻译区包括聚腺苷酸化位点，获自乳腺上皮特异性基因、例如乳清蛋白基因或酪蛋白基因。这种3’非翻译区可以获自酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)、β乳球蛋白基因、乳清酸性蛋白基因或乳清蛋白基因。优选该3’非翻译区来自山羊β酪蛋白基因。
在优选的实施方案中，所述的转基因、例如本文所述的转基因整合入转基因动物的生殖细胞和/或体细胞。
在另一个方面中，本发明涉及一种核酸构建体、优选一种分离的核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)启动子，例如乳腺上皮特异性启动子、例如乳蛋白启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列、例如来自乳特异性蛋白的信号序列的核苷酸序列；
(d)可选的，编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质的氨基末端编码区充足部分的核苷酸序列，该部分足以使非分泌蛋白质在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码本文所述的融合蛋白的一种或多种核苷酸序列；和
(f)可选的，来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如乳蛋白基因)的3’非翻译区。
在优选的实施方案中，所述的启动子是乳腺上皮特异性启动子，例如乳清蛋白或酪蛋白启动子(例如β酪蛋白启动子)。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，所述的信号序列是使蛋白质的表达定向于细胞外部或使其进入细胞膜的氨基末端序列。优选所述的信号序列来自乳特异性蛋白。优选所述的信号序列指导所编码的融合蛋白分泌入转基因动物、例如转基因哺乳动物的乳中。
在优选的实施方案中，所述的3’非翻译区包括聚腺苷酸化位点且获自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因、例如乳清蛋白基因或酪蛋白基因。这种3’非翻译区可以获自酪蛋白基因(例如β酪蛋白基因)、β乳球蛋白基因、乳清酸性蛋白基因或乳清蛋白基因。优选该3’非翻译区来自山羊β酪蛋白基因。
在另一个方面中，本发明涉及一种宿主细胞、例如一种分离的宿主细胞，它包括本发明的核酸(例如转基因、例如本文所述的核酸构建体)。
在另一个方面中，本发明涉及含有有效量的融合蛋白、例如本文所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白和药物上可接受的载体的药物或营养(nutraceutical)组合物。
在一个优选的实施方案中，所述的组合物包括奶。
在另一个方面中，本发明涉及包括编码融合蛋白的转基因、例如编码本文所述免疫球蛋白-酶融合蛋白的转基因的转基因动物。
优选的转基因动物包括：哺乳动物；鸟类动物；爬行动物；有袋类动物；和两栖动物。合适的哺乳动物包括：反刍动物；有蹄类动物；养驯的哺乳动物；和产奶动物。特别优选的动物包括：小鼠、山羊、绵羊、骆驼、兔、母牛、猪、马、公牛和美洲驼。合适的鸟类包括小鸡、鹅和火鸡。如果转基因蛋白分泌入转基因动物的奶，那么该动物每年应能够产至少1升、且更优选至少10升或100升的奶。优选所述的转基因动物是反刍动物，例如山羊、母牛或绵羊。最优选的转基因动物是山羊。
在优选的实施方案中，所述的转基因动物具有包含可编码融合蛋白、例如本文所述融合蛋白的转基因的生殖细胞和体细胞。
在优选的实施方案中，在转基因动物体内表达的融合蛋白处于乳腺特异性启动子、例如乳特异性启动子、例如乳清蛋白或酪蛋白启动子的控制下。乳特异性启动子可以是酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子或乳清蛋白启动子。优选所述的启动子是山羊β酪蛋白启动子。
在优选的实施方案中，所述的转基因动物是哺乳动物且所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白分泌入所述转基因动物的奶中，其浓度至少约为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或5mg/ml以上。
在另一个方面中，本发明涉及一种选择性杀伤或裂解异常或病态细胞的方法，所述的细胞在其表面上表达靶抗原，该方法包括下列步骤：
使所述异常或病态细胞与以转基因方式生产的融合蛋白、例如以转基因方式生产的本文所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白接触，其中所述融合蛋白中的免疫球蛋白可识别所述的靶抗原。
术语肽、蛋白质和多肽在本文中可以互换使用。
本文所用的多肽的纯化制品、基本上纯的制品或分离的多肽指的是已经从至少一种其它蛋白质、脂类或核酸中分离的多肽，这种多肽与所述其它蛋白质、脂类或核酸一起出现在表达它的细胞或生物体中，例如所述的多肽分离自转基因动物或液体、例如奶或其它物质、例如由转基因动物产的卵中的蛋白质、脂类或核酸。优选这种多肽分离自用于纯化它的物质、例如抗体或凝胶基质、例如聚丙烯酰胺。优选这种多肽至少构成所述纯化制品干重的10％、20％、50％、70％、80％或95％。优选所述制品含有：足以进行蛋白质测序的多肽；至少1μg、10μg或100pg的所述多肽；至少1mg、10mg或100mg的所述多肽。
基本上纯的核酸是属于下列核酸中的一种或两种的核酸：与直接连入所述核酸所来源于的生物体的天然出现的基因组中(即5’末端序列上的一种序列和3’末端序列上的一种序列)的一种或两种序列、例如编码序列并不直接连接的核酸；或基本上不含在所述核酸所来源于的生物体中出现的核酸序列的核酸。该术语例如包括导入载体、例如导入自主复制质粒或病毒或导入原核生物或真核生物的基因组DNA或作为独立于其它DNA序列存在的独立分子(例如通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的eDNA或基因组DNA片段)的重组DNA。基本上纯的DNA还包括一种属于编码其它融合蛋白序列的杂种基因的部分的重组DNA。
本文所用的术语转基因指的是导入转基因生物体基因组的核酸序列(例如编码一种或多种融合蛋白多肽类)。转基因可以包括一种或多种转录调节序列和诸如内含子这样对编码所述融合蛋白的核酸的最佳表达和分泌而言可能是必不可少的其它核酸。转基因可以包括增强子序列。融合蛋白序列可以可操作地与组织特异性启动子、例如导致所述蛋白在转基因哺乳动物的乳中分必的乳腺特异性启动子序列、尿特异性启动子或卵特异性启动子相连接。
本文所用的术语″转基因细胞″指的是含有转基因的细胞。
本文所用的“转基因生物体”指的是转基因动物或植物。
本文所用的″转基因动物″是一种非人的动物，其中该动物中的一种或多种细胞、优选基本上所有的细胞含有通过人为干涉、诸如通过本领域中公知的转基因技术导入的转基因。可以通过导入细胞前体、通过谨慎的遗传操作、诸如通过显微注射或通过使用重组病毒感染，将这种转基因直接或间接导入细胞。
本文将哺乳动物定义为不包括人的具有乳腺并可产奶的所有动物。
本文所用的″产奶动物″指的是非人的大于啮齿动物的产奶动物。在优选的实施方案中，所述的产奶动物可产大量的奶并具有较长的分泌乳汁期，例如母牛或山羊。
本文所用的措辞″受试者″包括人和非人动物。本发明中的术语″非人的动物″包括：脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人的灵长类、反刍动物、鸟类、两栖动物、爬行动物和啮齿动物，例如小鼠和大鼠。该术语还包括兔。
本文所用的″转基因植物″是一种植物、优选多细胞的植物或高等植物，其中所述植物中的一种或多种细胞且优选基本上所有的细胞含有通过人为干涉、诸如通过本领域中公知的转基因技术导入的转基因。
本文所用的术语″植物″指的是完整的植物、植物部位、植物细胞或植物细胞群。可以用于本发明方法的植物的种类一般扩展至可使用转化技术的高等植物种类，包括单子叶植物和双子叶植物。它包括各种倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。
本文所用的术语″营养物(nutraceutical)″指的是包括融合蛋白的食品物质或部分食品。营养物可以产生医疗或保健有益作用，包括预防、治疗或治愈疾病。在营养物中，转基因蛋白通常以至少为100μg/kg、更优选至少为1mg/kg、最优选至少为10mg/kg的浓度存在。营养物可以包括转基因动物的奶。
本文所用的术语″免疫球蛋白″和″抗体″指的是包括通过二硫键相互间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每条重链均由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。该重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链均由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。该轻链恒定区由一个结构域CL组成。可以将所述的VH和VL区进一步再划分成称作互补决定区(CDR)的高变区，其中分散有更为保守的称作构架区(FR)的区域。每条VH和VL均由按照下列顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述的重链和轻链可变区含有与抗原发生相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子、包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和传统补体系统的第一种成分(Clq)的结合。
本文所用的术语抗体的″抗原结合部分″(或简单地″抗体部分″)指的是抗体的保持与抗原(例如靶抗原)特异性结合的能力的一种或多种片段。已经证实可以使用全长抗体的片段实现抗体的抗原结合功能。术语抗体的″抗原结合部分″中包括的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包括通过铰链区上二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)《自然》(Nature)  341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过独立的基因编码，但是可以使用重组方法经合成接头连接它们，这种合成接头能够使它们形成一种单蛋白链，其中VL和VH区配对成单价分子(称作单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等(1988)《科学》(science)242：423-426；和Huston等(1988)《美国国家科学院学报)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：5879-5883)。这类单链抗体也包括在术语抗体的″抗原结合部分″范围内。使用本领域技术人员公知的常规技术获得这些抗体片段，并按照与完整抗体相同的方式对这些抗体进行用途筛选。
本文所用的术语″单克隆抗体″指的是单分子组成的抗体分子。单克隆抗体组成显示出单一结合特异性和对特定表位的亲和性。因此，术语″人单克隆抗体″指的是显示出单一结合特异性、具有来源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，所述的人单克隆抗体由包括获自转基因的非人动物、例如转基因小鼠的B细胞的杂交瘤产生，所述的转基因动物具有包括与无限增殖化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文所用的术语″重组人抗体″用以包括通过重组方式制备、表达、生成或分离的所有人抗体，诸如分离自属于对人免疫球蛋白基因进行转基因的动物(例如小鼠)的抗体；使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体；分离自重组、组合人抗体文库的抗体；或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列在内的任意其它方式制备、表达、生成或分离的抗体。这类重组人抗体具有来源于人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，使这类重组人抗体进行体外诱变(或当使用针对人Ig序列进行了转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，由此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是虽然来源于人生殖系VH和VL序列并与之相关，但可能天然并不存在于体内人抗体生殖系所有组成成分的序列。
核酸在处于与另一种核酸序列发生功能相关性的情况下时是″可操作地连接的″。例如，启动子或增强子可操作地与编码序列连接，条件是它可影响所述序列的转录。就转录调节序列而言，可操作地连接指的是所连接的DNA序列是邻接的，且如果有必要将两种蛋白质编码区相连接，则是邻近并处于阅读框架中。
本文所用的术语″载体″或″构建体″用以指能够转运所连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体是″质粒″，它指的是可以连入其它DNA片段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其它DNA片段可以连入该病毒的基因组。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。可以将其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组且由此使它们与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这类载体在本文中称作″重组表达载体″(或简单地″表达载体″)。一般来说，在重组DNA技术中应用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，由于质粒是最常用形式的载体，因此″质粒″和″载体″可以互换使用。然而，本发明包括这类其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随载体)。
本文所用的术语″重组宿主细胞″(或简单地″宿主细胞″)用以指已经导入了重组表达载体的细胞。应理解这类术语不仅指的是特定的受试者细胞，而且指这类细胞的子代。因为某些改变可以因突变或环境影响而在后续世代中出现，所以这类子代实际上可能不与亲代细胞相同，但它们仍然包括在本文所用的术语″宿主细胞″的范围内。
从下列详细描述和权利要求中显然可以得出本发明的其它特征和优点。
                          详细描述
首先描述附图。
附图1是遗传抗体和抗体血管生成素融合蛋白的图解表示。
附图2A是转移受体抗体(E6)和血管生成素-酶融合体(CH2Ang)的转基因表达载体的结构图解。将下列DNAs融合在经修饰的山羊β-酪蛋白基因(DiTullio等，1992)的外显子2和7之间用于在小鼠乳腺中表达：抗人转铁蛋白受体单克隆抗体E6(1)的重链、在CH2结构域上与上述编码血管生成素(Ang)的基因的5’末端融合的相同重链(Rybak等，1992)(II)、E6抗体(III)的轻链。开放框，重链；交叉线框，轻链：斜线框，Ang.
