JP4629813B2 - 内在性遺伝子活性化のための細胞の最適化 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞における遺伝子発現を最適化するための方法に関する。第１の面では、相同的組換えによって異種発現制御配列および／または増幅遺伝子を細胞のゲノムに導入することによる、真核細胞中に内在する標的遺伝子の発現を変化させる方法に関し、また、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される挿入外来ＤＮＡの切除、および他の異種発現制御配列および／または増幅遺伝子によるその置換に関する。本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させるための、相同的組換えによる、アクチベータータンパク質またはアクチベータータンパク質複合体（例えば、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ））が結合する１または数個の核酸配列の、真核細胞のゲノムへの導入に関する。さらに本発明は、レポーター遺伝子の発現を測定することによる、標的遺伝子の発現に及ぼす５’側または３’側の非コード核酸断片の影響を試験するための方法に関する。さらに本発明は、リコンビナーゼ標的配列を含有するＤＨＦＲ陰性真核細胞の作製方法、およびリコンビナーゼ標的配列中に挿入された核酸配列の発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞における遺伝子発現は、例えば、いわゆるハウスキーピング遺伝子では構成的に起こっており、また、調節することができる。調節された発現は、細胞の特定の発達段階で発現されたり、環境条件に変化があるときにのみ発現される遺伝子の場合に、特に必要である。
【０００３】
発現はコード核酸配列と機能的に結合しているプロモーターにより転写レベルで調節され、プロモーターの活性はリプレッサーおよびアクチベーターにより制御することができる。遺伝子の非コード核酸配列へのリプレッサーまたはアクチベーターの結合は、プロモーターの活性を低下または増大させうる（L. Stryer, Biochemie, Chapter 12, "Spektrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft", Heidelberg, 1990）。細胞に含まれるリプレッサーまたはアクチベーターの量は、例えば環境条件のような要因により調節される。低酸素誘導因子（hypoxia-inducible factor：ＨＩＦ）は、Ｏ2 供給の減少により誘導されるアクチベーターの一例であり、エリトロポエチン遺伝子の発現を増加させる（Blanchard K.L.ら, 「ヒトエリトロポエチン遺伝子の低酸素誘導：それぞれステロイド受容体応答要素を含有するプロモーターとエンハンサーとの協力」, (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 5373-5385；Wang G.L. and Semenza G.L., 「低酸素誘導因子１の特性決定および低酸素によるＤＮＡ結合活性の調節」, (1993), J. Biol. Chem., 268, 21513-21518；Wang G.L.ら, 「低酸素誘導因子１は細胞内Ｏ2 圧により調節される塩基性-ヘリックス-ループ-ヘリックス-ＰＡヘテロ二量体である」, (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514）。
【０００４】
さらに、タンパク質の発現量はｍＲＮＡの安定性に依存する。ｍＲＮＡの安定性に影響し、そのため発現レベルに影響するｍＲＮＡ分解酵素の認識配列がｍＲＮＡの３’領域に位置する（Shaw G. and Kamen, R.,「GM-CSH mRNAの3'非翻訳領域からの保存AU配列は選択的mRNA分解を媒介する」, Cell (1986), 659-667）。これに関連して、ｍＲＮＡの半減期は発現されたタンパク質の量に相関する。
発現調節の第３のレベルは翻訳である。
【０００５】
このため遺伝子の発現は、個々のケースで大きく異なる複雑な調節機構を受ける。
【０００６】
タンパク質は、発現調節に関する知識を利用する組換えＤＮＡ法により取得することができる（Sambrookら, 1989, 「分子クローニング、実験室マニュアル」, Cold Spring Harbor）。そのために、適切なプロモーターと、さらにはタンパク質の発現およびベクターの複製に必要な追加の配列の制御下に、対応するタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが使用される。次に既知の方法によりベクターを宿主細胞中に導入し、細胞を培養して、組換えタンパク質を細胞または培地から単離することができる。
【０００７】
原核または真核細胞を宿主細胞として使用することができる。原核細胞、特に大腸菌（E. coli）細胞は取扱いには問題がないが、組換えにより真核細胞タンパク質を発現させるときには多くの難点を抱えている。
【０００８】
原核および真核細胞は、発現プロセシング経路、細胞の培地条件、およびタンパク質プロセシングに関与するシャペロンにおいて異なっている。このため原核細胞で産生された真核細胞タンパク質は、対応する天然タンパク質とは決定的に異なることもある。
【０００９】
例えばタンパク質の折りたたみパターンおよびタンパク質の活性が改変されるかもしれない。また、原核宿主細胞のタンパク質は通常グリコシル化されない。しかし正しいグリコシル化パターンは、例えば薬剤の処方のためのタンパク質の産生では、多くの場合に有効性および寛容性にとってきわめて重大な特徴である。
【００１０】
したがってグリコシル化タンパク質は、真核宿主細胞または細胞系、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、により産生される。真核細胞の使用にもかかわらず、例えば非ヒト細胞においてヒトタンパク質を発現させるとき、種差のために組換え産生されたタンパク質に変化が生じることがあり、この方法が多くの用途に不適切であるのはこのためである。
【００１１】
タンパク質の組換え生産のために、宿主細胞は、発現ベクターで一時的にまたは安定にトランスフェクトされるが、特に大規模生産方法のためには安定にトランスフェクトされた細胞が使用される。
【００１２】
宿主細胞のゲノム中に発現ベクター配列が特異的でなくランダムに組み込まれると、低い産生能力の細胞ができるか、または細胞が不安定な性質になりうる。例えば、産生量が産生プロセスの過程で低下したり、組換えタンパク質を発現する細胞の能力が完全に消失したりする。
【００１３】
遺伝子発現を増大させる１つの方法は遺伝子増幅であり、この場合はタンパク質をコードする核酸配列を増幅遺伝子に結合させる。両方の配列の増加は、発現の増大をもたらす選択工程により達成される（Schimke, R.T.(編) (1982), 「遺伝子増幅」, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY）。
【００１４】
例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする核酸を増幅遺伝子として使用することができる（Kaufmann R.J., Sharp P.A. (1982), 「１モジュールのジヒドロ葉酸レダクターゼ相補ＤＮＡ遺伝子で同時トランスフェクションした配列の増幅と発現」, J. Mol. Biol. 159:601 ff）。
【００１５】
メトトレキセートを用いて行われる選択工程により、メトトレキセートに耐性であって、かつゲノム中に２０〜５０倍増幅されたＤＨＦＲコード核酸配列およびこれに結合した核酸配列を含有する細胞が入手できる（R. Knippers, 1982, "Molekulare Genetik", Thieme, Stuttgart）。
【００１６】
このような遺伝子増幅法は、ＤＨＲＦ陰性細胞で最も有効に行われる。JP-62265992 は、例えばヒトＤＨＦＲ陰性細胞を記載している。しかしこの特許は、この細胞におけるこれらの配列の相同的組換えと増幅による発現ベクターの部位特異的組込みには言及していない。
【００１７】
遺伝子増幅プロセスを行うときでさえ、細胞の不安定性のような上述の難点は、細胞のゲノム中への発現ベクターのランダムな組込みにより起こりうる。
【００１８】
上述の難点は、内在性遺伝子活性化をもたらす相同的組換えにより、選択された遺伝子座に外来ＤＮＡを部位特異的に組み込むときにのみ回避することができる。対応する方法は知られており、遺伝子ターゲッティングと呼ばれる（WO 90/11354；WO 91/09955）。このプロセスにおいて、細胞は、この細胞のゲノム中にベクターを組み込もうとする遺伝子座に相同な核酸配列により挟まれた、正の選択マーカー遺伝子を含有するベクターでトランスフェクトされる。相同な核酸配列の間に、細胞中の標的遺伝子の発現を増大させるための異種発現制御配列と、場合により標的遺伝子のコピー数を増加させるための増幅遺伝子がさらに存在する。
【００１９】
既知の遺伝子ターゲッティング法の難点は、商業目的にかなう量と質で目的タンパク質の産生を可能にする性質の細胞を作製することが、多くの場合非常に厄介であるということである。特に、目的の標的タンパク質の発現に最適な発現制御配列および／または増幅遺伝子の選択には、目的の組換え現象が起こっているクローンを単離するための複雑な手順のために、極めて時間のかかる、非常に多くの一連の相同的組換え実験がしばしば必要となる。
【００２０】
相同的組換えはまた、タンパク質機能の研究を行うために細胞内のある遺伝子の発現をスイッチオフするのにも使用することができる。このために、試験しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、胚性幹細胞内で相同的組換えによりスイッチオフされている、ノックアウトマウスが作り出されている。さらなるプロセスの工程を実施後、この遺伝子の両方の対立遺伝子の不活化のために、その発生の開始時点からある機能性タンパク質を発現することができないマウスが得られる（Thomas, K.R., Capecchi M.R., (1987),「マウス胚由来幹細胞における遺伝子ターゲッティングによる部位特異的突然変異誘発法」, Cell 51:503-512）。
【００２１】
Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を使用して、組織特異的かつ時間特異的にある遺伝子をスイッチオフして、これを試験することができる。この目的のためには、２つのｌｏｘＰ配列により挟まれた核酸断片を細胞のゲノムに相同的組換えにより導入し、次に細胞内で発現されるＣｒｅリコンビナーゼによりゲノムから再度切断することができる（Sauer B, Henderson N (1989):「哺乳動物細胞のゲノム中に入れたｌｏｘＰ部位での部位特異的ＤＮＡ組換え」, Nuc Acid Res 17:147-161；Sauer B., Henderson N. (1990),「Ｃｒｅリコンビナーゼによる真核細胞ゲノム中への外因性ＤＮＡの標的化された挿入」, New Biol. 5:441-449）。先行技術は、内在性遺伝子の発現を変化させるために真核細胞ゲノム中に発現制御配列または増幅遺伝子を部位特異的に組み込むための、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系または別の部位特異的リコンビナーゼ系の使用には全く言及していない。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、少なくとも部分的に先行技術の難点を排除する、相同的組換えによる内在性遺伝子活性化を最適化するための新しい方法を提供することであった。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本目的は、真核細胞の遺伝子の発現量の最適化をかなり単純化する新しい方法およびベクター構築物を提供することにより達成される。本発明の第１の面は、真核細胞に内在する核酸配列の発現を変化させる方法に関し、この方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする。
【００２４】
異種発現制御配列および／または増幅遺伝子と機能的に結合している内在性遺伝子を有する細胞が、本発明の方法により提供され、そしてこれらの配列は、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）の標的配列により挟まれている。この細胞は、部位特異的リコンビナーゼの標的配列の存在により、第２の異種発現制御配列および／または第２の増幅遺伝子による第１の異種発現制御配列および／または第１の増幅遺伝子の単純な置換が可能になるため、標的遺伝子の発現の最適化に関する研究に非常に適している。
【００２５】
本発明の「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、インテグラーゼまたはリゾルベースインベルターゼクラスの部位特異的リコンビナーゼを含む、特異的ＤＮＡ標的配列上のＤＮＡ再配列（Starkら, Trends Genet. 8 (1992), 432-439；AbremskiとHoess, Protein Engineering 5 (1992), 87-91；Khanら, Nucleic Acids Res. 19 (1991), 851-860）、およびイントロンがコードするエンドヌクレアーゼにより媒介される部位特異的組換え（Perrinら, EMBO J. 12 (1993), 2939-2947）を媒介するタンパク質およびタンパク質複合体を包含する。好ましいリコンビナーゼタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の２μエピソームのＦＬＰリコンビナーゼ（例えば、Falcoら, Cell 29 (1982), 573-584；Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 4223-4227；Konsolakiら, New Biologist 4 (1992), 551-557）、大腸菌（E. coli）ファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ（例えば、SauerとHenderson (1989)上掲）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）プラスミドｐＳＲ１からのＲリコンビナーゼ（Matsuzakiら, J. Bacteriol. 172 (1990), 610-618）、クライベロミセス・ドロソフィラリウム（Kluyveromyces drosophilarium）プラスミドｐＫＤ１からのＡリコンビナーゼ（Chenら, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 4471-4481）、クライベロミセス・ワルティー（Kluyveromyces waltii）プラスミドｐＫＷ１からのＡリコンビナーゼ（Chenら, J. Gen. Microbiol. 138 (1992), 337-345）、λ−ｉｎｔ組換え系の成分（Landy, Annu Rev. Biochem. 5 (1989), 913-949）およびファージμのジン(gin)組換え系の成分（Klippelら, EMBO J. 12 (1993), 1047-1057）よりなる群から選択される。さらに、部位特異的リコンビナーゼおよび核内受容体またはそのリガンド結合ドメインから構成される、ヨーロッパ特許EP-B-0 707 599に記載される融合タンパク質も適している。Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列、すなわちｌｏｘＰ配列は、本発明の方法のために特に好ましく使用される。
【００２６】
異種遺伝子の部位非特異的組込みによるタンパク質の組換え産生、およびそれに関連する不都合とは対照的に、本発明の方法では、相同的組換えによる部位特異的内在性遺伝子活性化の利点を利用する。
【００２７】
異種発現制御配列と増幅遺伝子との適切な組合せの単純化された選択により、安定した特性を有する最適化産生クローンが、その構造と活性に関して実質的に未変性タンパク質に対応するタンパク質の産生を可能にする高い確率で得られる。
【００２８】
異種発現制御配列、増幅遺伝子、正の選択マーカー遺伝子およびリコンビナーゼ標的配列に隣接する適切な相同配列の選択は、好ましくはWO 90/11354およびWO 91/09955に記載される方法により行われる。
【００２９】
さらに、相同配列はまた、例えば点突然変異のような、発現されるタンパク質中の突然変異、個々のアミノ酸または全アミノ酸部分の挿入および／または欠失をもたらす修飾を含んでいるかもしれない。
【００３０】
したがって本発明の方法により、内在性核酸配列の発現レベルを単一プロセス工程で変化させることができるだけでなく、同時に内在性核酸配列のコード領域中への突然変異の導入をも可能にする。このため本発明の方法は、薬剤応用のためのタンパク質の産生に特に有利である。このようなタンパク質は、タンパク質の効力を増大させる突然変異を除けば、未変性タンパク質に比較してさらなる改変は含まない。
【００３１】
本発明では、任意の真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、特に好ましくはヒト細胞を使用することができる。本発明の方法は、非不死化細胞（例えば、繊維芽細胞）を用いて行うことができ、また不死化細胞（例えば、腫瘍細胞株）を用いても行うことができる。不死化細胞が好ましい。
【００３２】
本発明の方法を実施するために使用される溶液および培地は、好ましくは各プロセス工程において最適な条件となるように選択される。細胞は、適切な細胞増殖に必要な全ての物質を含有し、かつ場合により緩衝化されている培地を使用して培養する。無血清培地で培養することができる細胞を使用するのが好ましい。使用される細胞は、特に好ましくはナマルワ（Namalwa）、ＨＴ１０８０またはＨｅＬａＳ３細胞である。
【００３３】
本発明の方法によって、最適な発現制御配列、最適な増幅遺伝子の選択により、および／または発現制御配列と増幅遺伝子との最適な組合せの選択により、細胞に内在する核酸配列、すなわち標的遺伝子の発現の最適化が可能になる。
【００３４】
細胞のゲノム中への組込み後の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす異種発現制御配列として、任意の核酸配列を使用することができる。これは、転写開始因子またはＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相互作用することができる核酸配列、および転写に及ぼす影響がアクチベーターまたはリプレッサーとの相互作用により媒介される核酸配列を含む。異種発現制御配列は、好ましくはプロモーター／エンハンサー、特に好ましくはウイルスプロモーターおよび最も好ましくはＣＭＶプロモーターを含有する。
【００３５】
異種発現制御配列はまた、３’非コード配列を含む。３’非コード配列は、ｍＲＮＡに安定化または不安定化作用を及ぼし、このためその半減期を延長または短縮させることができる。ｍＲＮＡを安定化させる配列の導入により、ｍＲＮＡの半減期を延長させて、そのコードするタンパク質の収量を増大させることができる。
【００３６】
好適な実施態様において、標的遺伝子の内在性発現制御配列は、相同的組換えにより除去される。これは、内在性配列がリプレッサー結合配列を含有するときには、特に有利である。発現はまた、ｍＲＮＡに不安定化作用を及ぼした結果、翻訳されるタンパク質の量を低下させる３’非コード配列によっても減少させることができる。
【００３７】
