KR100367062B1 - 내인성유전자활성화를위한세포의최적화방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포내에서 유전자 발현을 최적화하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 첫 번째 관점은 동종 재조합(homologous recombination)에 의해 세포의 게놈 내부로 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자를 주입시킴으로써 진핵 세포내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 발현을 변경시키기 위한 방법에 관한 것이며, 또한 다른 비정형 발현 제어 서열 또는/ 및 증폭 유전자에 의해 부위 특이적 재조합효소(site-specific recombinase) 및 그 대체물에 의해 매개된 삽입된 이질 DNA의 절제에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 변경시키기 위해 하나 또는 일부의 핵산 서열을 동종 재조합에 의해 진핵 세포의 게놈내부의 하이폭시아(hypoxia) 유도 인자(HIF) 등의 활성체 단백질 또는 활성체 단백질 복합물에 도입하는 것이다. 더욱이 본 발명은 리포터 유전자의 발현을 측정함으로써 표적 유전자의 발현에 대한 5' 또는 3'상에 비코드 핵산 단편의 영향을 시험하기 위한 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 재조합효소 표적 서열 내부로 삽입된 핵산 서열의 발현 및 재조합 표적 서열을 포함하는 DHFR-음성 진핵 세포를 제공하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

내인성 유전자의 활성화를 위한 세포의 최적화 방법
본 발명은 세포내에서 유전자 발현을 최적화하기 위한 방법에 관한 것이다.본 발명의 첫 번째 관점은 이종 발현 조절 서열 및/또는 증폭 유전자를 상동 재조합에 의해 세포의 게놈내로 도입시킴으로써 진핵세포내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 발현을 변화시키는 방법 및 부위 특이적 재조합효소에 의해 매개되는 삽입된 외래 DNA의 절단 및 다른 이종 발현 조절 서열 및/또는 증폭 유전자에 의한 이의 치환에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 촉진자 단백질 또는 촉진자 단백질 복합체, 예를 들어 하이폭시아(hypoxia) 유도 인자(HIF)와 결합하는 하나 또는 수개의 핵산 서열을 상동 재조합에 의해 진핵세포의 게놈내로 도입시켜 표적 유전자의 발현을 변경시키는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리포터 유전자의 발현을 측정함으로써 5' 또는 3'상의 비코딩 핵산 단편이 표적 유전자 발현에 미치는 영향을 시험하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합효소 표적 서열내에 삽입된 핵산 서열의 발현 뿐만 아니라 재조합효소 표적 서열을 함유하는 DHFR 음성 진핵 세포를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
세포내 유전자 발현은 예컨대, 소위 하우스키핑(house keeping) 유전자 내에서 구조적으로 발생되거나 조절될 수 있다. 조절 발현은 세포의 특정 발달 단계 또는 환경조건에서 변화가 있는 경우에만 발현되어야하는 유전자에 대해 특히 필요하다.
발현은 핵산 서열과 작동적으로 연결된 프로모터에 의해 전사 단계에서 조절되며, 그 활성은 억제자(repressor) 및 촉진자(activator)에 의해 조절될 수 있다. 유전자의 비코딩 핵산 서열에 대한 억제자 또는 촉진자의 결합은 프로모터의 활성을 감소시키거나 증가시킬 수 있다(참조: L. Stryer, Biochemie, Chapter 12, "Spektrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft", Heidelberg, 1990). 세포 내에 함유되어 있는 억제자 및 촉진자의 양은, 예컨대 환경 조건과 같은 요인에 의해 조절된다. 하이폭시아(hypoxia) 유도 인자(HIF)는 감소된 O2공급에 의해 유도되는 촉진자의 한 예이며, 이는 에리스로포이에틴(erythropoietin) 유전자 발현의 증가를 초래한다(Blanchard K.L. et al., Hypoxic induction of the human erythropoietin gene: Cooperation between the promoter and enhancer, each of which contains steroid receptor response elements, (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 5373-5385; Wang G.L. and Semenza G.L., Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia, (1993), J. Biol. Chem., 268, 21513-21518; Wang G.L. et al., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PA heterodimer regulated by cellular O2tension, (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514).
또한, 발현된 단백질의 양은 mRNA의 안정성에 의존한다. mRNA 분해효소에 대한 인식 서열은 mRNA의 안정성에 영향을 끼치며 따라서 발현 수준에 영향을 끼치 는 mRNA의 3' 영역에 위치되어 있다[참조: Shaw G. and Kamen, R, A Conserved AU Sequence from the 3' Untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation, Cell(1986), 659-667]. 이와 관련하여, mRNA의 반감기는 발현된 단백질의 양과 관련있다. 발현 조절의 제 3 순위는 번역이다.
따라서, 유전자의 발현은 각각의 경우에 있어서 크게 다를 수 있는 복합 조절 메카니즘에 따른다.
단백질은 발현조절에 관한 지식을 이용하는 재조합 DNA 기술의 협조로 수득될 수 있다(참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). 이를 위해 상응하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터가 사용된다. 상기 벡터는 단백질을 발현하고, 벡터를 복제하는데 필수적인 부가의 서열 및 적절한 프로모터의 조절하에서 사용된다. 그런 다음, 벡터는 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입되고, 세포가 배양되며 재조합 단백질이 세포 또는 배양 배지로부터 단리될 수 있다.
원핵 세포 또는 진핵 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 원핵 세포, 특히 대장균 세포는 취급에는 문제가 없으나, 진핵 세포 단백질이 재조합적으로 발현되는 경우에 다수의 단점을 갖는다.
원핵 세포 및 진핵 세포는 발현 진행 경로, 세포 배지 조건 뿐만 아니라 단백질 프로세싱과 관련된 샤페론(chaperones)에 있어서 상이하다. 따라서, 원핵 세포 내에서 생성된 진핵 세포 단백질은 상응하는 네이티브(native) 단백질과는 결정적으로 다르다.
예를 들어, 단백질 폴딩 패턴 및 단백질의 활성이 변경될 수 있다. 또한, 원핵 숙주 세포 내의 단백질은 대개 글리코실화되지 않는다. 그러나, 정확한 글리코실화 패턴은 많은 경우에 있어서, 예를 들어 약제학적 제형을 위한 단백질의 생성에서 효과 및 내성에 대한 중요한 특징이다.
글리코실화된 단백질은 진핵 숙주 세포 또는 세포주, 예를 들어 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에 의해 생성된다. 진핵 세포의 사용에도 불구하고 재조합적으로 제조된 단백질에서의 변화가, 예를 들어 비인간 세포내에서 인간 단백질을 발현시키는 경우, 종(species)의 차이에 의해 발생할 수 있으며, 이것이 상기 방법이 다수의 적용례에서 부적절한 이유이다.
단백질의 재조합 생성을 위해, 숙주 세포는 발현 벡터로 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션되며, 안정적으로 트랜스펙션된 세포는 특히 대규모의 생성 공정에 사용된다.
숙주 세포 게놈내로의 발현 벡터 서열의 비특이적인 임의적 혼입은 낮은 제조 용량을 갖는 세포 또는 세포의 불안정성을 초래할 수 있다. 예를 들어, 산출량이 생성 공정중에 감소될 수 있거나 재조합 단백질을 발현시키기 위한 세포의 능력이 완전히 상실될 수 있다.
유전자 발현을 증가시키기 위한 방법은 유전자의 증폭이며, 여기서 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 증폭 유전자와 결합된다. 두 서열 모두의 증배는 증가된 발현을 초래하는 선택 단계에 의해 달성된다[참조: Schimke, R.T (Ed.) (1982), Geneamplification, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY].
예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코딩하는 핵산은 증폭 유전자로서 사용될 수 있다[참조: Kaufmann R.T., Sharp R.A. (1982), Amplication and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary DNA gene, J. Mol. Biol. 159: 601 ff].
메토트렉세이트로 수행되는 선택 단계는 메토트렉세이트에 대해 내성이며, 게놈 내에 DHFR을 코딩하는 핵산 서열 및 20 내지 50 배 증폭되어 결합된 핵산 서열을 함유하는 세포가 수득될 수 있도록 해준다[참조: R. Knippers, 1982, "Molekulare Genetik", Thieme, Stuttgart].
상기 유전자 증폭 방법은 DHFR 음성 세포를 사용하여 가장 효과적으로 수행된다. JP-62265992에 사람 DHFR 음성 세포가 기재되어 있다. 그러나, 여기에는 세포내에서 상동 재조합 및 이러한 서열의 증폭에 의한 발현 벡터의 부위 특이적 혼입에 대해서는 언급되어있지 않다.
유전자 증폭 방법을 수행하는 경우에도, 세포의 불안정성과 같은 전술한 단점이 세포의 게놈 내부로의 발현 벡터의 임의적 혼입으로 인해 발생할 수 있다.
외래 DNA가 내인성 유전자 활성을 초래하는 상동 재조합에 의해 선택된 유전자좌에 부위 특이적으로 혼입될 때만이 전술한 단점을 방지할 수 있다. 상응하는 방법이 공지되어 있으며 유전자 표적화라 불린다(WO 90/11354: WO 91/09955). 상기 방법에서, 세포는 세포의 게놈 내로 벡터를 혼입시키기 위한 유전자좌와 상동인 핵산 서열에 의해 플랭킹된 양성 선별 마커 유전자를 함유하는 벡터로 트랜스펙션된다. 상동의 핵산 서열 사이에, 세포내에 표적 유전자의 발현을 증가시키기 위한 이종 발현 조절 서열이 부가적으로 존재하며, 표적 유전자의 카피(copy) 수를 증가시키기 위한 증폭 유전자가 임의적으로 존재한다.
이미 알려진 유전자 표적화 방법의 단점은, 목적하는 단백질을 상업적인 목적에 적합한 양과 질로 제조하는 것을 가능하게 하는 특성을 갖는 세포를 제조하는데 종종 많은 어려움이 요구된다는 것이다. 특히, 목적하는 표적 단백질의 발현을 위한 최적의 발현 조절 서열 및/또는 증폭 유전자의 선택은 종종 다수의 일련의 상동 재조합 실험이 요구되며, 상기 실험은 목적하는 재조합 사건이 발생하는 클론을단리하기 위한 복잡한 과정으로 인해 극히 시간 소모적이다.
