PT957165E - Optimização de células para a activação de genes endógenos - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "OPTIMIZAÇÃO DE CÉLULAS PARA A ACTIVAÇÃO DE GENES ENDÓGENOS" A invenção refere-se à introdução de duas sequências de ácido nucleico, às quais se liga a proteína activadora de um factor Induzível por hipoxia (HIF), no genoma de uma célula eucariótica através de recombinação homóloga, para alterar a expressão de um gene alvo. A expressão génica numa célula pode efectuar-se de forma constitutiva, por exemplo, no caso dos denominados genes "constitutivos", ou de forma regulada. A expressão regulada é necessária, especialmente, para genes que têm de ser expressos apenas numa determinada fase de desenvolvimento da célula ou no caso de uma alteração das condições ambientais. A expressão é regulada ao nível da transcrição, através do promotor que está ligado operativamente à sequência de ácido nucleico codificadora e cuja actividade pode ser controlada através de repressores e activadores. Uma ligação de repressores ou de activadores a sequências de ácido nucleico do gene, não codificadoras, pode provocar uma diminuição ou um aumento da actividade do promotor (L. Stryer, Biochemie, capítulo 12, Spektrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft, Heidelberg, 1990). A quantidade de repressores ou de activadores contidos numa célula é regulada, por sua vez, por factores, como por exemplo as condições ambientais. Um exemplo de activadores são os factores Induzíveis por hipoxia (HIF), os quais são induzidos 1 por uma diminuição do fornecimento de 02, conduzindo a um aumento da expressão do gene da eritropoietina (Blanchard K.L. et al., Hypoxic induction of the human erythropoietin gene: Cooperation between the promotor and enhancer, each of which contains steroid receptor response elements, (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 5373-5385; Wang G.L. and Semenza G.L., Characterization of hipoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hipoxia, (1993), J. Biol. Chem., 268, 21513-21518; Wang G.L. et al., Hipoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension, (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 5510-5514).
Além disso, a quantidade de uma proteína expressa depende da estabilidade do ARNm. Na região 3'-terminal de um ARNm estão localizadas sequências de reconhecimento para enzimas que degradam ARNm, que influenciam a estabilidade do ARNm e, por conseguinte, o nível de expressão (Shaw G. e Kamen R., A Conserved AU Sequence from the 3'Untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation, Cell (1986), 659-667). A semivida do ARNm está, neste caso, em correlação com a quantidade de proteína expressa. Um terceiro nível da regulação da expressão é a tradução. A expressão de um gene está portanto sujeita a mecanismos de regulação complexos, os quais podem diferir muito uns dos outros no caso particular.
As proteínas podem ser obtidas por meio da tecnologia do ADN recombinante, a qual tira proveito dos conhecimentos sobre a regulação da expressão (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). Para este fim são utilizados vectores que contêm uma sequência de ácido 2 nucleico codificadora da respectiva proteína sob o controlo de um promotor adequado, assim como outras sequências necessárias para a expressão da proteína e para a replicação do vector. 0 vector é introduzido então numa célula hospedeira por meio de métodos conhecidos, a célula é cultivada e a proteína recombinante pode ser obtida a partir da célula ou do meio de cultura.
Como célula hospedeira podem ser utilizadas células procarióticas ou eucarióticas. As células procarióticas, especialmente células de E.coli, são pouco problemáticas no que se refere ao seu manuseamento, apresentando no entanto uma série de inconvenientes no caso da expressão recombinante de proteínas eucarióticas.
Os procariotas e eucariotas distinguem-se pela sua via de processamento da expressão, pelas condições do ambiente celular, assim como pelas chaperonas que participam no processamento das proteínas. Por esta razão pode haver diferenças decisivas numa proteína eucariótica produzida num procariota, em comparação com a proteína nativa correspondente. Podem estar alterados, por exemplo, o padrão de dobragem da proteína e a actividade da proteína. Além disso, numa célula hospedeira procariótica as proteínas não são geralmente glicosiladas. No entanto, em muitos casos, por exemplo na produção de proteínas para uma formulação farmacêutica, um padrão de glicosilação correcto representa uma característica decisiva para a sua eficácia e compatibilidade.