さらに本発明の方法により、最適な増幅遺伝子の選択が可能になる。増幅遺伝子を、好ましくは発現可能な形態で、すなわち、適切なプロモーターと機能的に結合させて使用し、真核細胞のゲノム中へのベクターの相同的組み込み後、標的遺伝子の近くに位置するように、ベクター内に配置する。増幅工程を行うと、細胞内の標的遺伝子のコピー数が増大する。この結果、内在性核酸配列の発現をさらに増大させることができる。適切な増幅遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼまたはこれらの遺伝子のムテイン(muteins)がある。増幅遺伝子は、好ましくはＤＨＦＲ遺伝子またはその突然変異した形態（Simonsenら, Nucleic Acids Res. 1988, 16 (5): 2235-2246）、特に内在性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する細胞内のこれらである。
【００３８】
例えば、抗生物質耐性のような選択可能な表現型をもたらす、真核細胞のための任意の適切な耐性遺伝子を正の選択マーカーとして使用することができる。正の選択マーカー遺伝子は、好ましくは、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシン（geneticin）またはハイグロマイシン耐性遺伝子である。正の選択マーカー遺伝子は、好ましくは発現可能な形態、すなわち、適切なプロモーターと機能的に結合させて使用する。
【００３９】
負の選択マーカー遺伝子を使用する場合、正の選択工程にさらに第２の負の選択工程を通常行う。これの有利な点は、選択工程の実施後、同定されるクローンに含まれる擬陽性(false-positive)クローン（すなわち、ゲノムにランダムに組み込まれるベクター）の割合が低いことである。負の選択マーカー遺伝子は、好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および／またはヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である。
【００４０】
部位特異的リコンビナーゼの標的配列が存在する結果として、部位特異的リコンビナーゼを使用して、細胞のゲノムから、これらの配列の間に位置する核酸配列を切り出すことが可能となる。標的配列の間に位置する核酸配列は、好ましくは細胞内の対応するリコンビナーゼの一時的な活性化により、ゲノムから切断される。このリコンビナーゼの一時的な活性化は、例えば、
（ａ）細胞を、細胞内で活性であるか、または活性化することができる発現制御配列と機能的に結合している、リコンビナーゼをコードする核酸配列を含有する第２のベクターでトランスフェクトし、そして
（ｂ）このようにトランスフェクトした細胞を、リコンビナーゼが発現され、かつ活性である条件下で培養し、そして
（ｃ）場合により前記細胞を単離する、
ことにより行うことができる。
【００４１】
リコンビナーゼ／核内受容体融合タンパク質を使用する場合は、細胞の一時的な活性化はまた、核内受容体のリガンドの制御された添加によっても行うことができる。
【００４２】
標的配列の間に位置するＤＮＡの除去後、残りの標的配列（例えば、ｌｏｘＰ配列）は、さらなるプロセス工程に使用することができる。
【００４３】
さらなる好適な実施態様において、本方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）第２の異種発現制御配列および第２の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子と異なる、正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
を含む第３のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、標的配列に隣接する配列が、該細胞のゲノム内の標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離し、そして
（ｄ）場合により、各場合に異なる発現制御配列および／または増幅遺伝子を使用して工程（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回繰り返す、
ことを特徴とする。
【００４４】
このため本発明の方法により、多くの発現制御配列、増幅遺伝子または発現制御配列と増幅遺伝子との組合せを単純かつ迅速に試験することができる。このため、それぞれ個々の標的遺伝子に対する最適な発現／増幅系を決定するために、それぞれ個々の異種発現制御配列およびそれぞれ個々の増幅遺伝子について、時間および費用のかかる部位特異的組込みを行う必要がない。
【００４５】
第３のベクター内の正の選択マーカー遺伝子は、選択プロセスを単純化するため、および擬陽性クローンの数を最少化するために、好ましくは第１のベクターのマーカー遺伝子とは異なる。
【００４６】
本発明に使用されるベクター内のリコンビナーゼ標的配列は、天然に存在する標的配列に対応しても、または場合により部位特異的リコンビナーゼの有効性を損なわない突然変異を受けていてもよい。
【００４７】
本発明のさらなる主題は、相同的組換えのため、特に細胞のゲノム中へのリコンビナーゼ標的配列の部位特異的な導入のためのベクターであって、
（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および
（ｖ）場合により、負の選択マーカー遺伝子、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００４８】
さらに本発明の全てのベクターは、好ましくは、複製の起点、選択マーカー遺伝子などのような、適切な宿主細胞内での増殖および増加に必要な配列要素を含有する。
【００４９】
本発明のさらに別の主題は、特に部位特異的リコンビナーゼ系により細胞のゲノム中にＤＮＡを導入するためのベクターであって、
（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００５０】
本発明のさらに別の主題は、上述の方法により入手可能な真核細胞、好ましくはヒト細胞である。この細胞、例えば、ヒト細胞は、好ましくは、
（ａ）内在する核酸配列と機能的に結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの染色体位置が定められた配列を含有し、そして
（ｂ）この配列が、リコンビナーゼ標的配列により挟まれている、
ことを特徴とする。
【００５１】
本発明のさらなる側面は、真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる方法に関するものであり、この方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）アクチベータータンパク質（例えば、低酸素誘導因子（ＨＩＦ））と結合する、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする。
【００５２】
驚くべきことに、標的遺伝子の発現制御配列の領域内、特にその調節領域内に、１または数個のアクチベータータンパク質（核酸配列に結合することにより、遺伝子発現を増大させるタンパク質）と結合する核酸配列のゲノム組込みは、標的遺伝子の発現を減少させないが、これと対照的に、適切な培養条件の選択により、内在性標的遺伝子の発現を増大させるか、または発現されていない内在性標的遺伝子の発現を誘導することが可能である。
【００５３】
適切なアクチベータータンパク質の例には、低酸素誘導因子ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１β、ならびにインターフェロンコンセンサス配列（ＩＣＥ）への結合により転写を増大させることができるインターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）がある（Tanaka N., Kawakami T., Taniguchi T., Mol. Cell. Biol. (1993), Aug; 13(8): 4531-4538）。
【００５４】
ＨＩＦまたは他のアクチベータータンパク質と結合する１または数個の核酸配列を、内在する標的遺伝子に機能的に結合後、該標的遺伝子の発現を、適切な培養条件を選択することにより調節することができる。特に工業的規模の製造のための、これの有利な点は、タンパク質の発現を、製造プロセスにとって最適な時間に誘導しうることである。このことは、培養培地上清中の合成産物の平均滞留時間が短縮されるため、有益である。またこれにより、タンパク質の望ましくない分解産物の量が減少する。このことは、次の精製工程に良い影響を及ぼし、製造コストを減少させ、かつ最終産物が質的に改善する。
【００５５】
本発明の方法を実施するためには、１または数個のアクチベーター結合性核酸配列を標的遺伝子と機能的に結合させることで充分である。好ましくは２つのＨＩＦ結合性核酸配列が使用される。ＨＩＦ結合性核酸配列は、特に好ましくは、配列番号１（第一のＨＩＦ結合ヌクレオチド配列）の５３塩基対配列、配列番号２（第二のＨＩＦ結合ヌクレオチド配列）の４３塩基対配列、これらの配列の相同配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズする配列から選択される。
【００５６】
２つのＨＩＦ結合性核酸配列の使用により、驚くべきことに相乗効果(synergistic effect)が得られる。これにより、これらの配列のそれぞれを単独で使用する場合よりも、内在性核酸の発現が大きく増大する。
【００５７】
必要であれば、標的遺伝子の領域に導入されるアクチベーター配列に結合するアクチベータータンパク質の発現は、細胞内で誘導および／または増大させることができる。これは、例えば、細胞を、
（ｉ）この細胞内の活性な発現制御配列に機能的に結合している、アクチベータータンパク質をコードする核酸配列、および
（ii）場合により正の選択マーカー遺伝子、
を含むベクターでトランスフェクトすることにより達成することができる。
【００５８】
その発現産物が、ゲノム中に組み込まれたアクチベーター結合性核酸配列に結合することができる、アクチベータータンパク質をコードする任意の核酸配列を使用することができる。アクチベータータンパク質は、好ましくは、ＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ−１βタンパク質である。内在する核酸配列が、すでにアクチベーター結合性または好ましくはＨＩＦ結合性核酸配列を含有するならば、細胞内の活性な発現制御配列および場合により正の選択マーカー遺伝子に機能的に結合している、アクチベータータンパク質または好ましくはＨＩＦタンパク質をコードする核酸配列を含有する細胞中にベクターを導入するだけで充分であろう。
【００５９】
アクチベータータンパク質をコードする核酸配列と機能的に結合している発現制御配列は誘導可能であり、このため、例えば、ホルモンまたは重金属の添加によるなどの適切な培養条件により、活性化のためのさらに別の方法が提供される。これにより、製造プロセスにとって最適な時間に、内在性標的遺伝子の発現が誘導可能である。
【００６０】
構成的に活性な発現制御配列を使用することの利点は、アクチベータータンパク質が、培地へのアクチベーターの添加とは無関係に構成的に発現されることである。
【００６１】
アクチベータータンパク質結合性核酸配列が、ＨＩＦ結合性核酸配列であるならば、標的遺伝子の発現は、例えば、適切な培養条件により、例えば、０．１〜２％のＯ2 濃度で誘導することができる。
【００６２】
本発明のさらなる主題は、相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少なくとも１つの核酸配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００６３】
本発明のさらに別の主題は、上述の方法の１つにより入手可能な、真核細胞、好ましくはヒト細胞である。この細胞は、好ましくは、細胞中に内在する遺伝子と機能的に結合している、少なくとも１つの異種の染色体位置が定められたアクチベータータンパク質／複合体結合性核酸断片を含有することを特徴とする。アクチベータータンパク質結合性核酸断片は、ある標的遺伝子に最適なアクチベーター配列の単純な同定を可能にする、上に説明される部位特異的組換え系により、ゲノム内で置換することができる。
【００６４】
本発明のさらなる側面は、真核細胞中に内在する標的遺伝子の領域からの非コード核酸配列の、その発現に及ぼす影響を試験する方法に関するものであり、この方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞内で活性であるか、または活性化することができる異種発現制御配列、および
（ii）標的遺伝子の領域からの５’側および／または３’側の非コード核酸断片、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）細胞を、発現制御配列が活性である条件下で培養し、そして
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する、
ことを特徴とする。
【００６５】
標的遺伝子の最適な発現速度を達成するために、ゲノム内の標的遺伝子の領域にどのように異種発現制御配列を配置するべきか、および標的遺伝子の領域からの５’および／または３’非コード配列の存在または非存在が発現にどのような影響を及ぼすかは、本発明の方法により簡便に求めることができる。試験ベクターは、好ましくは一時的に細胞にトランスフェクトさせ、レポーター遺伝子の発現を測定する。このように、異種発現制御配列と標的遺伝子の多くの取り合わせまたは多くの異なる発現制御配列を、迅速かつ安価に試験することができる。異種発現制御配列は、転写開始因子またはＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相互作用することができる核酸配列、および転写に及ぼす影響がアクチベーターまたはリプレッサーとの相互作用により媒介される核酸配列を含む。異種発現制御配列は、好ましくはプロモーター／エンハンサー、特に好ましくはウイルスプロモーターそして最も好ましくはＣＭＶプロモーターである。本発明の方法は、特にさらに複雑なプロセス工程を含むプロセスにおいて、顕著なコスト削減に貢献する。これは、例えば、ある細胞型における特定の内在性核酸配列の発現を増大させようとする、マウス、ヒツジまたはウシのようなトランスジェニック動物の生産における場合である。
【００６６】
標的遺伝子領域からの非コード核酸断片５’または３’は、好ましくはレポーター遺伝子の５’側または３’側でのそのゲノムの配置に従って、ベクター内で配置される。
【００６７】
細胞内でその発現を検出することができる当業者に公知のレポーター遺伝子はすべて使用され得る。好ましくは、クロラムフェニコール(chloroamphenicol)−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコードするレポーター遺伝子が用いられる。一方、目的のタンパク質、例えばＥＰＯなどをコードするレポーター遺伝子（免疫学的方法、例えばＥＬＩＳＡによってその発現を検出することができる）を使用することも可能である。
【００６８】
好ましい実施態様においては、標的遺伝子の異なる5'または／および3'非コード核酸断片を含む少なくとも２個のベクターを、異なる細胞にそれぞれトランスフェクトし、その異なる細胞におけるレポーター遺伝子の発現を当業者に公知の方法を用いて測定する。異種発現制御配列をどこに配置すればある一定の宿主細胞に対して最適な発現を生じさせることができるかを本発明の方法を用いて容易に確立することができる。
【００６９】
本発明のさらなる局面は、ＤＨＦＲ−陰性真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、特に好ましくはヒト細胞を取得する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼに対する少なくとも１個の標的配列、
（ii）配列（ｉ）に隣接し、相同的組換えを可能にするための細胞内に内在的に存在するＤＨＦＲ核酸配列に相同であるＤＮＡ配列、ならびに
（iii）任意に正の選択マーカー遺伝子および任意に負の選択マーカー遺伝子を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトされた細胞を、ベクターの相同的組換えが生じる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする、前記方法に関する。
本発明による方法においては、前記のリコンビナーゼ標的配列および相同配列は、上記で説明したようにして選択され、使用される。
【００７０】
正の選択マーカー遺伝子は、存在する場合には、ＤＨＦＲ遺伝子と相同である配列の間に配置される。負の選択マーカー遺伝子は、存在する場合には、相同配列の外側に配置される。
【００７１】
相同的組換えがＤＨＦＲ遺伝子座で生じた後は、その細胞は機能性ＤＨＦＲタンパク質を合成することができない。この場合、ベクターの配列を、ＤＨＦＲ遺伝子のプロモーターが不活性化されるように、または／およびＤＨＦＲ遺伝子のコード配列中の挿入または欠失により機能性ＤＨＦＲタンパク質がそれ以上合成され得ないように配列することができる。
【００７２】
ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の両方を不活性化するために、まず細胞を本発明によるベクターでトランスフェクトし、次いで選択し、単離する。ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の一つはこれらの細胞中で不活性化される。すなわちそれらの細胞はＤＨＦＲ遺伝子に対してヘテロ接合性（＋／−）である。次に、これらの細胞は、第１のベクターとは異なった、好ましくは正の選択マーカー遺伝子を含む本発明によるベクターを用いて再びトランスフェクトされ得る。選択工程後、ＤＨＦＲ対立遺伝子の両方が不活性化されている細胞が得られる。一方、選択圧力を増大させることにより遺伝子変換を生じさせることができ、したがって、対立遺伝子の両方を不活性化することができる（例えば、Mortensenら, Mol. Cell. Biol. 12(1992), 2391-2395を参照されたい）。
【００７３】
本発明による方法によって、遺伝子増幅処理において使用した場合に内在性ＤＨＦＲタンパク質を合成しないという利点を有するＤＨＦＲ陰性細胞が得られる。選択工程を行ってＤＨＦＲタンパク質をコードする核酸配列に結合する異種核酸配列を増幅させる場合、内在性ＤＨＦＲ遺伝子の発現産物は干渉作用を持たないので、遺伝子増幅の効率が高まる。
【００７４】
選択可能な表現型をもたらすのに適した選択マーカー遺伝子はすべて正の選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性として使用することができる。正の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列は、好ましくは、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【００７５】
当業者に公知の負の選択マーカー遺伝子はすべて使用することができ、負の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列は、好ましくは、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）または／およびヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である。
【００７６】
リコンビナーゼ標的配列に挟まれている配列を、対応するリコンビナーゼの一過性活性化により、例えば、
（ａ）細胞を、かかる細胞内で活性である発現制御配列に機能的に結合しリコンビナーゼをコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）かかる手法でトランスフェクトされた細胞を、リコンビナーゼが発現され、活性であるような条件下で培養し、そして
