KR100952960B1 - 돼지 β-카제인 게놈 ＤＮＡ를 이용하여 생리활성물질을생산하기 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용하여생리활성물질을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 β-카제인 게놈 DNA(porcine β-casein genomic DNA)를 이용하여 생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인(knock-in) 벡터 및 이를 이용한 생리활성물질의 생산방법에 관한 것으로서, 돼지의 유즙으로부터 유용한 생리활성물질, 예를 들어 사람 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; basic Fibroblast Growth Factor), 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein) 등을 보다 효율적이고도 안정적으로 발현 생산할 수 있다.

돼지 β-카제인 게놈 DNA, 넉-인 벡터, bFGF, GFP, 유전자 타켓팅, 유선 특이적 발현

Description

돼지 β-카제인 게놈 ＤＮＡ를 이용하여 생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용하여 생리활성물질을 생산하는 방법{Knock-in vectors for producing bioactive substances by using porcine β-casein genomic DNA, and processes for producing bioactive substances using the same}

본 발명은 돼지 β-카제인 게놈 DNA(porcine β-casein genomic DNA)를 이용한 넉-인(knock-in) 벡터 및 이의 사용방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 5' 아암(arm)으로서 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 2.65kb 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1을 포함하는 5' 말단 단편, 및 3' 아암으로서 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 엑손 5, 6 및 7을 포함하는 3' 말단 단편을 이용하는, 생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인 벡터 및 이를 사용하여 생리활성물질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

유전공학적 방법에 의해 제조되는 바이오 의약품은 주로 대장균이나 동물세포 배양을 통해 생산되므로 생산단가가 높다. 특히, 대장균을 이용한 시스템에서 생산된 단백질은 '번역 후 수식'(posttranslational modification)의 문제점을 가지고 있다. 동물세포를 이용하는 경우에는, 생산에 막대한 투자비가 필요하며 이에 비해 생산성은 극히 낮다는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 근본적으로 해결하기 위한 방안으로, 형질전환 가축(transgenic animals)을 생체반응기(bioreactor)로 이용하려는 노력이 있어 왔다. 현재 형질전환 가축을 생산하는데 이용되는 방법은 수정란 전핵에 외래 유전자를 미세주입(microinjection)하는 방법, 외래 유전자를 체세포에 도입하고 그 체세포를 이용하여 복제동물을 생산하는 방법, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)를 수정란에 감염시키는 방법 등이 이용되고 있다. 그러나 이러한 방법은 외래 유전자 발현벡터가 염색체 내에 무작위로 삽입되어 그 유전자의 발현이 불안정하고 발현량이 적어 산업화에 문제점이 있다. 또한, 벡터 구축 시 프로모터를 적절하게 선정하여도 생체 내에서 원하지 않은 발현이 나타나는 문제점이 있다. 아울러, 미세주입 방법과 레트로바이러스를 이용하는 방법은 유전자가 모자이크(mosaic)로 세포에 삽입되어 생식세포로부터 그 자손을 얻는데 어려움이 있을 수도 있다. 최근 형질전환 동물 생산에 많이 이용되는 체세포 복제방법은 외래 유전자를 도입한 체세포의 선별 시 다양한 문제로 복제동물 생산에 적절한 유전자가 도입된 체세포를 확보하는데 어려움이 있다.

넉-인(knock-in) 시스템은 유전자 타켓팅(gene targeting) 방법의 하나로서, 특정 유전자를 넉-아웃(knock-out)시키고 그 유전자의 위치에 정확하게 발현시키고자 하는 외래 유전자를 도입하는 방법이다. 넉-인 시스템은 외래 유전자를 원하는 위치에 삽입할 수 있는 시스템으로, 넉-인 시스템에 의하여 삽입된 외래 유전자는 삽입된 위치의 게놈 상에 위치한 유전자 발현조절 영역의 모든 부분을 이용할 수 있으므로, 원래 그 위치에 존재하는 유전자의 발현량 만큼 발현될 가능성이 있다.

유전자 타겟팅은 생쥐에서 처음 위치 특이적으로 특정 유전자에 변이를 도입할 수 있는 기술로 보고되었다(문헌 [Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. Cell, 51, 3, 503-512(1987)]). 이러한 유전자 타겟팅 기술은 양에서 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자와 프리온(Prion) 단백질 유전자의 넉-아웃에도 이용되었으나, 그 효율은 1.7%와 1%로 매우 낮았다(문헌 [Denning, C. et al., Nature Biotechnology, 19, 559-562(2001)]). 또한, 장기이식용 복제돼지 생산을 위하여 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 넉-아웃된 돼지가 유전자 타겟팅 방법에 의해 생산되었다(문헌 [Dai, Y. et al., Nature biotechnology, 20, 251-155(2002)] 및 [Lai, L. et al. Science, 295, 1089-1092(2002)]).

유용한 재조합 단백질을 대량 생산하기 위하여 생체반응기로서 형질전환 동물의 유즙, 소변 등이 주목받아 왔으며, 포유동물의 유선에서 분비되는 유즙에 대해서는 가장 많은 연구가 이루어졌다. 유즙 내 단백질의 주성분은 카제인 단백질, 즉 칼슘-감수성 카제인들(α-S1-, β-, α-S2-카제인) 및 κ-카제인이다. β-카제인은 소, 산양, 면양의 유즙의 주성분으로서, 그 프로모터는 형질전환동물의 유선에서 형질전환 유전자의 발현을 조절하는데 사용하기에 적합한 후보로 여겨진다. 산양의 β-카제인 유전자 영역을 이용한 유전자 타겟팅 벡터(문헌 [Yu, HQ et al., Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 20, 21-24(2004)])가 개발되었으며, 산양의 β-카제인 유전자 영역을 이용하여 ht-PAm(human plasminogen activator mutant)(문헌 [Shen, W. et al., Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 20, 361-365(2004)]), GFP(문헌 [Shen, W. et al., Yi Chuan Xue Bao, 32, 366-371(2005)]) 또는 사람의 락토페린 (문헌 [Li, L et al., Yi Chuan, 28, 1513-1519(2005)])을 넉-인한 세포를 확보한 것으로 보고되어 있다.

돼지 β-카제인 cDNA 서열(1110bp)은 젠뱅크(GenBank)에 X54974로 등록되어 있으며, 돼지 β-카제인 프로모터 및 엑손 1을 포함하는 부분 서열(5544bp)이 AY452035로 등록되어 있다. 돼지의 β-카제인 프로모터 3.2kb 서열과 이를 이용한 형질전환 벡터가 보고되어 있으나, 이는 프로모터만을 사용하고 있으므로 다양한 개선의 여지를 가지고 있다. 한국등록특허 제646222호(2005. 12. 7 공개)는 돼지 β-카제인 유전자의 프로모터 및 인트론 1의 염기서열을 결정 분석하고, 돼지 β-카제인 유전자 프로모터 염기서열 3,101bp와 인트론 1의 2,398bp를 루시퍼라아제 리포터 유전자에 결합한 발현벡터 및 이를 이용한 형질전환 동물 유선에서 유전자 발현방법을 개시한 바 있다. 그러나 이 또한 돼지 β-카제인 유전자의 부분 서열(partial sequence)을 이용한 것으로서, 여전히 개선의 여지를 안고 있다.

