MXPA02002769A

MXPA02002769A - Proteinas de fusion producidas transgenicamente.

Info

Publication number: MXPA02002769A
Application number: MXPA02002769A
Authority: MX
Inventors: M Rybak Susanna
Original assignee: Gtc Biotherapeutics Inc
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2005-07-01
Also published as: AU782840B2; BR0014527A; CN1414970A; WO2001019846A9; EP1220864A4; CA2382725A1; KR20020073127A; RU2002110121A; JP2003509040A; NO20021275D0; NZ517666A; WO2001019846A8; EP1220864A1; HUP0500423A2; IL148550A0; WO2001019846A1; AU3883201A; NO20021275L

Abstract

Un metodo de hacer una proteina de fusion transgenica. El metodo incluye proveer un animal transgenico que incluye un transgen que provee la expresion de la proteina de fusion; permitir que se exprese el transgen; y recuperar la proteina de fusion de la leche del animal transgenico.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN PRODUCIDAS TRANSGENICAMENTE Patrocinio Los trabajos descritos en la presente han sido costeados, en parte, con fondos del gobierno federal de los Estados Unidos de América, provenientes del National Cáncer Institute, National Institutes of Health, bajo el contrato No. NO1-CO-60000. Campo de la Invención La invención se relaciona con proteínas de fusión producidas transgénicamente (v.gr., proteínas de fusión de inmunoglobulina-enzima) , ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión, y métodos de hacer y usar proteínas de fusión y ácidos nucleicos . Antecedentes de la invención Se está desarrollando para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico un número creciente de proteínas recombinantes . Sin embargo, muchas de estas proteínas pueden ser difíciles o costosas de producir en una forma funcional y/o en las cantidades requeridas usando métodos convencionales. Los métodos convencionales implican insertar el gen responsable de la producción de una proteína particular en células hospederas tales como bacterias, levaduras o células de mamíferos, v.gr., células COS, y luego cultivando las células en medios de cultivo. Las células cultivadas entonces sintetizan la proteína deseada. Sistemas tradicionales de bacterias o levaduras pueden ser incapaces de producidas muchas proteínas complejas en una forma funcional. Aunque las células de mamíferos pueden reproducir proteínas complejas, son generalmente difíciles y costosas de cultivar, y a menudo solo producen cantidades de mg/1 de proteína. Las limitaciones usando sistemas bacterianos, de levadura o mamíferos son particularmente aplicables a proteínas complejas, tales como proteínas de fusión inmunoglobulina-enzima, que requieren de modificaciones post -traducción apropiadas y ensamble para estar en forma funcional . Compendio de la invención En general, la invención presenta un método de hacer una proteína de fusión transgénica, v.gr., una proteína de fusión inmunoglobulina-enzima. El método incluye proveer un animal transgénico, v.gr., cabra o una vaca, que incluye un transgén que provee la expresión de la proteína de fusión, v.gr., una proteína de fusión inmunoglobulina-enzima; permitir que el transgén sea expresado; y, de preferencia, recuperar la proteína de fusión de la leche del animal transgénico. (Aunque la forma de realización descrita se refiere a expresión en leche, pueden usarse otros promotores, v.gr., promotores específicos a tejidos, v.gr., promotores específicos a músculo, cabello, orina, sangre, o huevos, para producir proteínas de fusión en otros tejidos o productos . ) En una forma de realización preferida, el transgén incluye un primer miembro fusionado a un segundo miembro. El primer miembro puede incluir la sub-unidad de una molécula objetivo, v.gr., una sub-unidad Ig, v.gr., una sub-unidad de una Ig específica para un antígeno tumoral (v.gr. , antígeno carciono-embriónico (CEA), un receptor de transíerrina, TAG-72, un receptor del factor de crecimiento epidérmico) . El segundo miembro puede ser:' una enzima; un polipéptido distinto de una sub-unidad Ig, o fragmento de éste; una ARNasa, v.gr. , ARNasa A, v.gr., angiogenina; o la enzima carboxipeptidasa B. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica es hecha en una glándula mamaria del mamífero transgénico, v.gr., un rumiante, v.gr., una cabra o una vaca. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica es secretada en la leche del mamífero transgénico, v.gr., un rumiante, v.gr., un animal lechero, v.gr., una cabra o una vaca . En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica es secretada en la leche de un mamífero transgénico en concentraciones de al menos alrededor de 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml , 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml , 2 mg/ml, 3 mg/ml , 5 mg/ml, o mayores. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica es hecha bajo el control de un promotor específico de glándula mamaria, v.gr., un promotor específico a la leche, v.gr. , un promotor de proteína de suero de leche o de caseína. El promotor específico a la leche puede ser un promotor de caseína, promotor de ß-lactoglobulina, promotor de proteína de ácido del suero de leche, o promotor de lactalbúmin . De preferencia, el promotor es un promotor de ß-caseína de cabra. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica tiene la fórmula: R1-L-R2; R2-L-R1; R2-R1 ? R1-R2, donde Rl es una fracción inmunoglobulina, L es un enlazador péptido y R2 es una fracción enzima. Preferiblemente, Rl y R2 están enlazadas covalentemente , v.gr., directamente fusionadas o enlazadas vía un enlazador péptido. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica incluye además: una secuencia de señal que dirige la secreción de la proteína de fusión, v.gr., una señal de una proteína secretada (v.gr. , una señal de una proteína secretada a la leche, o una señal de inmunoglobulina) ; y (opcionalmente) una secuencia que codifica una porción suficiente de la región de codificación amino terminal de una proteína secretada, v.gr., una proteína secretada a la leche, o una inmunoglobulina, para permitir la secreción, v.gr., en la leche de un mamífero transgénico, de la proteína de fusión. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión incluye una sub-unidad de anti-cuerpo monoclonal, v.gr., una sub-unidad de anti-cuerpo monoclonal humano, murino (por ejemplo, de ratón) , o fragmento del mismo, v.gr. , un fragmento de ligadura de antígeno del mismo. La sub-unidad de anti-cuerpo monoclonal o fragmento de ligadura de antígeno del mismo puede ser un polipéptido de cadena sencilla, un dímero de una cadena pesada y una cadena ligera, o un tetrámero de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. De preferencia, el anti-cuerpo monoclonal es un anti-cuerpo humano o un fragmento del mismo, v.gr., un fragmento de ligadura de antígeno. Por ejemplo, el anti-cuerpo humano puede ser producido a partir de un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, v.gr. , un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. Los anti-cuerpo pueden ser de los diversos isotipos, incluyendo: IgG (v.gr., IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4) , IgM, IgAl, IgA2 , IgA.sub.sec, IgD, o IgE. Preferiblemente, la sub-unidad inmunoglobulina es un isotipo IgG, por ejemplo, IgG3. Los anti-cuerpos pueden ser de longitud completa (v.gr., un anti-cuerpo IgGl o IgG4) , o pueden incluir solamente una porción de ligadura de antígeno (v.gr., una Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla) . En formas de realización preferidas, la sub-unidad inmunoglobulina de la proteína de fusión es monovalente (v.gr., incluye un par de cadenas pesada y ligera, o porciones de ligadura de antígeno de las mismas) . En otras formas de realización, la proteína de fusión es un anti-cuerpo divalente (v.gr., incluye dos pares de cadenas pesada y ligera, o porciones de ligadura de antígeno de las mismas) . En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica incluye una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma, v.gr. , un fragmento de ligadura de antígeno de la misma. Preferiblemente, la cadena pesada de inmunoglobulina o el fragmento de la misma (v.gr., un fragmento de ligadura de antígeno de la misma) está enlazada, v.gr. , enlazada vía un enlace enlazador péptido o se fusiona directamente, a una enzima. Preferiblemente, la proteína de fusión de cadena pesada de inmunoglobulina-enzima es capaz de ensamblarse en un complejo funcional, v.gr., un complejo di-, tri-, tetra-, o multimérico que tiene actividad enzimática. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica incluye una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento de la misma (v.gr., un fragmento de ligadura de antígeno de la misma) , y una cadena ligera o un fragmento de la misma (v.gr., un fragmento de ligadura de antígeno de la misma) . Preferiblemente, la cadena pesada de inmunoglobulina está enlazada, v.gr., enlazada vía un enlazador péptido o fusionada directamente, a una enzima. Preferiblemente, la proteína de fusión inmunoglobulina-enzima es capaz de ensamblarse en un complejo funcional, v.gr., un complejo di-, tri-, tetra-, o multimérico que tiene actividad enzimática. En formas de realización preferidas, la enzima de la proteína de fusión es una ARNasa, v.gr., ARNasa A, v.gr. , angiogenina ; o la enzima carboxipeptidasa B. Para aplicaciones de diagnóstico, la enzima puede ser peroxidasa de rábano picante. En una forma de realización preferida, la proteína de fusión transgénica incluye un enlazador péptido y el enlazador péptido tiene una o más de las siguientes características: a) permite la rotación de la proteína inmunoglobulina y la proteína enzima una con relación a la otra; b) es resistente a la digestión por proteasas; c) no interactúa con la inmunoglobulina o la enzima; d) permite a la proteína de fusión formar un complejo (por ejemplo, un complejo di-, tri-, tetra-, o mu1 imé-rico) que retiene la actividad enzimática; y e) promueve el plegado y/o ensamble de la proteína de fusión en un complejo activo . En una forma de realización preferida: la proteína de fusión transgénica incluye un enlazador péptido y el enlazador péptido es de 5 a 60, más preferiblemente, de 10 a 30 aminoácidos de longitud; el enlazador péptido tiene 20 aminoácidos de longitud; el enlazador péptido tiene 17 aminoácidos de longitud; cada uno de los aminoácidos en el enlazador péptido se selecciona del grupo que consiste en Gly, Ser, Asn, Thr y Ala; el enlazador péptido incluye un elemento Gly-Ser. En una forma de realización preferida, la proteína de fusión incluye un enlazador péptido y el enlazador péptido incluye una secuencia que tiene la fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly) donde y es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8. Preferiblemente, el enlazador péptido incluye una secuencia que tiene la fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly) 3. Preferiblemente, el enlazador péptido incluye una secuencia que tiene la fórmula ( (Ser-Gly-Gly-Gly- En formas de realización preferidas, la proteína de fusión transgénica se ensambla en un dimero, trímero, tetrámero, o complejo polimérico superior. En forma de realización preferidas, el transgén que codifica la proteína de fusión es una construcción de ácido nucleico, que incluye: (a) opcionalmente, una secuencia aislante; (b) un promotor, v.gr. , un promotor específico epitelial mamario, v.gr., un promotor de proteína de leche; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señales la cual puede dirigir la secreción de la proteína de fusión, v.gr., una señal a partir de una proteína específica de la leche; (d) opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica una porción suficiente de la región de codificación amino terminal de una proteína secretada, v.gr., una proteína secretada en la leche, para permitir la secreción, por ejemplo, en la leche de un mamífero transgénico, de la proteína no secretada; (e) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión, v.gr., una proteína de fusión de inmunoglobulina-enzima , v.gr. , una proteína como se describe en la presente; y (f) (opcionalmente) una región 3Ü no traducida de un gen de mamífero, v.gr., un gen específico epitelial mamario, (v.gr. , un gen de proteína de la leche) . En formas de realización preferidas, los elementos a (si está presente), b, c, d (si están presentes) , y f del transgén son del mismo gen; los elementos a (si está presente) , b, c, d (si están presentes) , y f del transgén son de dos o más genes. Por ejemplo, la secuencia de señal, la secuencia de promotor y la secuencia no traducida 3Ü pueden ser de un gen específico epitelial mamario, v.gr. , una proteína de suero de la leche o gen de caseína (v.gr., un gen de ß-caseína) . Preferiblemente, la secuencia de señales, la secuencia del promotor y la secuencia no traducida 3Ü son de un gen de -caseína de cabra. En formas de realización preferidas, el promotor del transgén es un promotor específico epitelial mamario, v.gr., una proteína de suero de la leche o promotor de caseína (v.gr. , un promotor de ß-caseína) . El promotor específico de leche puede ser un promotor de caseína, un promotor de ß-lactoglobulina, un promotor de proteína ácida de suero de leche, o un promotor de lactalbúmina . Preferiblemente, el promotor es un promotor de ß-caseína de cabra. En formas de realización preferidas, la secuencia de señal codificada por el transgén es una secuencia amino terminal que dirige la expresión de la proteína al exterior de una célula, o hacia la membrana celular. Preferiblemente, la secuencia de señales es de una proteína que se secreta en la leche, v.gr. , la leche de un animal transgénico. En formas de realización preferidas, la región 3Ü no traducida del transgén incluye un sitio de poliadenilación, y se obtiene a partir de un gen específico epitelial mamario, v.gr., un gen de proteína de suero de leche o gen de caseína. La región 3Ü no traducida se puede obtener a partir de un gen de caseína (v.gr, un gen de ß-caseína) , un gen de ß-lactoglobulina, gen de proteína acida de suero de leche, o gen de lactalbúmina . Preferiblemente, la región 3Ü no traducida es de un gen de ß-caseína de cabra. En formas de realización preferidas, el transgén, v.gr., el transgén como se describe en la presente, integra en una célula germinal y/o una célula somática del animal transgénico . En formas de realización preferidas, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico, de preferencia una construcción de ácido nucleico aislado, que incluye: (a) opcionalmente, una secuencia aislante; (b) un promotor, v.gr., un promotor específico epitelial mamario, v.gr., un promotor de proteína de la leche; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal que puede dirigir la secreción de la proteína de fusión, v.gr., una señal a partir de una proteína específica de la leche; (d) opcionalmente , una secuencia de nucleótidos que codifica una porción suficiente de la región de codificación amino terminal de la proteína secretada, v.gr., una proteína secretada en la leche, o una inmunoglobulina, para permitir la secreción, v.gr., en la leche de un mamífero transgénico, de la proteína no secretada; (e) una o más secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión como se describe en la presente; y (f) opcionalmente, una región 3Ü no traducida de un gen de mamífero, v.gr., un gen específico epitelial mamario, (v.gr., un gen de proteína de la leche) . En formas de realización preferidas, el promotor es un promotor específico epitelial mamario, v.gr., un promotor de proteína de suero de lecho o promotor de caseína (v.gr., un promotor de ß-caseína) . El promotor específico a la leche puede ser un promotor de caseína, un promotor de ß-lactoglobulina, un promotor de la proteína ácida del suero d ela leche, o promotor de lactalbúmina . De preferencia, el promotor es un promotor de ß-caseína de cabra. En formas de realización preferidas, la secuencia de señal es una secuencia amino terminal que dirige la expresión de la proteína al exterior de una célula, o hacia la membrana celular. Preferiblemente, la secuencia de señales dirige la secreción de la proteína de fusión codificada en la leche de un animal transgénico, v.gr., un mamífero transgénico. En formas de realización preferidas, la región 30 no traducida incluye un sitio de poliadenilación, y se obtiene de un gen de mamífero, v.gr., un gen específico epitelial mamario, v.gr., un gen de proteína de suero de leche o gen de caseína. La región 30 no traducida se puede obtener a partir de un gen de caseína (v.gr., un gen de ß- caseína) , un gen de ß-lactoglobuli-na, un gen de proteína ácida de suero de leche, o un gen de lactalbümina . Preferiblemente, la región 30 no traducida es de un gen de ß-caseína de cabra. En otro aspecto, la invención presenta una célula hospedera, v.gr., una célula ' hospedera aislada, la cual incluye un ácido nucleico de la invención (v.gr., un transgén, v.gr., una construcción de ácido nucleico, como se describe en la presente) . En otro aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica o nutracéutica que tiene una cantidad efectiva de una proteína de fusión, v.gr., una proteína de fusión de inmunoglobulina-enzima como se describe en la presente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización preferida, la composición incluye leche. En otro aspecto, la invención presenta un animal transgénico que incluye un transgén que codifica una proteína de fusión, v.gr., un transgén que codifica una proteína de fusión de inmunoglobulina-enzima descrita en la presente. Los animales transgénicos preferidos incluyen: mamíferos; aves; reptiles; marsupiales; y anfibios. Los mamíferos adecuados incluyen: rumiantes; ungulados; mamíferos domésticos; y animales lecheros. Los animales particularmente preferidos incluyen: ratones, cabras, ovejas, camellos, conejos, vacas, cerdos, caballos, zorras, y llamas. Las aves convenientes incluyen pollos, gansos, y pavos. Cuando la proteína transgénica se secreta en la leche de un animal transgénico, el animal deberá ser capaz de producir cuando menos 1, o 100, litros de leche al año. Preferiblemente, el animal transgénico es un rumiante, v.gr., una cabra, vaca u oveja. Más preferiblemente, el animal transgénico es una cabra. En formas de realización preferidas, el animal transgénico tienen células germinales y células somáticas que contienen un transgén que codifica una proteína de fusión, v.gr. , una proteína de fusión descrita en la presente. En formas de realización preferidas, la proteína de fusión expresada en el animal transgénico está bajo el control de un promotor específico de glándula mamaria, v.gr. , un promotor específico de leche, v.gr., un promotor de la proteína de suero de leche o de caseína. El promotor específico de leche puede ser un promotor de caseína, un promotor de ß-lactoglobulina, un promotor de proteína ácida de suero de leche, o un promotor de lactalbúmina . Preferiblemente, el promotor es un promotor de (5-caseína de cabra. En formas de realización preferidas, el animal transgénico es un mamífero, y la proteína de fusión de inmuno-globulina-enzima se secreta en la leche del animal transgénico en concentraciones de cuando menos alrededor de 0.1 mg/ml , 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml o más altas . En otro aspecto, la invención presenta un método para matar o lisar selectivamente una célula aberrante o enferma que expresa sobre su superficie un antígeno objetivo. El método incluye : poner en contacto dicha célula aberrante o enferma con una proteína de fusión producida transgénicamente , v.gr. , una proteína de fusión de inmunoglobulina-enzima descrita en la presente, donde la inmunoglobulina de dicha proteína de fusión reconoce dicho antígeno objetivo. Los términos péptidos, proteínas, polipéptidos se usan de manera intercambiable en la presente. Una preparación purificada, preparación sustancialmente pura de un polipéptido, o un polipéptido aislado, como se usa en la presente, significa un polipéptido que ha sido separado de cuando menos alguna otra proteína, lípido, o ácido nucleico con el cual se presenta en la célula u organismo el cual lo expresa, v.gr., a partir de una proteína, lípido o ácido nucleico en el animal transgénico o en un fluido, v.gr. , leche, u otra sustancia, v.gr. , un huevo, producido por el animal transgénico. El polipéptido preferiblemente constituye cuando menos 10, 20, 50, 70, 80 o 95% en peso seco de la preparación purificada. Preferiblemente, la preparación contiene: suficiente polipéptido para permitir el secuenciamiento de proteína; cuando menos 1, 10, o 100 ig del polipéptido; cuando menos 1, 10, o 100 mg del polipéptido. Un ácido nucleico sustancialmente puro es un ácido nucleico que es uno o ambos entre: no inmediatamente contiguo con ya sea una o ambas de las secuencias, v.gr., secuencias de codi icación, con las cuales está inmediatamente contiguo (es decir, uno en el extremo 5? y otro en el extremo 3Ü) en el genoma que se presenta naturalmente del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico; o el cual está sustancialmente libre de una secuencia de ácidos nucleicos con la cual se presenta en el organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, v.gr., en un plásmido o virus que se replica de manera autónoma, o en el ADN genómico de un procariote o eucariote, o el cual existe como una molécula separada (v.gr., un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido mediante reacción de cadena de polimerasa o tratamiento de endonucleasa por restricción) independiente de otras secuencias de ADN. El ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia de proteína de fusión adicional. Como se usa en la presente, el término transgén significa una secuencia de ácidos nucleicos (codificando, v.gr. , uno o más polipéptidos de proteína de fusión) , que se introduce en el genoma de un organismo transgénico. Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de transcripción y otros ácidos nucleicos, tales como intrones, que pueden ser necesarios para la expresión y secreción óptima de un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Un transgén puede incluir una secuencia me oradora. Una secuencia de proteína de fusión se puede enlazar operativamente a un promotor específico de tejido, v.gr., una secuencia de promotor específico de glándula mamaria, que da como resultado la secreción de la proteína en la leche de un mamífero transgénico, un promotor específico de orina, o un promotor específico de huevo. Como se usa en la presente, el término "célula transgénica" se refiere a una célula que contiene un transgén. Un organismo transgénico, como se usa en la presente, se refiere a un animal o planta transgénica. Como se usa en la presente, un "animal transgénico" es un animal no humano en el cual una o más y preferiblemente esencialmente todas las células del animal, contienen un transgén introducido por medio de intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas conocidas en la materia. El transgén se puede introducir en la célula, directamente o indirectamente mediante la introducción en un precursor de la célula, por medio de manipulación genética deliberada, tal como mediante micro-inyección o mediante infección con un virus recombinante. Los mamíferos se definen en la presente como todos los animales, excluyendo los seres humanos, que tienen glándulas mamarias y producen leche. Como se usa en la presente, "animal lechero" se refiere a un animal no humano que produce leche que es mayor que un roedor. En formas de realización preferidas, el animal lechero produce grandes volúmenes de leche y tiene períodos de lactancia largos, por ejemplo, vacas o cabras. Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. El término "animales no humanos" de la invención incluye vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, rumiantes, aves, anfibios, reptiles y roedores, v.gr., ratones y ratas. El término también incluye conejos. Como se usa en la presente, una "planta transgénica" es una planta, preferiblemente una planta de múltiples células o una planta superior, en la cual una o más, y preferiblemente esencialmente todas, las ¦ células de la planta contienen un transgén introducido por medio de intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas conocidas en la materia. Como se usa en la presente, el término "planta" se refiere ya sea a una planta completa, una parte de la planta, una célula de la planta, o un grupo de células de la planta. La clase de plantas que se pueden usar en métodos de la invención generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles a las técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploide, incluyendo poliploide, diploide y haploide. Como se usa en la presente, el término "nutracéutico" se refiere a una sustancia alimenticia, o parte de un alimento, que incluye una proteína de fusión. Los nutracéuticos pueden aportar beneficios médicos o para la salud, incluyendo la prevención, el tratamiento o la cura de un padecimiento. La proteína transgénica a menudo estará presente en el nutracéutico a una concentración de al menos 100 ug/kg, con mayor preferencia al menos 1 mg/kg, con la mayor preferencia al menos 10 mg/kg. Un nutracéutico puede incluir la leche de un animal transgénico. Como se usan en la presente, los términos "inmunoglobu-lina" y "anti-cuerpo" se refieren a una glicoproteína que comprende cuando menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces bisulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden sobrevivir además en regiones de hiper-variabilidad, denominadas regiones de determinación de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres regiones de determinación de complementariedad y cuatro regiones de estructura, acomodadas desde el término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3 , CDR3 , FR . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospederos, incluyendo distintas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de ligadura de antígeno" de un anti-cuerpo (o simplemente "porción de anti -cuerpo" ) , como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de ligarse específicamente a un antígeno (v.gr. , un antígeno objetivo) . Se ha demostrado que la función de ligadura de antígeno del anti-cuerpo se puede realizar mediante fragmentos de anti-cuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término de "porción de ligadura de antígeno" de un anti -cuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL y CH1 (ii) un fragmento F(ab0)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un O puente bisulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341 : 544-546) , que consiste en un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (CDR) . Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes , mediante un enlazador sintético que permite que se formen como una cadena de proteína simple en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv) ; véase por ejemplo, Bird y colaboradores, (1988) Science 242 :423-426; y Huston y colaboradores , (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85.: 5879-5883 ) . Estos anti-cuerpos de cadena simple también pretenden ser abarcados dentro del término "porción de ligadura de antígeno" de un anti -cuerpo. Estos fragmentos de anti -cuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para los técnicos en la materia, y los fragmentos se seleccionan por su utilidad de la misma manera de lo que se hace con los anti-cuerpos intactos. El término "anti-cuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a una molécula de anti-cuerpo de una composición molecular simple. Una composición de anti -cuerpo monoclonal exhibe una especificidad y afinidad de enlace simple por un epítope particular. De conformidad con lo anterior, el término "anti-cuerpo monoclonal humano" se refiere a anti-cuerpos que exhiben una especificidad de enlace simple que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una modalidad, los anti-cuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, v.gr. , un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionada a una célula inmortalizada. El término "anti-cuerpo humano recombinante" , como se usa en la presente, pretende incluir todos los anti-cuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes , tales como anti-cuerpos aislados de un animal (v.gr., un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana; anti-cuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transíectados en una célula hospedera, anti-cuerpos aislados de una biblioteca de anti-cuerpos humanos recombinantes, combinatorios, o anti-cuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que involucran dividir secuencias de genes de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Estos anti-cuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, estos anti-cuerpos humanos recombinan-tes se someten a mutagénesis ín vi tro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de inmunoglobulina humana, mutagénesis somática in vivo) y de este modo, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anti-cuerpos recombi -nantes son secuencias que, aunque se derivan de y se relacionan con las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anti-cuerpos humanos in vivo. Un ácido nucleico está "operablemente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o mej orador está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de transcripción, operablemente enlazado significa que las secuencias de ADN que se están enlazando son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones de codificación de proteína, son contiguas y en marcos de lectura. Los términos "vector" o "construcción" , como se usan en la presente, pretenden referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazada. Un tipo de vector es un "plásmido" , el cual se refiere a un ciclo de ADN de cadena doble circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autónoma en una célula hospedera en la cual se introducen (v.gr., vectores bacterianos que tienen origen bacteriano de replicacion y vectores de mamífero episomal) . Otros vectores (v.gr. , vectores de mamífero no episomales) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera después de la introducción en la célula hospedera, y mediante lo cual se replican junto con el genoma hospedero. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Estos vectores se denominan en la presente "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinantes frecuentemente están en forma de plásmidos . En la presente descripción, "plásmido" y "vector" se pueden usar intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de expresión de vectores, tal como vectores virales (por ejemplo, retrovirus con defecto de replicacion, adenovirus y vectores adeno-asocia-dos) . El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), como se usa en la presente, pretende referirse a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante . Deberá entenderse que estos términos pretenden referirse no solamente a la célula objeto particular sino a la progenie de esta célula. Debido a que se pueden presentar ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a ya sea mutación o influencias ambientales, esta progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula padre, pero todavía está incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" como se usa en la presente. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones. Descripción Detallada Primero se describen los dibujos. La Figura 1 es una representación esquemática del anticuerpo genético y las proteínas de fusión del anti-cuerpo angiogenina . La Figura 2A es un diagrama esquemático de la estructura de los vectores de expresión transgénicos para transferir el anti-cuerpo receptor (E6) y la proteína de fusión de angiogenina-enzima (CH2Ang) . Se fusionaron los siguientes AD 1 s entre los exones 2 y 7 de un gen de ß-caseína de cabra modificado (DiTullio y colaboradores, 1992) , para expresión en la glándula mamaria de ratón,- la cadena pesada del anti-cuerpo monoclonal receptor de transferrina humano, E6 (1) ; la misma cadena pesada fusionada en el dominio CH2 al extremo 5' del gen que codifica angiogenina (Ang) , como se describió previamente (Rybak y colaboradores, 1992) (II) ; la cadena ligera del anti-cuerpo E6 (III) . Cajas abiertas, cadena pesada; cajas articuladas cruzadas, cadena ligera; cajas rayadas, Ang . La Figura 2B muestra análisis Western usando anticuerpos anti -angiogenina o anti-IgG bajo condiciones reductoras, de leche recolectada a partir de hembras lactantes que producen el anti-cuerpo de IgG E6 o la proteína de fusión CH2Ang. Se aplicaron al gel 15 µ? de leche diluida con un volumen igual de PBS . La figura 2C muestra análisis Western del anti-cuerpo E6 purificado o CH2Ang bajo condiciones reductoras o no reducto-ras. Los manchados fueron analizados con los anti-cuerpos indicados; 0.3 ug E6, carriles 1 y 2; 4 pg ES, carril 3; 3.07 y 0.2 ug CH2Ang, carriles 4 y 5, respectivamente. La figura 3 es una gráfica que bosqueja los efectos de la angiogenina o una fusión de angiogenina-anti -cuerpo (CH2Ang) sobre la traducción del ARNm. La angiogenina o la proteína de fusión fue añadida a una mezcla lisada conteniendo ARNm BMV y [35S] metionina . La síntesis de proteína fue determinada midiendo la incorporación de marbete en la proteína recién sintetizada como se describe en Newton y colaboradores, 1996. Los datos de 2-3 experimentos fueron juntados y graficados ± SEM. Los resultados son expresados como un porcentaje de la reacción de control, tratada falsamente. IC50 es la concentración de Ang o la proteína de fusión de Ang requerida para ocasionar 50% de inhibición de la síntesis de proteína y se determinó a partir de las curvas de respuesta de dosis. Círculos sólidos, Ang,-círculos abiertos, CH2Ang. La figura 4 es una gráfica que bosqueja una curva de respuesta a dosis que muestra el efecto citotoxico de la fusión de angiogenina-anti-cuerpo en células cultivadas. La toxicidad in vivo de CH2Ang a células SF539 y DA-MB-231] mdr, como se determina por inhibición de síntesis de proteína. Los ensayes de citotoxicidad fueron llevados a cabo midiendo la incorporación de [14C] leucina en proteínas celulares, como se describe en la sección de métodos. Los ensayes fueron conducidos en presencia de suero y cambiados a medio libre de leucina y suero antes de pulsar con [14C] leucina . La IC50 es la concentración de las proteínas de fusión de angiogenina requeridas para ocasionar un 50% de inhibición de la síntesis de proteína después de 3 días, y se determinó directamente a partir de las curvas de respuesta a dosis. La SEM es introducida entonces, cuando es mayor que el símbolo. Símbolos sólidos: células de glioma humano SF539 símbolos abiertos, células de cáncer de pecho humano MDA-MB-231] radr . La presente invención proporciona, cuando menos en parte, proteínas de fusión producidas transgénicamente . En una forma de realización, la proteína de fusión incluye una sub-unidad de inmunoglobulina (v.gr. , una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina) fusionada a una toxina (v.gr., una sub-unidad de una enzima) . Las proteínas de fusión de inmunoglobulina-enzima descritas en la presente sirven para dirigir un agente citotoxico (v.gr., la enzima) a una célula indeseable, v.gr., una célula de tumor. Por ejemplo, las proteínas de fusión descritas en los ejemplos que siguen (es decir, un anti -cuerpo contra el antígeno carcino-embriónico (CEA) fusionado a una enzima, v.gr. , ARNasa A o carboxipeptidasa) se puede usar para poner en objetivo a una célula de tumor. Después de permitir suficiente tiempo para que la fusión de inmunoglobulina-enzima se localice en el sitio del tumor, se puede administrar un pro-fármaco no tóxico. Este profármaco se convierte en un fármaco altamente citotoxico mediante la acción de la enzima puesta en objetivo localizada en el sitio del tumor, permitiendo alcanzar niveles terapéuticos del fármaco sin toxicidad inaceptable para los pacientes. Producción de inmunoglobulinas Un anti-cuerpo monoclonal contra un antígeno objetivo, v.gr. , una proteína de la superficie celular (v.gr. , receptor) sobre una célula se puede producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anti-cuerpo monoclonal convencional, v.gr., la técnica de hibridación celular somática estándar de Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975) . Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación celular somática, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales , v.gr. , transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el . aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la materia. También se conocen los participantes de la fusión (v.gr., células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión. Se pueden generar anti-cuerpos monoclonales humanos (mAbs) dirigidos contra proteínas humanas usando ratones transgénicos que llevan el sistema inmune completo en vez del sistema de ratón. Esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se usan para producir hibridomas que secretan anti-cuerpos monoclonales humanos contra afinidades específicas por epítopes de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood y colaboradores, publicación internacional O 91/00906; Kucherlapati y colaboradores, publicación internacional WO 91/10741; Lonberg y colaboradores, publicación internacional WO 92/03918; Kay y colaboradores, publicación internacional 92/03917; Lonberg, N. , y colaboradores, 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L., y colaboradores, 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. y colaboradores, 1994 Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:6851-6855; Bruggeman y colaboradores, 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon y colaboradores, 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman y colaboradores, 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326) . Los anti -cuerpos monoclonales también se pueden generar mediante otros métodos conocidos por los técnicos en la materia de la tecnología de ADN recombi ante . Un método alternativo, conocido como el método "de despliegue de anti -cuerpo combinatorio", se ha desarrollado para identificar y aislar fragmentos de anti -cuerpos que tienen una especificidad de antígeno particular, y se pueden utili2ar para producir anti -cuerpos monoclonales (para ver descripciones de despliegue de anti -cuerpo combinatorio véase, v.gr., Sastry y colaboradores, 1989 PNAS 86:5728; Huse y colaboradores, 1989 Science 246:1275; y Orlandi y colaboradores, 1989 PNAS 86:3833) . Después de inmunizar un animal con un inmunógeno como se describe anteriormente, el repertorio de anticuerpos del depósito de células B resultantes se clona. Se conocen métodos en general para obtener la secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina usando una mezcla de cebadores de oligómeros y reacción de cadena de polimerasa. Por ejemplo, los cebadores de oligonucleótidos mezclados que corresponden a las secuencias delanteras 5Ü (péptido señal) y/o las secuencias de estructura 1 (FR1) , así como el cebador a un cebador de región constante 3Ü conservada se pueden usar para amplificación por reacción de cadena de polimerasa de las regiones variables de cadena pesada y ligera a partir- de. varios anti-cuerpos de murino (Larrick y colaboradores, 1991, Biotechniques 11:152-156) . Una estrategia similar también se puede usar para amplificar las regiones variables de cadena pesada y ligera humana a partir de anticuerpos humanos (Larrick y colaboradores, 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-110) . En una forma de realización ilustrativa, el ARN se aisla de linfocitos B, por ejemplo, células de sangre periférica, médula ósea, o preparaciones de bazo, usando protocolos estándares (v.gr., patente US 4,683,202; Orlandi, y colaboradores, PNAS (1989) 86:3833-3837; Sastry y colaboradores , PNAS (1989) 86:5728-5732; y Huse y colaboradores, (1989) Science 246:1275-1281) . El ADNc de primera cadena se sintetiza usando cebadores específicos para la región constante de la o las cadenas pesadas y cada una de las cadenas ligeras ? y ?, así como cebadores para la secuencia de señal . Usando cebadores de reacción de cadena de polimerasa de región variable, las regiones variables tanto de las cadenas pesadas como ligeras se amplifican, cada una sola o en combinación, y se ligan en vectores adecuados para la manipulación adicional para generar los paquetes de despliegue. Los cebadores de oligonucleótidos útiles en protocolos de amplificación pueden ser únicos o degenerarse o incorporar inosina en posiciones degeneradas. La restricción de secuencias de reconocimiento de endonucleasa también se pueden incorporar en los cebadores para permitir la clonación del fragmento amplificado en un vector en un marco de lectura predeterminado para la expresión.