（ｃ）任意に細胞を単離する
ことによって細胞のゲノムから切り出すことができる。
【００７７】
本発明による方法によれば、ＤＨＦＲ遺伝子を不活性化するだけでなく、細胞のゲノムから、リコンビナーゼ標的遺伝子配列の間に位置するＤＨＦＲ遺伝子の配列を、導入選択マーカー遺伝子と、リコンビナーゼ介在反応によって切り出すことも可能である。
【００７８】
リコンビナーゼ標的配列に挟まれている配列が正の選択マーカー遺伝子を含む場合、この配列を含む細胞は抗生物質耐性である。したがって、当業者に公知の方法によって細胞を容易に選択することができる。
【００７９】
本発明の方法によって産生されたＤＨＦＲ陰性細胞のさらなる利点は、その特性を当業者に公知の方法によって特徴づけることができ、したがって細胞をその他の方法に使用することができるということである。さらに、ＤＨＦＲ遺伝子座に導入されたリコンビナーゼ標的配列は、ゲノムへの核酸配列の部位特異的組込みを可能にする。
【００８０】
さらなる好ましい実施態様は、異種ＤＨＦＲ遺伝子を真核細胞に導入する方法において、上記の方法の一つによって得られるＤＨＦＲ陰性細胞を、
（ａ）（ｉ）任意に、好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子とは異なる正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）由来の核酸配列のそれぞれが、その5'側および3'側において少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列に隣接しており、発現可能な状態にある、タンパク質をコードする増幅される核酸配列
を含む第３のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）そのトランスフェクトされた細胞を、リコンビナーゼ標的配列に挟まれている核酸配列が細胞のゲノム内にすでに存在しているリコンビナーゼ標的配列に組み込まれるような条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする前記方法に関する。
【００８１】
正の選択マーカー遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子および所望のタンパク質をコードする標的遺伝子は、それぞれ、細胞内で活性であるか活性化することができる発現制御配列に機能的に結合されていることが好ましい。内部リボソーム結合部位(internal ribosomal binding sites)を有するポリシストロン性構築物も原則として可能である。しかしながら、標的遺伝子の増幅される核酸配列は、別個のプロモーターによって誘導されるべきである。特に好ましい発現制御配列は、ウイルスプロモーター／エンハンサーである。タンパク質の発現には、ＣＭＶプロモーターが最も好ましい。
【００８２】
異種配列の細胞のゲノムへの本発明による組み込みを部位特異的手法で行うことにより、異種配列とゲノム配列との干渉を排除することは都合がよい。したがって、このことによって不安定な産生クローンなどのさらに上記したような欠点が回避される。
【００８３】
タンパク質をコードする異種核酸配列の発現速度を増大させるために、メトトレキセートとともに公知の処理工程によって増幅工程を行うことができる。
【００８４】
本発明のさらなる主題は、
（ｉ）任意に正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、ならびに
（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）由来の核酸配列のそれぞれが、その5'側および3'側において少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列に隣接している、所望のタンパク質をコードする発現可能な状態にある核酸配列
を含むベクターである。
【００８５】
本発明のさらに別の主題は、
（ｉ）任意に正の選択マーカー遺伝子、
（ii）各場合において配列（ｉ）に隣接する少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接し、相同的組換えを可能にするための細胞内に内在的に存在するＤＨＦＲ核酸配列と相同であるＤＮＡ配列、ならびに
（iv）任意に、相同配列（iii）の外側、好ましくは3'側に位置する負の選択マーカー遺伝子
を含む、相同的組換え用のベクターである。
【００８６】
さらに、本発明は、上記の方法の一つによって得ることができる真核細胞、好ましくはヒト細胞に関する。この細胞は、
（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも１個の内在性核酸配列が不活性化され、好ましくは内在性対立遺伝子の両方が不活性化されており、そして
（ｂ）少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列がＤＨＦＲをコードする前記核酸配列の領域においてゲノムに組み込まれている
ことを特徴とする。
【００８７】
最後に、本発明のさらに別の主題は、
（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（ii）所望のタンパク質をコードする核酸配列、ならびに
（iii）少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列
を含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域にある異種核酸配列によって特徴づけられる、真核細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００８８】
本発明を、下記の実施例、図面および配列プロトコールによって説明する。
配列番号３は、ｌｏｘＰ配列を示す。
【００８９】
【実施例】
実施例１ ＣＭＶプロモーターの制御下およびＨＩＦの過剰発現下でのエリスロポエチン遺伝子の発現
ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αおよびｐＡＲＮＴ（図３を参照されたい）を遺伝子的に改変したＨｅＬａＳ３細胞にトランスフェクトした。ＥＰＯ発現を制御するＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターは、細胞内の、ＥＰＯ対立遺伝子のエリスロポエチン遺伝子（ＥＰＯ）翻訳開始部位に最も近いところに導入された。細胞は、通常、24時間、107 細胞当たり１μｇのエリスロポエチンを産生する。トランスフェクションの24時間前に、細胞を６ウェルプレート当たり６×104 細胞の濃度で継代した。トランスフェクションの当日、細胞をＤＮＡ−ＤＯＴＡＰ混合物とともにインキュベートした。混合物には、ウェル当たり、各ベクター1.25μｇ、10μｌＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim 1202375）を20mM Hepes緩衝液に最終容量が75μｌになるように加えたものが含まれていた。混合物を室温で10〜15分間プレインキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり３mlの培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、完全培地中で５日間培養した。３、４および５日目に上清100μlをそれぞれ取り出し、エリスロポエチンＥＬＩＳＡで分析した。このアッセイは５日目に完了し、細胞数を測定した。ウェル当たりのエリスロポエチンの量をその細胞数に対して計算した（図３を参照されたい）。
【００９０】
この実施例は、異種発現制御配列（ＣＭＶプロモーター）がエリスロポエチン遺伝子の対立遺伝子のプロモーター領域に導入されていてもＨＩＦによるエリスロポエチンの誘導は可能であるということを示すものである。エリスロポエチン濃度の測定値の増大は、対立遺伝子の両方における１個またはそれ以上の低酸素誘導因子の協同作用を示すものである。
【００９１】
したがって、内在性核酸配列発現を、異種発現制御配列を導入することによって増大させることができるということは明らかである。アクチベーター（ＨＩＦ）が結合性核酸配列が発現制御配列内に存在する細胞内で発現する場合、かかる遺伝子の発現はさらに増大され得る。対応する配列がこの遺伝子座に存在しない場合、それらの配列を本発明の方法により相同的組換えによってゲノム内に特異的に導入することができる。
【００９２】
実施例２ 内在性核酸配列の発現を増大させるための発現制御配列の最適化された配置
内在性遺伝子の5'側の配列は発現を刺激することができ、そして抑制特性を有するものである。異種発現制御配列をゲノムの標的遺伝子の5'側に導入する場合、発現レベルは内在性5'配列によって影響される。異種発現制御配列によって標的遺伝子の最適発現を得るためには、かかる異種発現制御配列は、その異種発現制御配列の活性が標的遺伝子の5'側にある非コード配列によって低減されないように配置されなければならない。特定の配置は、個々の配列エレメントの共同作用を得るために都合がよいであろう。異種発現制御配列の種々の配置を試験するために、すなわち、例えば標的遺伝子のコード配列の翻訳開始部位からどのくらいの距離のところに異種発現制御配列を細胞のゲノムに組み込まなければならないかを決定するために、標的遺伝子の異なる5'非コード核酸断片を有する異なるベクターを試験した（図４を参照されたい）。図４に記載されたベクターでＨｅＬａＳ３細胞をトランスフェクトし、レポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼの発現を測定した（図５を参照されたい）。
【００９３】
アッセイの24時間前に、細胞を10センチメートルペトリ皿当たり１×106 細胞の濃度で継代した。トランスフェクションの当日に、細胞をＤＮＡ−ＤＯＴＡＰ混合物とともにインキュベートした。この混合物には、各ベクター（Ａ３−１７８、Ａ３−１７７、Ａ３−１７５、Ａ３−１８１またはｐＮＡＳＳβ。図４を参照されたい）１pmolを60μｌＤＯＴＡＰ(Boehringer Mannheim 1202375)に加えて20mMＨＥＰＥＳ緩衝液で300μｌにしたものが含まれていた。この混合物を室温で10〜15分間インキュベートした。細胞をペトリ皿当たり６mlの血清を含まない培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６時間プレインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、完全培地中で22時間培養した。β−ガラクトシダーゼ発現を測定するために、細胞を200μｌＰＢＳ中で単離し、-20℃に凍結し、解凍することによって溶解させた。溶解物10μｌを基質（3.29mMクロロフェノールレッド−β−Ｄガラクトピラノシド(Boehringer Mannheim 884308)、100mM ＨＥＰＥＳ、150mM NaCl、２mM MgCl2 、１％ＢＳＡ、0.1％Triton-X100、１％アジ化ナトリウム、pH７）で１：１０に希釈した。試料を１：２段階に希釈して、暗赤色に発色するまで96ウェルプレート中で37℃にてインキュベートした。次いで、試料を570／580nm、または550nmで測定した。
【００９４】
図５に示したように、レポーター遺伝子の発現は、ベクターＡ３−１７８でトランスフェクトされた細胞中で最も高かった。このベクターにおいては、異種発現制御配列はコード配列の翻訳開始部位に近接している。
【００９５】
したがって、この方法を用いることにより、内在性標的遺伝子の最適発現を得るためには宿主細胞のゲノム内の異種発現制御配列のいずれの配置を選択しなければならないかを簡単且つ迅速に決定することができる。
【００９６】
実施例３ ＤＨＦＲ陰性細胞の産生
第１の工程では、本発明による組換え用ベクターを調製した。第２の工程ではこれらのベクターでヒト細胞系をトランスフェクトし、相同的組換えイベントをスクリーニングした。この方法では、最初にＤＨＦＲ遺伝子の一つの対立遺伝子を不活性化することができ、次いで第２の対立遺伝子を不活性化することができた。
【００９７】
相同的組換え用のＤＨＦＲベクター
ヒトＤＨＦＲ遺伝子は染色体５に位置しており、６個のエキソンに分かれた30kbを含む。プロモーターの一部、エキソン２の一部およびエキソン１全体を含む1.8kbのEcoRI断片を用いて相同的組換え用ベクターを調製した。エキソン１をApaI消化により除去し、生じたギャップ（0.45kb）にリンカーを介してＮｅｏ（1.4kb）またはＨｙｇ（2.2kb）耐性遺伝子を挿入した。これらのリンカーには、アダプター(adaptor)ヌクレオチドに加えて最小配列TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA（ｌｏｘＰ配列）が含まれている。このリンカー配列は同じ向きに配列され、耐性遺伝子は好ましくはＤＨＦＲ遺伝子に対してアンチセンスである。耐性遺伝子が挿入された後、相同領域は伸びた。このため、ベクターを3'領域由来のEcoRI断片（6.0kb）によって伸長させた（図６）。この方法では、本発明による標的構築物ｐＮＤＩ（11.5kb）およびｐＨＤＩ（12.3kb）が得られた。
【００９８】
相同的組換えが完了した後、エキソン１全体（アミノ酸１〜28）およびＤＨＦＲ遺伝子のプロモーターの一部が除去されていた。細胞は、もはや機能的ＤＨＦＲタンパク質を発現することはできない。
【００９９】
細胞のトランスフェクション
使用されるヒト細胞系は、染色体５について倍数体である必要はなく、ＭＴＸ選択下で維持されている必要はない。いずれの場合においても、２以上の対立遺伝子が不活性化されなければならない。
【０１００】
ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ ATCC CCL-2.2 ）
細胞を、組織培養フラスコ内、ＲＰＭＩ１６４０培地、10％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミンおよび１mM ＭＥＭ（非必須アミノ酸）中で培養した。インキュベーションを37℃、５％ＣＯ2 で行った。エレクトロポレーション緩衝液には20mM Ｈｅｐｅｓ、138mM NaCl、５mM KCl、0.7mM Na2HPO4 、６mM Ｄ−グルコース一水和物、pH 7.0が含まれていた。10μｇの線状化ベクターＤＮＡ（ｐＮＤＩ）を１×107 細胞に960μＦおよび250Ｖでエレクトロポレーションした（Biorad Gene Pulser）。エレクトロポレーション後、600μg/ml Ｇ４１８（ジェネティシン(geneticin) Boehringer Mannheim）を含む培地中に細胞を回収して培養した。10日間選択を行った後（培地は２日毎に交換する）、陽性クローンを単離して拡大増殖させた。
【０１０１】
ＨＴ１０８０細胞（ ATCC CCL-121 ）
細胞を、ＨｅＬａ Ｓ３細胞について記載したようにして10％ウシ胎児血清、２mMＬ−グルタミンおよび１mM ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地を用いて培養し、選択した。
【０１０２】
Ｎａｍａｌｗａ細胞（ ATCC CRL-1432 ）
この細胞系は懸濁細胞系であり、それに対応して培養しなければならない。この培地は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞について記載したものと一致する。トランスフェクション後、細胞を40個の96-ウェルプレートに分配した。陽性クローンを48−、24−、12−および６−ウェルプレートで拡大増殖させた。１mg/ml Ｇ４１８を用いて選択を行った。
【０１０３】
ＤＨＦＲ陰性（＋／−）細胞の検出
ベクターの挿入をサザンブロット分析またはＰＣＲによって検出した。相同的組換えが正しく生じている場合、EcoRI消化後、Ｎｅｏ遺伝子の挿入によって形成された2.9kbのバンドならびに無傷ＤＨＦＲ遺伝子に該当する1.8kbのバンドが検出された（図７ｃ）。混合クローン（サザンブロットにおいてはバンド強度の比が同等でない）をＦＡＣＳにおける単細胞沈着(single cell deposition)によって分離し、サブクローニンングし、続いて拡大増殖させた。陽性として同定されたクローン中ではＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の一つが不活性化されていた。
【０１０４】
ＤＨＦＲ陰性（−／−）細胞の産生
ＤＨＦＲ対立遺伝子（＋／−）が不活性化されている細胞クローンは、新たな相同的組換えを行うことができる。この目的のために、細胞クローンを上記のようにしてベクターｐＨＤＩの線状化ＤＮＡ10μｇを用いてトランスフェクトした。選択は、ハイグロマイシンＢ（Boehringer Mannheim）500μg/mlを含む培地中で行った。
【０１０５】
培地中のＧ４１８の濃度が高くなると、ＤＨＦＲ+/- 細胞における選択圧力が増大し、ＤＨＦＲ-/- 細胞が得られた。遺伝子変換によって第２のＤＨＦＲ対立遺伝子が活性化される原因となる染色体内組換えが生じた。
ＤＨＦＲ-/- 細胞には２個の不活性化ＤＨＦＲ対立遺伝子が含まれており、もはやテトラヒドロ葉酸を合成することはできない。したがって、チミジン、グリシンおよびプリンを培地に加えなければならない（補足）。任意に細胞をα- 培地（Gibco BRL）で培養した。
【０１０６】
ＤＨＦＲ-/- 細胞を、上記のようにして検出した。ホモ接合性ＤＨＦＲ陰性細胞では野生型バンド（1.8kb）が検出可能であった。ｐＤＨＩでトランスフェクトした細胞は、相同的組換え後、EcoRIサザンブロットにおいて新たな3.7kbのバンドを示した（図７ｃ）。
【０１０７】
ＤＨＦＲ陰性細胞（−／−）の使用
本発明による細胞をタンパク質の大量生産に使用することができる。この目的のために、本発明によるベクター（図８）およびＣｒｅリコンビナーゼをコードする発現ベクターでＤＨＦＲ-/- 細胞をトランスフェクトした。ＣｒｅリコンビナーゼによってＤＨＦＲ遺伝子座から抗生物質耐性が除かれ、本発明によるベクターがＤＨＦＲ-/- 細胞のゲノムのｌｏｘＰ配列に組み込まれた。細胞は再び抗生物質感受性になり、チミジン、グリシンおよびプリン補足から独立した。
【０１０８】
補足なしの培地を用いることによって、または培養培地に適当な抗生物質を加えることによって選択を行うことができる。この場合、抗生物質は、細胞のゲノムからＣｒｅリコンビナーゼによって除去された耐性遺伝子に対応するものである。ｌｏｘＰ配列に組み込まれたベクターが正の選択マーカー遺伝子を含む場合には、この抗生物質を培地に添加することによって選択を行うことができる。
【０１０９】
遺伝子増幅による産生量の増大
細胞の組換えタンパク質の産生量を増大させるために、細胞に導入されたＤＨＦＲ遺伝子および異種タンパク質をコードする異種核酸配列を増幅するメトトレキセート（ＭＴＸ）選択を行った。
増幅を行うために、細胞をＭＴＸの濃度を上昇させながら（100〜1000mM）培養した。増幅の程度は、比較(comparative)サザンブロットのデンシトメーター評価(densitometric evaluation)によって監視した（ＭＴＸ添加前、添加中および添加後に行った）。
増幅工程後に得られた本発明による細胞には、ｌｏｘＰ遺伝子座に導入ＤＨＦＲ遺伝子および挿入異種核酸配列の多数のコピーが含まれていた。これらの細胞は、異種核酸の高産生量を特徴とする。
【０１１０】
本発明の好ましい実施態様を説明の一部として下記に示す。
１．真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の核酸部分と相同であるＤＮＡ配列
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、該ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする前記方法。