附图2B表示使用抗血管生成素或抗-IgG抗体，在还原条件下，对采集自产生E6IgG抗体或CH2Ang融合蛋白的泌乳雌性动物的乳进行的蛋白质印迹分析。将用等体积PBS稀释的15ul乳上凝胶。
附图2C表示在还原或非还原条件下，纯化的E6抗体或CH2Ang的蛋白质印迹分析。分别用指定的抗体分析所述印迹：0.3μg E6，泳道1和2；4μg E6，泳道3；07和0.2μg CH2Ang，泳道4和5。
附图3是描绘血管生成素或血管生成素-抗体融合体(CH2Ang)对mRNA翻译的作用的示意图。将血管生成素或所述融合蛋白加入到含有BMV mRNA和[35S]甲硫氨酸的裂解物混合物中。通过如(Newton等，1996)所述测定掺入新近合成蛋白质中的标记的量来确定蛋白质的合成量。从2-3次实验中采集数据并绘成+SEM的图。将结果表示为模拟处理的对照反应的百分比，IC50是对蛋白质合成产生50％抑制作用所需的Ang或Ang融合蛋白的浓度，是根据剂量反应曲线测定的。实心圈：Ang；空心圈：CH2 Ang。
附图4是描绘表示血管生成素-抗体融合体在培养细胞中的细胞毒性作用的剂量反应曲线示意图。通过蛋白质合成的抑制作用来评价CH2Ang对SF539和MDA-MB-231]mdr细胞的体内毒性。通过如方法中所述测定掺入细胞蛋白质中的[14C]亮氨酸的量来进行细胞毒性测定试验。本试验在有血清存在的情况下进行，在用[14C]亮氨酸脉冲前将换成不含亮氨酸和血清的培养基。IC50是3天后对蛋白质合酶产生50％抑制作用所需的血管生成素融合蛋白的浓度，直接根据剂量反应曲线测定。如果大于符号，那么是SEM。实心符号：SF539人神经胶质瘤细胞；空心符号：MDA-MB-23]mdrl人乳腺癌细胞。
本发明至少部分提供了以转基因方式生产的融合蛋白。在一个实施方案中，所述的融合蛋白包括与毒素(例如酶的亚单位)融合的免疫球蛋白亚单位(例如免疫球蛋白重链或轻链)。本文所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白可用于将细胞毒性剂(例如所述的酶)靶向至不需要的细胞、例如肿瘤细胞。例如，可以将下列实施例中所述的融合蛋白(即针对癌胚抗原(CEA)的抗体与例如RNA酶A或羧肽酶这样的酶融合)用于靶向至肿瘤细胞。在使所述的免疫球蛋白-酶融合体定位于肿瘤部位后，可以给予无毒性的前体药物。通过定位于肿瘤部位的靶向酶的作用将该前体药物转化成具高度细胞毒性的药物，从而获得该药物的治疗水平而不会对患者产生不可接受的毒性。
免疫球蛋白的生产
可以通过各种技术生产针对细胞上例如细胞表面蛋白(例如受体)这样的靶抗原的单克隆抗体，所述的技术包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Mi1stein在《自然》(Nature)256：495(1975)中所述的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法通常是优选的，但是一般也可以使用用于生产单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化技术。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠体内产生杂交瘤是一种得到充分确立的方法。免疫接种方案和用于分离融合用免疫脾细胞的技术在本领域中是公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
可以使用携带完全人免疫系统而非小鼠系统的转基因小鼠生产针对人蛋白的人单克隆抗体(mAbs)。将来自这些免疫接种了有意义抗原的转基因小鼠的脾细胞用于生产分泌对来自人蛋白的表位具有特异性亲和性的人mAb的杂交瘤(例如，参见Wood等，国际中请号WO91/00906；Kucherlapati等，PCT公开号WO91/10741；Lonberg等人，国际申请号WO92/03918；Kay等人，国际申请号92/03917；Lonberg，N.等，1994《自然》(Nature)368：856-859；Green，L.L.等，1994《自然遗传学》(Nature Genet.)7：13-21；Morrison，S.L.等，1994《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855；Bruggenman等，1993，《免疫学年鉴》(Year Immunol.)7：33-40；Tuaillon等，1993，PNAS90：3720-3724；Bruggeman等，1991，《欧洲免疫学杂志》(Eur J Immunol)21：1323-1326)。
还可以通过重组DNA技术领域的技术人员公知的其它方法生产单克隆抗体。已经开发出了另一种称作″组合抗体展示″法的方法以鉴定并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，并可以将这种方法用于生产单克隆抗体(就组合抗体展示法的说明而言，例如参见Sastry等，1989PNAS 86：5728；Huse等，1989《科学》(Science)246：1275；和Orlandi等，1989 PNAS 86：3833)。在用如上所述的免疫原对动物进行免疫接种后，克隆所得B-细胞收集物的抗体的所有组成成分。用于通过使用寡聚体引物混合物和PCR获得免疫球蛋白分子多样群体可变区的DNA序列的方法一般是公知的。例如，可以将相当于5’前导(信号肽)序列和/或构架1(FRl)序列的混合寡核苷酸引物以及相当于保守的3’恒定区引物的引物用于对来自大量鼠抗体的重链和轻链可变区进行PCR扩增(Larrick等，1991，《生物技术》(Biotechniques)11：152-156)。还可以将相似的策略用于扩增来自人抗体的人重链和轻链可变区(Larrick等，1991，《方法：与酶学方法的比较》(Method：Companionto Methods in Enzymology)2：106-110)。
在一个解释性实施方案中，使用标准方案从B淋巴细胞例如外周血细胞、骨髓或脾制备物中分离RNA(例如美国专利号US4,683,202；Orlandi，等，PNAS(1989)86：3833-3837；Sastry等，PNAS(1989)86：5728-5732；和Huse等(1989)《科学》(Science)246：1275-1281。)。使用对重链和每条K和X轻链恒定区具有特异性的引物以及用于信号序列的引物来合成cDNA第一链。使用可变区PCR引物以单独或组合的方式扩增重链和轻链的可变区，并将其连入合适的载体，以便进一步在生产展示包装物中进行操作。可用于扩增方案的寡核苷酸引物可以是独有的，或者简并的，或者在简并位置处掺入肌苷。还可以将限制性内切核酸酶识别序列掺入所述引物中，以便将扩增的片段以预定读框的形式克隆入载体中进行表达。
可以用展示包装的群体、优选来源于丝状噬菌体的展示包装的群体表达克隆自免疫接种衍生抗体的所有组成成分的V-基因文库，以便形成抗体展示文库。理想的情况是，这种展示包装包括一种系统，该系统可以对极大的杂化抗体展示文库取样、在每次亲合分离循环后快速分拣并从纯化的展示包装中便利地分离所述抗体。除用于生产噬菌体展示文库的商购试剂盒(例如Pharmacia的重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)之外，特别适用于生产杂化抗体展示文库的方去和试剂的实例也可以在下列文献中找到：例如Ladner等的美国专利号US5,223,409；Kang等，国际公开号WO92/18619；Dower等，国际公开号WO91/17271；Winter等，国际公开号WO92/20791；Markland等，国际公开号WO92/15679；Breitling等，国际公开号WO93/01288；McCafferty等，国际公开号WO92/01047；Garrard等，国际公开号WO92/09690；Ladner等，国际公开号WO90/02809；Fuchs等(1991)《生物技术》(Bio/Technology)9：1370-1372；Hay等(1992)《人抗体杂交瘤》(HumAntibodHybridomas)3：81-85；Huse等(1989)《科学》(Science)246：1275-1281；Griffths等(1993)《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBOJ)12：725-734；Hawkins等(1992)《分子生物学杂志》(J Mol Biol)226：889-896；Clackson等(1991)《自然》(Nature)352：624-628；Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等(1991)《生物技术》(Bio/Technology)9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)《核酸研究》(Nuc Acid Res)19：4133-4137；和Barbas等(1991)PNAS88：7978-7982。
在某些实施方案中，可以在通过柔性接头连接的相同多肽上表达重链和轻链的V区结构域，以便形成单链Fv片段，且随后将scFV基因克隆入所需的表达载体或噬菌体基因组。正如McCafferty等在《自然》(Nature)(1990)348：552-554中一般性描述的，可以将通过柔性(Gly4-Ser)3接头连接的抗体的完整VH和VL结构域用于产生可使得展示包装基于抗原亲和性进行分离的单链抗体。随后可以将对所述抗原具有免疫反应性的分离的scFV抗体配制成用于本发明主题方法的药物制剂。
一旦在展示包装(例如丝状噬菌体)表面进行了展示，则用靶抗原或其肽片段筛选抗体文库，以便鉴定和分离可表达对所述靶抗原具有特异性的抗体的包装。可以从展示包装中(例如从噬菌体基因组中)回收编码筛选的抗体的核酸，并通过标准重组DNA技术将其亚克隆入其它表达载体。
可以按照本领域中公知的方法、例如包括筛选文库的方法(Ladner，R.C.等，美国专利US5,233,409；Ladner，R.C.，等，美国专利US5,403,484)，制备对表面蛋白具有高度亲和性的特异性抗体分子。此外，可以在筛选过程中使用这些文库，以便获得属于抗体结构决定簇模拟物的结合决定簇。
特别地，特定抗体分子的Fv结合表面与其靶配体按照蛋白-蛋白相互作用的原理发生相互作用，由此VH和VL(它们中的后者可以是κ或λ链型)的序列数据是本领域技术人员所公知的蛋白质工程技术的基础。包括结合决定子的蛋白质表面的具体组成可以获自抗体序列信息，该步骤通过使用由NMR研究或结晶数据获得的其它抗体的预定三维结构的建模过程来进行。例如，参见Bajorath，J.和S.Sheriff，1996，《蛋白质：结构、功能和遗传学》(Proteins：Struct.，Funct.，and Genet.)24(2)，152-157；Webster，D.M.和A.R.Rees，1995，“抗体结合位点的分子模拟”(″Molecular modeling ofantibody-combining sites″)-S.Paul，编辑，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biol.)51：“抗体工程方案”(AntibodyEngineering Protocols)，Humana Press，Totowa，NJ，pp17-49；和Johnson，G.，Wu，T.T.和E.A.Kabat，1995，“Seqhunt：用于筛选比对核苷酸和氨基酸序列的程序”(″Seqhunt：A program to screen alignednucleotide and amino acid sequences″)-《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biol.)51，在所引的文献中的1-15页。
在一个实施方案中，通过一种展示包装群体来表达杂化肽文库，以便形成肽展示文库。理想的情况乏，该展示文库包括一种系统，该系统可以对极大的杂化肽展示文库取样、在每次亲合分离循环后快速分拣并从纯化的展示包装中便利地分离编码肽的基因。肽展示文库例如可以位于原核生物体和病毒中，它们可以被快速扩增、相对易于操纵且可以生成大量克隆。优选的展示包装例如包括植物性细菌细胞、细菌孢子，且最优选细菌病毒(尤其是DNA病毒)。然而，本发明还关注包括酵母及其孢子在内的真核细胞作为有潜力的展示包装的用途。噬菌体展示文库如上所述。
其它技术包括亲和色谱法，其中使用合适的″受体″、例如靶抗原，随后通过常规技术(例如质谱法和NMR)鉴定分离的结合剂或配体。优选所述的可溶性受体与可被检测以指示配体结合的标记(例如荧光团、显色酶、放射性同位素或发光化合物)缀合。另一方面，可以选择性释放固定化化合物且允许它们通过膜扩散而与受体发生相互作用。
