JP2000316583A - 脳で特異的に発現するベクター - Google Patents

脳で特異的に発現するベクター

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Abstract

(57)【要約】 【課題】脳においてのみ発現しているP/Q-type Ca chan
nel遺伝子の上流にある転写制御配列を用いて、外来遺
伝子を脳特異的に発現させることにある。 【解決手段】 P/Q-type Ca channel上流配列の下流に
アルカリフォスファターゼ遺伝子をつなぐことにより、
アルカリフォスファターゼ遺伝子を神経細胞でのみ発現
させることができた。また、P/Q-type Ca channel上流
配列の下流にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入したDNA
を導入したトランスジェニックマウスを作製することに
より、 β-ガラクトシダーゼ遺伝子を脳でのみ発現させ
ることが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、P/Q-type Ca chan
nel a1A遺伝子上流配列を用いて外来遺伝子を神経細
胞、特に脳の神経細胞に発現させるDNAに関する。
【0002】
【従来の技術】脳内の局所で、疾患に関連した遺伝子を
発現させる遺伝子治療、例えばアルツハイマー病の治療
のために、脳内の局所で神経細胞を増殖させるNGFを産
生する遺伝子を発現させる、又はアセチルコリン合成に
関与する遺伝子を発現させる、あるいはパーキンソン病
の治療のために脳内の局所でセロトニン合成に関与する
遺伝子を発現させる等の遺伝子治療は、これら疾病の有
効な治療手段となりうる。また、パーキンソン病・痴呆
等脳の特定の領域が傷害される疾患のモデル動物を作製
においても、脳の局所で神経細胞を傷害する物質を産生
する遺伝子を発現させ、神経細胞を傷害する方法は、外
科的な方法(Perese, D.A. et. Al. BrainRes. 494:285
-293, 1989, Naritomi, H. Alzheimer Dis. Assoc. Dis
ord. 5:103-111, 1991)に代わる有力な方法であると考
えられる。一方で遺伝子の発現は、発現する場所(組
織)・時期(発生段階)が厳密に制御されており、これ
らの発現制御は、遺伝子上流の転写制御配列、遺伝子近
傍のエンハンサー・サイレンサー配列等の制御配列によ
り行われていると考えられている。しかしながら、これ
までに組織特に脳に強く発現させる配列は報告されてい
るものの(Scott M.R. et. Al. Protein Sci. 1992 Au
g;1:986-997, 1992)、脳に特異的に発現させる配列が
明らかにされた例は少ない。そこで、脳でのみ発現して
いる遺伝子産物の転写制御配列を、外来遺伝子の上流に
挿入し、外来遺伝子を脳に特異的に発現させることを考
えた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、脳に
おいてのみ発現している遺伝子の上流にある転写制御配
列を用いて、外来遺伝子を脳特異的に発現させることに
ある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、P/Q-type
Ca channel a1A遺伝子が神経細胞、特に脳の神経細胞
においてのみ発現していることに着目し、その転写制御
配列を用いて脳特異的に発現するベクターを作製するこ
とを考えた。そして、マウスよりP/Q-type Cachannel a
1A遺伝子上流配列をクローニングし、塩基配列決定、構
造決定を行ったところ、CAAT box様配列・NF1・NF-kB・
AP1・E1A・AP2・E2F・Sp1の配列が見出され(配列番号
1)、この配列がP/Q-type Ca channel a1A遺伝子の転
写制御を担っていることが予想された。そこで、 P/Q-t
ype Ca channel a1A遺伝子上流配列及びその下流にアル
カリフォスファターゼ遺伝子を含むベクターを構築した
ところ、アルカリフォスファターゼ遺伝子が培養繊維芽
細胞には発現せず、培養神経細胞で発現させることが可
能であることを見出した。更に本発明者らは、 P/Q-typ
e Ca channel a1A遺伝子の転写開始点より上流6.3 kbの
配列(配列番号1)、上流3.0 kb の配列(配列番号
2)、及び上流1.5 kb の配列(配列番号3)の下流にβ
-ガラクトシダーゼ遺伝子を組込んだDNAを導入したトラ
ンスジェニックマウスを作製したところ、β-ガラクト
シダーゼが脳特異的に発現されることを見出した。すな
わち、P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列が、そ
れにより転写制御を受ける外来遺伝子を神経細胞、特に
脳に特異的に発現させることを見出し本発明を完成する
に到った。
【0005】すなわち本発明は、配列番号1に記載の塩
基配列からなるDNA、配列番号2に記載の塩基配列から
なるDNA、配列番号3に記載の塩基配列からなるDNA、な
らびに配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ該DNA
の下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させる
DNAである。ここでストリンジェントな条件の一例は、6
5℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで6
5℃で1時間0.1 X SSC中での洗浄である。また別法とし
てストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42℃
4 X SSCである。また本発明には、配列番号1に記載さ
れた塩基配列の一部、すなわち配列番号1に記載された
塩基配列中の連続した10塩基、好ましくは15塩基、
更に好ましくは25塩基からなるDNAをプライマーとし
て、genomic DNAからPCRにより増幅されるDNAで、かつ
該DNAの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現
させるDNAも含まれるものである。更に本発明には、配
列番号1に記載された塩基配列の一部、すなわち配列番
号1に記載された塩基配列中の連続した8塩基、好まし
くは15塩基、更に好ましくは25塩基からなるDNA、
あるいはそれらDNAの組合せから成り、かつ該DNAの下流
につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAも
含まれるものである。すなわち配列番号1に記載された
塩基配列より、転写制御因子の結合配列(多くは8〜1
2塩基からなる)を含み下流につながれた外来遺伝子を
神経細胞に発現させるのに必要な塩基配列を特定し、必
要な塩基配列を組み合わせて、下流につながれた外来遺
伝子を神経細胞に発現させることができるよう構築した
DNAも含まれるものである。更に本発明は、配列番号4
に記載のウサギP/Q-type Ca channel a1Aサブユニット
をコードするDNA、あるいは配列番号5に記載のウサギP
/Q-type Ca channela1AサブユニットをコードするDNAの
HindIII-NotIフラグメント、あるいはその一部、すなわ
ち配列番号4あるいは配列番号5に記載された塩基配列
中の連続した50塩基、好ましくは100塩基、更に好
ましくは200塩基からなるDNAを用い、下流につなが
れた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAをクローニ
ングする方法に関する。すなわちgenomic DNAより、配
列番号4・配列番号5に記載のP/Q-type Ca channel a1
A遺伝子塩基配列あるいはその一部からなるDNAとハイブ
リダイズするDNAをクローニングし、塩基配列を決定し
てP/Q-type Ca channela1A遺伝子の上流配列を含むクロ
ーンを選択し、その上流配列の後ろに、P/Q-type Ca ch
annel a1A遺伝子に代えて適当な外来遺伝子を接続し
て、外来遺伝子を神経細胞に発現させる塩基配列を選び
出す方法に関する。また本発明は、該クローニング方法
によりクローニングされたDNAにも関する。
【0006】「外来遺伝子」とは、 P/Q-type Ca chann
el a1A遺伝子上流配列を使って、神経細胞、特に脳の神
経細胞で発現させたい遺伝子である。例えば脳神経系疾
患の遺伝子治療に当たって、例えば神経細胞増殖に関与
するNGF遺伝子、アポトーシスを抑制するp53遺伝子等、
脳に発現させて脳神経系疾患の治療を目的とする遺伝子
である。また例えば脳疾患のモデル動物作製に当たっ
て、例えばジフテリア毒素等、脳に発現させて神経細胞
に細胞死をもたらす遺伝子である。 また「外来遺伝
子」とは、P/Q-type Ca channel a1A遺伝子上流配列を
含むクローンより、神経細胞特に脳の神経細胞で下流に
つながれた外来遺伝子を発現させるクローンを選択する
に当たっては、検出の容易なβ-ガラクトシダーゼ・分
泌型アルカリフォスファターゼ等の遺伝子である。これ
ら「外来遺伝子」は目的に応じて自由に選択することが
でき、特に限定されるものではない。「下流につながれ
た外来遺伝子を神経細胞に発現させる」とは、該DNAを
適当な培養神経細胞株(例えばIMR32)にtransfection
して、その下流につながれた外来遺伝子を発現させるこ
とを指す。或いは、「下流につながれた外来遺伝子を神
経細胞に発現させる」とは、該DNAをトランスジェニッ
クマウスに導入して、その下流につながれた外来遺伝子
を神経細胞、好ましくは脳の神経細胞に発現させること
を指す。また本発明には、以上に述べた下流につながれ
た外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAを含むベクタ
ー、そのDNAにより形質転換した細胞、そのDNAを導入し
たトランスジェニックマウスを含むものである。ここで
ベクターとしては、例えばpBlueScript等が挙げられる
が、本発明はこれに限られるものではない。
【0007】
【発明の実施の形態】以下に本発明について、1.転写
制御配列をクローニングする方法、2.神経細胞で発現
させるためのベクター構築法、3.培養神経細胞で発現
させる方法、4.トランスジェニックマウスの作製法を
具体的に説明する。尚、以下に記載する操作は適当なマ
ニュアル、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H
arbor, NY等に記載の方法に従って行うことができる。
【0008】1.転写制御配列のクローニング:配列番
号4に記載のP/Q-type Ca channel a1AサブユニットcDN
Aプローブ、例えばpSPCBI-2(Mori, Y et. al., Natur
e, 350:398-402, 1991)HindIII-NotIフラグメント(配
列番号5)・SalI-HincIIフラグメントをプローブとし
て、マウス又はマウス以外の哺乳類のgenomic DNAライ
ブラリーをスクリーニングし、 塩基配列を調べてP/Q-t
ype Ca channel a1Aサブユニットのcoding領域及びその
上流配列を含むクローンを選択する。場合によっては、
得られたクローンをプローブとして、更に上流配列を含
むクローンを拾い上げても良い。また別法として、配列
番号1に記載の塩基配列を元にPCRプライマーを設定
し、マウスgenomic DNAを鋳型として、PCR を行いP/Q-t
ype Ca channel上流領域を増幅する。この場合、PCRプ
ライマーに制限酵素切断配列等の人工配列を付加して、
転写制御領域を含むと思われるDNAを作製しても良い。
あるいは、配列番号1に記載の塩基配列を元に合成した
DNAをプローブとして、或いは配列番号1に記載の塩基
配列を元にPCRプライマーを設定し、マウスgenomic DNA
を鋳型としたPCRで得られたDNAをプローブとして、マウ
ス又はマウス以外の哺乳類のgenomic DNA libraryよ
り、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするクロ
ーンを選択して、転写制御領域を含むと思われるDNAを
得ても良い。ここでストリンジェントな条件の一例は、
65℃ 4 x SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで
65℃で1時間0.1 X SSC中での洗浄である。また別法と
してストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド中42
℃ 4 X SSCである。更に、配列番号1に記載の塩基配列
中の、例えばNF1等の転写因子が結合する塩基配列の周
辺配列をプライマーとして設定し、マウス又はマウス以
外の哺乳類のgenomic DNAを鋳型としたPCRを行って、転
写制御配列を含むと思われるDNAをクローニングするこ
とも許される。場合によっては、配列番号1に記載の塩
基配列中の一部で転写制御に関与していると思われる配
列、例えばNF1等の転写因子が結合する塩基配列の周辺
配列、あるいはそれら複数個を組み合わせた配列を、DN
A合成によりあるいはDNA組換え技術により再構成して、
転写制御領域を作製しても良い。
【0009】2.ベクターの構築:1でクローニングさ
れたDNAに適当な制限酵素切断部位がある場合には制限
酵素で切断し、無い場合はPCR primerに適当な制限酵素
サイトを付加してPCRを行って制限酵素サイトを組み込
んだ後に制限酵素で切断して、転写制御領域を含むと思
われるDNAを得る。得られた、転写制御配列を含むと思
われるDNAを、適当なレポーター遺伝子、例えばCAT遺伝
子・β-ガラクトシダーゼ遺伝子・アルカリフォスファ
ターゼ遺伝子などの上流に挿入する。好ましくは、哺乳
類細胞で発現し5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-gala
ctopyranoside (X-gal:宝酒造社製)を基質した染色に