Por isso, as proteínas glicosiladas são produzidas por meio de células hospedeiras ou linhas celulares eucarióticas, por exemplo células de CHO (Ovário de Hamster Chinês). Apesar da utilização de células eucarióticas, podem ocorrer alterações na 3 proteína produzida da forma recombinante, devido a diferenças entre as espécies, por exemplo no caso de expressão de uma proteína humana em células não humanas, o que torna esta proteína inutilizável para muitas aplicações.
Para a produção recombinante de proteínas, as células hospedeiras são transfectadas de maneira transiente ou estável com vectores de expressão, sendo que, especialmente em processos de produção à escala industrial, são utilizadas células transfectadas de maneira estável. A integração aleatória, não específica, das sequências do vector de expressão no genoma da célula hospedeira, pode conduzir a células com baixo rendimento produtivo ou a propriedades instáveis das células. É, por exemplo, possível que ao longo do processo de produção o rendimento produtivo diminua ou que a capacidade das células de expressarem a proteína recombinante se perca completamente. A presente invenção refere-se a um processo para a alteração da expressão de uma sequência de ácido nucleico, existente de forma endógena numa célula humana, caracterizado por (a) a célula ser transfectada com um vector, compreendendo (i) duas sequências de ácido nucleico que se ligam à proteína activadora HIF, escolhidas a partir da sequência de acordo com a SEQ ID N°.l e da sequência de acordo com a SEQ ID N°.2, (ii) um gene marcador de selecção positivo, 4 (iii) as sequências de ADN que flanqueiam as sequências (i) e (ii) que são homólogas a uma secção de ácido nucleico no genoma da célula, sendo que as sequências (iii) homólogas são escolhidas de tal modo que ocorre uma integração genómica das sequências (i) de ácido nucleico que se ligam à proteína activadora na região da sequência de controlo da expressão do gene alvo de modo a permitir uma recombinação homóloga, (b) a célula transfectada ser cultivada sob condições nas quais ocorre uma recombinação homóloga do vector, (c) a célula obtida de acordo com a etapa (b) ser recuperada, e (d) a célula ser transfectada com um vector, compreendendo (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína activadora HIF-102 e uma que codifica a proteína activadora HIF-1B, as quais estão ligadas operativamente a uma sequência de controlo da expressão activa nesta célula, e (ii) eventualmente um gene marcador de selecção positivo.
Por meio de integração genómica de uma sequência de ácido nucleico, sendo a ligação a uma ou mais proteínas activadoras (através da ligação de proteínas que aumentam a expressão do gene à sequência de ácido nucleico) na região da sequência de controlo da expressão de um gene alvo, especialmente nas suas regiões de regulação, surpreendentemente, a expressão do gene alvo não é reduzida, sendo antes possível, pelo contrário, aumentar a expressão do gene alvo existente de forma endógena 5 por meio de condições de cultura adequadas, ou seja, sendo possível induzir a expressão de um gene alvo existente de forma endógena não exprimido.
As proteínas activadoras são os factores Induzíveis por hipoxia HIF-Ία e HIF-β.
Após a ligação operativa a um gene alvo existente de forma endógena de duas sequências de ácido nucleico que ligam o HIF, a expressão do gene alvo pode ser regulada, uma vez seleccionadas as condições de cultura adequadas. Especialmente numa produção à escala industrial, isto oferece a vantagem de a expressão de uma proteína poder ser induzida num momento ideal para o processo e produção. Neste caso, afigura-se vantajoso o facto de o tempo médio de permanência do produto de síntese ser reduzido no sobrenadante do meio de cultura. Por este meio também pode ser reduzida a quantidade de produtos de decomposição indesejáveis da proteína. Isto repercute-se de forma positiva, aquando da realização das etapas de purificação subsequentes, reduz os custos e produção e conduz a um produto final melhorado em termos qualitativos.
