ES2284228T3 - Optimizacion de celulas para la activacion endogena del gen. - Google Patents

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Abstract

LA INVENCION TRATA DE PROCEDIMIENTOS PARA LA OPTIMIZACION DE LA EXPRESION GENICA EN CELULAS. UN PRIMER ASPECTO TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA VARIAR LA EXPRESION DE UN GEN QUE SE ENCUENTRA EN UNA CELULA EUCARIOTICA MEDIANTE LA INTRODUCCION DE UNA SECUENCIA HETEROLOGA DEL CONTROL DE LA EXPRESION EN EL GENOMA DE LA CELULA MEDIANTE RECOMBINACION HOMOLOGA, ASI COMO EL CORTE MEDIANTE UNA RECOMBINASA ESPECIFICA DEL SITIO DEL DNA EXTRAÑO INSERTADO, Y SU SUSTITUCION POR OTRAS SECUENCIAS HETEROLOGAS DE CONTROL DE LA EXPRESION O/Y GENES DE AMPLIFICACION. TAMBIEN TRATA LA INVENCION DE LA INTRODUCCION DE UNA O VARIAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO, A LAS CUALES ESTA UNIDA UNA PROTEINA ACTIVADORA O UN COMPLEJO PROTEINICO ACTIVADOR, P. E. UN FACTOR INDUCTOR DE LA HIPOXIA (HIF) EN EL GENOMA DE UNA CELULA EUCARIOTICA MEDIANTE RECOMBINACION HOMOLOGA, PARA VARIAR LA EXPRESION DE UN GEN. TAMBIEN TRATA LA INVENCION DE UN PROCEDIMIENTO PARA INVESTIGAR LA INFLUENCIA POR EL EXTREMO 5 '' O 3 '' DE FRAGMENTOS DE ACIDONUCLEICO NO CODIFICADOR SOBRE LA EXPRESION DE UN GEN DIANA MEDIANTE LA DETERMINACION DE LA EXPRESION DE UN GEN INFORMADOR. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UNA CELULA EUCARIOTICA QUE ES NEGATIVA AL DHFR QUE CONTIENE UNA SECUENCIA DE RECOMBINASA, ASI COMO LA EXPRESION DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO INSERTA EN LA SECUENCIA DE LA RECOMBINASA.

Description

Optimización de células para la activación endógena del gen.
La invención se refiere a la introducción de dos secuencias de ácido nucleico, en las que la proteína activador se une al factor inducible por hipoxia (HIF), en el genoma de una célula eucarióntica por recombinación homóloga, para cambiar la expresión de un gen objetivo o específico.
La expresión de un gen en una célula puede efectuarse de forma constitutiva, por ejemplo, en los denominados genes Housekeeping, o bien de forma regulada. La expresión regulada es especialmente necesaria para los genes, los cuales deben ser expresados únicamente en un estadio de desarrollo determinado de la célula o bien en un cambio de las condiciones ambientales.
La expresión se regula a nivel de transcripción a través del promotor unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico codificada, cuya actividad puede ser controlada a través de represores y activadores. Un enlace de los represores o de los activadores a las secuencias de ácido nucleico no codificadas del gen puede producir una disminución o un aumento de la actividad del promotor (L. Stryer, Biochemie, capitulo 12, Spectrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft, Heidelberg, 1990). La cantidad de represores o de activadores contenidos en una célula es regulada de nuevo por factores como, por ejemplo, las condiciones ambientales. Un ejemplo de activadores son los factores inducibles por hipoxia (HIF), que son inducidos por una oferta de O_{2} reducida y conducen a una elevada expresión del gen de eritropoyetina (Blanchard K.L, y cols., Hypoxic induction of the human erythropoietin gene: Cooperation between the promotor and enhancer, each of which contains steroid receptor response elements,(1992), Mol. Cell. Biol. 12, 5373-5385: Wang G.L. y Semenza G.L., Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia, (1993), J. Biol. Chem., 268, 21513-21518; Wang G.L., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O_{2} tension, (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514).