또한 상동 재조합은 세포 내에 특정 유전자의 발현을 제지하여 단백질 기능연구를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 이를 위해, 녹아웃(knockout) 마우스가 제조되는데, 여기서 조사될 단백질을 코딩하는 유전자는 배아 간세포(embryonic stem cell)내에서 상동 재조합에 의해 차단된다. 부가의 과정 단계를 수행한 후에, 이러한 유전자의 대립형질 둘 모두의 불활성화로 인해 발생의 초기부터 기능성 단백질을 발현시킬 수 없는 마우스가 얻어진다[참조: Thomas, K.R., Capecchi M.R., (1987), Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells, Cell 51: 503-512].
Cre-Lox 시스템은 특정 유전자를 조직 특이적이며, 시간 특이적으로 차단하고 이를 검사하는데 사용될 수 있다. 상기 목적을 위해, 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된 핵산 단편이 상동 재조합에 의해 세포의 게놈 내부로 도입되며, 연속적으로 세포 내에서 발현된 Cre 재조합효소에 의해 게놈으로부터 다시 절단될 수 있다[참조: Sauer B, Henderson N (1989): Site-specific DNA recombination at loxP sites placed into the genome of mammalian cells. Nuc Acid Res 17:147-161; Sauer B., Henderson N, (1990), Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase, New Biol. 5:441-449]. 종래 기술은 내인성 유전자 발현을 변경시키기 위해, 진핵 세포의 게놈 내부로 증폭 유전자 또는 발현 조절 서열의 부위 특이적 혼입을 위한 Cre-lox 시스템 또는 다른 부위 특이적 재조합효소 시스템의 사용에 대해서는 언급하고 있지 않다.
본 발명의 목적은 상동 재조합에 의한 내인성 유전자 활성을 최적화하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것으로서, 이는 종래 기술의 단점을 적어도 부분적으로 제거한 것이다.
본 발명의 목적은 진핵 세포 내에 유전자의 발현 수율의 최적화를 상당히 단순화시키는 새로운 방법 및 벡터 작제물 제공함으로써 달성된다.
도 1
(A)는 제 1 벡터로 사용되는 상동 재조합용 벡터를 도시한 것이다. 여기서, HR: 상동 서열, Seq 1: 제 1 이종 발현 조절 서열, R1: 양성 선별 마커 유전자, loxP: 배향성을 갖는 loxP 서열이고,
(B)는 (a) 상동 재조합이 완료된 후, (b) Cre 재조합효소에 의해 촉매된 loxP 서열에 의해 플랭킹된 서열의 절단후의 게놈 서열을 도시한 것이고,
(C)는 loxP 서열 사이에 배열된 서열을 함유하는 Cre 재조합효소 매개 혼입용 벡터를 도시한 것이다. (c)는 loxP 서열에서 제 2 벡터의 혼입 후의 게놈 서열을 도시한 것이다(R2: R1 과는 선택적으로 상이한 양성 선별 마커 유전자, Seq 2: 제 2 이종 발현 조절 서열).
도 2
(A)는 상동 재조합용 벡터를 도시한 것이다. 여기서, HR: 상동 서열, R-박스: 양성 및 선택적으로 음성 선별 마커 유전자, loxP: 배향성을 갖는 loxP 서열, HSV-tk: 단순포진바이러스 티미딘 키나제이고;
(B)는 한 측면이 상동 서열인 상동 재조합용 벡터를 도시한 것이다.
도 3
벡터 pHYG, pHIF-1α및 pARNT(pHIF-1β)로 트랜스펙션된 HeLa S3 세포의 CMV 프로모터/HIF 조절된 에리스로포이에틴(EPO) 발현을 도시한 것이며, EPO 발현은 트랜스펙션후 3, 4 및 5 일째의 세포 상층액(3,4,5)에서 측정되었다(에리스로포이에틴 농도(㎍/ml)).
pHYG: 조절 벡터, pHIF-1α: SRα프로모터의 조절을 받는 HIF-1α cDNA, pARNT: CMV 프로모터 조절을 받는 HIF-β cDNA .
도 4
CMV 프로모터(C) 및 리포터 유전자 β-갈락토시다아제(B)를 각각 함유하는 4개의 상이한 벡터들을 도시한 것이며, 상이한 길이의 표적 유전자(S)의 비코딩 핵산 단편이 이들 서열 사이에 삽입된다. 비코딩 핵산 단편의 길이는 벡터 A3-178에서 0kb, 벡터 A3-177에서 2.5 kb, 벡터 A3-175에서 3.7 kb 및 벡터 A3-181에서 5.7kb 이다. 조절 벡터 pNASSβ는 CMV 프로모터 없이 리포터 유전자 β-갈락토시다아제를 함유한다.
도 5
도 4의 벡터를 일련의 희석(1:2 내지 1:128)하에서 사용하여 HeLa S3 세포를 트랜스펙션한 후, 리포터 유전자 β-갈락토시다아제의 발현을 측정한 것을 을 도시한 것이다.
도 6
(A)는 DHFR 유전자좌에서 상동 재조합을 위한 벡터 pNDI를 도시한 것이다. 양성 선별 마커 유전자(Neo)가 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된다. DHFR유전자(5',3' DHFR 영역)와 상동인 서열이 loxP 서열의 5' 측면 및 다른 loxP 서열의 3'측면 상에 위치된다.
(B)는 DHFR 유전자좌에서 상동 재조합을 위한 벡터 pHDI를 도시한 것이다. 양성 선별 마커 유전자(Hyg)가 두 개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된다. DHFR 유전자(5',3' DHFR 영역)에 상동인 서열이 loxP 서열의 5' 측면 및 다른 loxP 서열의 3'측면 상에 위치된다.
도 7
(A)는 엑손 1, 엑손 2 및 엑손 3 뿐만 아니라 이들 사이에 위치된 인트론을 갖는 DHFR 유전자의 게놈 구성을 도시한 것이다.
(B) 도 6의 벡터에 상응하는 표적 작제물의 개략도를 도시한 것이다.
(C) DHFR 유전자내에 상동 재조합용 벡터의 상동 재조합이 완료된 이후의 게놈 구조를 도시한 것이다. EcoRI 절단 부위 사이의 거리는 벡터 pNDI를 사용하는 경우에 2.9 kb이며 벡터 pHDI를 사용하는 경우에는 3.7 kb 이다. Neo: 네오마이신, Hyg: 히그로마이신, kb: 킬로염기.
도 8
단백질 X를 코딩하는 핵산 서열 및 DHFR 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하고, 각각의 서열이 조절서열을 포함하며, 2개의 loxP 서열에 의해 플랭킹된 벡터를 도시한 것이다. 상기 벡터는 loxP 서열내의 게놈 내부로 Cre 재조합효소 촉매된 혼입을 위해 사용될 수 있다.
서열 번호 1은 제 1 HIF-결합 누클레오티드 서열을 도시한 것이다.
서열 번호 2는 제 2 HIF-결합 누클레오티드 서열을 도시한 것이다.
서열 번호 3은 loxP 서열을 도시한 것이다.
본 발명의 첫 번째 관점은, 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 방법에 있어서,
(1) 세포가,
(i) 제 1 이종 발현 조절 서열 및 제 1 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
(ii) 양성 선별 마커 유전자,
(iii) 서열(i) 및 (ii)를 플랭킹 하는 부위 특이적 재조합효소에 대한 두 개이상의 표적 서열, 및
(iv) 서열 (i), (ii) 및 (iii)을 플랭킹 하고, 세포의 게놈 내의 핵산 절편과 상동으로서 그 결과 상동 재조합을 허용하는 DNA 서열을 포함하는 제 1의 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건에서 배양되는 단계, 및
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
세포가 이종 발현 조절 서열 및 증폭 유전자와 작동적으로 연결된 내인성 유전자를 갖는 본 발명에 따른 방법에 의해 제공되며, 이러한 서열은 예를 들어 Cre 재조합효소와 같은 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 서열에 의해 플랭킹된다. 이러한 세포는 표적 유전자 발현의 최적화에 대한 조사에 적합한데, 이는 부위 특이적 재조합효소에 대한 표적 서열의 존재가 제 1 이종 발현 조절 서열 및/또는 제 1 증폭 유전자를 제 2 이종 발현 조절 서열 및/또는 제 2 증폭 유전자로 간단히 치환시키는 것을 가능하게 하기 때문이다.
본 발명에서 "부위-특이적 재조합효소"는, 인테그라제(integrase) 또는 리솔바제 인버타제(resolvase invertase) 계열인 부위 특이적 재조합효소를 포함하는 특이적 DNA 표적 서열상에 DNA의 재배열(Stark et al., Trends Genet. 8 (1992),432-439; Abremski and Hoess, Protein Engineering 5 (1992), 87-91; Khan et al., Nucleic Acids Res. 19(1991), 851-860) 및 인트론으로 코팅된 엔도누클레아제에 의해 매개된 부위 특이적 재조합(Perrin et al., EMBO J. 12(1993), 2939-2947)을 매개하는 단백질 및 단백질 복합체를 포함한다. 바람직한 재조합효소 단백질은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 2μ의 에피좀의 FLP 재조합효소 (Falco et al. Cell 29(1982), 573-584; Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983) 4223-4227; Konsolaki et al., New Biologist 4(1992), 551-557), 대장균 파아지 P1의 Cre 재조합효소(Sauer and Henderson(1989) supra), 지고사카로마이세스 루시(Zygosaccharomyces rouxii) 플라스미드 pSR1으로부터의 R 재조합효소(Matsuzaki et al., J. Bacteriol. 172(1990), 610-618), 클루이베로마이세스 드로소필라리움(Kluyveromyces drosophilarium) 플라스미드 pKD1로부터의 재조합효소(Chen et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 4471-4481),클루이베로마이세스 왈티이(Kluyveromyces waltii) 플라스미드 pKW1로부터의 A 재조합효소(Chen et al., J. Gen. Microbiol. 138(1992), 337-345), λ-int 재조합 시스템의 성분(Landy, Annu Rev. Biochem. 5(1989), 913-949), 및 파아지 μ의 gin 재조합 시스템의 성분(Klippel et al., EMBO J. 12(1993), 1047-1057)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또한, 유럽 특허 EP-B-0 707 599 에 기술된 것으로서, 부위 특이적 재조합효소 및 핵 수용체 또는 상기의 리간드 결합 도메인으로 구성된 융합 단백질이 또한 적합하다. Cre 재조합효소의 표적 서열, 즉 loxP 서열은 본 발명에 따른 방법에 특히 바람직하게 사용된다.