Para a realização do processo de acordo com a invenção, é suficiente ligar operativamente, ao gene alvo, duas sequências de ácido nucleico que ligam o HIF, escolhidas a partir da sequência 53 pb, de acordo com a sequência ID N°l, e da sequência 43 pb, de acordo com a sequência ID N°2. A utilização de duas sequências de ácido nucleico que ligam o HIF conduz, surpreendentemente, a um efeito sinergético. Por este meio é obtido um aumento mais forte da expressão dos ácidos 6 nucleicos endógenos do que na utilização separada de cada uma destas sequências. A sequência de controlo da expressão ligada operativamente à sequência de ácido nucleico que codifica a proteína activadora é susceptível de ser induzida, de modo que pode ser conseguida uma possibilidade adicional de activação mediante condições de cultura adequadas como, por exemplo, adução de hormonas ou de metais pesados. Por este meio torna-se possível induzir a expressão de um gene alvo endógeno num momento ideal para o processo de produção. A utilização de uma sequência de controlo da expressão constitutivamente activa tem a vantagem de a proteína activadora ser expressa constitutivamente, independentemente da adução de activadores no meio de cultura.
Quando a sequência de ácido nucleico que liga a proteína activadora é uma sequência de ácido nucleico que liga o HIF, a expressão do gene alvo pode ser induzida, por exemplo, mediante condições de cultura adequadas, por exemplo, numa concentração de O2 de 0,1 - 2%.
Um outro objecto da presente invenção consiste numa célula humana susceptível de ser obtida através de um processo como o acima descrito. Esta célula caracteriza-se pelo facto de conter pelo menos um gene existente de forma endógena na célula, ligada operativamente a uma sequência de controlo da expressão e em dois fragmentos de ácido nucleico heterólogos, escolhidos a partir da sequência de acordo com a SEQ ID N°1 e da sequência de acordo com a SEQ ID N°2, que ligam a proteína activadora HIF, localizados num cromossoma e integrados genomicamente na região 7 da sequência de controlo da expressão de um gene alvo e um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína activadora HIF-Ια e uma que codifica a proteína activadora HIF-Ιβ que estão ligadas operativamente a uma sequência de controlo da expressão activa nesta célula e que, eventualmente, contém um gene marcador de selecção positivo. Com o auxílio de um sistema de recombinação, localizado especificamente, podem ser trocados, no genoma, fragmentos de ácido nucleico que ligam a proteína activadora, de modo que se torna possível uma fácil identificação de uma sequência de activadores ideal em relação a um determinado gene alvo. A invenção é explicada através do exemplo seguinte, da figura e do protocolo de sequências.
Descrição das figuras
Figura 1
Mostra a expressão da eritropoietina (EPO) de células HeLa S3 controlada pelo promotor de CMV / HIF, células essas que foram transfectadas com os vectores pHYG, pHIF-Ια e pARNT (pHIF-1β) e cuja expressão EPO foi medida 3, 4 e 5 dias após a transfecção nos excedentes de células (concentração de eritropoietina em yg/ml). pHYG: vector de controlo, pHIF-Ια: um HIF-la ADNc sob controlo de um promotor SRa, pARNT: um HIF-β ADNc sob controlo de um promotor de CMV.
EXEMPLOS
Exemplo 1 Expressão de um gene de eritropoietina sob o controlo de um promotor de CMV e de sobre-expressão de HIF
Os vectores pHYG, pHIF-Ια e pARNT (comparar com a figura 3) são transfectados em células HeLa S3 geneticamente transformadas. Nas células, proximamente ao inicio da tradução do gene de eritropoietina (EPO) de um alelo do EPO foi introduzido um promotor de CMV (citomegalovirus) no qual controla a expressão do EPO. As células produzem, normalmente, 1 yg de eritropoietina por cada 24 horas por cada 107 células. Elas são transferidas 24 horas, antes da transfecção, com uma concentração de 6 x 104 células por cada placa de seis orifícios. No dia da transfecção as células são incubadas com uma mistura de ADN - DOTAP. A mistura contém 1,25 yg do respectivo vector, 10 yL de DOTAP (Boehringer Mannheim 1202375) ad 75 yL em 20 mM de tampão Hepes por orifício. A mistura é previamente incubada durante 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. As células são então incubadas, durante 6 horas, em 3 mL de meio, por orifício, com o ADN-DOTAP. Em seguida, as células são lavadas, duas vezes, em tampão PBS e cultivadas em meio pleno, durante 5 dias. No dia 3, 4 e 5 são retirados respectivamente 100 yl de excedente e analisados mediante um teste ELISA eritropoietina. O ensaio biológico está terminado no dia 5, sendo determinado o número de células. A quantidade de eritropoietina por orifício é calculada relativamente ao número de células idêntico (comparar com a figura 3) . O exemplo mostra que uma indução do gene de eritropoietina através de HIF continua a ser possível, embora uma sequência de 9 controlo da expressão heteróloga (promotor de CMV) tenha sido introduzida na região de promotor de um alelo do gene de eritropoietina. 0 aumento medido da concentração de eritropoietina aponta para um efeito sinergético do factor induzido por Hipoxia, ou seja, dos factores induzidos por Hipoxia sobre os dois alelos.