还可以用″标记″合成化合物的组合文库，以便指示所述文库中每种成分的身份(例如，参见W.C.Still等，国际申请WO94/08051)。一般来说，这种方法的特征在于使用惰性的而便于可检测的标记，它们结合在固体支持物上或与所述化合物连接。当检测活性化合物时，通过鉴定独有的附带标记来确定化合物的身份。这种标记方法可合成化合物的较大文库，就该文库中全部组的所有化合物而言，可以鉴定极低浓度的所述化合物。
术语修饰的抗体还用来包括已经通过例如缺失、添加或取代所述抗体的部分而修饰的抗体，诸如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，可以通过缺失铰链区来修饰抗体，由此产生单克隆抗体。任意的修饰均属于本发明的范围，条件是所述抗体带有至少一种特异性的抗原结合区。
可以通过本领域中公知的重组DNA技术生产嵌合小鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)。例如，用限制酶消化编码鼠(或其它种类)单克隆抗体的Fc恒定区的基因，以便除去编码鼠Fc的区，并取代成编码人Fc恒定区的基因的等同部分。(参见Robinson等，国际专利公开号PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184，187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO86/01533；Cabilly等，美国专利号US4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，《免疫学杂志》(J.Immunol.)139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-2l8；Nishimura等，1987，《癌症研究》(Canc.Res.)47：999-1005；Wood等(1985)《自然》(Nature)314：446-449；和Shaw等，1988，《国家癌症研究所杂志》(J.NatlCancer Inst.)80：1553-1559)。
可以进一步用来自人Fv可变区的等同序列取代并不直接涉及抗原结合的Fv可变区序列，使嵌合抗体人源化。Morrison，S.L.在1985《科学》(Science)229：1202-1207和Oi等在1986《生物技术》(BioTechniques)4：214中提供了对人源化嵌合抗体的一般性综述。那些方法包括分离、操作和表达可编码来自重链或轻链中至少一种的免疫球蛋白Fv可变区的全部或部分的核酸序列。这类核酸的来源对本领域技术人员而言是众所周知的，且例如可以获自一种产生抗-GPIIbIIIa抗体的杂交瘤7E3。然后可以将编码嵌合抗体或其片段的重组DNA克隆入合适的表达载体。另一方面，可以通过CDR取代来生产合适的人源化抗体，参见：美国专利US5,225,539；Jones等1986《自然》(Nature)321：552-525；Verhoeyan等1988《科学》(Science)239：1534；和Beidler等1988《免疫学杂志》(J Immunol.)141：4053-4060。
可以用至少部分非人的CDR来取代特定人抗体的全部CDR，或可以用非人的CDR仅取代特定人抗体的某些CDR。唯一必须的是取代人源化抗体与Fc受体结合所需数量的CDRs。
可以通过任意方法使抗体人源化，所述的方法能够用来源于非人抗体的CDR取代人抗体CDR的至少一部分。Winter描述了一种可以用于制备本发明人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A，1987年3月26日提交)，特别将该文献的内容引入作为参考。可以使用寡核苷酸定点诱变用非人的CDRs取代人CDRs。
本发明范围内还包括嵌合抗体和人源化抗体，其中已经取代、缺失或添加了特定的氨基酸。特别地，优选的人源化抗体在构架区内具有氨基酸取代，由此可以改善与抗原的结合。例如，在带有小鼠CDRs的人源化抗体中，可以用位于小鼠抗体相应位置上的氨基酸取代位于人构架区中的氨基酸。已知在某些情况中，这类取代可以改善人源化抗体与抗原的结合。已经添加、缺失或取代了氨基酸的抗体在本文中称作已修饰抗体或已改变的抗体。
靶抗原
在优选的实施方案中，本发明融合蛋白中的第一种成分是靶向剂，例如对例如抗体、配体或酶这样的靶物具有高度亲和性的多肽。因此，可以将本发明的融合蛋白用于使该融合蛋白中的第二种成分选择性地定向于(例如定位于)不需要细胞的附近。
例如，所述的第一种成分可以是与靶抗原发生相互作用(例如与靶抗原结合)的免疫球蛋白。在某些实施方案中，所述靶抗原存在于细胞、例如异常细胞、诸如增殖过度细胞(例如癌细胞)的表面上。例示的靶抗原包括癌胚抗原(CEA)、TAG-72、her-2/neu、表皮生长因子受体、转铁蛋白受体等。
本文所用的″靶细胞″应指可以由本发明融合蛋白靶向的受试者(例如人或动物)体内任意不需要的细胞。例示的靶细胞包括肿瘤细胞，诸如癌或腺癌衍生的细胞(例如结肠、乳腺、前列腺、卵巢和子宫内膜癌细胞)(Thor，A.等(1997)《癌症研究》(Cancer Res)46：3118；SoissonA.P.等(1989)《美国妇产科学杂志》(Am.J.Obstet.Gynecol.)：1258-63)。术语″癌″是本领域中公知的，指的是上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。典型的癌包括从宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈、结肠和卵巢的组织中形成的那些癌。该术语还包括癌肉瘤，例如包括由癌组织和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。″腺癌″指的是来源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语″肉瘤″是本领域中公知的，指的是间充质衍生的恶性肿瘤。
融合蛋白的生产
所述融合蛋白的第一种成分和第二种成分可以彼此连接，优选通过接头序列彼此连接。所述的接头序列应隔开所述融合蛋白的第一种成分和第二种成分足够的距离，以确保每种成分适当折叠成其二级和三级结构。优选的接头序列(1)应采取柔性扩展的构象、(2)不应显示出具有发展成可以与功能性第一种成分和第二种成分发生相互作用的有序二级结构的倾向，且(3)应具有可促进与功能性蛋白结构域的相互作用的最低程度的疏水或带电特性。柔性蛋白区中典型的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser。预计含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列变换可满足接头序列的上述标准。还可以将诸如Thr和Ala这样的其它近中性氨基酸用于所述的接头序列。
可以将长度为20个氨基酸的接头序列用于适当隔开功能性蛋白结构域，不过也可以使用较长或较短的接头序列。隔开第一种成分和第二种成分的接头序列可以为5-500个氨基酸长度，或更优选5-100个氨基酸长度。优选所述的接头序列约为5-30个氨基酸长度。在优选的实施方案中，所述的接头序列约为5-约20个氨基酸，且有利的是约为10-约20个氨基酸。可用作第一种成分和第二种成分的接头的氨基酸序列包括但不限于：(SerGly4)y，其中y大于或等于8；或者Gly4SerGly5Ser。优选的接头序列具有式(SerGly4)4。另一种优选的接头具有序列((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro)。
第一种成分和第二种成分可以直接融合而不需要接头序列。当融合的蛋白质具有非必需的可以用于隔开功能性结构域和防止空间干扰的N-或C-末端氨基酸区时，接头序列不是必须的。在优选的实施方案中，可以使第一种成分的C-末端与第二种成分的N-末端直接融合，反之也可。
重组生产
可以使用应用编码所述融合蛋白的核酸分子的标准重组DNA技术制备本发明的融合蛋白。可以通过标准DNA合成方法合成编码融合蛋白的核苷酸序列。
可以将编码融合蛋白的核酸导入宿主细胞、例如原代或无限增殖化细胞系的细胞。可以将重组细胞用于生产所述的融合蛋白。例如，可以通过同源重组将编码融合蛋白的核酸导入宿主细胞。在大部分情况中，可以将编码所述融合蛋白的核酸掺入重组表达载体。
可以使编码融合蛋白的核苷酸序列可操作地与基于待用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列连接。术语″可操作地连接″指的是编码所述融合蛋白化合物的序列以允许表达所述融合蛋白的方式与所述调节序列连接。术语″调节序列″指的是启动子、增强子和其它表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)。这类调节序列例如描述在下列文献中：Goeddel；《基因表达技术：酶学方法》(Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)，将该文献的内容引入本文作为参考。调节序列包括那些指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中的组成型表达的调节序列、那些指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的调节序列(例如组织特异性调节序列)和那些以可调节方式指导表达的调节序列(例如仅在有诱导剂存在的情况下)。本领域技术人员可以理解所述表达载体的设计可能取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需融合蛋白的表达水平等这样的因素。可以将融合蛋白表达载体导入宿主细胞而由此产生由核酸编码的融合蛋白。
可以为原核细胞或真核细胞中融合蛋白的表达设计重组表达载体。例如，可以在诸如大肠杆菌这样的细菌细胞、昆虫细胞(例如在杆状病毒表达载体系统中)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达融合蛋白。一些合适的宿主细胞进一步描述在下列文献中：Goeddel；《基因表达技术：酶学方法》(Gene Expression Technology：Methods inEnzymology)185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。用于在啤酒糖酵母中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)《细胞》(Cell)30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)《基因》(Gene)54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达融合蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.，和Summers，M.D.，(1989)《病毒学》(Virology)170：31-39)。
哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.，(1987)《自然》(Nature)329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的调控功能通常由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
除上述调节控制序列外，所述的重组表达载体还可以含有其它核苷酸序列。例如，所述的重组表达载体可以编码选择标记基因以便鉴定已经导入了所述载体的宿主细胞。此外，为了有利于从宿主细胞、尤其是哺乳动物宿主细胞中分泌所述融合蛋白，所述的重组表达载体可以编码可操作地与编码所述融合蛋白氨基末端的序列连接的信号序列，使得在表达时，合成的融合蛋白尤其氨基末端融合了信号序列。这种信号序列指导所述融合蛋白进入细胞的分泌途径且然后使其裂解，从而从宿主细胞中释放成熟的融合蛋白(即不含所述信号序列的所述融合蛋白)。利用信号序列促进从哺乳动物宿主细胞中分泌蛋白质或肽类在本领域中是公知的。
可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入原核细胞或真核细胞。本文所用的术语″转化″和″转染″指的是用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的各种本领域的已知技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染法、脂转染法、电穿孔法、显微注射法和病毒介导的转染法。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等《分子克隆实验指南》第2版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress(1989))和其它实验室指南中找到。