이종 유전자의 부위 비특이적 혼입에 의한 단백질의 재조합체의 제조 및 그와 관련되는 단점과는 대조적으로, 본 발명에 따른 방법은 상동 재조합에 의한 부위-특이적 내인성 유전자 활성화의 잇점을 이용한다.
이종 발현 조절 서열 및 증폭 유전자의 적절한 조합체의 단순화된 선택은 구조 및 활성에 있어 천연 단백질에 실질적으로 상응하는 단백질의 제조를 가능하게 하는 안정한 특성을 갖는 최적화된 클론의 제조를 가능하게 한다.
이종 발현 조절 서열, 증폭 유전자, 양성 선별 마커 유전자 및 재조합 표적서열을 플랭킹하는 적절한 상동 서열의 선택은 바람직하게는 WO 90/11354 및 WO91/09955에 기술된 방법에 따라 수행된다.
또한, 상동 서열은, 예를 들어 점 돌연변이 또는 개별 아미노산 또는 전체 아미노산 절편의 삽입및/또는 결실과 같은 발현된 단백질 내에서 돌연변이를 가져오는 변형을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 단일 공정 단계내에 변화되어질 내인성 핵산서열의 발현 수준 뿐만 아니라, 동시에 내인성 핵산 서열의 코딩 영역내로 돌연변이를 도입하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 약제학적 적용을 위한 단백질의 제조에 특히 바람직하다. 이러한 단백질은 천연 단백질과 비교할 때, 단백질의 효능을 증가시키기 위한 돌연변이외에 다른 변형예는 없어야 한다.
본 발명에 따라 임의의 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포, 특히 바람직하게는 인간 세포를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 방법은, 예를 들어 섬유아 세포와 같은 비 불멸화된 세포 및 또한 예를 들어 종양 세포 주와 같은 불멸화된 세포로 수행될 수 있다. 불멸화된 세포가 바람직하다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 사용된 용액 및 배지는 각각의 방법 단계에서 최적의 조건이 되도록 바람직하게 선택된다. 세포는 성장에 필요한 모든 성분을 충분히 함유하는 배지에서 배양되며, 선택적으로 완충 처리된다. 혈청 부재(serum-free) 배지에서 배양될 수 있는 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 사용된 세포는, 특히 바람직하게는 나말와(Namalwa), HT 1080, 또는 HeLa S3 세포이다.
본 발명에 따른 방법은 최적의 발현 조절 서열, 최적의 증폭 유전자의 선택에 의해 및/또는 발현 조절 서열과 증폭 유전자의 최적의 조합체의 선택에 의해 세포내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열, 즉 표적 유전자의 발현의 최적화를 가능하게 한다.
임의의 핵산 서열이 세포의 게놈에 혼입된 후, 표적 유전자의 발현에 영향을미치는 이종 발현 조절 서열로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 전사 개시 인자 또는 RNA 중합효소와 같은 전사 성분과 직접적으로 상호작용할 수 있는 핵산 서열 및 전사에 대한 그의 영향이 촉진자(activator) 또는 억제자(repressor)와 상호작용에 의해 매개되는 핵산 서열을 포함한다. 이종 발현 조절 서열은 바람직하게는 프로모터/인핸서(promotor/enhancer)를 포함하며, 특히 바람직하게는 바이러스성 프로모터 및 가장 바람직하게는 CMV 프로모터를 포함한다.
이종 발현 조절 서열은 3' 비코딩 서열을 또한 포함할 수 있다. 3' 비코딩 서열은 mRNA에 대해 안정화 또는 탈안정화 효과를 가지며, 따라서 그의 반감기를증가시키거나 감소시킬 수 있다. mRNA를 안정화시키는 서열의 도입은 mRNA의 반감기를 증가시킬 수 있으며, 따라서 엔코딩된 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다.
바람직한 실시예에서, 표적 유전자의 내인성 발현 조절 서열은 상동 재조합에 의해 제거된다. 이는 내인성 서열이 리프레서 결합 서열을 함유하고 있을 경우에 특히 장점적이다. 발현이 mRNA에 대해 탈안정화 효과를 갖는 3' 비코딩 서열에 의해 감소될 수 있으며, 이는 번역되는 단백질의 양의 감소를 초래한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 최적의 증폭 유전자의 선택을 허용한다. 이러한 증폭 유전자는 바람직하게는 발현할 수 있는 형태, 즉 적절한 프로모터와 작동적으로 연결되어 사용되며, 그 결과 벡터가 진핵 세포의 게놈 내로 상동 혼입된 후에 표적 유전자의 부근에 위치되도록 벡터 내에 배열된다. 증폭 단계의 수행은 세포 내의 표적 유전자의 카피 수를 증가시킨다. 이는 내인성 핵산 서열 발현의 추가적인 증가를 초래한다. 적절한 증폭 유전자의 예로는 디히드로폴레이트 환원 효소(DHFR), 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase), 오르니틴 디카르복실라제또는 이들 유전자의 뮤테인(mutein)이다. 증폭 유전자는, 특히 내인성 DHFR 유전자를 함유하고 있는 세포 내에서, 바람직하게는 DHFR 유전자 또는 상기 유전자의 돌연변이된 형태(Simonsen et al., Nucleic Acids Res. 핵산 1988, 16(5) :2235-2246) 이다.
예를 들어, 항생제 내성과 같은 선택가능한 표현형을 유도하는 진핵 세포의 임의의 적절한 내성 유전자가 양성 선별 마커로서 사용될 수 있다. 양성 선별 마커 유전자는 바람직하게 네오마이신, 카나마이신, 제네티신 또는 히그로마이신 내성유전자이다. 양성 선별 마커 유전자는 바람직하게는 발현가능한 형태, 즉 적절한 프로모터와 작동적으로 연결되어 사용된다.
음성의 선별 마커 유전자가 사용되는 경우에, 제 2 음성 선택 단계가 통상적으로 양성 선별 단계에 추가로 수행된다. 상기의 잇점은 선별 단계 수행후, 확인된 클론이 낮은 분율의 착오 양성 클론, 즉 게놈 내에 임의로 혼입된 벡터를 함유한다는 것이다. 음성 선별 마커 유전자는 바람직하게는 티미딘 키나제 유전자(TK) 및/또는 히포잔틴-구아닌-포스포리보실(hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl) 트랜스퍼라제 유전자(HGPRT) 이다.
부위 특이적 재조합효소의 표적 서열의 존재로 인해, 부위 특이적 재조합효소를 사용하여 세포의 게놈으로부터 이들 서열 사이에 위치하는 핵산 서열의 절단이 가능하다. 표적 서열 사이에 위치된 핵산 서열은 바람직하게는 세포 내의 상응하는 재조합효소의 일시적인 활성화에 의해 게놈으로부터 절단된다.
재조합효소의 일시적인 활성화는, 예를 들어 (1) 세포 내에서 활성이거나 활성화될 수 있는 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 재조합효소를 코딩하는 핵산서열을 함유하는 제 2의 벡터로 세포를 트랜스펙션 시키는 단계, (2) 재조합효소가 발현되고 활성화되는 조건에서 상기 방법으로 트랜스펙션시킨 세포를 배양시키는 단계, 및 (3) 세포를 선택적으로 단리시키는 단계에 의해 수행될 수 있다.
재조합효소/핵 수용체 융합 단백질이 사용되는 경우에, 세포의 일시적인 활성화는 또한 핵 수용체용 리간드의 조절된 부가에 의해 수행될 수 있다.
표적 서열 사이에 위치된 DNA를 제거한 후에, 예를 들어 loxP 서열과 같은잔존 표적 서열이 부가적인 방법 단계를 위해 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 방법은
(1) 세포가 (i) 제 2 이종 발현 조절 서열 및 제 2의 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열, (ii) 바람직하게는 제 1 벡터의 양성 선별 마커 유전자와 상이한 양성 선별 마커 유전자, 및 (iii) 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 두 개 이상의 표적 서열을 포함하는 제 3 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가, 표적 서열에 의해 플랭킹된 서열이 세포의 게놈 내의 표적 서열 내로 혼입되는 조건하에서 배양되는 단계,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계, 및
(4) 선택적으로, 단계 (1) 내지 (3)이 각각의 경우마다 다른 발현 조절 서열및/또는 증폭 유전자로 1회 이상 반복되는 단계를 특징으로 한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 다수의 발현 조절 서열, 증폭 유전자 또는 발현 조절 서열과 증폭 유전자의 조합체가 간단하고 신속하게 시험되도록 한다. 따라서, 각각의 개별 표적 유전자에 대한 최적의 발현/증폭 시스템을 결정하기 위해 각각의 개별 증폭 유전자 및 각각의 이종 발현 조절 서열에 대한 시간 소모적이 고, 고비용의 부위 특이적 혼입을 수행하는 것이 필요하지 않다.
제 3 벡터 내의 양성 선별 마커 유전자는 제 1 벡터의 마커 유전자와는 다르며, 그 결과 착오 양성 클론의 수를 최소화하고 선택 공정을 간소화할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 벡터 내의 재조합효소 표적 서열은 천연 발생 표적서열에 상응하거나, 선택적으로, 부위 특이적 재조합효소의 효과를 손상시키지 않는 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 추가 목적은 특히 재조합효소 표적 서열을 세포의 게놈 내에 부위특이적으로 도입시키기 위한, 상동 재조합용 벡터에 관한 것으로서,
(1) 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
(2) 양성 선별 마커 유전자,
(3) 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 부위 특이적 재조합효소에 대한 두 개 이상의 표적 서열,
(4) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열 (1), (2) 및 (3)을 플랭킹 하는 DNA 서열 및
(5) 선택적으로, 음성 선별 마커 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 모든 벡터는, 바람직하게는 복제 원점, 선별 마커 유전자 등과 같은 적합한 숙주 세포내에서의 번식 및 증식에 필요한 서열 엘리먼트를 포함한다.