본 발명자들은 유전자 타켓팅 기술의 하나의 넉-인 벡터 개발에 이용하기 위하여 돼지 β-카제인의 전체 게놈 DNA 서열을 동정 분석하고, 본 출원과 동일자로 출원한 바 있다(도 1 및 서열번호 1 참조). 본 발명자들은 돼지 β-카제인 게놈 DNA를 이용하여 생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 이용하여 생리활성물질을 효율적이고도 안정적으로 발현할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 돼지 β-카제인 게놈 DNA를 이용하여 생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 넉-인 벡터를 이용하여 생리활성물질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은 5' 아암으로서 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 2.65kb 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1을 포함하는 5' 말단 단편;

생리활성물질을 코딩하는 유전자; 및

3' 아암으로서 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 엑손 5, 6 및 7을 포함하는 3' 말단 단편을 포함하는,

생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인 벡터에 관한 것이다.

둘째, 본 발명은 상기 벡터를 세포에 도입하여 생리활성물질을 발현시키는 단계를 포함하는, 생리활성물질의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 돼지 β-카제인 게놈 DNA를 이용한 넉-인 벡터를 이용하면 돼지의 유즙으로부터 목적하는 생리활성물질, 예를 들어 사람 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF; basic Fibroblast Growth Factor), 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein) 등을 보다 효율적이고도 안정적으로 발현 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 도 1에 나타낸 바와 같은 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 5' 말단으로부터의 약 5kb 단편을 5' 아암(좌측 아암(left arm))으로 이용하고, 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 3' 말단으로부터의 약 2.7kb 단편을 3' 아암(우측 아암(right arm))으로 이용하여 넉-인 벡터를 구축하였다. 5' 말단 5kb 단편은 2.65kb 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1을 포함하며, 3' 말단 2.7kb 단편은 엑손 5, 6 및 7을 포함하는 것이다. 생리활성물질을 코딩하는 유전자를 상기 5' 및 3' 아암 사이에 도입하되, 생리활성물질을 코딩하는 유전자의 개시 코돈(ATG)이 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 개시 코돈과 일치하도록 한다. 돼지 β-카제인 게놈 DNA는 도 1a 내지 도 1e 및 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로서, 돼지 β-카제인 게놈 DNA에 대한 본 출원인의 동일자 출원의 전체 개시내용은 본 출원에 참조로서 인용된다.

본 발명에서, 생리활성물질은 예를 들어 사람 bFGF, GFP 등을 포함하나(도 2 및 3 참조), 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는, 추가로 5' 말단에 핵 배치 신호(NLS; Nuclear Localization Signal)를 연결하고, 양성 선별마커(positive selectable marker), 음성 선별마커(negative selectable marker)를 각각 또는 함께 사용하는 것이 바람직하다. 핵 배치 신호는 예를 들어 벡터가 세포의 핵 내로 도입되는데 관여하는 것으로 일려져 있는 X-서열(X-sequence)를 포함하나(도 4 참조), 이로 제한되는 것은 아니다. 양성 선별마커와 음성 선별마커는 각각 예를 들어 마우스 포스포글리세레이트 키나제-Ⅰ 프로모터(mouse phosphoglycerate kinase-Ⅰ promoter)에 의해 발현되는 neo 유전자와 MC1 프로모터에 의해 발현되는 DT-A(Diphtheria Toxin-A) 유전자를 포함 하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 양성 선별마커와 음성 선별마커를 동시에 사용함으로써, 양성-음성 선별이 가능하도록 할 수 있다.

유전자의 발현을 위해서는 유전자의 3' 영역에 polyA 신호가 존재해야 되며 이 신호를 이용하여 RNA로 전사될 때 polyA가 형성되어 RNA의 안정화 또는 핵에서 세포질로의 이행에 관여한다. 그러므로 본 발명의 넉-인 벡터에서는 발현시키고자 하는 생리활성물질의 안정적 발현을 위하여 polyA 신호, 예를 들어 SV40 polyA 신호를 포함할 수 있다(도 5 참조).

도 6은 돼지 β-카제인 영역을 이용하여 제조한 넉-인 벡터의 전체적인 모식도를 나타낸 것이다. 본 발명의 구체적인 태양에서는, β-카제인 유전자의 ATG 위치를 과발현시키고자 하는 hFGF와 GFP 유전자의 ATG와 일치시켜 돼지 β-카제인 유전자의 유전자 조절 서열을 전체적으로 이용하여 유전자가 발현될 수 있도록 넉-인 벡터를 제조하였다. 과발현시키고자 하는 유전자의 polyA 신호는 SV40 polyA 신호를 이용하였다. 또한 양성 선별마커와 음성 선별마커는 polyA 신호를 포함하고 있지 않으며, 넉-인 벡터가 정상적으로 β-카제인 게놈 위치에 상동 유전자 재조합에 의하여 삽입되면 원래 β-카제인 유전자의 polyA를 이용하여 양성 선별마커가 발현되도록 고안되었다. 그리고 음성 선별마커는 상동 유전자 재조합이 일어나지 않고 무작위로 삽입된 경우 선별할 수 있도록 고안되어 있다.

상기와 같은 방법에 의하여, 본 발명에서는 양성 선별마커만을 포함하고 있는 5'-hFGF(GFP)-polyA-Pneo-3' 벡터, 세포의 핵 내로 벡터가 도입되는데 관여하고 있는 것으로 알려진 X 서열과 양성 선별마커로 구성된 X-5'-hFGF(GFP)-polyA-Pneo- 3' 벡터, X 서열을 포함하지 않고 양성 선별마커와 음성 선별마커를 포함하고 있는 5'-hFGF(GFP)-polyA-Pneo-3'-DT 벡터, X 서열, 양성 선별마커와 음성 선별마커를 모두 포함하고 있는 X-5'-hFGF(GFP)-polyA-Pneo-3'-DT 벡터를 hFGF와 GFP에 대하여 구축하였다( 도 7 및 8). 본 발명의 구체적인 태양에 따른 넉-인 벡터의 구성을 나타내면 아래 표 1과 같다.