通常仅有小部分哺乳动物将外源DNA整合入其基因组。为了鉴定并筛选这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与编码所述融合蛋白的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些赋予对诸如G418、潮霉素和氨甲蝶呤这样的药物的抗性的选择标记。可以将编码选择标记的核酸与编码所述融合蛋白的核酸在同一载体上导入宿主细胞中，或将其在单独的载体上导入。通过药物筛选可以鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞(例如已经掺入了所述选择标记基因的细胞会存活，而其它细胞则死亡)。
可以在体外，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶，转录并翻译重组表达载体。
转基因哺乳动物
用于生产非人的转基因动物的方法如本文所述。可以将DNA构建体导入哺乳动物的生殖系以便产生转基因哺乳动物。例如，可以通过标准转基因技术将所述构建体的一个或几个拷贝导入哺乳动物胚胎的基因组。
通常比较理想的是在转基因哺乳动物的奶中表达转基因蛋白。优选可产大量奶并具有较长的分泌乳汁期的哺乳动物。优选的哺乳动物是：反刍动物，例如母牛、绵羊、骆驼或山羊，例如来源于瑞士的山羊，例如Alpine、Saanen和Toggenburg种山羊。其它优选的动物包括牛、兔和猪。
在一个典型的实施方案中，通过将转基因导入非人动物的生殖系来生产转基因的非人动物。可以在不同的发育阶段将转基因导入胚胎靶细胞。根据所述胚胎靶细胞发育阶段的不同而使用不同的方法。如果可能，应对所用的任何动物的具体品系进行选择以便获得一般良好的健康、良好的胚胎产量、胚胎中良好的原核可见性和良好的繁殖适度。
可以通过诸如显微注射、电穿孔或脂转染这样本领域中公知的各种方式中的任意一种将所述融合蛋白转基因导入所述胚胎。例如，可以通过将所述构建体显微注射入受精的哺乳动物卵的原核而将融合蛋白转基因导入哺乳动物，以使所述构建体的一个或多个拷贝在发育中的哺乳动物细胞中得到保留。在将所述的转基因构建体导入受精卵后，可以在体外将该卵孵育不同的时间，或再植入替代宿主或实施这两个步骤。一种常用的方法是根据种类的不同在体外将胚胎孵育约1-7天，然后将其重新植入替代宿主。
可以通过对组织的部分进行DNA印迹分析来对以转基因方式操作的胚胎的子代测试所述构建体的存在。可以将含有稳定整合入基因组的外源性克隆构建体的一个或多个拷贝的胚胎用于建立携带以转基因方式添加的构建体的永久性转基因哺乳动物品系。
可以在出生后检测以转基因方式改变的哺乳动物的幼崽，以便确定是否所述构建体掺入了所述后代的基因组。该步骤可以通过将相当于编码所述融合蛋白的DNA序列或其片段的探针杂交到来自子代的染色体物质上来进行。将发现在其基因组中含有至少一个所述构建体拷贝的哺乳动物子代生长至成熟。这些子代的雌性种类会在其奶中或与奶一起产生所需的蛋白质。可以将这种转基因哺乳动物繁殖，以产生可用于在其奶中生产所需蛋白质的其它转基因子代。
可以使用本领域中公知的试验技术、例如蛋白质印迹或酶试验对转基因雌性动物的蛋白质分泌入奶的情况进行测试。
其它转基因动物
可以由多种转基因动物表达融合蛋白。用于生产转基因猪的方案可以在下列文献中找到：White和Yannoutsos，“补体研究中的最新主题：第64届免疫学讨论会”(Current Topics in Complement Research：64th Forumin Immunology)，88-94页；美国专利号US5,523,226；美国专利号US5,573,933；PCT申请WO93/25071；和PCT申请WO95/04744。用于生产转基因小鼠的方案可以在美国专利号US5,530,177中找到。用于生产转基因大鼠的方案可以在Bader和Ganten的《临床和实验药理学和生理学》(Clinical and Experimental Pharmacology andPhysiology)增刊3：S81-S87，1996中找到。用于生产转基因母牛的方案可以在《转基因动物技术手册》(Transgenic Animal Technology，AHandbook)1994年版，Carl A.Pinkert，Academic Press，Inc.中找到。用于生产转基因绵羊的方案可以在《转基因动物技术手册》(Transgenic Animal Technology，A Handbook)1994年版，Carl A.Pinkert，Academic Press，Inc.中找到。用于生产转基因兔的方案可以在Hammer等的《自然》(Nature)31：680-683，1985和Taylor和Fan的《生物科学前沿》(Frontiers in Bioscience)2：d298-308，1997中找到。
转基因动物奶中转基因蛋白质的生产
乳特异性启动子
有用的转录启动子是那些优先在乳腺上皮细胞中激活的启动子，包括控制编码诸如酪蛋白、β乳球蛋白(Clark等(1989)《生物/技术》(Bio/Technology) 7：487-492)、乳清酸性蛋白(Gorton等(1987)《生物/技术》(Bio/Technology) 5：1183-1187)和乳清蛋白(Soulier等，(1992)《FEBS通讯》(FEBS Letts.) 297： 13)这样的乳蛋白的基因的启动子。可以将任何哺乳动物种类的α、β、γ或κ酪蛋白基因启动子用于提供哺乳动物的表达；优选的启动子是山羊β酪蛋白基因启动子(DiTullio，(1992)《生物技术》(Bio/Technology)10：74-77)。乳特异性蛋白启动子或特异地在乳腺组织中激活的启动子可以分离自cDNA或基因组序列。优选它们是基因组来源。
可以获得至少一种、常常是数种生物体中上述所列乳腺特异性基因的DNA序列信息。例如，参见Richards等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)256，526-532(1981)(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee&Rosen，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，《生物化学杂志》(Biochem.J.)242，735-742(1987)(人α-乳清蛋白)；Stewart，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)12，389(1984)(牛αsl和κ酪蛋白cDNAs)；Gorodetsky等，《基因》(Gene)66，87-96(1988)(牛β酪蛋白)；Alexander等，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)178，395-401(1988)(牛κ酪蛋白)；Brignon等，《FEBS通讯》(FEBS Lett.)188，48-55(1977)(牛αS2酪蛋白)；Jamieson等，《基因》(Gene)61，85-90(1987)，Ivanov等，《生物学与化学》(Biol.Chem.)Hoppe-Seyler369，425-429(1988)，Alexander等，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)17，6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte等，《生物化学》(Biochimie)69，609-620(1987)(牛α-乳清蛋白)。不同乳蛋白基因的结构和功能由Mercier&Vilotte在《乳品科学杂志》(J.Dairy Sci.)76，3079-3098(1993)中综述(为了全部目的而将这些文献的全部内容引入作为参考)。如果其它侧翼序列可用于优化表达，那么可以使用存在的序列作为探针来克隆这类序列。可以通过使用已知的关联核苷酸序列或针对关联蛋白的抗体作为探针，筛选这类生物体的文库，来获得来自不同生物体的乳腺特异性调节序列。
信号序列
有用的信号序列是乳特异性信号序列或导致原核或真核蛋白分泌的其它信号序列。优选所述的信号序列选自乳特异性信号序列，即它来自编码分泌入乳的产物的基因。最优选所述的乳特异性信号序列与用于本发明表达系统的乳特异性启动子相关。信号序列的大小对本发明而言并不关键。所要求的只是所述序列应具有足以使所需重组蛋白例如在乳腺组织中分泌的大小。例如，来自编码例如α、β、γ或κ酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白和乳清蛋白这样的酪蛋白的基因的信号序列可用于本发明。优选的信号序列是山羊β-酪蛋白信号序列。
还可以使用来自其它分泌蛋白，例如免疫球蛋白，或由肝细胞、肾细胞或胰腺细胞分泌的蛋白质的信号序列。
绝缘子序列
本发明的DNA构建体进一步包括至少一种绝缘子序列。术语″绝缘子″、″绝缘子序列″和″绝缘子元件″在本文中可以互换使用。绝缘子元件是可将置于其作用范围内的基因转录绝缘而不会负面或正面影响基因表达的调控元件。优选将绝缘子序列插在所转录的DNA序列的任一侧上。例如，所述的绝缘子可以定位于距启动子5’约200bp-约1kb，距启动子5’约1kb-5kb，目的基因3’末端。绝缘子序列距所述启动子和目的基因3’末端的距离可以由本领域技术人员根据目的基因的相对大小、构建体中所用启动子和增强子的不同来测定。此外，可以有一个以上绝缘子序列位于启动子的5’或位于转基因的3’末端。例如，可以有两个或多个绝缘子序列位于启动子的5’。转基因3’末端的绝缘子可以位于目的基因的3’末端，或3’调节序列、例如3’非翻译区(UTR)或3’侧翼序列的3’末端。
优选的绝缘子是一种包括鸡β-珠蛋白基因座的5’末端且相当于如PCT公开号94/23046中所述的鸡5’组成型超敏位点的DNA区段，将所述文献的内容引入本文作为参考。
DNA构建体
可以由包括对乳腺上皮细胞具有特异性的启动子和编码融合蛋白的DNA的构建体表达融合蛋白，所述的启动子例如酪蛋白启动子、例如山羊β酪蛋白启动子、乳特异性信号序列、例如酪蛋白信号序列、例如β-酪蛋白信号序列。
构建体还可以包括编码非分泌蛋白质的DNA序列3’非翻译区的下游。这类区可以使表达系统中的RNA转录物保持稳定，由此增加来自所述表达系统的所需蛋白质的产量。可用于本发明构建体的3’非翻译区包括提供聚腺苷酸信号的序列。这类序列例如可以来源于SV40小t抗原、酪蛋白3’非翻译区或其它本领域中众所周知的3’非翻译序列。优选所述的3’非翻译区来源于乳特异性蛋白。该3’非翻译区的长度并不关键，而其聚腺苷酸转录物的稳定作用看起来在使表达序列中的RNA保持稳定方面是重要的。
构建体可以包括启动子与编码信号序列的DNA序列之间的5’非翻译区。这类非翻译区可以来自启动子所来源的相同调控区，或来自不同基因，例如，它们可以来源于其它合成、半合成或天然来源。同样，其具体长度并不关键，然而，看起来它们可用于改善表达水平。
构建体还可以包括约10％、20％、30％或30％以上优选在乳腺上皮细胞中表达的基因的N-末端编码区。例如，该N-末端编码区可以相当于所用的启动子、例如山羊β-酪蛋白N-末端编码区。
现有技术的方法可以包括制备一种构建体，并在将该构建体置于转基因动物体内前测试其在培养细胞中产生产物的能力。令人意外的是，本发明者已经发现，这类方案在确定是否例如可以在转基因动物的奶中分泌通常并不分泌的蛋白质方面可能并不具有预计的价值。因此，可能比较理想的是直接在转基因动物、例如转基因小鼠体内测试构建体，因为某些不能在CHO细胞中分泌的构建体却能分泌入转基因动物的乳中。
从奶中纯化
转基因融合蛋白可以以相对高的浓度和较大的体积在奶中产生，从而连续高水平输出易于从可再生来源中收获的正常加工的肽。本领域中存在几种用于从奶中分离蛋白质的不同方法。
通常通过组合方法分离乳蛋白。例如，首先通过撇去、离心、沉淀(H.E.Swaisgood，《乳品化学进展》(Developments in DairyChemistry)，I：“乳蛋白化学”(Chemistry of Milk Protein)，AppliedScience Publishers，NY，1982)、酸沉淀(美国专利号US4,644,056)或使用凝乳酶或胰凝乳蛋白酶的酶凝固(Swaisgood，文献同上)将原料乳分级分离以除去脂肪。下一步可以将主要的乳蛋白分级分离成澄清溶液或大量沉淀物，从其中易于纯化出感兴趣的特定蛋白质。
USSNO8/648,235中公开了一种用于通过切向流过滤由全乳或乳级分以生物活性形式分离诸如肽这样的可溶性乳成分的方法。不同于现有的分离方法，这种方法不需要首先将全乳分级分离以除去脂肪和酪蛋白胶团，由此简化了工艺且避免了回收率和生物活性的损耗。可以将这种方法与其它纯化步骤联合使用，以便进一步除去污染物并纯化感兴趣的成分。