본 발명의 추가의 대상물은 특히
(1) 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
(2) 양성 선별 마커 유전자 및
(3) 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 두 개 이상의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 부위 특이적 재조합효소 시스템에 의해 세포 게놈으로 DNA를 도입시키기 위한 벡터이다.
또한, 본 발명의 추가의 대상물은 진핵 세포, 바람직하게는 상기한 방법에의해 수득할 수 있는 인간의 세포이다. 예컨대 인간 세포와 같은 상기 세포는,
(1) 내생적으로 존재하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 이종 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된, 염색체에 위치한 서열을 하나 이상 함유하고,
(2) 상기 서열이 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 관점은 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변화시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
(1) 세포가
(i) 하이폭시아 유도 인자(HIF)등의 촉진자 단백질에 결합하는 하나 이상의 핵산 서열,
(ii) 양성 선별 마커 유전자 및
(iii) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열(i) 및 (ii)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되는 단계,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
놀랍게도, 표적 유전자의 발현 조절 서열의 영역, 특히 그의 조절 영역(regulatory region)에서 하나 또는 수개의 촉진자 단백질(핵산 서열에 결합하여 유전자 발현을 증가시키는 단백질)에 결합하는 핵산 서열의 게놈 혼입이 표적 유전자의 발현을 감소시킨 것이 아니라, 그와는 반대로 적절한 배양 조건을 선택함으로써 내생적인 표적 유전자의 발현을 증가시키거나, 비-발현된 내생의 표적 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
적절한 촉진자 단백질의 실시예는 하이폭시아-유도 인자 HIF-1α 와 HIF-1β 및 인터페론 조절 요소1(IRF-1) 이다. 상기 인터페론 조절 요소 1(IRF-1)은 인터페론 컨센서스 서열(ICE)과 결합하여 전사를 증가시킬 수 있다(참조: Tanaka N., Kawakami T., Taniguchi T., Mol. Cell. Biol.(1993), Aug; 13(8):4531 - 4538).
내생적으로 존재하는 표적 유전자와 HIF 또는 다른 촉진자 단백질에 결합하는 하나 또는 수개의 핵산 서열을 작동적으로 연결한 후에, 표적 유전자의 발현은 적절한 배양 조건을 선택함으로써 조절될 수 있다. 이러한 방법의 잇점은 특히 상업적 규모의 생산에서, 단백질의 발현이 제조 공정동안 최적의 시간에서 유도될 수 있다는 점이다. 이것이 유익한 것은 배양 배지 상층액에서의 합성물의 평균 잔류시간이 감소되기 때문이다. 이는 또한 바람직하지 못한 단백질 변성물을 감소시킨다. 이는 연속적인 정제 단계에 적용할 수 있으며, 제조 비용을 감소시키고, 최종 제품 질적인 개선을 유도한다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 하나 또는 수개의 촉진자 결합 핵산을 표적 유전자와 작동적으로 결합시키는 것으로 충분하다. 바람직하게는, 두 개의 HIF 결합 핵산 서열이 사용된다. HIF 결합 핵산 서열은 특히 바람직하게는 서열 번호 1에 따른 53 bp 서열, 서열 번호 2에 따른 43 bp 서열, 상기 서열과 상동인 서열 또는 엄격한 조건에서 상기 서열을 혼성화하는 서열로부터 선택된다.
두 개의 HIF 결합 핵산 서열의 사용은 놀랍게도 시너지(synergy) 효과를 유도한다. 이는 내생의 핵산의 발현에 있어서 각각의 서열이 단독으로 사용될 경우 보다 훨씬 더 큰 증가를 유도한다.
필요하다면, 표적 유전자의 영역에 도입된 촉진자 서열에 결합하는 촉진자 단백질의 발현이 세포 내에서 유도 및/또는 증가될 수 있다. 이는 예를 들어, 하기를 포함하는 벡터로 세포를 트랜스펙션시키는 것에 의해 달성될 수 있다. (1) 세포 내에 활성 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 촉진자 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 (2) 선택적으로 양성 선별 마커 유전자를 갖는 벡터.
촉진자 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열이 사용될 수 있으며, 그의 발현생성물은 게놈 내로 혼입된 촉진자 결합 핵산 서열과 결합할 수 있다. 이러한 촉진자 단백질은 바람직하게는 HIF-1α 및/또는 HIF-1β 단백질이다. 이미 내생적으로 존재하는 핵산 서열이, 촉진자 결합 핵산 서열 또는 바람직하게는 HIF 단백질을 코딩하는 핵산 서열로서, 세포내의 활성 발현 조절 서열 및 선택적으로 양성 선별 마커 유전자와 작동적으로 연결된 핵산 서열을 함유하는 세포에 벡터를 단순히 도입하는 것으로 충분하다.
촉진자 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 발현 조절 서열이유도 가능하며, 이는 예를 들어 호르몬 또는 중금속을 부가하는 것과 같이 적절한 배양 조건에 의한 활성화를 위해 부가의 방법을 제공한다. 이는 내생 표적 유전자의 발현이 제조 공정중에 최적의 시간에서 유도될 수 있도록 한다.
구조적으로 활성인 발현 조절 서열을 사용하는 잇점은 촉진자 단백질이 배양배지내로의 촉진자의 부가에 구조적으로 독립적으로 발현된다는 것이다.
촉진자 단백질-결합 핵산 서열이 HIF 결합 핵산 서열이라면, 표적 유전자의 발현은, 예를 들어 0.1 내지 2 %의 O2농도와 같은 적합한 배양 조건에 의해 유도될 수 있다.
본 발명의 추가의 대상물은 상동 재조합을 위한 벡터로서,
(1) 촉진자 단백질과 결합하는 하나 이상의 핵산 서열,
(2) 양성 선별 마커 유전자, 및
(3) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 대상물은 진핵 세포로서, 바람직하게 인간 세포이며 전술한 방법중의 어느 하나에 의해 수득될 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 염색체에 위치된 하나 이상의 이종 촉진자 단백질/복합체 결합 핵산 단편을 함유하는 것을 특징으로 하며, 핵산 단편은 세포 내에 내생적으로 존재하는 유전자와 작동적으로 결합한다. 촉진자 단백질 결합 핵산 단편은, 전술한 바과 같은 부위 특이적 재조합 시스템의 도움으로 게놈내에서 치환될 수 있으며, 이는 특정 표적 유전자에 대한 촉진자 서열의 간단한 확인을 가능하게 한다.
본 발명의 추가의 관점은 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 영역으로부터 비코딩 핵산 서열이 발현에 미치는 영향을 시험하기 위한 방법에관한 것으로서,
(1) 세포가
(i) 리포터 유전자와 작동적으로 연결된 세포 내에서 활성화되거나 활성화될 수 있는 이종 발현 조절 서열, 및
(ii) 표적 유전자의 영역으로부터 5' 측면 및 3' 측면 모두 또는 어느 한 측면의 비코딩 핵산 단편을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 세포가 발현 조절 서열이 활성인 조건에서 배양되는 단계, 및
(3) 리포터 유전자의 발현이 측정되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법을 사용하여, 이종 발현 조절 서열이 표적 유전자의 최적의 발현율을 달성하기 위해 게놈 내의 표적 유전자의 영역 내에 어떻게 위치되는가 및 표적 유전자의 영역으로부터 5' 및/또는 3' 비코딩 서열의 존재 및 부재가 발현에 어떤 영향을 미치는가를 간단히 결정할 수 있다. 바람직하게는 시험 벡터가 세포 내부에 일시적으로 트랜스펙션되며, 리포터 유전자의 발현이 측정된다. 이러한 방식으로, 이종 발현 조절 서열 및 표적 유전자 또는 다수의 다른 발현 조절 서열의 다양한 배열을 신속하고 경제적으로 시험하는 것이 가능하다. 이종 발현 조절 서열은 전사 개시 인자 또는 RNA 중합효소, 및 촉진자 또는 억제자와 상호작용에 의해 매개되는 핵산 서열과 같은 전사 성분과 직접 상호작용할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 이종 발현 조절 서열은 바람직하게는 프로모터/인핸서이며, 특히 바람직하게는 바이러스성 프로모터이고, 가장 바람직하게는 CMV 프로모터이다. 본 발명에 따른 방법은 복잡한 단계를 포함하는 방법에서, 특히 비용 절감을 가져온다.이는, 예를 들어 마우스, 양, 또는 소 등의 유전자 전이 동물의 제조에 있어서 그러하며, 이는 특정 세포 유형에서 특정 내인성 핵산 서열의 발현을 증가시키도록 의도된다.
표적 유전자 영역으로부터의 비코딩 핵산 단편 5' 또는 3'이 바람직하게는 리포터 유전자의 5'측면 또는 3' 측면 상의 유전자 배열에 따라 벡터 내에서 배열된다.
세포내에서 그의 발현이 검출될 수 있는, 당업자에게 공지된 임의의 리포터 유전자가 사용된다. 바람직하게는 클로로암페니콜-아세틸-트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(β- Gal) 또는 lacZ를 코딩하는 리포터 유전자가 사용된다. 한편, 예컨대, EPO 와 같은 목적하는 단백질을 코딩하는 리포터 유전자가 또한 사용될 수 있으며, 그의 발현은 예를들어 ELISA와 같은 면역학적 방법으로 검출될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 표적 유전자의 다른 5' 및/또는 3' 비코딩 핵산 단편을 함유하는 두 개 이상의 벡터가 각각 다른 세포로 트랜스펙션되며, 다른 세포 내에서의 리포터 유전자의 발현이 당업자에게 공지된 방법에 따라 검출된다. 특정 숙주 세포에 대해 최적의 발현의 결과가 되는 이종 발현 조절 서열의 배열이 본 발명에 따른 방법으로 쉽게 확인될 수 있다
본 발명의 추가의 관점은 포유류 세포, 특히 바람직하게는 인간 세포인 DHFR 음성 진핵 세포를 제공하는 방법에 관한 것으로서,
(1) 세포가
(i) 부위 특이적 재조합효소에 대한 하나 이상의 표적 서열,
(ii) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산 서열과 상동인 서열 (i)을 플랭킹하는 DNA 서열, 및
(iii) 선택적으로 양성 선별 마커 유전자 및 선택적으로 음성 선별 마커 유전자를 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건에서 배양되는 단계,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 재조합효소 표적 서열 및 상동 서열은 상기한 바와 같이 선택되며 사용된다.