La biblioteca de V-gen clonada a partir del repertorio de anti-cuerpos derivados de inmunización se puede expresar mediante una población de paquetes de despliegue, preferiblemente derivados de fago filamentosa, para formar una biblioteca de despliegue de an i -cuerpos . Idealmente, el paquete de despliegue comprende un sistema que permite el muestreo de bibliotecas de despliegue de anti-cuerpos muy grandes variadas, la clasificación rápida después de cada ronda de separación por afinidad, y el fácil aislamiento del gen del anti-cuerpo a partir de paquetes de despliegue purificados. Además de los juegos disponibles comercialmente para generar las bibliotecas de despliegue de fago (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System, de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-01; y el juego de despliegue de fago SurfZAF® de Stratagene, número de catálogo 240612) , ejemplos de métodos y reactivos particularmente dóciles para su uso para generar una biblioteca de despliegue de anti-cuerpo variada se pueden encontrar en, por ejemplo, Ladner y colaboradores, patente US 5,223,409; Kang y colaboradores, publicación internacional WO 92/18619; Dower y colaboradores, publicación internacional WO 91/17271; Winter y colaboradores, publicación internacional WO 92/20791; arkland y colaboradores, publicación internacional WO 92/15679; Breitling y colaboradores, publicación internacional WO 93/01288; McCafferty y colaboradores, publicación internacional WO 92/01047; Garrard y colaboradores, publicación internacional WO 92/09690; Ladner y colaboradores, publicación internacional WO 90/08209; Fuchs y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ; Hay y colaboradores, (1992) Hum Antibod Hybridomas 2:81-85 ; Huse y colaboradores, (1989) Science 246 : 1275-1281 ; Griffths y colaboradores, (1993) EMBO J 12 : 725-734 ; Hawkins y colaboradores , (1992) J Mol Biol 226 : 889-896 ; Clackson y col boradores, (1991) Nature 352 : 624-628; Gram y colaboradores, (1992) PNAS 89 ; 3576-3580; Garrad y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377 ; Hoogenboom y colaboradores, (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y colaboradores, (1991) PNAS 88:7978-7982. En ciertas modalidades, los dominios de la región V de las cadenas pesadas y ligeras se pueden expresar en el mismo polipéptido, unido por un enlazador flexible para formar un fragmento Fv de cadena simple, y el gen scFV posteriormente clonado en el vector de expresión deseado o genoma de fago. Como se describe generalmente en McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348 : 552-554 , los dominios completos VH y VL de un anticuerpo, unidos por un enlazador flexible (Gly4-Ser)3 se puede usar para producir un anti-cuerpo de cadena simple el cual puede volver al paquete de despliegue separable basándose en afinidad de antígeno. Los anti-cuerpos scFV aislados inmuno-reactivos con el antígeno pueden posteriormente formularse en una preparación farmacéutica para su uso en el presente método. En cuanto se despliega la superficie del paquete de despliegue (v.gr. , un fago filamentoso), la biblioteca de anticuerpo se selecciona con el antígeno objetivo, o el fragmento de péptido del mismo, para identificar y aislar paquetes que expresan un anti-cuerpo que tiene especificidad para el antígeno objetivo. El ácido nucleico que codifica el anti-cuerpo seleccionado se puede recuperar del paquete de despliegue (v.gr. , del genoma de fago) y sub-clonar en otros vectores de expresión mediante técnicas de ADN recombinantes estándares. Las moléculas de anti-cuerpos específicos con altas afinidades para una proteína de superficie se pueden hacer de acuerdo con métodos conocidos para los técnicos en la materia, por ejemplo, métodos que involucran la selección de bibliotecas (Ladner, R.C., y colaboradores, patente US 5,233,409; Ladner, R.C., y colaboradores, patente US 5,403,484). Además, los métodos de estas bibliotecas se pueden usar en selecciones para obtener determinantes de enlace que son miméticos de los determinantes estructurales de los anti-cuerpos. En particular, la superficie de enlace Fv de una molécula de anti-cuerpo particular interactúa con su ligando objetivo de acuerdo con principios de interacciones de proteínas-proteína, por lo tanto los datos de la secuencia para VK y VL (la última de las cuales puede ser del tipo de cadena ? y ?) es la base para las técnicas de diseño artificial de proteínas conocidos por los técnicos en la materia. Los detalles de la superficie de proteína que comprende los determinantes de enlace se pueden obtener a partir de información de secuencias de anticuerpos, mediante un procedimiento de modelado usando estructuras tridimensionales previamente determinadas a partir de otros anticuerpos obtenidos de estudios de resonancia magnética nuclear o datos cristalográficos. Véase por ejemplo, Bajorath, J. y S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Furzct., andGenet. 24 (2), 152-157; Webster, D.M., y A.R. Rees, 1995, "Molecular modelling of antibody-combining sites", en S. Paul, editor, Methods in Molecular Biol . 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, páginas 17-49; y Johnson, G., Wu, T.T. y E.A. Kabat, 1995, "Seqhunt : A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences" , in ATet-hods in Molecular Biol. 51, op., cit. , páginas 1-15. En una forma de realización, una biblioteca de péptido variable se expresa por una población de paquetes de despliegue para formar una biblioteca de despliegue de péptidos. Idealmente, el paquete de despliegue comprende un sistema que permite el muestreo de bibliotecas de despliegue de péptidos muy grandes variadas, la clasificación rápida después de cada ronda de separación por afinidad, y el aislamiento fácil del gen que codifica el péptido a partir de paquetes de despliegue purificado. Las bibliotecas de despliegue de péptidos pueden estar en, v.gr., organismos procarióticos y virus, los cuales se pueden amplificar rápidamente, y son relativamente fáciles de manipular, y los cuales permiten la creación de un gran número de clonas. Los paquetes de despliegue preferidos incluyen, por ejemplo, células bacterianas vegetativas, esporas bacterianas, y más preferiblemente , virus bacterianos (especialmente virus de ADN) . Sin embargo, la presente invención también contempla el uso de células eucarióticas , incluyendo levaduras y sus esporas, como paquetes de despliegue potenciales. Las bibliotecas de despliegue de fago se describen anteriormente. Otras técnicas incluyen cromatografía por afinidad con un "receptor" adecuado, v.gr. , un antígeno objetivo, seguido por la identificación de los agentes de ligadura aislados o ligandos mediante técnicas convencionales (v.gr., espectrometría de masa y resonancia magnética nuclear). Preferiblemente, el receptor soluble se conjuga a una etiqueta (v.gr., fluoroforas, enzimas colorimétricas , radioisótopos, o compuestos luminiscentes) que se pueden detectar para indicar la ligadura de ligandos. Alternativamente, los compuestos inmovilizados se pueden liberar selectivamente y permitir difundir a través de una membrana para interactuar con un receptor. Las bibliotecas combinatorias de los compuestos también se pueden sintetizar con "etiquetas" para codificar la identidad de cada miembro de la biblioteca (véase, por v.gr., W.C. Still y colaboradores, publicación internacional WO 94/08051). En general, este método caracteriza el uso de etiquetas inertes pero fácilmente detectables, que se unen al soporte sólido o a los compuestos. Cuando se detecta un compuesto activo, la identidad del compuesto se determina mediante la identificación de la etiqueta acompañante única. Este método de etiquetado permite la síntesis de grandes bibliotecas de compuestos que se pueden identificar a niveles muy bajos entre el conjunto total de todos los compuestos de la biblioteca. El término anti-cuerpo modificado también pretende incluir anti-cuerpos, tales como los anti-cuerpos monoclonales , anti-cuerpos quiméricos, y anti-cuerpos humanizados que han sido modificados mediante, v.gr., supresión, adición, o sustitución de porciones del anti-cuerpo. Por ejemplo, un anti-cuerpo se puede modificar suprimiendo la región de articulación, generando de este modo un anti-cuerpo monovalente. Cualquier modificación está dentro del alcance de la invención en tanto el anti-cuerpo tenga cuando menos una región de ligadura de antígeno específica. Los anti-cuerpos monoclonales humanos, de ratón quimérico (es decir, anti-cuerpos quiméricos) se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinantes conocidas en la materia. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fe de una molécula de anti-cuerpo molecular murino (o de otra especie) se digiere con enzimas de restricción para remover la región que codifica el Fe murino, y la porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fe humana se sustituye. (Véase Robinson y colaboradores, publicación internacional PCT/ US86/02269; Akira, y colaboradores, publicación europea 184,187; Taniguchi, ., publicación europea 171,496; Morrison y colaboradores, publicación europea 173,494; Neuberger y colaboradores, publicación internacional WO 86/01533; Cabilly y colaboradores, patente US 4,816,567; Cabilly y colaboradores, publicación europea 125,023; Better y colaboradores, (1988 Science 240:1041-1043); Liu y colaboradores, (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu y colaboradores, 1987, J. Im unol . 139:3521-3526; Sun y colaboradores, (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y colaboradores, 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood y colaboradores, (1985) Nature 314:446-449; y Shaw y colaboradores, 1988, J". Nati Cáncer Inst. , 80 : 1553-1559) . El anti-cuerpo quimérico se puede humanizar adicional-mente reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están directamente involucradas en el enlace de antígeno con secuencias equivalentes a partir de regiones variables de Fv humanas. Las revisiones generales de los anti-cuerpos quiméricos humanizados son proporcionados por Morrisson, S. L. , 1985, Science 229:1202-1207 y por Oi y colaboradores, 1986 Bio Techniques 4:214. Esos métodos incluyen aislar, manipular, y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican toda o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina a partir de cuando menos una cadena pesada o ligera. Las fuentes de este ácido nucleico son muy conocidas a los técnicos en la materia, y, por ejemplo, se pueden obtener a partir de 7E3 , un hibridoma que produce el anti-cuerpo anti-GPIIbIIIa. El ADN recombinante que codifica el anti-cuerpo quimérico, o fragmento del mismo, se puede entonces clonar en un vector de expresión adecuado. Los anti-cuerpos humanizados convenientes alternativamente pueden ser producidos mediante sustitución de región de determinación de complementariedad, patente US 5,225,539; Jones y colaboradores, 1986 Wature 321:552-525; Verhoeyan y colaboradores, 1988 Science 239:1534; y Beidler y colaboradores, 1988 J. Inwnunol. 141:4053-4060. Todas las regiones de determinación de complementariedad de un anti-cuerpo humano particular se pueden reemplazar con cuando menos una porción de una región de determinación de complementariedad humana o solamente algunas de las regiones de determinación de complementariedad se pueden reemplazar con regiones de determinación de complementariedad no humana. Sólo es necesario reemplazar el número de regiones de determinación de complementariedad requeridos para enlazar el anti-cuerpo humanizado al receptor Fe. Un anti-cuerpo se puede humanizar mediante cualquier método, el cual sea capaz de reemplazar cuando menos una porción de una región de determinación de complementariedad de un anticuerpo humano con una región de determinación de complementariedad derivada de un anti-cuerpo no humano. Winter describe un método el cual se puede usar para preparar los anti -cuerpos humanizados de la presente invención (solicitud de patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987) , el contenido de la cual se incorpora expresamente mediante referencia. Las regiones de determinación de complementariedad se pueden reemplazar con regiones de determinación de complementa-riedad no humanas usando mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos . También dentro del alcance de la invención están los anti -cuerpos quiméricos y humanizados en los cuales aminoácidos específicos han sido sustituidos, suprimidos o añadidos. En particular, los anti-cuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región de la estructura, de manera que mejoran el enlace al antígeno. Por ejemplo, en un anti -cuerpo humanizado que tiene regiones de determinación de complementariedad de ratón, los aminoácidos localizados en la región de estructura humana se pueden reemplazar con los aminoácidos localizados en las posiciones correspondientes en el anti-cuerpo de ratón. Estas sustituciones se sabe que mejoran el enlace de los anti-cuerpos humanizados con el antígeno en algunos casos. Los anti-cuerpos en los cuales se han añadido, suprimido, o sustituido aminoácidos se conocen en la presente como anticuerpos modificados o anti-cuerpos alterados. Antígenos objetivo En formas de realización preferidas, el primer miembro de las proteínas de fusión de la presente invención es un agente objetivo, v.gr., un polipéptido que tiene una alta afinidad para un objetivo, v.gr., un anti-cuerpo, un ligando, o una enzima. De conformidad con lo anterior, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para dirigir selectivamente (v.gr., localizar) el segundo componente de la proteína de fusión en la vecindad de una célula indeseable. Por ejemplo, el primer componente puede ser una inmunoglobulina que interactúa con (v.gr. , se liga a un antígeno objetivo) . En ciertas modalidades, el antígeno objetivo está presente en la superficie de una célula, v.gr., una célula aberrante tal como una célula hiper-proliferativa (v.gr. , una célula de cáncer). Los antigenos objetivos ejemplares incluyen el antígeno carcino-embriónico (CEA), TAG-72, her-2/neu, el receptor del factor de crecimiento epidérmico, el receptor de transíerrina, entre otros. Como se usa en la presente, "célula objetivo" puede significar cualquier célula indeseable en un sujeto (v.gr., un humano o un animal) que pueda ser alcanzado por una proteína de fusión de la invención. Las células objetivo ejemplares incluyen células de tumor, tales como células de carcinoma o células derivadas de adeno-carcinoma (v.gr. , células de cáncer de colon, de pecho, de próstata, de ovario y de endometrio) (Thor, A. , y colaboradores, (1997) Cáncer Res 46:3118; Soisson A.P., y colaboradores, (1989) Am. J. Obstet. Gynecol.: 1258_63) . El término "carcinoma" se reconoce en la materia y se refiere a malignidades de tejidos epiteliales o endocrinos que incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares , carcinomas de pecho, carcinomas ováricos, carcinomas prostéticos, carcinomas del sistema endócrino, y melanomas. Los carcinomas ejemplares incluyen los que se forman de tejidos de la cérvix, pulmón, próstata, pecho, cabeza y cuello, colon y ovario. El término también incluye carcino-sarcomas, v.gr., los cuales incluyen tumores malignos compuestos de tejidos carcinoma-tosos y sarcomatosos . Un "adeno-carcinoma" se refiere a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el cual las células de tumor forman estructuras glandulares reconocibles. El término "sarcoma" es reconocido en la materia y se refiere a tumores malignos de derivación mesenquimal . Producción de proteínas de fusión Los componentes de la proteína de fusión se pueden enlazar entre sí, preferiblemente vía una secuencia enlazadora. La secuencia enlazadora deberá separar el primero y segundo miembro de la proteína de fusión en una distancia suficiente para asegurar que cada miembro adecuadamente se doble en sus estructuras secundarias y terciarias. Las secuencias enlazadoras preferidas (1) deberán adoptar una conformación extendida flexible, (2) no deberán exhibir una propensidad a desarrollar una estructura secundaria ordenada la cual podría interactuar con los primero y segundo miembros funcionales, y (3) deberá tener un carácter hidrófobo mínimo o cargado, el cual podría promover la interacción con los dominios de proteínas funcionales. Los aminoácidos de superficie típicos en las regiones de proteínas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Las permutaciones de secuencias de aminoácidos que contienen Gly, Asn y Ser se esperaría que satisficieran los criterios anteriores de una secuencia enlazadora. Otros aminoácidos neutros cercanos, tales como Thr y Ala, también se pueden usar en la secuencia enlazadora . Una longitud de secuencia enlazadora de 20 aminoácidos se puede usar para proporcionar una separación conveniente de dominios de proteínas funcionales, aunque secuencias enlazadoras más largas o más cortas también se pueden usar. La longitud de la secuencia enlazadora que separa el primero y el segundo componentes puede ser de 5 a 500 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente de 5 a 100 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia enlazadora es de aproximadamente 5-30 aminoácidos de longitud. En formas de realización preferidas, la secuencia enlazadora es de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, y ventajosamente es de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos útiles como enlazadores del primero y segundo miembro incluye, pero no se limita a, (SerGly4)y donde y es mayor que o igual a 8, o Gly SerGly5Ser . Una secuencia enlazadora preferida tiene la fórmula (SerGly4)4. Otro enlazador preferido tiene la secuencia ( (Ser-Ser-Ser-Gly) 3-Ser-Pro) . El primero y el segundo componentes se pueden fusionar directamente sin una secuencia enlazadora. Las secuencias enlazadoras no son necesarias cuando las proteínas que se están fusionando tienen regiones de aminoácidos N- o C-terminales no esenciales las cuales se pueden usar para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica. En formas de realización preferidas, el término C del primer miembro se puede fusionar directamente al término N del segundo, o viceversa. Producción recombinante Una proteína de fusión de la invención se puede preparar con técnicas de ADN recombinantes usando una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión se puede sintetizar mediante métodos de síntesis de ADN estándares. Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión se puede introducir en una célula hospedera, por ejemplo, una célula de una línea celular primaria o inmortalizada. Las células recombinantes se pueden usar para producir la proteína de fusión. Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión se puede introducir en una célula hospedera, v.gr. , por medio de recombinación homologa. En la mayoría de los casos, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se incorpora en un vector de expresión recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión se puede enlazar operativamente a una o más secuencias reguladoras, seleccionadas con base en las células hospederas que se van a usar para la expresión. El término "enlazado operablemente" significa que las secuencias que codifican el compuesto de la proteína de fusión están enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la proteína de fusión. El término "secuencia reguladora" se refiere a promotores, mej oradores y otros elementos de control de la expresión (v.gr., señales de poliadenilación) . Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Exprés-sion Technology: Methods in Enzymology 185 , Academic Press, San Diego, CA (1990) , el contenido de la cual se incorpora en la presente mediante referencia. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospederas, las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células hospederas (v.gr., secuencias reguladoras específicas de tejido) y las que dirigen la expresión de una manera regulable (v.gr. , solamente en la presencia de un agente inductor) . Será apreciado por los técnicos en la materia que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que se va a transformar, el nivel de la expresión de la proteína de fusión deseada, y similares. Los vectores de expresión de la proteína de fusión se pueden introducir en las células hospederas para producir con ello las proteínas de fusión codificadas por ácidos nucleicos . Los vectores de expresión recombinantes se pueden diseñar para la expresión de proteínas de fusión en células procarióticas o eucarióticas . Por ejemplo, las proteínas de fusión se pueden expresar en células bacterianas tales como E.coli, células de insectos (v.gr. , en el sistema de expresión del baculovirus) , células de levadura o células de mamíferos. Algunas células hospederas convenientes se mencionan adicional -mente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 , Academic Press, San Diego, California (1990). Los ejemplos de vectores de expresión en levaduras S. cerevisiae incluyen pJRY88 ( (Schultz y colaboradores, (1987) Gene 54:113-123) , y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California) . Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas de fusión en células de insectos cultivadas (v.gr. , células Sf 9) incluyen las células pAc (Smith y colaboradores, (1983) Mol. Cell. Biol . 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow, V.A., y Summers, M.D. , (1989) Viroloay 170:31-39). Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B . , (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores, (1987), EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión frecuentemente son proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40. Además de las secuencias de control regulador discutidas anteriormente, los vectores de expresión recombinantes pueden contener secuencias de nucleótidos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión recombinante puede codificar un gen marcador seleccionable para identificar células hospederas que se han incorporado al vector. Más aún, para facilitar la secreción de la proteína de fusión a partir de una célula hospedera, en particular células hospederas de mamíferos, el vector de expresión recombinante puede codificar una secuencia de señales operativamente enlazada a secuencias que codifican el término amino de la proteína de fusión de manera que después de la expresión, la proteína de fusión se sintetiza con la secuencia de señales fusionada en su término amino. Esta secuencia de señal dirige la proteína de fusión hacia la senda secretora de la célula y ahí se disocia, permitiendo la liberación de la proteína de fusión madura (v.gr., la proteína de fusión sin la secuencia de señales) a partir de la célula hospedera. El uso de una secuencia de señales para facilitar la secreción de proteínas o péptidos a partir de células hospederas de mamíferos se conoce en la materia. El ADN de vector se puede introducir en células procarióticas o en células eucarióticas vía técnicas convencionales de transformación o de transfección . Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una variedad de técnicas relacionadas con el campo para introducir ácido nucleico extraño (v.gr., ADN) en una célula hospedera, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrán, lipofección, electro- incorporación, micro-inyección y transfec-ción mediada viralmente. Los métodos convenientes para transformar o transfectar células hospederas se pueden encontrar en Sambrook y colaboradores, {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) , y otros manuales de laboratorio. Frecuentemente sólo una fracción pequeña de células de mamíferos integran el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (v.gr., resistencia a los antibióticos) se puede introducir en las células hospederas junto con el gen que codifica la proteína de fusión) . Los marcadores selecciona-bles preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula hospedera sobre el mismo vector que al que codifica la proteína de fusión o se puede introducir sobre un vector separado. Las células establemente transíectadas con el ácido nucleico introducido se pueden identificar mediante selección por fármaco (v.gr. , células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren) . Un vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vi tro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