【０１１１】
２．リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘＰ配列を使用する、１項に記載の方法。
３．細胞がヒト細胞である、１項または２項に記載の方法。
４．細胞が不死化細胞である、１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
５．細胞がＨＴ１０８０細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞またはＨｅＬａ Ｓ３細胞である、４項に記載の方法。
【０１１２】
６．異種発現制御配列が、プロモーター／エンハンサー、好ましくはウイルスプロモーター、特に好ましくはＣＭＶプロモーターを含む、１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
７．異種発現制御配列が3'−非コード配列を含む、１〜６項のいずれか１項に記載の方法。
８．異種配列を、内在する核酸配列の内在性発現制御配列が相同的組換えによって除去されるように選択する、１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【０１１３】
９．正の選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシン(geneticin)、またはハイグロマイシン耐性遺伝子である、１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記ベクターが、１項（ａ）（iv）に記載の相同配列の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子をさらに含有する、１〜９項のいずれか１項に記載の方法。
１１．リコンビナーゼ標的配列間に位置する核酸配列を、該標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼの一時的な活性化により細胞のゲノムから切り出す、１〜１０項のいずれか１項に記載の方法。
【０１１４】
１２．（ａ）細胞を、
（ｉ）第２の異種発現制御配列および第２の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子と異なる、正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、
を含むさらなるベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、標的配列により挟まれている配列が細胞のゲノム内の標的配列に組み込まれる条件下で培養し、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離し、そして
（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を、各場合において異なる発現制御配列および／または増幅遺伝子を用いて少なくとも１回繰り返す
ことを特徴とする、１項に記載の方法。
【０１１５】
１３．相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および
（ｖ）場合により、負の選択マーカー遺伝子
を含む前記ベクター。
【０１１６】
１４．（ｉ）異種発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、
（iv）場合により、負の選択マーカー遺伝子
を含むベクター。
【０１１７】
１５．１〜１２項のいずれか１項に記載された方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細胞。
１６．（ａ）真核細胞中に内在する核酸配列と機能的に結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの染色体位置が定められた配列を含有し、そして
（ｂ）この配列がリコンビナーゼ標的配列により挟まれている、
真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１１８】
１７．真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）アクチベータータンパク質を結合する、少なくとも１つの核酸配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする、前記方法。
【０１１９】
１８．少なくとも１つの低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）結合性核酸配列を使用する、１７項に記載の方法。
１９．ＨＩＦ−結合性核酸配列を、配列番号１による53bpの配列、配列番号２による43bpの配列、これらの配列と相同である配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズする配列から選択する、１８項に記載の方法。
【０１２０】
２０．さらに、細胞を
（ｉ）この細胞の活性発現制御配列に機能的に結合している、アクチベータータンパク質をコードする核酸配列、および
（ii）場合により、正の選択マーカー遺伝子
を含むベクターでトランスフェクトすることを含む、１７〜１９項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２１】
２１．アクチベータータンパク質が、ＨＩＦ−１αタンパク質および／またはＨＩＦ−１βタンパク質である、２０項に記載の方法。
２２．細胞を0.1〜２％のＯ2濃度で培養する、１８〜２１項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２２】
２３．相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少なくとも１つの核酸配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含む前記ベクター。
【０１２３】
２４．１７〜２１項のいずれか１項に記載の方法により得られる、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
２５．真核細胞中に内在する遺伝子と機能的に結合している、アクチベータータンパク質／アクチベータータンパク質複合体を結合する、少なくとも１つの異種の染色体位置が定められた核酸断片を含有する、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１２４】
２６．真核細胞中に内在する標的遺伝子の領域からの非コード核酸配列の、その標的遺伝子発現に及ぼす影響を試験する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞内で活性であるか、または活性化することができる異種発現制御配列、および
（ii）標的遺伝子の領域からの5'側および／または3'側の非コード核酸断片、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）前記細胞を、発現制御配列が活性である条件下で培養し、そして
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する、
ことを特徴とする、前記方法。
【０１２５】
２７．レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコードするものである、２６項に記載の方法。
２８．（ａ）互いに異なる標的遺伝子の5'および／または3'非コード核酸断片を含む少なくとも２個のベクターで、それぞれ異なる細胞をトランスフェクトし、そして
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を異なる細胞において測定する
ことを特徴とする、２６項または２７項に記載の方法。
【０１２６】
２９．ＤＨＦＲ陰性真核細胞を作製する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的配列、
（ii）相同的組換えが可能であるように細胞中に内在するＤＨＦＲ核酸配列に相同である、配列（ｉ）に隣接するＤＮＡ配列、および
（iii）場合により、正の選択マーカー遺伝子、および場合により、負の選択マーカー遺伝子、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする前記方法。
【０１２７】
３０．リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘＰ配列を使用する、２９項に記載の方法。
３１．正の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列が、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子である、２９項または３０項に記載の方法。
【０１２８】
３２．負の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および／またはヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である、２９〜３１項のいずれか１項に記載の方法。
３３．リコンビナーゼ標的遺伝子により挟まれている配列を、対応するリコンビナーゼの一時的な活性化によって細胞のゲノムから切り出す、２９〜３２項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２９】
３４．異種ＤＨＦＲ遺伝子を真核細胞中に導入する方法であって、
（ａ）３３項に記載の方法により得られた細胞を、
（ｉ）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子と異なる、場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）からの核酸配列のそれぞれが、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接する、発現可能な形態でタンパク質をコードする増幅すべき核酸配列、
を含む第３のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、リコンビナーゼ標的配列に隣接する核酸配列が、細胞のゲノムに既に存在するリコンビナーゼ標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする、前記方法。
【０１３０】
３５．（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、および
（iii）目的のタンパク質をコードする、発現可能な形態の核酸配列
を含み、ここで、部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）からの各核酸配列は、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接する、ベクター。
【０１３１】
３６．相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）それぞれの場合に配列（ｉ）に隣接する、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列
（iii）相同的組換えが可能であるように、細胞に内在するＤＨＦＲ核酸配列相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、および
（iv）相同配列（iii）の外側の、場合により、負の選択マーカー遺伝子、
を含む、前記ベクター。
【０１３２】
３７．２９〜３４項のいずれか１項に記載の方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細胞。
３８．（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも１つの内在性核酸配列が不活性化されており、そして
（ｂ）ＤＨＦＲをコードするこの核酸配列の領域のゲノム中に、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列が組み込まれている、
真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１３３】
３９．（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（ii）目的のタンパク質をコードする核酸配列、および
（iii）少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列
を含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域内の異種核酸配列を特徴とする、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、第１のベクターとして使用される相同的組換え用のベクターを示すものである。ＨＲ：相同配列、Ｓｅｑ１：第１の異種発現制御配列、Ｒ１：正の選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有するｌｏｘＰ配列。
（Ｂ）は、ゲノム配列を示すものであり、
（ａ）は相同的組換えの完了後のものであり、
（ｂ）はＣｒｅリコンビナーゼによって触媒されたｌｏｘＰ配列に挟まれた配列の除去後のものである。
（Ｃ）は、ｌｏｘＰ配列の間に位置する配列を含むＣｒｅリコンビナーゼ介在組込み用のベクターを示すものであり、
（ｃ）は、第２のベクターのｌｏｘＰ配列における組込み後のゲノム配列を示すものである。Ｒ２：任意にＲ１とは異なる正の選択マーカー遺伝子、Ｓｅｑ２：第２の異種発現制御配列。
【図２】（Ａ）は、相同的組換え用のベクターを示すものである。ＨＲ：相同配列、Ｒ−ボックス：正のおよび任意に負の選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有するｌｏｘＰ配列、ＨＳＶ−ｔｋ：単純ヘルペスチミジンキナーゼ。
（Ｂ）は、片側だけに相同配列を有する相同的組換え用ベクターを示すものである。
【図３】図３は、ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αおよびｐＡＲＮＴ（ｐＨＩＦ−１β）でトランスフェクトされたＨｅＬａＳ３細胞のＣＭＶプロモーター／ＨＩＦ−制御エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を示すものであり、そのＥＰＯ発現は、トランスフェクションの３、４および５日後に細胞上清において測定されたものである（エリスロポエチン濃度をμg/mlで示す）。
ｐＨＹＧ：制御ベクター、ｐＨＩＦ−１α：ＳＲαプロモーターの制御下にあるＨＩＦ−１αｃＤＮＡ、ｐＡＲＮＴ：ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＨＩＦ−βｃＤＮＡ。
【図４】図４は、それぞれ、ＣＭＶプロモーター（Ｃ）およびレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ（Ｂ）を含み、これらの配列の間には、異なる長さの標的遺伝子（Ｓ）の非コード核酸断片が挿入されている、４種の異なるベクターを示すものである。非コード核酸断片の長さは、ベクターＡ３−１７８では０kbであり、ベクターＡ３−１７７では2.5kbであり、ベクターＡ３−１７５では3.7kbであり、ベクターＡ３−１８１では5.7kbである。制御ベクターｐＮＡＳＳβは、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼを含むが、ＣＭＶプロモーターを含まない。
【図５】図５は、一連の希釈（１：２〜１：１２８）における、ＨｅＬａＳ３細胞を図４のベクターでトランスフェクトした後のレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの発現の測定を示すものである。
【図６】（Ａ）は、ＤＨＦＲ遺伝子座における相同的組換え用のベクターｐＮＤＩを示すものである。正の選択マーカー遺伝子（Ｎｅｏ）には２個のｌｏｘＰ配列に挟まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相同の配列（5'、3'ＤＨＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列の5'側と他方のｌｏｘＰ配列の3'側に位置している。
（Ｂ）は、ＤＨＦＲ遺伝子座における相同的組換え用のベクターｐＨＤＩを示すものである。正の選択マーカー遺伝子（Ｈｙｇ）には２個のｌｏｘＰ配列に挟まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相同の配列（5'、3'ＤＨＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列の5'側と他方のｌｏｘＰ配列の3'側に位置している。
【図７】（Ａ）は、エキソン１、エキソン２およびエキソン３ならびにそれらの間に位置するイントロンを有するＤＨＦＲ遺伝子のゲノム構築物を示すものである。
（Ｂ）は、図６のベクターに対応する標的構築物の概略を示すものである。
（Ｃ）は、ＤＨＦＲ遺伝子における相同的組換え用のベクターの相同的組換えが完了した後のゲノム構成を示すものである。ベクターｐＮＤＩを使用した場合、EcoRI切断部位間の距離は2.9kbであり、ベクターｐＨＤＩを使用した場合3.7kbである。Ｎｅｏ：ネオマイシン、Ｈｙｇ：ハイグロマイシン、kb：キロベース。
【図８】図８は、それぞれ調節配列を含み、２個のｌｏｘＰ配列に挟まれているタンパク質Ｘをコードする核酸配列およびＤＨＦＲタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを示すものである。このベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼが触媒するｌｏｘＰ配列におけるゲノムへの組込みに使用することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞における遺伝子発現を最適化するための方法に関する。第１の面では、相同的組換えによって異種発現制御配列および／または増幅遺伝子を細胞のゲノムに導入することによる、真核細胞中に内在する標的遺伝子の発現を変化させる方法に関し、また、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される挿入外来ＤＮＡの切除、および他の異種発現制御配列および／または増幅遺伝子によるその置換に関する。本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させるための、相同的組換えによる、アクチベータータンパク質またはアクチベータータンパク質複合体（例えば、低酸素症誘導因子（ＨＩＦ））が結合する１または数個の核酸配列の、真核細胞のゲノムへの導入に関する。さらに本発明は、レポーター遺伝子の発現を測定することによる、標的遺伝子の発現に及ぼす５’側または３’側の非コード核酸断片の影響を試験するための方法に関する。さらに本発明は、リコンビナーゼ標的配列を含有するＤＨＦＲ陰性真核細胞の作製方法、およびリコンビナーゼ標的配列中に挿入された核酸配列の発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞における遺伝子発現は、例えば、いわゆるハウスキーピング遺伝子では構成的に起こっており、また、調節することができる。調節された発現は、細胞の特定の発達段階で発現されたり、環境条件に変化があるときにのみ発現される遺伝子の場合に、特に必要である。
【０００３】
