KR19990062655A - 내인성 유전자 활성화를 위해 세포를 최적화시키는 방법 - Google Patents

내인성 유전자 활성화를 위해 세포를 최적화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포내에서 유전자 발현을 최적화하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 첫 번째 관점은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 세포의 게놈 내부로 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자를 주입시킴으로써 진핵 세포내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 발현을 변경시키기 위한 방법에 관한 것이며, 또한 다른 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자에 의해 부위 특이적 재조합효소(site-specific recombinase) 및 그 대체물에 의해 매개된 삽입된 이질 DNA의 절제에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 변경시키기 위해 하나 또는 일부의 핵산 서열을 동종 재조합에 의해 진핵 세포의 게놈 내부의 하이폭시아(hypoxia) 유도 인자(HIF) 등의 활성체 단백질 또는 활성체 단백질 복합물에 도입하는 것이다. 더욱이, 본 발명은 리포터 유전자의 발현을 측정함으로써 표적 유전자의 발현에 대한 5' 또는 3'상에 비코드 핵산 단편의 영향을 시험하기 위한 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 재조합효소 표적 서열 내부로 삽입된 핵산 서열의 발현 및 재조합 표적 서열을 포함하는 DHFR-음성 진핵 세포를 제공하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

내인성 유전자 활성화를 위해 세포를 최적화시키는 방법
본 발명은 세포내에서 유전자 발현을 최적화하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 첫 번째 관점은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 세포의 게놈 내부로 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자를 주입시킴으로써 진핵 세포내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 발현을 변경시키기 위한 방법에 관한 것이며, 또한 다른 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자에 의해 부위 특이적 재조합효소(site-specific recombinase) 및 그 대체물에 의해 매개된 삽입된 이질 DNA의 절제에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 변경시키기 위해 하나 또는 일부의 핵산 서열을 동종 재조합에 의해 진핵 세포의 게놈 내부의 하이폭시아(hypoxia) 유도 인자(HIF) 등의 활성체 단백질 또는 활성체 단백질 복합물에 도입하는 것이다. 더욱이, 본 발명은 리포터 유전자의 발현을 측정함으로써 표적 유전자의 발현에 대한 5'측면 또는 3'측면상에 비코드 핵산 단편의 영향을 시험하기 위한 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 재조합효소 표적 서열 내부로 삽입된 핵산 서열의 발현 및 재조합 표적 서열을 포함하는 DHFR-음성 진핵 세포를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
세포 내의 유전자 표현은 소위 하우스키핑 유전자 내에서 구조적으로 발생되거나 제어될 수 있다. 제어된 발현은 세포의 특정 개선 단계 또는 환경적 개선 단계에서 변화가 있을 때 발현되기 위한 유전자용으로 특히 필요하다.
발현은 코드 핵산 서열로 작동연결된 프로모터에 의해 전사(transcription) 단계에서 조절되며, 그 활성도는 억제체 및 활성체에 의해 제어될 수 있다. 억제체 또는 활성체에 유전자의 비코드 핵산 서열의 결합은 프로모터의 활성도를 감소시키거나 증가시킬 수 있다(엘. 스트리어(L. Stryer), 바이오케미(Biochemi), 12장, 과학의 스펙트럼, 출판협회 하이델베르그, 1990). 세포 내에 함유되어 있는 억제체 및 활성체의 양은 환경 조건과 같은 요소에 의해 차례로 조절된다. 하이폭시아(hypoxia) 유도 인자(HIF)는 감소된 O2공급량에 의해 유도된 활성체의 예이며, 에리스로포이에틴(erythropoietin) 유전자의 발현의 증가를 초래한다(블랭차드 케이.엘.(Blanchard K.L. et al., 인간 에리스로포이에틴 유전자의 하이폭시아 도입: 프로모터(promoter)와 인핸서(enhancer) 사이의 협력, 각각은 스테로이드 수용체 반응 요소를 함유한다, (1992), Mol. 세포. 생물학. 12, 5373-5385; 왕 지.엘(Wang G.L.et al.), 하이폭시아-유도 인자 1 은 세포질의 O2응력에 의해 조절된 basic-helix-loop-helix- 비정형2분자체이다. (1995), proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514).
또한, 발현된 단백질의 양은 mRNA의 안정성에 따라 달라진다. 효소를 강등시키기 위한 mRNA용 인지 서열은 mRNA의 안정성에 영향을 끼치는 mRNA 의 3' 영역내에 위치된다(쇼.지(Shaw G.) 및 카멘, 알.(Kamen, R), A Conserved AU Sequence from the 3' Untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation, Cell(1986), 659-667). 이와 관련하여, mRNA 의 수명은 발현된 단백질의 양과 관련있다. 발현 조절의 제 3 순위는 번역(translation)이다.
따라서, 유전자의 발현은 각각의 경우에 있어서 크게 다른 복합 조절 메카니즘에 놓이게 된다.
단백질은 발현조절에 지식을 이용하는 재조합 DNA 기술로 인해 얻어질 수 있다(샘브룩, 1989, 분자 클로닝, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). 단백질을 발현하기 위해 필요한 부가적인 서열과 적합한 프로모터의 제어하에서 대응 단백질에 대해 코드화한 핵산 서열 코드를 함유하는 벡터가 사용되며, 벡터를 복제한다. 벡터는 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내부로 유입되며, 세포는 배양되며 재조합형 단백질은 세포 또는 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
숙주 세포로 원핵 또는 진핵 세포가 사용될 수 있다. 원핵 세포, 특히 대 장균 세포는 진핵 세포가 재조합형으로 발현될 때 취급하기는 문제가 없으나 다수의 단점을 갖는다.
원핵 및 진핵 생물은 발현 진행 통로, 세포 배지 조건과 단백질 처리에 관련된 샤프론(chaperones) 내에서 서로 다르다. 따라서, 원핵 생물 내에서 제조된 진핵 단백질은 대응하는 천연 단백질과는 결정적으로 다르다.
예를 들어, 단백질 폴딩 패턴 및 단백질의 활성도는 변경될 수 있다. 또한, 원핵 숙주 세포 내의 단백질은 항상 글리코시드화되는 것은 아니다. 그러나, 올바른 글리코시드화 패턴은 많은 경우에 있어서 조제 공식화를 위한 단백질의 제조에서 효과 및 내성이 결정적인 특성이다.
글리코시드화된 단백질은 예를 들어 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포와 같은 진핵 숙주 세포 또는 세포 라인에 의해 제조된다. 진핵 세포의 사용에도 불구하고, 재조합형으로 제조된 단백질 내에서의 변화는 종(species)의 차이, 예를 들어 많은 적용예에서 비적절한 방법인 비-인간 세포내에 인간 단백질을 발현할 때 발생할 수 있다.
단백질의 재조합 제조를 위해, 숙주 세포는 발현 벡터로 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙팅되며, 특히 안정되게 트랜스펙팅된 대용량의 제조 공정에 사용된다.
숙주 세포의 게놈 내부로 발현 벡터 서열의 임의의 비특정 통합은 낮은 제조 용량을 갖는 세포 또는 불안정한 세포의 특성을 초래할 수 있다. 예를 들어, 제조 출력량은 제조 공정 과정중에 감소될 수 있으며, 재조합형 단백질을 발현시키기 위한 세포의 출력은 완전히 손실될 수 있다.
유전자 발현을 증가시키기 위한 방법은 유전자의 증폭으로, 단백질용으로 코드화된 핵산 서열은 증폭 유전자와 결합된다. 두 서열의 증가는 발현의 증가를 초래하는 선택 단계에 의해 달성된다(스킴케, 알. 티.(1982), 유전자 증폭, 콜드 스프링 하버 Lab., 콜드 스프링 하버, 뉴욕).
탈수산엽산(dihydrofolate) 환원 효소(DHFR)에 대해 코드화된 핵산은 증폭 유전자로 사용된다(코프만 알.제이., 샤프 피.에이.(1982), 서열의 증폭 및 발현은 모듈 탈수산엽산 환원효소 보조 DNA 유전자로 함께 트랜스펙팅된다., 제이. 몰. 생물학.(J. Mol. Biol.) 159 : 601 ff).
메토트랙사트(methotrexate)와 수행된 선택 단계는 세포가 메토트랙사트에 저항하며 게놈 내에 DHFR용으로 코드화된 핵산 서열, 및 20 내지 50 배 증폭되어 결합된 핵산 서열을 함유할 수 있다(에르. 크니퍼스, 1982, 분자 유전학, 티메, 슈투트가르트).
이러한 유전자 증폭 방법은 DHFR- 음성 세포로 가장 효과적으로 수행된다. JP-62265992 는 인간 DHRF- 음성 세포를 기술하고 있다. 그러나, 이러한 세포 내에 동종 재조합 및 이러한 서열의 증폭에 의해 발현 벡터의 부위 특이적(site-specific) 통합에 대해서는 언급되어있지 않다.
유전자 증폭 공정을 수행할 때에도, 세포의 불안정성과 같은 전술한 단점은 세포의 게놈 내부로 발현 벡터의 임의의 통합으로 인해 발생할 수 있다.
이질적인 DNA 가 내인성 유전자 활성을 초래하는 동종 재조합에 의해 선택된 유전자 위치에서 부위 특이적으로 통합될 때만이 전술한 단점을 방지할 수 있다. 대응 방법은 공지되어 있으며, 유전자 표적(gene targeting)으로 불려진다(WO 90/11354; WO91/09955). 이러한 공정에서, 세포는 세포 유전자 내부로 벡터를 통합하기 위해 의도된 유전자 위치에서 동종인 핵산 서열에 의해 플랭킹되어진 양성 선택 표지 유전자(marker gene)를 함유하는 벡터로 트랜스펙팅된다. 동종의 핵산 서열 사이에는, 세포내에 표적 유전자의 발현을 증가시키기 위한 비정형 발현 제어 서열이 부가적으로 존재하며, 표적 유전자의 사본 수를 증가시키기 위한 증폭 유전자가 선택적으로 존재한다.
전술한 유전자 표적 방법의 단점은 상업상 이용 복적에 따른 충분한 양과 질의 소정의 단백질의 제조를 가능하게 하는 특성을 갖는 세포를 제조하기 위해서는 많은 어려움이 요구된다는 것이다. 특히, 소정의 표적 단백질의 발현을 위한 최적의 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자는 소정의 재조합이 발생하는 클론을 분리하기 위한 복잡한 공정으로 인해 극히 시간 소모적인 다수의 일련의 동종 재조합이 요구된다.