より、或いはortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranosi
de(ONPG)を基質とした細胞ホモジェネートの酵素活性
測定により検出可能なβ-ガラクトシダーゼ遺伝子、哺
乳類細胞で発現し細胞外に分泌されて培養上清の酵素活
性測定により検出可能な分泌型アルカリフォスファター
ゼ例えばPLAP(Goto, M. et. al., Mol. Pharmacol. 4
9:860-873, 1996)が望ましい。またこの場合、レポー
ター遺伝子の上流に既知のプロモーター配列、例えばTK
プロモーター・アデノウイルスE1bプロモーター等が存
在し、挿入した該転写制御配列がそのプロモーター活性
に影響を与えて、神経細胞での発現を増強させるように
転写制御することも許される。ベクターには更に、薬剤
耐性等の選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子
を含んでも良い。
【0010】3.培養神経細胞での発現:2で構築され
た該転写制御配列及びレポーター遺伝子を含むDNAを、
培養神経細胞、例えばIMR32にtransfectionする。trans
fectionの方法としては、DEAEデキストラン法・リン酸
カルシウム法・リポフェクチン法等が挙げられるが、本
発明はこれに限られるものではない。transfectionされ
た細胞は適当な培地中で培養され、導入されたレポータ
ー遺伝子の発現は、レポーター遺伝子産物に対応した適
当な方法により測定される。例えば、レポーター遺伝子
がβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の場合は、X-galを基質と
して細胞を染色することにより、或いはONPGを基質とし
て細胞ホモジェネート中の酵素活性を測定することによ
り測定する。また、レポーター遺伝子が分泌型アルカリ
フォスファターゼPLAP遺伝子の場合は、培養上清中のア
ルカリフォスファターゼ活性をルミステイン(住友化学
社製)を基質として化学発光を測定することにより測定
する。導入されたベクターに薬剤耐性等の選択マーカ
ー、例えばネオマイシン耐性遺伝子が含まれる場合は、
transfection後対応する薬剤、即ちネオマイシンを含む
培地中で更に培養を続け、導入された遺伝子を構成的に
発現するクローンを選択し、導入された遺伝子を構成的
に発現する細胞株を樹立しても良い。この様にして得ら
れた形質転換細胞は、例えば遺伝子の神経細胞特異的な
発現に影響を与える薬剤のスクリーニングに使用するこ
とができる。
【0011】4.トランスジェニックマウスの作製:
以下にトランスジェニックマウスの作製法について述べ
るが本発明はこれに限られるものではない。トランスジ
ェニックマウスは、遺伝子導入に用いるマウス受精卵の
採取、2で構築された該転写制御配列及びレポーター遺
伝子を含むベクターからの直鎖状DNAの精製、精製したD
NAのマウス受精卵雄生前核への注入(マイクロインジェ
クション)、DNAを導入したマウス卵(以下、操作卵)
の培養、精管結紮雄マウスと正常雌マウスとの交配によ
る偽妊娠マウスへの操作卵の移植、偽妊娠マウスの出産
と産仔の育成、PCR法による遺伝子導入マウスの選抜、
導入遺伝子をもつマウスの系統樹立、のステップを経て
作製する(Hong, B.L.M., A laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, New York, 1986)。また、操作卵はDNAをマウスES細
胞にtransfectionして、その後薬剤耐性マーカーにより
選択したクローンを注入したマウス卵(以下、操作卵)
を使っても良い。受精卵は、雌マウスに過剰排卵を誘発
させるため、例えば妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン(pr
egnant mare's serum gonadotropin,PMSG:セロトロピ
ン: 帝国臓器, 東京)5国際単位とヒト絨毛性生殖腺刺
激ホルモン(human chorionic gonadotropin, hCG:ゴ
ナトロピン:帝国臓器,東京)2.5国際単位をそれぞれ腹
腔内投与して、卵管―子宮還流法により採取する。ここ
で、マウス卵培養用培地は、例えばBrinster' BMOC-3培
地(Gibco BRL)を用いることが望ましい。導入するDNA
は、1で構築された該転写制御配列及びレポーター遺伝
子を含むベクターを制限酵素で切断し、目的とする該転
写制御配列及びレポーター遺伝子を含む直鎖状DNAを、
例えばアガロース電気泳動・超遠心等により精製して用
いる。マイクロインジェクションは、例えばノマルスキ
ー微分干渉装置を取り付けた倒立顕微鏡(ダイアフォト
TMD:日本光学工業,東京)下で、マイクロマニピュレー
タ(粗動電動マニピュレータに懸架式ジョイスティック
3次元油圧マイクロマニピュレータを装着:ナリシゲ,東
京)、マイクロインジェクター(ナリシゲ,東京)、イ
ンジェクションピペットおよびホールディングピペット
を用いて行う。インジェクション用ディッシュには、例
えば(Falcon 3002:Becton Dickinson Labware, New J
ersey,U.S.A.)に培地5μlの液滴およびDNA溶液0.5μl
の液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用い
る。偽妊娠マウスへの操作卵移植は、ます、マウスを50
mg/kg体重のペントバルビタールナトリウム(Nembuta
l:Abbott Laboratories, Illinois,U.S.A.)にて全身
麻酔を行い、両けん部を約1cm切開して卵巣および卵管
を露出し、実体顕微鏡下で卵巣嚢をピンセットで切開し
卵管采を露出させる。次に卵管あたり7〜8個の操作卵を
卵管采に送り込む。この時、操作卵とともに入れた微小
気泡によって、卵管内に移植されたことを確認する。こ
のあと卵管および卵巣を腹腔に戻し両切開部を縫合し、
マウスを麻酔から覚醒させる。多くの場合、移植後20日
目には仔マウスが得られる。マウスの尾から抽出したDN
Aを鋳型として導入遺伝子をPCRで増幅できることによ
り、導入遺伝子を確認する。更に、導入遺伝子を持つこ
とが確認されたマウスの各組織で発現したβ-ガラクト
シダーゼの活性は、マウスの各組織を適当な緩衝液、例
えば0.25M Tris-HClbuffer pH8.0でホモゲナイズした
後、適当な基質、例えばortho-nitrophenyl-β-D-galac
topyranoside(ONPG)を基質として測定し、組織特異的
な発現を確認する。また、 各組織で発現したβ-ガラク
トシダーゼ活性を、X-galによる組織染色法により検出
しても良い。マウスの組織を適当な固定液、例えば0.5%
paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, 0.1 M リン酸
bufferで固定し、OCT compound(Sakura FineTek社製)
に包埋後切片に切断し、染色液例えば0.5 mg/ml X-gal,
5 mM フェロシアン化カリウム, 5 mMフェロシアン化カ
リウム, 1 mM MgCl2, 0.1 Mリン酸bufferに37℃一晩浸
して、nuclear fast red(VECTOR社製)で染色・脱水
後、顕微鏡で観察して、組織特異的な発現を確認する。
【0012】
【発明の効果】P/Q-type Ca channel a1A遺伝子の上流
にある転写制御配列を用いることにより、外来遺伝子を
神経細胞、特に脳の神経細胞に特異的に発現させること
が可能となった。
【0013】
【実施例】以下に、本発明の実施について具体的に記す
が、本発明はこれに限られるものではない。 実施例1 P/Q-type Ca channel上流配列のクローニン
グ TT2細胞のgenomic DNAライブラリー約9 x 105クローン
の組換えファージをウサギa1AサブユニットcDNAプロー
ブ、pSPCBI-2(Mori, Y et. al., Nature, 350:398-40
2, 1991)のHindIII-NotIフラグメント・SalI-HincIIフ
ラグメントをプローブとしてスクリーニングし、13.5-k
bのクローンTT2-5を分離し塩基配列を決定した。続け
て、CBA mouse genomic DNAライブラリーをZAP express
vector(Stratagene社製)に構築し、CBA mouse genom
ic DNAライブラリーより、TT2-5のBglII-ApaIフラグメ
ントをプローブとしてスクリーニングして、8.4-kbのク
ローンCBA-104を分離した。CBA-104のBglII-EcoRIフラ
グメント(8,397 bp)をBluescript-IIKS-(Stratagene
社製)にサブクローニングしpBS104とした。図1にpBS1
04の制限酵素地図を示した。また、配列番号1にはBglI
I siteより翻訳開始点までの配列を、配列番号2にはEc
oRV siteより転写開始点までの配列を、配列番号3には
StuI siteより転写開始点までの配列を載せた。
【0014】実施例2 P/Q-type Ca channel上流配列
による神経細胞での発現調節 P/Q-type Ca channel上流配列の下流にPLAP遺伝子を含
むpa1A6.3-PLAP は以下のように作製した。PCR法を用い
てpBS104内にあるNotI siteをHindIII siteに、また翻
訳開始配列をHindIII siteに改変したベクター、pBS104
HHを構築した。pBS104HHベクターよりHindIIIフラグメ
ントを得、このHindIIIフラグメントを、胎盤性アリカ
リフォスファターゼ遺伝子(PLAP)をレポーター遺伝子
として含むプラスミドpUG-BGH-PLAP(Goto, M. et. a
l., Mol.Pharmacol. 49:860-873, 1996)のHindIII sit
eに導入してpa1A6.3-PLAPを構築した。また、 P/Q-type
Ca channel転写開始点より上流3kbから 6 kbの間にあ
る配列の下流にTKプロモーター、続いてPLAP遺伝子を含
むp6-3a1ATK-PLAP を以下のように作製した。最初にp6-
3BS104をpBS104よりEcoRV-EcoRV断片を取り除くことに
より作製した。次にTKプロモーターより転写されるPLAP
遺伝子を含むpTK-PLAP(Goto, M. et. al., Mol.Pharma
col. 49:860-873, 1996)のXbaI siteにXhoI linkerを
挿入し(pTK-PLAPI) 、p6-3BS104のSpeI-XhoI断片をpT
K-PLAPIのSpeI-XhoI siteに挿入して、p6-3a1ATK-PLAP
を作製した。神経細胞株IMR32、副腎髄質細胞株PC12と
線維芽細胞株NIH3T3にpa1A6.3-PLAP又はp6-3a1ATK-PLAP
をDEAE-デキストラン法により遺伝子導入した。遺伝子
導入24時間後に培地交換を行い、培地交換24時間後に培
養上清中のアルカリフォスファターゼ活性(Goto, M. e
t. al., Mol. Pharmacol. 49:860-873, 1996)を測定し
た。図2には、それぞれの細胞について、 pa1A6.3-PLA
P を導入した細胞の培養上清中のPLAP活性値を、pTK-PL
APを導入した時のPLAP活性値で割った値を示した。図2
に示すように、IMR32ではTKプロモーター以上の、PC12
ではTKプロモーターと同等のPLAPの活性が認められた
が、 NIH3T3ではPLAP活性はほとんど認められなかっ
た。この結果より、 P/Q-type Ca channel上流配列が、
神経細胞においてのみプロモーター活性を持つことが明
らかとなった。図3には同様に、それぞれの細胞につい
て、 p6-3a1ATK-PLAP を導入した細胞の培養上清中のPL
AP活性値を、 pTK-PLAPを導入した時のPLAP活性値で割
った値を示した。図3に示すように、PC12ではTKプロモ
ーター単独と比較して約2倍のPLAP活性上昇が認められ
たが、 NIH3T3ではPLAP活性の上昇は認められなかっ
た。 この結果より、P/Q-type Ca channel上流3kbから6
kbの間にある配列が、神経細胞においてのみプロモー
ター活性を上昇させる活性を有することが明らかとなっ
た。
【0015】実施例3 トランスジェニックマウスに導
入するベクターの構築 pBS104をHincIIで切断しXhoI siteを導入してpBS104Xh
6.3を得た。pBS104Xh6.3のXhoI siteにNeomycin耐性遺
伝子を導入し、更にEcoRV-BamHI siteにβ-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を導入してpa1A6.3-lacZを作製した。 a1A
サブユニット遺伝子の翻訳開始siteの構造が保たれるよ
うに、β-ガラクトシダーゼ遺伝子はP/Q-type Ca chann
el a1Aサブユニット遺伝子の第一エクソンの中央から接
続されている。pBS104Xh6.3をNot1/EcoRVで切断しBglII
siteを導入後再びligationしてpBS104Xh3.0を得た。pB
S104Xh3.0のXhoI siteにNeomycin耐性遺伝子を導入し、
更にEcoRV-BamHI siteにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を
導入してpa1A3.0-lacZを作製した。
【0016】実施例4 トランスジェニックマウスの作
製 pa1A6.3-lacZをNotI/BamHIで切断してa1A6.3-lacZ(配
列番号1)を、 pa1A3.0-lacZをBglII/BamHIで切断して
a1A3.0-lacZ(配列番号2)を、 pa1A3.0-lacZをStuI/B
amHIで切断してa1A1.5-lacZ(配列番号3)を、 pa1A3.
0-lacZをPstI/BamHIで切断してa1A0.5-lacZを作製し
た。それぞれa1A6.3-lacZ・a1A3.0-lacZ・a1A1.5-lacZ
・a1A0.5-lacZを、ICRマウスの受精卵の雄生前核に注入