Además, la cantidad de una proteína expresada o manifestada depende de la estabilidad del ARNm. En un sector lateral 3' de un ARNm se localizan secuencias de reconocimiento para los enzimas desintegrados del ARNm, que influyen en la estabilidad del ARNm y por tanto en la magnitud de la expresión (Shaw G. y Kamen R., A conserved AU sequence from the 3'untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation, Cell(1986), 659-667). El periodo de semidesintegración del ARNm se correlaciona pues con la cantidad de proteína expresada. Un tercer nivel de la regulación de la expresión es la traslación.
La expresión de un gen se basa por tanto en unos mecanismos de regulación complejos, que pueden ser muy diferentes en cada caso.
Las proteínas pueden obtenerse con ayuda de la tecnología del ADN recombinante, que aprovecha los conocimientos de la regulación de la expresión (Sambrook u cols., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Col Spring Harbor). Para ello se emplean vectores que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína correspondiente bajo el control de un promotor adecuado, así como otras secuencias necesarias para la expresión de la proteína y para la replicación del vector. El vector se introduce entonces mediante un método conocido en una célula anfitriona, la célula se cultiva y la proteína recombinante puede obtenerse a partir de la célula o del medio de
cultivo.
Como células anfitrionas se pueden emplear las células procariónticas o eucariónticas. Las células procariónticas, en particular las células de E.coli, no son problemáticas en lo que se refiere a su manipulación, pero presentan una serie de inconvenientes en una expresión recombinante de proteínas eucariónticas.
Los procariontes y eucariontes se distinguen por una vía de procesamiento de la expresión, en las condiciones del medio celular así como en el "Chaperon" que interviene en el tratamiento de la proteína. Por eso pueden aparecer diferencias decisivas en una proteína eucarióntica fabricada en los procariontes en comparación con la proteína nativa correspondiente. Por ejemplo, la muestra de plegamiento de la proteína y la actividad de la proteína varían. Además las proteínas en una célula procarióntica generalmente no se glucosilan. Una muestra de glucosilación correcta equivale en muchos casos, por ejemplo en la síntesis de proteínas para una formula farmacéutica, a una característica decisiva para la eficacia y la tolerancia.
Las proteínas glucosiladas son fabricadas pues por medio de células anfitrionas eucariónticas o líneas celulares, por ejemplo CHO (Chinese Hamster Ovary). A pesar de la utilización de las células eucariónticas pueden aparecer cambios en la proteína fabricada de forma recombinante debido a las diferentes especies, por ejemplo, en la expresión de una proteína humana en células no humanas, lo que hace que ésta no se pueda utilizar en muchas aplicaciones.
Para la fabricación recombinante de proteínas las células anfitrionas ocasionales o transitorias o bien estables son transfeccionadas con vectores de expresión, donde se emplean células transfeccionadas estables especialmente en un método de fabricación muy técnico.
La integración casual poco específica de las secuencias del vector de expresión en el genoma de la célula anfitriona puede llevar a células con un rendimiento de producción escaso o bien a unas propiedades celulares inestables. Por ejemplo, puede disminuir el rendimiento de producción en el transcurso del proceso de producción o bien la capacidad de las células de expresar la proteína recombinante puede perderse del todo.