Mamíferos transgénicos Los métodos para generar animales transgénicos no humanos se describen en la presente. Las construcciones de ADN se pueden introducir en la línea germinal de un mamífero para hacer un mamífero transgénico. Por ejemplo, una o varias copias de la construcción se pueden incorporar en el genoma de un embrión de mamífero mediante técnicas transgénicas estándares. Frecuentemente es deseable expresar la proteína transgénica de la leche de un mamífero transgénico. Los mamíferos que producen grandes volúmenes de leche y tienen periodos de lactancia largos se prefieren. Los mamíferos preferidos son rumiantes, v.gr. , vacas, ovejas, camellos o cabras, v.gr., cabras de origen suizo, v.gr., las cabras de raza Alpina, Saanen y Toggenburg. Otros animales preferidos incluyen bueyes, conejos y cerdos. En una modalidad ejemplar, se produce un animal no humano transgénico introduciendo un transgén en la línea germinal de un animal no humano. Los transgenes se pueden introducir en células objetivo embrionarias en varias etapas de desarrollo. Se usan diferentes métodos dependiendo de la etapa de desarrollo de la célula objetivo embrionaria. La o las líneas específicas de cualquier animal usado, si es posible, deberán seleccionarse para tener salud buena en general, buena producción de embriones, buena visibilidad pro-nuclear en el embrión, y buen estado reproductivo .

La introducción del transgen de la proteína de fusión en el embrión se puede llevar a cabo mediante cualquier variedad de medios conocidos en la materia tales como micro-inyección, electro-incorporación, o lipofección. Por ejemplo, un transgén de proteínas de fusión se puede introducir en un mamífero mediante micro- inyección de la construcción en el pro-núcleo de el o los huevos de mamífero fertilizados para causar que una o más copias de la construcción sean retenidas en las células de los mamíferos que se desarrollan. Después de la introducción de la construcción de transgén en el huevo fertilizado, el huevo se puede incubar in vitro durante cantidades variantes de tiempo, o reimplantar en el anfitrión sustituto, o ambos. Un método común es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de la especie, y luego reimplantarlo en el anfitrión sustituto. La progenie de los embriones manipulados transgénica-mente se puede probar para determinar la presencia de la construcción mediante análisis de manchado Southern de un fragmento de tejido. Un embrión que tenga una o más copias de la construcción clonada exógenamente establemente integrada en el genoma se puede usar para establecer una línea de mamífero transgénico permanente que lleva la construcción añadida transgénicamente . Carnadas de mamíferos alterados transgénicamente se pueden probar después del nacimiento para determinar la incorpo-ración de la construcción en el genoma de los hijos. Esto se puede hacer hibridando una sonda correspondiente a la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión o un segmento de la misma sobre un material cromosomal de la progenie. La progenie de mamífero que se encuentre que contiene cuando menos una copia de la construcción en su genoma se cría hasta la madurez. La especie femenina de esta progenie producirá la proteína deseada en o junto con su leche. Los mamíferos transgénicos se pueden usar para producir otra progenie transgénica útil para producir las proteínas deseadas en su leche. Las hembras transgénicas se pueden examinar para determinar la secreción de proteína en la leche, usando técnicas de ensayo conocidas en el campo, por ejemplo, manchado Western o un ensayo enzimático. Otros animales transgénicos La proteína de fusión se puede expresar a partir de una variedad de animales transgénicos. Un protocolo para la producción de un cerdo transgénico se puede encontrar en White y Yannoutsos, Current Topics in Complement Research; 64th Forum in Immunology, páginas 88-94; patente US 5,523,226; patente US 5,573,933; solicitud internacional WO 93/25071; y solicitud internacional WO 95/04744. Un protocolo para la producción de ratones transgénicos se puede encontrar en la patente US 5,530,177. Un protocolo para la producción de ratas transgénicas se puede encontrar en Bader y Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996. Un protocolo para la producción de una vaca transgénica se puede encontrar en Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, editor, Cari A. Pinkert, Academic Press, Inc. Un protocolo para la producción de una oveja transgénica se puede encontrar en Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed. , Cari A. Pinkert, Academic Press, Inc. Un protocolo para la producción de un conejo transgénico se puede encontrar en Hammer y colaboradores, ature 315:680-683, 1985 y Taylor y Fan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308, 1997. Producción de proteína transgénica en la leche de un animal transgénico Promotores específicos de leche Los promotores de transcripción útiles son aquellos promotores que preferencialmente se activan en células epiteliales mamarias, incluyendo los promotores que controlan los genes que codifican las proteínas de la leche, tales como caseínas, ß-lactoglobulina (Clark y colaboradores, (1989) Bio/Technology 7:487-492), proteína de ácido de suero de leche (Gorton y colaboradores, (1987) Bio/Technology 5: 1183 - 1187) , y lactalbúmina (Soulier y colaboradores, (1992) FEBS Letts. 297:13) . El promotor de gen de a, ß, ? o ? caseína de cualquier especie de mamífero se puede usar para proporcionar expresión' mamaria; un promotor preferido es el promotor del gen de ß- caseína de cabra (DiTullio, (1992) Bio/Technology 10:74-77). El promotor de proteína específico de leche o los promotores que se activan específicamente en tejido mamario se pueden aislar a partir de ADNc o secuencias genómicas. Preferiblemente, son de origen genómico . La información de la secuencia de ADN está disponible para genes específicos de la glándula mamaria enlistados anteriormente, y cuando menos uno, y frecuentemente en varios organismos. Véase, v.gr., Richards y colaboradores, J. Biol . Chem. 256, 526-532 (1981) (a-lactalbúmina de rata) ; Campbell y colaboradores, Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (WAP de rata); Jones y colaboradores, J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (ß-caseína de rata); Yu-Lee y Rosen, J". Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (?-caseína de rata) ; Hall, BiochemJ. 242,735-742 (1987) (a-lactalbúmina humana); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (ADNc de asi y caseína bovina); Gorodetsky y colaboradores, Gene 66, 87-96 (1988) (ß-caseína bovina); Alexander y colaboradores, Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (K caseína bovina) ; Brignon y colaboradores, FEBS Lett 188, 48-55 (1977) (aS2 caseína bovina); Jamieson y colaboradores, Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov y colaboradores, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988) , Alexander y colaboradores, Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) ( ß- lactoglobulina bovina) ,- Vilotte y colaboradores, Biochimie 69, 609-620 (1987) (a-lactalbúmina bovina) . La estructura y la función de distintos genes de proteínas de la leche son realizados por Mercier & Vilotte, J".

Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993) (incorporada mediante referencia por entero para todos los propósitos) . Si son útiles secuencias de flanqueo adicionales para optimizar la expresión, estas secuencias se pueden clonar usando las secuencias existentes como sondas. Las secuencias reguladoras específicas de la glándula mamaria de diferentes organismos se pueden obtener seleccionando bibliotecas de estos organismos usando secuencias de nucleotidos cognados conocidas, o anti -cuerpos para las proteínas cognadas como sondas . Secuencias de señal Las secuencias de señal útiles son secuencias de señal específicas de la leche u otras secuencias de señales que dan como resultado la secreción de proteínas eucarióticas o procarió-ticas. Preferiblemente, la secuencia de señal se selecciona de secuencias de señales específicas de la leche, es decir, es a partir de un gen el cual codifica un producto secretado en leche. Más preferiblemente, la secuencia de señal específica de la leche se relaciona con el promotor específico de la leche usado en el sistema de expresión de esta invención. El tamaño de la secuencia de señal no es crítico para esta invención. Todo lo que se requiere es que la secuencia tenga un tamaño suficiente para efectuar la secreción de la proteína recombinante deseada, v.gr., en el tejido mamario. Por ejemplo, la secuencia de señales de genes que codifican caseínas, v.gr., a, ß, ? o ? caseínas, ß-lactoglobulina, proteína de ácido de suero de leche, y lactalbúmina son útiles en la presente invención. Una secuencia de señal preferida es la secuencia de señales de ß-caseína de cabra. Las secuencias de señales de otras proteínas secretadas, por ejemplo, inmunoglobulinas, o proteínas secretadas por células del hígado, células de riñon, o células pancreáticas también se pueden usar. Secuencias aislantes Las construcciones del ADN de la invención además comprenden cuando menos una secuencia aislante. Los términos "aislante", "secuencia aislante" y "elemento aislante" se usan intercambiablemente en la presente. Un elemento aislante es un elemento de control que aisla la transcripción de genes colocados dentro de su rango de acción pero que no perturba la expresión del gen, ya sea negativamente o positivamente. Preferiblemente, una secuencia aislante se inserta en cualquiera de los lados de la secuencia de ADN que se va a transcribir. Por ejemplo, el aislante se puede colocar aproximadamente 200 pares de bases hasta aproximadamente 1 kb, 5Ü a partir del promotor, y cuando menos aproximadamente 1 kb a 5 kb a partir del promotor, en el extremo 3Ü del gen de interés. La distancia de la secuencia aislante del promotor y el extremo 3Ü del gen de interés se puede determinar por los técnicos en la materia, dependiendo de los tamaños relativos del gen de interés, el promotor y el mej orador usado en la construcción. Además, se puede colocar más de una secuencia aislante 5Ü a partir del promotor o en el extremo 30 del transgén. Por ejemplo, dos o más secuencias aislantes se pueden colocar 50 del promotor. El aislante o los aislantes en el extremo 3Ü del transgén se pueden colocar en el extremo 3Ü del gen de interés, o en el extremo 3Ü de una secuencia reguladora 30, v.gr., una región no traducida 3Ü (UTR) o una secuencia de flanqueo 3Ü. Un aislante preferido es un segmento de ADN que abarca el extremo 50 del lugar ß-globina de pollo y corresponde al sitio hipersensible constitutivo 50 de pollo como se describe en la publicación internacional WO 94/23046, cuyo contenido se incorpora en la presente mediante referencia. Construcciones de ADN Una proteína de fusión se puede expresar a partir de una construcción que incluye un promotor específico para células epiteliales mamarias, v.gr., un promotor de caseína, v.gr., un promotor de ß-caseína de cabra, una secuencia de señal específica de leche, v.gr., una secuencia de señal de caseína, v.gr., una secuencia de señal de ß-caseína, y un ADN que codifica una proteína de fusión. Una construcción también puede incluir una región no traducida 30 corriente abajo de la secuencia de ADN que codifica la proteína no secretada. Estas regiones pueden estabilizar la transcripción del ARN del sistema de expresión y de este modo aumenta la producción de la proteína deseada del sistema de expresión. Entre las regiones no traducidas 3Ü útiles en las construcciones de esta invención están las secuencias que proporcionan una señal poli A. Estas secuencias se pueden derivar, v.gr. , del antígeno t pequeño SV40, la región no traducida 3Ü de caseína u otras secuencias no traducidas 3Ü muy conocidas en la materia. Preferiblemente, la región no traducida 3Ü se deriva de una proteína específica de la leche. La longitud de la región no traducida 3Ü no es crítica pero el efecto estabilizante de esta transcripción poli A parece importante para estabilizar el ARN de la secuencia de expresión. Una construcción puede incluir una región no traducida 5Ü entre el promotor y la secuencia de ADN que codifica la secuencia de señales. Estas regiones no traducidas pueden ser de la misma región de control a partir de la cual el promotor se toma o pueden ser de un gen diferente, v.gr., se pueden derivar de otras fuentes sintéticas, semi-sintéticas o naturales. De nuevo su longitud específica no es crítica, sin embargo, parece ser útiles en mejorar el nivel de expresión. Una construcción también incluye aproximadamente 10%, 20%, 30%, o más de la región de codificación N-terminal de un gen preferencialmente expresado en células epiteliales mamarias. Por ejemplo, la región de codificación N-terminal puede corresponder al promotor usado, v.gr. , una región de codificación N-terminal de ß-caseína de cabra. Los métodos del estado de la técnica pueden incluir hacer una construcción y probarla para determinar la capacidad de producir un producto en células cultivadas antes de colocar la construcción en un animal transgénico. De manera sorprendente, los inventores han encontrado que este protocolo puede no ser de valor predictivo para determinar si una proteína normalmente no secretada se puede secretar, v.gr. , en la leche de un animal transgénico. Por lo tanto, puede ser deseable probar construcciones directamente en animales transgénicos , v.gr., ratones transgénicos , ya que algunas construcciones que no se secretan en las células CHO se secretan en la leche de animales transgénicos. Purificación a partir de leche La proteína de fusión transgénica se puede producir en la leche a concentraciones relativamente altas y en volúmenes grandes, proporcionando una producción a alto nivel continuo de péptido procesado normalmente que es fácilmente cosechado de un recurso renovable. Hay varios métodos diferentes conocidos en la materia para el aislamiento de proteínas a partir de leche. Las proteínas de la leche usualmente se aislan mediante una combinación de procesos. La leche bronca primero se fracciona para remover las grasas, por ejemplo, mediante formación de nata, centrifugación, sedimentación (H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, New York, 1982), la precipitación acida (patente US 4,644,056) o coagulación enzimática con renina o quimiotripsina (Swaisgood, ibid.) . Enseguida, las principales proteínas de leche se pueden fraccionar en ya sea una solución clara o un precipitado en volumen a partir del cual se puede purificar fácilmente la proteína de interés específica. La solicitud de patente US No. de Serie 08/648,235 describe un método para aislar un componente de la leche soluble, tal como un péptido, en su forma biológicamente activa a partir de la leche entera o una fracción de leche mediante filtración de flujo tangencial. A diferencia de los métodos de aislamiento anteriores, esto elimina la necesidad de un primer fraccionamiento de la leche entera para remover la grasa y las micelas de caseína, mediante lo cual se simplifica el proceso y se evitan pérdidas de recuperación y bioactividad. Este método se puede usar en combinación con pasos de purificación adicionales para remover adicionalmente contaminantes y purificar el componente de interés . Producción de proteína transgénica en los huevos de un animal transgénico Se puede producir una proteína de fusión en tejidos, secreciones, u otros productos, v.gr., un huevo, de un animal transgénico. Por ejemplo, se pueden producir proteínas de fusión en los huevos de un animal transgénico, preferiblemente un pavo transgénico, pato, ganso, avestruz, gallina de guinea, pavorreal, perdiz, faisán, paloma, y más preferiblemente un pollo transgénico, usando métodos conocidos en la materia (Sang y colaboradores, Trends Biotechnolog , 12:415-20, 1994). Los genes que codifican proteínas específicamente expresadas en el huevo, tales como los genes de proteína de yema y los genes de proteína de albúminas, se pueden modificar para dirigir la expresión de la proteína de fusión. Promotores específicos del huevo Los promotores de transcripción útiles son aquellos promotores que se activan preferencialmente en el huevo, incluyendo los promotores que controlan los genes que codifican las proteínas del huevo, v.gr., ovoalbúmina, lisozima y avidina . Los promotores de la ovoalbúmina de pollo, lisozima o genes de avidina se prefieren. Los promotores de proteína específica del huevo o los promotores que se activan específicamente en el tejido del huevo pueden ser a partir de secuencias de ADNc o secuencias genómicas . Preferiblemente, los promotores específicos del huevo son de origen genómico. Las secuencias de ADN de genes específicos del huevo se conocen en la materia (véase, v.gr., Burley y colaboradores, "The Avian Egg" , John Wiley and Sons, pág. 472, 1989, el contenido de la cual se incorpora en la presente mediante referencia) . Si son útiles las secuencias de flanqueo adicionales para optimizar la expresión, estas secuencias se pueden clonar usando las secuencias existentes como sondas. Las secuencias reguladoras específicas del huevo a partir de diferentes organismos se pueden obtener seleccionando bibliotecas de estos organismos usando secuencias de nucleótidos cognados conocidas, o anti-cuerpos para las proteínas cognadas como sondas. Plantas transgénicas Se puede expresar una proteína de fusión en un organismo transgénico, v.gr., una planta transgénica, v.gr., una planta transgénica en la cual el transgén de ADN se inserta en el genoma nuclear o plastídico. La transformación de las plantas se conoce en la materia. Véase, en general, Methods in Enzymology Vol . 153 ( "Recombinant DNA Part D" ) 1987, Wu y Grossman editores, Academic Press y la solicitud de patente europea EP 693554. Se puede introducir ácido nucleico extraño en las células de la planta o los protoplastos mediante varios métodos. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede transferir mecánicamente mediante micro-inyección directamente en las células de la planta mediante el uso de micro-pipetas. El ácido nucleico extraño también se puede transferir a una célula de planta usando polietilenglicol el cual forma un complejo de precipitación con el material genético que es absorbido por la célula (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2712-22). El ácido nucleico extraño se puede introducir en una célula de planta mediante electro-incorporación (Fromm y colaboradores, (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5824) . En esta técnica, los protoplastos de la planta se electro-incorporan en presencia de plásmidos o ácidos nucleicos que contienen la construcción genética relevante. Los impulsos eléctricos de fuerza de campo alta permeabilizan reversiblemente las bio-membranas permitiendo la introducción de los plásmidos . Los protoplastos de la planta electro- incorporada reforman la pared celular, dividen, y forman un callo de planta. La selección de las células de la planta transformada con el gen transformado se puede llevar a cabo usando marcadores fenotípi-cos . El virus del mosaico de coliflor se puede usar como un vector para introducir ácido nucleico extraño en las células de planta (Hohn y colaboradores, (1982) "Molecular Biology of Plant Tumors" , Academic Press, New York, páginas 549-560; Howell, patente US 4,407,956). El genoma del ADN viral CaMV se inserta en un plásmido bacteriano padre creando una molécula de ADN recombinante la cual se puede propagar en la bacteria. El plásmido recombinante se puede modificar adicionalmente mediante la introducción de la secuencia de ADN deseada. La porción viral modificada del plásmido recombinante se separa del plásmido bacteriano padre, y se usa para inocular las células de la planta o las plantas. La penetración balística de alta velocidad por partículas pequeñas se puede usar para introducir ácido nucleico extraño en las células de plantas. El ácido nucleico se dispone dentro de la matriz de pequeñas cuentas o partículas, o en la superficie (Klen y colaboradores, (1987) Nature 327:70-73). Aunque típicamente solamente una sola introducción de un segmento de ácido nucleico nuevo se requiere, este método también proporciona múltiples introducciones.

Se puede introducir un ácido nucleico en una célula de planta mediante la infección de una célula de planta, una ex planta, un meristemo o una semilla con Agrobacterium tumefaciens transformada con el ácido nucleico. Bajo condiciones adecuadas, las células de la planta transformadas se cultivan para formar retoños, raíces, y desarrollarse después como plantas. Los ácidos nucleicos se pueden introducir en las células de las plantas, por ejemplo, mediante el plásmido Ti del Agrojbacteriuj. turaefaciens. El plásmido Ti se transmite a las células de las plantas después de la infección mediante Agrojbacteriun tumefaciens, y se integra establemente en el genoma de la planta (Horsch y colaboradores, (1984) "Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants" , Science 233:496-498; Fraley y colaboradores, (1983) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:4803). Las plantas de las cuales se pueden aislar los protoplastos y cultivar para dar las plantas enteras regeneradas se pueden transformar de manera que las plantas enteras se recuperan que contienen el gen extraño transferido. Algunas convenientes incluyen, por ejemplo, especies del género Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linun, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hewreroca-llis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis , Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura. La regeneración de las plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans y colaboradores, "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176 (MacMillan Publishing Co., New York 1983); M. R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts (1983 ) -Lecture Proceedings, páginas 12-29, (Birkhauser, Basal 1983) ; P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops" , Protoplasts (1983 ) -Lecture Proceedings, páginas 31-41, (Birkhauser, Basel 1983); y H. Binding, "Regeneration of Plants" , Plant Protoplasts, páginas 21-73, (CRC Press, Boca Ratón 1985). La regeneración a partir de protoplastos varía de una especie a otra de plantas, pero en general una suspensión de protoplastos transformados que contiene copias de la secuencia exógena se genera primero. En ciertas especies, la formación del embrión se puede introducir entonces a partir de la suspensión de protoplastos, hasta el estado de maduración y germinación como embriones naturales. El medio de cultivo ventajosamente puede contener varios aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquinina. También puede ser ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies como maíz y alfalfa. Los retoños y las raíces normalmente se desarrollan simultáneamente. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es completamente reproducible y repetible. En cultivos propagados vegetativamente, las plantas transgénicas maduras se pueden propagar tomando cortes o mediante técnicas de cultivo de tejido para producir múltiples plantas idénticas para ensayos, tales como probar las características de producción. La selección de una planta transgénica deseable se hace y nuevas variedades se obtienen mediante esto, y se propagan vegetativamente para venta comercial. En cultivos propagados de semillas, las plantas transgénicas maduras se pueden cruzar con sí mismas para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semillas que contienen el gen para el nivel de actividad del gen extraño recientemente introducido. Estas semillas se pueden cultivar para producir plantas que tienen el fenotipo seleccionado. Las plantas cruzadas con ellas mismas de acuerdo con esta invención se pueden usar para desarrollar nuevos híbridos. En este método una línea de planta auto-cruzada seleccionada se cruza con otra línea de planta auto-cruzada para producir el híbrido. Las partes obtenidas de una planta transgénica, tales como flores, semillas, hojas, ramas, fruto, y similares están cubiertas por la invención, a condición de que estas partes incluyen células que han estado transformadas de esta manera. La progenie y las variantes, y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de esta invención, a condición de que estas partes comprenden las secuencias de ADN introducidas. La progenie y las variantes, y los mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de esta invención. La selección de plantas transgénicas o células de plantas se puede basar en un ensayo visual, tal como observar los cambios de color (v.gr. , una flor blanca, producción de pigmento variable, y patrón de color uniforme en flores o en patrones irregulares) , pero también puede incluir ensayos bioquímicos ya sea de actividad de enzima o de cuantif icación de producto. Las plantas transgénicas o las células de plantas se cultivan en plantas que llevan la parte de la planta de interés y se monitorean las actividades del gen, tales como mediante apariencia visual (para ver genes flavonoides) o ensayos bioquímicos (manchados Northern) ; manchados Western; ensayos de enzima y ensayos de compuesto flavonoide, incluyen espectroscopia, véase, Harborne y colaboradores, (editores) , (1975) The Flavonoids, Vol . 1 y 2, [Acad. Press]) . Las plantas adecuadas se seleccionan y se evalúan adicionalmente . Los métodos para la generación de plantas diseñadas técnicamente por medio de genética se describen adicionalmente en la patente US 5,283,184, la patente US 5,482,852, y la solicitud de patente europea EP 693 554, todas éstas se incorporan en la presente mediante referencia. Las modalidades de la invención se ilustran adicional-mente mediante los siguientes e emplos que no deberán considerarse limitantes. Los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo referencias a la literatura, patentes emitidas, solicitudes de patente publicadas, y solicitudes de patente conjuntas pendientes) citadas en toda esta solicitud se incorporan mediante ésta expresamente mediante referencia. Ejemplo 1: generación y prueba de una fusión anti-cuerpo-carboxipeptidasa B Una proteína de fusión F (a ') 2 -enzima fue sub-clonada en un vector de expresión de ß-caseína de cabra BC350. Para cada una de las tres construcciones: 213 (MF2iq3-l3, gen de Fd-enzima de fusión), LC (LC3, cadena ligera), y 141 (MF141-4, pro-dominio con leucina C-terminal) , se separaron cartuchos de expresión de las secuencias de plásmido bacteriano. Los tres transgenes fueron entonces co-micro-inyectados en cigotos de ratón. Se analizaron siete líneas de ratón transgénico que llevan todas tres sub-unidades del anti -cuerpo de la proteína de fusión F (ab ') 2 -enzima y tres líneas que solo llevan transgenes LC y 213. Muestras de leche fueron recolectadas de la hembra fundadora y las hembras de primera generación, y fueron probadas por ELISA y ensayes de actividad enzimática. Cuatro de las siete líneas que llevan tres transgenes expresan la proteína de fusión F(ab')2-enzima en niveles superiores a 1 mg/ml (posiblemente hasta 4-6 mg/ml) , mientras que las tres líneas que llevan solamente los transgenes LC y 213 se expresan a niveles inferiores a 0.1 mg/ml.