し(Hong, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York, 1986)、擬妊娠させたICRマウスに移植して、妊
娠・出産させた。導入した遺伝子を持っているかどうか
は、出産したマウスの尾より抽出したDNAよりβ-ガラク
トシダーゼ遺伝子をPCRで増幅することにより確かめ
た。また、挿入されたコピー数・DNA再配列の有無は、
β-ガラクトシダーゼ遺伝子をプローブとしたSouthern
blot解析により調べた。a1A6.3-lacZ・a1A3.0-lacZ・a1
A1.5-lacZ・a1A0.5-lacZそれぞれのb-ガラクトシダーゼ
遺伝子を持ったマウスより、3系統、2系統、7系統、
4系統のトランスジェニックマウスを樹立した。また、
それぞれのトランスジェニックマウスは、2〜30コピ
ーの導入遺伝子を持ち(表1)、導入された位置で DNA
再配列は起こって異なかった。
【0017】実施例5 発現したβ-ガラクトシダーゼ
の検出 トランスジェニックマウスの各組織で発現したβ-ガラ
クトシダーゼの活性は、10週齢マウスの各組織を0.25M
Tris-HCl buffer pH8.0でホモゲナイズした後、ortho-n
itrophenyl-b-D-galactopyranoside(ONPG)を基質とし
て測定した。その結果、元のICRマウス・ a1A0.5-lacZ
を導入したマウスでは、何れの臓器にも発現は観察され
なかった。これに対しa1A1.5-lacZ・a1A3.0-lacZ・a1A
6.3-lacZを導入したマウスではそれぞれ1/2・3/7・3/4
のマウスで脳に発現が見られた。また、これらのマウス
の心臓・脾臓・肺・肝臓・腎臓には発現が見られなかっ
た(表1)。
【表1】P/Q-type Ca channel上流配列により転写制御
を受けるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の各臓器における
発現 トランスジェニックマウスの脳で発現したβ-ガラクト
シダーゼは、X-galによる染色法により検出した。具体
的には、10週齢マウスの脳を固定液(0.5% paraformald
ehyde, 2% glutaraldehyde, 0.1 M リン酸buffer)で固
定し、OCT compound(Sakura FineTek社製)に包埋後、
15 mmの厚さの切片に切断した。切片は染色液(0.5 mg/
ml X-gal, 5 mM フェロシアン化カリウム, 5 mMフェロ
シアン化カリウム, 1 mM MgCl2, 0.1 Mリン酸buffer)
に37℃一晩浸し、nuclear fast red(VECTOR社製)で染
色・脱水後、顕微鏡で観察した。その結果、a1A1.5-lac
Zを導入したマウスでは、嗅球、大脳皮質、海馬でβ-ガ
ラクトシダーゼの活性が検出された。a1A3.0-lacZを導
入したマウスでは、嗅球、大脳皮質、扁桃核、海馬、手
綱部、中隔、黒質、後四丘体、橋、小脳でb-ガラクトシ
ダーゼの活性が検出された。また、a1A6.3-lacZを導入
したマウスでは、嗅球、大脳皮質、海馬、後四丘体、小
脳でβ-ガラクトシダーゼの活性が検出された。(表
2)
【表2】P/Q-type Ca channel上流配列により転写制御
を受けるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の各臓器における
発現
【0018】
【配列表】 <110> Eisai Co., Ltd. <120> Brain specific expression vector <130> P/Q type Ca channel upstream 6.3kb <141> <160>3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210>1 <211>6542 <212>DNA <213>mouse <220> <221>CAAT signal <222>(6208)...(6211) <220> <221>protein bind <222>(5426)...(5437) <223>NF1 <220> <221>protein bind <222>(5527)...(5536) <223>NF-kB <220> <221>protein bind <222>(5633)...(5639) <223>AP1 <220> <221>protein bind <222>(6027)...(6033) <223>E1A <220> <221>protein bind <222>(6175)...(6182) <223>AP2 <220> <221>protein bind <222>(6213)...(6221) <223>E2F <220> <221>protein bind <222>(6224)...(6230) <223>SP1 <400>1 gatctaccta tagtagccac ttgagattct gtgagaaatt aattccttca tcttaaagaa 60 tgtctcctta tctgcaaaat caatgcaccc agagcccatc actgtttagg gcaactgagt 120 taaattctct gtggaaaaga gttattattt tgctgggcac ggcacacatc tttgatccca 180 gtattctggt gcaggaccag tcagatttct gtgagctcaa gaccagcagc ttctgcatag 240 agagtttcag gtcagcaggg ctgcacagtg agaccctatc tcaaaacaaa caaaaacgaa 300 catagaaaca aactgaaaag attgtggaga gaggggagtt gggatcatcc tctagggact 360 ttacagaagg acagttaggt ctgaggagat ggccagaggc agtaaagggc tggagttcaa 420 tcccagagcc cgtgtaaaaa gctgagtgtt tggtagtgtg tgctgccaat ctcagctctg 480 gggagatgga gtcaaggagg cccctggagc ttgctggcta cctagtgaga tccagccaat 540 gagagatgct atgaaaaaca acattaaata ataaaagtga tagttcctct ggcacacaca 600 gatgtgcaca cacttacgtg gacacacatg tatgtgcact tacacattca tgaacaaggg 660 cacacacaca tgtgcaccca aacatacatg aacatggaca cacacacaca cacacacata 720 cacacacaca cacacacacg aattggggct cagcacttgt ttgttgttgt tgtttgcttg 780 tttgtttttt ctttttgaag gcaaagtctc atataccagg ctagccttga gcatctgtct 840 cctgagtgct gggatcacat gtgagcagca ttacactggc tttatgtagt gctgaggaca 900 gaacctagga gcttgtgcag gctaggaaag cactctacca actaagcaac attacaacag 960 cgtagcccat gcagcccatt tgtctgctat ggaggcatgg gtgggcgagg gccctggggg 1020 acaatttgtt tttcaccatg gaggaaggct gaggttggtg ttggggcctc ctggtcagag 1080 ttgaagaggg gaatccctac aaatgaccat gagaaatagt gttgctaaac cagcacccag 1140 cagacttagc acccagaacc ccgcagagat acagaacatt ttattgaagt ctctctctct 1200 ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctcacaca cacacacaca cacacacaca 1260 cacacacaca cacacacaca cacacacacc attgcataca agcaccatat gaagctcaat 1320 taaatgatta agcaacaggc tgggagcatg acccagctga cgggacacat tctcagtatg 1380 caagaagctc tgggttccac cccaagaact gggcctggca gctcatatct gtaacctcag 1440 cactcaggag gcagaggcag gaagatcaga aacttaaggc catctttgat tatctaatga 1500 gtttaaggcc agcctagata catgagtcct gcttcaaaaa agtaaataaa acacacgaga 1560 gctgtaagaa accaagcatt ctgccttgag tccgtgagtc tcacagagaa gagcctgaga 1620 caggacacca gctgagaatt taaggacagt ctgggctaca tgagacccta gctcacaaaa 1680 agagcatttt attttattat taacttatgg ttactgtgca tgtatgacac atgttcatgg 1740 tgtgtacaca gggtggcacg catgtggagg ccagagaaca atttgggggg tgacttctct 1800 ccttccatcc ctatgtggaa ggtcccagga aactgactca ggcattaagg tgagttttgc 1860 agggcaagtg cctttgctgc tcaaccatct cactagccca aaggtttttg cttttaaatg 1920 aacaaacttt gcaaaataaa catatttgtg caattgtcat ccacagagag atgtttgtaa 1980 aagatccctc taggccagtc acttccttac caccaatgtg tggtggccac ttcgccctcc 2040 caaatgtcag caaacttctg ctcagatttg gactttatag aatagaaatt acacacagct 2100 gggctgacaa gatggcttag tcaggaaaga tgcttgctgc acacaactga ctaaatttgt 2160 ttcccaggac ccacatggta agaggagaaa accgatttca gttaaggttt gctctagact 2220 ctaaacgtgc atctcagcag gtgcatgccc gtcacacaga cagcaccctt gggcatgttc 2280 gtccatggac ttatgtcctc tttcttctta gacaaacacc cagaagggtc agcaggatag 2340 ctcatcaggg aagggtgctt gctgggagag cgatgtgacc cacattctat ccctggcacc 2400 atgtgaaggt gggatgagga agccaacatc acaaagtcat cttctggtgc tcacacacaa 2460 acagcaatgg taataaataa aagatgcaga tccgggctga gacaccgctc tcagcctgtt 2520 tggatgttta gcactgactc tgttttctga agtgcatatc agactgtcct ctatgctgca 2580 cagtgtcaaa gggttttaga ctcatggcag tgacttgagt aaattttcca acctttccca 2640 gcctcagtgc ttatgagtgg gctgctgggc ttgggaagtg gctcagtcag taaagtcctt 2700 gactttcaag catgaggacc tgagtcggtt ctccacatcc cacataggaa gtagggtgtg 2760 gtaccacact cccagggcta gggaggcaga gtctggaaga tgtctcaggt tcacccacca 2820 gctagccttg tctgcttggc aaactgcagg tcagtgcgga 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atttgccttc ttagcctctc 3720 cccctctccc tttcacattc tgctttccaa tccacacaca tttaggctta atgaaattca 3780 tgacaaatca tgatcccctg cctcagcctc tgagttctat gatggaagac ctgcacctat 3840 aaaaaaaacc cagcttcttt attattaaaa caatttttaa ttgtattttt aattttgtat 3900 atgtgtatgg aggtcagagc acatcttgtg agagtcaggt ttcttccatc atatggattc 3960 tgggaatcca actcacgtta gcaggcttgg tggtaagccc ttttatctat tgagccatct 4020 tgctggtccc tgaaatccat tccttctttt aaaaacttta ttatttcatt ttatatgtat 4080 gagagttttg tttgagagca tgcctgtgca ccacatacat gcacacctgg tgcccaagga 4140 agccagaaga tggtgttgga ttgcccagaa ctggagttac agctggttgt aagtcaccat 4200 gtgggcgctg ggaatccaac tggggtcctt tggaagaaca gcctacattc tgccttctaa 4260 gccacctttc tagctcccca aactatttct tggtacatct gctttagaag ttaagtttca 4320 catcctataa