동종 재조합은 단백질 기능 연구를 수행하기 위해 세포 내에 임의의 유전자의 발현을 제지하기 위해 사용된다. 이를 위해, 검사되어질 단백질용으로 코드화된 유전자는 배 간 세포 내의 동종 재조합에 의해 제지되는 녹아웃 마우스(knockout mice)가 제조된다. 부가 공정 단계를 수행한 후에, 이러한 유전자의 대립 유전자의 비활성으로 인한 개선점의 시초로부터 기능성 단백질을 발현시킬 수 없도록 하는 마우스가 얻어진다(토마스, 케이. 알., 카페키 엠. 알.,(1987),마우스 배 유도된 간 세포에서 유전자 표적차에 의한 부위 부위 유도적 돌연변이 유발).
Cre-Lox 시스템은 임의의 유전자를 조직 특이적으로, 시간 특이적으로 제지하고 이를 검사하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적에 따라, 핵산 단편은 동종 재조합에 의해 세포의 게놈 내부로 도입된 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹되며, 연속적으로 세포 내에 발현된 Cre 재조합효소에 의해 게놈으로부터 다시 분리될 수 있다(사우어 비, 헨델슨 엔(1989) : 표유류 세포의 게놈 내에 위치된 loxP 부위에 부위 특이적 DNA 재조합. 핵산 Res 17 : 147-161; 사우어 비., 헨델슨 엔(1990), Cre 재조합효소에 의해 진핵 게놈 내부로 외인성 DNA의 표적 삽입, New Biol. 5: 441-449). 종래 기술은 내인성 유전자 발현을 변경시키기 위해 진핵 세포의 게놈 내부로 증폭 유전자 또는 발현 제어 서열의 부위 특이적 통합에 대한 다른 부위 특이적 재조합 효소 시스템 또는 Cre-lox 시스템의 사용에 대해서는 언급하고 있지 않다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 단점을 적어도 부분적으로 제거한 동종 재조합에 의한 내인성 유전자 활성을 최적화하기 위한 새로운 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 진핵 세포 내에 유전자의 발현 출력의 최적화를 상당히 간략하게 하는 새로운 공정 및 벡터 구성물을 제공함으로써 얻어진다.
도 1은 (A) 제 1 벡터로 사용되는 동종 재조합용 벡터를 도시하고 있다. (여기서, HR :동종 서열, Seq 1 : 제 1 비정형 발현 제어 서열, R1: 양성 선택 표지 유전자, loxP : 정위를 갖는 loxP 서열).
(B) (a) 동종 재조합이 완료된 이후, (b) Cre 재조합에 의해 촉매화된 loxP 에 의해 플랭킹된 서열의 절제 이후의 게놈 서열을 도시하고 있다.
(C) loxP 서열 사이에 배열된 서열을 포함한 Cre 재조합효소 매개 통합용 벡터를 도시하고 있다. (c) loxP 서열에서 제 2 벡터의 통합 이후에 게놈 서열을 도시하고 있다(R2 : R1 과는 선택적으로 다른 양성 선택 표지 유전자, Seq 2 : 제 2 비정형 발현 제어 서열).
도 2는 (A) 동종 재조합 HR : 동종 서열, R-박스: 양성 및 선택적으로 음성 선택 표지 유전자, loxP :정위를 갖는 loxP 서열, HSV-tk : Herpes 단일 티미딘 카나아제용 벡터를 도시하고 있다.
(B) 한측면이 동종인 서열인 동종 재조합용 벡터를 도시하고 있다.
도 3은 벡터 PHYG 로 트랜스펙팅된 HeLa S3 의 CMV 프로모터/HIF -제어식 에리스로포이에틴(EPO)를 도시하고 있으며, pHIF-1α 및 pARNT (pHIF-1β) 및 EPO 발현은 트랜스펙팅된 이후 3,4,5일 세포 상청액(3,4,5)내에서 측정된다(㎍/ml 내의 에리스로포이에틴 농도).
pHYG : 제어 벡터, pHIF-1α: SRα 프로모터의 제어하에서 HIF-1α, pARNT : CMV 프로모터 제어하의 HIF-β cDNA .
도 4는 CMV 프로모터(C) 및 리포터 유전자 β-갈락토시다아제(B)를 각각 함유한 다른 벡터를 도시하고 있으며, 다른 길이를 갖는 표적 유전자(S)의 비코드핵산 부분이 이러한 서열 사이에 삽입된다. 비코드 핵산 부분의 길이는 벡터 A3-178 0kb와, 벡터 A3-177 2.5 kb와, 벡터 A3-175 3.7 kb ,벡터 A3-181 5.7kb 이다. 제어 벡터 pNASSβ는 CMV 프로모터없이 리포터 유전자 β-갈락토시다아제를 함유한다.
도 5는 희석 시리즈(1:2 내지 1:128) 내의 도 4의 벡터로 HeLa S3이 트랜스펙팅된 이후에 리포터 유전자 β-갈락토시다아제의 발현의 측정을 도시하고 있다.
도 6은 (A) DHFR 유전자 궤적 내에 동종 재조합을 위한 벡터 pNDI를 도시하고 있다. 양성 선택 표지 유전자(Neo)는 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된다. DHFR 유전자(5',3' DHFR 영역)에 동종인 서열은 loxP 서열의 5' 측면과 다른 loxP 서열의 3'측면 상에 위치된다.
(B) DHFR 유전자 궤적 내에 동종 재조합용 벡터 pHDI를 도시하고 있다. 양성 선택 표지 유전자(Hyg)는 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된다. DHFR 유전자(5',3' DHFR 영역)에 동종인 서열은 loxP 서열의 5' 측면과 다른 loxP 서열의 3'측면 상에 위치된다.
도 7은 (A) 엑손1, 엑손 2, 엑손3과 그 사이에 위치된 인트론과 DHFR 유전자의 게놈 구성을 도시하고 있다.
(B) 도 6의 벡터에 대응하는 표적 구성물을 도시하고 있다.
(C) DHFR 유전자내에 동종 재조합용 벡터의 동종 재조합이 완료된 이후에 게놈 구조를 도시하고 있다. EcoRI 분열 장소 사이의 거리는 벡터 pNDI를 사용하여 2.9 kb 이며 벡터 pHDI를 사용할 때 3.7 kb 이다. Neo :네오마이신, Hyg : 히그로마이신, kb : 킬로염기.
도 8은 조절 서열을 각각 포함하고 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된 단백질 X용으로 코드화된 핵산 서열 및 DHFR 단백질용으로 코드화된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도시하고 있다. 이러한 벡터는 loxP 서열내의 게놈 내부로 Cre 재조합효소 촉매화된 통합용으로 사용될 수 있다.
서열 번호 1은 제 1 HIF -결합 누클레오티드 서열을 도시하고 있으며,
서열 번호 2는 제 2 HIF -결합 뉴클레오티드 서열을 도시하고 있으며,
서열 번호 3은 loxP 서열을 도시하고 있다.
본 발명의 첫 번째 관점은 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변화시키기 위한 공정에 관한 것으로서, 다음을 특징으로 하고 있다.
(a) 세포는 (i)제 1 비정형 발현 제어 서열 및 제 1 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열, (ii) 양성 선택 표지 유전자, (iii) 서열(i) 및 (ii)에 플랭킹되어진 부위 특이적 재조합효소에 대한 적어도 두 개의 표적 서열, 및 (ⅳ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈 내부로 핵산 섹션에 동종인 서열 (i), (ii), (iii)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 트랜스펙팅된 세포가 벡터의 동종 제조합이 발생하는 조건하에서 배양되는 단게와, 그리고
(c) (b)단계에 따라 얻어진 세포는 분리되는 단계를 포함한다.
비정형 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로 작동연결된 내인성 유전자를 갖는 본 발명에 따른 공정에 의해 세포가 제공되며, 이러한 서열은 Cre 재조합과 같은 부위 특이적 재조합 효소에 대한 표적 서열에 의해 플랭킹된다. 이러한 세포는 표적 유전자 발현의 최적화의 조사에 적합한데, 이는 부위 특이적 재조합 효소에 대한 표적 서열의 존재하에 제 1 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 제 1 증폭 유전자를 제 2 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 제 2 증폭 유전자로 간단하게 교체할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 용어 부위-특이적 재조합효소는 인테그레이스(integrase)의 부위 특이적 재조합효소를 포함한 특정 DNA 표적 서열 상에 DNA 재배열을 매개하는 단백질 및 단백질 복합물을 둘러싸고 있다. (Stark et al., Trends Genet. 8 (1992), 432-439; Abremski 및 Hoess, 단백질 공학 5 (1992), 87-91; Khan et al., 핵산 Res. 19(1991), 851-860) 및 인트론으로 코드화된 엔도뉴클레아제에 의해 매개된 부위 특이적 재조합(Perrin et al., EMBO J. 12(1993), 2939-2947). 바람직한 재조합효소 단백질은 Saccharomyces cerevisiae (Falco et al. CELL 29(1982), 573-584; Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. USA80(1983) 4223-4227; Konsolaki et al., New Biologist 4(1992), 551-557)의 2μ의 에피좀의 FLP 재조합효소, E. coli phage P1(Sauer 와 Henderson(1989) supra)의 Cre 재조합효소, Zygosaccharomyces rouxii 플라스미드 pSR1(Matsuzaki et al., J. Bacteriol. 172(1990), 610-618)으로부터 R- 재조합효소, Kluyveromyces drosophilarrium 플라스미드 pKD1(Chen et al., 핵산 Res. 14 (1986), 4471-4481)로부터 재조합효소, Kluyveromyces waltii 플라스미드 pKW1(Chen et al., J. Gen. Microbiol. 138(1992), 337-345), λ-int 재조합 시스템(Landy, Annu Rev. Biochem. 5(1989), 913-949) 성분, 및 phage μ(Klippel et al., EMBO J. 12(1993), 1047-1057)의 gin 재조합 시스템 성분을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또한, 유럽 특허 EP-B-O 707 599 DP 기술되어진 융해 단백질은 부위 특이적 재조합효소로 구성되고 핵 수용체 또는 수용체의 리간드 결합 영역은 또한 적합하다. Cre 재조합효소의 표적 서열, 즉 loxP 서열은 본 발명에 따른 방법에 특히 바람직하게 사용된다.