양성 선별 마커 유전자가 존재하는 경우에, DHFR 유전자와 상동인 서열 사이에 배열되며, 음성 선별 마커 유전자가 존재하는 경우, 상동 서열의 외부에 배열된다.
상동 재조합이 DHFR 좌에서 발생한 후에, 비기능적인 DHFR 단백질이 세포에의해 합성될 수 있다. 이러한 경우에, 벡터의 서열이 DHFR 유전자 프로모터가 불활성화되거나 및/또는 기능성 DHFR 단백질이 더이상 합성되지 않는 결과로 배열되는데, 이는 DHFR 유전자의 코딩 서열 내에서의 삽입 또는 결실로 인해 더이상 합성되지 않도록 배열될 수 있다.
DHFR 유전자의 양 대립 형질을 불활성화시키기 위해, 먼저 세포가 본 발명에 따른 벡터로 트랜스펙션된 다음, 선택되고 단리된다. DHFR 유전자의 하나의 대립형질이 이러한 세포 내에서 불활성화된다. 즉, DHFR 유전자에 대한 이종접합체(heterozygous)이다(+/-). 다음, 이들 세포가 바람직하게는 제 1 벡터와는 다른 양성 선별 마커 유전자를 함유하는 본 발명에 따른 벡터로 다시 트랜스펙션된다. 선택 단계 후에 세포가 수득되고, 여기서 양 DHFR 대립 형질이 불활성화 된다. 대안적으로, 선택 압력의 증가는 유전자 전환 및 이에 따른 두 개의 유전자의 불활성화를 초래할 수 있다(참조: Mortensen et al., Mol.Cell. Biol. 12(1992), 2391-2395).
본 발명에 따른 방법은 DHFR 음성 세포를 제공하며, 상기 DHFR 음성 세포는 유전자 증폭 방법에서 DHFR 단백질을 합성하지 않는 장점을 갖는다. 선택 단계가 DHFR 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 결합된 이종 핵산 서열을 증폭시키기 위해 수행되는 경우, 내인성 DHFR 유전자의 발현물은 저해하는 영향을 갖지 않으며, 따라서 유전자 증폭의 효율이 증가된다.
선택가능한 표현형을 유도하는 임의의 적합한 선별 마커 유전자가 예를 들어 항생제 내성과 같은 양성 선별 마커 유전자로서 사용될 수 있다. 양성 선별 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 네오마이신(neomycin), 카나마이신(kanamycin), 제네티신(geneticin), 또는 히그로마이신(hygromycin) 내성 유전자이다.
당업자에 공지된 임의의 음성 선별 마커 유전자가 사용되며, 음성 선별 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열은 티미딘 키나제 유전자(thymidine kinase gene :TK)및/또는 하이포잔틴-구아닌-포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(HGPRT)이다.
재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되는 서열이 상응하는 재조합효소의 일시적인 활성화에 의해 세포의 게놈으로부터 절단되며, 이는 예를 들어,
(1) 세포 내에서 활성인 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 재조합효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터로 세포를 트랜스펙션시키는 단계,
(2) 재조합효소가 발현되고 활성화되는 조건에서 상기 방식 (1)로 트랜스펙션된 세포를 배양시키는 단계 및
(3) 선택적으로, 세포를 단리시키는 단계에 의한다.
본 발명에 따라 DHFR 유전자를 불활성화시킬 수 있으며, 재조합효소 매개 반응에 의해 세포의 게놈으로부터 도입된 선별 마커 유전자뿐 아니라 재조합효소 표적 유전자 서열 사이에 위치하는 DHFR 유전자 서열을 제거시킬 수 있다.
재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 서열이 양성 선별 마커 유전자를 함유하는 경우에, 상기 서열을 함유하는 세포는 항생제 내성이다. 따라서, 이는 본 발명의 당업자에 의해 공지된 방법에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 DHFR 음성 세포의 추가의 잇점은 그 특성이 당업자들에게 공지된 방법에 의해 특성화 될 수 있으며, 세포가 다른 방법을 위해 계속하여 사용될 수 있다. 더욱이, DHFR 유전자좌에서 도입된 재조합효소 표적 서열은 게놈 내부로 핵산 서열의 부위 특이적 혼입을 가능하게 한다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예는 진핵 세포 내부로 이종 DHFR 유전자를 도입시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기한 방법중 어느 하나에 의해 수득된 DHFR 음성세포가,
(1) (i) 선택적으로, 바람직하게는 제 1 벡터의 양성 선별 마커 유전자와는 다른 양성 선별 마커 유전자,
(ii) DHFR을 코딩하는 핵산 서열, 및
(iii) 발현형태의 단백질을 코딩하는 증폭되는 핵산서열을 포함하고, 부분서열 (i), (ii)및 (iii)로부터의 각 핵산서열이 하나 이상의 재조합효소 표적서열에 의해 5'및 3' 측면에 플랭킹되는 것을 포함하는 제 3벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가, 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 핵산서열이 세포 게놈 내에 이미 존재하는 재조합효소 표적 서열로 혼입되는 조건에서 배양되는 단계, 및
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
양성 선별 마커 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 DHFR 유전자 및 표적 유전자가 바람직하게는 각각 세포 내에서 활성화되거나 활성화될 수 있는 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된다. 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론(polycistronic) 구조가 원칙적으로 또한 가능하다. 그러나, 표적 유전자의 증폭되는 핵산 서열은 개별적인 프로모터에 의해 작동되어야 한다. 특히, 바람직한 발현 조절 서열은 바이러스성 프로모터/인핸서이다. CMV 프로모터는 단백질의 발현에 대해 가장 바람직하다.
본 발명에 따르는 경우에, 이종 서열을 부위 특이적 방식으로 세포의 게놈 내부로 혼입시킬 수 있으며, 따라서 게놈 서열을 지닌 이종 서열의 저해를 제거하는 장점이 있다. 따라서, 이는 예를 들어 불안정적인 제조 클론과 같은 상기에서 추가로 기술한 단점을 방지할 수 있다.
단백질을 코딩하는 이종 핵산 서열의 발현율을 증가시키기 위해, 공지된 방법으로 메토트랙세이트(methotrexate)를 사용하여 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 대상물은,
(1) 선택적으로 양성 선별 마커 유전자,
(2) DHFR을 코딩하는 핵산 서열, 및
(3) 목적하는 단백질을 코딩하는 발현 형태의 핵산 서열로서, 부분 서열 (1), (2), 및 (3)으로부터 각 핵산 서열이 하나 이상의 재조합효소 표적 서열에 의해 5' 측면 및 3' 측면에서 플랭킹된 핵산 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명의 추가의 대상물은,
(1) 선택적으로 양성 선별 마커 유전자,
(2) 각각의 경우에 서열 (1)을 플랭킹하는 하나 이상의 재조합효소 표적 유전자,
(3) 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산에 상동으로서 상동 재조을 허용하는, 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 DNA 서열, 및
(4) 선택적으로, 상동 서열 (3)의 외부 및 바람직하게는 3' 측면에 음성 선별 마커 유전자를 포함하는 상동 재조합용 벡터이다.
또한, 본 발명은 상기한 방법에 의해 얻어질 수 있는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포이다. 상기 세포는,
(1) DHFR을 코딩하는 하나 이상의 내인성 핵산 서열이 불활성화되고, 바람직하게는 두 개의 내인성 대립 형질 모두이며,
(2) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열이 DHFR을 코딩하는 핵산 서열의 영역내의 게놈 내에 혼입되는 것을 특징으로 한다.
최종적으로, 본 발명의 목적은 진핵 세포, 바람직하게 인간 세포로서, 이는
(1) DHFR을 코딩하는 핵산 서열,
(2) 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및
(3) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 내인성 DHFR 유전자좌의 영역내의 이종 핵산 서열을 특징으로 한다.
본 발명은 다음의 실시예, 도면, 및 서열에 의해 설명되어질 것이다.
실시예
실시예 1 CMV 프로모터의 조절하에서 에리트로포이에틴 유전자의 발현 및 HIF의 과잉발현
벡터 pHYG, PHIF-1α 및 pARNT를 유전공학에 의해 변경된 HeLa S3 세포 내부로 트랜스펙션 시켰다(도 3 참조). EPO 발현을 조절하는 CMV(사이토메가로바이러스) 프로모터를 EPO 대립형질의 에리트로포이에틴 유전자(EPO) 번역 개시점에 근접하도록 세포 내부로 도입시켰다. 107세포는 통상 24 시간동안 1㎍의 에리트로포이에틴을 제조한다. 세포는 트랜스펙션 시키기 전에 24 시간동안, 6개의 웰 플레이트당 6 ×104농도로 계대배양 하였다. 트랜스펙션 시키는 날에, 세포를 DNA-DOTAP 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 상기 혼합물은 각 벡터 1.25㎍와 10㎕ DOTAP(뵈링거 만하임 1202375)를 함유하도록하여, 웰당 20 mM의 Hepes 완충액내에 최종 부피를 75㎕로 하였다. 상기 혼합물을 실온에서 10 내지 15분동안 미리 배양했다. 세포를 웰당 3 ml 배지에서 DNA-DOTAP와 6시간동안 배양했다. 세포를 PBS 완충액으로 연속하여 2 회 세척하였으며, 5일동안 완전 배지에서 배양했다. 배양 후 3, 4 및 5일째되는 날에, 매번 100㎕의 상충액을 분리하여 에리트로포이에틴 ELISA로 분석했다. 5일째에 분석을 마치고 세포를 계수했다. 웰당 에리트로포이에틴의 양을 동일한 세포 계수와 관련하여 계산하였다(도 3 참조).
상기 실시예는, 비록 이종 발현 조절 서열(CMV 프로모터)이 에리트로포이에틴 유전자의 대립형질의 프로모터 영역으로 도입된다고 하더라도, HIF에 의한 에리트로포이에틴의 도입이 여전히 가능함을 보여 주었다. 측정된 에리트로포이에틴 농도의 증가치는 하이폭시아 유도 인자 또는 양쪽 대립 형질상의 하이폭시아 유도 인자의 시너지 효과를 지시했다.