tcctgaagct actacgtgta tagagcctga aacactgccc atacaaagcc 4380 ttaatccaca agcaggcaag ttcacatgca tatggtgtct caggcaatgc cgtactgtgg 4440 ccccaaaaga aagaacccag atgcccatta aaaataaaaa gaaagaaaga aaaaagaaag 4500 tggacaagca aattgtagac ttttctttat agagtattat 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cttctttcag cggagctggg 5400 gggaagggag ggaggcaccc gggggtggga tgctgccagg ctctgccgca gcccgaacct 5460 ctgccgagcg gcgcgcaccg ccctccctcg ctcgttcgct cgctctctcg cctccttccc 5520 cccgtgggga attttcaaga ctgcgctgct gcaatttccc cccggccgag gctgcgccgc 5580 gcctgggctg cgcgcacaca cgcttgccgc gcgcagagga gccggcggct gctgaatcag 5640 gaggaaaaca gatcgggctt tttttcaaag ccggggacca gcggctgccc tgaagcctcc 5700 gagccccgcc gcgcccctgc gccccgctcc tccgccctgt gctctccagt cgggttgaat 5760 ttgggggagg ggctgcagcg ttttgcagga attttctatt ctttccaggt ctaggaaagt 5820 gcagcaaaac agacggacaa atccttcgtg ccaccctctt cctatagcaa agacctggtt 5880 tttttttttt tttgttattt aattcttttc tttttatttt attttatttt tttactaatg 5940 ggccgagccc acgcctttag caagatgcca agctgacccg gacctcctca ggaatttgaa 6000 gccagtctct gcgtccaagg gaggggggga cgtccttcgt ttagacttcg cgttttaaag 6060 ggggtgtgca ttggagcgtt gctttaaaaa aaaaaagctg atctttttac actatttttt 6120 ttaactgatt ttttttttaa ctgaaaaaaa atttttttct tcttcctccg gagtgggtgg 6180 ccggggatcg cctggatcgc gtccccggtt atttttgccg cgccccgccc ccgcgccctc 6240 ccccgcaccc ctcctcccgt cccgggtcac cgct ctgccg gcatgtcccg agccggcgct 6300 ccccggtcgg ccgggccgtc ccgctcgtga gcccccccga gctgaggccg ggcgccgccg 6360 cccgatgggc tgggccgtgg agcgtctccg cagtcgcagg tgcagccgcg tccccacagc 6420 ccggccagcc tgagcagcgg cggcggtggt ggtggtggtg gtggcggtgc ccgtggcttc 6480 cgcagcgctc gccgcagcaa cagcagccgc cgcgtaaccc gaggcccttt gctctttgca 6540 ga 6542
【0019】 <210>2 <211>3021 <212>DNA <213>mouse <400>2 atccttaggc aacagcttcc tgttttgcac tattggcctt tgagacagtg aaaggcagaa 60 cagggtcaga tataaacacc atcgtggtgt ggtgagtgcc ctgtaccccc ggcacagctc 120 tgcccctgtg tgttacttat gccacgcctg ttgtatcaaa ttcctagttg tgatttattt 180 atatgctttg ttgtttgagg caggatttga ctagcttaac atgtaccctg gagcccagac 240 tgtgctgaac ttacaacaat cctcctgccg cagcctcttg tgcaggtggg tgacaggtgg 300 gtaccaccac cacacctggc ttgttttgac aaattaggaa atcttaaaat gcactaagag 360 tttatataca gacataacat cattttcaaa tgttccaaat gaactcaaat actgcgtgtg 420 ggccaagcag gctttaacta gctgaagatt tgccttctta gcctctcccc ctctcccttt 480 cacattctgc tttccaatcc acacacattt aggcttaatg aaattcatga caaatcatga 540 tcccctgcct cagcctctga gttctatgat ggaagacctg cacctataaa aaaaacccag 600 cttctttatt attaaaacaa tttttaattg tatttttaat tttgtatatg tgtatggagg 660 tcagagcaca tcttgtgaga gtcaggtttc ttccatcata tggattctgg gaatccaact 720 cacgttagca ggcttggtgg taagcccttt tatctattga gccatcttgc tggtccctga 780 aatccattcc ttcttttaaa aactttatta tttcatttta tatgtatgag agttttgttt 840 gagagcatgc ctgtgcacca catacatgca cacctggtgc ccaaggaagc cagaagatgg 900 tgttggattg cccagaactg gagttacagc tggttgtaag tcaccatgtg ggcgctggga 960 atccaactgg ggtcctttgg aagaacagcc tacattctgc cttctaagcc acctttctag 1020 ctccccaaac tatttcttgg tacatctgct ttagaagtta agtttcacat cctataatcc 1080 tgaagctact acgtgtatag agcctgaaac actgcccata caaagcctta atccacaagc 1140 aggcaagttc acatgcatat ggtgtctcag gcaatgccgt actgtggccc caaaagaaag 1200 aacccagatg cccattaaaa ataaaaagaa agaaagaaaa aagaaagtgg acaagcaaat 1260 tgtagacttt tctttataga gtattataca gcaaagaaaa tgtgtcaccc acaggttctg 1320 cagaatgatg cttattatga gatcaaaaga acgaaagcat aactcctgcc gaggaaggca 1380 tgccaaggtc ataaataaag ctaaaagaat tagcagaatg ctcaggcaga agttatactg 1440 gcactggccc ccgtgtaggc ctgtaggcgg gtttctgggg agctggcttc caggaggttc 1500 attcgcagca attcctcaac ttgttcattt gtgatttatg tagttttctc tgtgttcatg 1560 gagtttccaa ataggaagaa aaaaaaaaaa aagcaggtgg ggtgatccaa gtgccttata 1620 gaacagggcc aaaccgagct aggccagcag cccccgccta acaccctaag tctcggtgag 1680 tggtctgctc ctggagctca cacgggggct gccaccagga tctcctatac attagcttgg 1740 attggccccc tgggacccac agccttccta gaagtgcccc aaaccattct tctagctcat 1800 aaaaactgtc ttctgctcaa cagacccaca tttgttcagc gacggccacc cgcaccaagt 1860 ctccagacca aaccctctgg tcttttaagt ttcttccttc ctgttgggca cgcctcgttc 1920 taggcagcga cgcggacctc gggtggcaag caaggtccct tgtgcgggag gactctgtcc 1980 cgacttcccc ctgcgcgcct ggccgcgcct gctctcgcgc tggtgattgg ttgcgcgtgt 2040 cgccgggtgg gtcttgctct agggcgcagg gccgcgatct agccccggct cccggccggg 2100 acagctccct cctcgcaccc cgcacctctt ctttcagcgg agctgggggg aagggaggga 2160 ggcacccggg ggtgggatgc tgccaggctc tgccgcagcc cgaacctctg ccgagcggcg 2220 cgcaccgccc tccctcgctc gttcgctcgc tctctcgcct ccttcccccc gtggggaatt 2280 ttcaagactg cgctgctgca atttcccccc ggccgaggct gcgccgcgcc tgggctgcgc 2340 gcacacacgc ttgccgcgcg cagaggagcc ggcggctgct gaatcaggag gaaaacagat 2400 cgggcttttt ttcaaagccg gggaccagcg gctgccctga agcctccgag ccccgccgcg 2460 cccctgcgcc ccgctcctcc gccctgtgct ctccagtcgg gttgaatttg ggggaggggc 2520 tgcagcgttt tgcaggaatt ttctattctt tccaggtcta ggaaagtgca gcaaaacaga 2580 cggacaaatc cttcgtgcca ccctcttcct atagcaaaga cctggttttt tttttttttt 2640 gttatttaat tcttttcttt ttattttatt ttattttttt actaatgggc cgagcccacg 2700 cctttagcaa gatgccaagc tgacccggac ctcctcagga atttgaagcc agtctctgcg 2760 tccaagggag ggggggacgt ccttcgttta gacttcgcgt tttaaagggg gtgtgcattg 2820 gagcgttgct ttaaaaaaaa aaagctgatc tttttacact atttttttta actgattttt 2880 tttttaactg aaaaaaaatt tttttcttct tcctccggag tgggtggccg gggatcgcct 2940 ggatcgcgtc cccggttatt tttgccgcgc cccgcccccg cgccctcccc cgcacccctc 3000 ctcccgtccc gggtcaccgc t 3021
【0020】 <210>3 <211>1562 <212>DNA <213>mouse <400>3 cctgtaggcg ggtttctggg gagctggctt ccaggaggtt cattcgcagc aattcctcaa 60 cttgttcatt tgtgatttat gtagttttct ctgtgttcat ggagtttcca aataggaaga 120 aaaaaaaaaa aaagcaggtg gggtgatcca agtgccttat agaacagggc caaaccgagc 180 taggccagca gcccccgcct aacaccctaa gtctcggtga gtggtctgct cctggagctc 240 acacgggggc tgccaccagg atctcctata cattagcttg gattggcccc ctgggaccca 300 cagccttcct agaagtgccc caaaccattc ttctagctca taaaaactgt cttctgctca 360 acagacccac atttgttcag cgacggccac ccgcaccaag tctccagacc aaaccctctg 420 gtcttttaag tttcttcctt cctgttgggc acgcctcgtt ctaggcagcg acgcggacct 480 cgggtggcaa gcaaggtccc ttgtgcggga ggactctgtc ccgacttccc cctgcgcgcc 540 tggccgcgcc tgctctcgcg ctggtgattg gttgcgcgtg tcgccgggtg ggtcttgctc 600 tagggcgcag ggccgcgatc tagccccggc tcccggccgg gacagctccc tcctcgcacc 660 ccgcacctct tctttcagcg gagctggggg gaagggaggg aggcacccgg gggtgggatg 720 ctgccaggct ctgccgcagc ccgaacctct gccgagcggc gcgcaccgcc ctccctcgct 780 cgttcgctcg ctctctcgcc tccttccccc cgtggggaat tttcaagact gcgctgctgc 840 aatttccccc cggccgaggc tgcgccgcgc ctgggctgcg cgcacacacg cttgccgcgc 900 gcagaggagc cggcggctgc tgaatcagga ggaaaacaga tcgggctttt tttcaaagcc 960 ggggaccagc ggctgccctg aagcctccga gccccgccgc gcccctgcgc cccgctcctc 1020 cgccctgtgc tctccagtcg ggttgaattt gggggagggg ctgcagcgtt ttgcaggaat 1080 tttctattct ttccaggtct aggaaagtgc agcaaaacag acggacaaat ccttcgtgcc 1140 accctcttcc tatagcaaag acctggtttt tttttttttt tgttatttaa ttcttttctt 1200 tttattttat tttatttttt tactaatggg ccgagcccac gcctttagca agatgccaag 1260 ctgacccgga cctcctcagg aatttgaagc cagtctctgc gtccaaggga gggggggacg 1320 tccttcgttt agacttcgcg ttttaaaggg ggtgtgcatt ggagcgttgc tttaaaaaaa 1380 aaaagctgat ctttttacac tatttttttt aactgatttt ttttttaact gaaaaaaaat 1440 ttttttcttc ttcctccgga gtgggtggcc ggggatcgcc tggatcgcgt ccccggttat 1500 ttttgccgcg ccccgccccc gcgccctccc ccgcacccct cctcccgtcc cgggtcaccg 1560 ct 1562