본 발명의 구체적인 태양에 따른 넉-인 벡터의 구성

명칭	구조	설명
hFGF-DT	5'-hFGF-polyA-Pneo-3'	양성 선별마커만을 포함
X+hFGF-DT	X-5'-hFGF-polyA-Pneo-3'	X 서열과 양성 선별마커를 포함
hFGF+DT	5'-hFGF-polyA-Pneo-3'-DT	X 서열을 포함하지 않고 양성 선별마커와 음성 선별마커를 포함
X+hFGF+DT	X-5'-hFGF-polyA-Pneo-3'-DT	X 서열, 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 모두 포함
GFP-DT	5'-GFP-polyA-Pneo-3'	양성 선별마커만을 포함
X+GFP-DT	X-5'-GFP-polyA-Pneo-3'	X 서열과 양성 선별마커를 포함
GFP+DT	5'-GFP-polyA-Pneo-3'-DT	X 서열을 포함하지 않고 양성 선별마커와 음성 선별마커를 포함
X+GFP+DT	X-5'-GFP-polyA-Pneo-3'-DT	X 서열, 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 모두 포함

본 발명에서 구축된 넉-인 벡터에는 β-카제인 유전자의 엑손 1의 5' 쪽으로 약 2.65kb의 프로모터를 포함하고 있다. 그리고 발현시키고자 하는 GFP와 hFGF의 ATG 위치는 β-카제인 유전자의 엑손 2에 있는 ATG 위치에 일치시켜 β-카제인 유전자의 유전자 조절 서열을 이용하여 발현되도록 고안되어 있다. 따라서 본 벡터를 마우스의 유선세포 세포주인 HC11에 형질감염하면 벡터에 포함되어 있는 2.65kb의 프로모터에 의하여 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있다. 또한 이러한 벡터가 체세포에서 상동 유전자 재조합에 의하여 β-카제인 유전자 위치에 유전자 타겟팅이 되면 2.65kb의 프로모터뿐만 아니라 그 앞쪽에 있는 유전자 조절 서열을 모두 이용하여 유전자 발현이 일어날 수 있다. 본 발명에서 구축된 벡터가 기본적인 전사인자들에 의하여 마우스의 유선세포 세포주인 HC11에서 발현하는지를 확인하기 위하여, GFP+DT 벡터를 마우스 유선 세포주인 HC11에 도입하였다. 일정시간(예: 48시간) 후 GFP의 발현을 확인한 결과, GFP+DT 벡터가 도입된 HC11 세포에서 형광을 발하는 것이 확인되었다(도 9 참조). 따라서 제조된 넉-인 벡터가 세포 내에서 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 넉-인 벡터의 도입은 당업계에 알려진 통상적인 방법 중 어느 하나를 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어, 형질감염 시약(transfection reagent)을 이용하거나 전기천공(electroporation) 등의 방법을 이용할 수 있으나, 이들로 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 넉-인 벡터는 돼지 유즙으로부터 다양한 생리활성물질을 보다 효율적이고도 안정적으로 발현 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

제조예 1: LA-PCR(Long & Accurate-Polymerase Chain Reaction)에 의한 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 동정

돼지 β-카제인 게놈 DNA는 돼지의 태아섬유아세포를 이용하여 게놈 DNA를 회수하고 PCR을 수행하여 동정하였다. PCR은 NCBI에 보고된 돼지 β-카제인 프로모터 부위(accession No. AY452035)와 cDNA 분석 결과를 바탕으로 프라이머를 제조 하여 롱 PCR을 수행하였다. PCR은 돼지 β-카제인 프로모터 상류 센스(서열번호 2: CCCACTATTTCCTGATTCTTGATTAACTTT) 프라이머, β-카제인 엑손 6으로 추정되는 안티센스(서열번호 3: TGTTGTTCCTCCCGCTTTAGCTTCTCAATT) 프라이머, 엑손 2를 포함하는 센스(서열번호 4: GACTTGATCGCCATGAAGCTCCTCATCCTT) 프라이머와 마지막 엑손 9를 포함하는 안티센스(서열번호 5: GCCTAAGGATTAATTTATTGAAATGACTGG) 프라이머를 제작하여 수행하였다. 돼지의 태아섬유아세포에서 회수된 게놈 DNA 100 ng을 사용하여 10 pmol의 센스, 안티센스 프라이머, 0.5U i-Max Ⅱ DNA 중합효소(Intron), 1×PCR-완충액, 200 μM dNTP 조성으로 변성 94 ℃ 30 초, 어닐링 63 ℃ 30 초, 연장 72 ℃ 7분 30초, 30 주기의 반응조건으로 롱 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였다. 그 결과, 약 6.8kb 및 약 5.5kb의 밴드를 검출하였다.

염기서열 결정을 위하여 pGEM T-이지 벡터(Promega)에 서브클로닝하였다. 염기서열 결정은 ABI PRISM 377 시퀀서(Applied Biosystems)를 사용하여 결정하였다. 결정된 염기서열의 분석은 진틱스-윈(version 4.0)을 이용하여 분석하고, 그 결과 β-카제인 DNA임을 확인하였다(도 1a 내지 1e 및 서열번호 1 참조). 동정된 돼지 β-카제인 게놈은 전체 9개의 엑손과 8개의 인트론으로 이루어져 있으며 사람과 설치류에서 보고되는 결과와 일치하였다.

제조예 2: 사람 FGF 유전자의 동정 및 분석

사람 FGF 유전자는 간암세포 세포주인 HepG2 세포(ATCC HB-8065)로부터 총 RNA를 분리하여 다음과 같이 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)에 의하여 분리하였다. 총 RNA는 1 ㎖의 트리졸 시약(Gibco BRL)에 회수된 세포를 넣고 1분 동안 균질화한 후 에탄올 침전을 수행하여 회수하였으며 RNase-프리 워터에 녹여 사용 전까지 -70 ℃에 보존하였다. 인간 FGF 유전자를 클로닝하기 위한 제1쇄 cDNA 합성은 총 RNA 5 ㎍을 사용하여 슈퍼스크립트 Ⅱ RNaseH-역전사효소(Invitrogen)와 랜덤 프라이머(Takara)를 이용하여 합성하였다. PCR은 1 ㎕ 제1쇄 cDNA를 합성하여 보고된 인간 FGF(accession No. NM_002006)에 상응하는 20 pmol 센스(서열번호 6: GCCCCGCAGGGACCATGGCA)와 안티센스(서열번호 7: AAATCAGCTCTTAGCAGACA) 프라이머를 이용하여 1×PCR-완충액, 0.5U Taq 중합효소(Promega), 각 200 μM dNTP 조성으로 변성 94 ℃ 30 초, 어닐링 50 ℃ 30초, 연장 72℃ 1 분, 40 주기의 반응조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였으며, 제조예 1과 동일한 방법에 따라 염기서열을 결정 및 분석하였다. 동정된 FGF2는 484bp로 염기서열 결정 후 상동성을 검사한 결과 NCBI에 보고된 FGF2와 염기서열이 100% 일치하였다(도 2 참조).

제조예 3: GFP 유전자의 동정과 분석

GFP 유전자는 클론테크(Clontech) pEGFP-N3 벡터(Clontech)를 이용하여 PCR에 의하여 클로닝하였다. DNA는 10 pg으로 희석하여 사용하였고 20 pmol의 센스 프라이머(서열번호 8: AAGCTTCGAATTCTGCAGTC), 안티센스 프라이머(서열번호 9: CTCGAGTTACTT GTACAGCT)를 이용하여 1×PCR-완충액, 0.5U Taq 중합효소(Promega), 각 200 μM dNTP 조성으로 변성 94 ℃ 30 초, 어닐링 60 ℃ 30 초, 연장 72 ℃ 1 분, 35 주기의 반응조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였으며, 제조예 1과 동일한 방법에 따라 염기서열을 결정 및 분석하였다. 그 결과 도 3의 A)에서 나타낸 바와 같이 778bp의 단편을 동정할 수 있었다. 염기서열 결정 후 상동성을 검색하여 GFP 유전자임을 확인하였다(도 3의 B)).