비정형 유전자 및 그와 관련된 단점의 부위-비특정 통합에 의한 단백질의 재조합 제조와는 대조적으로, 본 발명에 따른 방법은 동종 제조합에 의한 부위-특이적 내인성 유전자 활성의 잇점을 이용한다.
비정형 발현 제어 서열 및 증폭 유전자의 적절한 조합중 단순화된 선택은 구조 및 활성도에 대해 천연 단백질에 상응하는 단백질의 제조를 가능하게 하는 안정한 특성을 갖는 최적화된 제조 클론(clone)을 가능하게 한다.
비정형 발현 제어 서열, 증폭 유전자, 양성 선택 표지 유전자 및 재조합 표적 서열에 플랭킹되어진 적절한 동종 서열의 선택은 WO 90/11354 및 WO 91/09955 에 기술된 방법에 따라 수행된다.
또한, 동종 서열은 발현된 단백질 내에서 돌연변이, 예를 들어 포인트 돌연변이, 개별적인 아미노 산 또는 전체 아미노 산 섹션의 삽입 또는/ 및 삭제등의 변형예를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 단일 공정 단계내에 변화되어질 내인성 핵산 서열의 발현 수치를 가능하게 하고 또한 동시에 내인성 핵산 서열의 코드화된 영역 내부로 돌연변이의 도입을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 조제시에 단백질의 제조에 특히 바람직하다. 이러한 단백질은 단백질의 효능을 증가시키기 위해 돌연변이로부터 벗어난 천연 단백질과 비교하여 또 다른 변형예는 없다.
본 발명에 따라, 임의의 진핵 세포 바람직하게 포유류 세포, 특히 바람직하게 인간 세포를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 방법은 섬유아 세포(fibroblasts)등의 비-불멸 세포 및 종양 세포 라인등의 불멸 세포로 수행될 수 있다. 불멸 세포가 바람직하다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 사용된 용액 및 배지는 각각의 공정 단계에서 최적의 조건이 되도록 바람직하게 선택된다. 이러한 세포는 충분한 세포 성장을 위해 필요한 모든 재료를 함유한 매체를 사용하여 배양되며 선택적으로 완화된다. 유액이 없는(serum-free) 배지 내에서 배양되는 것이 바람직하다. 사용된 세포는 바람직하게 나말와(Namalwa), HT 1080, 또는 HeLa S3 세포이다.
본 발명에 따른 방법은 세포내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열, 예를 들어 최적의 발현 제어 서열, 최적의 확대 유전자의 선택에 의해 또는/ 및 발현 제어 서열 및 확대 유전자의 최적의 결합물의 선택에 의해 표적 유전자의 발현의 최적화를 가능하게 한다.
임의의 핵산 서열은 세포의 제놈 내부로 도입된 이후에 표적 유전자의 발현에 영향을 미치는 비정형 발현 제어 서열로 사용될 수 있다. 이는 전사 개시 인자 또는 RNA 폴리메라아제 및 전사의 영향이 활성체 또는 억제체의 상호작용에 의해 중재되는 핵산 서열등의 전사 성분과 직접적으로 상호작용할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 비정형 발현 제어 서열은 바람직하게 프로모터/강화제를 포함하며, 특히 바람직하게 바이러스성 프로모터 및 가장 바람직하게는 CMV 프로모터를 포함한다.
이종 발현 제어 서열은 3' 비코드 서열을 포함한다. 3' 비코드 서열은 mRNA 상에 안정 또는 탈안정 효과를 가지며 반 수명을 증가시키거나 감소시킨다. mRNA를 안정시키는 서열의 도입은 mRNA의 반 수명을 증가시킬 수 있으며 코드화된 단백질의 수율도 증가시킬 수 있다.
바람직한 실시예에서, 표적 유전자의 내인성 발현 제어 서열은 동종 재조합에 의해 제거된다. 이는 내인성 서열이 억제체 결합 서열을 함유하고 있을 때 특히 바람직하다. 이러한 발현은 번역된 단백질의 양을 감소시키는 mRNA 상에 탈안정 효과를 갖는 3' 비코드 서열에 의해 감소될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 최적의 증폭 유전자의 선택을 허용한다. 이러한 증폭 유전자는 바람직하게 적합한 프로모터와 작동 관계 내에 발현 형태로 사용되며, 진핵 세포의 게놈 내부로 벡터의 동종 통합 이후에 표적 유전자의 부근에 위치되도록 벡터 내에 배열된다. 확대 단계의 수행은 세포 내의 표적 유전자의 복사의 수를 증가시킨다. 이는 내인성 핵산 서열의 발현에 더 큰 증가를 초래한다. 적절한 확대 유전자는 탈수산엽산 환원효소(DHFR), 아데노신 탈아미노, 오르니틴 발효 탈탄산 효소 또는 이러한 유전자의 돌연변이 단백질이다. 증폭 유전자는 바람직하게 DHFR 유전자 또는 이러한 유전자의 돌연변이 형상이며(시몬센(Simonsen, 핵산 1988, 16(5) : 2235 -2246), 특히 내생 DHFR 유전자를 함유하고 있는 세포이다.
항생 작용 저항과 같은 선택가능한 표현형을 초래하는 진핵 세포용 임의의 적합한 저항 유전자는 양성 선택 표지로서 사용될 수 있다. 양성 선택 표지 유전자는 바람직하게 네오미신, 카나미신, 제네티신, 또는 아히그로미신 저항 유전자이다. 양성 선택 표지 유전자는 바람직하게 발현 형상, 즉 적합한 프로모터를 갖는 작동 결합 형태로 사용된다.
음성의 선택 표지 유전자가 사용될 때, 제 2 음성 선택 단계는 양성 선택 단계 이외에 수행된다. 선택 단계가 수행된 이후에, 이러한 잇점은 낮은 분율의 착오 양성 클론, 즉 게놈 내부로 임의의 통합된 벡터를 함유한다. 음성 선택 표지 유전자는 바람직하게 티미딘 키나아제 유전자(TK) 또는/ 및 하이포산틴-쿼닌-포스포리복실 전이효소(HGPRT) 이다.
부위특이적 재조합효소의 표적 서열의 존재로 인해, 부위특이적 재조합효소를 이용한 세포의 게놈으로부터 이러한 서열 사이에 위치된 핵산 연속물의 절제가 가능하다. 표적 서열 사이에 위치된 핵산 서열은 바람직하게 세포내의 대응 재조합효소의 일시적인 활성에 의해 게놈으로부터 분열된다.
재조합효소는 (a) 이러한 세포 내에서 활성화된 발현 제어 서열로 작동 연결된 재조합효소용으로 코드화된 핵산 서열을 함유하는 제 2 벡터로 세포를 감염시키는 단계와, (b) 재조합효소가 발현되고 활성화된조건하에서 (a) 방식으로 감염된 세포를 배양시키는 단계, 및 (c) 세포를 선택적으로 분리시키는 단계에 의해 수행가능하다.
재조합효소 및 핵 억제체 결합 단백질이 사용된다면, 세포의 일시적인 활성은 핵 억제체용 리간드의 제어식 부가에 의해 수행가능하다.
표적 서열 사이에 위치된 DNA를 제거한 후에, loxP 서열과 같은 잔존 표적 서열은 부가적인 공정 단계로 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 이러한 공정은 다음을 특징으로 하고 있다.
(a) 세포는 (i) 제 2 이종 발현 제어 서열 및 제 2 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열과, (ii) 제 1 벡터의 양성 선택 표지 유전자와는 바람직하게 다른 양성 선택 표지 유전자, 및 (iii) 서열(i) 및 (ii)에 플랭킹되어진 적어도 두 개의 표적 서열을 포함하는 제 3 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 트랜스펙팅되어진 세포가 표적 서열에 의해 플랭킹되어진 서열은 세포의 게놈 내의 표적 서열 내부로 통합된 조건 하에서 배양되는 단계와, 된다.
(c) (b)단계에 따라 얻어진 세포는 분리되는 단계와, 그리고
(d) (a) 내지(c) 단계는 선택적으로 각각의 경우 변화하는 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자로 적어도 한번 반복되는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 공정은 다수의 발현 제어 서열, 증폭 유전자, 및 발현 제어 유전자 및 증폭 유전자의 결합물이 간단하고 신속하게 시험되도록 한다. 각각의 개별 표적 유전자에 대한 최적의 발현/증폭 시스템을 결정하기 위해 각각의 개별 증폭유전자 및 각각의 이종 발현 제어 서열에 대한 시간 소모적이도 고가의 부위특이적 통합을 수행하는 것은 필요하지 않다.
제 3 벡터 내의 양성 선택 표지 유전자는 착오 양성 클론의 수를 최소화하고 선택 공정을 간략화하기 위해 제 1 벡터의 표지 유전자와는 다르다.
본 발명에 따라 사용되는 벡터 내에서의 재조합효소 표적 서열은 자연 발생적인 표적 서열에 상응하거나 선택적으로 부위특이적 재조합효소의 효과를 손상시키지 않는 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 또 다른 목적은 동종 재조합, 특히 세포의 게놈 내부로 재조합효소 표적 서열의 부위특이적 도입에 대한 벡터에 관한 것으로서,
(ⅰ) 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열과,
(ⅱ) 양성 선택 표지 유전자와,
(ⅲ) 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)에 플랭킹되어진 부위특이적 재조합효소에 대한 적어도 두 개의 표적 서열과,
(ⅳ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈 내부로 핵산 섹션에 동종인 (ⅰ),(ⅱ), 및 (ⅲ)에 플랭킹되어진 DNA 서열, 및
(ⅴ) 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 모든 벡터는 복제의 원조, 선택 표지 유전자와 같은 적합한 숙주 세포내의 번식 및 증식에 필요한 서열 요소를 포함한다.
그러나, 본 발명의 또 다른 목적은 벡터, 특히 특이부위적 재조합효소 시스템에 의해 세포의 게놈 내부로 DNA를 도입시키기 위한 벡터에 관한 것으로서,
(ⅰ) 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열과,
(ⅱ) 양성 선택 표지 유전자, 및
(ⅲ) 서열(ⅰ) 및 (ⅱ)에 플랭킹되어진 적어도 두 개의 재조합효소 표적 서열을 포함한다.