【0021】 <210>4 <211>6822 <212>DNA <213>Rabbit <220> <221>CDS <222> (25)..(6819) <400>4 aagctttatc gataccgtcg acct cct gcc cgc tac ggg gga gga ggc gcc 51 Pro Ala Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 ggg gca gcc gcc ggg gtg gtc gtg ggc gcc gca ggc ggg cga gga gcc 99 Gly Ala Ala Ala Gly Val Val Val Gly Ala Ala Gly Gly Arg Gly Ala 10 15 20 25 ggg ggc agc cgg cag ggc ggg cag ccc ggg gcg caa agg atg tac aag 147 Gly Gly Ser Arg Gln Gly Gly Gln Pro Gly Ala Gln Arg Met Tyr Lys 30 35 40 caa tcc atg gcg cag agg gca cgg acc atg gcc ctg tac aac ccc atc 195 Gln Ser Met Ala Gln Arg Ala Arg Thr Met Ala Leu Tyr Asn Pro Ile 45 50 55 ccg gtc cga cag aac tgc ctc acg gtc aac cgc tcc ctc ttc ctc ttc 243 Pro Val Arg Gln Asn Cys Leu Thr Val Asn Arg Ser Leu Phe Leu Phe 60 65 70 agc gag gac aac gtg gtg aga aaa tac gcg aag aag atc acc gaa tgg 291 Ser Glu Asp Asn Val Val Arg Lys Tyr Ala Lys Lys Ile Thr Glu Trp 75 80 85 cct ccc ttt gag tac atg att tta gcc acc atc ata gca aac tgc att 339 Pro Pro Phe Glu Tyr Met Ile Leu Ala Thr Ile Ile Ala Asn Cys Ile 90 95 100 105 gtc ctg gcg ctg gag cag cat ctg cca gat gac gac aag acc ccg atg 387 Val Leu Ala Leu Glu Gln His Leu Pro Asp Asp Asp Lys Thr Pro Met 110 115 120 tct gag cgg ctg gat gac aca gaa ccg tac ttc att ggc att ttt tgt 435 Ser Glu Arg Leu Asp Asp Thr Glu Pro Tyr Phe Ile Gly Ile Phe Cys 125 130 135 ttc gag gct gga att aaa att atc gcc ctg ggg ttt gcc ttc cac aaa 483 Phe Glu Ala Gly Ile Lys Ile Ile Ala Leu Gly Phe Ala Phe His Lys 140 145 150 ggg tcc tac cta agg aac ggt tgg aac gtg atg gac ttt gtg gtg gtg 531 Gly Ser Tyr Leu Arg Asn Gly Trp Asn Val Met Asp Phe Val Val Val 155 160 165 cta act ggc atc ttg gcg aca gtt ggg aca gag ttt gac ctt cgg aca 579 Leu Thr Gly Ile Leu Ala Thr Val Gly Thr Glu Phe Asp Leu Arg Thr 170 175 180 185 ctg cga gca gtg cgg gtg ctg cgg ccg ctc aag ctg gtg tct gga atc 627 Leu Arg Ala Val Arg Val Leu Arg Pro Leu Lys Leu Val Ser Gly Ile 190 195 200 cca agt tta caa gtc gtc ttg aag tca atc atg aag gcg atg att cct 675 Pro Ser Leu Gln Val Val Leu Lys Ser Ile Met Lys Ala Met Ile Pro 205 210 215 ctg ctg cag atc gga ctc ctc cta ttt ttt gca ata ctt att ttt gca 723 Leu Leu Gln Ile Gly Leu Leu Leu Phe Phe Ala Ile Leu Ile Phe Ala 220 225 230 atc ata ggg tta gaa ttt tat atg gga aaa ttt cat acc acc tgc ttt 771 Ile Ile Gly Leu Glu Phe Tyr Met Gly Lys Phe His Thr Thr Cys Phe 235 240 245 gaa gag ggg aca gac gac att cag ggg gag tct ccg gct cca tgc ggg 819 Glu Glu Gly Thr Asp Asp Ile Gln Gly Glu Ser Pro Ala Pro Cys Gly 250 255 260 265 aca gag gaa ccc gcc cgc acc tgc ccc aat ggg acc aga tgc cag ccc 867 Thr Glu Glu Pro Ala Arg Thr Cys Pro Asn Gly Thr Arg Cys Gln Pro 270 275 280 tac tgg gaa gga ccc aac aat ggg atc acc cag ttc gac aac atc ctg 915 Tyr Trp Glu Gly Pro Asn Asn Gly Ile Thr Gln Phe Asp Asn Ile Leu 285 290 295 ttc gcc gta ctg act gtt ttt cag tgc atc aca atg gaa gga tgg acg 963 Phe Ala Val Leu Thr Val Phe Gln Cys Ile Thr Met Glu Gly Trp Thr 300 305 310 gac ctc ctt tac aac agc aac gat gcc tca ggg aac act tgg aac tgg 1011 Asp Leu Leu Tyr Asn Ser Asn Asp Ala Ser Gly Asn Thr Trp Asn Trp 315 320 325 ttg tac ttc atc ccc ctc atc atc atc ggc tcc ttt ttt atg ctg aac 1059 Leu Tyr Phe Ile Pro Leu Ile Ile Ile Gly Ser Phe Phe Met Leu Asn 330 335 340 345 ctc gtg ctg ggt gtg ctg tca ggg gag ttt gcc aaa gaa agg gag cgg 1107 Leu Val Leu Gly Val Leu Ser Gly Glu Phe Ala Lys Glu Arg Glu Arg 350 355 360 gtg gag aac cgg cgc gca ttc ctg aag ctg cgg cgg cag cag cag att 1155 Val Glu Asn Arg Arg Ala Phe Leu Lys Leu Arg Arg Gln Gln Gln Ile 365 370 375 gaa cgc gag ctc aac ggg tac atg gag tgg atc tca aaa gca gaa gag 1203 Glu Arg Glu Leu Asn Gly Tyr Met Glu Trp Ile Ser Lys Ala Glu Glu 380 385 390 gtg atc ctc gca gag gac gag acc gac gtg gag cag aga cat ccc ttt 1251 Val Ile Leu Ala Glu Asp Glu Thr Asp Val Glu Gln Arg His Pro Phe 395 400 405 gat gga gct ctg cgg aga gcc act atc aag aag agc aag acg gac ctg 1299 Asp Gly Ala Leu Arg Arg Ala Thr Ile Lys Lys Ser Lys Thr Asp Leu 410 415 420 425 ctc cac cca gag gag gcg gag gat cag ctg gcc gac atc gcc tcc gtg 1347 Leu His Pro Glu Glu Ala Glu Asp Gln Leu Ala Asp Ile Ala Ser Val 430 435 440 ggg tct ccc ttt gcc cga gcc agc att aaa agt gcc aag ctg gag aac 1395 Gly Ser Pro Phe Ala Arg Ala Ser Ile Lys Ser Ala Lys Leu Glu Asn 445 450 455 tcg agt ttt ttc cac aaa aaa gag agg aga atg cgt ttc tac atc cgt 1443 Ser Ser Phe Phe His Lys Lys Glu Arg Arg Met Arg Phe Tyr Ile Arg 460 465 470 cgc atg gtc aaa act cag gcc ttc tac tgg act gtg ctc agt ctg gta 1491 Arg Met Val Lys Thr Gln Ala Phe Tyr Trp Thr Val Leu Ser Leu Val 475 480 485 gcc ctc aac acg ctg tgc gtg gct atc gtc cat tac aac cag ccc gag 1539 Ala Leu Asn Thr Leu Cys Val Ala Ile Val His Tyr Asn Gln Pro Glu 490 495 500 505 tgg ctc tcc gac ttc ctg tac tat gca gaa ttc att ttc tta gga ctc 1587 Trp Leu Ser Asp Phe Leu Tyr Tyr Ala Glu Phe Ile Phe Leu Gly Leu 510 515 520 ttt atg tcc gaa atg ttt ata aaa atg tac ggg ctt ggg acg cgg cct 1635 Phe Met Ser Glu Met Phe Ile Lys Met Tyr Gly Leu Gly Thr Arg Pro 525 530 535 tac ttc cac tcc tct ttc aac tgc ttt gac tgt ggg gtc atc atc ggc 1683 Tyr Phe His Ser Ser Phe Asn Cys Phe Asp Cys Gly Val Ile Ile Gly 540 545 550 agt atc ttt gaa gtc atc tgg gct gtc ata aaa ccc ggc acg tcc ttt 1731 Ser Ile Phe Glu Val Ile Trp Ala Val Ile Lys Pro Gly Thr Ser Phe 555 560 565 ggg atc agc gtg tta cga gcc ctc agg tta ctg cgt att ttc aaa gtc 1779 Gly Ile Ser Val Leu Arg Ala Leu Arg Leu Leu Arg Ile Phe Lys Val 570 575 580 585 aca aag tac tgg gcg tct ctc cga aac ctg gtc gtg tca ctt ctc aac 1827 Thr Lys Tyr Trp Ala Ser Leu Arg Asn Leu Val Val Ser Leu Leu Asn 590 595 600 tcc atg aaa