转基因动物卵中转基因蛋白的生产
融合蛋白可以在转基因动物的组织、分泌物或其它产物、例如卵中产生。例如，可以使用本领域中公知的方法，在转基因动物、优选转基因火鸡、鸭、鹅、鸵鸟、几内亚鸟(guinea fowl)、孔雀、partridge、pheasant、鸽子且更优选转基因鸡的卵中产生融合蛋白(Sang等，《生物技术趋向》(Trends Biotechnology)，12：415-20，1994)。可以修饰诸如卵黄-蛋白基因和清蛋白-蛋白基因这样的编码在卵中特异性表达的蛋白质的基因，以便指导融合蛋白的表达。
卵特异性启动子
有用的转录启动子是那些优先在卵中活化的启动子，包括调控编码例如卵清蛋白、溶菌酶和抗生物素蛋白这样的卵蛋白的基因的启动子。优选来自鸡卵清蛋白、溶菌酶或抗生物素蛋白基因的启动子。卵特异性蛋白启动子或特异地在卵组织中活化的启动子可以来自cDNA或基因组序列。优选所述的卵特异性启动子来源于基因组。
卵特异性基因的DNA序列在本领域中是公知的(例如，参见Burley等，《鸟类的卵》(″The Avian Egg″)，John Wiley和Sons，472页，1989，将该文献的内容引入本文作为参考)。如果其它侧翼序列可用于优化表达，那么可以使用现有的序列作为探针来克隆这类序列。可以通过使用公知的关联核苷酸序列或针对关联蛋白的抗体作为探针筛选这种生物体文库，来获得来自不同生物体的卵特异性调节序列。
转基因植物
可以在转基因生物体、例如转基因植物、例如DNA转基因插入到核或质体基因组的转基因植物中表达融合蛋白。植物的转化为本领域所公知。通常参见：《酶学方法》(Methods in Enzymology)第153卷(“重组DNA部分D”(″Recombinant DNA Part D″))1987，Wu和Grossman编辑，Academic Press；和欧洲专利申请EP693554。
可以通过几种方法将外源核酸导入植物细胞或原生质体。例如，可以通过使用微量吸管进行显微注射而以机械方式将核酸直接转入植物细胞。还可以通过使用与由细胞吸收的遗传物质形成沉淀复合物的聚乙二醇将外源核酸转入植物细胞(Paszkowski等(1984)《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)3：2712-22)。可以通过电穿孔将外源核酸导入植物细胞(Fromm等(1985)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：5824)。在这项技术中，在有含有相关遗传构建体的质粒或核酸存在的情况下对植物原生质体实施电穿孔。高场强的电脉冲以可逆方式透化生物膜，从而可导入质粒。电穿孔植物的原生质体重新形成细胞壁、分裂并形成了植物愈伤组织。可以使用表型标记完成被转化基因转化了的植物细胞的筛选。
可以将花椰菜花叶病毒(CaMV)用作将外源核酸导入植物细胞的载体(Hohn等(1982)《植物肿瘤的分子生物学》(″Molecular Biology ofPlant Tumors″)，Academic Press，New York，549-560页；Howell，美国专利号US4,407,956)。将CaMV病毒DNA基因组插入亲代细菌质粒，生成可在细菌中增殖的重组DNA分子。可以通过导入所需的DNA序列来进一步修饰重组质粒。然后从亲代细菌质粒中切下所述重组质粒的经修饰病毒部分，并用于接种植物细胞或植物。
可以将通过小粒子进行高速弹击渗入的技术用于将外源核酸导入植物细胞。将核酸分布在小珠或粒子的基质内或表面上(Klein等(1987)《自然》(Nature)327：70-73)。尽管一般仅需要一次导入新核酸片段，但是本方法还可提供多次导入。
可以通过用根癌农杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子而将核酸导入植物细胞，所述的根癌农杆菌用所述核酸进行了转化。在合适的条件下，使转化的植物细胞生长成苗、根并进一步发育成植物。例如，可以通过根癌农杆菌的Ti质粒将该核酸导入植物细胞。所述的Ti质粒在用根癌农杆菌感染时透入植物细胞且稳定地整合入植物基因组(Horsch等(1984)：“植物中功能性外源基因的遗传”(″Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants″)，《科学》(Science)233：496-498；Fraley等(1983)《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：4803)。
可以转化可以分离出原生质体并培养成完整再生植物的植物，使得可以回收含有转化的外源基因的完整植物。某些合适的植物例如包括来自草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食豆属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、鼠耳芥属、芸苔属、萝卜属、白芥鼠、颠茄属、辣椒属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、Ciohorium、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、Hererocallis、龙面花属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、Salpiglossis、香瓜属、Browaalia、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属和曼陀罗属的品种。
从培养的原生质体中再生植物的技术描述在下列文献中：Evans等，“原生质体的分离和培养”-《植物细胞培养手册》(Handbook of PlantCell Cultures)1：124-176(MacMillan Publishing Co.New York1983)；M.R.Davey，“植物原生质体的培养和再生中的最新进展”-《原生质体(1983)-演讲记录汇编》(Protoplasts(1983)-LectureProceedings)，12-29页，(Birkhauser，Basal 1983)；P.J.Dale，“谷类植物和其它抗性农作物的原生质体培养和植物再生”-《原生质体(1983)-演讲记录汇编》(Protoplasts(1983)-LectureProceedings)，31-41页，(Birkhauser，Basel 1983)；和H.Binding，“植物的再生”-《植物原生质体》(Plant Protoplasts)21-73页，(CRCPress，Boca Raton 1985)。
从原生质体再生随植物的品种与品种之间的不同而改变，但通常是首先产生含有外源序列拷贝的转化原生质体的混悬液。在某些品种中，随后可以由该原生质体混悬液诱导胚形成至作为天然胚的成熟和发芽阶段。培养基可以含有不同的氨基酸和激素，诸如生长素和细胞分裂素。另外有利的是向所述培养基中添加谷氨酸和脯氨酸，尤其是对诸如玉米和苜蓿这样的品种而言更是如此。苗和根通常同时发育。有效的再生将取决于培养基、基因型和培养史。如果控制这三种可变因素，那么再生过程是完全可再生的和可重复的。
在营养繁殖的作物中，可以通过获得插条或通过组织培养技术使成熟的转基因植物繁殖成多种相同植物用于试验，诸如测试产量特征。进行对所需转基因植物的筛选，由此获得新的品种，并对其进行营养繁殖以用于商业销售。在种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可以自交成纯合的近交植物。这种近交植物产生含有新近导入的外源基因活性水平的基因的种子。可以使这些种子生长成具有所选择的表型的植物。可以将本发明的近交体用于开发新的杂种。在该方法中，选择的近交系与另一种近交系杂交成所述杂种。
本发明包括诸如花、种子、叶、枝条、果实等这样获自转基因植物的部位，条件是这些部位包括已经如此转化的细胞。本发明范围内还包括再生植物的子代和变体以及突变株，条件是这些部分包括导入的DNA序列。本发明范围内还包括再生植物的子代和变体以及突变株。
对转基因植物或植物细胞的筛选可以基于一种视觉试验，诸如观察色泽的改变(例如白色的花、可变的色素产生和花上均匀的色泽图案或不规则的图案)，还可以包括对酶活性或产物定量进行生化试验。转基因植物或植物细胞可以生长成具有目的植物部分的植物，且诸如通过下列方法监测基因活性：视觉外观(就黄酮类化合物基因而言)或生化试验(RNA印迹)；蛋白质印迹；酶试验和黄酮类化合物试验、包括光谱法，参见Harborne等(编辑)，(1975)《黄酮类化合物》(TheFlavonoids)，第1卷和第2卷[Acad.Press]。选择合适的植物并进一步评价。用于生产遗传工程植物的方法描述在美国专利号US5,283,184、美国专利号US5,482,852和欧洲专利申请EP693554中，将所有这些文献引入本文作为参考。通过下列实施例来进一步解释本发明的实施方案，这些实施例不应起限定作用。特别将本中请全文中引用的全部引用参考文献的内容(包括文献参考书、授权的专利、公开的专利申请和未审的专利申请)引入本文作为参考。实施例1： 抗体-羧肽酶B融合体的生成和测试
将F(ab’)2-酶融合蛋白亚克隆入山羊β-酪蛋白表达载体BC350。就3种构建体213(MF21q3-13，Fd-酶融合基因)、LC(LC3，轻链)和141(MF141-4，带有C-末端亮氨酸的pro结构域)中的每一种而言，从细菌质粒序列中分离表达盒。然后将三种转基因共同显微注射入小鼠的合子。分析携带所有3种F(ab’)2-酶融合蛋白抗体亚单位的7个转基因小鼠品系和仅携带转基因LC和213的3个品系。从建立者(founder)和第一代雌性动物体中收集乳样品并对其进行ELISA和酶活性试验测试。携带3种转基因的7个品系中的4个以超过1mg/ml(可能高达4-6mg/ml)的水平表达F(ab’)2-酶融合蛋白，而仅携带LC和213转基因的所有3个品系以低于0.1mg/ml的水平表达。
制作表达人源化抗体片段-酶融合蛋白(F(ab’)2-CPB)的转基因小鼠，其中所述的融合蛋白包括人源化抗癌胚抗原(CEA)F(ab’)2，806.077及与之融合的经修饰的人羧肽酶B酶。通过将三种山羊β-酪蛋白乳腺表达构建体共同显微注射来生产这些转基因小鼠。一种构建体141(MF141-4，带有C-末端亮氨酸的pro结构域)表达CPB的pro-结构域，其它2种构建体LC和213(分别为轻链和Fd-酶融合基因)表达抗体-CPB融合体。上述实验表明，反式表达CPB pro-结构域对于基于成熟CPB的融合蛋白的适当折叠而言是必需的。材料和方法
限制酶获自New England Biolabs，Beverly，MA。尼龙膜(MagnaGraph尼龙转移膜)获自Micron Sepasrat ions Inc(MSI，Westboro，MA 01581)。α32P--dATP获自NEN Life Science Products，Inc.Boston，MA。由Sequegen Company，Worcester，MA进行测序。质粒，即含有MF21q3-13Fd-酶融合基因的213、含有806.077轻链编码区的LC和141 Zeneca Pharmaceuticals.CD1小鼠获自CharlesRiver Labs，Wilmington，MA。注射片段的制备
质粒DNA获自Michael D.Edge博士(zeneca Pharmaceuticals)，通过用SalI消化至完全而从载体主链上分离表达盒(各100μg)。然后使用1X TAE(Maniatis等，1982)作为电泳缓冲液，在琼脂糖凝胶中对消化物进行电泳。在UV光(长波)下观测含有相当于所述表达盒的DNA片段的凝胶区。切下含有所关注DNA的带、转入透析袋并通过在1X TAE中进行电洗脱来分离所述DNA。将该步骤用于每个表达盒。
在电洗脱后浓缩DNA片段并将其通过使用″Wizard DNA clean-upsystem″(Promega，Cat #A7280)、实施上述方案且在125ml显微注射缓冲液(10nM Tris pH7.5 EDTA 0.2mM)洗脱来纯化。通过比较型琼脂糖凝胶电泳来评价片段浓度。显微注射片段储备溶液的推定浓度如下：LC，15ng/ml；141ng/ml、180ng/ml；和213，270ng/ml。在原核注射前将该储备溶液共稀释在显微注射缓冲液中，使得每种片段的终浓度为0.5ng.ml。显微注射
使CD1雌性小鼠超排卵并从输卵管中收集受精卵。然后给雄性原核显微注射稀释在显微注射缓冲液中的DNA。将显微注射的胚胎在CZB培养基上培养过夜或直接转入假妊娠受体CD1雌性小鼠的输卵管。将20-30个二细胞胚胎或40-50个单细胞胚胎转入每个受体雌性动物并使之完成妊娠。建立者动物的鉴定