La presente invención se refiere a un método para modificar la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos presente de forma endógena en una célula humana,
que se caracteriza porque
a)
la célula es transfeccionada con un vector, que comprende
(i)
dos de las secuencias objetivo formadas a partir de la proteína activador HIF, elegidas de la secuencia conforme a SEQ ID NO.1 y la secuencia conforme a SEQ ID NO.2,
(ii)
un gen marcador de selección positivo,
(iii)
las secuencias de ADN flanqueadas por las secuencias(i) y (ii), que son homólogas a un segmento de ácido nucleico en un genoma de la célula, de manera que las secuencias homólogas (iii) se eligen de forma que se realiza una integración genómica de las secuencias de ácidos nucleicos enlazadas a la proteína activador (i) en una zona de la secuencia de control de la expresión del gen objetivo para permitir una recombinación homóloga,
b)
la célula transfeccionada es cultivada en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación homóloga del vector, y
c)
se consigue la célula obtenida según el apartado (b), y
d)
la célula es transfeccionada con un vector que comprende
(i)
una secuencia de ácido nucleico codificada para la proteína activador HIF-1\alpha y una para la proteína activador HIF-1\beta, que están enlazadas operativamente con una secuencia de control de la expresión activa en esta célula, y
(ii)
si fuera preciso un gen marcador de selección positivo.
Mediante la integración genómica de una secuencia de ácidos nucleicos, que induce el enlace de una o varias proteínas activador (mediante el enlace a la secuencia de ácidos nucleicos de proteínas que elevan la expresión genética), en la zona de la secuencia de control de la expresión de un gen específico, en particular en sus zonas o regiones reguladoras, no se reduce sorprendentemente la expresión del gen específico, sino que por el contrario es posible que mediante las condiciones adecuadas del cultivo se incremente la expresión del gen específico presente de forma endógena o bien se induzca la expresión de un gen específico presente de forma endógena no expresado.
Las proteínas activador son los factores inducidos por hipoxia HIF-1\alpha y HIF-1\beta.
Tras el acoplamiento operativo de dos secuencias de ácido nucleico enlazadas al HIF con un gen objetivo presente de forma endógena se puede regular la expresión del gen objetivo. Esto tiene la ventaja, en particular en una fabricación técnica importante, de que la expresión de una proteína pueda ser inducida en un momento óptimo para el proceso de fabricación. Es preferible por tanto que se reduzca el periodo de duración medio del producto de síntesis en el sobrante del medio de cultivo. De este modo, se puede reducir la cantidad de productos disgregados no deseados de la proteína. Esto actúa de forma positiva en la realización de las etapas de limpieza posteriores, se reducen los costes de fabricación y se llega a un producto final que ha mejorado desde un punto de vista cualitativo.
Para llevar a cabo el proceso conforme a la invención es suficiente con acoplar de forma operativa dos secuencias de ácido nucleico enlazadas al HIF, elegidas de la secuencia 53 bp conforme a la secuencia ID NO.1 y de la secuencia 43 bp conforme a la secuencia ID NO.2, con el gen objetivo.
La utilización de dos secuencias de ácidos nucleicos enlazadas al HIF conduce sorprendentemente a un efecto sinergístico. De este modo se alcanza un incremento mayor de la expresión de ácidos nucleicos endógenos que si se utilizan cada una de estas secuencias por si solas.
La secuencia de control de la expresión unida operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos codificada para la proteína activador puede ser inducida de manera que se pueda conseguir una posibilidad adicional de la activación mediante unas condiciones de cultivo adecuadas, como por ejemplo, la adición de hormonas o metales pesados. De este modo es posible inducir la expresión de un gen objetivo endógeno en un momento óptimo para el proceso de fabricación.
La utilización de una secuencia de control de la expresión activa tiene la ventaja de que la proteína activador se expresa independientemente de la adición de activadores al medio de cultivo.
Cuando la secuencia de ácido nucleico enlazada a la proteína activador es una secuencia de ácido nucleico enlazada al HIF, se puede inducir por ejemplo la expresión del gen objetivo mediante unas condiciones de cultivo adecuadas, por ejemplo, para una concentración de O_{2} del 0,1 al 2%.