제조예 4: 핵 배치 신호서열(NLS)의 동정 및 염기서열 분석

핵 배치 신호(NLS)는 클론테크 pEGFP-N3 벡터(Clontech)를 이용하여 클로닝하였다. DNA는 10 pg으로 희석하여 사용하였고 10 pmol의 센스 프라이머(서열번호 10: CGGAGTTAGGGGCGGGACTA), 안티센스 프라이머(서열번호 11: CCAGCTGTGG AATGTGTGTC)를 이용하여 1×PCR-완충액, 0.5U Taq 중합효소(Promega), 각 200 μM dNTP 조성으로 변성 94 ℃ 30 초, 어닐링 60 ℃ 30 초, 연장 72 ℃ 30 초, 40 주기의 반응조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였으며, 제조예 1과 동일한 방법에 따라 염기서열을 결정 및 분석하였다. 동정된 nls는 72bp 탠덤 리피트(tandem repeat) 구조를 가지고 있으며 염기서열을 확인한 결과 100% 일치하였다(도 4 참조).

제조예 5: SV40 polyA 신호 서열의 동정 및 염기서열 분석

SV40 polyA는 pCMV-Tag1(Stratagene) 벡터를 이용하였다. DNA는 10 pg으로 희석하여 사용하였고 20 pmol의 센스 프라이머(서열번호 12: AAGCTTATCGATACCGTCGA), 안티센스 프라이머(서열번호 13: GGGCCCTTAAGATACATTGATGAG)를 이용하여 1×PCR-완충액, 0.5U Taq 중합효소(Promega), 각 200 μM dNTP 조성으로 변성 94 ℃ 30 초, 어닐링 50 ℃ 30 초, 연장 72 ℃ 40 초, 40 주기의 반응조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였으며, 제조예 1과 동일한 방법에 따라 염기서열을 결정 및 분석하였다. 그 결과 504bp의 단편을 동정할 수 있었으며 염기서열 결정 결과 SV40 polyA 신호임을 확인하였다(도 5 참조).

실시예 1: 돼지 β-카제인 게놈 DNA를 이용한 넉-인 벡터의 구축

넉-인 벡터는 돼지 β-카제인 5' 영역 5kb의 단편을 좌측 아암으로 이용하였으며 돼지 β-카제인 엑손 5 내지 7을 포함하는 약 2.7kb의 3' 영역을 우측 아암으로 이용하여 구축하였다. 또한 양성 선별마커로는 마우스 포스포글리세레이트 키나제-Ⅰ 프로모터에 의해 발현되는 neo 유전자를 이용하였으며 음성 선별마커로는 DT-A 유전자를 이용하여 양성-음성 선별이 가능한 넉-인 벡터를 구축하였다. β-카제인의 개시 코돈은 GFP와 hFGF의 개시 코돈과 일치하도록 연결하였다. 이하, X 서열+5'+hFGF(GFP)+polyA+Pneo+3'+DT 벡터의 제조에 대하여 기술한다.

과발현시킬 hFGF, GFP 유전자의 5'에는 NcoⅠ 제한효소 위치, 3'은 SalⅠ 제한효소 위치를 넣어 프라이머를 제작하여 hFGF cDNA를 주형으로 이용하여 PCR 증폭한 후 pGEM T-이지 벡터(pGEM T-easy vector)(Promega)에 서브클로닝하였다. GFP 는 pEGFP-N3 DNA를 주형으로 이용하여 PCR로 증폭하였다. SV40 poly A는 pCMV-Tag1 DNA를 주형으로 이용하여 센스 프라이머에는 XhoⅠ 제한효소 위치를 안티센스 프라이머에는 EcoRⅤ 제한효소 위치를 삽입하여 PCR을 수행한 후 서브클로닝하였다. 벡터를 세포로 도입하였을 때 세포질에서 세포의 핵 내로 벡터가 도입되는데 관여하고 있는 것으로 알려진 X 서열은 pEGFP-N3 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하였고 pGEM T-이지 벡터에 서브클로닝하였다. 넉-인 벡터의 5' 아암 부분의 구축을 위해 돼지 β-카제인 프로모터부터 엑손 2까지 프로모터 부분에는 NotⅠ 제한효소 위치를 엑손 2 부분에는 NcoⅠ 제한효소 위치를 넣어 프라이머를 제작하여 PCR로 증폭하였다.

이렇게 PCR 증폭된 넉-인 벡터의 5' 아암 부분은 NotⅠ-NcoⅠ 제한효소 처리에 의하여 약 5kb의 삽입체를 제조하고 과발현시킬 유전자인 hFGF, GFP는 NcoⅠ-SalⅠ 제한효소 처리를 하여 삽입체로 준비하여 pBSK+/NotⅠ-SalⅠ 벡터(pBSK+: Stratagene)를 이용 3 단편 결찰을 실시하였다. 이렇게 제조된 넉-인 벡터의 5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)의 단편은 시퀀싱을 통해 정상적인지 확인한 후 프로모터 앞부분에 X 서열을 삽입하였다. X 서열을 삽입하기 위해 X 서열이 연결된 pGEM T-이지 벡터를 SpeⅠ으로 절단한 후 점착성(sticky) 말단을 평활화(blunting)시켜 주었고 반대쪽에 존재하는 NotⅠ 위치를 제한효소로 절단하여 X 서열 단편(NotⅠ-평활화)을 삽입체로 준비하였다. 넉-인 벡터의 5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)의 단편을 포함하고 있는 플라스미드는 NotⅠ-EcoRⅤ로 절단하여 X 서열 단편(NotⅠ-평활화)을 연결할 수 있는 벡터로 이용하여 이 두 개의 단편을 결찰하여 넉-인 벡 터는 X 서열+5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)의 단편을 완성하였다. hFGF 또는 GFP 유전자 뒤에 SV40 polyA를 연결하기 위해 PCR에 의해 서브클로닝되어 있는 SV40 polyA 플라스미드를 XhoⅠ-EcoRⅤ로 절단하여 삽입체를 준비하고, X 서열+5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)의 단편이 서브클로닝되어 있는 플라스미드는 NotⅠ-SalⅠ으로 절단하여 삽입체를 준비한 후 pBSK+/NotⅠ-EcoRⅤ 벡터에 3 단편 결찰을 실시하였다. 이렇게 하여 X 서열+5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)+SV40 poly A를 포함하는 플라스미드를 제조하였다.