Los ratones transgénicos que expresan una proteína de fusión fragmento de anti-cuerpo humanizado-enzima (F (ab 1 ) 2 -CPB) comprendiendo un antígeno anti-carcino-embriónico humanizado (CEA) F(ab')2, 806.077, fusionado a una enzima carboxipeptidasa B humana, modificada, fueron generados . Estos ratones transgénicos fueron generados por co-micro-inyección de tres construcciones de expresión de glándula mamaria de ß-caseína de cabra. Una construcción, 141 (MF141-4, pro-dominio con leucina C-terminal) , expresó el pro-dominio de CPB, las otras dos construcciones, LC y 213 (cadena ligera y gen de fusión Fd-enzima, respectivamente) , expresaron la fusión anti-cuerpo-CPB . La expresión del prodominio CPB in trans fue mostrada en experimentos conducidos previamente por ser necesarios para el plegado apropiado de las proteínas de fusión con base en CPB maduro. Materiales y Métodos Se obtuvieron enzimas de restricción de New England Biolabs, de Beverly, Massachusetts, Estados Unidos. Se obtuvieron membranas de nilón (membranas de transferencia de nilón MagnaGraph) de Micron Separations Inc. (MSI, de Westboro, Massachusetts, Estados Unidos) . Se obtuvo alfa32P--dATP de NEN Life Science Products, Inc., de Boston, Massachusetts, Estados Unidos. El secuenciamiento fue llevado a cabo por Sequegen Company, de Worcester, Massachusetts, Estados Unidos . Plásmidos, 213 que contiene el gen de fusión MF21q3-13 Fd-enzima, LC conteniendo la región de codificación de cadena ligera 806.077, y 141, de Zeneca Pharmaceuticals . Se obtuvieron ratones CD1 de Charles River Labs, de Wilmington, Massachusetts, Estados Unidos. Preparación de fragmentos de invección ADN de plásmido fue obtenido del Dr. Michael D. Edge (Zeneca Pharmaceuticals) y se separaron cartuchos de expresión (100 ug cada uno) de la columna vertebral del vector por digestión hasta completarse con Salí. Las digestiones fueron entonces sometidas a electroforesis en un gel de agarosa, usando IX TAE (Maniatis y colaboradores, 1982) como agente de ajuste de pH corriente. La región del gel que contiene el fragmento de ADN correspondiente al cartucho de expresión fue visualizada bajo luz UV (onda larga) . La banda conteniendo el ADN de interés fue cortada, transferida a una bolsa de diálisis, y el ADN es aislado por electro-levigación en IX TAE. Este procedimiento fue aplicado para cada cartucho de expresión. Después de la electro-levigación, se concentraron los fragmentos de ADN y se limpiaron usando el "sistema de limpieza de ADN Wizard" (Promega, catálogo #A7280) , siguiendo el protocolo provisto y levigando en 125 mi de agente de ajuste de pH de micro-inyección (10 mM Tris, pH 7.5, EDTA 0.2 mM) . La concentración de fragmentos fue evaluada por electroforesis comparativa en gel de agarosa. Las concentraciones deducidas de materiales de fragmentos de micro- inyección fueron las siguientes: LC, 15 ng/ml; 141, 180 ng/ml y 213, 270 ng/ml . Los materiales fueron co-diluidos en agente de ajuste de pH de micro-inyección justo antes de inyecciones pro-nucleares, de modo que la concentración final de cada fragmento fuese de 0.5 ng/ml. Micro-invección Ratones hembra CD1 fueron super-ovulados y fertilizados. Se retiraron óvulos del oviducto. Los pro-núcleos machos fueron entonces micro-inyectados con ADN diluido en agente de ajuste del pH de micro- inyección . Los embriones micro- inyectados fueron ya sea cultivados durante la noche en medio CZB o transferidos de manera inmediata al oviducto de ratones hembra CD1 receptores, pseudo-preñados . Embriones de 20 a 32 células o 40 a 51 células fueron transferidos a cada receptor hembra y dejados proseguir hasta término. Identificación de animales fundadores ADN genómico fue aislado de tejido de cola por precipitación con isopropanol y analizados por reacción de cadena de polimerasa (PCR) respecto de la presencia de la secuencia de ADN aislante de ß-globina de pollo. Esta secuencia es parte del vector de ß-caseína de cabra (GBC 350) . Para las reacciones PCR, aproximadamente 250 ng de ADN genómico son diluidos en 50 µ? de agente de ajuste de pH de PCR (20 m Tris, pH 8.3, 50 mM KC1, y 1.5 mM MgCl2, 100 µ? desoxinucleótido trifosfatos, y cada cebador a una concentración de 600 nM) con 2.5 unidades de Taq polimerasa y procesados usando el siguiente programa de temperaturas: 1 ciclo 94°C 60 seg . 5 ciclos 94°C 30 seg . 58°C 45 seg . 74°C 45 seg . 30 ciclos 94°C 30 seg . 55°C 30 seg . 74°C 30 seg . Con untos cebadores : GBC 332 y GBC 386, el amplicón es de 206 pares GBC 332: TGTGCTCCTCTCCATGCTGG (SEQ ID NO:_) GBC 386: TGGTCTGGGGTGACACATGT (SEQ ID NO:_) Análisis de manchado Southern de los fundadores transgénicos ADN genómico (24 yg total, 8 ug/carril) de cada ratón fundador, positivo a PCR aislante, fue digerido hasta completarse con la enzima de restricción EcoRI . Los ADN's digeridos fueron sometidos a electroforesis en triplicado y transferidos a membranas de nilón de acuerdo con métodos estándar (Maniatis y colaboradores, 1982). Se aislaron sondas específicas para cada cartucho de expresión de los plásmidos VK (LC10 en pSP72, sonda de 72 pares de bases), ProL (pMF141-4 en pSP72, sonda de 345 pares de bases), y fd-CPB (pMF213-20 en pSP72 , sonda de 1,861 pares de bases) (provistos por el Dr. Michael D. Edge, de Zeneca Pharmaceuticals) por corte con Salí, Xhol y Xhol , respectivamente. Cada sonda fue marbetada usando reactivos del kit Prime-It"II (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e hibridada a un conjunto de filtros de nilón en formamida al 50% a 42 °C siguiendo protocolos estándar (Maniatis y colaboradores, 1982) . Los lavados fueron llevados a cabo a 60, con 0.2X SSC, 0.1% SOS. Extracción de leche de ratones Se permitió que ratones hembra parieran a sus crías de manera natural, y se retiró la leche generalmente los días 7 y 9 post -parto. Los ratones fueron separados de sus cajas por aproximadamente una hora antes del procedimiento de extracción de leche. Después del período de retención de una hora, los ratones fueron inducidos a lactancia usando una inyección intra-perito-neal de 5 i. U. oxitocina en solución salina estéril, con agente de ajuste de pH de fosfato, usando una aguja calibre 25. Las inyecciones de hormona fueron seguidas por un período de espera de 1 a 5 minutos para que surtiera efecto la oxitocina. Un sistema de succión y recolección consistente en un tubo cónico de 15 mi, sellado con un tapón de hule, con dos agujas calibre 18 insertadas en el mismo, el extremo de punta de una aguja siendo insertado en la tubería de hule conectada a una bomba para senos humanos, fue usado para extracción de leche. Los ratones fueron colocados en la parte superior de una jaula, sostenidos únicamente por su cola, y no fueron restringidos ni confinados de otra manera. El extremo de punta de la otra aguja fue colocado sobre las tetas de los ratones (una a la vez) con el fin de recolectar la leche en tubos Eppendorf individuales colocados en el tubo cónico de 15 mi. Los tubos Eppendorf fueron cambiados después de cada recolección de muestras. La extracción de leche fue continuada hasta que al menos 150 µ? de leche habían sido obtenidos. Después de la recolección, los ratones fueron devueltos a sus cajas. Micro-invección de embriones de ratón Los fragmentos fueron co- inyectados en 1,708 embriones de ratón, de los cuales 945 fueron transferidos a 31 hembras receptoras. De estas hembras, 27 llevaron sus crías hasta término y dieron nacimiento a 172 crías, 20 de las cuales parecieron ser transgénicas después de análisis PCR. De los embriones inyectados, 1.2% parecieron ser transgénicos ; de las crías paridas, 11.6% parecieron ser transgénicas. Análisis de manchado Southern de líneas de ratones fundadores Los 20 fundadores transgénicos identificados con PCR aislante fueron analizados adicionalmente por hibridación de manchado Southern para determinar: A - cuáles eran positivos para los tres (35, 63, 73, 81, 86, 92, 120, 169) fueron mosaicos débiles. Estos fueron claramente positivos usando el ensaye PCR sumamente sensible, pero no pudo detectarse una señal positiva equívoca usando hibridaciones Southern. Seis otros fundadores (5, 76, 121, 128, 131 y 161) fueron claramente positivos para al menos uno de los transgenes, pero claramente negativos o mosaico para al menos uno de los demás transgenes. Finalmente, seis fundadores (25, 67, 89, 106, 161, 166) mostraron señales de hibridación indicando al menos una copia de cada transgén. Tabla 1: compendio de datos de hibridación Southern de fundadores transgénicos de la proteína de fusión ß-caseína-F (ab ') 2 -enzima . El número de copias fue evaluado burdamente por comparación con la señal obtenida con la cantidad conocida del fragmento de micro-inyección digerido con EcoRI (n.d. es no detectable por análisis Southern) .

Fundador # de copias # de copias # de copias estimado del estimado del estimado del transgén LC transgén 141 transgén 213 2 n.d. 2-3 25 4 4 2 35 n.d. n.d. n.d. 63 n.d. n.d. n.d. 67 2-3 2-3 3 73 n.d. n.d. <1 76 n.d. 1-2 1 81 n.d. n.d. n.d. 86 n.d. n.d. n.d. 89 >10 >10 >10 92 n.d. n.d. <1 106 3 2-3 1 120 n.d. n.d. n.d. 121 <1 1 1 128 <1 n.d. <1 131 <1 n.d. <1 152 2-3 2-3 2-3 161 n.d. 1 <1 166 2-3 3 3-5 169 n.d. n.d. n.d.

Reproducción de líneas de ratón Después de análisis de manchado Southern de los fundadores, se seleccionaron para reproducción 10 líneas: 5, 25, 67, 76, 89, 106, 121, 128, 152, y 166. La Tabla 2 resume la reproducción de cada línea; la Tabla 3 resume el análisis de manchado Southern de la progenie Fl positiva a PCR. A partir de este análisis, todos los fundadores, salvo por el #121, pasaron su(s) integración (es) transgénica (s) a la siguiente generación. Otras líneas (5, 25, 76, 128, ver Tabla 2) también mostraron signos de mosaicismo de la línea germinal, con un bajo porcentaje de progenie positiva al transgén. El análisis Southern también sugirió que algunos de los fundadores pueden tener múltiples integraciones para algunos de los transgenes. Por ejemplo, 200 y 201, que son la progenie del fundador 166, parecer tener un diferente número de copias para los transgenes LC y 141, y el mismo número de copias para el transgén 213. Una explicación puede ser que el fundador 166 tiene al menos dos sitios de integración en diferentes cromosomas, uno conteniendo solamente transgenes LC y 141 y el otro conteniendo los tres transgenes. El #200 habría heredado ambos sitios de integración, mientras que el #201 puede haber heredado solamente el sitio con todos los transgenes (son también posibles otros escenarios) . Las integraciones múltiples son difíciles de identificar por análisis de manchado Southern, especialmente cuando están implicados tres diferentes transgenes. Sin embargo, en animales grandes, el uso de FISH (hibridación in situ por fluorescencia) y cario-tipos permiten discernir en situaciones de integraciones múltiples. En resumen, dos fundadores (5, 76) pasaron integraciones de transgenes dobles (LC y 213) a su progenie, y seis líneas (25, 67, 89, 106, 152 y 166) pasaron los tres transgenes a la siguiente generación. Otro fundador, 128, fue doblemente transgénico para LC y 213, tuvo una progenie transgénica (232) . Sin embargo, esta progenie no fue analizada (nació después debido a retrasos en la reproducción 128) . Esa línea no fue analizada adicionalmente, pues el análisis de proteínas de la leche 128 no mostró producción significativa de la proteína de fusión.

Tabla 2: reproducción de fundadores transgénicos . Todas las progenies fueron analizadas con el ensaye de PCR aislante.

Fundador (sexo) Progenie positiva a Número de ID de PCR/caja (solo se hembras transgéni- analizaron hembras) cas Fl selectas (F) 2/10 217, 219 25 (F) 1/7 204 67 (M) 1/3 177 76 (F) 1/6 212 89 (F) 2/5 178, 179 106 (M) 1/5 186 121 (M) 0/5 ninguno 128 (F) 1/8 232 152 (M) 2/4 194, 195 166 (F) 2/6 200, 201 Tabla 3 : compendio de datos de hibridación Southern de la proteína de fusión ß-caseína-F (ab ') 2-enzima transgénica Fl. El número de copias fue evaluado burdamente por comparación con la señal obtenida con la cantidad conocida del fragmento de micro-inyección digerido con EcoRI (n.d. es no detectable por análisis Southern) .

Análisis de muestras de leche de ratón transgénico Se recolectaron muestras de leche de ratón a partir de hembras fundadoras así como a partir de hembras transgénicas Fl . Se decidió no diluir la leche con PBS, para evitar una posible interferencia con los ensayes enzimáticos . Las muestras fueron congeladas a -20°C hasta que se llevaron a cabo las pruebas. Los ensayes son resumidos mas adelante como la Tabla 4.

Tabla 4: compendio de ensayes ELISA y de actividad llevados a cabo en la leche de ratones que expresan una proteína de fusión de fragmento de anti-cuerpo humanizado-enzima (F (ab 1 ) 2-CPB) (n.a. es no aplicable) 'ensayes realizados en leche recolectada en la segunda lactancia de 25 dieron valores superiores de manera consistente Construcciones que enlazan las secuencias reguladoras de ß-caseína de cabra a la región de codificación de las cadenas ligera y pesada de anti-CEA F(ab')2, 806.077, humanizado, fusionado a una enzima carboxipeptidasa B humana, modificada, y a la región de codificación del pro-dominio de CPB (con leucina C- terminal) fueron generadas. Líneas de ratones transgénicos fueron generadas con y sin el transgén que expresa el pro-dominio CPB. Se demostró que ratones transgénicos para las tres construcciones son capaces de producir la fusión (Fab')2-CPB a altos niveles (hasta 4-6 mg/ml) en la leche de ratones transgéni-cos (4/6 líneas transgénicas triples expresadas a niveles superiores a 1 mg/ml) , con la actividad enzimática esperada. Sin embargo, la ausencia de expresión del pro-dominio CPB parece correlacionarse con el bajo nivel de secreción de la proteína de fusión activa. Sin embargo, este resultado debe ser considerado con precaución pues solamente se analizaron tres líneas transgénicas dobles (solamente 2, tanto fundador como Fl) . En suma, variantes de carboxipeptidasa B pancreática, humana (HCPB) , con especificidad para hidrólisis de ácido glutámico C-terminal y ácido aspártico, fueron preparados por mutagénesis dirigida en el sitio del gen humano y expresados en el periplasma de E. coli . Cambiando residuos en el forro de la cavidad SI' de la enzima, fue posible invertir la especificidad del sustrato para dar variantes capaces de hidrolizar antes de los residuos de aminoácidos C-terminales , ácidos, en vez de los residuos C-terminales básicos, normales. Esto fue logrado mutando Asp253 en la base de la cavidad de especificidad SI ' , que normalmente interactúa con la cadena lateral básica del sustrato, con ya sea Lys o Arg. Las enzimas resultantes tuvieron la polaridad invertida deseada y la actividad enzimática fue mejorada de manera significativa con mutaciones adicionales en el residuo 251. El mutante doble [G251T, D253K] HCPB fue 100 veces mas activo contra ácido L-glutámico hipurílico (hipp-Glu) como sustrato que el imitante sencillo. [D253K]JCPB, mutantes triples, conteniendo cambios adicionales en Ala248, tuvieron actividad mejorada contra el sustrato hipp-Glu cuando la posición 251 era Asn. Estos mutantes de polaridad invertida de una enzima humana tienen el potencial de ser usados en terapia de cáncer con profármaco de enzima dirigida por anti-cuerpo. Ejemplo 2: generación y pruebas de construcciones de fusión de anti-cuerpo receptor anti-transferrina/angiogenina Este ejemplo muestra la expresión de proteínas de fusión del anti-cuerpo receptor anti-transferrina/angiogenina en la glándula mamaria de ratones transgénicos . Un anti-cuerpo quimérico de ratón/humano, dirigido contra el receptor de transferrina humano (E6) fue fusionado en su dominio CH2 al gen para una ribonucleasa angiogenica humana, angiogenina (Ang) . Se expresó en la glándula mamaria de ratones y se secretó en la leche de ratones. Los niveles de expresión en la leche fueron aproximadamente de 0.8 g/1. La proteína quimérica conservó la actividad de ligadura de anti-cuerpo y la actividad inhibitoria de síntesis de proteínas, equivalente a la Ang libre. Fue específicamente citotóxica a células tumorales humanas in vi tro. Materiales y métodos Ratones transgénicos Se generaron ratones transgénicos siguiendo procedimientos estándar publicados (Roberts y colaboradores, 1992 ; DiTullio y colaboradores, 1992; Gutiérrez y colaboradores, 1996) .