tcc atc atc agt ctg ctg ttc ctc ctc ttc ctg ttt atc 1875 Ser Met Lys Ser Ile Ile Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Leu Phe Ile 605 610 615 gtt gtc ttt gca ctt ctg ggg atg cag ctc ttc ggt ggc cag ttt aat 1923 Val Val Phe Ala Leu Leu Gly Met Gln Leu Phe Gly Gly Gln Phe Asn 620 625 630 ttc gac gaa gga act cct ccc acc aac ttt gac acc ttt ccg gca gca 1971 Phe Asp Glu Gly Thr Pro Pro Thr Asn Phe Asp Thr Phe Pro Ala Ala 635 640 645 ata atg acg gtg ttt cag atc ctg acg gga gag gac tgg aac gag gtc 2019 Ile Met Thr Val Phe Gln Ile Leu Thr Gly Glu Asp Trp Asn Glu Val 650 655 660 665 atg tac gac ggc atc aag tcg cag ggc ggc gtg cag ggc ggc atg gtg 2067 Met Tyr Asp Gly Ile Lys Ser Gln Gly Gly Val Gln Gly Gly Met Val 670 675 680 ttc tcc atc tac ttc atc gtc ctc aca ctc ttt ggg aac tac acc ctc 2115 Phe Ser Ile Tyr Phe Ile Val Leu Thr Leu Phe Gly Asn Tyr Thr Leu 685 690 695 ctg aat gtg ttc ttg gcc atc gcc gtg gac aac ctg gcc aat gcc cag 2163 Leu Asn Val Phe Leu Ala Ile Ala Val Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gln 700 705 710 gag ctc acc aag gat gag caa gag gaa gag gag gcc gtc aat caa aag 2211 Glu Leu Thr Lys Asp Glu Gln Glu Glu Glu Glu Ala Val Asn Gln Lys 715 720 725 ctt gcc ctg cag aag gcc aag gag gtg gcg gaa gtg agt ccc ctg tct 2259 Leu Ala Leu Gln Lys Ala Lys Glu Val Ala Glu Val Ser Pro Leu Ser 730 735 740 745 gca gcc aac atg tcc ata gcc atg aag gaa cag caa aag aac cag aag 2307 Ala Ala Asn Met Ser Ile Ala Met Lys Glu Gln Gln Lys Asn Gln Lys 750 755 760 ccg gcc aag tcg gtg tgg gag cag cgg acc agc gag atg cgg aaa cag 2355 Pro Ala Lys Ser Val Trp Glu Gln Arg Thr Ser Glu Met Arg Lys Gln 765 770 775 aac ctg ctg gcc agc cgc gag gcc ctg tac agc gag atg gac ccg gag 2403 Asn Leu Leu Ala Ser Arg Glu Ala Leu Tyr Ser Glu Met Asp Pro Glu 780 785 790 gag cgc tgg aag gcg tcg tac gcg cgc cac ctg cgg ccg gac atg aaa 2451 Glu Arg Trp Lys Ala Ser Tyr Ala Arg His Leu Arg Pro Asp Met Lys 795 800 805 acg cac ctg gac cgg ccg ctg gtc gtg gac ccg cag gag aac cgc aac 2499 Thr His Leu Asp Arg Pro Leu Val Val Asp Pro Gln Glu Asn Arg Asn 810 815 820 825 aac aac acc aac aag agc cgc gtg gcc gag ccc acg gtg gac cag cgc 2547 Asn Asn Thr Asn Lys Ser Arg Val Ala Glu Pro Thr Val Asp Gln Arg 830 835 840 ctc ggg cag cag cgg gcc gag gac ttc ctc cgg aag cag gcc cgc cac 2595 Leu Gly Gln Gln Arg Ala Glu Asp Phe Leu Arg Lys Gln Ala Arg His 845 850 855 cac gat cgc gcg cgg gac ccc agc gcc cac gcc gcc gcc ggc ctg gac 2643 His Asp Arg Ala Arg Asp Pro Ser Ala His Ala Ala Ala Gly Leu Asp 860 865 870 gcg cgc agg ccc tgg gcg ggc agc cag gag gcc gag ctg agc cgg gag 2691 Ala Arg Arg Pro Trp Ala Gly Ser Gln Glu Ala Glu Leu Ser Arg Glu 875 880 885 ggg ccg tac ggc cgc gag tcg gac cac cag gcc cgg gag ggc ggc ctg 2739 Gly Pro Tyr Gly Arg Glu Ser Asp His Gln Ala Arg Glu Gly Gly Leu 890 895 900 905 gag cct ccg ggc ttc tgg gag ggc gag gcg gag cgg ggc aag gct ggg 2787 Glu Pro Pro Gly Phe Trp Glu Gly Glu Ala Glu Arg Gly Lys Ala Gly 910 915 920 gac ccg cac cgc agg cac gcg cac cgg caa ggc gtt ggc ggc agc ggg 2835 Asp Pro His Arg Arg His Ala His Arg Gln Gly Val Gly Gly Ser Gly 925 930 935 ggt agc cgc agc ggc tcg ccc cgc acc ggc acc gcc gac ggg gag ccc 2883 Gly Ser Arg Ser Gly Ser Pro Arg Thr Gly Thr Ala Asp Gly Glu Pro 940 945 950 cgc agg cac cgg gtc cat cgc agg ccc gga gag gac gga ccg gac gac 2931 Arg Arg His Arg Val His Arg Arg Pro Gly Glu Asp Gly Pro Asp Asp 955 960 965 aag gcc gaa agg agg ggc cgg cat cgc gag ggc agc cgg cca gcc cgg 2979 Lys Ala Glu Arg Arg Gly Arg His Arg Glu Gly Ser Arg Pro Ala Arg 970 975 980 985 agc ggc gag gga gag gcc gag ggg ccg gac ggc ggt ggc ggt ggt ggt 3027 Ser Gly Glu Gly Glu Ala Glu Gly Pro Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly 990 995 1000 ggc gaa cgc agg agg cgg cat cgg cat ggc ccc ccg ccc gcc tac gac 3075 Gly Glu Arg Arg Arg Arg His Arg His Gly Pro Pro Pro Ala Tyr Asp 1005 1010 1015 ccc gac gcg cgg agg gac gac agg gaa cgc agg cac cgg agg agg aaa 3123 Pro Asp Ala Arg Arg Asp Asp Arg Glu Arg Arg His Arg Arg Arg Lys 1020 1025 1030 gac acc cag ggc tcc ggc gtc ccc gtg tcc ggc ccc aac ctc tcc acc 3171 Asp Thr Gln Gly Ser Gly Val Pro Val Ser Gly Pro Asn Leu Ser Thr 1035 1040 1045 acc cgg ccg atc cag cag gat ctg agc cgc cag gag ccc ccg ctg gcc 3219 Thr Arg Pro Ile Gln Gln Asp Leu Ser Arg Gln Glu Pro Pro Leu Ala 1050 1055 1060 1065 gag gac atg gac aac ctg aag aac agc cgg cta gcc acc gcc gag ccg 3267 Glu Asp Met Asp Asn Leu Lys Asn Ser Arg Leu Ala Thr Ala Glu Pro 1070 1075 1080 gtc agc ccc cac gag aac ctc agc cac gcc ggc ctg ccc cag agc ccg 3315 Val Ser Pro His Glu Asn Leu Ser His Ala Gly Leu Pro Gln Ser Pro 1085 1090 1095 gcc aag atg ggg agc agc acc gac ccc gcc ggc ccc acg ccg gcc acg 3363 Ala Lys Met Gly Ser Ser Thr Asp Pro Ala Gly Pro Thr Pro Ala Thr 1100 1105 1110 gcc gcc aac ccc cag aac agc acc gcc agc cgc cgc aca ccc aac aac 3411 Ala Ala Asn Pro Gln Asn Ser Thr Ala Ser Arg Arg Thr Pro Asn Asn 1115 1120 1125 ccg ggg aac ccg tcc aac ccc ggc ccc ccc aag acc ccc gag aac agc 3459 Pro Gly Asn Pro Ser Asn Pro Gly Pro Pro Lys Thr Pro Glu Asn Ser 1130 1135 1140 1145 ctt atc gtc acc aac ccc agc acc gcc caa acc aac tca gcc aag act 3507 Leu Ile Val Thr Asn Pro Ser Thr Ala Gln Thr Asn Ser Ala Lys Thr 1150 1155 1160 gcc agg aaa cct gac cac acc acg gtg gaa atc cca cca gcc tgc cca 3555 Ala Arg Lys Pro Asp His Thr Thr Val Glu Ile Pro Pro Ala Cys Pro 1165 1170 1175 ccg ccc ctc aac cac acc gtg gtc caa gtg aac aaa aat gcc aac ccg 3603 Pro Pro Leu Asn His Thr Val Val Gln Val Asn Lys Asn Ala Asn Pro 1180 1185 1190 gac cca cta cca aag aaa gaa gat gag aag aag gag gag gtg gac gag 3651 Asp Pro Leu Pro Lys Lys Glu Asp Glu Lys Lys Glu Glu Val Asp Glu 1195 1200 1205 ggc cct ggg gaa gac ggc ccc aag ccc atg cct ccc tac agt tcc atg 3699 Gly Pro Gly Glu Asp Gly Pro Lys Pro Met Pro Pro Tyr Ser Ser Met 1210 1215 1220 1225 ttt atc ctg tcc acc acc aac ccc ctt cgc cgc ctg tgc cat tac atc 3747 Phe Ile Leu Ser Thr Thr Asn Pro Leu Arg Arg Leu Cys His Tyr Ile 1230 1235 1240 ctg aac ctg cgc tac ttc gag atg tgc atc ctc atg gtc atc gcc atg 3795 Leu Asn Leu Arg Tyr Phe Glu Met Cys Ile Leu Met Val Ile Ala Met 1245 1250 1255 agc agc atc gcc ctg gcc gcc gag gac ccc gtg cag ccc aat gcg ccg 3843 Ser Ser Ile Ala Leu Ala Ala Glu Asp Pro Val Gln Pro Asn Ala Pro 1260 1265 1270 cgc aac aac gtg ctg cga tat ttc gac tac gtt ttc act ggc gtc ttt 3891 Arg Asn Asn Val Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Val