Torna-se, por conseguinte, claro que a expressão de uma sequência de ácido nucleico endógena pode ser aumentada mediante a introdução de uma sequência de controlo da expressão heteróloga. Caso seja expresso um activador (HIF) na célula para o qual existem sequências de ácido nucleico que se ligam à sequência de controlo da expressão, então a expressão deste gene pode continuar a ser aumentada. Caso não existam, neste local do gene, as sequências correspondentes, estas podem ser introduzidas no genoma através do processo de acordo com a invenção, mediante recombinação homóloga.
PROTOCOLO DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:
(A) NOME: Boehringer Mannheim GmbH (B) RUA: Sandhofer Strasse 112-132 (C) LOCALIDADE: Mannheim (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: D-68305 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Optimização de células para a activação de genes endógenos 10 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPA) (2) INFORMAÇÃO REFERENTE À SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: ambas (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: CCTCTCCTCT AGGCCCGTGG GGCI^GCCCT GCACCGCCSA GCTTCCCGGG 53 (2) INFORMAÇÃO REFERENTE À SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: ambas (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2 CTACGTGCTG TCTCACACAG CCTGTCTGAC CTCTCGACCC TAC 43 11 (2) INFORMAÇÃO REFERENTE À SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: ambas (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3 TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA 34
PROTOCOLO DE SEQUÊNCIAS <110> Roche Diagnostics GmbH <120> Optimização de células para a activação de genes endógenos <130> Activação de genes endógenos 15964P EP-2 <140> 99112607.9 <141> 1998-12-01 <150> 97121075.2 <151> 1997-12-01 <160> 3 <170> Patente In Ver. 2.1 <210> 1 12
<211> 53 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1
cctctcctct aggcccgtgg ggctggccct gcaccgccga gcttcccggg atg 53 <210> 2 <211> 43 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2
ctacgtgctg tctcacacag cctgtctgac ctctcgaccc tac 43 <210> 3 <211> 34 <212> ADN <213> bacteriofago PI < 4 0 0 > 3 tattgaagca tattacatac gatatgcttc aata 34
Lisboa, 9 de Julho de 2007 13

Claims (3)

  1. REIVINDICAÇÕES Processo para a alteração da expressão de uma sequência de ácido nucleico existente sob a forma endógena numa célula humana, caracterizado por (a) a célula ser transfectada com um vector, compreendendo (i) duas sequências de ácido nucleico que se ligam à proteina activadora HIF, escolhidas a partir da sequência de acordo com a SEQ ID N°1 e da sequência de acordo com a SEQ ID N°2, (ii) um gene marcador de selecção positivo, (iii) as sequências de ADN que flanqueiam as sequências (i) e (ii) que são homólogas a uma secção de ácido nucleico no genoma da célula, sendo que as sequências (iii) homólogas são escolhidas de tal modo que ocorre uma integração genómica das sequências (i) de ácido nucleico que se ligam à proteína activadora na região da sequência de controlo da expressão do gene alvo de modo a permitir uma recombinação homóloga, (b) a célula transfectada ser cultivada sob condições nas quais ocorre uma recombinação homóloga do vector, (c) a célula obtida de acordo com a etapa (b) ser recuperada, e (d) a célula ser transfectada com um vector, compreendendo 1 (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína activadora HIF-102 e uma que codifica a proteína activadora HIF-1B, as quais estão ligadas operativamente a uma sequência de controlo da expressão activa nesta célula, e (ii) eventualmente um gene marcador de selecção positivo.