그러나, 본 발명의 요지는 진핵 세포, 바람직하게 전술한 공정에 의해 얻어질 수 있는 인간의 세포이다. 이러한 세포는 다음을 특징으로 한다.
(a) 인간 세포는 내생적으로 존재하는 핵산 서열과 작동 연결된 이종 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 염색체 위치 서열을 포함한다.
(b) 이러한 서열은 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된다.
본 발명의 또 다른 관점은 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변화시키기 위한 공정에 관한 것이며, 다음을 특징으로 하고 있다.
(a) 세포는 (ⅰ) 하이폭시아 유도 인자(HIF)등의 활성체 단백질을 결합하는 적어도 하나의 핵산 서열, (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자, 및 (ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈내의 핵산 섹션에 동종인 서열(ⅰ) 및(ⅱ)에 플랭킹되어진 DNA 서열을 포함하는 벡터에 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 트랜스펙팅되어진 세포가 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되는 단계와,
(c) (b) 단계에 따라 얻어진 세포는 분리되는 단계를 포함한다.
놀랍게도, 표적 유전자의 발현 제어 서열의 영역내에서 하나 또는 일부 활성체 단백질(핵산 서열에 묶음으로써 유전자 발현을 증가시키는 단백질)을 묶는 핵산 서열의 게놈 통합은 표적 유전자의 발현을 감소시키지 않으나, 대조적으로 내생적인 표적 유전자의 발현을 증가시키고 비-발현 내생 표적 유전자의 발현을 유도하기 위해 적합한 배양 조건의 선택으로 가능하다.
적합한 활성체 단백질의 실시예는 하이폭시아-유도 인자 HIF -1α 및 HIF -1β와 또한 인터페론 교감 서열(ICE) 에 결합시킴으로써 전사를 증가시킬 수 있는 인터페론 조절 요소 1(IRF-1) 등 이다(타나카 엔., 카와카미 티., 타니구치 티., Mol. 셀. Biol.(1993), Aug; 13(8):4531 - 4538).
내생적으로 존재하는 표적 유전자에 HIF 또는 다른 활성체 단백질을 결합하는 하나 또는 일부 핵산 서열을 작동 연결한 후에, 표적 유전자의 발현은 적합한 배양 조건을 선택함으로서 조절될 수 있다. 이러한 잇점은 단백질의 발현은 제조 공정동안 적절한 시간에 유도될 수 있다는 점이다. 이는 배양 배지 상청액 내의 합성 제품의 평균 잔류 시간이 감소된다는 잇점을 갖는다. 이는 바람직하지 못한 단백질의 분해 제품을 감소시킨다. 이는 연속적인 정화 단계에서 양성 효과를 가지며, 제조 비용을 감소시키고 재선된 최종 제품을 질적으로 상승시킨다.
본 발명에 따른 공정을 수행하기 위해서는, 표적 유전자로 하나 또는 일부 활성체 결합 핵산을 작동 결합하기에 충분하다. 바람직하게, 두 개의 HIF-결합 핵산 서열이 사용된다. HIF- 결합 핵산 서열은 서열 ID NO.1 에 따라 53 bp 서열, ID NO.2 에 따른 43 bp 서열, 이러한 서열에 동종인 서열 또는 엄격한 조건하게서 서열과 서열의 이종교배로부터 바람직하게 선택된다.
두 개의 HIF- 결합 핵산 서열의 사용은 놀랍게도 상승 효과를 초래한다. 이는 각각의 서열이 단독으로 사용될 때 보다 내생적인 핵산의 발현시 더 크게 발현한다.
필요하다면, 표적 유전자의 영역내에 도입된 활성체 서열에 결합하는 활성체 단백질의 발현은 세포 내에서 도입되거나 또는/ 및 증가된다. 이는 이러한 세포 내에 활성 발현 제어 서열과 작동 결합된 활성체 단백질용 핵산 서열 코드, 및 선택적으로 양성 선택 표지 유전자를 갖는 벡터로 세포를 트랜스펙팅시킴으로써 달성된다.
활성체 단백질용으로 임의의 핵산 서열 코드는 발현 제품이 게놈 내부로 통합된 활성체 결합 핵산 서열에 결합될 수 있다. 이러한 활성체 단백질은 바람직하게 HIF-1α 또는/ 및 HIF-1β 단백질이다. 이미 내생적으로 존재하는 핵산 서열이 활성체 결합 또는 바람직하게 HIF - 결합 핵산 서열을 함유하고 있다면, 활성체 단백질 또는 바람직하게 세포 내의 활성 발현 제어 서열과 작동 연결된 HIF 단백질에 대한 핵산 서열 코드를 함유한 세포 내부로 벡터 및 선택적으로 양성 선택 표지 유전자를 도입시키는 것이 충분하다.
유도가능한 활성체 단백질에 대한 핵산 서열 코드와 작동연결된 발현 제어 서열은 호르몬 또는 중금속의 부가에 의해 적합한 배양 조건에 의한 활성 주가 방법을 제공한다. 이는 내생 표적 유전자의 발현이 제조 공정중에 최적의 시간에서 도입될 수 있도록 한다.
구조적으로 활성인 발현 제어 서열을 사용하는 잇점은 활성체 단백질은 배양 배지 내부로 활성체의 부가와는 관계없이 구조적으로 발현된다.
활성체 단백질-결합 핵산 서열이 HIF 결합 핵산 서열이라면, 표적 유전자의 발현은 0.1 내지 2%의 O2농도등의 적합한 배양 조건에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 요지는 (i)활성체 단백질을 결합하는 적어도 하나의 핵산 서열, (ii)양성 선택 표지 유전자, 및 (iii) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈내의 핵산 섹션에 동종인(i) 및 (ii)서열을 플랭킹한 DNA 서열을 포함하는 동종 재조합용 벡터이다.
또한, 본 발명의 요지는 진핵 세포이며, 바람직하게 인간 세포이며 전술한 방법중의 하나에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 세포는 적어도 하나의 비정형 염샘체에 위치한 세포내에 내생적으로 존재하는 유전자와 작동결합하는 활성체 단백질/ 복합 결합 핵산 부분이다. 활성체 단백질-결합 핵산 부분은 임의의 표적 유전자에 대한 최적의 활성체 서열의 간단한 동정을 가능하게 하는 전술한 특정부위적 재조합으로 인해 게놈 내부로 대체될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 영역으로부터 비코드 핵산 서열의 발현의 영향을 시험하기 위한 방법에 관한 것으로서, 다음과 같은 특성을 갖는다.
(a) 세포는 (i) 리포터 유전자로 작동 연결된 세포 내에서 활성화되거나 활성화될 수 있는 이종 발현 제어 연속물, 및 (ii) 표적 유전자의 영역으로부터 5' 측면 또는/ 및 3'측면 상의 비코드 핵산 부분을 포함하는 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 발현 제어 서열이 활성화된 조건 하에서 세포가 배양되는 단계와, 그리고
(c) 리포터 유전자의 발현은 측정되는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법으로 이종 발현 제어 서열이 타겟 유전자의 최적의 발현율을 달성하기 위해 게놈 내의 표적 유전자의 영역 내에 어떻게 위치되는지 표적 유전자의 영역으로부터 5' 또는/ 및 3' 비코드 서열의 존재 및 부재가 발현에 어떤 영향을 미치는지는 간단히 결정하는 것이다. 시험 벡터는 바람직하게 세포 내부로 일시적으로 트랜스펙팅되고 리포터 유전자의 발현이 측정된다. 이러한 방식으로, 이종 발현 제어 서열 및 표적 유전자 또는 다수의 다른 발현 제어 서열의 다수 배열을 신속하게 경제적으로 시험하는 것이 가능하다. 이종 발현 제어 서열은 전사 초기 인자 또는 RNA 폴리메라아제, 및 활성체 또는 억제체와 상호작용에 의해 매개되는 전사의 영향을 받는 핵산 서열등의 전사 성분과 직접 상호작용할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 이종 발현 제어 서열은 바람직하게 프로모터/인핸서이며, 특히 바람직하게는 바이러스성 프로모터이며 가장 바람직하게는 CMV 프로모터이다. 본 발명에 따른 방법은 복잡한 단계를 포함하는 공정에서 특히 비용 절감을 초래한다. 이는 쥐, 양, 또는 소등의 유전자이식의 제조시에 임의의 세포 형태의 특별한 내인성 핵산의 발현을 증가시키고자 하는 것이다.
표적 유전자 영역으로부터 비코드 핵산 부분 5' 또는 3'는 리포터 유전자의 5'측면 또는 3' 측면 상의 유전자 배열에 따라 벡터 내에서 바람직하게 배열된다.
세포내에서 발현이 탐지될 수 있는 당업자들에게 공지된 임의의 리포터 유전자가 사용된다. 리포터 유전자는 클로로암페니콜-아세틸-전이효소(CAT)용 코드, β-갈락토시다즈(β- Gal) 또는 lacZ 용 코드로 바람직하게 사용된다. 반면에, ELISA와 같은 면역감시방법에 의해 발현이 탐지될 수 있는 EPO 등의 단백질용 리포터 유전자 코드를 사용한다.
바람직한 실시예에서, 표적 유전자의 다른 5' 또는/ 및 3' 비코드 핵산 부분을 함유한 적어도 두 개의 벡터는 각각 다른 세포로 트랜스펙팅되며 다른 세포 내에서의 리포터 유전자의 발현은 당업자들에게 공지된 방법에 따라 결정된다. 이종 발현 제어 서열의 배열인 본 발명에 따른 방법은 임의의 숙주 세포에 대한 최적의 발현을 초래한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 표유류 세포, 특히 바람직하게 인간 세포인 DHFR -음성 진핵 새포를 제공하는 방법에 관한 것으로서,
(a) 세포는 (i) 부위특이적 재조합효소에 대한 적어도 하나의 표적 서열, (ii) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산 서열에 동종인 서열(i)을 플랭킹하는 DNA 서열, 및 (iii) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자 및 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 트랜스펙팅되어진 세포가 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되는 단계와,
(c) (b)단계에 따라 얻어진 세포가 분리되는 단계를 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 재조합효소 표적 서열 및 동종 서열은 전술한 바와 같이 선택되며 사용된다.