Phe Thr Gly Val Phe 1275 1280 1285 acc ttt gag atg gtg atc aag atg atc gac tta ggg ctt gtc ctg cat 3939 Thr Phe Glu Met Val Ile Lys Met Ile Asp Leu Gly Leu Val Leu His 1290 1295 1300 1305 caa ggt gcc tac ttc cgg gac ctc tgg aac att ctc gac ttc ata gtg 3987 Gln Gly Ala Tyr Phe Arg Asp Leu Trp Asn Ile Leu Asp Phe Ile Val 1310 1315 1320 gtc agt ggg gcc ctg gtg gcc ttt gct ttc acc ggc aat agc aaa ggg 4035 Val Ser Gly Ala Leu Val Ala Phe Ala Phe Thr Gly Asn Ser Lys Gly 1325 1330 1335 aag gat ata aac acg atc aaa tcc ctc cga gtg ctc cgg gtg cta cga 4083 Lys Asp Ile Asn Thr Ile Lys Ser Leu Arg Val Leu Arg Val Leu Arg 1340 1345 1350 cct ctc aaa acc atc aag cgg ttg cca aag ctc aag gcc gtg ttc gac 4131 Pro Leu Lys Thr Ile Lys Arg Leu Pro Lys Leu Lys Ala Val Phe Asp 1355 1360 1365 tgc gtg gtg aac tca ctc aaa aac gtc ttc aac atc ctc att gtg tac 4179 Cys Val Val Asn Ser Leu Lys Asn Val Phe Asn Ile Leu Ile Val Tyr 1370 1375 1380 1385 atg ctg ttc atg ttc atc ttc gcc gtg gtg gct gtc cag ctg ttc aag 4227 Met Leu Phe Met Phe Ile Phe Ala Val Val Ala Val Gln Leu Phe Lys 1390 1395 1400 ggc aag ttt ttt cac tgc acc gat gag tcc aag gaa ttt gag aaa gat 4275 Gly Lys Phe Phe His Cys Thr Asp Glu Ser Lys Glu Phe Glu Lys Asp 1405 1410 1415 tgt cgc ggc aag tac ctc ctg tac gag aag aac gag gtg aaa gcc cgc 4323 Cys Arg Gly Lys Tyr Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Glu Val Lys Ala Arg 1420 1425 1430 gat cgc gag tgg aag aag tac gag ttt cac tat gac aac gtg ctg tgg 4371 Asp Arg Glu Trp Lys Lys Tyr Glu Phe His Tyr Asp Asn Val Leu Trp 1435 1440 1445 gcc ctg ctc acc ctc ttc acc gtg tcc acg gga gaa ggc tgg cca cag 4419 Ala Leu Leu Thr Leu Phe Thr Val Ser Thr Gly Glu Gly Trp Pro Gln 1450 1455 1460 1465 gtc ctc aag cac tcg gtg gac gcc acc ttt gaa aac cag ggc ccc agc 4467 Val Leu Lys His Ser Val Asp Ala Thr Phe Glu Asn Gln Gly Pro Ser 1470 1475 1480 ccc ggc tac cgc atg gag atg tcc atc ttc tac gtg gtc tac ttc gtc 4515 Pro Gly Tyr Arg Met Glu Met Ser Ile Phe Tyr Val Val Tyr Phe Val 1485 1490 1495 gtc ttc cct ttc ttc ttt gtc aac atc ttc gtg gcc ttg atc atc atc 4563 Val Phe Pro Phe Phe Phe Val Asn Ile Phe Val Ala Leu Ile Ile Ile 1500 1505 1510 acc ttc cag gag cag ggc gac aag atg atg gag gag tac agc ttg gag 4611 Thr Phe Gln Glu Gln Gly Asp Lys Met Met Glu Glu Tyr Ser Leu Glu 1515 1520 1525 aaa aac gag agg gcc tgc atc gac ttc gcc atc agt gcc aag ccg ctg 4659 Lys Asn Glu Arg Ala Cys Ile Asp Phe Ala Ile Ser Ala Lys Pro Leu 1530 1535 1540 1545 acc agg cac atg ccc cag aac aag cag agc ttc cag tac cgc atg tgg 4707 Thr Arg His Met Pro Gln Asn Lys Gln Ser Phe Gln Tyr Arg Met Trp 1550 1555 1560 cag ttc gtg gtg tcc ccg ccc ttc gag tac acc atc atg gcc atg atc 4755 Gln Phe Val Val Ser Pro Pro Phe Glu Tyr Thr Ile Met Ala Met Ile 1565 1570 1575 gcc ctc aac acc atc gtg ctg atg atg aag ttc tac gga gcc tca gtg 4803 Ala Leu Asn Thr Ile Val Leu Met Met Lys Phe Tyr Gly Ala Ser Val 1580 1585 1590 gcc tac gac aat gcc ctg aag gta ttc aac atc gtc ttc acc tcg ctc 4851 Ala Tyr Asp Asn Ala Leu Lys Val Phe Asn Ile Val Phe Thr Ser Leu 1595 1600 1605 ttc tcc ctg gag tgc ctg cta aag gtc ctg gct ttt ggg att ctg aat 4899 Phe Ser Leu Glu Cys Leu Leu Lys Val Leu Ala Phe Gly Ile Leu Asn 1610 1615 1620 1625 tat ttc cgc gat gcc tgg aat atc ttt gac ttt gtg acc gtc ctc ggt 4947 Tyr Phe Arg Asp Ala Trp Asn Ile Phe Asp Phe Val Thr Val Leu Gly 1630 1635 1640 agc atc acc gac atc ctt gtg acg gag ttt ggg aac aac ttc atc aac 4995 Ser Ile Thr Asp Ile Leu Val Thr Glu Phe Gly Asn Asn Phe Ile Asn 1645 1650 1655 ctg agc ttc ctg cgc ctc ttc cgc gcc gcg cgg ctc atc aag ctc ctg 5043 Leu Ser Phe Leu Arg Leu Phe Arg Ala Ala Arg Leu Ile Lys Leu Leu 1660 1665 1670 cgg cag ggc tac acc atc cgc atc ctc ctc tgg acg ttc gtg cag tcc 5091 Arg Gln Gly Tyr Thr Ile Arg Ile Leu Leu Trp Thr Phe Val Gln Ser 1675 1680 1685 ttc aag gcg ctg ccc tac gtc tgc ctg ctg atc gcc atg ctc ttc ttc 5139 Phe Lys Ala Leu Pro Tyr Val Cys Leu Leu Ile Ala Met Leu Phe Phe 1690 1695 1700 1705 atc tac gcc atc atc ggg atg cag gtg ttc ggc aac atc ggc atc gac 5187 Ile Tyr Ala Ile Ile Gly Met Gln Val Phe Gly Asn Ile Gly Ile Asp 1710 1715 1720 atg gag gac gag gac agc gac gag gac gag ttc cag atc acc gag cac 5235 Met Glu Asp Glu Asp Ser Asp Glu Asp Glu Phe Gln Ile Thr Glu His 1725 1730 1735 aat aac ttc cgg acc ttc ttc cag gcc ctc atg ctg ctc ttc cgg agc 5283 Asn Asn Phe Arg Thr Phe Phe Gln Ala Leu Met Leu Leu Phe Arg Ser 1740 1745 1750 gcc acc gga gaa gcc tgg cac aac atc atg ctg tcc tgc ctc agc ggg 5331 Ala Thr Gly Glu Ala Trp His Asn Ile Met Leu Ser Cys Leu Ser Gly 1755 1760 1765 aag ccg tgc gac aag aac tcg ggc atc ctg acg cct gag tgc ggc aac 5379 Lys Pro Cys Asp Lys Asn Ser Gly Ile Leu Thr Pro Glu Cys Gly Asn 1770 1775 1780 1785 gaa ttt gcc tat ttt tac ttc gtg tcc ttc atc ttc ctc tgc tcc ttc 5427 Glu Phe Ala Tyr Phe Tyr Phe Val Ser Phe Ile Phe Leu Cys Ser Phe 1790 1795 1800 ctg atg ttg aac ctc ttt gtg gcc gtc atc atg gac aac ttc gag tac 5475 Leu Met Leu Asn Leu Phe Val Ala Val Ile Met Asp Asn Phe Glu Tyr 1805 1810 1815 ctc acg cgc gac tcc tcc atc ctg ggc ccc cac cac ctg gat gaa tac 5523 Leu Thr Arg Asp Ser Ser Ile Leu Gly Pro His His Leu Asp Glu Tyr 1820 1825 1830 gtg cgg gtc tgg gcc gag tac gac cct gct gct tgg gga cgc atg ctt 5571 Val Arg Val Trp Ala Glu Tyr Asp Pro Ala Ala Trp Gly Arg Met Leu 1835 1840 1845 tac cgg gac atg tat gcg atg ctg aga cac atg ccc cca ccc ctg ggt 5619 Tyr Arg Asp Met Tyr Ala Met Leu Arg His Met Pro Pro Pro Leu Gly 1850 1855 1860 1865 ctg ggg aag aac tgc ccg gcc aga gtg gcc tac aag agg ctc ctg cgg 5667 Leu Gly Lys Asn Cys Pro Ala Arg Val Ala Tyr Lys Arg Leu Leu Arg 1870 1875 1880 atg gat ctg ccc gtg gcc gac gac aac act gtg cac ttc aac tcc aca 5715 Met Asp Leu Pro Val Ala Asp Asp Asn Thr Val His Phe Asn Ser Thr 1885 1890 1895 ctc atg gct ttg atc cgt acg gcg ctg gac atc aag atc gcc aag ggc 5763 Leu Met Ala Leu Ile Arg Thr Ala Leu Asp Ile Lys Ile Ala Lys Gly 1900 1905 1910 gga gca gat aaa cag cag atg gac gct gag ctg cgc aaa gag atg atg 5811 Gly Ala Asp Lys Gln Gln Met Asp Ala Glu Leu Arg Lys Glu Met Met 1915 1920 1925 gcc att tgg ccc aac ctg tcc cag aag aca ctg gac ctg ctg gtc aca 5859 Ala Ile Trp Pro Asn Leu Ser Gln Lys Thr Leu Asp Leu Leu Val Thr 1930 1935 1940 1945 ccc cac aag tcc acg gac ctg aca gtg ggc aag atc tat gcc gcc atg 5907 Pro His Lys Ser Thr Asp Leu Thr Val Gly Lys Ile Tyr Ala Ala Met 1950 1955 1960 atg atc atg gag tac tac cgg cag agc aaa gcc aaa aag