Otro objetivo de la presente invención es una célula humana que se obtiene conforme a uno de los métodos descritos. Esta célula se caracteriza porque contiene al menos un gen presente en la célula de forma endógena que se acopla operativamente con una secuencia de control de la expresión y con dos fragmentos de ácido nucleico, elegidos de la secuencia conforme a SEQ ID NO.1 y de la secuencia conforme a SEQ ID NO.2, enlazados a la proteína activador HIF, heterólogos, localizados en los cromosomas, integrados genómicamente en la zona de la secuencia de control de la expresión de un gen objetivo, y un vector, que comprende una secuencia de ácido nucleico codificada para la proteína activador HIF-1\alpha y una secuencia de ácido nucleico codificada para la proteína activador HIF-1\beta, que están unidas operativamente a una secuencia de control de la expresión activa en esta célula y si fuera preciso contiene un gen marcador de selección positivo. Con ayuda de un sistema de recombinación específico del lugar se pueden sumergir en un genoma los fragmentos de ácido nucleico enlazados a la proteína activador, de manera que es posible una simple identificación de una secuencia de activador óptima para un gen objetivo determinado.
La invención se aclara con ayuda del ejemplo, figura y protocolo de secuencia siguiente.
Descripción de la figura
Figura 1
Muestra la expresión de la eritropoyetina (EPO) controlada por el CMV-promotor/HIF de las células HeLa S3, que son transfeccionadas con los vectores pHYG, pHIF-1\alpha y pARNT (pHIF-1\beta) y cuya expresión EPO se midió 3, 4 y 5 días después de la transfección en los sobrantes celulares (concentración de eritropoyetina en \mug/ml).
pHYG: Vector de control, pHIF-1\alpha: un HIF-1\alpha cADN bajo el control de un promotor SR\alpha, pARNT: un HIF-\beta cADN bajo el control de un promotor CMV.
SEQ ID NO.1
muestra una primera secuencia de nucleótidos enlazada al HIF
SEQ ID NO.2
muestra una segunda secuencia de nucleótidos enlazada al HIF
SEQ ID NO.3
muestra una secuencia loxP
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión de un gen de eritropoyetina bajo el control de un promotor CMV y sobre expresión del HIF
Los vectores pHYG, pHIF-1\alpha y pARNT (compárese figura 3) son transfeccionados en células HeLa-S3 modificadas genéticamente. En las células se ha introducido un CMV (citomegalovirus) proximal al gen de eritropoyetina (EPO) al inicio de la traslación de un alelo EPO, que controla la expresión del EPO. Las células producen normalmente 1 \mug de eritropoyetina cada 24 horas por 10^{7} células. 24 horas antes de la transfección son transportadas con una concentración de 6 x 10^{4} células por 6 planchas de agujeros. El día de la transfección las células son incubadas con una mezcla DNA-DOTAP. La mezcla contiene 1,25 \mug del vector respectivo, 10 \mug de DOTAP (Boehringer Mannheim 1202375) hasta 75 \mul en tampón Hepes 20 mM por orificio. La mezcla es incubada previamente durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Luego las células se incuban en 3 ml de medio por agujero con el ADN-DOTABP durante 6 horas. A continuación, las células se lavan dos veces con tampón PBS y se cultivan en un medio completo durante 5 días. El día 3, 4 y 5 se recogen 100 \mul respectivamente de residuo y se analizan con una ELISA de eritropoyetina. El ensayo se concluye el día 5 y se determina el número de células. Se calcula la cantidad de eritropoyetina por orificio respecto al mismo número de células (compárese figura 3).
El ejemplo muestra que una inducción del gen de eritropoyetina siempre es posible a través del HIF aunque se haya introducido una secuencia de control de la expresión heteróloga (promotor de CMV) en la región promotor de un alelo del gen de eritropoyetina. El incremento medido de la concentración de eritropoyetina se refiere a un efecto sinergístico del factor que induce la hipoxia o bien de los factores que inducen la hipoxia en ambos alelos.