양성 선택 표지 유전자는 존재한다면, DHFR 유전자에 동종인 서열 사이에 배열되며, 음성 선택 표지 유전자가 존재한다면, 동종 서열의 외부에 배열된다.
동종 재조합이 DHFR 궤적내에서 발생한 후에, 기능적인 DHFR 단백질은 세포에 의해 합성될 수 있다. 이러한 경우, 벡터의 서열은 DHFR 유전자 프로모터가 비활성이거나 또는/ 및 기능성 DHFR 단백질이 DHFR 유전자의 코드 서열 내에서 삽입 또는 삭제로 인해 더 이상 합성되지 않도록 배열될 수 있다.
DHFR 유전자의 대립 유전자 형질을 비활성화시키기 위해서는, 세포는 먼저 본 발명에 따른 벡터로 트랜스펙팅되며, 그 다음 선택되고 분리되어야 한다. DHFR 유전자의 하나의 대립 유전자 형질은 이러한 세포 내에서 비활성화된다, 즉 DHFR 유전자에 대한 이질접합(heterozygous)이다(+/-). 이때, 이러한 세포는 제 1 벡터와는 다른 양성 선택 표지 유전자를 바람직하게 함유하는 본 발명에 따른 벡터로 트랜스펙팅된다. 선택 단계 이후에, 두 개의 DHFR 대립 유전자 형질내에서 얻어진 세포는 비활성 상태이다. 선택적으로, 선택 압력의 증가는 유전자 전환을 초래할 수 있으며, 두 개의 유전자 형질의 비활성화를 초래한다(모르텐센, Mol.Cell. Biol. 12(1992), 2391 -2395).
본 발명에 따른 방법은 DHFR 단백질을 합성하지 않는 잇점을 갖는 유전자 증폭 공정에서 사용하는 DHFR 음성 세포를 제공하는 것이다. 선택 단계가 DHFR 단백질용으로 코드화된 핵산 서열에 결합된 비정형 핵산 서열을 증폭하기 위해 수행될 때, 내생 DHFR 유전자의 발현 제품은 간섭 영향을 받지 않으며 유전자 증폭의 효율이 증가된다.
선택가능한 표현형을 초래하는 임의의 적합한 선택 표지 유전자는 항생물질 저항과 같은 양성 선택 표지 유전자로 사용될 수 있다. 양성 선택 표지 유전자용으로 코드화된 핵산 서열은 바람직하게 네오마이신(neomycin), 카나마이신(kanamycin), 지네티신(geneticin), 또는 하이그로미신(hygromycin) 저항 유전자이다.
당업자들에게 공지된 임의의 음성 선택 표지 유전자가 사용되며, 음성 선택 표지 유전자용으로 코드화된 핵산 서열은 티미딘 키나아제 유전자(thymidine kinase gene :TK) 또는/ 및 하이포산틴-구아닌-포스포리복실 전이효소 유전자(HGPRT)이다.
재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되어진 서열은 (a) 세포 내에 활성화된 발현 제어 서열로 작동연결된 재조합효소용으로 코드화된 핵산 서열을 함유하는 벡터로 세포를 트랜스펙팅시키는 단계와, (b) 재조합효소가 발현되고 활성화된 조건하에서 (a) 방식으로 트랜스펙팅된 세포를 배양시키는 단계와, 그리고 (c) 선택적으로 세포를 분리시키는 단계에 의해 대응 재조합 효소의 일시적인 활성에 의해 세포의 게놈 외부로 분리시킬 수 있다.
본 발명에 따라 DHFR 유전자를 비활성화시킬 수 있으며, 재조합효소 매개 반응에 의해 세포의 게놈으로부터 도입된 선택 표지 유전자뿐 아니라 재조합효소 표적 유전자 서열 사이에 위치된 DHFR 유전자 서열을 제거시킬 수 있다.
재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 서열이 양성 선택 표지 유전자를 함유하고 있다면, 이러한 서열을 함유하는 세포는 항생물질 저항체이다. 따라서, 본 발명의 당업자에 의해 공지된 방법에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 공정에 의해 제조된 DHFR 음성 세포의 또 다른 잇점은 그 특성이 당업자들에게 공지된 방법에 의해 특징화되며, 세포는 다른 공정에 계속 사용될 수 있다. 더욱이, DHFR 유전자 궤적에서 도입된 재조합효소 표적 서열은 게놈 내부로 핵산 서열의 부위특이적 통합을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 진핵 세포 내부로 이종 DFHRR 유전자를 도입시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
(a) (i)선택적으로 제 1 벡터의 양성 선택 표지 유전자와는 바람직하게 다른 양성 선택 표지 유전자, (ii)DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열, 및 (iii)발현 형태로 단백질용으로 코드화된 증폭되어질 핵산 서열로서 발현 형태 내의 부분 서열 (i), (ii),(iii)으로부터 각각의 핵산 서열은 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열에 의해 5' 및 3' 측면상에 플랭킹된 핵산 서열을 포함하는 제 3 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b)재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 핵산 서열이 세포의 유전자내에 이미 존재하는 재조합효소 표적 서열 내부로 통합되는 조건하에서 트랜스펙팅된 세포가 배양되는 단계와, 그리고
(c) (b) 단계에 따라 얻어진 세포는 분리되는 단계를 특징으로 한다.
양성 선택 표지 유전자, 소정의 단백질용으로 코드화된 DFHR 유전자 및 표적 유전자는 세포 내에서 활성화되거나 활성화될 수 있는 발현 제어 서열로 바람직하게 각각 작동 연결된다. 내부 리보좀 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 구조는 원칙적으로 가능하다. 표적 유전자의 증폭되어질 핵산 서열은 개별적인 프로모터에 의해 구동된다. 특히, 바람직한 발현 제어 서열은 바이러스성 프로모터/인핸서이다. CMV 프로모터는 단백질의 발현으로 가장 바람직하다.
본 발명에 따라 부위 특이적 방식으로 세포의 게놈 내부로 이종 서열의 도입과 게놈 서열로 이종 서열의 간섭을 배제하는 것이 바람직하다. 따라서, 이는 불안정 제조 클론등의 전술한 단점을 방지할 수 있다.
단백질용으로 코드화된 이종 핵산 서열의 발현율을 증가시키기 위해서는, 공지된 공정 단계에 의해 메토트랙사트로 증폭 단계를 수행하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자, (ii) DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열, 및 (iii) 소정의 단백질용으로 코드화된 발현 형태의 핵산 서열로서 단백질 내의 부분 서열 (i),(ii),(iii)로부터 각각의 핵산 서열은 적어도 하나의 재조합효소에 의해 5'측면 및 3' 측면상에 플랭킹되어진 핵산 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명의 또 다른 요지는 (i) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자, (ii) 서열 (i)을 플랭킹하는 각각의 경우에 적어도 하나의 재조합효소 표적 유전자, (iii) 동종 재조합효소를 허용하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산에 동종인 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 DNA 서열, 및 (ⅳ) 바람직하게 동종 서열(III)의 3' 측면상에 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 동종 재조합효소에 대한 벡터이다.
또한, 본 발명은 진핵 세포, 바람직하게 전술한 방법에 의해 얻어질 수 있는 인간 세포이다. 이러한 세포는 (a) 비활성되고 바람직하게 내생적인 대립 유전자인 DHFR용으로 코드화된 적어도 하나의 내생 핵산 서열, 및 (b) DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열의 영역내에 게놈 내부로 통합된 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열을 특징으로 한다.
최종적으로, 본 발명의 요지는 DHFR용으로 코드화된 적어도 하나의 내생 핵산 서열, 소정의 단백질용으로 코드화된 핵산 서열, 및 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 내생 DHFR 유전자의 영역내의 이종 핵산 서열을 특징으로 하는 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포이다.
본 발명은 다음의 실시예, 도면, 및 서열에 의해 설명되어질 것이다.
실시예
실시예 1 CMV 프로모터의 제어하에서 에리트로포에틴 유전자의 발현 및 HIF의
과다발현
벡터 pHYG, pHIF-1α, pARNT는 유전공학에 의해 변경된 HeLa S3 세포 내부로 트랜스펙팅된다(도 3 참조). EPO 발현을 제어하는 CMV(사이토메가로바이러스) 프로모터는 EPO 대립유전자의 에리트로포에틴 유전자(EPO)번역 초기에 근접하게 세포 내부로 도입된다. 세포는 항상 24시간당 107당 1㎍ 에리트로포에틴을 발생시킨다. 감염되기 이전 24시간동안, 6개의 웰 플레이트당 6 x 104세포의 농도를 갖는다. 감염일에, 세포는 DNA-DOTAP 혼합물와 함께 배양된다. 혼합물은 1.25㎍의 개별 벡터와, 웰당 20 mA의 Hepes 완충액내의 75㎕의 최종 체적 내에 10㎕ DOTAP(뵈링거 만하임 1202375)를 갖는다. 혼합물은 실온에서 10 내지 15분동안 미리 배양된다. 세포는 3 ml DNA-DOTAP으로 6시간동안 배양된다. 연속적으로, 세포는 PBS 완충제에 두 번 세척되며 5일동안 완전 배지 내에서 배양된다. 배양된 후 3,4,5일째, 100㎕의 상청액을 매시간 분리하여 에리트로포에틴 ELISA 로 분석한다. 분석은 5일째 완료되며 세포 총수가 계산된다. 웰당 에리트로포에틴의 양은 동일한 세포 총수에 대해 계산된다(도 3 참조).
HIF 에 의해 에리트로포에틴의 도입이 동종 발현 제어 서열(CMV 프로모터)이 에리트로포에틴 유전자의 대립유전자의 프로모터 영역 내부로 도입된다 하더라도, 여전히 가능함을 실시예는 도시하고 있다. 측정된 에리트로포에틴 농도의 증가치는 하이폭시아 유도 인자 또는 양쪽 대립 유전자상의 하이폭시아 유도 인자의 상승 효과를 나타낸다.
따라서, 내인성 핵산 서열의 발현은 동종 발현 제어 서열을 도입함으로써 증가될 수 있음이 명백하다. 활성체(HIF)가 결합 핵산 서열이 발현 제어 서열 내에 존재하는 세포내에 발현될 때, 이러한 유전자의 발현은 더욱 증가될 수 있다. 대응 서열이 유전자 궤적내에 존재하지 않는다면, 동종 재조합에 의해 본 발명에 따른 방법에 의해 게놈 내부로 특별히 도입될 수 있다.