ctg cag gcc 5955 Met Ile Met Glu Tyr Tyr Arg Gln Ser Lys Ala Lys Lys Leu Gln Ala 1965 1970 1975 atg cgc gag gag cag aac cgg aca ccg ctc atg ttc cag cgc atg gag 6003 Met Arg Glu Glu Gln Asn Arg Thr Pro Leu Met Phe Gln Arg Met Glu 1980 1985 1990 ccc ccg ccg gat gag ggg ggc gcc ggc cag aac gcc ctg ccc tcc acg 6051 Pro Pro Pro Asp Glu Gly Gly Ala Gly Gln Asn Ala Leu Pro Ser Thr 1995 2000 2005 cag ctg gac ccg gca gga ggc ctg atg gct cac gaa gac ggc ctc aaa 6099 Gln Leu Asp Pro Ala Gly Gly Leu Met Ala His Glu Asp Gly Leu Lys 2010 2015 2020 2025 gac agc cca tcc tgg gtg acc cag cgc gct cag gag atg ttc cag aag 6147 Asp Ser Pro Ser Trp Val Thr Gln Arg Ala Gln Glu Met Phe Gln Lys 2030 2035 2040 acg ggc acg tgg agc ccg gag cgc gcg ccc ccc gcc gac atg gcc gac 6195 Thr Gly Thr Trp Ser Pro Glu Arg Ala Pro Pro Ala Asp Met Ala Asp 2045 2050 2055 agc cag ccc aag cct cag tcc gtg gag atg cga gaa atg agc cag gac 6243 Ser Gln Pro Lys Pro Gln Ser Val Glu Met Arg Glu Met Ser Gln Asp 2060 2065 2070 ggc tac tcg gac agc gag cac tgc ctc ccc atg gaa ggc cag gcc cgc 6291 Gly Tyr Ser Asp Ser Glu His Cys Leu Pro Met Glu Gly Gln Ala Arg 2075 2080 2085 gcc gcc tct atg ccc cgc ctc ccc gcc gag aac cag agg aga agg ggc 6339 Ala Ala Ser Met Pro Arg Leu Pro Ala Glu Asn Gln Arg Arg Arg Gly 2090 2095 2100 2105 cgg cca cgt ggg agt gat ctc agt acc atc tgt gac acc agc ccc atg 6387 Arg Pro Arg Gly Ser Asp Leu Ser Thr Ile Cys Asp Thr Ser Pro Met 2110 2115 2120 aag cgc tcg gcc tcc gtg ctg ggc ccc aag gcg tcc cgg cgc ctg gac 6435 Lys Arg Ser Ala Ser Val Leu Gly Pro Lys Ala Ser Arg Arg Leu Asp 2125 2130 2135 gac tac tcc ctg gag cgc gtc cca ccc gag gag aac cag cga cac cac 6483 Asp Tyr Ser Leu Glu Arg Val Pro Pro Glu Glu Asn Gln Arg His His 2140 2145 2150 ccg cgg cgt cgc gag cgc gcg cat cgc acc tcc gag cgc tcc ctg ggc 6531 Pro Arg Arg Arg Glu Arg Ala His Arg Thr Ser Glu Arg Ser Leu Gly 2155 2160 2165 cgc tac acc gac gtg gac aca ggc ttg ggc acg gac ctc agc atg acc 6579 Arg Tyr Thr Asp Val Asp Thr Gly Leu Gly Thr Asp Leu Ser Met Thr 2170 2175 2180 2185 acc cag tcc ggg gac ctg ccg tcc aga gag cga gag cag gag cgc ggc 6627 Thr Gln Ser Gly Asp Leu Pro Ser Arg Glu Arg Glu Gln Glu Arg Gly 2190 2195 2200 cgg ccc aag gac cgg aag cac cgg ccg cat cac cac cac cac cac cac 6675 Arg Pro Lys Asp Arg Lys His Arg Pro His His His His His His His 2205 2210 2215 cac cac ccc ggc ccg gcg gcc gcc gac aag gaa cgc tac ggc ccg cag 6723 His His Pro Gly Pro Ala Ala Ala Asp Lys Glu Arg Tyr Gly Pro Gln 2220 2225 2230 gac cgg ccc gac cat ggc cac ggc cgc gcc cgc gcc cgg gac cag cgc 6771 Asp Arg Pro Asp His Gly His Gly Arg Ala Arg Ala Arg Asp Gln Arg 2235 2240 2245 tgg tcc cgc tcg ccc agc gag ggc cgg gag cac acc acg cac cgg cag 6819 Trp Ser Arg Ser Pro Ser Glu Gly Arg Glu His Thr Thr His Arg Gln 2250 2255 2260 2265 tag 6822
【0022】 <210>5 <211>601 <212>DNA <213>Rabbit <220> <221>CDS <222> (25)..(600) <400>5 aagctttatc gataccgtcg acct cct gcc cgc tac ggg gga gga ggc gcc 51 Pro Ala Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 ggg gca gcc gcc ggg gtg gtc gtg ggc gcc gca ggc ggg cga gga gcc 99 Gly Ala Ala Ala Gly Val Val Val Gly Ala Ala Gly Gly Arg Gly Ala 10 15 20 25 ggg ggc agc cgg cag ggc ggg cag ccc ggg gcg caa agg atg tac aag 147 Gly Gly Ser Arg Gln Gly Gly Gln Pro Gly Ala Gln Arg Met Tyr Lys 30 35 40 caa tcc atg gcg cag agg gca cgg acc atg gcc ctg tac aac ccc atc 195 Gln Ser Met Ala Gln Arg Ala Arg Thr Met Ala Leu Tyr Asn Pro Ile 45 50 55 ccg gtc cga cag aac tgc ctc acg gtc aac cgc tcc ctc ttc ctc ttc 243 Pro Val Arg Gln Asn Cys Leu Thr Val Asn Arg Ser Leu Phe Leu Phe 60 65 70 agc gag gac aac gtg gtg aga aaa tac gcg aag aag atc acc gaa tgg 291 Ser Glu Asp Asn Val Val Arg Lys Tyr Ala Lys Lys Ile Thr Glu Trp 75 80 85 cct ccc ttt gag tac atg att tta gcc acc atc ata gca aac tgc att 339 Pro Pro Phe Glu Tyr Met Ile Leu Ala Thr Ile Ile Ala Asn Cys Ile 90 95 100 105 gtc ctg gcg ctg gag cag cat ctg cca gat gac gac aag acc ccg atg 387 Val Leu Ala Leu Glu Gln His Leu Pro Asp Asp Asp Lys Thr Pro Met 110 115 120 tct gag cgg ctg gat gac aca gaa ccg tac ttc att ggc att ttt tgt 435 Ser Glu Arg Leu Asp Asp Thr Glu Pro Tyr Phe Ile Gly Ile Phe Cys 125 130 135 ttc gag gct gga att aaa att atc gcc ctg ggg ttt gcc ttc cac aaa 483 Phe Glu Ala Gly Ile Lys Ile Ile Ala Leu Gly Phe Ala Phe His Lys 140 145 150 ggg tcc tac cta agg aac ggt tgg aac gtg atg gac ttt gtg gtg gtg 531 Gly Ser Tyr Leu Arg Asn Gly Trp Asn Val Met Asp Phe Val Val Val 155 160 165 cta act ggc atc ttg gcg aca gtt ggg aca gag ttt gac ctt cgg aca 579 Leu Thr Gly Ile Leu Ala Thr Val Gly Thr Glu Phe Asp Leu Arg Thr 170 175 180 185 ctg cga gca gtg cgg gtg ctg cgg c 601 Leu Arg Ala Val Arg Val Leu Arg 190
【0023】
【図面の簡単な説明】
【図1】pBS104の制限酵素地図
【図2】P/Q-type Ca channel上流配列により転写制御
を受けるPLAP遺伝子の培養細胞での発現。
【図3】P/Q-type Ca channel上流配列及びTKプロモー
ターにより転写制御を受けるPLAP遺伝子の培養細胞での
発現。
フロントページの続き Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA11 BA12 CA09 CA20 DA02 EA04 FA01 GA11 HA17 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ13 QQ33 QQ35 QQ44 QQ48 QR32 QR33 QR56 QR57 QR62 QS25 QS34 4B065 AA90Y AA91Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA31 CA44

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列番号1に記載の塩基配列からなるDN
    A。
  2. 【請求項2】配列番号2に記載の塩基配列からなるDN
    A。
  3. 【請求項3】配列番号3に記載の塩基配列からなるDN
    A。
  4. 【請求項4】配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA
    とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
    該DNAの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現
    させるDNA。
  5. 【請求項5】配列番号1に記載の塩基配列の一部からな
    るDNAをプライマーとしてPCRにより増幅されるDNAで、
    かつ該DNAの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に
    発現させるDNA。
  6. 【請求項6】配列番号1に記載の塩基配列の一部からな
    るDNA、あるいはそれらDNAの組合せからなり、かつ該DN
    Aの下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に発現させ
    るDNA。
  7. 【請求項7】配列番号4に記載の塩基配列あるいはその
    一部からなるDNAをプローブとして用い、下流につなが
    れた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAをクローニ
    ングする方法。
  8. 【請求項8】配列番号5に記載の塩基配列あるいはその
    一部からなるDNAをプローブとして用い、下流につなが
    れた外来遺伝子を神経細胞に発現させるDNAをクローニ
    ングする方法。
  9. 【請求項9】配列番号4あるいは配列番号5に記載の塩
    基配列、あるいはそれらの一部からなるDNAをプローブ
    として用い、下流につながれた外来遺伝子を神経細胞に
    発現させるDNAをクローニングする方法によりクローニ
    ングされたDNA。
  10. 【請求項10】請求項1ないし6及び9の何れか一項に
    記載されたDNAを含有するベクター。
  11. 【請求項11】請求項1ないし6及び9の何れか一項に
    記載されたDNAを含有するDNAにより形質転換した細胞。
  12. 【請求項12】請求項1ないし6及び9の何れか一項に
    記載されたDNAを含有するDNAを組込んだトランスジェニ
    ックマウス。
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