따라서, 내인성 핵산 서열의 발현이 이종 발현 조절 서열을 도입함으로써 증가될 수 있음이 명백하였다. 촉진자(HIF)가 세포내에서 발현되고, 이를 위해 결합핵산 서열이 발현 조절 서열 내에 존재하는 경우에, 상기 유전자의 발현이 훨씬 더 증가될 수 있었다. 대응 서열이 상기 유전자좌내에 존재하지 않으면, 상기 대응 서열을 상동 재조합에 의해, 본 발명에 따른 방법으로 게놈에 특이적으로 도입시킬 수 있다.
실시예 2 내인성 핵산 서열의 발현을 증가시키기 위한 발현 조절 서열의 최적화된 배열
내인성 유전자의 5' 측면상의 서열은 발현을 자극하며 억제성질을 가졌다. 이종 발현 조절 서열이 표적 유전자의 5' 측면상의 게놈으로 도입되는 경우에, 발현 수준이 내인성 5' 서열에 의해 영향을 받았다. 이종 발현 조절 서열에 의한 표적 유전자의 최적의 발현을 달성하기 위해, 이종 발현 조절 서열의 활성이 표적 유전자의 5' 측면상의 비코딩 서열에 의해 감소되지 않도록 배열되어야 했다. 특이적인 배열은 각 서열 요소의 시너지 효과를 달성하는데 장점이 있었다. 이종 발현 조절 서열의 다양한 배열을 시험하기 위해, 즉 예를 들어 이종 발현 조절 서열이 표적 유전자의 코딩 서열의 번역 개시점으로부터 어느 정도 거리에서 세포내의 게놈으로 혼입되어야 하는 가를 결정하기 위해, 표적 유전자의 다른 5' 비코딩 핵산 단편을 지닌 다른 벡터를 시험했다(도 4 참조). 도 4에 기술한 벡터를 HeLa S3 세포에 트랜스펙션 시켰으며, 리포터 유전자 β-갈락토시다아제의 발현을 측정했다(도 5 참조) .
분석 24시간 전에, 세포를 10cm 페트리 디쉬당 1 ×106농도로 계대배양하였다. 트랜스펙션시키는 날에, 세포를 DNA-DOTAP 혼합물로 인큐베이션하였다. 상기 혼합물은 60㎕의 DOTAP(뵈링거 만하임 1202375)내에 각각의 벡터(A3-178, A3-177, A3-175, A3-181, 또는 pNASSβ, 도 4 참조) 1 pmol를 함유하도록 하였고, 20 mM HEPES 완충액으로 300 ㎕가 되도록 하였다. 상기 혼합물을 실온에서 10 내지 15분간 인큐베이션했다. 세포를 페트리 디쉬당 6 ml의 혈청 부재 배지에서 DNA-DOTAP와6시간동안 미리 인큐베이션했다. 다음, 세포를 PBS 완충액으로 2 회 세척하고, 22시간동안 완전 배지에서 배양하였다. β-갈락토시다아제의 발현을 측정하기 위해, 세포를 200㎕ PBS로부터 단리하고 -20'c에서 냉동 및 해동시켜 용균시켰다. 10㎕의 용균질을 기질(3.29 mM 클로로페놀 레드-β-D) 갈락토피라노시드(뵈링거 만하임 884308), 100 mM HEPES, 150 mM NACL, 2 mM MgCl2, 1% BSA, 0.1% Triton-X100, 1% 아지드화 나트륨, PH 7)을 사용하여 1:10으로 희석하였다. 샘플을 1:2 단계에서 회석시켰으며, 암적색이 형성될 때까지 96개의 웰 플레이트에서 37℃로 인큐베이션했다. 다음, 샘플을 570/580 nm, 또는 550 nm에서 측정했다.
도 5에 도시한 것과 같이, 리포터 유전자의 발현은 벡터 A3-178로 트랜스펙션시킨 세포에서 가장 높았다. 상기 벡터에서, 이종 발현 조절 서열이 코딩 서열의 번역 개시점과 근접하였다.
따라서, 본 방법은 내인성 표적 유전자의 최적의 발현을 얻기 위해, 숙주 세포의 게놈내에서 어떠한 이종 발현 조절 서열의 배열이 선택되어야 하는가를 간단하고 신속하게 선택하는데 사용될 수 있다.
실시예 3 DHFR 음성 세포의 제조
제 1단계에서, 본 발명에 따른 재조합용 벡터를 제조하였다. 제 2단계에서,상기 벡터를 인간 세포주로 트랜스펙션시키고 상동 재조합을 위해 스크리닝하였다.상기 방식으로, DHFR 유전자에 대해 제 1 및 제 2 대립형질을 불활성화시킬 수 있었다.
상동 재조합용 DHFR 벡터
인간 DHFR 유전자를 염색체 5상에 위치시켰으며, 이는 6개의 엑손 내에 배열된 30 kb를 포함하였다. 프로모터 부분, 엑손 2 부분 및 완전 엑손 1을 포함하는 1.8 kb EcoRI 부분은 상동 재조합용 벡터의 제조에 사용했다. 엑손 1을 AapI 로 분해시켜 제거하였고, 그 결과인 갭(0.45 kb)에 Neo(1.4 kb) 또는 Hyg(2.2 kb) 내성 유전자를 링커를 통해 삽입시켰다. 링커는 어댑터 누클레오티드외에 TAT TGAAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA (loxP 서열)을 포함했다. 링커 서열을 동일한 배향으로 배열시켰으며, 내성 유전자는 바람직하게는 DHFR 유전자에 대해 안티센스였다. 내성 유전자를 삽입시킨 후, 상동 영역을 확장시켰다. 이를 위해, 벡터를 EcoRI 단편으로 3' 영역(6.0 kb)으로부터 확장시켰다(도 6 참조). 상기 방식으로, 본 발명에 따른 표적 구성체 pNDI(11.5 kb) 및 pHDI(12.3kb)를 수득할 수 있었다.
상동 재조합의 종료후, 완전 엑손 1(아미노산 1-28) 및 DHFR 유전자의 프로모터로부터 일부분을 제거하였다. 상기 세포는 기능성 DHFR 단백질을 더 이상 발현할 수 없었다.
세포의 트랜스펙션
사용된 인간 세포주는 5번 염색체에 대해서 배수체(polyploid)가 아니어야 했으며, MTX 선택하에 유지되지 않아야 했다. 양자의 경우에 2 이상의 대립 형질이 불활성화되어야 했다.
HeLa S3 세포(ATCC CCL-2.2)
세포를 RPMI 1640 배지, 10%의 소 태아 혈청, 2 mM의 L-글루타민 및 1 mMMEM(비 필수 아미노산)를 함유하는 조직 배양 플라스크에서 배양하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션 시켰다. 일렉트로포레이션 완충액은 pH 7.O에서 20 mM의 Hepes, 138 mM의 NaCl, 5 mM 의 KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 6mM D-글루코스 모노하이드레이트를 함유하도록 하였다. 10㎍의 선형화된 벡터 DNA(pNDI)를 960 ㎌ 및 250 V에서 1 x107세포 내부로 일렉트로포레션 시켰다(Biorad Gene Pulser). 일렉트로포레이션 후, 세포를 600 ㎍/ml G418(geneticin Boehringer Mannheim)을 함유한 배지에서 배양했다. 선택 10 일후에(배지는 2일마다 교체하였다) 양성 클론을 단리시키고 확장시켰다.
HT1080 세포(ATCC CCL-121)
HeLa S3 세포에 대해 기술한 것과 같이 세포를 10%의 소 태아 혈청, 2mM의 L-글루타민 및 1 mM의 소듐 피루베이트를 함유한 DMEM 배지를 사용하여 배양하고 선택하였다.
나말와 세포(ATCC CRL-1432)
상기 세포주는 현탁 세포주이며, 그에 상응하여 배양되어야 했다. 배지는 HeLa S3 세포용으로서 상기한 배지와 같았다. 트랜스펙션시킨 후에, 세포를 4096-웰 플레이트중에 분포시켰다. 양성 클론을 48-웰, 24-웰, 12-웰 및 6-웰 플레이트 내에서 확장시켰다. 1 mg/ml G418로 선택하였다.
DHFR - 음성(+/-) 세포의 검출
벡터의 삽입을 서던 블롯 분석(Southern blot analysis) 또는 PCR에 의해 검출했다. 상동 재조합이 정확히 발생하는 경우에, 2.9 kb 밴드를 완전한 DHFR 유전자를 나타내는 1.8 kb 밴드에 부가하여, Neo 유전자의 삽입에 의해 형성된 EcoR1 분해 이후에 검출하였다(도 7c참조). 혼합된 클론(서던 블롯에서 밴드 강도의 불균등 비)을 FACS내의 단일 세포 증착으로 단리시키고, 서브클로닝시켰으며, 연속적으로 확장 시켰다. DHFR 유전자의 대립형질은 양성으로 확인된 클론내에서 불활성화되었다.
DHFR음성(-/-) 세포의 생성
DHFR 대립 형질(+/-)이 불활성화된 세포 클론을 다시 새롭게 상동 재조합 시켰다. 이를 위해, 세포를 상기한 것과 같이 벡터 pHDI의 선형화한 DNA 10㎍/ml으로 트랜스펙션시켰다. 500 ㎍/ml의 히그로마이신 B(뵈링거 만하임)를 함유하는 배지에서 선택하였다.
배지에서 G418 농도를 증가시키는 것이 수득된 DHFR+/-세포 및 DHFR-/-세포에 대한 선택 압력을 증가시켰다. 유전자 전환은 염색체간의 재조합을 유도했으며, 이는 제 2 DHFR 대립형질이 불활성화되는 원인이었다.
DHFR-/-세포는 두 개의 불활성화된 DHFR 대립 형질을 포함하며, 더 이상 테트라히드로폴레이트(tetrahydrofolate)를 합성하지 않았다. 따라서, 티미딘, 글리신 및 퓨린을 배지에 보충해야 했다. 선택적으로, 세포를 α-배지(Gibco BGL) 에서 배양했다.