発現はコード核酸配列と機能的に結合しているプロモーターにより転写レベルで調節され、プロモーターの活性はリプレッサーおよびアクチベーターにより制御することができる。遺伝子の非コード核酸配列へのリプレッサーまたはアクチベーターの結合は、プロモーターの活性を低下または増大させうる（L. Stryer, Biochemie, Chapter 12, "Spektrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft", Heidelberg, 1990）。細胞に含まれるリプレッサーまたはアクチベーターの量は、例えば環境条件のような要因により調節される。低酸素誘導因子（hypoxia-inducible factor：ＨＩＦ）は、Ｏ2 供給の減少により誘導されるアクチベーターの一例であり、エリトロポエチン遺伝子の発現を増加させる（Blanchard K.L.ら, 「ヒトエリトロポエチン遺伝子の低酸素誘導：それぞれステロイド受容体応答要素を含有するプロモーターとエンハンサーとの協力」, (1992), Mol. Cell. Biol. 12, 5373-5385；Wang G.L. and Semenza G.L., 「低酸素誘導因子１の特性決定および低酸素によるＤＮＡ結合活性の調節」, (1993), J. Biol. Chem., 268, 21513-21518；Wang G.L.ら, 「低酸素誘導因子１は細胞内Ｏ2 圧により調節される塩基性-ヘリックス-ループ-ヘリックス-ＰＡヘテロ二量体である」, (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514）。
【０００４】
さらに、タンパク質の発現量はｍＲＮＡの安定性に依存する。ｍＲＮＡの安定性に影響し、そのため発現レベルに影響するｍＲＮＡ分解酵素の認識配列がｍＲＮＡの３’領域に位置する（Shaw G. and Kamen, R.,「GM-CSH mRNAの3'非翻訳領域からの保存AU配列は選択的mRNA分解を媒介する」, Cell (1986), 659-667）。これに関連して、ｍＲＮＡの半減期は発現されたタンパク質の量に相関する。
発現調節の第３のレベルは翻訳である。
【０００５】
このため遺伝子の発現は、個々のケースで大きく異なる複雑な調節機構を受ける。
【０００６】
タンパク質は、発現調節に関する知識を利用する組換えＤＮＡ法により取得することができる（Sambrookら, 1989, 「分子クローニング、実験室マニュアル」, Cold Spring Harbor）。そのために、適切なプロモーターと、さらにはタンパク質の発現およびベクターの複製に必要な追加の配列の制御下に、対応するタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが使用される。次に既知の方法によりベクターを宿主細胞中に導入し、細胞を培養して、組換えタンパク質を細胞または培地から単離することができる。
【０００７】
原核または真核細胞を宿主細胞として使用することができる。原核細胞、特に大腸菌（E. coli）細胞は取扱いには問題がないが、組換えにより真核細胞タンパク質を発現させるときには多くの難点を抱えている。
【０００８】
原核および真核細胞は、発現プロセシング経路、細胞の培地条件、およびタンパク質プロセシングに関与するシャペロンにおいて異なっている。このため原核細胞で産生された真核細胞タンパク質は、対応する天然タンパク質とは決定的に異なることもある。
【０００９】
例えばタンパク質の折りたたみパターンおよびタンパク質の活性が改変されるかもしれない。また、原核宿主細胞のタンパク質は通常グリコシル化されない。しかし正しいグリコシル化パターンは、例えば薬剤の処方のためのタンパク質の産生では、多くの場合に有効性および寛容性にとってきわめて重大な特徴である。
【００１０】
したがってグリコシル化タンパク質は、真核宿主細胞または細胞系、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、により産生される。真核細胞の使用にもかかわらず、例えば非ヒト細胞においてヒトタンパク質を発現させるとき、種差のために組換え産生されたタンパク質に変化が生じることがあり、この方法が多くの用途に不適切であるのはこのためである。
【００１１】
タンパク質の組換え生産のために、宿主細胞は、発現ベクターで一時的にまたは安定にトランスフェクトされるが、特に大規模生産方法のためには安定にトランスフェクトされた細胞が使用される。
【００１２】
宿主細胞のゲノム中に発現ベクター配列が特異的でなくランダムに組み込まれると、低い産生能力の細胞ができるか、または細胞が不安定な性質になりうる。例えば、産生量が産生プロセスの過程で低下したり、組換えタンパク質を発現する細胞の能力が完全に消失したりする。
【００１３】
遺伝子発現を増大させる１つの方法は遺伝子増幅であり、この場合はタンパク質をコードする核酸配列を増幅遺伝子に結合させる。両方の配列の増加は、発現の増大をもたらす選択工程により達成される（Schimke, R.T.(編) (1982), 「遺伝子増幅」, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY）。
【００１４】
例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする核酸を増幅遺伝子として使用することができる（Kaufmann R.J., Sharp P.A. (1982), 「１モジュールのジヒドロ葉酸レダクターゼ相補ＤＮＡ遺伝子で同時トランスフェクションした配列の増幅と発現」, J. Mol. Biol. 159:601 ff）。
【００１５】
メトトレキセートを用いて行われる選択工程により、メトトレキセートに耐性であって、かつゲノム中に２０〜５０倍増幅されたＤＨＦＲコード核酸配列およびこれに結合した核酸配列を含有する細胞が入手できる（R. Knippers, 1982, "Molekulare Genetik", Thieme, Stuttgart）。
【００１６】
このような遺伝子増幅法は、ＤＨＲＦ陰性細胞で最も有効に行われる。JP-62265992 は、例えばヒトＤＨＦＲ陰性細胞を記載している。しかしこの特許は、この細胞におけるこれらの配列の相同的組換えと増幅による発現ベクターの部位特異的組込みには言及していない。
【００１７】
遺伝子増幅プロセスを行うときでさえ、細胞の不安定性のような上述の難点は、細胞のゲノム中への発現ベクターのランダムな組込みにより起こりうる。
【００１８】
上述の難点は、内在性遺伝子活性化をもたらす相同的組換えにより、選択された遺伝子座に外来ＤＮＡを部位特異的に組み込むときにのみ回避することができる。対応する方法は知られており、遺伝子ターゲッティングと呼ばれる（WO 90/11354；WO 91/09955）。このプロセスにおいて、細胞は、この細胞のゲノム中にベクターを組み込もうとする遺伝子座に相同な核酸配列により挟まれた、正の選択マーカー遺伝子を含有するベクターでトランスフェクトされる。相同な核酸配列の間に、細胞中の標的遺伝子の発現を増大させるための異種発現制御配列と、場合により標的遺伝子のコピー数を増加させるための増幅遺伝子がさらに存在する。
【００１９】
既知の遺伝子ターゲッティング法の難点は、商業目的にかなう量と質で目的タンパク質の産生を可能にする性質の細胞を作製することが、多くの場合非常に厄介であるということである。特に、目的の標的タンパク質の発現に最適な発現制御配列および／または増幅遺伝子の選択には、目的の組換え現象が起こっているクローンを単離するための複雑な手順のために、極めて時間のかかる、非常に多くの一連の相同的組換え実験がしばしば必要となる。
【００２０】
相同的組換えはまた、タンパク質機能の研究を行うために細胞内のある遺伝子の発現をスイッチオフするのにも使用することができる。このために、試験しようとするタンパク質をコードする遺伝子が、胚性幹細胞内で相同的組換えによりスイッチオフされている、ノックアウトマウスが作り出されている。さらなるプロセスの工程を実施後、この遺伝子の両方の対立遺伝子の不活化のために、その発生の開始時点からある機能性タンパク質を発現することができないマウスが得られる（Thomas, K.R., Capecchi M.R., (1987),「マウス胚由来幹細胞における遺伝子ターゲッティングによる部位特異的突然変異誘発法」, Cell 51:503-512）。
【００２１】
Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を使用して、組織特異的かつ時間特異的にある遺伝子をスイッチオフして、これを試験することができる。この目的のためには、２つのｌｏｘＰ配列により挟まれた核酸断片を細胞のゲノムに相同的組換えにより導入し、次に細胞内で発現されるＣｒｅリコンビナーゼによりゲノムから再度切断することができる（Sauer B, Henderson N (1989):「哺乳動物細胞のゲノム中に入れたｌｏｘＰ部位での部位特異的ＤＮＡ組換え」, Nuc Acid Res 17:147-161；Sauer B., Henderson N. (1990),「Ｃｒｅリコンビナーゼによる真核細胞ゲノム中への外因性ＤＮＡの標的化された挿入」, New Biol. 5:441-449）。先行技術は、内在性遺伝子の発現を変化させるために真核細胞ゲノム中に発現制御配列または増幅遺伝子を部位特異的に組み込むための、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系または別の部位特異的リコンビナーゼ系の使用には全く言及していない。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、少なくとも部分的に先行技術の難点を排除する、相同的組換えによる内在性遺伝子活性化を最適化するための新しい方法を提供することであった。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本目的は、真核細胞の遺伝子の発現量の最適化をかなり単純化する新しい方法およびベクター構築物を提供することにより達成される。本発明の第１の面は、真核細胞に内在する核酸配列の発現を変化させる方法に関し、この方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする。
【００２４】
異種発現制御配列および／または増幅遺伝子と機能的に結合している内在性遺伝子を有する細胞が、本発明の方法により提供され、そしてこれらの配列は、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）の標的配列により挟まれている。この細胞は、部位特異的リコンビナーゼの標的配列の存在により、第２の異種発現制御配列および／または第２の増幅遺伝子による第１の異種発現制御配列および／または第１の増幅遺伝子の単純な置換が可能になるため、標的遺伝子の発現の最適化に関する研究に非常に適している。
【００２５】
本発明の「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、インテグラーゼまたはリゾルベースインベルターゼクラスの部位特異的リコンビナーゼを含む、特異的ＤＮＡ標的配列上のＤＮＡ再配列（Starkら, Trends Genet. 8 (1992), 432-439；AbremskiとHoess, Protein Engineering 5 (1992), 87-91；Khanら, Nucleic Acids Res. 19 (1991), 851-860）、およびイントロンがコードするエンドヌクレアーゼにより媒介される部位特異的組換え（Perrinら, EMBO J. 12 (1993), 2939-2947）を媒介するタンパク質およびタンパク質複合体を包含する。好ましいリコンビナーゼタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の２μエピソームのＦＬＰリコンビナーゼ（例えば、Falcoら, Cell 29 (1982), 573-584；Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 4223-4227；Konsolakiら, New Biologist 4 (1992), 551-557）、大腸菌（E. coli）ファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼ（例えば、SauerとHenderson (1989)上掲）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）プラスミドｐＳＲ１からのＲリコンビナーゼ（Matsuzakiら, J. Bacteriol. 172 (1990), 610-618）、クライベロミセス・ドロソフィラリウム（Kluyveromyces drosophilarium）プラスミドｐＫＤ１からのＡリコンビナーゼ（Chenら, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 4471-4481）、クライベロミセス・ワルティー（Kluyveromyces waltii）プラスミドｐＫＷ１からのＡリコンビナーゼ（Chenら, J. Gen. Microbiol. 138 (1992), 337-345）、λ−ｉｎｔ組換え系の成分（Landy, Annu Rev. Biochem. 5 (1989), 913-949）およびファージμのジン(gin)組換え系の成分（Klippelら, EMBO J. 12 (1993), 1047-1057）よりなる群から選択される。さらに、部位特異的リコンビナーゼおよび核内受容体またはそのリガンド結合ドメインから構成される、ヨーロッパ特許EP-B-0 707 599に記載される融合タンパク質も適している。Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列、すなわちｌｏｘＰ配列は、本発明の方法のために特に好ましく使用される。
【００２６】
異種遺伝子の部位非特異的組込みによるタンパク質の組換え産生、およびそれに関連する不都合とは対照的に、本発明の方法では、相同的組換えによる部位特異的内在性遺伝子活性化の利点を利用する。
【００２７】
異種発現制御配列と増幅遺伝子との適切な組合せの単純化された選択により、安定した特性を有する最適化産生クローンが、その構造と活性に関して実質的に未変性タンパク質に対応するタンパク質の産生を可能にする高い確率で得られる。
【００２８】
異種発現制御配列、増幅遺伝子、正の選択マーカー遺伝子およびリコンビナーゼ標的配列に隣接する適切な相同配列の選択は、好ましくはWO 90/11354およびWO 91/09955に記載される方法により行われる。
【００２９】
さらに、相同配列はまた、例えば点突然変異のような、発現されるタンパク質中の突然変異、個々のアミノ酸または全アミノ酸部分の挿入および／または欠失をもたらす修飾を含んでいるかもしれない。
【００３０】
したがって本発明の方法により、内在性核酸配列の発現レベルを単一プロセス工程で変化させることができるだけでなく、同時に内在性核酸配列のコード領域中への突然変異の導入をも可能にする。このため本発明の方法は、薬剤応用のためのタンパク質の産生に特に有利である。このようなタンパク質は、タンパク質の効力を増大させる突然変異を除けば、未変性タンパク質に比較してさらなる改変は含まない。
【００３１】
本発明では、任意の真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、特に好ましくはヒト細胞を使用することができる。本発明の方法は、非不死化細胞（例えば、繊維芽細胞）を用いて行うことができ、また不死化細胞（例えば、腫瘍細胞株）を用いても行うことができる。不死化細胞が好ましい。
【００３２】
本発明の方法を実施するために使用される溶液および培地は、好ましくは各プロセス工程において最適な条件となるように選択される。細胞は、適切な細胞増殖に必要な全ての物質を含有し、かつ場合により緩衝化されている培地を使用して培養する。無血清培地で培養することができる細胞を使用するのが好ましい。使用される細胞は、特に好ましくはナマルワ（Namalwa）、ＨＴ１０８０またはＨｅＬａＳ３細胞である。
【００３３】
本発明の方法によって、最適な発現制御配列、最適な増幅遺伝子の選択により、および／または発現制御配列と増幅遺伝子との最適な組合せの選択により、細胞に内在する核酸配列、すなわち標的遺伝子の発現の最適化が可能になる。
【００３４】
細胞のゲノム中への組込み後の標的遺伝子の発現に影響を及ぼす異種発現制御配列として、任意の核酸配列を使用することができる。これは、転写開始因子またはＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相互作用することができる核酸配列、および転写に及ぼす影響がアクチベーターまたはリプレッサーとの相互作用により媒介される核酸配列を含む。異種発現制御配列は、好ましくはプロモーター／エンハンサー、特に好ましくはウイルスプロモーターおよび最も好ましくはＣＭＶプロモーターを含有する。
【００３５】
異種発現制御配列はまた、３’非コード配列を含む。３’非コード配列は、ｍＲＮＡに安定化または不安定化作用を及ぼし、このためその半減期を延長または短縮させることができる。ｍＲＮＡを安定化させる配列の導入により、ｍＲＮＡの半減期を延長させて、そのコードするタンパク質の収量を増大させることができる。
【００３６】
好適な実施態様において、標的遺伝子の内在性発現制御配列は、相同的組換えにより除去される。これは、内在性配列がリプレッサー結合配列を含有するときには、特に有利である。発現はまた、ｍＲＮＡに不安定化作用を及ぼした結果、翻訳されるタンパク質の量を低下させる３’非コード配列によっても減少させることができる。
【００３７】
さらに本発明の方法により、最適な増幅遺伝子の選択が可能になる。増幅遺伝子を、好ましくは発現可能な形態で、すなわち、適切なプロモーターと機能的に結合させて使用し、真核細胞のゲノム中へのベクターの相同的組み込み後、標的遺伝子の近くに位置するように、ベクター内に配置する。増幅工程を行うと、細胞内の標的遺伝子のコピー数が増大する。この結果、内在性核酸配列の発現をさらに増大させることができる。適切な増幅遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼまたはこれらの遺伝子のムテイン(muteins)がある。増幅遺伝子は、好ましくはＤＨＦＲ遺伝子またはその突然変異した形態（Simonsenら, Nucleic Acids Res. 1988, 16 (5): 2235-2246）、特に内在性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する細胞内のこれらである。
【００３８】
例えば、抗生物質耐性のような選択可能な表現型をもたらす、真核細胞のための任意の適切な耐性遺伝子を正の選択マーカーとして使用することができる。正の選択マーカー遺伝子は、好ましくは、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシン（geneticin）またはハイグロマイシン耐性遺伝子である。正の選択マーカー遺伝子は、好ましくは発現可能な形態、すなわち、適切なプロモーターと機能的に結合させて使用する。
【００３９】
負の選択マーカー遺伝子を使用する場合、正の選択工程にさらに第２の負の選択工程を通常行う。これの有利な点は、選択工程の実施後、同定されるクローンに含まれる擬陽性(false-positive)クローン（すなわち、ゲノムにランダムに組み込まれるベクター）の割合が低いことである。負の選択マーカー遺伝子は、好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および／またはヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である。
【００４０】
部位特異的リコンビナーゼの標的配列が存在する結果として、部位特異的リコンビナーゼを使用して、細胞のゲノムから、これらの配列の間に位置する核酸配列を切り出すことが可能となる。標的配列の間に位置する核酸配列は、好ましくは細胞内の対応するリコンビナーゼの一時的な活性化により、ゲノムから切断される。このリコンビナーゼの一時的な活性化は、例えば、