β-카제인 3' 부분을 넉-인 벡터에 이용하기 위해 β-카제인 게놈 DNA의 인트론 4에 존재하고 있는 PstⅠ과 인트론 7에 존재하고 있는 XbaⅠ 효소 위치를 이용하였다. β-카제인 3' 부분을 PstⅠ과 XbaⅠ으로 절단하면 약 2.6 kb의 단편을 얻을 수 있다. 이 단편을 pBSK+/PstⅠ-XbaⅠ 벡터에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 DNA를 PstⅠ으로 절단 후 평활화시키고 SalⅠ 링커를 연결한 후 XbaⅠ으로 절단하여 이 단편을 pBSK+/SalⅠ-XbaⅠ 벡터에 연결하였다. 효소 위치가 PstⅠ에서 SalⅠ으로 치환된 것을 확인한 후 XbaⅠ 위치를 XhoⅠ으로 치환하는 과정을 수행 하였다. 이 과정을 통해 pBSK+/SalⅠ-XhoⅠ 벡터에 β-카제인 3'이 연결된 플라스미드를 얻게 되었다. PGK-neo 유전자(오리엔탈효모공업주식회사(일본)로부터 구입)는 효소 위치를 치환하는 과정을 통해 pBSK+/EcoRⅤ-SalⅠ 벡터에 연결하였다. β-카제인 3' 부분과 PGK-neo를 연결하기 위해 β-카제인 3' 부분이 연결되어 있는 플라스미드를 EcoRⅤ-SalⅠ으로 절단하여 벡터로 이용하고 PGK-neo 플라스미드는 EcoRⅤ-SalⅠ으로 절단하여 삽입체를 준비하여 이 두 개의 단편을 결찰하여 pBSK+/EcoRⅤ-XhoⅠ에 PGKneo+β-카제인 3' 부분이 연결된 플라스미드를 얻었다.

pBSK+/NotⅠ-EcoRⅤ[X 서열+5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)+SV40 polyA]와 pBSK+/EcoRⅤ-XhoⅠ[PGK-neo+β-카제인 3' 부분]을 최종적으로 연결하기 위해 pBSK+/EcoRⅤ-XhoⅠ[PGK-neo+β-카제인 3' 부분]을 EcoRⅤ-XhoⅠ으로 절단하여 삽입체를 준비하였고 pBSK+/NotⅠ-EcoRⅤ[X 서열+5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)+SV40 polyA]를 EcoRⅤ-XhoⅠ으로 절단하여 벡터로 이용하여 이 두 단편을 결찰하였다. 이렇게 하여 pBSK+/NotⅠ-XhoⅠ[X 서열 + 5' 아암 부분+(hFGF 또는 GFP)+SV40 polyA+PGKneo+β-카제인 3' 부분] 플라스미드를 얻었다. 이 플라스미드를 NotⅠ-XhoⅠ으로 절단하여 삽입체를 만든 후 pMCDT-A(A+T/pau) 벡터(문헌 [Yagi, T. et al. 1993. Anal. Biochem. 214:77-86], 오리엔탈효모공업주식회사(일본)로부터 구입)의 NotⅠ-XhoⅠ 위치에 삽입하여 최종 넉-인 벡터인 X 서열+5'+hFGF(GFP)+polyA+Pneo+3'+DT를 완성하였다(도 6, 7 및 8 참조). 도 10a 내지 10e에 본 발명에 따른 넉-인 벡터의 하나인 X 서열+5'+hFGF+polyA+Pneo+3' 벡터의 전체 염기서열(서열번호 14) 및 각 부분의 위치를 나타내었으며, 도 11a 내지 11e에 본 발명에 따른 넉-인 벡터의 하나인 X 서열+5'+GFP+polyA+Pneo+3' 벡터의 전체 염기서열(서열번호 15) 및 각 부분의 위치를 나타내었다.

실시예 2: 구축된 넉-인 벡터의 발현 검증

구축된 넉-인 벡터가 유선세포에서 발현하는지 확인하기 위해 GFP가 발현되도록 고안된 5'+GFP+polyA+Pneo+3'+DT 벡터를 마우스의 유선세포 세포주인 HC11 세 포(COMMA-1D 마우스 유선세포주(문헌 [Danielson, K. et al. (1984), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 3756-3760])로부터 유래)에 도입하여 검증하였다. HC11 세포의 배양에는 10%의 FBS와 항생제가 포함된 RPMI 1640을 사용하였다. 벡터의 형질감염은 다음과 같이 실시하였다. 형질감염을 하기 위해 형질감염 16 시간 전에 HC11 세포를 3 ㎝ 디쉬에 2.4×10⁵ 세포를 접종한 후 다음 날 1.8 ㎖의 배양액으로 교체하였다. 형질감염에 대조 GFP DNA와 넉-인 벡터 DNA는 0.2 ㎍/㎖로 희석하여 4 ㎍을 사용하였으며 형질감염 시약은 jetPEI™ 형질감염 시약(Polyplus-transfection)을 각각의 샘플에 8 ㎕씩을 사용하였다. 형질감염을 하기 위해 준비된 DNA 20 ㎕(4 ㎍)과 150 mM NaCl 80 ㎕를 혼합하여 총 부피 100 ㎕를 조제한 후 15 초 동안 혼합해 주었고 형질감염 시약인 jetPEI™ 8 ㎕과 150 mM NaCl 92 ㎕를 혼합하여 총 부피 100 ㎕를 조제한 후 혼합하였다. 각각 혼합한 DNA 용액 100 ㎕ 와 형질감염 시약 100 ㎕를 한 튜브로 옮긴 후 다시 15 초 동안 볼텍싱(vortexing)하여 혼합한 후 실온에서 30 분 동안 방치하였다. 이렇게 제조된 DNA·jetPEI™ 혼합액은 각각의 디쉬에 총 부피 200 ㎕씩 접종하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 24 시간 후에 배양액을 교체하였고 48 시간 후에 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 확인하였다. 또한 형질감염 효율 확인 및 양성 대조로 GFP 발현 확인은 pEGFP-N3 DNA를 사용하여 확인하였다.

그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이 5'-GFP-SV40pA-neo-β3'-DT 넉-인 벡터를 도입한 HC11 세포에서 형광을 발하는 것을 확인하였다. 대조군인 pEGFP-N3 벡터보 다 GFP가 발현하는 세포수가 적은 것은 넉-인 벡터의 크기가 약 14kb로 대조군인 pEGFP-N3 벡터 4.7kb보다 약 3배 크기 때문에 유전자 도입율이 낮아 일어난 결과라고 생각된다. 또한 HC11 세포는 마우스의 유선세포이기 때문에 GFP가 세포 밖으로 분비되어 그 발현이 낮게 나타난 것일 수도 있다. 그렇지만 본 결과는 넉-인 벡터 구축 시 β-카제인 유전자의 엑손 2에 있는 ATG를 이용하여 GFP가 안정적으로 발현하고 있음을 나타낸다.