Los ratones fundadores fueron reproducidos para producir hembras lactantes y la leche fue recolectada y diluida con un volumen igual de solución salina ajustada en pH con fosfato, como se describió previamente. La leche fue almacenada a -70 °C. Fraccionamiento de leche Leche conteniendo el anti-cuerpo E6 IG fue aplicada a una columna de sefarosa A con proteína y levigada con 0.1M glicina, pH 3.0, en tubos conteniendo 1M Tris para ajustar el pH a un valor neutro. Se hizo leche conteniendo la proteína de fusión (CH2Ang) , 0.2M EDTA, y se incubó en hielo por 20 minutos antes de centrifugación por 10 minutos a 4°C en una centrífuga. La leche descremada fue removida cuidadosamente de la capa de grasa y centrifugada de nuevo antes de purificación por cromatografía de líquidos de alto desempeño, con exclusión de tamaño, en una columna TSK 3000 (Toso Haas Corp., Pennsylvania, Estados Unidos), equilibrada y levigada con 0.1 agente de ajuste de pH de fosfato, pH 7.4. La tasa de flujo fue de 0.5 ml/min y se recolectaron fracciones de 1 minuto. La mayor parte del material que reacciona con un anti-cuerpo contra angiogenina fue levigado en el volumen hueco de la columna. Este material fue recabado y se añadió polvo de arginina a una concentración final de 1M. Después de incubación durante la noche a 4°C, la muestra fue re-sometida a cromatografía en la columna TSK 3000, como se describió antes. La leche conteniendo CH2Ang requirió de un segundo tratamiento con 1M arginina y fue re-sometida a cromato-grafía en la columna de dimensionamiento . Determinación de proteínas Se determinaron las proteínas usando los siguientes coeficientes de extinción: anti-cuerpo E6 IgG, El%/280nm = 14.0; CH2Ang, El%/280nm = 10.0. Ensaye de síntesis de proteínas Se dispusieron células en placas a razón de 2,500 células por cavidad en placas de micro-título de 96 cavidades en medio esencial mínimo de Dulbecco, complementado con 10% de suero fetal de bovino. Las adiciones se hicieron en un volumen total de 10 µ?, y las placas fueron incubadas a 37°C por 3 días antes de que se añadieran 0.1 mCi de [14C] leucina por 2-4 horas. Las células fueron cosechadas sobre filtros de fibra de vidrio usando un cosechador de células PHD, lavadas con agua, secadas con etanol, y contadas. Los resultados son expresados como un porcentaje de la incorporación de [14C] leucina en cavidades tratadas falsamente. Ejemplo 3: expresión del anti-cuerpo receptor de transferrina anti-humano y la proteína de fusión anti-cuerpo-angiogenina en la leche de ratones transgénicos Las construcciones de ADN usadas para producir los ratones transgénicos son ilustradas en las figuras 1 y 2A. El anti-cuerpo quimérico del receptor de transferrina usado en los estudios descritos fue originalmente fusionado al factor de necrosis tumoral humano (Hoogenboom y colaboradores, 1991) y luego a ribonucleasa humana, angiogenina (Ang, Rybak y colaboradores, 1992) . El gen Ang fue fusionado detrás de los tres primeros residuos de aminoácidos de la región 5 ' del dominio CH2 del anti-cuerpo, así dejando la región de articulación sin afectar y haciendo posible la dimerizacion de la cadena pesada. La meta fue la de crear proteínas similares a inmunotoxin , humanizadas, que pudieran estimular efectos secundarios menos inmunogénicos cuando se administran a pacientes. Los sistemas de expresión de células de mamífero in vivo rindieron muy pocos estudios funcionales de material, especialmente cuando el anticuerpo fue fusionado a la ARNasa humana, angiogenina (Ang) . Ang es un miembro de la super- familia de la ARNasa A. Todos los miembros de esta super- familia son pequeñas (12-14 kDa) enzimas ribonucleóticas básicas encontradas en el páncreas así como en otros órganos, fluidos y tejidos de mamíferos y anfibios. Aunque estas ARNasa' s pueden cortar acciones fisiológicas del ARN, v.gr. , estimulando angiogénesis , se han descrito para varios miembros de las ARNasa 1 s acciones de defensa de hospedero y efectos anti-virales . Debido a que las ARNasa' s pueden ser parte de un sistema de defensa natural, se han usado para crear conjugados químicos y proteínas de fusión recombinantes con una variedad de anti -cuerpos . Como esos estudios indican que las terapias a base de ARNasa ' s pueden tener el potencial para el tratamiento de cáncer y SIDA, el trabajo original de ARNasa ' s con el anti-cuerpo quimérico contra el receptor de transferrina humano fue re-explorado, usando tecnología recién desarrollada para la producción de proteínas complejas en la leche de animales transgénicos . Los detalles moleculares de las construcciones genéticas usadas en estos estudios son mostrados anteriormente. Los números romanos corresponden a los mostrados en el panel A de la figura 2 y se expanden en los ADN's clonados entre los exones 2 y 7 del gen de ß-caseína de cabra. ADN que codifica toda la cadena pesada del anti-cuerpo E6, un anti-cuerpo quimérico contra el receptor de transferrina humano (Hoogenboom y colaboradores, 1990), fue usado entre los exones 2 y 7 de un gen de ß-caseína de cabra modificado (figura 2A, I) , que se expresa a altos niveles en la leche de ratones transgénicos lactantes (Roberts y colaboradores, 1992) . Un segundo transgén que codifica una fusión anti-cuerpo-enzima fue preparado enlazando el gen de la ARNasa humana, angiogenina (Ang) con el dominio CH2 del anti-cuerpo (figuras 1 y 2A, II) . Esos genes, así como el gen que codifica la cadena ligera del mismo anti-cuerpo (figura 2A, III) , fueron todos clonados por separado, y los pares apropiados (cadenas pesada (H) y ligera (L) ; CH2Ang y cadena L) fueron purificados, libres de ADN procariótico, y coinyectados en embriones de ratón que fueron re-implantados usando métodos estándar (Roberts y colaboradores, 1992) . Los ratones transgénicos fueron identificados por PCR y análisis de manchado Southern de ADN obtenido de las colas de la progenie resultante. Los ratones fundadores fueron reproducidos para producir hembras transgénicas lactantes. La leche fue recolectada, diluida con PBS y analizada en cuanto a la presencia de las cadenas de anti-cuerpo y Ang . Los anti -cuerpos policlonales alzados contra Ang humana solamente reaccionaron con una banda de M esperada (43 kDa; cadena pesada de anti -cuerpo, 29 kDa; Ang, 14 kDa) en la proteína de fusión (figura 2B, panel izquierdo) . Sin embargo, el anti-suero anti- IgG reaccionó intensamente tanto con las cadenas H como L del anti-cuerpo quimérico E6 (figura 2B, panel derecho) . Aunque la cadena L de la proteína de fusión de anti-cuerpo fue observada claramente con el anti-suero anti- IgG, la cadena H trunca de CH2Ang fue apenas detectable, sugiriendo que la fusión de angiogenina al dominio CH2 impidió la ligadura del anti-suero a la cadena H. El anti-cuerpo quimérico IgG fue purificado por cromatografía en sefarosa A de proteínas. Como se muestra en la figura 2C, carriles 1 y 2, el análisis Western del producto purificado final por electroforesis en gel, bajo condiciones reductoras, mostró la presencia de proteínas de cadena ligera (28 kDa) y pesada (aproximadamente 55 kDa) . El análisis Western bajo condiciones no reductoras (figuras 2C, carril 3) , demostró que el anti-cuerpo transgénico existió como una mezcla de las formas IgG y Fab (168 y 84 kDa, respec ivamente) . También se observó una pequeña cantidad de cadena pesada libre (55 kDa) . Leche conteniendo la proteína de fusión CH2Ang fue similarmente recolectada y diluida con PBS. La proteína sefarosa A no pudo ligarse a la proteína de fusión de angiogenina. Se obtuvieron resultados análogos cuando el mismo fragmento de anticuerpo CH2 previamente fue fusionado a TNF y se postuló que esto se debía a la eliminación del sitio de ligadura para la proteína A que se cree está cerca de la unión CH2-CH3 (Hoogenboom y colaboradores, 1991) . La naturaleza de la proteína de fusión anti -cuerpo transgénico-Ang fue determinada por manchado Western. Después de la reducción de los enlaces bisulfuro inter-cadenas , la fusión cadena H Ang (43 kDa) y cadena ligera (28 kDa) fue disociada (figura 2C, carril 2) . El análisis Western con un anti-cuerpo anti-IgG bajo condiciones no reductoras (figura 2C, carril 5) demostró que la proteína de fusión anti-cuerpo transgénico-enzima existió como una mezcla de las formas F(ab)2 y Fab (142 y 71 kDa, respectivamente) . Se obtuvieron resultados idénticos cuando el análisis fue llevado a cabo con anti-suero anti-Ang (no mostrado) . Tomados de manera conjunta, estos últimos resultados demuestran que la cadena ligera está asociada con la fusión cadena pesada-Ang. Ejemplo 4: caracterización biológica de la proteína de fusión anti -cuerpo-angiogenina La angiogenina es un potente inhibidor de la capacidad de traducción del lisado de reticulocito de conejo por un mecanismo que depende de su actividad ribonucleótica (St. Clair y colaboradores, 1987) . La figura 2 muestra que la adición de Ang o CH2Ang al lisado ocasionó la inhibición de la síntesis de proteínas, como se mide por la incorporación de [35S] metionina en la proteína precipitable en ácido. Los valores de IC503 (40 nM) de Ang sin fusionar o CH2Ang fueron indistinguibles en el ensaye, indicando que la conformación de los residuos de sitio activo no fueron afectados por la fusión de Ang en esta orientación (término NH2) al dominio del anti-cuerpo CH2. La porción de anti-cuerpo de la proteína de fusión fue caracterizada por experimentos de ligadura por competencia (Tabla 5) . La ligadura de anti-cuerpo E6 (IgG) derivado de leche al receptor de transferrina humano fue probada y comparada con la del mismo anti-cuerpo, originalmente purificado a partir de células de hibridoma (Heyligen y colaboradores, 1985) . La capacidad de ambos anti -cuerpos a desplazar el anti-cuerpo parental etiquetado con [125I] fue idéntica (50% de desplazamiento de cualquier anti-cuerpo fue de 0.8 nM) . La proteína de fusión CH2Ang fue 175 veces menos activa que el anti-cuerpo E6 intacto (140 nM CH2Ang versus 0.8 nM E6) . Los efectos citotóxicos de la proteína de fusión Ang sobre células tumorales humanas fueron determinados midiendo la incorporación de [14C] leucina en proteínas recién sintetizadas. Las curvas de respuesta a dosis típica son bosquejadas en la figura 3. CH2Ang inhibió la síntesis de proteínas de células de glioma humano SFS39 y células de cáncer de pecho MDA-MB 231mdrl con IC50S de 15 y 45 nM, respectivamente. La citotoxicidad sobre otras líneas de células tumorales humanas es comparada en la Tabla II. El valor de IC50S varió de 15 a 70 nM. La citotoxici-dad fue específica a la proteína de fusión pues no se observó actividad en una línea celular negativa a antígeno (células de ratón NIH3T3, datos no mostrados) y un exceso molar de cinco veces de anti-cuerpo quimérico sin fusionar invirtió la citotoxi-cidad en aproximadamente 50%. Aunque CH2Ang inhibió la síntesis de proteínas a 99% de células tratadas falsamente, la síntesis de proteínas fue reducida a 45% de las células tratadas falsamente en presencia de un exceso molar de cinco veces del anti-cuerpo. Como ni el anti-cuerpo sin fusionar (Rybak y colaboradores, 1992) ni Ang libre (Newton y colaboradores, 1996) son citotóxicos, los dos dominios en las proteínas de fusión deben estar unidos de manera covalente para estimular citotoxicidad. La angiogenina fue aislada de medio acondicionado con células tumorales siguiendo la actividad angiogénica en la membrana corioalantoica de embriones de pollo y ensayes de córnea de conejo (Fett y colaboradores, 1985) . Su homología a la ribonucleasa y la actividad nucleolítica distintiva (Shapiro y colaboradores, 1986) , junto con su actividad angiogénica, rinden propiedades biológicas únicas que pueden promover la muerte acrecentada de células tumorales cuando Ang es puesta en objetivo a células tumorales con agentes de objetivo específico a células. La actividad angiogénica es mantenida cuando se expresa Ang como una proteína de fusión (Newton y colaboradores, 1996) . La angiogenina también se liga a una superficie celular sobre células de carcinoma de colon humano (Soncin y colaboradores, 1994) . En consecuencia, la localización en sitios tumorales por el anti-cuerpo puede ser incrementada por las propiedades de ligadura de células tumorales de Ang mientras que la angiogénesis incrementada puede ayudar de manera concebible a la penetración de tumores incrementando la vascularización de tumores (Newton y colaboradores, 1996). Mas aún, los antagonistas de Ang impiden el crecimiento tumoral (Piccoli y colaboradores, 1998; Olson y colaboradores, 1995) . De esta manera, las actividades de Ang son pleyotróficas ; su manifestación es gobernada por el lugar celular al cual se expone Ang, v.gr., poner en objetivo la maquina de la síntesis de proteínas citosólicas ocasiona citotoxicidad (St. Clair y colaboradores, 1987; Rybak y colaboradores, 1991), mientras que se ha reportado que endocitosis y translocación de Ang al núcleo en células endoteliales estimulan la angiogénesis (Moroianu y Riordan, 1994) . Estas propiedades biológicas de Ang aportan oportunidades únicas para diseñar estrategias terapéuticas tanto citoesetáticas (anti-angiogénicas) como citotóxicas (células anti-tumorales) antagonizando o poniendo en objetivo específicamente esta proteína, respectivamente. La realización de terapias objetivadas en multi-dominios, basadas en enzimas humanas, para cáncer (Rybak y colaboradores, 1991; Rybak y colaboradores, 1992; Newton y colaboradores, 1994; Newton y colaboradores, 1996; Jinno y colaboradores, 1996; Zewe y colaboradores, 1997; Deonarain y Epenetos, 1998) y enfermedades cardio-vasculares (Haber, 1994; Collen, 1997) , dependen de desarrollar sistemas de expresión capaces de producir estos reactivos para caracterización pre-clínica y uso clínico eventual. La expresión de una proteína de fusión anti-cuerpo-Ang de dos cadenas en la leche de ratones transgénicos fue lograda y presentada en este estudio. No fue obvio que Ang pudiera expresarse de manera exitosa como una proteína de fusión en ratones transgénicos debido a que una proteína de fusión similar fue expresada solamente en niveles sumamente bajos a partir de células cultivadas de mieloma, presumiblemente debido a transporte retrógrado durante la secreción que lleva a la selección de productores bajos (Rybak y colaboradores, 1992) . De manera notoria, en el ambiente natural de la glándula mamaria, la eficiencia de la expresión fue incrementada 160,000 veces sobre el sistema de cultivo de células (0.8 g/1 vs . 5 ug/l en leche y células de mieloma, respectivamente) . De esta manera, fue posible purificar cantidades suficientes de la proteína de fusión Ang para caracterización biológica. Una de las consecuencias de estas labores es que la importancia de la orientación de Ang en una proteína de fusión es demostrada por vez primera. En proteínas de fusión anti-cuerpo-Ang de una sola cadena, se fusionó Ang en el término C al término N del anti-cuerpo (Newton y colaboradores, 1996) . Posteriormente, se supo que los tres últimos residuos de aminoácidos de la región C terminal de Ang contribuyen a un sub-sitio activo en el centro (Russo y colaboradores, 1996) . Aunque Ang en la proteína de fusión CH2 y Ang libre fueron equipotentes en el ensayo de lisado de reticulocitos de conejo, Ang en una proteína de fusión de una sola cadena fue dos veces menos efectiva que Ang libre para inhibir la síntesis de proteínas en el ensayo de lisados (Newton y colaboradores, 1996) . Esta es la primera demostración, en general, que las proteínas de fusión anti -cuerpo-enzima pueden ser expresadas a altos niveles en la glándula mamaria. En particular, la demostración que las fusiones anti-cuerpo-Ang pueden expresarse en la glándula mamaria tiene implicaciones para el desarrollo de modelos de ratones transgénicos para cáncer de pecho. Los promotores de otros genes específicos de la leche han sido usados para ocasionar la expresión de transgenes durante la lactancia, imitando la aparición de neoplasias (Amundadottier y colaboradores, 1996) . Como los resultados del presente estudio muestran que un promotor específico de la leche puede inducir la expresión de una inmunotoxina activa, cepas transgénicas dobles pueden ser desarrolladas para probar si la expresión de la proteína de fusión Ang objetivada contra la neoplasia artificial puede impedir o alterar el avance de la enfermedad. Estos resultados son especialmente relevantes a Ang, pues están disponibles contrapartes de murino (Bond y colaboradores, 1993) . En suma, estos resultados demuestran por vez primera que proteínas de fusión heterólogas complejas pueden ser expresadas en la glándula mamaria de ratones en grandes cantidades y con propiedades biológicas superiores que el cultivo de células de mamífero (Rybak y colaboradores, 1992) y sistemas de expresión de E. coli (Newton y colaboradores, 1996) . Los resultados impactan tanto la posibilidad de producir estas proteínas de fusión como agentes terapéuticos así como la posibilidad de crear nuevos modelos animales para cáncer de pecho . Se usan en la presente las siguientes abreviaturas: Ang, angiogenina humana; E6 , anti -cuerpo monoclonal IgG an i-receptor de transíerrina ; ARNasa, ribonucleasa A; cadena H, cadena pesada; cadena L, cadena ligera; CH2Ang, angiogenina fusionada al dominio CH2 de la cadena pesada de E6; IC50, la concentración de la proteína de fusión que inhibe la síntesis de proteínas en 50%. Tabla 5: ligadura de proteínas de fusión de E6 y Ang a receptor de transferrina humano Construcción Fuente IC50(nM) de Diferencia ligadura gruesa E6 hibridoma 0.8 1 E6 leche 0.8 1 CH2Ang leche 140 175 Tabla II: citotoxicidad de CH2Ang Ejemplo 7: generación y caracterización de cabras transgénicas Las secciones señaladas más adelante brevemente describen los pasos más importantes en la producción de cabras transgénicas . Especies y razas de cabras Cabras de origen suizo, v.gr., las razas Alpina, Saanen, y Toggenburg, se prefieren en la producción de cabras transgénicas . Super-ovulación de cabras La duración del estro de las donadoras se sincroniza en el día 0 mediante implantes en la oreja sub-cutáneos de 6 mg de norgestomet (Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, Kansas, Estados Unidos) . Se administra prcstaglandina después de los primeros siete a nueve días para terminar la síntesis endógena de progesterona . Comenzando el Día 13 después de la inserción del implante, se da intramuscularmente un total de 18 miligramos de hormona estimulante de folículo (FSH - Schering Corp., Kenilworth, New Jersey, Estados Unidos) durante tres días en inyección dos veces al día. El implante se remueve el día 14. Veinticuatro horas después de la remoción del implante los animales donadores se aparean varias veces con machos fértiles durante un periodo de dos días (Selgrath, y colaboradores, Theriogenology, 1990, páginas 1195-1205) . Recolección de embriones La cirugía para la recolección de embriones se presenta el segundo día después del apareamiento (o 72 horas después de la remoción del implante) . Las hembras super-ovuladas se separan del alimento y del agua 36 horas antes de la cirugía. A las hembras se les administra 0.8 miligramos/kilogramo de Diazepam (Valium®) intravenoso, seguido inmediatamente por 5.0 miligramos/kilogramo de cetamina (Keteset) , intravenosa. Se administra Halothane (2.5 por ciento) durante la cirugía en 2 litros/minuto de oxígeno vía un tubo endotraqueal . El aparato reproductor se exterioriza a través de una incisión del aparato de línea media. El cuerpo lúteo, los folículos sin romperse mayores de 6 milímetros de diámetro, y los quistes de ovario se cuentan para evaluar los resultados de la super-ovulación y para predecir el número de embriones que deberán ser recolectados por el lavado de oviducto. Se coloca una cánula en el ostio del oviducto y se mantiene en su lugar con una ligadura temporal de simple de 3.0 Proleno. Se coloca una aguja de 20 gauge en el útero aproximadamente 0.5 centímetros desde la unión útero-tubal. Luego de 10 a 20 mililitros de solución salina regulada de fosfato estéril (PBS) se hace circular a través del oviducto canalizado y se recolecta en una caja de Petri. Este procedimiento se repite del lado opuesto y luego se reemplaza el aparato reproductor en el abdomen. Antes de cerrar, se vierte una solución de glicerol con salina estéril de 10-20 mililitros en la cavidad abdominal para evitar adhesiones. Se cierre la línea alba con suturas interrumpidas simples de 2.0 Polidioxanona o Supramid y la piel se cierra con grapas estériles para heridas . Los óvulos de cabra fertilizados se recolectan del lavado del oviducto con solución regulada de fosfato sobre un estéreo-microscopio, y luego se lavan en medio F12 Ham (Sigma, St . Louis, Missouri, Estados Unidos) que contiene 10 por ciento de suero bovino fetal (FBS) comprado en Sigma. En casos donde los pronúcleos son visibles, los embriones inmediatamente se micro-inyectan. Si los pronúcleos no son visibles, los embriones se pueden colocar en medio F12 de Ham que contiene 10 por ciento de suero bovino fetal durante un cultivo a corto plazo a 37°C en una cámara de gas humedecida que contiene 5 por ciento de C02 en aire hasta que los pronúcleos se vuelvan visibles (Selgrath, y colaboradores, Theriogenology, 1990, páginas 1195-1205). Procedimiento de micro- invección Embriones de cabra de una célula se colocan en un micro-gotero de medio bajo aceite sobre un portaobjetos con depresión de vidrio. Los óvulos fertilizados que tienen dos pronúcleos visibles se inmovilizan en una micro-pipeta de sujeción pulida a flama en un microscopio vertical Zeiss con un escalón fijo usando óptica Normarski . Se micro-inyecta un pronúcleo con la construcción de ADN de interés, por ejemplo, un vector BC355 que contiene el gen de proteína de fusión operablemente enlazado a los elementos reguladores del gen de ß-caseína de cabra, en solución reguladora inyección (Tris-EDTA) usando una micro-aguja de vidrio fina (Selgrath y colaboradores, Theriogeno-logy, 1990, páginas 1195-1205) . Desarrollo del embrión Después de la micro- inyección, los embriones sobrevivientes se colocan en un cultivo de F12 de Ham que contiene 10 por ciento de suero bovino fetal y luego se incuban en una cámara de gas humedecida que contiene 5 por ciento de C02 en aire a 37 °C hasta que los animales receptores están preparados para la transferencia de embriones (Selgrath, y colaboradores, Therioge-nology, 1990, páginas 1195-1205). Preparación de las receptoras La sincronización del estro en los animales receptores se inducen mediante 6 miligramos de implantes en la oreja de norgestomet (Syncromate-B) . El día 13 después de la inserción del implante, se les da a los animales una inyección única no super-ovulatoria (400 unidades internacionales) de gonadotropina de suero de hembras preñadas (PMSG) obtenido en Sigma. Las hembras receptoras se aparean con machos vasectomizados para asegurar la sincronización del estro (Selgrath y colaboradores, Theriogenology, 1990 páginas 1195-1205) . Transferencia de embrión Todos los embriones de una hembra donadora se mantienen juntos y se transfieren a un solo receptor cuando es posible. El procedimiento quirúrgico es idéntico al señalado para la recolección de embriones señalado anteriormente, excepto que el oviducto no se canaliza, y los embriones se transfieren en un volumen mínimo de solución F12 de Ham que contiene 10 por ciento de suero de bovino fetal en el lumen del oviducto vía la fimbria usando una micro-pipeta de vidrio. Los animales que tienen más de seis a ocho puntos de ovulación sobre el ovario se consideran no convenientes como receptores. La cerradura de la incisión y el cuidado post-operatorio son iguales para los animales donantes (véase, v.gr., Selgrath y colaboradores, Theriogenology, 1990, páginas 1195-1205) . Monitoreo del embarazo y el parto El embarazo se determina mediante ultra-sonografía 45 días después del primer día de que se establece el estro. En el Día 110 se lleva a cabo un segundo examen de ultrasonido para confirmar el embarazo y valorar la tensión fetal. En el Día 130 la hembra receptora preñada se vacuna con toxoide tetánico y con Clostridio de C&D. Se le dan intramuscularmente Selenio y vitamina E (Bo-Se) y subcutáneamente se le da Ivermectina. Las hembras se mueven a un establo limpio en el Día 145 y se deja que se aclimaten a este ambiente antes de inducir el trabajo de parto el día 147. El parto se induce en el día 147 con 40 miligramos de PGF2a (Lutalyse®, Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan, Estados Unidos) . Esta inyección se da intramuscularmente en dos dosis, una dosis de 20 mg seguida por una dosis de 20 mg cuatro horas después. La hembra está en observación periódica durante el día y la tarde después de la primera inyección de Lutalyse® en el día 147. Las observaciones aumentan cada 30 minutos comenzando en la mañana del segundo día. El parto se presenta entre 30 y 40 horas después de la primera inyección. Después del alumbramiento se ordeña a la hembra para recolectar el calostro y se confirma el paso de la placenta. Verificación de la naturaleza transgénica de los animales F„ Para seleccionar los animales transgénicos F0, se aisla ADN genómico de dos diferentes líneas celulares para evitar perderse cualquier transgénico de mosaico. Se define un animal mosaico como cualquier cabra que no tiene cuando menos una copia del transgén en cada célula. Por lo tanto, se toman una muestra de tejido de la oreja (mesodermo) y una muestra de sangre de un animal F0 de dos días de edad para el aislamiento del ADN genómico (Lacy y colaboradores, A Laboratory Manual, 1986, Cold Springs Harbor, NY y Hermann and Frischauf , Methods Enzymology, 1987. 152: páginas 180-183). Las muestras de ADN se analizan mediante la reacción de cadena de polimerasa (Gould y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci, 1989. 86: páginas 1934-1938) usando cebadores específicos para el gen de proteína de fusión y mediante análisis de manchado Southern (Thomas, Proc Nati. Acad. Sci., 1980. 77:5201-5205) usando una sonda de ADNc de primer miembro o segundo miembro cebada aleatoria (Feinberg y Vogels-tein, Anal. Bioc. , 1983. 132: páginas 6-13). Se estima la sensibilidad del ensayo como la detección de una copia del transgén en el 10 por ciento de las células somáticas. Generación y selección de ganado de producción Los procedimientos descritos anteriormente se pueden usar para la producción de cabras fundadoras transgénicas (F0) , así como a otras cabras transgénicas. Las cabras fundadoras transgénicas F0, por ejemplo, se crían para producir leche, si son hembras, o para producir crías hembras transgénicas si es un fundador macho. Este macho fundador transgénico, se puede cruzar con hembras no transgénicas, para producir hijas hembras transgénicas . Transmisión de transgén y características pertinentes La transmisión del transgén de interés, en la línea de la cabra se analiza en el tejido de la oreja y en la sangre mediante reacción de cadena de polimerasa y análisis de manchado Southern. Por ejemplo, el análisis de manchado Southern del macho fundador y de tres hijos transgénicos no muestra reacomodo ni cambio en el número de copias entre generaciones. Los manchados Southern se sondean con una sonda de ADNc de proteína de fusión de inmunoglobulina-enzima . Los manchados se analizan en un Betascope 603 y se determina el número de copias por comparación del transgén contra el gen endógeno de la ß-caseína de cabra. Evaluación de los niveles de expresión El nivel de expresión de la proteína transgenica, en la leche de los animales transgénicos , se determina usando ensayos enzimáticos o manchados Western.