（ａ）細胞を、細胞内で活性であるか、または活性化することができる発現制御配列と機能的に結合している、リコンビナーゼをコードする核酸配列を含有する第２のベクターでトランスフェクトし、そして
（ｂ）このようにトランスフェクトした細胞を、リコンビナーゼが発現され、かつ活性である条件下で培養し、そして
（ｃ）場合により前記細胞を単離する、
ことにより行うことができる。
【００４１】
リコンビナーゼ／核内受容体融合タンパク質を使用する場合は、細胞の一時的な活性化はまた、核内受容体のリガンドの制御された添加によっても行うことができる。
【００４２】
標的配列の間に位置するＤＮＡの除去後、残りの標的配列（例えば、ｌｏｘＰ配列）は、さらなるプロセス工程に使用することができる。
【００４３】
さらなる好適な実施態様において、本方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）第２の異種発現制御配列および第２の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子と異なる、正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
を含む第３のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、標的配列に隣接する配列が、該細胞のゲノム内の標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離し、そして
（ｄ）場合により、各場合に異なる発現制御配列および／または増幅遺伝子を使用して工程（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回繰り返す、
ことを特徴とする。
【００４４】
このため本発明の方法により、多くの発現制御配列、増幅遺伝子または発現制御配列と増幅遺伝子との組合せを単純かつ迅速に試験することができる。このため、それぞれ個々の標的遺伝子に対する最適な発現／増幅系を決定するために、それぞれ個々の異種発現制御配列およびそれぞれ個々の増幅遺伝子について、時間および費用のかかる部位特異的組込みを行う必要がない。
【００４５】
第３のベクター内の正の選択マーカー遺伝子は、選択プロセスを単純化するため、および擬陽性クローンの数を最少化するために、好ましくは第１のベクターのマーカー遺伝子とは異なる。
【００４６】
本発明に使用されるベクター内のリコンビナーゼ標的配列は、天然に存在する標的配列に対応しても、または場合により部位特異的リコンビナーゼの有効性を損なわない突然変異を受けていてもよい。
【００４７】
本発明のさらなる主題は、相同的組換えのため、特に細胞のゲノム中へのリコンビナーゼ標的配列の部位特異的な導入のためのベクターであって、
（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および
（ｖ）場合により、負の選択マーカー遺伝子、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００４８】
さらに本発明の全てのベクターは、好ましくは、複製の起点、選択マーカー遺伝子などのような、適切な宿主細胞内での増殖および増加に必要な配列要素を含有する。
【００４９】
本発明のさらに別の主題は、特に部位特異的リコンビナーゼ系により細胞のゲノム中にＤＮＡを導入するためのベクターであって、
（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、（ii）正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００５０】
本発明のさらに別の主題は、上述の方法により入手可能な真核細胞、好ましくはヒト細胞である。この細胞、例えば、ヒト細胞は、好ましくは、
（ａ）内在する核酸配列と機能的に結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの染色体位置が定められた配列を含有し、そして
（ｂ）この配列が、リコンビナーゼ標的配列により挟まれている、
ことを特徴とする。
【００５１】
本発明のさらなる側面は、真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる方法に関するものであり、この方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）アクチベータータンパク質（例えば、低酸素誘導因子（ＨＩＦ））と結合する、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする。
【００５２】
驚くべきことに、標的遺伝子の発現制御配列の領域内、特にその調節領域内に、１または数個のアクチベータータンパク質（核酸配列に結合することにより、遺伝子発現を増大させるタンパク質）と結合する核酸配列のゲノム組込みは、標的遺伝子の発現を減少させないが、これと対照的に、適切な培養条件の選択により、内在性標的遺伝子の発現を増大させるか、または発現されていない内在性標的遺伝子の発現を誘導することが可能である。
【００５３】
適切なアクチベータータンパク質の例には、低酸素誘導因子ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１β、ならびにインターフェロンコンセンサス配列（ＩＣＥ）への結合により転写を増大させることができるインターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）がある（Tanaka N., Kawakami T., Taniguchi T., Mol. Cell. Biol. (1993), Aug; 13(8): 4531-4538）。
【００５４】
ＨＩＦまたは他のアクチベータータンパク質と結合する１または数個の核酸配列を、内在する標的遺伝子に機能的に結合後、該標的遺伝子の発現を、適切な培養条件を選択することにより調節することができる。特に工業的規模の製造のための、これの有利な点は、タンパク質の発現を、製造プロセスにとって最適な時間に誘導しうることである。このことは、培養培地上清中の合成産物の平均滞留時間が短縮されるため、有益である。またこれにより、タンパク質の望ましくない分解産物の量が減少する。このことは、次の精製工程に良い影響を及ぼし、製造コストを減少させ、かつ最終産物が質的に改善する。
【００５５】
本発明の方法を実施するためには、１または数個のアクチベーター結合性核酸配列を標的遺伝子と機能的に結合させることで充分である。好ましくは２つのＨＩＦ結合性核酸配列が使用される。ＨＩＦ結合性核酸配列は、特に好ましくは、配列番号１（第一のＨＩＦ結合ヌクレオチド配列）の５３塩基対配列、配列番号２（第二のＨＩＦ結合ヌクレオチド配列）の４３塩基対配列、これらの配列の相同配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズする配列から選択される。
【００５６】
２つのＨＩＦ結合性核酸配列の使用により、驚くべきことに相乗効果(synergistic effect)が得られる。これにより、これらの配列のそれぞれを単独で使用する場合よりも、内在性核酸の発現が大きく増大する。
【００５７】
必要であれば、標的遺伝子の領域に導入されるアクチベーター配列に結合するアクチベータータンパク質の発現は、細胞内で誘導および／または増大させることができる。これは、例えば、細胞を、
（ｉ）この細胞内の活性な発現制御配列に機能的に結合している、アクチベータータンパク質をコードする核酸配列、および
（ii）場合により正の選択マーカー遺伝子、
を含むベクターでトランスフェクトすることにより達成することができる。
【００５８】
その発現産物が、ゲノム中に組み込まれたアクチベーター結合性核酸配列に結合することができる、アクチベータータンパク質をコードする任意の核酸配列を使用することができる。アクチベータータンパク質は、好ましくは、ＨＩＦ−１αおよび／またはＨＩＦ−１βタンパク質である。内在する核酸配列が、すでにアクチベーター結合性または好ましくはＨＩＦ結合性核酸配列を含有するならば、細胞内の活性な発現制御配列および場合により正の選択マーカー遺伝子に機能的に結合している、アクチベータータンパク質または好ましくはＨＩＦタンパク質をコードする核酸配列を含有する細胞中にベクターを導入するだけで充分であろう。
【００５９】
アクチベータータンパク質をコードする核酸配列と機能的に結合している発現制御配列は誘導可能であり、このため、例えば、ホルモンまたは重金属の添加によるなどの適切な培養条件により、活性化のためのさらに別の方法が提供される。これにより、製造プロセスにとって最適な時間に、内在性標的遺伝子の発現が誘導可能である。
【００６０】
構成的に活性な発現制御配列を使用することの利点は、アクチベータータンパク質が、培地へのアクチベーターの添加とは無関係に構成的に発現されることである。
【００６１】
アクチベータータンパク質結合性核酸配列が、ＨＩＦ結合性核酸配列であるならば、標的遺伝子の発現は、例えば、適切な培養条件により、例えば、０．１〜２％のＯ2 濃度で誘導することができる。
【００６２】
本発明のさらなる主題は、相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少なくとも１つの核酸配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の１つの核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むことを特徴とする上記ベクターである。
【００６３】
本発明のさらに別の主題は、上述の方法の１つにより入手可能な、真核細胞、好ましくはヒト細胞である。この細胞は、好ましくは、細胞中に内在する遺伝子と機能的に結合している、少なくとも１つの異種の染色体位置が定められたアクチベータータンパク質／複合体結合性核酸断片を含有することを特徴とする。アクチベータータンパク質結合性核酸断片は、ある標的遺伝子に最適なアクチベーター配列の単純な同定を可能にする、上に説明される部位特異的組換え系により、ゲノム内で置換することができる。
【００６４】
本発明のさらなる側面は、真核細胞中に内在する標的遺伝子の領域からの非コード核酸配列の、その発現に及ぼす影響を試験する方法に関するものであり、この方法は、
（ａ）細胞を、
（ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞内で活性であるか、または活性化することができる異種発現制御配列、および
（ii）標的遺伝子の領域からの５’側および／または３’側の非コード核酸断片、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）細胞を、発現制御配列が活性である条件下で培養し、そして
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する、
ことを特徴とする。
【００６５】
標的遺伝子の最適な発現速度を達成するために、ゲノム内の標的遺伝子の領域にどのように異種発現制御配列を配置するべきか、および標的遺伝子の領域からの５’および／または３’非コード配列の存在または非存在が発現にどのような影響を及ぼすかは、本発明の方法により簡便に求めることができる。試験ベクターは、好ましくは一時的に細胞にトランスフェクトさせ、レポーター遺伝子の発現を測定する。このように、異種発現制御配列と標的遺伝子の多くの取り合わせまたは多くの異なる発現制御配列を、迅速かつ安価に試験することができる。異種発現制御配列は、転写開始因子またはＲＮＡポリメラーゼのような転写成分と直接相互作用することができる核酸配列、および転写に及ぼす影響がアクチベーターまたはリプレッサーとの相互作用により媒介される核酸配列を含む。異種発現制御配列は、好ましくはプロモーター／エンハンサー、特に好ましくはウイルスプロモーターそして最も好ましくはＣＭＶプロモーターである。本発明の方法は、特にさらに複雑なプロセス工程を含むプロセスにおいて、顕著なコスト削減に貢献する。これは、例えば、ある細胞型における特定の内在性核酸配列の発現を増大させようとする、マウス、ヒツジまたはウシのようなトランスジェニック動物の生産における場合である。
【００６６】
標的遺伝子領域からの非コード核酸断片５’または３’は、好ましくはレポーター遺伝子の５’側または３’側でのそのゲノムの配置に従って、ベクター内で配置される。
【００６７】
細胞内でその発現を検出することができる当業者に公知のレポーター遺伝子はすべて使用され得る。好ましくは、クロラムフェニコール(chloroamphenicol)−アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコードするレポーター遺伝子が用いられる。一方、目的のタンパク質、例えばＥＰＯなどをコードするレポーター遺伝子（免疫学的方法、例えばＥＬＩＳＡによってその発現を検出することができる）を使用することも可能である。
【００６８】
好ましい実施態様においては、標的遺伝子の異なる5'または／および3'非コード核酸断片を含む少なくとも２個のベクターを、異なる細胞にそれぞれトランスフェクトし、その異なる細胞におけるレポーター遺伝子の発現を当業者に公知の方法を用いて測定する。異種発現制御配列をどこに配置すればある一定の宿主細胞に対して最適な発現を生じさせることができるかを本発明の方法を用いて容易に確立することができる。
【００６９】
本発明のさらなる局面は、ＤＨＦＲ−陰性真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、特に好ましくはヒト細胞を取得する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼに対する少なくとも１個の標的配列、
（ii）配列（ｉ）に隣接し、相同的組換えを可能にするための細胞内に内在的に存在するＤＨＦＲ核酸配列に相同であるＤＮＡ配列、ならびに
（iii）任意に正の選択マーカー遺伝子および任意に負の選択マーカー遺伝子を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトされた細胞を、ベクターの相同的組換えが生じる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする、前記方法に関する。
本発明による方法においては、前記のリコンビナーゼ標的配列および相同配列は、上記で説明したようにして選択され、使用される。
【００７０】
正の選択マーカー遺伝子は、存在する場合には、ＤＨＦＲ遺伝子と相同である配列の間に配置される。負の選択マーカー遺伝子は、存在する場合には、相同配列の外側に配置される。
【００７１】
相同的組換えがＤＨＦＲ遺伝子座で生じた後は、その細胞は機能性ＤＨＦＲタンパク質を合成することができない。この場合、ベクターの配列を、ＤＨＦＲ遺伝子のプロモーターが不活性化されるように、または／およびＤＨＦＲ遺伝子のコード配列中の挿入または欠失により機能性ＤＨＦＲタンパク質がそれ以上合成され得ないように配列することができる。
【００７２】
ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の両方を不活性化するために、まず細胞を本発明によるベクターでトランスフェクトし、次いで選択し、単離する。ＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の一つはこれらの細胞中で不活性化される。すなわちそれらの細胞はＤＨＦＲ遺伝子に対してヘテロ接合性（＋／−）である。次に、これらの細胞は、第１のベクターとは異なった、好ましくは正の選択マーカー遺伝子を含む本発明によるベクターを用いて再びトランスフェクトされ得る。選択工程後、ＤＨＦＲ対立遺伝子の両方が不活性化されている細胞が得られる。一方、選択圧力を増大させることにより遺伝子変換を生じさせることができ、したがって、対立遺伝子の両方を不活性化することができる（例えば、Mortensenら, Mol. Cell. Biol. 12(1992), 2391-2395を参照されたい）。
【００７３】
本発明による方法によって、遺伝子増幅処理において使用した場合に内在性ＤＨＦＲタンパク質を合成しないという利点を有するＤＨＦＲ陰性細胞が得られる。選択工程を行ってＤＨＦＲタンパク質をコードする核酸配列に結合する異種核酸配列を増幅させる場合、内在性ＤＨＦＲ遺伝子の発現産物は干渉作用を持たないので、遺伝子増幅の効率が高まる。
【００７４】
選択可能な表現型をもたらすのに適した選択マーカー遺伝子はすべて正の選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性として使用することができる。正の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列は、好ましくは、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【００７５】
当業者に公知の負の選択マーカー遺伝子はすべて使用することができ、負の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列は、好ましくは、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）または／およびヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である。
【００７６】
リコンビナーゼ標的配列に挟まれている配列を、対応するリコンビナーゼの一過性活性化により、例えば、
（ａ）細胞を、かかる細胞内で活性である発現制御配列に機能的に結合しリコンビナーゼをコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）かかる手法でトランスフェクトされた細胞を、リコンビナーゼが発現され、活性であるような条件下で培養し、そして
（ｃ）任意に細胞を単離する
ことによって細胞のゲノムから切り出すことができる。
【００７７】
本発明による方法によれば、ＤＨＦＲ遺伝子を不活性化するだけでなく、細胞のゲノムから、リコンビナーゼ標的遺伝子配列の間に位置するＤＨＦＲ遺伝子の配列を、導入選択マーカー遺伝子と、リコンビナーゼ介在反応によって切り出すことも可能である。
【００７８】
リコンビナーゼ標的配列に挟まれている配列が正の選択マーカー遺伝子を含む場合、この配列を含む細胞は抗生物質耐性である。したがって、当業者に公知の方法によって細胞を容易に選択することができる。
【００７９】
本発明の方法によって産生されたＤＨＦＲ陰性細胞のさらなる利点は、その特性を当業者に公知の方法によって特徴づけることができ、したがって細胞をその他の方法に使用することができるということである。さらに、ＤＨＦＲ遺伝子座に導入されたリコンビナーゼ標的配列は、ゲノムへの核酸配列の部位特異的組込みを可能にする。
【００８０】
さらなる好ましい実施態様は、異種ＤＨＦＲ遺伝子を真核細胞に導入する方法において、上記の方法の一つによって得られるＤＨＦＲ陰性細胞を、
（ａ）（ｉ）任意に、好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子とは異なる正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）由来の核酸配列のそれぞれが、その5'側および3'側において少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列に隣接しており、発現可能な状態にある、タンパク質をコードする増幅される核酸配列
を含む第３のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）そのトランスフェクトされた細胞を、リコンビナーゼ標的配列に挟まれている核酸配列が細胞のゲノム内にすでに存在しているリコンビナーゼ標的配列に組み込まれるような条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする前記方法に関する。