DHFRR-/-세포를 전술한 바와 같이 검출했다. 동형접합체(homozygous) DHFR 음성 세포에서는 어떠한 야생형 밴드(1.8 kb)도 검출할 수 없었다. pDHI로 트랜스펙션시킨 세포는 상동 재조합후, EcoRI 서던 블롯 내에서 신규한 3.7 kb를 나타냈다.
DHFR음성 세포(-/-)의 용도
본 발명에 따른 세포는 대용량의 단백질 제조에 사용할 수 있다. 이를 위해, 본 발명(도 8)에 따른 벡터 및 Cre 재조합효소를 코딩하는 발현 벡터를 DHFR-/-세포로 트랜스펙션시켰다. Cre 재조합효소는 DHFRR 유전자좌로부터 항생제 내성을 제거하며 본 발명에 따른 벡터를 DHFRR-/-세포의 게놈 내부로 loxP 서열로 통합한다. 세포는 티미딘, 글리신, 및 퓨린 보충과는 관계 없이 항생작용에 민감했다.
선택은 첨가물 없는 배지를 사용하거나 적절한 항생제를 배양배지에 보충함으로써 달성될 수 있었다. 이러한 경우에, 항생제는 세포의 게놈으로부터 Cre 재조합효소에 의해 제거된 내성 유전자와 상응하였다. loxP 서열에 혼입된 벡터가 양성 선별 마커 유전자를 함유하는 경우에, 배지에 항생제를 첨가함으로써 수행할 수 있었다.
유전자 증폭에 의한 생산 수율의 증가
재조합 단백질을 위한 세포의 생산 수율을 증가시키기 위해, 메토트랙세이트(MTX) 선택을 수행하여 세포 내로 도입되는 DHFR 유전자 및 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 증폭시켰다.
증폭시키기 위해, 세포를 MTX의 농도를 증가시키면서(100-1000 mM) 배양하였다. 증폭의 정도를 상대적인 서던 블롯의 농도측정(MTX 첨가 이전, 첨가 동안 및 첨가 이후)으로 모니터링했다.
증폭 단계 이후에 얻어진 본 발명에 따른 세포는 loxP 좌위에서 다수의 도입된 DHFR 유전자 및 삽입된 이종 핵산 서열의 카피를 함유했다. 이는 이종 핵산의 고 수율을 특징으로 하였다.
본 발명의 바람직한 실시예는 상세한 설명의 일부분으로 하기에 설명된다.
1. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 방법에 있어서,
(1) 세포가
(i) 제 1 이종 발현 조절 서열 및 제 1 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열 ,
(ii) 양성 선별 마커 유전자,
(iii) 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 부위 특이적 재조합효소에 대한 두 개이상의 표적 서열, 및
(iv) 상동 재조합이 일어나도록 하기 위해 세포의 게놈 내에 핵산 절편과 상동인 서열 (i), (ii) 및 (iii)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건에서 배양되는 단계,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, loxP 서열이 재결합효소의 표적 서열로 사용되는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 세포가 불멸화된 세포인 방법.
5. 제 4항에 있어서, 세포가 HT1080, 나말와, 또는 HeLa S3 세포인 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 이종 발현 조절 서열이 프로모터/인핸서, 바람직하게는 바이러스성 프로모터, 특히 바람직하게는 CMV 프로모터인 방법.
7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 이종 발현 조절 서열이 3'비코딩 서열을 함유하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 상동 서열이 선택되어 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 내인성 발현 조절 서열이 상동 재조합에 의해 제거되는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 양성 선별 마커 유전자가 네오마이신, 카나마이신, 제네티신 및 히그로마이신 내성 유전자인 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 제 1항 (1)(iv)와같은 상동 서열의 외부에 배열된 음성 선별 마커 유전자를 추가로 포함하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소 표적 서열 사이에 위치된 핵산 서열이, 표적 서열을 인식하는 부위 특이적 재조합효소의 일시적인 활성화에 의해 세포 게놈으로부터 절단되는 방법.
12. 제 1항에 있어서,
(1) 세포가
(i) 제 2 이종 발현 조절 서열 및 제 2 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
(ii) 바람직하게는 제 1 벡터의 양성 선별 마커 유전자와는 다른 양성 선별마커 유전자, 및
(iii) 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 두 개 이상의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 추가의 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 표적 서열에 의해 플랭킹된 서열이, 세포 게놈 내의 표적 서열 내부로 혼입된 조건에서 배양되는 단계,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계, 및
(4) 선택적으로, 단계 (1) 내지 (3)이 각각의 경우 변화하는 발현 조절 서열및/또는 증폭 유전자로 1 회 이상 반복되는 단계를 포함하는 방법.
13. (1) 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
(2) 양성 선별 마커 유전자,
(3) 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 부위 특이적 재조합효소에 대한 두 개이상의 표적 서열,
(4) 상동 재조합이 일어나도록 하기 위해 세포의 게놈 내에 핵산 절편과 상동인 서열 (1), (2), 및 (3)에 플랭킹된 DNA 서열, 및
(5) 선택적으로, 음성 선별 마커 유전자를 포함하는 상동 재조합용 벡터.
14. (1) 이종 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
(2) 양성 선별 마커 유전자,
(3) 서열 (1) 및 (2)에 플랭킹된 두 개 이상의 재조합효소 표적 서열,
(4) 선택적으로, 음성 선별 마커 유전자를 포함하는 벡터.
15. 제 1 항 내지 제 12항중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
16. (1) 내생적으로 존재하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 이종 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된, 염색체에 위치한 서열을 하나 이상 함유하고,
(2) 상기 서열이 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
17. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 방법으로서,
(1) 세포가
(i) 촉진자 단백질을 결합하는 하나 이상의 핵산 서열,
(ii) 양성 선별 마커 유전자, 및
(iii) 상동 재조합이 일어나도록 하기 위해 세포의 게놈 내에 핵산 절편과 상동인 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건에서 배양되는 단계 ,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 방법.
18. 제 17항에 있어서, 하나 이상의 하이폭시아-유도-인자(HIF)-결합 핵산 서열이 사용되는 방법.
19. 제 18항에 있어서, HIF-결합 핵산 서열이 서열 번호 1에 따른 53 bp 서열, 서열 번호 2에 따른 43 bp 서열, 상기 서열과 상동인 서열, 또는 엄격한 조건에서 상기 서열과 혼성화되는 서열로부터 선택되는 방법.
20. 제 17항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서,
(1) 상기 세포 내에서 활성 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된 촉진자 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및
(2) 선택적으로, 양성 선별 마커 유전자를 포함하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 촉진자 단백질이 HIF-1α및/또는 HIF-1β단백질인 방법.
22. 제 18항 내지 제 21항중 어느 한 항에 있어서, 세포가 0.1% 내지 2%의 O2농도에서 배양되는 방법.
23. (1) 촉진자 단백질과 결합하는 하나 이상의 핵산 서열,
(2) 양성 선별 마커 유전자,
(3) 상동 재조합이 일어나도록 하기 위해 세포의 게놈 내에 핵산 절편과 상동인 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
24. 제 17항 내지 제 21항중 어느 한 항에 의해 수득되는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
25. 세포 내에 내생적으로 존재하는 유전자와 작동적으로 연결된 촉진자 단백질/촉진자 단백질 복합체와 결합하는, 하나 이상의 이종 염색체에 위치된 핵산 단편을 포함하는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
26. 진핵 세포 내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 영역으로부터의 비코딩 핵산 서열의, 그의 발현에 대한 영향을 시험하기 위한 방법으로서,
(1) 세포가
(i) 리포터 유전자와 작동적으로 연결된, 세포 내에서 활성이거나 활성화될 수 있는 이종 발현 조절 서열 및
(ii) 표적 유전자의 영역으로부터의 5' 측면 및/또는 3' 측면의 비코딩 핵산단편을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 발현 조절 서열이 활성화되는 조건에서 상기 세포가 배양되는 단계,
(3) 리포터 유전자의 발현이 측정되는 단계를 특징으로 하는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 리포터 유전자가 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다아제(β-Gal) 또는 lacZ를 코드화하는 방법.
28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
(1) 다른 표적 유전자의 5' 및/또는 3' 비코딩 핵산 단편을 함유하는 2개 이상의 벡터가, 각각 다른 세포로 트랜스펙션되며,
(2) 리포터 유전자의 발현이 다른 세포 내에서 측정되는 방법.
29. DHFR 음성 진핵 세포를 제공하기 위한 방법으로서,
(1) 세포가,
(i) 부위 특이적 재조합효소에 대한 하나 이상의 표적 서열,
(ii) 상동 재조합이 일어나도록 하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산에 상동인 서열 (i)을 플랭킹하는 DNA 서열,
(iii) 선택적으로 양성 선별 마커 유전자 및 선택적으로 음성 선별 마커 유전자를 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 상기 트랜스펙션된 세포가, 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건에서 배양되는 단계,
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 방법.
30. 제 29항에 있어서, loxP 서열이 재조합효소 표적 서열로 사용되는 방법.
31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 양성 선별 마커 유전자를 코딩하는 핵산이 네오마이신, 카타나마이신, 제네티신 또는 히그로마이신 내성 유전자인 방법.
32. 제 29항 내지 제 31항중 어느 한 항에 있어서, 음성 선별 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열이 티미딘 키나제 유전자(TK)및/또는 하이포잔틴-구아닌-포스포리복실 트랜스퍼라제 유전자(HGPRT)인 방법.
33. 제 29항 내지 제 32항중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹되는 서열이 대응하는 재조합효소의 일시적인 활성화에 의해 세포의 게놈 외부로 절단되는 방법.
34. 진핵 세포의 내부로 이종 DHFR 유전자를 도입시키는 방법으로서,
(1) 제 33항에 의해 수득된 세포가,
(i) 선택적으로, 바람직하게는 제 1 벡터의 양성 선별 마커 유전자와는 다른 양성 선별 마커 유전자,
(ii) DHFR을 코딩하는 핵산 서열,
(iii) 발현 형태의 단백질을 코딩하는 증폭된 핵산 서열을 포함하고, 부분서열 (i), (ii)및 (iii)로부터의 각 핵산서열이 하나 이상의 재조합효소 표적 서열에 의해 5'및 3' 측면에 플랭킹되는 것을 포함하는 제 3벡터로 트랜스펙션되는 단계,
(2) 트랜스펙션된 세포가, 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 핵산 서열이 세포 게놈 내에 이미 존재하는 재조합효소 표적 서열에 혼입되는 조건에서 배양되는 단계, 및
(3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 단계를 포함하는 방법.