도 1a 내지 1e는 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 염기서열을 보여주는 도면이고;

도 2는 사람 FGF cDNA의 동정 및 염기서열을 보여주는 도면이며;

도 3은 GFP 유전자의 동정 및 염기서열을 보여주는 도면이고;

도 4는 핵 배치 신호서열(NLS)의 동정 및 염기서열을 보여주는 도면이며;

도 5는 SV40 polyA 신호 서열의 동정 및 염기서열을 보여주는 도면이고;

도 6은 돼지 β-카제인 영역을 이용한 넉-인 벡터의 모식도이며;

도 7은 hFGF 발현 유도를 위한 넉-인 벡터 4종류의 모식도이고;

도 8은 GFP 발현 유도를 위한 넉-인 벡터 4종류의 모식도이며;

도 9는 HC11 세포에 있어서 5'-GFP-SV40pA-neo-β3'-DT 넉-인 벡터의 발현을 보여주는 도면이고;

도 10a 내지 10e는 X 서열+5'+hFGF+polyA+Pneo+3' 벡터의 전체 염기서열 및 각 부분의 위치를 보여주는 도면이며;

도 11a 내지 11e는 X 서열+5'+GFP+polyA+Pneo+3' 벡터의 전체 염기서열 및 각 부분의 위치를 보여주는 도면이다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Knock-in vectors for producing bioactive substances by using procine beta-casein genomic DNA, and processes for producing bioactive substances using the same <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11517 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> gene <222> (1)..(11517) <223> Porcine beta-casein gDNA <400> 1 cccactattt cctgattctt gattaacttt ataaattaat ctcaatagcc atatttatca 60 taaatcagat gttattttat gtggctaatc ttatggaaag aattaaaata ttccatctat 120 ataaataatg ctatgcaatc tcatggaaag aattaaaata ttacatctat ataaataatg 180 ctatgctacc tattcttaac taataatttg gtggaattaa caaattttgt tttacattgt 240 tgccatatct gaatcattat ataaacttca ctcttttttt atcctatttc cacccccgcc 300 catgttttgg aagttattaa acagagtctc aaatattatt tagaaaaatg aagtttttag 360 taacagctct atttctaaag agctgcagtc tcctgaaaaa aaacaatgca aattcacagg 420 ccctctgttt ctttgcctct aaaatatatt taaaacatca tatggatgat atctagggtc 480 tcttctagtc cttattttct gaacaatttt tggtcctttt attgtacttt ttatccagct 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ttatgaatgt gtgaaggtct taaaaaaatt tccattacac agttgagaaa agtaagatac 8820 agaacaattg agtacacaat tgtgtgacaa cttgcatagt tattaataag cagggcttgc 8880 ttaaaaacaa ggatttgagg atgaaataaa attctttaat taaattactc ttgtggtaac 8940 atatttatcc aatcatgata tttaagcttt cctgttttac caatgaagtt ggattatttg 9000 gtacttaccc caaatatttt ctaaatcaaa atgaatttac aaatttatgc ctctttaaaa 9060 actcaagatt accactttat accaagggaa gtagtgctgg aagtttgcca ttaagtacct 9120 ccttgaatta aaaacacaaa attaagattt aaacaatata aatcttggag ttatccaagc 9180 cttttttggg aagaactctt ccttcattat atgaaaacaa tttggtctat tatcaacaca 9240 ttgttgtaaa gtctgtaccc tctgaagacc aaagtaagta gctacagctc cgcaggcagc 9300 tcaggaaaag gtgaaacaaa tcttgacatc tccaaacact gatttccctt ggctctgcgc 9360 attgcctagg aaggaagggg ttagggagca gtccctccat gagcatttta cccagtaatc 9420 ctcacatggt atgactccta aaccaaaaga agtgaacaat ttgttctctt ttcacttaat 9480 tatgagtgtt caaaaaaaga ggccgctaat tcatcatgaa tgacagttgt agctgcatta 9540 cggactcaac gattcttttt ccttctttcc aggatgaacg ccagaataaa atccaccagt 9600 ttccccagcc tcagcctcta gcccatcctt acaccgagcc catcccttac cccatccttc 9660 cacaaaacat cctgcctctt gcccaggtcc ctgtggtggt gcctcttctt catcctgaag 9720 taatgaaaga ttccaaagct aaggagacca ttgttcccaa gcgtaaagga atgcccttcc 9780 ctaaatctcc agcagagcct tttgtggaag gccagagcct aactctcacc aattttgaag 9840 gcctttctct gcctctgctc cagtccctga tgcaccagat tccccagcct gttcctcaga 9900 cccccatgtt tgctcctcag cccctgctgt ccctgcctca ggccaaagtc ctgcctgttc 9960 cccagcaagt ggtgcccttc ccccagagag atatgccctt ccaggccctt ctgctctacc 10020 aggatcctct acttggccct ctccgagggt tctaccctgt gcctcaacca gttgccccag 10080 tttacaaccc tgtaagtcca agtttattca ctgtgctgtt tcacttatga tgtttagttg 10140 ctgttagagt aattaagcaa gaactctagc ctcgag 10176 <210> 15 <211> 10427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP knock-in vector <400> 15 gcggccgcgg gaattcgatt cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga 60 tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttccaca cctggttgct 120 gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca 180 caccctaact gacacacatt ccacagctgg aatcactaga tctagggtct cttctagtcc 240 ttattttctg aacaattttt ggtcctttta ttgtactttt tatccagctt ttctttcttt 300 ctttctttct ttttttttct ttttaggccc acacttgtgg catatggagg ttcaggctag 360 ggatcaaatc agagttgtag ctgctgacct acaccacagc cacagccacg caggatccta 420 tctgcatggg tgctggtcag atttgctaac cactgagtca cgacaggaac tcccttatca 480 gcttttctat tactctattt cttgagggtg ttattcacat ggtttcagct attacctttt 540 tgctttacct atatctcatg cctgcatatt tcagattcat catccaatat tggaaaaagc 600 tttgactgaa caaattctgc ttataacaaa tagtactaga acactttgca tagatcatat 660 attactcctc acccagggtt gtcttataaa atttctgtgg atgaaattct cactttgata 720 tataaaaatg gcaacgcttg ggttattcat tgcaaaagct tggtttgccc atatggcact 780 ttgctcctta ctggtcattg tgctctgagg cttacctggc cagtggcacc tgatgttatc 840 ttaaatctct ggcttttcaa ctctcccttg ggcaagtctt tttctctggt gtattgttag 900 tgatttcctt gatcaaggtt ttacctactt ttctggccca atcaagtcca taactgtatc 960 tattcatata attcaaaatt ggtgagcgat agtcataagg gaatgttgta tttattgcac 1020 aataggtaaa gcatcttgct gagaaaacac aaaggaagta tcaaatggtt agggcacact 1080 tgcttttgta ttccttttct tagaaattat actcttttgc ctatggcctt ggcaaccaag 1140 agctaacaca taaaggcaca gtgaacagcc aagacctttt ctagttatac ctatgacact 1200 ggggtcattt catcatttct tttcatggct tcctcctggc tccatatgaa cactcttaga 1260 attaatatta gctgaataat ttgaatacac agtagacact gagttgggtt tctgaggaat 1320 acaaaaccta tatgacagtc aggaatattc tcctcccaca tacatctagc atgatatgaa 1380 tgcaaggtat cttatgaaga aaaatcatta attatgccga tactctactt gcttacttca 1440 taacagcatc tatctatcta tacttaagta ctgaatatat ctttacaggc aatgaataga 1500 agaaataaag ataaaaatga gtagtctaat acaatcagcc aattacattt atgaacatct 1560 atcactaaag aggcaaagaa acttgaagac aacttttata cgtgggcaac taagaaatac 1620 ttttgaggcc tggctcagac tctattatag cacgttaggt gagaccctcc tcctgtctgg 1680 gctttcatct tctttcctcc ttccatcatt tggccttcat gaatattagc tgacatacat 1740 tgattcacta tagaagatat gagaccaaac ttgagaggat cgatttgttt ttcttttctt 1800 tctttcttct tcttcttctt cttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaaggctgc 1860 ccccaaagca ctgggaagtt tccaggccag gggtcaaatc agagttgcag ctgtggtcta 1920 taccacagcc ataacaacac cgaactgaaa ctgcacctgt gaccaaggtc tcttgtgggg 1980 atgcggattc ttaacccaat gagcaaggcc cgggattgaa cctgcatcct catggacacc 2040 atgttttgtt cttgacccgc tgagccacaa agggaattcc tagaagcacc actttaataa 2100 atttgtacca gtatcatttt tttctctaga aatattctct aaatgctact ttctgtctta 2160 aaacccttca aaaagtcctc actatctaga gaataaaatt tgcactcmtt agaattcttt 2220 gcccactgtt atgtcacccc tttgtctttc ttctcatctc catctactcg ctactccttg 2280 cacttcataa cctaaattca ctatttgatt tagttgtagt gactttgtta tcatgttcaa 2340 gaccatattc ttcctttcgt tttagcctac atctctcttt cttccttagg tctgagctgt 2400 catcacaggc ttgtcatgtc attttctcca ttatggcata aaatggtaac atctatttag 2460 ttagcatgaa atagtgacct tcgtgtggcc tgtgtatctc caatacctat tagaatttcc 2520 ccacaagaaa gctcttgaaa acctaccaag tgctaaagag accttattgt ggctaccata 2580 acttggggac tgggccagaa tgtcactgtc ccccagccaa cgtctgtact tattgaacag 2640 tttcatttcc tggatggatt ttctttatca gatggtaaat tatccacttg ttaaaatgct 2700 cctcagaatt tctggggata gataatagga agaaatcatt ttctaatcat gcagatttct 2760 tggaattcaa actcactatt gattttattt tccaaccaca caattagcat gtcattaaat 2820 actgtataaa aatagccaca gaagtggatg attatccatt cacctcctcc ttcacttctt 2880 gtcctccact ttggagaaaa ggtaagaatt tcagattcaa ttcaatgtat cctctcatcc 2940 tgatcttaaa ctacgttgag atatagaaag aacatagttg cttaaaaata tgtatttaat 3000 atatagggta tttgtgggta tttaagatag tgctgatact attttcagta cttagtttaa 3060 aaaaatagaa gtgcctgtaa agatttgata aaaatttaaa tgaccgtgtt gtatgaatct 3120 aacaaaatgt agtaatggtg actgctattt cctttagtaa aagactagtt aacaggctgt 3180 attaaaagat acatttcttg aattatatgt ctctcaaatt gattaaacat accacagcca 3240 taaaggcaaa tacatttaat ttatagcatg agtatatgaa taatcattat taagaaagtt 3300 ttagcccaca aatagtttat agatgttgca tgtcagtcaa gaaatggaga gatttgtttg 3360 ggaacatgtg ctccttaaaa tatttataaa taatattttt agaagaagag catatttgtc 3420 agaattgttt aaaatatcca aattctcaat ttaccattta tattatgata tttcaaaact 3480 attaaaatag attcataaaa tacagaatta aattaaagac aaacaaaatg tttactttgt 3540 gaaaaaaaaa aaaatcctag ggggaacaga gtttatctgg gaacaaaaaa gaaggaaaac 3600 atgatctgaa ataaagaata gtttaaaatt catggagttc ctgttgtggc tcagtggtaa 