Se pone de manifiesto que la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos endógena se puede elevar introduciendo una secuencia de control de la expresión heteróloga. Si se manifiesta un activador (HIF) en la célula, para el cual existen secuencias de ácidos nucleicos enlazadas a la secuencia de control de la expresión, se puede incrementar de nuevo la expresión de este gen. Si no existen las secuencias correspondientes en este locus genético, se pueden conseguir mediante la aplicación del método conforme a la invención por medio de la recombinación homóloga en el genoma.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Inscripción:
\vskip0.500000\baselineskip
(a)
Nombre: Boehringer Mannheim GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
(b)
Calle: Sandhofer Strasse 112-132
\vskip0.500000\baselineskip
(c)
Lugar: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
(d)
País: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(e)
Código postal: D-68305
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
Nombre de la invención: Optimización de células para la activación genética endógena
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
Número de secuencias: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
Versión legible del ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
(a)
Soporte de datos: Floppy Disk
\vskip0.500000\baselineskip
(b)
Ordenador: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(c)
Sistema de funcionamiento: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(d)
Software: PatentIn Release nº1.0, versión 1.30(EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Datos respecto a la secuencia ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(a)
Longitud: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(b)
Tipo: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(c)
Forma de ramificación: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
(d)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Sec ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCTCCTCT AGGCCCGTGG GGCTGGCCCT GCACCGCCGA GCTTCCCGGG ATG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Datos respecto a la secuencia ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(a)
Longitud: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(b)
Tipo: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(c)
Forma de ramificación: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
(d)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Sec ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACGTGCTG TCTCACACAG CCTGTCTGAC CTCTCGACCC TAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Datos respecto a la secuencia ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
(a)
Longitud: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(b)
Tipo: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(c)
Forma de ramificación: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
(d)
Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: Sec ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Roche Diagnostics GMBH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Optimización de células para la activación genética endógena
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Activación genética endógena 15964P EP-2
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 99112607.9
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1998-12-01
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 97121075.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1997-12-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctctcctct aggcccgtgg ggctggccct gcaccgccga gcttcccggg atg 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctacgtgctg tctcacacag cctgtctgac ctctcgaccc tac 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Bacteriófago P1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tattgaagca tattacatac gatatgcttc aata 
\hfill
34

Claims (2)

1. Método para modificar la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos presente de forma endógena en una célula humana,
que se caracteriza porque
(a)
La célula es transfeccionada con un vector, que comprende
(i)
Dos de las secuencias de ácidos nucleicos unidas a la proteína activador HIF, seleccionadas de la secuencia conforme a la SEQ ID NO.1 y de la secuencia conforme a SEQ ID NO.2
(ii)
Un gen marcador positivo de la selección,
(iii)
Las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i) y (ii), que son homólogas a un segmento de ácido nucleico en un genoma de la célula, de manera que las secuencias homólogas (iii) se eligen de forma que se realiza una integración genómica de las secuencias de ácido nucleico unidas a la proteína activador (i) en la zona de la secuencia de control de la expresión del gen específico para permitir una recombinación homóloga,
b)
la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación homóloga del vector,
c)
se consigue la célula obtenida según el apartado (b), y
d)
la célula es transfeccionada con un vector que comprende
(i)
una secuencia de ácido nucleico codificada para la proteína activador HIF-1\alpha y una para la proteína activador HIF-1\beta, que están unidas operativamente a una secuencia de control de la expresión activa en esta célula, y
(ii)
si fuera preciso, un gen marcador positivo de la selección.
2. Célula humana que
se caracteriza porque
contiene al menos un gen presente de forma endógena en la célula, acoplado operativamente con una secuencia de control de la expresión y con dos fragmentos de ácido nucleico, elegidos de la secuencia conforme a SEQ ID NO.1 y de la secuencia conforme a SEQ ID NO.2, enlazados a la proteína activador HIF, heterólogos, localizados en el cromosoma, integrados genómicamente en una zona de la secuencia de control de la expresión de un gen objetivo, y un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico codificada para la proteína activador HIF-1\alpha y una para la proteína activador HIF-1\beta, que están enlazadas operativamente a una secuencia de control de la expresión activa en esta célula, y si fuera preciso contiene un gen marcador positivo de la selección.
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