【００８１】
正の選択マーカー遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子および所望のタンパク質をコードする標的遺伝子は、それぞれ、細胞内で活性であるか活性化することができる発現制御配列に機能的に結合されていることが好ましい。内部リボソーム結合部位(internal ribosomal binding sites)を有するポリシストロン性構築物も原則として可能である。しかしながら、標的遺伝子の増幅される核酸配列は、別個のプロモーターによって誘導されるべきである。特に好ましい発現制御配列は、ウイルスプロモーター／エンハンサーである。タンパク質の発現には、ＣＭＶプロモーターが最も好ましい。
【００８２】
異種配列の細胞のゲノムへの本発明による組み込みを部位特異的手法で行うことにより、異種配列とゲノム配列との干渉を排除することは都合がよい。したがって、このことによって不安定な産生クローンなどのさらに上記したような欠点が回避される。
【００８３】
タンパク質をコードする異種核酸配列の発現速度を増大させるために、メトトレキセートとともに公知の処理工程によって増幅工程を行うことができる。
【００８４】
本発明のさらなる主題は、
（ｉ）任意に正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、ならびに
（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）由来の核酸配列のそれぞれが、その5'側および3'側において少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列に隣接している、所望のタンパク質をコードする発現可能な状態にある核酸配列
を含むベクターである。
【００８５】
本発明のさらに別の主題は、
（ｉ）任意に正の選択マーカー遺伝子、
（ii）各場合において配列（ｉ）に隣接する少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接し、相同的組換えを可能にするための細胞内に内在的に存在するＤＨＦＲ核酸配列と相同であるＤＮＡ配列、ならびに
（iv）任意に、相同配列（iii）の外側、好ましくは3'側に位置する負の選択マーカー遺伝子
を含む、相同的組換え用のベクターである。
【００８６】
さらに、本発明は、上記の方法の一つによって得ることができる真核細胞、好ましくはヒト細胞に関する。この細胞は、
（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも１個の内在性核酸配列が不活性化され、好ましくは内在性対立遺伝子の両方が不活性化されており、そして
（ｂ）少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列がＤＨＦＲをコードする前記核酸配列の領域においてゲノムに組み込まれている
ことを特徴とする。
【００８７】
最後に、本発明のさらに別の主題は、
（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（ii）所望のタンパク質をコードする核酸配列、ならびに
（iii）少なくとも１個のリコンビナーゼ標的配列
を含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域にある異種核酸配列によって特徴づけられる、真核細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００８８】
本発明を、下記の実施例、図面および配列プロトコールによって説明する。
配列番号３は、ｌｏｘＰ配列を示す。
【００８９】
【実施例】
実施例１ ＣＭＶプロモーターの制御下およびＨＩＦの過剰発現下でのエリスロポエチン遺伝子の発現
ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αおよびｐＡＲＮＴ（図３を参照されたい）を遺伝子的に改変したＨｅＬａＳ３細胞にトランスフェクトした。ＥＰＯ発現を制御するＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターは、細胞内の、ＥＰＯ対立遺伝子のエリスロポエチン遺伝子（ＥＰＯ）翻訳開始部位に最も近いところに導入された。細胞は、通常、24時間、107 細胞当たり１μｇのエリスロポエチンを産生する。トランスフェクションの24時間前に、細胞を６ウェルプレート当たり６×104 細胞の濃度で継代した。トランスフェクションの当日、細胞をＤＮＡ−ＤＯＴＡＰ混合物とともにインキュベートした。混合物には、ウェル当たり、各ベクター1.25μｇ、10μｌＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim 1202375）を20mM Hepes緩衝液に最終容量が75μｌになるように加えたものが含まれていた。混合物を室温で10〜15分間プレインキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり３mlの培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６時間インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、完全培地中で５日間培養した。３、４および５日目に上清100μlをそれぞれ取り出し、エリスロポエチンＥＬＩＳＡで分析した。このアッセイは５日目に完了し、細胞数を測定した。ウェル当たりのエリスロポエチンの量をその細胞数に対して計算した（図３を参照されたい）。
【００９０】
この実施例は、異種発現制御配列（ＣＭＶプロモーター）がエリスロポエチン遺伝子の対立遺伝子のプロモーター領域に導入されていてもＨＩＦによるエリスロポエチンの誘導は可能であるということを示すものである。エリスロポエチン濃度の測定値の増大は、対立遺伝子の両方における１個またはそれ以上の低酸素誘導因子の協同作用を示すものである。
【００９１】
したがって、内在性核酸配列発現を、異種発現制御配列を導入することによって増大させることができるということは明らかである。アクチベーター（ＨＩＦ）が結合性核酸配列が発現制御配列内に存在する細胞内で発現する場合、かかる遺伝子の発現はさらに増大され得る。対応する配列がこの遺伝子座に存在しない場合、それらの配列を本発明の方法により相同的組換えによってゲノム内に特異的に導入することができる。
【００９２】
実施例２ 内在性核酸配列の発現を増大させるための発現制御配列の最適化された配置
内在性遺伝子の5'側の配列は発現を刺激することができ、そして抑制特性を有するものである。異種発現制御配列をゲノムの標的遺伝子の5'側に導入する場合、発現レベルは内在性5'配列によって影響される。異種発現制御配列によって標的遺伝子の最適発現を得るためには、かかる異種発現制御配列は、その異種発現制御配列の活性が標的遺伝子の5'側にある非コード配列によって低減されないように配置されなければならない。特定の配置は、個々の配列エレメントの共同作用を得るために都合がよいであろう。異種発現制御配列の種々の配置を試験するために、すなわち、例えば標的遺伝子のコード配列の翻訳開始部位からどのくらいの距離のところに異種発現制御配列を細胞のゲノムに組み込まなければならないかを決定するために、標的遺伝子の異なる5'非コード核酸断片を有する異なるベクターを試験した（図４を参照されたい）。図４に記載されたベクターでＨｅＬａＳ３細胞をトランスフェクトし、レポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼの発現を測定した（図５を参照されたい）。
【００９３】
アッセイの24時間前に、細胞を10センチメートルペトリ皿当たり１×106 細胞の濃度で継代した。トランスフェクションの当日に、細胞をＤＮＡ−ＤＯＴＡＰ混合物とともにインキュベートした。この混合物には、各ベクター（Ａ３−１７８、Ａ３−１７７、Ａ３−１７５、Ａ３−１８１またはｐＮＡＳＳβ。図４を参照されたい）１pmolを60μｌＤＯＴＡＰ(Boehringer Mannheim 1202375)に加えて20mMＨＥＰＥＳ緩衝液で300μｌにしたものが含まれていた。この混合物を室温で10〜15分間インキュベートした。細胞をペトリ皿当たり６mlの血清を含まない培地中でＤＮＡ−ＤＯＴＡＰとともに６時間プレインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、完全培地中で22時間培養した。β−ガラクトシダーゼ発現を測定するために、細胞を200μｌＰＢＳ中で単離し、-20℃に凍結し、解凍することによって溶解させた。溶解物10μｌを基質（3.29mMクロロフェノールレッド−β−Ｄガラクトピラノシド(Boehringer Mannheim 884308)、100mM ＨＥＰＥＳ、150mM NaCl、２mM MgCl2 、１％ＢＳＡ、0.1％Triton-X100、１％アジ化ナトリウム、pH７）で１：１０に希釈した。試料を１：２段階に希釈して、暗赤色に発色するまで96ウェルプレート中で37℃にてインキュベートした。次いで、試料を570／580nm、または550nmで測定した。
【００９４】
図５に示したように、レポーター遺伝子の発現は、ベクターＡ３−１７８でトランスフェクトされた細胞中で最も高かった。このベクターにおいては、異種発現制御配列はコード配列の翻訳開始部位に近接している。
【００９５】
したがって、この方法を用いることにより、内在性標的遺伝子の最適発現を得るためには宿主細胞のゲノム内の異種発現制御配列のいずれの配置を選択しなければならないかを簡単且つ迅速に決定することができる。
【００９６】
実施例３ ＤＨＦＲ陰性細胞の産生
第１の工程では、本発明による組換え用ベクターを調製した。第２の工程ではこれらのベクターでヒト細胞系をトランスフェクトし、相同的組換えイベントをスクリーニングした。この方法では、最初にＤＨＦＲ遺伝子の一つの対立遺伝子を不活性化することができ、次いで第２の対立遺伝子を不活性化することができた。
【００９７】
相同的組換え用のＤＨＦＲベクター
ヒトＤＨＦＲ遺伝子は染色体５に位置しており、６個のエキソンに分かれた30kbを含む。プロモーターの一部、エキソン２の一部およびエキソン１全体を含む1.8kbのEcoRI断片を用いて相同的組換え用ベクターを調製した。エキソン１をApaI消化により除去し、生じたギャップ（0.45kb）にリンカーを介してＮｅｏ（1.4kb）またはＨｙｇ（2.2kb）耐性遺伝子を挿入した。これらのリンカーには、アダプター(adaptor)ヌクレオチドに加えて最小配列TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA（ｌｏｘＰ配列）が含まれている。このリンカー配列は同じ向きに配列され、耐性遺伝子は好ましくはＤＨＦＲ遺伝子に対してアンチセンスである。耐性遺伝子が挿入された後、相同領域は伸びた。このため、ベクターを3'領域由来のEcoRI断片（6.0kb）によって伸長させた（図６）。この方法では、本発明による標的構築物ｐＮＤＩ（11.5kb）およびｐＨＤＩ（12.3kb）が得られた。
【００９８】
相同的組換えが完了した後、エキソン１全体（アミノ酸１〜28）およびＤＨＦＲ遺伝子のプロモーターの一部が除去されていた。細胞は、もはや機能的ＤＨＦＲタンパク質を発現することはできない。
【００９９】
細胞のトランスフェクション
使用されるヒト細胞系は、染色体５について倍数体である必要はなく、ＭＴＸ選択下で維持されている必要はない。いずれの場合においても、２以上の対立遺伝子が不活性化されなければならない。
【０１００】
ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ ATCC CCL-2.2 ）
細胞を、組織培養フラスコ内、ＲＰＭＩ１６４０培地、10％ウシ胎児血清、２mM Ｌ−グルタミンおよび１mM ＭＥＭ（非必須アミノ酸）中で培養した。インキュベーションを37℃、５％ＣＯ2 で行った。エレクトロポレーション緩衝液には20mM Ｈｅｐｅｓ、138mM NaCl、５mM KCl、0.7mM Na2HPO4 、６mM Ｄ−グルコース一水和物、pH 7.0が含まれていた。10μｇの線状化ベクターＤＮＡ（ｐＮＤＩ）を１×107 細胞に960μＦおよび250Ｖでエレクトロポレーションした（Biorad Gene Pulser）。エレクトロポレーション後、600μg/ml Ｇ４１８（ジェネティシン(geneticin) Boehringer Mannheim）を含む培地中に細胞を回収して培養した。10日間選択を行った後（培地は２日毎に交換する）、陽性クローンを単離して拡大増殖させた。
【０１０１】
ＨＴ１０８０細胞（ ATCC CCL-121 ）
細胞を、ＨｅＬａ Ｓ３細胞について記載したようにして10％ウシ胎児血清、２mMＬ−グルタミンおよび１mM ピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地を用いて培養し、選択した。
【０１０２】
Ｎａｍａｌｗａ細胞（ ATCC CRL-1432 ）
この細胞系は懸濁細胞系であり、それに対応して培養しなければならない。この培地は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞について記載したものと一致する。トランスフェクション後、細胞を40個の96-ウェルプレートに分配した。陽性クローンを48−、24−、12−および６−ウェルプレートで拡大増殖させた。１mg/ml Ｇ４１８を用いて選択を行った。
【０１０３】
ＤＨＦＲ陰性（＋／−）細胞の検出
ベクターの挿入をサザンブロット分析またはＰＣＲによって検出した。相同的組換えが正しく生じている場合、EcoRI消化後、Ｎｅｏ遺伝子の挿入によって形成された2.9kbのバンドならびに無傷ＤＨＦＲ遺伝子に該当する1.8kbのバンドが検出された（図７ｃ）。混合クローン（サザンブロットにおいてはバンド強度の比が同等でない）をＦＡＣＳにおける単細胞沈着(single cell deposition)によって分離し、サブクローニンングし、続いて拡大増殖させた。陽性として同定されたクローン中ではＤＨＦＲ遺伝子の対立遺伝子の一つが不活性化されていた。
【０１０４】
ＤＨＦＲ陰性（−／−）細胞の産生
ＤＨＦＲ対立遺伝子（＋／−）が不活性化されている細胞クローンは、新たな相同的組換えを行うことができる。この目的のために、細胞クローンを上記のようにしてベクターｐＨＤＩの線状化ＤＮＡ10μｇを用いてトランスフェクトした。選択は、ハイグロマイシンＢ（Boehringer Mannheim）500μg/mlを含む培地中で行った。
【０１０５】
培地中のＧ４１８の濃度が高くなると、ＤＨＦＲ+/- 細胞における選択圧力が増大し、ＤＨＦＲ-/- 細胞が得られた。遺伝子変換によって第２のＤＨＦＲ対立遺伝子が活性化される原因となる染色体内組換えが生じた。
ＤＨＦＲ-/- 細胞には２個の不活性化ＤＨＦＲ対立遺伝子が含まれており、もはやテトラヒドロ葉酸を合成することはできない。したがって、チミジン、グリシンおよびプリンを培地に加えなければならない（補足）。任意に細胞をα- 培地（Gibco BRL）で培養した。
【０１０６】
ＤＨＦＲ-/- 細胞を、上記のようにして検出した。ホモ接合性ＤＨＦＲ陰性細胞では野生型バンド（1.8kb）が検出可能であった。ｐＤＨＩでトランスフェクトした細胞は、相同的組換え後、EcoRIサザンブロットにおいて新たな3.7kbのバンドを示した（図７ｃ）。
【０１０７】
ＤＨＦＲ陰性細胞（−／−）の使用
本発明による細胞をタンパク質の大量生産に使用することができる。この目的のために、本発明によるベクター（図８）およびＣｒｅリコンビナーゼをコードする発現ベクターでＤＨＦＲ-/- 細胞をトランスフェクトした。ＣｒｅリコンビナーゼによってＤＨＦＲ遺伝子座から抗生物質耐性が除かれ、本発明によるベクターがＤＨＦＲ-/- 細胞のゲノムのｌｏｘＰ配列に組み込まれた。細胞は再び抗生物質感受性になり、チミジン、グリシンおよびプリン補足から独立した。
【０１０８】
補足なしの培地を用いることによって、または培養培地に適当な抗生物質を加えることによって選択を行うことができる。この場合、抗生物質は、細胞のゲノムからＣｒｅリコンビナーゼによって除去された耐性遺伝子に対応するものである。ｌｏｘＰ配列に組み込まれたベクターが正の選択マーカー遺伝子を含む場合には、この抗生物質を培地に添加することによって選択を行うことができる。
【０１０９】
遺伝子増幅による産生量の増大
細胞の組換えタンパク質の産生量を増大させるために、細胞に導入されたＤＨＦＲ遺伝子および異種タンパク質をコードする異種核酸配列を増幅するメトトレキセート（ＭＴＸ）選択を行った。
増幅を行うために、細胞をＭＴＸの濃度を上昇させながら（100〜1000mM）培養した。増幅の程度は、比較(comparative)サザンブロットのデンシトメーター評価(densitometric evaluation)によって監視した（ＭＴＸ添加前、添加中および添加後に行った）。
増幅工程後に得られた本発明による細胞には、ｌｏｘＰ遺伝子座に導入ＤＨＦＲ遺伝子および挿入異種核酸配列の多数のコピーが含まれていた。これらの細胞は、異種核酸の高産生量を特徴とする。
【０１１０】
本発明の好ましい実施態様を説明の一部として下記に示す。
１．真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）第１の異種発現制御配列および第１の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の核酸部分と相同であるＤＮＡ配列
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、該ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする前記方法。
【０１１１】
２．リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘＰ配列を使用する、１項に記載の方法。
３．細胞がヒト細胞である、１項または２項に記載の方法。
４．細胞が不死化細胞である、１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
５．細胞がＨＴ１０８０細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞またはＨｅＬａ Ｓ３細胞である、４項に記載の方法。
【０１１２】
６．異種発現制御配列が、プロモーター／エンハンサー、好ましくはウイルスプロモーター、特に好ましくはＣＭＶプロモーターを含む、１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
７．異種発現制御配列が3'−非コード配列を含む、１〜６項のいずれか１項に記載の方法。
８．異種配列を、内在する核酸配列の内在性発現制御配列が相同的組換えによって除去されるように選択する、１〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【０１１３】
９．正の選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシン(geneticin)、またはハイグロマイシン耐性遺伝子である、１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記ベクターが、１項（ａ）（iv）に記載の相同配列の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子をさらに含有する、１〜９項のいずれか１項に記載の方法。
１１．リコンビナーゼ標的配列間に位置する核酸配列を、該標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼの一時的な活性化により細胞のゲノムから切り出す、１〜１０項のいずれか１項に記載の方法。
【０１１４】
１２．（ａ）細胞を、