通过用异丙醇沉淀从尾组织中分离基因组DNA并通过聚合酶链反应(PCR)分析鸡β-珠蛋白绝缘子DNA序列的存在情况。该序列是山羊β-酪蛋白(Case)载体(GBC 350)的部分。为了进行PCR反应，将约250ng的基因组DNA与2.5个单位的Taq聚合酶一起在50μl的PCR缓冲液(20mM Tris pH8.3、50mM KCl和1.5mM MgCL2、100μM脱氧核苷三磷酸且每种引物的浓度为600nM)中稀释，并使用下列温度程序进行处理：
1个循环              94℃               60秒
5个循环              94℃               30秒
                     58℃               45秒
                     74℃               45秒
30个循环             94℃               30秒
                     55℃               30秒
                     74℃               30秒引物组：GBC 332和GBC 386，扩增子为206bpGBC 332：TGTGCTCCTCTCCATGCTGG(SEQ ID NO：_)GBC 386 TGGTCTGGGGTGACACATGT(SEQ ID NO：_)转基因建立者的DNA印迹分析：
用限制酶EcoRI将来自就绝缘子PCR而言属于阳性的各建立者小鼠的基因组DNA(总计24μg，8μg/泳道)消化至完全。按一式三份对消化的DNAs进行电泳并按照标准方法(Maniatis等，1982)转到尼龙膜上。通过分别用SalI、Xhol和Xhol切割而从VK(pSP72中的LC10，72bp探针)、ProL(pSP72中的pMF141-4，345bp探针)和fd-CPB(pSP72中的pMF213-20，1861bp探针)质粒(由Michae1 D.Edge，zeneca Pharmaceuticals提供)中分离对每种表达盒具有特异性的探针。使用来自Prime-It″II试剂盒(Stratagene，LaJolla CA 92037)的试剂、按照制造商的说明标记每种探针并在42℃下按照标准方案(Maniatis等，1982)使之在50％甲酰胺中与一组尼龙滤膜杂交。在60℃下用0.2X SSC、0.1％SDS进行洗涤。小鼠的挤奶
使雌性小鼠天然产仔并一般在产后的第7天和第9天挤奶。在挤奶步骤前将小鼠与其幼仔分开约1小时。这样放置1小时后，应用25号针头、使用腹膜内注射溶于无菌磷酸缓冲盐水中的5i.U.催产素诱导小鼠分泌乳汁。激素注射后有1-5分钟的等待期使催产素发挥作用。将一种吸入和收集系统用于挤奶，它由用橡胶塞密封的15ml圆锥形管组成，在橡胶塞上带有两根插入其中的18号针头，一根针头的插孔端插入与人乳腺泵相连的橡胶管中。将小鼠置于笼上部、仅通过其尾固定且另外不限制或约束它们。将另一针头的插孔端置于小鼠的乳头(一次一个)上，以便将奶收集入置于圆锥形管内的各个微量离心管中。在每次采集样品后更换微量离心管。将挤奶持续到至少已经获得了150μl奶为止。收集后将小鼠放回到其幼仔身边。小鼠胚胎的显微注射
将片段共注入1708个小鼠胚胎，将它们中的945个转入31只受体雌性小鼠。在这些雌性小鼠中，27只完成了妊娠过程并产下172只幼仔，它们中有20只在经PCR分析后看起来属于转基因的。在注射的胚胎中，1.2％看起来是转基因的：在出生的幼仔中，11.6％看起来是转基因的。建立者小鼠品系的DNA印迹分析
通过DNA印迹杂交进一步分析使用绝缘子PCR鉴定出的20只转基因建立者，确定出：A-一些对所有三种转基因而言均为阳性的建立者(35、63、73、81、86、92、120、169)是弱嵌合体。它们在使用极为敏感的PCR试验检测时显然是阳性的，但使用DNA杂交没有检测到可靠的阳性信号。6个其它建立者(5、76、121、128、131和161)对转基因中的至少一种而言显然是阳性的，而对其它转基因中的至少一种而言显然是阴性的或嵌合性的。最后，6个建立者(25、67、89、106、161、166)显示有杂交信号，表明各转基因至少有一拷贝。表1：来自β-酪蛋白-F(ab’)2-酶融合蛋白转基因建立者的DNA印迹杂交数据的概括。通过与使用已知量Eco RI消化的显微注射片段获得的信号进行比较来粗略地估计拷贝数(und，指不能通过DNA印迹检测到)。
  建立者   LC转基因估计的拷贝数   141转基因估计的拷贝数   213转基因估计的拷贝数
    5     2     und     2-3
    25     4     4     2
    35     und.     und.     und.
    63     und.     und.     und.
    67     2-3     2-3     3
    73     und.     und.     ＜1
    76     und.     1-2     1
    81     und.     und.     und.
    86     und.     und.     und.
    89     ＞10     ＞10     ＞10
    92     und.     und.     ＜1
    106     3     2-3     1
    120     und.     und.     und.
    121     ＜1     1     1
    128     ＜1     und.     ＜1
    131     ＜1     und.     ＜1
    152     2-3     2-3     2-3
    161     und.     1     ＜1
    166     2-3     3     3-5
    169     und.     und.     und.
小鼠品系的繁殖：
在对建立者进行DNA印迹分析后，选择10个品系用于繁殖：5、25、67、76、89、106、121、128、152和166。表2概括了每个品系的繁殖情况；表3概括了对PCR阳性的F1后代进行的DNA印迹分析。从该分析中可以看出，除#121外，所有的建立者均将其转基因整合传递到了下一代。其它品系(5、25、76、128，参见表2)也表现出了种系嵌合的迹象，其中转基因阳性后代的百分比较低。
DNA印迹分析还提示某些建立者中某些转基因可能有多次整合。例如，属于建立者166后代的200和201看起来具有不同拷贝数的转基因LC和141，而具有相同拷贝数的转基因213。一种解释可能是建立者166在不同的染色体上有至少两个整合位点，一个仅含有LC和141转基因，而另一个含有全部三种转基因。200可以遗传了两个整合位点，而201可能仅遗传了带有全部转基因的位点(也存在其它可能性)。多重整合难以通过DNA印迹分析鉴定，尤其是当包括3种不同的转基因时更是如此。然而，在较大的动物中，我们应用的FISH(原位荧光杂交)和核型分析能够检出多重整合事件。
概括地说，2个建立者(5、76)将双重转基因整合(LC和213)传递给了其后代，6个品系(25、67、89、106、152和166)将全部三种转基因传递给了下一代。另一个建立者128属于LC和213双重转基因，具有转基因后代(232)。然而，没有对这一后代进行分析(它因在繁殖128过程延缓而出生较晚)。没有对该品系进一步进行追踪，因为对128乳的蛋白质分析显示没有明显的融合蛋白产生。表2.转基因建立者的繁殖。使用绝缘子PCR试验分析所有的后代。
    建立者(性别) PCR阳性后代/幼仔(仅分析了雌性) 所选F1转基因雌性动物的ID号
    5(F)     2/10   217，219
    25(F)     1/7   204
    67(M)     1/3   177
    76(F)     1/6   212
    89(F)     2/5   178，179
    106(M)     1/5   186
    121(M)     0/5   无
    128(F)     1/8   232
    152(M)     2/4   194，195
    166(F)     2/6   200，201
表3：来自β-酪蛋白-F(ab’)2-酶融合蛋白转基因F1的DNA印迹杂交数据的概括。通过与使用已知量Eco RI消化的显微注射片段获得的信号进行比较来粗略地估计拷贝数(und，指不能通过DNA印迹检测到)。
  建立者亲代   转基因F1   LC转基因拷贝数 141转基因拷贝数 213转基因拷贝数
    5   217，219     2     0     2
    25   204     3     3     33-4
    67   177     1     1-2？     1-2？
    76   212     2     0     2
    89   178，179     ＞10     ＞10     ＞10
    106   186     3     3-4     2-3
    152   194，195     4-5     4     4-5
    166   200，201     1(2003-4(201)     1(2004(200)     4-5(200和201)
转基因小鼠乳样品的分析：
从建立者雌性动物以及F1转基因雌性动物中采集小鼠乳样品。决定不用PBS稀释乳以避免有可能干扰酶试验。将样品冷冻在-20℃下至测试。将测定结果概括在下面的表4中。表4：对表达人源化抗体片段-酶融合蛋白(Fab’)2-CPB的小鼠乳进行的ELISA和活性测定试验的概括。(NA，不适用)
建立者(性别，转基因) F1(转基因) ELISA浓度(mg/ml) 酶试验(mg/ml)
5(F，LC-213) 217，219(LC-213) 0.092低 0.025低
25(F，LC-213-141) 204(LC-213-141) 1.5*1.5-2 1.2*1.5-2
67(M，LC-213-141) 177(LC-213-141) NA阴性 NA阴性
76(F，LC-213) 212(LC-213) 阴性阴性 阴性阴性
89(F，LC-213-141) 178，179(LC-213-141) 1.5-21.5-2 1.5-21.5-2
106(M，LC-213-141) 186(LC-213-141) NA4-6 NA4-6
128(F，LC-213) 低 低
152(M，LC-213-141) 195(LC-213-141) NA4-6 NA4-6
166(F，LC-213-141) 200，201(LC-213-141) 阴性阴性 阴性阴性
*对25只一致性地具有较高数值的动物第二次分泌乳汁采集的乳进行试验
制备连接山羊β酪蛋白调节序列与同经修饰人羧肽酶B融合的人源化抗-CEA F(ab’)2即806.077的轻链和重链编码区以及CPB pro-结构域(带有C-末端亮氨酸)的编码区的构建体。生产含有和不含有表达CPB pro-结构域的转基因的转基因小鼠品系。已经证实，对所有3种构建体均为转基因的小鼠能够在转基因小鼠的乳中产生高浓度(达4-6mg/ml)的具有预计酶活性的(Fab’)2-CPB融合体(4/6三重转基因品系的表达水平超过1mg/ml)。然而，没有CPB pro-结构域的表达看起来与活性融合蛋白的分泌水平较低有关。然而，必须慎重考虑这一结果，因为仅分析了3个双重转基因品系(仅对2个分析了建立者和F1)。
概括地说，通过对人基因进行定点诱变来制备对C-末端谷氨酸和天冬氨酸的水解具有特异性的人胰腺羧肽酶B(HCPB)的变体并将其在大肠杆菌壁膜间隙中表达。通过改变酶S1’袋内层中的残基，有可能使底物的特异性逆转而得到能够在C-末端酸性氨基酸残基而非正常的C-末端碱性残基前水解的变体。通过使S1’特异性袋基底的Asp253突变成Lys或Arg，获得了上述结果，其中所述的S1’特异性袋通常与底物的碱性侧链发生相互作用。产生的酶具有所需的逆转极性，在251位残基上具有进一步突变的酶活性得到了显著改善。[G251T，D253K]HCPB双重突变体对作为底物的马尿酸-L-谷氨酸(hipp-Glu)的活性高于单一突变体100倍。在Ala248上含有额外改变的[D253K]JCPB三重突变体在251位为Asn时改善了对hipp-Glu底物的活性。这些具有逆转极性的人酶突变体有可能用于抗体定向酶前体药物的癌症疗法中。实施例2： 抗-转铁蛋白受体抗体/血管生成素融合构建体的制备和测试
本实施例证实抗-转铁蛋白受体抗体/血管生成素融合蛋白在转基因小鼠的乳腺中的表达。将针对人转铁蛋白受体(E6)的嵌合小鼠/人抗体在其CH2结构域与人生血管核糖核酸酶、即血管生成素(Ang)的基因融合。它在小鼠的乳腺中表达并分泌入小鼠的乳。在乳中的表达水平约为0.8g/L。所述的嵌合蛋白保留了与游离Ang相当的抗体结合活性和蛋白质合成抑制活性。它在体外对人肿瘤细胞具有特异性细胞毒性。材料和方法 转基因小鼠