3660 tgaaccctac tagtatccat gaggacatgg gtttgatccc tggacctgct cagtgggtta 3720 aggatccagc attgctgtgg ctgtggcatg ggccagcagc tacagcttca attcaatccc 3780 tagcctagga atttcaatat gccaaaaaaa aaaaaggcaa taataaaaat cctggcttac 3840 aaatttataa ataaaattat aattataaaa taaagaacat gtaataatat cttccctact 3900 tgtaaagaat tctaataaag tactatattc tttttttcag tctctacagt aaaaaatatt 3960 tggaaatgtt tgagaatttc tgcataaagt aaaatcaata aggaataaga cagcacccat 4020 gagaaaaatc tagggcgaaa agtcttaatt tagtaaaaat cttggattga agattgcgtg 4080 tcaagggata ttggtggcac aaacattatt tttttacaaa acttttagaa atgcagtaaa 4140 atctaccatt tagtacattt tggtcaaaag tattaacata ttttatgcta tgcagccagg 4200 agaagtagcc tagagtgggg aagtagcctg gagtggggaa gtagcctgga gtggggaggt 4260 agcctggagt ggggagatag cctggagtgg taagcagcct agagtgggga ttgggcaagt 4320 gaacctgacc ttttggtaaa tcatcaagag acaagtgcac acatgttcac agagatgaaa 4380 gaaggagagt gtataatctc cacaattatg tggcacaaag gagaagagat gctgttaggt 4440 atgggggatt aagactgtga ggtggatata tatggagaag aaacaaacca atccgcccaa 4500 gaaaacatct ggataagtgg agcaagtaaa cgaaatacta aaatgaaaag ctcagtctta 4560 tggaaataaa aagctatgta taagccaatt atccatataa atcatttagt tcaataaagc 4620 taaaataaaa tatgaccttc tttgtatgca ttttatctga taactttcct ctctgtagaa 4680 ctgaggctcc aatagggctg agaccttact attttgttca ctgctaacat tccagcacat 4740 aagcaaagtc tggcaataaa aagtgctaaa taataagcac tgagaaactg ctgtacagca 4800 cagagaactc tatccaatca cttgtgataa aacatgatag aagataatat gagaaaaaga 4860 atgtttacat atgtatgact gggtcacttt gctgtagagc agaaatcgac agaacattgt 4920 aaatcaactg tacttcaatt ttaaaaaatt ttaaaaggtg ccaaataaat atttttgaat 4980 ctattaatta agctttctgt caatatttgt agcttctgta tttcaaaaga aaaaaccaac 5040 atgtactgtg aaatgagatg aaaaagattg aagtaggata aggctgttag tggaaaaaat 5100 ctgaatggct ggcaatgaaa taggaacttg acatgtaaga ttaaggagtc atagtagatg 5160 ttgaccctgg tcatatgaca aaatttctat cagacatttt tattacacct ttggtttctt 5220 ttagaggaaa taaaataaga aatatattag attgaccagt catatacatt ttttccctca 5280 tttccccatt cacaggactt gatcgccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 5340 gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 5400 ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 5460 ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 5520 ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 5580 ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 5640 gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 5700 aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 5760 tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 5820 atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 5880 ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 5940 cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 6000 ctcggcatgg acgagctgta caagtaaagc ggccggtcga gactcgatcg cccttcccaa 6060 cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggaga tccaattttt aagtgtataa tgtgttaaac 6120 tactgattct aattgtttgt gtattttaga ttcacagtcc caaggctcat ttcaggcccc 6180 tcagtcctca cagtctgttc atgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac 6240 ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 6300 ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 6360 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 6420 atgtatctta acgcgtaaat tgatatccag aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc 6480 caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg 6540 gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg 6600 gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc 6660 agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga 6720 tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc caatagcagc 6780 tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca 6840 ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca 6900 cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga 6960 cctgcagcca atatgggatc ggccattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 7020 gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 7080 gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 7140 tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 7200 ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 7260 ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 7320 ttatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 7380 ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 7440 gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 7500 aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 7560 ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 7620 ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 7680 ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 7740 cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag gggatcggtc gaccgcatat 7800 ggaggttccc aggttagggg cctaatcaga gctgtagccg ctggcctaca ccagagccac 7860 agcaatgtgg gagtgggatc tgagccgcat ctgcgaccta caccacaact catggcaacg 7920 ccaaatcctt aacccactga gcaaggccag gaatcgaacc cacaaactca tggttcctag 7980 tcggatttgt taaccactgg gccacgacag gaactctgat tactgtattt tcaatgactg 8040 ttattctttt caaatcagat gggttattag agatcctttg ttattgtaag aagggtaata 8100 gagagaaatt agtatctgtt acaggcctct gttgttacta tgctcactca ttttctttcc 8160 ttttatgact gcatcatctg ttcttctttt atacaataga tttattcaga atagtgtaac 8220 ataaatttcc agcaattaaa ataatattat caaacaaggt gtccacatta acctataaaa 8280 tgtcatttgc tgacttatat tgacaaataa gaattgttca ttaaaactca atcttatttt 8340 tatttttcta aaggaatcta ttactcacat cagcaaggta aagacttcat ccttaaatac 8400 gcctattttc aaaacttcct gttcacttgt tacaaatagc aacatttatt ttggtgtgat 8460 ctgttttcta ggagaaaatt gagaagctaa agcgggagga acaacaacaa acagaggtaa 8520 tttgttcatg atgagcatat tttgaaaatt attattaaac atgatatatg caaaatgttt 8580 atatgttcac tcaaaaacat ggtattaata taaatcagtg taagaaatta aactatgaca 8640 aagtgaaaag attttaaaga catagacaca tttaaataca taatcaactt ccagagtaaa 8700 gaataagtac ctgtgaataa ctattgattt attcatttta ccaacagtat acctgttttc 8760 agtaagtgca cttaatggga acatttccgg ttcggggctg tgatcccctt gatgaaagag 8820 tagggaggtg gtgcaccacg aatcctgatt ggatcctata tcagctgtat aaccctggtc 8880 ccaagtttct ctgtacctca atttcttctt ctgtaaaatt gagaaaattc ataagccaat 8940 agggtggatg agctggcaca cagtgactat ccaatgattt tacgttaaca ttctgtagct 9000 tttatactca tttatgaatg tgtgaaggtc ttaaaaaaat ttccattaca cagttgagaa 9060 aagtaagata cagaacaatt gagtacacaa ttgtgtgaca acttgcatag ttattaataa 9120 gcagggcttg cttaaaaaca aggatttgag gatgaaataa aattctttaa ttaaattact 9180 cttgtggtaa catatttatc caatcatgat atttaagctt tcctgtttta ccaatgaagt 9240 tggattattt ggtacttacc ccaaatattt tctaaatcaa aatgaattta caaatttatg 9300 cctctttaaa aactcaagat taccacttta taccaaggga agtagtgctg gaagtttgcc 9360 attaagtacc tccttgaatt aaaaacacaa aattaagatt taaacaatat aaatcttgga 9420 gttatccaag ccttttttgg gaagaactct tccttcatta tatgaaaaca atttggtcta 9480 ttatcaacac attgttgtaa agtctgtacc ctctgaagac caaagtaagt agctacagct 9540 ccgcaggcag ctcaggaaaa ggtgaaacaa atcttgacat ctccaaacac tgatttccct 9600 tggctctgcg cattgcctag gaaggaaggg gttagggagc agtccctcca tgagcatttt 9660 acccagtaat cctcacatgg tatgactcct aaaccaaaag aagtgaacaa tttgttctct 9720 tttcacttaa ttatgagtgt tcaaaaaaag aggccgctaa ttcatcatga atgacagttg 9780 tagctgcatt acggactcaa cgattctttt tccttctttc caggatgaac gccagaataa 9840 aatccaccag tttccccagc ctcagcctct agcccatcct tacaccgagc ccatccctta 9900 ccccatcctt ccacaaaaca tcctgcctct tgcccaggtc cctgtggtgg tgcctcttct 9960 tcatcctgaa gtaatgaaag attccaaagc taaggagacc attgttccca agcgtaaagg 10020 aatgcccttc cctaaatctc cagcagagcc ttttgtggaa ggccagagcc taactctcac 10080 caattttgaa ggcctttctc tgcctctgct ccagtccctg atgcaccaga ttccccagcc 10140 tgttcctcag acccccatgt ttgctcctca gcccctgctg tccctgcctc aggccaaagt 10200 cctgcctgtt ccccagcaag tggtgccctt cccccagaga gatatgccct tccaggccct 10260 tctgctctac caggatcctc tacttggccc tctccgaggg ttctaccctg tgcctcaacc 10320 agttgcccca gtttacaacc ctgtaagtcc aagtttattc actgtgctgt ttcacttatg 10380 atgtttagtt gctgttagag taattaagca agaactctag cctcgag 10427