실시예 2 내인성 핵산 서열의 발현을 증가시키기 위한 발현 제어 서열의 최적화된 배열
내인성 유전자의 5' 측면상의 서열은 발현을 자극하며 재압(repressin g) 특성을 갖는다. 동종 발현 제어 서열이 표적 유전자의 5' 측면사에 게놈 내부로 도입될 때, 발현 수치는 내생 5' 서열에 의해 영향을 받는다. 동종 발현 제어 서열에 의한 표적 유전자의 최적의 발현을 달성하기 위해서는, 동종 발현 제어 서열의 활성도가 표적 유전자의 5' 측면상의 비코드 서열에 의해 감소되지 않는다. 개별적인 서열 요소의 상승 효과를 달성하기 위해 특정 배열이 바람직하다. 동종 발현 제어 서열의 다양한 배열을 시험하기 위해서, 즉 표적 유전자의 코드 서열의 번역 개시점으로부터의 거리에서 결정하기 위해서는, 동종 발현 제어 서열은 세포의 게놈 내부로 통합되며, 표적 유전자의 다른 5' 비코드 핵산 부분을 갖는 다른 벡터가 시험된다(도 4 참조). 도 4에 기술된 벡터는 HeLa S3 으로 트랜스펙팅되며 리포터 유전자 β-갈락토시다아제의 발현이 측정된다(도 5 참조).
분석평가 24시간 이전에, 세포는 10cm 페트리 디쉬당 1 x 106세포의 농도에서 체류한다. 세포 감염일에, 세포는 DNA-DOTAP 혼합물로 배양된다. 혼합물은 20mM의 완충액 Hepes 300㎕로 구성된 60㎕의 DOTAP(뵈링거 만하임 1202375) 내의 1 pmol의 개별 벡터(A3-178, A3-177, A3-175, A3-181, 또는 pNASSβ, 도 4 참조)를 함유한다. 이러한 혼합물은 실온에서 10 내지 15분간 배양된다. 세포는 페트리 디쉬당 6 ml의 유액이 없는 배지에서 6시간동안 미리 배양된다. 그 후, 세포는 PBS 완충액으로 두 번 세척되고 22시간동안 완전 배지 내에서 배양된다. β-갈락토시다아제의 발현을 측정하기 위해서는, 세포는 200㎕ PBS 내에서 분리되며 -20℃에서 냉동 및 해동에 의해 용해된다. 10㎕ 의 용해질은 기질(3.29 mM 클로로페놀 레드-β-D) 갈락토피라노시드(뵈링거 만하임 884308), 100 mM HEPES, 150 mM NACL, 2 mM MgCl2, 1% BSA, 0.1% Triton-X 100, 1% 아지드화 나트륨, pH 7로 1: 10으로 희석된다. 샘플들은 1 :2 단계에서 희석되고 암적색이 형성될 때까지 96 개의 웰 판에서 37℃에서 배양된다. 샘플은 570/580 nm, 또는 550 nm에서 측정된다.
도 5에 도시되어진 것과 같이, 리포터 유전자의 발현은 벡터 A3-178 로 트랜스펙팅된 세포 내에서 가장 높다. 이러한 벡터에서, 동종 발현 제어 서열은 코드 서열의 번역 개시점과 근접하다.
그러므로, 본 방법은 숙주 세포의 게놈내에 동종 발현 제어 서열의 배열이 내인성 표적 유전자의 최적의 발현을 얻기 위해 간단하고 신속하게 선택하는데 사용될 수 있다.
실시예 3 DHFR 음성 세포의 제조
제 1 단계에서, 본 발명에 따른 재조합용 벡터가 준비된다. 이러한 벡터는 두 번째 단계에서 인간 세포 라인으로 트랜스펙팅되고 동종 재조합 사건용으로 구분된다. 이러한 방식으로, DHFRR 유전자에 대한 첫째 및 둘째 대립유전자는 비활성화될 수 있다.
동종 재조합용 DHFR 벡터
인간 DHFR 유전자는 염색체 상에 위치되며 6개의 엑손 내에 배열된 30 kb를 포함한다. 프로모터 부분, 엑손 2 부분 및 완전 엑손 1을 포함하는 1.8 kb EcoRI 부분은 동종 재조합용 벡터를 제조하는데 사용된다. 엑손 1은 AapI 침지에 의해 제거되며 Neo(1.4 kb) 또는 Hyg(2.2 kb) 저항 유전자는 링커를 거쳐 최종 간극(0.45 kb)내부로 삽입된다. 이러한 링커는 어댑터 뉴클레오티드 이외에도 TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA (loxP 서열)을 포함한다. 링커 서열은 동일한 정위로 배열되며 저항 유전자는 DHFR 유전자에 대한 유전 인자에 속한다. 저항 유전자가 삽입된 이후에, 상동 영역이 확장된다. 이를 위해, 벡터는 EcoRI 부분에 의해 3' 영역(6.0 kb)으로부터 확장된다(도 6 참조). 이러한 방식에서, 본 발명에 따른 표적 구조 pNDII (11.5 kb) 및 pHDI(12.3kb)를 얻을 수 있다.
완료된 동종 재조합 뒤에, DHFR 유전자의 프로모터로부터 완전 엑손 1(아미노산 1-28) 및 부분이 제거된다. 이러한 세포는 기능성 DHFR 단백질을 더 이상 발현할 수 없다.
세포의 트랜스펙션
사용된 인간 세포 라인은 염색체용 배수체가 아니며 MTX 선택하에 유지되지 않는다. 두가지의 경우에 2 이상의 대립 유전자는 활성화되지 않는다.
HeLa S3 세포(ATCC CCL-2.2)
세포는 RPMI 1640 배지, 10%의 우태아 혈청, 2 mM의 L-글루타민 및 1 mM MEM(비 필수 아미노산) 내의 조직 배양 플라스크 내에서 배양된다. 37℃ 및 5% CO2에서 부화가 발생된다. 일렉트로포레이션 완충액은 20 mM 의 Hepes, 138 mM의 NaCl, 5 mM 의 KCl, 0.7 mM Na2HPO4,6mM D-글루코스 단일수산화물을 함유한다. pH 7.0 의 10㎍의 비선형 벡터 DNA(pNDII)는 960 ㎌ 및 250 V에서 1 x107세포 내부로 일렉트로포레이티드화된다. 일렉트로포레이션 후에, 세포는 600 ㎍/ml G418을 함유한 배지 내에 위치하여 배양된다. 선택 10일후에(매 2일마다 변화된 배지) 양성 클론은 분리되며 확장된다.
HT1080 세포(ATCC CCL-121)
세포는 배양되고 10%의 우태아 혈청, 2mM의 L-글루타민 및 1 mM의 소듐 비루베이트를 함유한 DMEM 배지를 사용한 HeLa S3 세포용으로 전술되어진 것으로 선택된다.
나말와 세포(ATCC CRL-1432)
이 세포는 부유세포 라인이며 그에 상응하여 배양되어야 한다. 배지는 HeLa S3 세포용으로 전술한 배지와 상응한다. 트랜스펙션 이후에, 세포는 40- 96-웰 플레이트로 분포된다. 양성 클론은 48-24-12- 및 6-웰 플레이트 내에서 확장된다. 선택은 1 mg/ml G418 로 수행된다.
DHFR - 음성(+/-) 세포의 탐지
벡터의 삽입은 서던 블롯 분석(Southern blot analysis) 또는 PCR 에 의해 탐지된다. 동종 재조합이 정확히 발생했다면, 2.9 kb 밴드는 완전한 DHFR 유전자를 나타내는 1.8 kb 밴드 이외에도 Neo 유전자의 삽입에 의해 형성된 EcoR1 침지 이후에 탐지된다(도 7c참조). 혼합된 클론(서던 블롯에서 밴드 강도의 불균등 비)은 FACS 내의 단일 세포 증착에 의해 분리되며, 클론을 만들며, 연속적으로 팽창된다. DHFR 유전자의 대립유전자는 양성으로 확인된 클론 내에서 비활성화된다.
DHFR 음성( - / - ) 세포의 제조
세포 클론 내의 비활성화된 DHFR 대립 유전자(+/-)는 새롭게 동종 재조합을 하게된다. 이로 인해, 벡터 pHDII 의 선형화된 DNA 10㎍/ml으로 전술한 바와 같이 세포감염된다. 선택은 500 ㎍/ml의 하이그로마이신 B (뵈링거 만하임)을 함유한 배지 내에서 수행된다.
배지 내에서 G418 농도의 증가는 얻어진 DHFR+/-세포 및 DHFR-/-세포상의 선택 압력이 증가한다. 유전자 전환은 제 2 DHFR 대립유전자가 비활성화된 내부 염색체 재조합에 이른다.
DHFRR-/-세포는 두 개의 비활성화된 DHFRR 대립 유전자를 포함하고 더 이상 테트라하이드로폴레이트를 합성하지 않는다. 따라서, 티미딘, 글리신, 및 푸린은 배지에 부가된다. 선택적으로, 세포는 α-배지(Gibco BGL) 내에서 배양된다.
DHFRR-/-세포는 전술한 바와 같이 탐지된다. 동종 DHFR-음성 세포에서, 야생형 밴드(1.8 kb)가 탐지될 수 있다. pDHI 로 세포감염된 세포는 동종의 재조합이후에 EcoRI 서던 블롯 내에 신규한 3.7 kb를 나타낸다.
DHFR -음성 세포(-/-)의 사용
본 발명에 따른 세포는 대용량의 단백질 제조에 사용될 수 있다. 이를 위해, 본 발명(도 8)에 따른 벡터 및 Cre 재조합효소용 발현 코드는 DHFR-/-세포로 세포감염된다. Cre 재조합효소는 DHFRR 유전자 궤적으로부터 항생 저항을 제거하며 본 발명에 따른 벡터를 DHFRR-/-세포의 게놈 내부로 loxP 서열로 통합한다. 세포는 티미딘, 글리신, 및 푸린 부속물과는 관계없이 항생작용에 민감하다.