按照公开的标准步骤产生转基因小鼠(Roberts等，1992；DiTullio等，1992；Gutierrez等，1996)。将建立者小鼠繁殖成可分泌乳汁的雌性动物并收集乳，如上所述用等体积的磷酸缓冲盐水稀释。将乳保存在-70℃下。乳的分级分离
将含有E6IG抗体的乳上蛋白质A琼脂糖柱并用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱。到含有IM Tris碱的管中从而将pH调节至中性。将含有所述融合蛋白(CH2Ang)的乳调节成0.2M EDTA的溶液并在冰上保温20分钟，随后在4℃下在微量离心管(eppifuge)中离心10分钟。从脂肪层中谨慎地取出脱脂奶并再次进行离心，然后通过在TSK 3000柱(Toso Haas Corp.，PA)上进行大小排阻高效液相层析纯化，所述的柱用pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲液平衡并洗脱。流速为0.5ml/分钟并收集1分钟的级分。与针对血管生成素的抗体发生反应的大部分物质洗脱在柱的空柱体积中。合并该物质并将精氨酸粉加入至终浓度为1M。在4℃下保温过夜后，如上所述使样品在TSK 3000柱上重新进行层析。含有CH2Ang的乳要求用1M精氨酸进行第二次处理并重新在分级柱上进行层析。蛋白质的测定
使用下列消光系数测定蛋白质：E6 IgG抗体，E1％/280nm＝14.0；CH2Ang，E1％/280nm＝10.0。蛋白质合成测定试验
以2500个细胞/孔将细胞在补充了10％胎牛血清的Dulbecco极限必需培养基中铺在96-孔微量滴定平板上。将添加物制备成总体积为10μL，并在37℃下将该平板保温3天，随后加入0.1mCi的[14C]-亮氨酸2-4小时。使用PHD细胞收集仪将细胞收集在玻璃纤维滤器上、用水洗涤、用乙醇干燥并计数。将结果表示为模拟处理孔中[14C]-亮氨酸掺入的百分比。实施例3： 抗人转铁蛋白受体抗体和抗体-血管生成素融合蛋白在转基 因小鼠乳中的表达
用于生产转基因小鼠的DNA构建体如附图1和附图2A中所解释。最初将用于所述研究的嵌合抗转铁蛋白受体抗体与人肿瘤坏死因子融合(Hoogenboom等，1991)，然后与人核糖核酸酶血管生成素融合(Ang，Rybak等，1992)。使Ang基因融合在所述抗体CH2结构域5’区的前3个氨基酸之后，由此保持了铰链区不受影响重链二聚化(dimeriaation)成为可能。该目的是为了生成可以在对患者给药时引起更少免疫原性副作用的人源化免疫毒素样蛋白。体内哺乳动物细胞表达系统几乎不能用来对物质进行功能性的研究，尤其是当将所述抗体与人RNA酶、即血管生成素(Ang)融合时更是如此。Ang是RNA酶A超家族中的一个成员。该超家族中的所有成员均较小(12-14kDa)。在哺乳动物和两栖动物的胰腺和其它器官以及体液和组织中发现了碱性核糖核酸酶。尽管这些RNA酶可以保留例如引起血管生成这样的RNA生理作用，但是已经对各种RNA酶描述了宿主防御作用和抗病毒作用。因为RNA酶可能是天然防御系统的部分，所以已将它们用于生成化学缀合物和与各种抗体形成重组融合蛋白。由于这些研究表明基于RNA酶的疗法可能对治疗癌症和AIDS有效，所以使用新近开发的用于在转基因动物乳中产生复合蛋白的技术重新研究使用针对人转铁蛋白受体的嵌合抗体进行的早期RNA酶工作。用于这些研究中的遗传构建体的具体分子组成如上所述。罗马数字相当于附图2的A组中所示的那些，且扩展至在山羊β-酪蛋白基因的外显子2与7之间克隆的DNA上。
在以高水平在分泌乳汁的转基因小鼠(Roberts等，1992)乳中表达的修饰的山羊β-酪蛋白基因(附图2A，I)的外显子2与7之间使用编码一种针对人转铁蛋白受体的嵌合抗体(Hoogenboom等，1990)即E6抗体完整重链的DNA。通过连接人RNA酶即血管生成素(Ang)的基因与所述抗体的CH2结构域，来制备编码抗体-酶融合体的第二种转基因(附图1和附图2A，II)。分别将那些基因和编码相同抗体轻链的基因(附图2A，III)全部克隆，将合适的对(重链(H)和轻链(L)；CH2Ang和L链)纯化成不含原核DNA，且共注入使用标准方法(Roberts等，1992)再植入的小鼠胚胎中。通过对获自所得子代的尾部的DNA进行PCR和DNA印迹分析来鉴定转基因小鼠。
将建立者小鼠繁殖，生成分泌乳汁的转基因雌性动物。收集乳、用PBS稀释并分析抗体链和Ang的存在情况。针对人Ang的多克隆抗体仅与融合蛋白中的预计M(43 kDa；抗体重链，29 kDA；Ang，14 kDA)条带反应(附图2B，左侧的组)。然而，抗-IgG抗血清与嵌合E6抗体的H和L链强烈反应(附图2B，右侧的组)。明显观察到了所述抗体融合蛋白的L链抗-IgG抗血清发生反应，而CH2Ang的截短的H链几乎不可检测到，从而提示血管生成素与CH2结构域的融合体可能阻碍了抗血清与H链的结合。
通过蛋白质A Sepharose层析法纯化嵌合IgG抗体。正如附图2C中泳道1和2所示，通过在还原条件下的凝胶电泳对最终纯化的产物进行的蛋白质印迹分析表明存在轻链(28kDa)和重链蛋白质(约55kDa)。在非还原条件下的蛋白质印迹分析(附图2C，泳道3)表明转基因抗体作为IgG和Fab形式(分别为168和84kDa)的混合物存在。还观察到了少量的游离重链(55kDa)。
类似地收集含有CH2Ang融合蛋白的乳并用PBS稀释。蛋白质ASepharose不能与血管生成素融合蛋白结合。当预先将相同的CH2抗体片段与TNF融合时获得了类似的结果，据推定这是由于缺失了据信在CH2-CH3连接处附近的蛋白质A结合位点所导致的(Hoogenboom等，1991)。通过蛋白质印迹测定转基因抗体-Ang融合蛋白的性质。在将链间二硫键还原后，H链Ang融合体(43kDA)和轻链(28kDA)解离(附图2C，泳道2)。在非还原条件下使用抗-IgG抗体进行的蛋白质印迹分析(附图2C，泳道5)表明转基因抗体-酶融合蛋白作为F(ab)2和Fab形式(分别为142和71kDa)的混合物存在。当使用抗-Ang抗血清进行分析时获得了相同的结果(未显示)。综上，后面的结果表明轻链与重链-Ang融合体相结合。实施例4： 抗体-血管生成素融合蛋白的生物学鉴定
血管生成素是家兔网织红细胞(rabbiteticulocyte)裂解物翻译能力的有效抑制剂，其作用的机理取决于其核糖核酸酶活性(St.Clair等，1987)。附图2显示，向所述裂解物中添加Ang或CH2Ang导致蛋白质合成受到抑制(如通过[35S]甲硫氨酸向可酸沉淀的蛋白质的掺入所测定的)。在本试验中，未融合的Ang或CH2Ang的IC50S(40nM)无法区分，从而表明活性位点残基的构象不受以这种方向(NH2-末端)融合Ang与CH2抗体结构域的影响。
所述融合蛋白的抗体部分的特征通过竞争性结合实验来鉴定(表5)。测试乳衍生的E6抗体(IgG)与人转铁蛋白受体的结合情况，并将其与最初纯化自杂交瘤细胞的相同抗体的结合情况进行比较(Heyligen等，1985)。两种抗体替换[125I]标记的亲代抗体的能力是相同的(两种抗体中任一种产生50％替换的浓度为0.8nM)。CH2Ang融合蛋白的活性低于E6完整抗体的活性175倍(140nM CH2Ang相比于0.8nM E6)。
通过测定[14C]亮氨酸向新近合成的蛋白质的掺入情况来评价Ang融合蛋白对人肿瘤细胞的细胞毒性作用。典型的剂量反应曲线如附图3中所描绘。CH2Ang抑制了SFS39人神经胶质瘤细胞和MDA-MB-231mdrl乳腺癌细胞的蛋白质合成，其中IC50 S分别为15和45nM。在表II中比较了对其它人肿瘤细胞系的细胞毒性。IC50 S范围在15-70nM。细胞毒性对所述融合蛋白具有特异性，因为观察到对抗原阴性细胞系(小鼠NIH3T3细胞，数据未显示)没有活性，且5倍摩尔过量的未融合嵌合抗体使细胞毒性逆转约50％。CH2Ang抑制蛋白质合成达到模拟处理细胞的99％，而在有5倍摩尔过量的抗体存在下，蛋白质合成减少至模拟处理细胞的45％。由于未融合的抗体(Rybak等，1992)或游离的Ang(Newton等，1996)均没有细胞毒性，所以融合蛋白中的这两种结构域必须共价连接以便引起细胞毒性。
通过在鸡胚尿囊绒膜和家兔角膜试验中追踪血管发生活性，从肿瘤细胞条件培养基中分离血管生成素(Fett等，1985)。它与核糖核酸酶的同源性及与其血管发生活性关联的显著溶核活性(Shapiro等，1986)具有独特的生物特性，这种特性可以在Ang被细胞特异性靶向剂靶向至肿瘤细胞时提高对肿瘤细胞的强力杀伤。当将Ang表达为融合蛋白时维持了血管发生活性(Newton等，1996)。血管生成素还结合人结肠癌细胞上的细胞表面蛋白聚糖(Soncin等，1994)。因此，通过Ang的肿瘤细胞结合特性可以增加抗体在肿瘤位点的定位，而血管发生增加可以通过增加肿瘤血管化而有助于肿瘤渗入(Newton等，1996)。此外，Ang的拮抗剂可防止肿瘤生长(Piccoli等，1998；Olson等，1995)。因此，Ang的活性是多效的；其表现由Ang所接触的细胞环境来控制，例如靶向胞质蛋白合成器会产生细胞毒性(St.Clair等，1987；Rybak等，1991)，而已经报导Ang胞吞并移位至内皮细胞的核中可引起血管发生(Moroianu和Riordan，1994)。Ang的这些生物特性为设计分别通过拮抗或特异性地靶向这种蛋白质而引起细胞抑制(抗血管发生)和细胞毒性(抗肿瘤细胞)的治疗策略提供了独一无二的机会。
实现对癌症(Rybak等，1991；Rybak等，1992；Newton等，1992；Newton等，1994；Newton等，1996；Jinno等，1996；Zewe等，1997；Deonarain&Epenetos，1998)和心血管疾病(Haber，1994；Collen，1997)的基于人酶的多结构域靶向疗法取决于开发能够产生用于临床前期鉴定和最终临床应用的这些试剂的表达系统。在本研究中完成并展示了在转基因小鼠乳中表达两链抗体Ang融合蛋白。Ang能在转基因小鼠中成功地表达为融合蛋白这一点并非显而易见，因为仅以极低的水平由培养的骨髓瘤细胞表达到相似的融合蛋白，这大概是由于在分泌过程中的逆向转运、引起选择了低产者的原因所造成的(Rybak等，1992)。显然在天然环境的乳腺中，表达功效比细胞培养系统提高了160,000倍(在乳和骨髓瘤细胞中分别为0.8g/L与5μg/L)。因此，能够纯化足量的Ang融合蛋白用于生物鉴定。这项工作的结论之一在于首次证实了融合蛋白中Ang方向的重要性。在单链抗体Ang融合蛋白中，Ang在C-末端与所述抗体的N-末端融合(Newton等，1996)。后来发现Ang C-末端区的最后3个氨基酸残基构成了活性中心亚位点(Russo等，1996)。CH2融合蛋白中的Ang和游离Ang在家兔网织细胞裂解物试验中是等效的，而在裂解物试验中就抑制蛋白质合成而言，单链融合蛋白中的Ang的有效性低于游离Ang 2倍(Newton等，1996)。
总的来说，这是首次证明可以在乳腺中以高水平表达抗体-酶融合蛋白。特别地，可以在乳腺中表达抗体-Ang融合体的这项证明提示可开发用于乳腺癌的转基因小鼠模型。已经将来自其它乳特异性基因的启动子用于引起泌乳期间转基因的表达，从而模拟瘤形成的启动(Amundadottier等，1996)。由于目前的研究结果表明乳特异性启动子可以诱导活性免疫毒素的表达，所以可以培育双重转基因品系，用以测试Ang融合蛋白靶向工程化瘤的表达能否预防或改变疾病的进展。这些结果尤其与Ang相关，这是因为可获得鼠的对应物(Bond等，1993)。
总之，这些结果首次表明可以在小鼠的乳腺中以比哺乳动物细胞培养物(Rybak等，1992)和大肠杆菌表达系统(Newton等，1996)更大量和更优良的生物特性表达复合异源融合蛋白。这些结果既推动了这些融合蛋白作为治疗剂生产的可能性、又推动了生成用于乳腺癌的新动物模型的可能性。
在本文中使用下列缩写：Ang-人血管生成素；E6-抗转铁蛋白受体IgG单克隆抗体；RNase：核糖核酸酶；H链-重链；L链-轻链；CH2Ang-与E6重链的CH2结构域融合的血管生成素；IC50，：抑制蛋白质合成达50％的融合蛋白浓度。表5E6和Ang融合蛋白与人转铁蛋白受体的结合
构建体       来源         结合EC50(nM)      显著差异
E6           杂交瘤       0.8                1
E6           乳           0.8                1
CH2aNG       乳           140                175表IICh2Ang的细胞毒性
细胞系                     Ch2Ang
                           Ic50(nM)
As539                      15
Hs578T                     70
MDAOMB-23 [mdr]           45