Claims (7)

1. 5' 아암(arm)으로서, 서열번호 1의 474번부터 5558번까지의 염기서열로 이루어지는, 돼지 β-카제인 게놈 DNA(porcine β-casein 게놈 DNA)의 2.65kb 프로모터, 엑손 1 및 인트론 1을 포함하는 5' 말단 단편;

   생리활성물질을 코딩하는 유전자; 및

   3' 아암으로서, 서열번호 1의 7283번부터 9908번까지의 염기서열로 이루어지는, 돼지 β-카제인 게놈 DNA의 엑손 5, 6 및 7을 포함하는 3' 말단 단편을 포함하는,

   생리활성물질을 생산하기 위한 넉-인(knock-in) 벡터.
2. 제1항에 있어서, 5' 말단에 핵 배치 신호(NLS)가 추가로 연결되어 있는 넉-인 벡터.
3. 제1항에 있어서, 생리활성물질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 polyA 신호가 추가로 연결되어 있는 넉-인 벡터.
4. 제1항에 있어서, 양성 선별마커(positive selectable marker)와 음성 선별마커(negative selectable marker)를 각각 또는 함께 포함하는 넉-인 벡터.
5. 제1항에 있어서, 생리활성물질이 사람 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 또는 녹색형광단백질(GFP)인 넉-인 벡터.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 넉-인 벡터를 세포 내로 도입하여 생리활성물질을 발현시키는 단계를 포함하는, 생리활성물질의 생산방법.
7. 제5항에 있어서, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 염기서열을 갖는 것인 넉-인 벡터.

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