  2. 2. Célula humana podendo ser obtida através de um processo de acordo com a reivindicação 1.
  3. 3. Célula humana caracterizada por conter pelo menos um gene existente, de forma endógena na célula ligada operativamente à sequência de controlo da expressão e a dois fragmentos de ácido nucleico heterólogos, escolhidos a partir da sequência de acordo com a SEQ ID N°1 e da sequência de acordo com a SEQ ID N°2, que ligam a proteína activadora HIF, localizados num cromossoma e integrados genomicamente na região da sequência de controlo da expressão de um gene alvo e um vector compreendendo uma que codifica a proteína activadora HIF-Ια e uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína activadora HIF-Ιβ que estão ligadas operativamente a uma sequência de controlo da expressão activa nesta célula e que, eventualmente, contém um gene marcador de selecção positivo. Lisboa, 9 de Julho de 2007 2
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316253B1 (en) 1999-11-01 2001-11-13 Chiron Corporation Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof
WO2001066717A2 (en) * 2000-03-03 2001-09-13 The University Of Utah Gene targeting method
DE10023887A1 (de) * 2000-05-17 2001-11-29 Axel Haverich Verfahren zur transienten Insertion genetischer Elemente
CA2455013A1 (en) * 2001-07-27 2003-02-13 Francesca Storici Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
CA2497913C (en) 2002-09-05 2014-06-03 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20120196370A1 (en) 2010-12-03 2012-08-02 Fyodor Urnov Methods and compositions for targeted genomic deletion
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CA2579677A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
WO2007014275A2 (en) * 2005-07-26 2007-02-01 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
CN103484496A (zh) * 2013-07-31 2014-01-01 新乡医学院 一种报告基因重组在染色体目的基因上的方法、位点及用途
US10006910B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same
US9857328B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same
US9618474B2 (en) 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10020300B2 (en) 2014-12-18 2018-07-10 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US9859394B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
EP3235010A4 (en) 2014-12-18 2018-08-29 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistor
WO2017201081A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Agilome, Inc. Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US568772A (en) * 1896-10-06 Albert s
CA1293460C (en) * 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
GB2187415A (en) 1986-03-05 1987-09-09 Deere & Co Machine for forming cylindrical bales of crop
JPS62265992A (ja) * 1986-05-12 1987-11-18 Ajinomoto Co Inc ヒト細胞を用いる有用物質の製造方法
US4956288A (en) * 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
DE69032809T2 (de) * 1989-11-06 1999-07-08 Cell Genesys Inc Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
US5272071A (en) * 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
EP0779362B2 (en) * 1989-12-22 2012-06-13 Laboratoires Serono SA DNA constructs for endogenous gene activation and expression modification
WO1992015694A1 (en) * 1991-03-08 1992-09-17 The Salk Institute For Biological Studies Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor
US6270989B1 (en) * 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
EP0626999A4 (en) * 1992-01-24 1997-04-09 Life Technologies Inc Modulation of enzyme activities in the -i(in vivo) cloning of dna.
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5527695A (en) * 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
ATE244311T1 (de) * 1993-12-23 2003-07-15 Merck & Co Inc Expressionssystem von antikörpern bei homologischer rekombinierung in murinezellen
US6130364A (en) * 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5882914A (en) 1995-06-06 1999-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acids encoding the hypoxia inducible factor-1
US5695977A (en) * 1995-08-31 1997-12-09 Genetic Information Research Institute Site directed recombination
AUPN903196A0 (en) * 1996-03-29 1996-04-26 Australian National University, The Single-step excision means
US6020144A (en) * 1996-09-12 2000-02-01 Symbiontics, Inc. Sustained delivery device comprising a Leishmania protozoa and methods of making and using the same

Also Published As

Publication number Publication date
DE59813413D1 (de) 2006-04-27
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