MALME                      40
ACHN                       30实施例7： 转基因山羊的制作和特征记述
下面概括的部分简要描述了生产转基因山羊的主要步骤。山羊的种类和品种：
优选来源于瑞士的山羊、例如Alpine、Saanen和Toggenburg的品种来生产转基因山羊。山羊的超排卵：
在第0天耳部皮下植入6mg诺甲醋孕酮(Syncromate-B，CEVALaboratories，Inc.，Overland Park，KS)使供体的动情期同步化。在第一个7-9天后给予前列腺素以便终止内源性孕酮的合成。从插入植入物后的第13天开始，3天内经肌内给予总计18mg的促卵泡激素(FSH-Schering Corp.，Kenilworth，NJ)，每日注射2次。在第14天除去植入物。在取出植入物后24小时，在2天时间内使供体动物与育性雄性动物交配几次(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。
胚胎的采集：
在繁殖后第2天(或取出植入物后72小时)进行采集胚胎的手术。在手术前36小时使超排卵的母山羊禁食物和水。对母山羊静脉内给予0.8mg/kg地西泮(Valium)，随后立即经静脉内给予5.0mg/kg氯胺酮(Keteset)。在手术过程中通过气管内的软管以2L/分钟给予混有氧气的氟烷(2.5％)。通过中线剖腹术切口将生殖道从腹内取出。统计黄体、未破裂的直径大于6mm的滤泡和卵囊以便评价超排卵的结果并预测应通过冲洗输卵管采集的胚胎的数量。将套管置于输卵管口上并通过用3.0Prolene单独临时结扎而固定就位。将20号针头置于子宫中距输卵管连接处约0.5cm。用10-20ml的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)经插套管的输卵管冲洗并收集在培养皿上。对生殖道的另一侧重复该步骤，然后将生殖道放回腹部。在缝合前，将10-20ml的无菌盐水甘油溶液倾入腹腔以防止粘连。用2.0Polydioxanone或Supramid的简单间断缝合线缝合白线并用无菌创伤用钳封闭皮肤。
在立体显微镜上从PBS输卵管冲洗液中收集受精的山羊卵，然后将其用含有商购自Sigma的10％胎牛血清(FBS)的Ham’s F12培养基(Sigma，St.Louis，MO)洗涤。在可观察到原核的情况中，立即对所述胚胎进行显微注射。如果不能观察到原核，那么可以将胚胎置于含有10％FBS的Ham’s F12中以便在37℃下，含有5％CO2的空气的加湿气室中进行短期培养，直至原核可见为止(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。显微注射步骤：
将单细胞山羊胚胎置于玻璃凹玻片上处于油下的培养基微滴中。将带有两个可见原核的受精卵固定在火焰抛光的微量吸管上，该微量吸管位于带有使用Normarski光学技术的固定载物台的Zeiss直立式显微镜上。使用精细玻璃显微操作针给原核显微注射溶于注射缓冲液(Tris-EDTA)的目的DNA构建体，例如含有与山羊β-酪蛋白基因调节元件可操作连接的人促红细胞生成素-人血清清蛋白(免疫球蛋白-酶-hSA)融合蛋白基因的BC355载体(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。胚胎发育：
在显微注射后，将存活的胚胎置于含有10％FBS的Ham’s F12培养基中，然后在37℃下含有5％CO2的空气的加湿气室内孵育至准备将受体动物进行胚胎转移为止(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。受体的制备：
通过6mg耳部诺甲醋孕酮植入物(Syncromate-B)诱发受体动物的动情期同步化。在插入植入物后的第13天对动物单一给予非超排卵(400I.U.)的获自Sigma的孕马血清促性腺激素(PMSG)注射液。使受体雌性动物与切除输精管的雄性动物交配以确保动情期同步(Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。胚胎转移：
将来自一只供体雌性动物的全部胚胎合在一起，如果可能则转入单一受体。手术过程与对上述采集胚胎概括的过程相同，但不给输卵管插套管，且通过使用玻璃微量吸管经伞部于最小体积的含有10％FBS的Ham’s F12中将胚胎转入输卵管腔。认为卵巢上带有超过6-8个排卵点的动物不适合作为受体。切口封闭和手术后的护理与供体动物相同(例如，参见Selgrath等，《动物生殖学》(Theriogenology)，1990.1195-1205页)。妊娠和分娩的监测：
在持续动情期的第1天后的45天时通过超声波检查法确定是否怀孕。在第110天时进行第二次超声检查以证实妊娠并评价胎儿状况。在第130天时给妊娠的受体母山羊接种破伤风类毒素和梭状芽胞杆菌属C&D。经肌内给予硒和维生素E(Bo-Se)并经皮下给予双氢除虫菌素(Ivermectin)。在第145天时将母山羊移至干净的厩中并在大约第147天诱导分娩前使之适应这种环境。在第147天时用40mg的PGF2a(Lutalyse，Upjohn Company，Kalamazoo Michigan)诱导分娩。经肌内将这种注射给予两次剂量，一次为20mg剂量，随后在4小时后给予20mg剂量。在第147天第一次注射Lutalyse后的白天和晚上对母山羊定期观察。从第二天早晨开始增加到每隔30分钟观察一次。分娩发生在第一次注射后30-40小时之间。在分娩后给母山羊挤乳以便收集初乳并证实胎盘的排出。F 0 动物的转基因性质的验证：
为了筛选转基因的F0动物，从两种不同的细胞系中分离基因组DNA以避免丢失任何嵌合型转基因动物。将嵌合型动物定义为并不是每个细胞中均带有至少一拷贝的转基因的任意山羊。因此，自两日龄F0动物取耳部组织样品(中胚层)和血样以用于分离基因组DNA(Lacy等，《实验指南》(A Laboratory Manual)，1986，Cold Springs Harbor，NY；以及Herrmann和Frischauf，《酶学方法》(Methods Enzymology)，1987.152：180-183页)。通过使用对人免疫球蛋白-酶-hSA融合蛋白基因具有特异性的引物的聚合酶链反应(Gould等，《国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci，)1989.86：1934-1938页)以及使用随机引发的免疫球蛋白-酶或hSA cDNA探针(Fe inberg和Vogelstein，《生化年鉴》(Anal.Bioc.)，1983.132：6-13页)的DNA印迹分析(Thomas，《国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci，)1980.77：5201-5205)来分析DNA样品。估计试验灵敏度是在10％体细胞中检测到一拷贝的转基因。生产种群的产生和筛选
可以将上述步骤用于生产转基因建立者(F0)山羊以及其它转基因山羊。例如，如果是雌性动物，那么繁殖转基因F0建立者山羊进行产奶；或如果是雄性动物建立者，那么繁殖其以产生转基因雌性后代。可以将这种转基因建立者雄性动物与非转基因的雌性动物杂交而产生转基因雌性后代。转基因的传递和相关的特征
通过PCR和DNA印迹分析来分析山羊品系耳部组织和血液中目的转基因的传递情况。例如，对建立者雄性动物和三只转基因后代的DNA印迹分析表明在各代之间没有发生重排或拷贝数的改变。使用免疫球蛋白-酶融合蛋白cDNA探针来探测DNA印迹。在Betascope 603上分析印迹并通过将所述转基因与山羊β酪蛋白内源性基因进行比较来确定拷贝数。表达水平的评价
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其它实施方案属于下列权利要求的范围。
                             序列表<110>Genzyme Transgenics Corporation<120>以转基因方式生产的融合蛋白<130>10275-137WOl<140>PCT/US00/25560<141>2000-09-18<150>09/398，610<151>1999-09-17<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1tgtgctcctc tccatgctgg                                         20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2tggtctgggg tgacacatgt                                          20

Claims (17)

1.一种转基因融合蛋白的生产方法，该方法包括下列步骤：提供一种包括可提供所述融合蛋白表达的转基因的转基因动物；使该转基因得到表达；和从所述转基因动物的乳中回收所述融合蛋白。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白包括免疫球蛋白亚单位和酶。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白包括与第二种成分融合的第一种成分；所述的第一种成分包括靶向分子的亚单位、而所述的第二种成分编码细胞毒素。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白包括对肿瘤抗原具有特异性的Ig亚单位。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的肿瘤抗原选自癌胚抗原(CEA)、转铁蛋白受体、TAG-72、表皮生长因子受体的组。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白包括RNA酶。
7.权利要求6所述的方法，其中所述的RNA酶是RNA酶A。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白包括血管生成素。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白包括羧肽酶B酶。
10.权利要求1所述的方法，其中在转基因哺乳动物的乳腺中制备所述的融合蛋白。
11.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白以至少约0.5mg/ml或0.5mg/ml以上的浓度分泌入转基因哺乳动物的乳中。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白以至少约1.0mg/ml或1.0mg/ml以上的浓度分泌入转基因哺乳动物的乳中。
13.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白的免疫球蛋白亚单位是人源化抗体。
14.权利要求1所述的方法，其中编码所述转基因融合蛋白的转基因是一种核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)乳腺上皮特异性启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列的核苷酸序列，所述的信号序列例如来自乳特异性蛋白的信号；
(d)可选的，编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质的氨基末端编码区充足部分的核苷酸序列，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码所述融合蛋白的一个或多个核苷酸序列；和
(f)可选的，来自哺乳动物基因的3’非翻译区。
15.一种分离的核酸构建体，它包括：
(a)可选的，绝缘子序列；
(b)乳腺上皮特异性启动子；
(c)编码可以指导融合蛋白分泌的信号序列、例如来自乳特异性蛋白的信号序列的核苷酸序列；
(d)可选的，编码分泌蛋白、例如分泌入乳的蛋白质的氨基末端编码区充足部分的核苷酸序列，该部分足以使所述融合蛋白在例如转基因哺乳动物的乳中分泌；
(e)编码如权利要求1中所述融合蛋白的一个或多个核苷酸序列；和
(f)可选的，来自哺乳动物基因、例如乳腺上皮特异性基因(例如一种乳蛋白基因)的3’非翻译区。
在另一个方面中，本发明涉及一种含有有效量的融合蛋白、例如本文所述的免疫球蛋白-酶融合蛋白以及药物上可接受的载体的药物组合物或营养组合物。
在一个优选的实施方案中，所述的组合物包括奶。
15.一种包括编码权利要求中所述的融合蛋白的转基因的转基因动物。
16.权利要求15的转基因动物，它可以以至少约0.5mg/ml或0.5mg/ml以上的浓度将所述融合蛋白分泌入其乳中。
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