선택은 부속물없이 배지를 사용하거나 배양 배지에 적합한 항생물질을 부가함으로써 달성될 수 있다. 이러한 경우에, 항생 물질은 세포의 게놈으로부터 Cre 재조합효소에 의해 제거된 저항 유전자와 상응한다. loxP 서열 내부로 통합된 벡터가 양성 선택 표지 유전자를 함유하고 있다면, 배지에 항생물질을 부가함으로써 수행될 수 있다.
유전자 증폭에 의한 생산 출력의 증가
재조합 단백질용으로 세포의 생산 출력을 증가시키기 위해서는, 메토트랙사트(MTX) 선택은 세포 내부로 도입된 DHFR 유전자와 단백질용 핵산 서열 코드를 증폭시킴으로써 수행된다.
증폭을 달성하기 위해서는, 세포는 증가된 농도(100-1000 mM)하에 배양된다. 증폭의 정도는 (MTX 부가 이전,진행중, 및 이후)비교 서던 블롯의 농도측정에 의해 측정된다.
증폭 단계 이후에 얻어진 본 발명에 따른 세포는 loxP 궤적에서 다수의 도입된 DHFR 유전자와 삽입된 동종 핵산 서열의 모사를 함유한다. 이는 동종 핵산의 높은 생산 출력에 의해 특징화된다.
본 발명의 바람직한 실시예는 상세한 설명의 일부분으로 다음에 설명되어 있다.
1. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 방법에 있어서,
(a) 세포가 (ⅰ)제 1 동종 발현 제어 서열 및 제 1 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열, (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자, (ⅲ) 서열(ⅰ) 및 (ⅱ)를 플랭킹하는 부위특이적 재조합효소에 대한 적어도 두 개의 표적 서열, 및 (ⅳ) 서열 (ⅰ),(ⅱ), 및(ⅲ)을 플랭킹하며 동종 재조합을 따르기 위해 세포의 게놈 내에 핵산 섹션에 동종인 DNA 서열을 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 세포감염된 세포가 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건 하에서 배양되는 단계와,
(c) (b) 단계에 따라 얻어진 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, loxP 서열은 재결합효소 표적 서열로 사용되는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2항에 있어서, 세포는 인간 세포인 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항목에 있어서, 세포는 불멸 세포인 방법.
5. 제 4항에 있어서, 세포는 HT1080 , 나말와, 또는 HeLa S3 세포인 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 비정형 발현 제어 서열은 바이러스성 프로모터 및 특히 바람직하게 CMV 프러모터인 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 비정형 발현 제어 서열은 3' 비코드 서열을 포함하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 동종 서열은 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 내인성 발현 제어 서열이 동종 재조합에 의해 제거되는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 양성 선택 표지 유전자는 네오마이신, 카나마이신, 하이그로미신 저항 유전자의 지네티신인 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 1항 (a)의(ⅳ)에 청구되어진 동종 서열의 외부에 배열된 음성 선택 표지 유전자를 부가적으로 함유하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 재결합효소 표적 서열 사이에 위치된 핵산 서열은 표적 서열을 인지하는 부위-특이적 재결합효소의 일시적인 활성에 의해 세포의 게놈 외부로 절제되는 방법.
12. 제 1항에 있어서,
(a) 세포는 (ⅰ) 제 2 비정형 발현 제어 서열 및 제 2 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열,(ⅱ) 제 1 벡터의 양성 선택 표지 유전자와는 바람직하게 다른 야성 선택 표지 유전자, 및 (ⅲ) 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 플랭킹하는 적어도 두 개의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 또 다른 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 표적 서열에 의해 플랭킹되어진 서열이 세포의 게놈 내의 표적 서열 내부로 통합된 조건 하에서 배양되는 단계와,
(c) (b) 단계에 따라 얻어진 세포가 분리되는 단계와, 그리고
(d) (a) 내지 (c) 단계가 각각의 경우 변화하는 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자로 적어도 1회 반복되는 단계를 갖는 방법.
13. 동종 재조합용 벡터에 있어서,
(ⅰ) 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열과,
(ⅱ) 양성 선택 표지 유전자와,
(ⅲ) 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)을 플랭킹하는 부위- 특이적 재조합효소에 대한 적어도 두 개의 표적 서열,
(ⅳ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈내에 핵산 섹션에 동종인 서열 (ⅰ),(ⅱ), 및(ⅲ)을 플랭킹하는 DNA 서열, 및
(ⅴ) 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 동종 재조합용 벡터.
14. (ⅰ) 비정형 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열,
(ⅱ)양성 선택 표지 유전자,
(ⅲ) 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)을 플랭킹하는 적어도 두 개의 재조합효소 표적 서열,
(ⅳ) 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 벡터.
15. 제 1 항 내지 제 12항중 어느 한 항에서 청구한 방법에 의해 얻어지는 바람직하게 인간 세포인 진핵 세포.
16. (a) 내생적으로 존재하는 핵산 서열로 작동연결된 비정형 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 염색체 위치된 적어도 하나의 서열을 함유하며,
(b) 이러한 서열은 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되는 바람직하게 인간 세포인 진핵 세포.
17. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 방법에 있어서,
(a) 세포는 (ⅰ) 활성체 단백질을 결합하는 적어도 하나의 핵산 서열, (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자, 및 (ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈 내부로 핵산 섹션에 동종인 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙팅되며,
(b) 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건하에서 트랜스펙팅된 세포가 배양되는 단계와,
(c) (b) 단계에 따라 얻어진 세포가 분리되는 단계를 더 포함하는 방법.
18. 제 17항에 있어서, 적어도 하나의 하이폭시아-유도-인자(HIF)-결합 핵산 서열이 사용되는 방법.
19. 제 18항에 있어서, HIF-결합 핵산 서열이 서열 ID NO.1에 따른 53 bp 서열, 서열 ID NO.2에 따른 43 bp 서열, 이러한 서열에 동종인 서열, 또는 엄격한 조건하에서 이러한 서열로 잡종을 만드는 서열로부터 선택되는 방법.
20. 제 17항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, (ⅰ) 이러한 세포 내에 활성 발현 제어 서열로 작동 연결된 활성체 단백질용으로 코드화된 핵산 서열, 및 (ⅱ) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자를 포함하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 활성체 단백질은 HIF-1α 또는/ 및 HIF-1β 단백질인 방법.
22. 제 18항 내지 제 21항에 있어서, 세포는 0.1 내지 2%의 O2농도에서 배양되는 방법.
23. 동종 재조합용 벡터로서,
(ⅰ) 활성체 단백질을 결합하는 적어도 하나의 핵산 서열과,
(ⅱ) 양성 선택 표지 유전자와,
(ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈내에 핵산 섹션에 동종인 서열 (ⅰ) 및(ⅱ)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
24. 제 17항 내지 제 21항중 어느 한 항에서 청구한 방법에 의해 얻어질 수 있는 바람직하게 인간 세포인 진핵 세포.
25. 바람직하게 인간 세포인 진핵 세포에 있어서,
세포 내에 내생적으로 존재하는 유전자로 작동연결된 활성체 단백질 및 활성체 단백질 복합물을 결합하는 적어도 하나의 비정형의 염색체 위치된 핵산 단편을 포함하는 진핵 세포.
26. 진핵 세포 발현에 대한 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 영역으로부터 비코드 핵산 서열의 영향을 시험하기 위한 방법에 있어서,
(a) 세포는 (ⅰ) 리포터 유전자로 작동 연결된 세포 내에서 활성화되거나 활성화될 수 있는 비정형 방현 제어 서열과, (ⅱ) 표적 유전자의 영역으로부터 5' 측면 또는/ 및 3' 측면상의 비토드 핵산 단편을 포함하는 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 발현 제어 서열이 활성화된 조건하에서 상기 세포가 배양되는 단계와,
(c) 리포터 유전자의 발현이 측정되는 단계를 특징으로 하는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 리포터 유전자는 클로로암페니콜 아세틸 전이효소(CAT), β-갈락토시다아제(β-Gal) 또는 라크(lacZ)로 코드화되는 방법.
28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
(a) 서로 다른 표적 유전자의 5' 또는/ 및 3' 비코드 핵산 단편을 포함하는 적어도 2개의 벡터는 각각의 경우 다른 세포로 트랜스펙팅되며,
(b) 리포터 유전자의 발현은 다른 세포 내에서 측정되는 방법.
29. DHFR-음성 진핵 세포를 제공하기 위한 방법에 있어서,
(a) 세포는 (ⅰ) 부위 특이적 재조합효소에 대한 적어도 하나의 표적 서열과, (ⅱ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFRR 핵산에 동종인 서열(ⅰ)을 플랭킹하는 DNA 서열과, (ⅲ) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자 및 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙팅하는 단계와,
(b) 트랜스펙팅된 세포가 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되는 단계와,
(c) (b) 단계에 따라 얻어진 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
30. 제 29항에 있어서, loxP 서열은 재조합 표적 서열로 사용되는 방법.
31. 제 29항 또는 제 30하아에 있어서, 양성 선택 표지 유전자로 코드화된 핵산은 네오마이신, 카타나마이신, 지네티신 또는 히그로마이신 저항 유전자인 방법.
32. 제 29항 내지 제 31항에 있어서, 음성 선택 표지 유전자로 코드화된 핵산 서열은 티미딘 키나아제 유전자(TK)또는/ 및 하이포산틴-구아닌-포스포리복실 전이효소 유전자(HGPRT)인 방법.
33. 제 29항 내지 제 32항에 있어서, 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되어진 서열은 대응 재조합효소의 일시적인 활성에 의해 세포의 게놈 외부로 절제되는 방법.
34. 진핵 세포 내부로 DHFR 유전자를 도입시키기 위한 방법에 있어서,
(a) 33항에 따른 방법에 의해 얻어진 세포는 (ⅰ) 선택적으로 제 1 벡터의 양성 선택 표지 유전자와는 바람직하게 다른 양성 선택 표지 유전자와, (ⅱ) DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열과, (ⅲ)단백질용으로 코드화된 증폭되어질 핵산 서열로서 단백질 내의 부분 서열(ⅰ),(ⅱ), 및(ⅲ)으로부터 각각의 핵산 서열은 적어도 하나의 재조합효소 표적 유전자에 의해 5' 측면 및 3' 측면상에서 플랭킹되어지는 핵산 서열을 포함하는 제 3 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
(b) 트랜스펙팅된 세포가 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 핵산 서열이 세포의 게놈 내부에 미리 존재하는 재조합효소 표적 서열로 통합된 조건하에서 배양되는 단계와,
(c) (b )단계에 따라 얻어진 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
35. (ⅰ) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자와, (ⅱ) DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열과, (ⅲ) 소정의 단백질용으로 코드화된 발현 형태의 핵산 서열을 포함하고,
부분 서열(ⅰ), (ⅱ), 및 (ⅲ)로부터 각각의 핵산 서열은 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열에 의해 5' 측면 및 3' 측면상에 플랭킹되는 벡터.