（ｉ）第２の異種発現制御配列および第２の増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子と異なる、正の選択マーカー遺伝子、および
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、
を含むさらなるベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、標的配列により挟まれている配列が細胞のゲノム内の標的配列に組み込まれる条件下で培養し、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離し、そして
（ｄ）場合により、工程（ａ）〜（ｃ）を、各場合において異なる発現制御配列および／または増幅遺伝子を用いて少なくとも１回繰り返す
ことを特徴とする、１項に記載の方法。
【０１１５】
１３．相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（iii）に隣接するＤＮＡ配列、および
（ｖ）場合により、負の選択マーカー遺伝子
を含む前記ベクター。
【０１１６】
１４．（ｉ）異種発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）配列（ｉ）および（ii）に隣接する、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列、
（iv）場合により、負の選択マーカー遺伝子
を含むベクター。
【０１１７】
１５．１〜１２項のいずれか１項に記載された方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細胞。
１６．（ａ）真核細胞中に内在する核酸配列と機能的に結合している、異種発現制御配列および増幅遺伝子から選択される、少なくとも１つの染色体位置が定められた配列を含有し、そして
（ｂ）この配列がリコンビナーゼ標的配列により挟まれている、
真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１１８】
１７．真核細胞中に内在する核酸配列の発現を変化させる方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）アクチベータータンパク質を結合する、少なくとも１つの核酸配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、
ことを特徴とする、前記方法。
【０１１９】
１８．少なくとも１つの低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）結合性核酸配列を使用する、１７項に記載の方法。
１９．ＨＩＦ−結合性核酸配列を、配列番号１による53bpの配列、配列番号２による43bpの配列、これらの配列と相同である配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズする配列から選択する、１８項に記載の方法。
【０１２０】
２０．さらに、細胞を
（ｉ）この細胞の活性発現制御配列に機能的に結合している、アクチベータータンパク質をコードする核酸配列、および
（ii）場合により、正の選択マーカー遺伝子
を含むベクターでトランスフェクトすることを含む、１７〜１９項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２１】
２１．アクチベータータンパク質が、ＨＩＦ−１αタンパク質および／またはＨＩＦ−１βタンパク質である、２０項に記載の方法。
２２．細胞を0.1〜２％のＯ2濃度で培養する、１８〜２１項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２２】
２３．相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）アクチベータータンパク質と結合する、少なくとも１つの核酸配列、
（ii）正の選択マーカー遺伝子、
（iii）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、
を含む前記ベクター。
【０１２３】
２４．１７〜２１項のいずれか１項に記載の方法により得られる、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
２５．真核細胞中に内在する遺伝子と機能的に結合している、アクチベータータンパク質／アクチベータータンパク質複合体を結合する、少なくとも１つの異種の染色体位置が定められた核酸断片を含有する、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１２４】
２６．真核細胞中に内在する標的遺伝子の領域からの非コード核酸配列の、その標的遺伝子発現に及ぼす影響を試験する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）レポーター遺伝子と機能的に結合している、細胞内で活性であるか、または活性化することができる異種発現制御配列、および
（ii）標的遺伝子の領域からの5'側および／または3'側の非コード核酸断片、
を含むベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）前記細胞を、発現制御配列が活性である条件下で培養し、そして
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する、
ことを特徴とする、前記方法。
【０１２５】
２７．レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）またはｌａｃＺをコードするものである、２６項に記載の方法。
２８．（ａ）互いに異なる標的遺伝子の5'および／または3'非コード核酸断片を含む少なくとも２個のベクターで、それぞれ異なる細胞をトランスフェクトし、そして
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を異なる細胞において測定する
ことを特徴とする、２６項または２７項に記載の方法。
【０１２６】
２９．ＤＨＦＲ陰性真核細胞を作製する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的配列、
（ii）相同的組換えが可能であるように細胞中に内在するＤＨＦＲ核酸配列に相同である、配列（ｉ）に隣接するＤＮＡ配列、および
（iii）場合により、正の選択マーカー遺伝子、および場合により、負の選択マーカー遺伝子、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする前記方法。
【０１２７】
３０．リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘＰ配列を使用する、２９項に記載の方法。
３１．正の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列が、ネオマイシン、カナマイシン、ジェネティシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子である、２９項または３０項に記載の方法。
【０１２８】
３２．負の選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）および／またはヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＧＰＲＴ）である、２９〜３１項のいずれか１項に記載の方法。
３３．リコンビナーゼ標的遺伝子により挟まれている配列を、対応するリコンビナーゼの一時的な活性化によって細胞のゲノムから切り出す、２９〜３２項のいずれか１項に記載の方法。
【０１２９】
３４．異種ＤＨＦＲ遺伝子を真核細胞中に導入する方法であって、
（ａ）３３項に記載の方法により得られた細胞を、
（ｉ）好ましくは第１のベクターの正の選択マーカー遺伝子と異なる、場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（iii）部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）からの核酸配列のそれぞれが、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接する、発現可能な形態でタンパク質をコードする増幅すべき核酸配列、
を含む第３のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、リコンビナーゼ標的配列に隣接する核酸配列が、細胞のゲノムに既に存在するリコンビナーゼ標的配列中に組み込まれる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する
ことを特徴とする、前記方法。
【０１３０】
３５．（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、および
（iii）目的のタンパク質をコードする、発現可能な形態の核酸配列
を含み、ここで、部分配列（ｉ）、（ii）および（iii）からの各核酸配列は、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列に5'側および3'側で隣接する、ベクター。
【０１３１】
３６．相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子、
（ii）それぞれの場合に配列（ｉ）に隣接する、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列
（iii）相同的組換えが可能であるように、細胞に内在するＤＨＦＲ核酸配列相同である、配列（ｉ）および（ii）に隣接するＤＮＡ配列、および
（iv）相同配列（iii）の外側の、場合により、負の選択マーカー遺伝子、
を含む、前記ベクター。
【０１３２】
３７．２９〜３４項のいずれか１項に記載の方法によって得られる真核細胞、好ましくはヒト細胞。
３８．（ａ）ＤＨＦＲをコードする少なくとも１つの内在性核酸配列が不活性化されており、そして
（ｂ）ＤＨＦＲをコードするこの核酸配列の領域のゲノム中に、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列が組み込まれている、
真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１３３】
３９．（ｉ）ＤＨＦＲをコードする核酸配列、
（ii）目的のタンパク質をコードする核酸配列、および
（iii）少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列
を含む、内在性ＤＨＦＲ遺伝子座の領域内の異種核酸配列を特徴とする、真核細胞、好ましくはヒト細胞。
【０１３４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、第１のベクターとして使用される相同的組換え用のベクターを示すものである。ＨＲ：相同配列、Ｓｅｑ１：第１の異種発現制御配列、Ｒ１：正の選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有するｌｏｘＰ配列。
（Ｂ）は、ゲノム配列を示すものであり、
（ａ）は相同的組換えの完了後のものであり、
（ｂ）はＣｒｅリコンビナーゼによって触媒されたｌｏｘＰ配列に挟まれた配列の除去後のものである。
（Ｃ）は、ｌｏｘＰ配列の間に位置する配列を含むＣｒｅリコンビナーゼ介在組込み用のベクターを示すものであり、
（ｃ）は、第２のベクターのｌｏｘＰ配列における組込み後のゲノム配列を示すものである。Ｒ２：任意にＲ１とは異なる正の選択マーカー遺伝子、Ｓｅｑ２：第２の異種発現制御配列。
【図２】（Ａ）は、相同的組換え用のベクターを示すものである。ＨＲ：相同配列、Ｒ−ボックス：正のおよび任意に負の選択マーカー遺伝子、ｌｏｘＰ：方向性を有するｌｏｘＰ配列、ＨＳＶ−ｔｋ：単純ヘルペスチミジンキナーゼ。
（Ｂ）は、片側だけに相同配列を有する相同的組換え用ベクターを示すものである。
【図３】図３は、ベクターｐＨＹＧ、ｐＨＩＦ−１αおよびｐＡＲＮＴ（ｐＨＩＦ−１β）でトランスフェクトされたＨｅＬａＳ３細胞のＣＭＶプロモーター／ＨＩＦ−制御エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を示すものであり、そのＥＰＯ発現は、トランスフェクションの３、４および５日後に細胞上清において測定されたものである（エリスロポエチン濃度をμg/mlで示す）。
ｐＨＹＧ：制御ベクター、ｐＨＩＦ−１α：ＳＲαプロモーターの制御下にあるＨＩＦ−１αｃＤＮＡ、ｐＡＲＮＴ：ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＨＩＦ−βｃＤＮＡ。
【図４】図４は、それぞれ、ＣＭＶプロモーター（Ｃ）およびレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ（Ｂ）を含み、これらの配列の間には、異なる長さの標的遺伝子（Ｓ）の非コード核酸断片が挿入されている、４種の異なるベクターを示すものである。非コード核酸断片の長さは、ベクターＡ３−１７８では０kbであり、ベクターＡ３−１７７では2.5kbであり、ベクターＡ３−１７５では3.7kbであり、ベクターＡ３−１８１では5.7kbである。制御ベクターｐＮＡＳＳβは、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼを含むが、ＣＭＶプロモーターを含まない。
【図５】図５は、一連の希釈（１：２〜１：１２８）における、ＨｅＬａＳ３細胞を図４のベクターでトランスフェクトした後のレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの発現の測定を示すものである。
【図６】（Ａ）は、ＤＨＦＲ遺伝子座における相同的組換え用のベクターｐＮＤＩを示すものである。正の選択マーカー遺伝子（Ｎｅｏ）には２個のｌｏｘＰ配列に挟まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相同の配列（5'、3'ＤＨＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列の5'側と他方のｌｏｘＰ配列の3'側に位置している。
（Ｂ）は、ＤＨＦＲ遺伝子座における相同的組換え用のベクターｐＨＤＩを示すものである。正の選択マーカー遺伝子（Ｈｙｇ）には２個のｌｏｘＰ配列に挟まれている。ＤＨＦＲ遺伝子に相同の配列（5'、3'ＤＨＦＲ領域）が一方のｌｏｘＰ配列の5'側と他方のｌｏｘＰ配列の3'側に位置している。
【図７】（Ａ）は、エキソン１、エキソン２およびエキソン３ならびにそれらの間に位置するイントロンを有するＤＨＦＲ遺伝子のゲノム構築物を示すものである。
（Ｂ）は、図６のベクターに対応する標的構築物の概略を示すものである。
（Ｃ）は、ＤＨＦＲ遺伝子における相同的組換え用のベクターの相同的組換えが完了した後のゲノム構成を示すものである。ベクターｐＮＤＩを使用した場合、EcoRI切断部位間の距離は2.9kbであり、ベクターｐＨＤＩを使用した場合3.7kbである。Ｎｅｏ：ネオマイシン、Ｈｙｇ：ハイグロマイシン、kb：キロベース。
【図８】図８は、それぞれ調節配列を含み、２個のｌｏｘＰ配列に挟まれているタンパク質Ｘをコードする核酸配列およびＤＨＦＲタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを示すものである。このベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼが触媒するｌｏｘＰ配列におけるゲノムへの組込みに使用することができる。
Claims (7)
- 真核細胞中に内在する標的遺伝子の発現を最適化させる方法であって、（ａ）細胞を、
（ｉ）該細胞中の標的遺伝子の発現を増加させるための少なくとも１つの異種発現制御配列および場合によりさらに増幅遺伝子の配列、
（ii）（ｉ）に隣接する正の選択マーカー遺伝子の配列、
（iii）配列（ｉ）および（ii）を含む部分の外側に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）配列（ｉ）、（ii）および（iii）を含む部分の外側に隣接し、かつ相同的組換えが可能であるように該細胞のゲノム内の核酸部分に相同であるＤＮＡ配列、
を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、該ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する（ここで、該細胞において、該標的遺伝子は（ｉ）の異種発現制御配列に機能的に結合している）、
ことを特徴とする上記方法。 - リコンビナーゼ標的配列としてｌｏｘＰ配列を使用する、請求項１に記載の方法。
- 前記ベクターが、請求項１（ａ）（iv）に記載の相同配列の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子をさらに含有する、請求項１または２に記載の方法。
- リコンビナーゼ標的配列間に位置する核酸配列を、該標的配列を認識する部位特異的リコンビナーゼの一時的な活性化により細胞のゲノムから切り出す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）細胞中の標的遺伝子の発現を増加させるための少なくとも１つの異種発現制御配列および場合によりさらに増幅遺伝子の配列、
（ii）（ｉ）に隣接する正の選択マーカー遺伝子の配列、
（iii）配列（ｉ）および（ii）を含む部分の外側に隣接する、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも２つの標的配列、
（iv）相同的組換えが可能であるように細胞のゲノム内の核酸部分に相同である、配列（ｉ）、（ii）および（iii）を含む部分の外側に隣接するＤＮＡ配列、および
（ｖ）場合により、相同配列（iv）の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子の配列、を含むことを特徴とする上記ベクター。 - ＤＨＦＲ陰性真核細胞を作製する方法であって、
（ａ）細胞を、
（ｉ）部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つの標的配列、
（ii）ＤＨＦＲ遺伝子のコード配列の欠失をもたらす相同的組換えが可能であるように細胞中に内在するＤＨＦＲ核酸配列に相同である、配列（ｉ）に隣接するＤＮＡ配列、および
（iii）場合により、相同配列（ii）の間に配置される正の選択マーカー遺伝子の配列、および場合により、相同配列（ii）の外側に配置される負の選択マーカー遺伝子の配列を含む第１のベクターでトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクトした細胞を、ベクターの相同的組換えが起こる条件下で培養し、そして
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞を単離する、ことを特徴とする上記方法。 - 相同的組換えのためのベクターであって、
（ｉ）場合により、正の選択マーカー遺伝子の配列、
（ii）少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列（ここで、該リコンビナーゼ標的配列は、配列（ｉ）が存在する場合には配列（ｉ）に隣接する）、
（iii）ＤＨＦＲ遺伝子のコード配列の欠失をもたらす相同的組換えが可能であるように、細胞に内在するＤＨＦＲ核酸配列に相同である、配列（ｉ）および（ii）を含む部分の外側に隣接するＤＮＡ配列、および
（iv）相同配列（iii）の外側に、場合により、負の選択マーカー遺伝子の配列、
を含むことを特徴とする上記ベクター。
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