Lista adicional de referencias Maniatis, T. , Fritsch, E. F. y Sambrook, J. 1983. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. Amudadottir, L. T. Merlino., y Dickson, R.B. (1996) Transgenic mouse models of breast cáncer, Breast Can. Res. and Treatment 39, 119. Bond, M.D., Stydom, D.J. y Vallee, B.L. (1993) Characterization and sequencing of rabbit pig and raouse angiogenins; discemment of functionally important residues and regions . Biochems Biophys, Acta 1162, 177. Bosslet, K. , Czech J. , Lorenz P., Sedlacek, H. H. , Schuermann, M., y Seemann. G. (1992) Molecular and functional characterization of a fusión protein suited for timer specific produg activation. Br.J. Cáncer 65, 234. Castilla, J. Pintado, B. Sola, I., Sanchez-Morgado , J.M. y Enjuanes, L. (1998) Engineering passive immunity in transgenic mice secreting virus-neutralization antibodies in milk. Nature Biotechnology 16, 349. Clark A. (1997) Gene expression in the mammary glands of transgenic animáis. Biochem. Soc . Symp. 63, 133. Collen, D. (1997) Thrombolytic Therapy. Thrombosis and Haemostasis 78,742. Colman, A. (1996) Production of proteins in the milk of transgenic livestocks; problems, solutions and success. Am. J. clin. Nutr. 63, 639S. Deonarain, M.P. y Epenetos, A.A. (1998) Design, characterization and antitumor cytoxicity of a panel or recombinant, mammalian ribonuclease-based immunotoxins Br.J. Cáncer 77, 537. DiTullio, P. Cheng S.H. Marshall, J. Gregory, R.J. Ebert , K.M. Meade H.M. y Smith, A.E. (1992) Production of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in the milk of transgenic mice. Bio/technology 10, 74. Fett, J. . Strydom, D.J. Lobb, R.R., Alderman, E.M. Bethune, J.L. Riodan, J.F. y Vallee, B.L. ( 1985) Isolation and characterization of angiogenin and angiogeníc protein for human carcinoma cells. Biochemistry 24, 5480. Goshorn, S.C. Svensson, H.P. Kerr, D.E. Somerville, J.E. Senter, P.D. y Fell, H.P. (1993) Genetic construction, expression and characterization of a single chain anti -carcinoma antibody fused to ß-lactamase, Cáncer Res. 53, 5123. Gutiérrez., A., Meade, H.M.., Ditullio, P. Pollock, D., Harvey, M. Jiménez-Flores, R. Anderson, G. Murray, J. , y Medrano, J. (1996) Expression of a bovine kappa CN cDNA in the mammary gland of transgenic mice utilizing a genomic milk protein gene as an expression cassette, Transgenic Res. 5, 271. Haber, E. (1994) Antibody-plasminogen activator conjugated and recombinant proteins. methods in Mol. Genet , 5, 111. Heyligen, H. , Thijs, C, Weber, W., Bosmans, E., y Raus , J. (1985) Monoclonal antibodies detecting human T cell activation antigens; development of monoclonal antibodies and expression of antigens on activated T. cells and leukemic cells. Fed. Proc . 44, 787. Hoogenboom, H.R. Raus, J.C.M., yVolckaert, G. (1990) Cloning and expression of a chimeric antibody directed against the human transferrin receptor. J. Immunol . 144, 3211. Hoogenboom, H.E. Volckaert, G., y Raus, J.C.M. (1991) Construction and expression of antibody-tumor necrosis factor fusión proteins. Mol. Immunol. 28, 1027. Jinno, H. , Ueda, M. , Ozawa, S., Kikuchi, k. , Ikeda, T. , Enomoto, K, y Kitajima, M. (1996) Epidermal growth factor receptor dependent cytotoxic effect by an effect by an EGF-ribonuclease conjúgate on human cáncer cell lines: a trail for less immongenic chimeric toxin. Can. Cheomoter. Pharmacol 38, 303. Limonta, J. Pedraza, A., Rodriquez, a., Grehre, F.M., Barral , A.M., Castri, F.O. Lleonart, R . , García, C.A. Gavilondo J.V., y DelaFuente, J. (1995) Production of active anti-CD6 mouse/human chimeric antibodies in the milk transgenic mice. Immontechnology 1, 107. Maga, E., y Murray J. (1995) Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk. Bio/Technology 13, 1452. Moroninau, J. , y Riordan, J.F. (1994) Nuclear translocation of angiogenin in proliferating endothelial cells is essential to its angiogenic activity. Proc. Nati. Acad, Sci U.S.A. 91, 1677.

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Claims

REIVI DICACIONES 1. Un método de hacer una proteína de fusión transgénica, que comprende proveer un animal transgénico que incluye un transgén que provee la expresión de la proteína de fusión; permitir que se exprese el transgén; y, recuperar la proteína de fusión de la leche del animal transgénico.
2. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión incluye una sub-unidad de inmunoglobulina y una enzima.
3. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión incluye un primer miembro fusionado a un segundo miembro y el primer miembro incluye la sub-unidad de una molécula objetivo y el segundo miembro codifica una toxina celular.
4. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión incluye una sub-unidad de una Ig específica para un antígeno tumoral .
5. El método de la reivindicación 4, donde el antígeno tumoral es del grupo del antígeno carcino-embriónico (CEA) , un receptor de traEl métodnsferencia, TAG-72, un receptor del factor de crecimiento epidérmico.
6. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión incluye una ARNasa.
7. El método de la reivindicación 6, donde la ARNasa es ARNasa A.
8. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión incluye angiogenina.
9. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión incluye la enzima carboxipeptidasa B.
10. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión es hecha en una glándula mamaria del animal transgénico .
11. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión es secretada en la leche de un mamífero transgénico en concentraciones de al menos 0.5 mg/ml o mayores.
12. El método de la reivindicación 1, donde la proteína de fusión es secretada en la leche de un mamífero transgénico en concentraciones de al menos alrededor de 1.0 mg/ml o mayores .
13. El método de la reivindicación 1, donde la sub-unidad inmunoglobulina de una proteína de fusión es un anticuerpo humanizado.
14. El método de la reivindicación 1, donde el transgén que codifica la proteína de fusión transgénica es una construcción de ácido nucleico que incluye: (a) opcionalmente , una secuencia aisladora; (b) un promotor epitelial mamario específico; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal que puede dirigir la secreción de la proteína de fusión, v.gr. , una señal de una proteína específica de la leche ; (d) opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica una porción suficiente de la región de codificación amino terminal de una proteína secretada, v.gr., una proteína secretada en la leche, para permitir la secreción, v.gr., en la leche de un mamífero transgénico, de la proteína de fusión; (e) una o mas secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de fusión; y (f) opcionalmente, una región 3' sin traducir de un gen de mamífero.
15. Una consttírucción de ácido nucleico aislada, que incluye : (a) opcionalmente, una secuencia aisladora; (b) un promotor epitelial mamario específico; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal que puede dirigir la secreción de la proteína de fusión, v.gr. , una señal de una proteína específica de la leche ; (d) opcionalmente, una secuencia de nucleótidos que codifica una porción suficiente de la región de codificación amino terminal de una proteína secretada, v.gr., una proteína secretada en la leche, para permitir la secreción, v.gr., en la leche de un mamífero transgénico, de la proteína de fusión; (e) una o mas secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de fusión, como se describe en la reivindicación 1 ; y (f) opcionalmente, una región 3' sin traducir de un gen de mamífero, v.gr., un gen epitelial mamario específico, v.gr. , un gen de proteína de leche.
16. Un animal transgénico, que incluye un transgén que codifica una proteína de fusión descrita en la reivindicación 1.
17. El animal transgénico de la reivindicación 16, el cual puede secretar la proteína de fusión en su leche en concentraciones de al menos alrededor de 0.5 mg/ml o mayores. esumen Un método de hacer una proteína de fusión transgénica. El método incluye proveer un animal transgénico que incluye un transgén que provee la expresión de la proteína de fusión; permitir que se exprese el transgén; y recuperar la proteína de fusión de la leche del animal transgénico.