36. 동종 재조합용 벡터에 있어서,
(ⅰ) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자와,
(ⅱ) 서열(ⅰ)을 플랭킹하는 각각의 경우에 적어도 하나의 재조합효소 표적 유전자와,
(ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산에 동종인 서열(ⅰ) 및 (ⅱ)를 플랭킹하는 DNA 서열과,
(ⅳ) 선택적으로 동종 서열(ⅲ) 외부의 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 벡터.
37. 제 29항 내지 제 34항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 바람직하게 인간 세포인 진핵 세포.
38. 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포에 있어서,
(a) 비활성화된 DHFR 용으로 코드화된 적어도 하나의 내인성 핵산 서열, 및
(b) DHFRR 용으로 코드화된 핵산 서열의 영역내의 게놈 내부로 통합된 적어도 하나의 재조합효소 표적 유전자인 진핵 세포.
39. 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포에 있어서,
내인성 DHFR 유전자 궤적의 영역내의 비정형 핵산 서열은 (ⅰ) DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열, (ⅱ) 소정의 단백질용으로 코드화된 핵산 서열, 및 (ⅲ) 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵 세포.
본 발명으로 인해 동종 재조합에 의한 내인성 유전자 활성을 최적화시킬 수 있다.
서열목록
(1) 일반적 사항
(ⅰ) 출원인:
(A) 성명: 뵈링거 만하임 게엠베하
(B) 거리: 잔트호퍼 슈트라쎄 112-132
(C) 도시: 만하임
(E) 국가: 독일
(F) 우편 번호: 데-68305
(ⅱ) 발명의 명칭: 내인성 유전자 활성화를 위해 세포를 최적화시키는 방법
(ⅲ) 서열의 수: 3개
(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D) 소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.30(EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 53 염기쌍
(B) 서열의 타입: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 43 염기쌍
(B) 서열의 타입: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 34 염기쌍
(B) 서열의 타입: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형

Claims (19)

  1. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 세포는 (ⅰ) 제 1 동종 발현 제어 서열 및 제 1 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열, (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자, (ⅲ) 상기 서열(ⅰ) 및 (ⅱ)에 플랭킹 위치한 부위 특이적 재조합용 적어도 두 개의 표적 서열, 및 (ⅳ) 동종 재조합을 허용하기 위해 상기 세포의 게놈 내부에 핵산 섹션이 동종인 상기 서열 (ⅰ), (ⅱ), 및 (ⅲ)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙팅하는 단계와,
    (b) 상기 트랜스펙팅된 세포가 상기 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건 하에서 배양되는 단계와, 그리고
    (c) 상기 (b) 단계에 따라 얻어진 상기 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, loxP 서열은 재조합 표적 서열로 사용되는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 벡터는 청구범위 제 1 항의 상기 (a) 단계의 (ⅳ)에 따른 동종 서열 외부면에 배열된 음성 선택 표지 유전자를 부가적으로 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 표적 서열 사이에 위치된 상기 핵산 서열은 상기 표적 서열을 인지하는 부위 특이적 재조합효소의 일시적인 활성에 의해 상기 세포의 게놈 외부로 절단되는 방법.
  5. 동종 재조합용 벡터에 있어서,
    (ⅰ) 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열과,
    (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자와,
    (ⅲ) 상기 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)에 플랭킹되어진 부위 특이적 재조합 효소에 대한 적어도 두 개의 표적 서열과,
    (ⅳ) 동종 재조합을 허용하기 위해 세포의 게놈 내의 핵산 섹션에 동종인 상기 서열(ⅰ),(ⅱ), 및 (ⅲ)에 플랭킹되어진 DNA 서열과, 그리고
    (ⅴ) 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 벡터.
  6. (ⅰ) 동종 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 서열과,
    (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자와,
    (ⅲ) 상기 서열(ⅰ) 및 (ⅱ)에 플랭킹되어진 적어도 두 개의 재조합 표적 서열과, 그리고
    (ⅳ) 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 벡터.
  7. 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포에 있어서,
    (a) 내생적을 존재하는 핵산 서열로 작동 결합된 동종 발현 제어 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 염색체 위치된 서열을 포함하며,
    (b) 상기 서열은 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되어진 진핵 세포.
  8. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 세포는 (ⅰ) 활성체 단백질을 결합시키는 적어도 하나의 서열, (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자, (ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 상기 세포의 게놈 내부에 핵산 섹션이 동종인 상기 서열 (ⅰ),및 (ⅱ)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙팅하는 단계와,
    (b) 상기 트랜스펙팅된 세포가 상기 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건 하에서 배양되는 단계와, 그리고
    (c) 상기 (b) 단계에 따라 얻어진 상기 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 적어도 하나의 하이폭시아 유도 인자(HIF) 결합 핵산 서열이 사용되는 방법.
  10. 동종 재조합용 벡터에 있어서,
    (ⅰ) 활성체 단백질을 결합하는 적어도 하나의 핵산 서열과,
    (ⅱ) 양성 선택 표지 유전자와,
    (ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 상기 세포의 게놈 내부로 핵산 섹션에 동종인 상기 서열 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
  11. 제 8항 내지 제 10항중 어느 한 항에서 청구한 방법에 의해 얻어지는 바람직하게 인간 세포인 진핵 세포.
  12. 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포에 있어서,
    상기 세포 내에서 내생적으로 존재하는 유전자로 작동 결합된 활성체 단백질 및 활성체 단백질 복합물을 결합하는 적어도 하나의 동종으로 염색체위치한 핵산 부분을 함유하는 진핵 세포.
  13. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 영역으로부터 비코드 핵산 서열의 작용을 시험하기 위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 세포가 (ⅰ) 리포터 유전자로 작동 결합된 세포 내에 활성화되거나 활성화 될 수 있는 동종 발현 제어 서열과, (ⅱ) 상기 표적 유전자의 영역으로부터 5' 측면 또는/ 및 3' 측면상에 비코드 핵산 부분을 포함하는 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
    (b) 상기 세포가 상기 발현 제어 서열이 활성화된 조건하에서 배양되는 단계와,
    (c) 상기 리포터 유전자의 발현이 측정되는 단계를 포함하는 방법.
  14. DHFR - 음성 진핵 세포를 제공하기 위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 세포가 (ⅰ) 부위 특이적 재조합효소용으로 적어도 하나의 표적 서열과, (ⅱ) 동종 재조합을 허용하기 위해 상기 세포 내에 내생적으로 존재하는 DFHR 핵산 서열에 동종인 서열(ⅰ)을 플랭킹하는 DNA 서열, 및 (ⅲ) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자 및 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
    (b) 상기 트랜스펙팅되어진 세포가 상기 벡터의 동종 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되는 단계와,
    (c) 상기 (b) 단계에 따라 얻어진 상기 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
  15. 동종 DHFR 유전자를 진핵 세포 내부로 도입시키기 위한 방법에 있어서,
    (a) 14항에 청구된 방법에 의해 얻어진 세포가 (ⅰ) 제 1벡터의 양성 선택 표지 유전자와는 바람직하게 다른 선택적으로 양성 선택 표지 유전자와, (ⅱ) DHFR 용 핵산 서열 코드와, (ⅲ) 발현 형태 내에 단백질용 코드로 증폭되어질 핵산 서열로서 상기 부분 서열 (ⅰ),(ⅱ), 및 (ⅲ)으로부터 상기 각각의 핵산 서열은 상기 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열에 의해 상기 5'측면 및 3'측면 상에 플랭킹되어진 핵산 서열을 포함하는 제 3 벡터로 트랜스펙팅되는 단계와,
    (b) 상기 트랜스펙팅된 세포가 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되어진 상기 핵산 서열이 상기 세포의 게놈 내부에 이미 존재하는 상기 재조합효소 표적 서열로 통합된 조건하에서 배양되는 단계와, 그리고
    (c) 상기 (b) 단계에 따라 얻어진 상기 세포가 분리되는 단계를 포함하는 방법.
  16. (ⅰ)선택적으로 양성 선택 표지 유전자와,
    (ⅱ) DHFR용 핵산 서열 코드와,
    (ⅲ) 소정의 단백질용 발현 형태 코드 내의 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 부분 서열 (ⅰ),(ⅱ), 및 (ⅲ)로부터 각각의 핵산 서열은 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열에 의해 5'측면 및 3' 측면상에 플랭킹되어진 벡터.
  17. 동종 재조합용 벡터로서,
    (ⅰ) 선택적으로 양성 선택 표지 유전자와,
    (ⅱ) 상기 서열 (ⅰ)에 플랭킹되어진 각각의 경우에 적어도 하나의 재조합효소 표적 유전자와,
    (ⅲ) 동종 재조합을 허용하기 위해 상기 세포 내에 내생적으로 존재하는 DFHR 핵산 서열에 동종인 서열(ⅰ) 및 (ⅱ)을 플랭킹하는 DNA 서열, 및
    (ⅳ) 상기 동종 서열(ⅲ) 외부에 위치한 선택적으로 음성 선택 표지 유전자를 포함하는 벡터.
  18. 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포에 있어서,
    (a) 비활성화된 DHFR 용으로 코드화된 적어도 하나의 내인성 핵산 서열, 및
    (b) DHFRR 용으로 코드화된 핵산 서열의 영역내의 게놈 내부로 통합된 적어도 하나의 재조합효소 표적 유전자인 진핵 세포.
  19. 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포에 있어서,
    내인성 DHFR 유전자 궤적의 영역내의 비정형 핵산 서열은 (ⅰ) DHFR 용으로 코드화된 핵산 서열, (ⅱ) 소정의 단백질용으로 코드화된 핵산 서열, 및 (ⅲ) 적어도 하나의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵 세포.
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