35. (1) 선택적으로, 양성 선별 마커 유전자,
(2) DHFR을 코딩하는 핵산 서열 및,
(3) 목적하는 단백질을 코딩하는 발현 형태의 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 부분 서열 (1), (2), 및 (3)으로부터의 각 핵산 서열이 하나 이상의 재조합효소 표적 서열에 의해, 5' 측면 및 3' 측면에서 플랭킹되는 벡터.
36. (1) 선택적으로, 양성 선별 마커 유전자,
(2) 각각의 경우에 서열 (1)을 플랭킹하는 하나 이상의 재조합효소 표적 유전자,
(3) 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산에 상동으로서 상동 재조합을 허용하는, 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 DNA 서열, 및
(4) 선택적으로, 상동 서열 (3)의 외부의 음성 선별 마커 유전자를 포함하는 상동 재조합용 벡터.
37. 제 29항 내지 제 34항중 어느 한 항에 의한 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
38. (1) DHFR을 코딩하는 하나 이상의 내인성 핵산 서열이 불활성화되고,
(2) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열이 DHFR을 코딩하는 상기 핵산 서열의 영역내의 게놈에 혼입되는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
39. (1) DHFR을 코딩하는 핵산 서열,
(2) 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및
(3) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열을 포함하는, 내인성 DHFR 유전자좌의 영역내의 이종 핵산 서열을 특징으로 하는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포.
본 발명으로 인해 상동 재조합에 의한 내인성 유전자 활성을 최적화시킬 수 있다.
서열목록
(1) 일반적 사항
(i) 출원인:
(A) 성명: 뵈링거 만하임 게엠베하
(B) 거리: 잔트호퍼 슈트라쎄 112-132
(C) 도시: 만하임
(E) 국가: 독일
(F) 우편 번호: 데-68305
(ii) 발명의 명칭: 내인성 유전자 활성화를 위해 세포를 최적화시키는 방법
(iii) 서열의 수: 3개
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D) 소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.30(EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 53 염기쌍
(B) 서열의 타입: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
[서열 1]
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 43 염기쌍
(B) 서열의 타입: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
[서열 2]
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 34 염기쌍
(B) 서열의 타입: 누클레오티드
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
[서열 3]

Claims (33)

  1. 불멸화된 세포주 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키는 시험관내 방법에 있어서,
    (1) 세포가
    (i) 제 1 이종 발현 조절 서열 및 제 1 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
    (ii) 양성 선별 마커 유전자,
    (iii) 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 부위 특이적 재조합효소에 대한 두 개 이상의 표적 서열, 및
    (iv) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열 (i), (ii) 및 (iii)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 제 1 벡터로 트랜스펙션되고,
    (2) 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되고,
    (3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, loxP 서열이 재조합효소 표적 서열로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 벡터가 제 1항 (1)(iv)에 따른 상동 서열의 외부에 배열된 음성 선별 마커 유전자를 추가로 함유함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 재조합효소 표적 서열 사이에 위치된 핵산 서열이, 표적 서열을 인식하는 부위 특이적 재조합효소의 일시적인 활성화에 의해 세포의 게놈으로부터 절단됨을 특징으로 하는 방법.
  5. (1) 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
    (2) 양성 선별 마커 유전자,
    (3) 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 부위 특이적 재조합효소에 대한 두 개 이상의 표적 서열 및
    (4) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열 (1), (2) 및 (3)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 상동 재조합용 벡터.
  6. (1) 이종 발현 조절 서열 및 증폭 유전자로부터 선택된 하나 이상의 서열,
    (2) 양성 선별 마커 유전자,
    (3) 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 두 개 이상의 재조합효소 표적 서열을 포함하는 벡터.
  7. (1) 내생적으로 존재하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된 증폭유전자 및 이종 발현 조절 서열로부터 선택된, 염색체에 위치한 서열을 하나 이상 함유하고,
    (2) 상기 서열이 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 불멸화된 세포주.
  8. 불멸화된 세포주 내에 내생적으로 존재하는 핵산 서열의 발현을 변경시키기 위한 시험관내 방법에 있어서,
    (1) 세포가
    (i) 촉진자(activator) 단백질과 결합하는 하나 이상의 핵산 서열,
    (ii) 양성 선별 마커 유전자 및
    (iii) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열 (i) 및 (ii)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되고,
    (2) 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되고,
    (3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 하나 이상의 하이폭시아 유도성 인자(HIF)-결합성 핵산 서열이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  10. (1) 촉진자 단백질과 결합하는 하나 이상의 핵산 서열,
    (2) 양성 선별 마커 유전자 및
    (3) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포의 게놈 내의 핵산 절편과 상동인 서열 (1) 및 (2)를 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 상동 재조합용 벡터.
  11. 제 8항 또는 제 9항중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는 불멸화된 세포주.
  12. 불멸화된 세포주 내에 내생적으로 존재하는 유전자와 작동적으로 연결된 촉진자 단백질 또는 촉진자 단백질 복합체와 결합하는, 염색체에 위치한 이종의 핵산 단편을 하나 이상 함유하는 불멸화된 세포주.
  13. 불멸화된 세포주 내에 내생적으로 존재하는 표적 유전자의 영역으로부터의 비코딩 핵산 서열이 발현에 미치는 영향을 시험하는 시험관내 방법에 있어서,
    (1) 세포가
    (i) 리포터 유전자와 작동적으로 연결된 세포 내에서 활성이거나 활성화될 수 있는 이종 발현 조절 서열, 및
    (ii) 표적 유전자의 영역으로부터 5'측면, 3'측면 또는 둘 모두 상의 비코딩 핵산 단편을 포함하는 벡터로 트랜스펙션 되고,
    (2) 트랜스펙션된 세포가 발현 조절 서열이 활성인 조건하에서 배양되고,
    (3) 리포터 유전자의 발현이 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  14. DHFR 음성 불멸화된 세포주를 제공하기 위한 시험관내 방법으로서,
    (1) 세포가
    (i) 부위 특이적 재조합효소에 대한 하나 이상의 표적 서열,
    (ii) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산 서열과 상동인 서열 (i)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 제 1벡터로 트랜스펙션되고,
    (2) 트랜스펙션된 세포가 벡터의 상동 재조합이 발생하는 조건하에서 배양되고,
    (3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 방법.
  15. 이종 DHFR 유전자를 불멸화된 세포주 내로 도입시키는 시험관내 방법으로서,
    (1) 제 14항에 따른 방법에 의해 수득된 세포가
    (i) DHFR을 코딩하는 핵산 서열,
    (ii) 발현가능한 형태로 단백질을 코딩하는 증폭될 핵산 서열로서, 부분 서열 (i) 및 (ii)를 함유하는 각각의 핵산 서열이 하나 이상의 재조합효소 표적 서열에 의해 5' 측면 및 3' 측면상에서 플랭킹되는 핵산 서열을 포함하는 제 3 벡터로 트랜스펙션되고,
    (2) 트랜스펙션된 세포가 재조합효소 표적 서열에 의해 플랭킹된 핵산 서열이 세포의 게놈 내에 이미 존재하는 재조합효소 표적 서열내로 혼입되는 조건하에서 배양되고,
    (3) 단계 (2)에 따라 수득된 세포가 단리되는 방법.
  16. (1) DHFR을 코딩하는 핵산 서열 및
    (2) 발현가능한 형태로 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 부분 서열 (1) 및 (2)로부터의 각 핵산 서열이 하나 이상의 재조합효소 표적 서열에 의해 5'측면 및 3'측면상에서 플랭킹된 벡터.
  17. (1) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열 및
    (2) 상동 재조합이 가능하도록 하기 위해 세포 내에 내생적으로 존재하는 DHFR 핵산 서열과 상동인 서열 (1)을 플랭킹하는 DNA 서열을 포함하는 상동 재조합용 벡터.
  18. (1) DHFR을 코딩하는 하나 이상의 내인성 핵산 서열이 불활성화되고,
    (2) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열이, DHFR을 코딩하는 핵산 서열의 영역에서 게놈내로 혼입된 불멸화된 세포주.
  19. (1) DHFR을 코딩하는 핵산 서열,
    (2) 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및
    (3) 하나 이상의 재조합효소 표적 서열을 포함하는, 내인성 DHFR 유전자좌의 영역내에 이종 핵산 서열이 존재함을 특징으로 하는 불멸화된 세포주.
  20. 제 5항에 있어서, 음성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는상동 재조합용 벡터.
  21. 제 6항에 있어서, 음성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  22. 제 7항에 있어서, 인간 세포임을 특징으로 하는 불멸화된 세포주.
  23. 제 11항에 있어서, 인간 세포임을 특징으로 하는 불멸화된 세포주.
  24. 제 12항에 있어서, 인간 세포임을 특징으로 하는 불멸화된 세포주.
  25. 제 14항에 있어서, 제 1 벡터가 양성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  26. 제 14항에 있어서, 제 1 벡터가 음성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  27. 제 15항에 있어서, 제 3 벡터가 재조합효소 표적 서열에 의해 5' 및 3' 측면상에서 플랭킹된 양성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 제 3벡터의 양성 선별 마커 유전자가 제 1벡터의 양성 선별 마커 유전자와 상이함을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  29. 제 16항에 있어서, 재조합효소 표적 서열에 의해 5' 및 3' 측면상에서 플랭킹된 양성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  30. 제 17항에 있어서, 재조합효소 표적 서열(1)에 의해 플랭킹된 양성선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  31. 제 17항에 있어서, 상동 서열(2)의 외부에 음성 선별 마커 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  32. 제 18항에 있어서, 인간 세포임을 특징으로 하는 불멸화된 세포주.
  33. 제 19항에 있어서, 인간 세포임을 특징으로 하는 불멸화된 세포주.
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