ES2259422T3 - Optimizacion de celulas para la activacion endogena del gen. - Google Patents
Optimizacion de celulas para la activacion endogena del gen.Info
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Abstract
Método para preparar una célula eucariótica negativa de DHFR, que se caracteriza porque: (a) la célula es transfeccionada con un primer vector, que comprende (i) al menos una secuencia objetivo para una recombinasa específica del lugar, (ii) las secuencias de ADN que flanquean la secuencia (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y (iii) opcionalmente, un gen marcador de selección positivo y opcionalmente uno negativo b) la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación complementaria del vector, y c) se consigue la célula obtenida según el apartado (b).
Description
Optimización de células para la activación
endógena del gen.
La invención se refiere a un método para la
optimización de la expresión o manifestación de un gen en las
células. La invención hace referencia a un método para preparar una
célula eucariótica negativa de DHFR que contiene una secuencia
objetivo de recombinasa así como la expresión o manifestación de una
secuencia de ácido nucleico insertada en la secuencia objetivo de la
recombinasa.
La expresión de un gen en una célula puede
efectuarse de forma constitutiva, por ejemplo, en los denominados
genes Housekeeping, o bien de forma regulada. La expresión regulada
es especialmente necesaria para los genes, los cuales deben ser
expresados únicamente en un estadio de desarrollo determinado de la
célula o bien en un cambio de las condiciones ambientales.
La expresión se regula a nivel de transcripción
a través del promotor unido de forma operativa a la secuencia de
ácido nucleico codificada, cuya actividad puede ser controlada a
través de represores y activadores. Un enlace de los represores o de
los activadores a las secuencias de ácido nucleico no codificadas
del gen puede producir una disminución o un aumento de la actividad
del promotor (L. Stryer, Biochemie, capitulo 12, Spectrum der
Wissenschaft, Verlagsgesellschaft, Heidelberg, 1990). La cantidad de
represores o de activadores contenidos en una célula es regulada de
nuevo por factores como, por ejemplo, las condiciones ambientales.
Un ejemplo de activadores son los factores que inducen hipoxia
(HIF), que son inducidos por una oferta de O_{2} reducida y
conducen a una elevada expresión del gen de eritropoyetina
(Blanchard K.L, y cols., Hypoxic induction of the human
erythropoietin gene: Cooperation between the promotor and enhancer,
each of which contains steroid receptor response elements, (1992),
Mol. Cell. Biol. 12,5373-5385: Wang G.L. y Semenza
G.L., Characterization of hypoxia-inducible factor 1
and regulation of DNA binding activity by hypoxia, (1993), J. Biol.
Chem., 268, 21513-21518; Wang G.L.,
Hypoxia-inducible factor 1 is a
basic-helix-loop-helix-PAS
heterodimer regulated by cellular O_{2} tension, (1995), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514).
Además, la cantidad de una proteína expresada o
manifestada depende de la estabilidad del ARNm. En un sector lateral
3' de un ARNm se localizan secuencias de reconocimiento para los
enzimas desintegrados del ARNm, que influyen en la estabilidad del
ARNm y por tanto en la magnitud de la expresión (Shaw G. y Kamen R.,
A conserved AU sequence from the 3'untranslated Region of
GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation,
Cell (1986), 659-667). El periodo de
semidesintegración del ARNm se correlaciona pues con la cantidad de
proteína expresada. Un tercer nivel de la regulación de la expresión
es la traslación.
La expresión de un gen se basa por tanto en unos
mecanismos de regulación complejos, que pueden ser muy diferentes en
cada caso.
Las proteínas pueden obtenerse con ayuda de la
tecnología del ADN recombinante, que aprovecha los conocimientos de
la regulación de la expresión (Sambrook u cols., 1989 Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Col Spring Harbor). Para ello se
emplean vectores que contienen una secuencia de ácido nucleico que
codifica la proteína correspondiente bajo el control de un promotor
adecuado, así como otras secuencias necesarias para la expresión de
la proteína y para la replicación del vector. El vector se introduce
entonces mediante un método conocido en una célula anfitriona, la
célula se cultiva y la proteína recombinante puede obtenerse a
partir de la célula o del medio de cultivo.
Como células anfitrionas se pueden emplear las
células procarióticas o eucarióticas. Las procarióticas, en
particular las células de E. coli, no son problemáticas en lo
que se refiere a su manipulación, pero presentan una serie de
inconvenientes en una expresión recombinante de proteínas
eucarióticas.
Los procariotos y eucariotos se distinguen por
una vía de procesamiento de la expresión, en las condiciones del
medio celular así como en el "Chaperon" que interviene en el
tratamiento de la proteína. Por eso pueden aparecer diferencias
decisivas en una proteína eucariótica fabricada en los procariotos
en comparación con la proteína nativa correspondiente. Por ejemplo,
la muestra de plegamiento de la proteína y la actividad de la
proteína varían. Además las proteínas en una célula procariótica
generalmente no se glucosilan. Una muestra de glucosilación correcta
equivale en muchos casos, por ejemplo en la síntesis de proteínas
para una formula farmacéutica, a una característica decisiva para la
eficacia y la tolerancia.
Las proteínas glucosiladas son fabricadas pues
por medio de células anfitrionas eucarióticas o líneas celulares,
por ejemplo CHO (Chinese Hamster Ovary). A pesar de la utilización
de las células eucarióticas pueden aparecer cambios en la proteína
fabricada de forma recombinante debido a las diferentes especies,
por ejemplo, en la expresión de una proteína humana en células no
humanas, lo que hace que ésta no se pueda utilizar en muchas
aplicaciones.
Para la fabricación recombinante de proteínas
las células anfitrionas ocasionales o transitorias o bien estables
son transfeccionadas con vectores de expresión, donde se emplean
células transfeccionadas estables especialmente en un método de
fabricación muy técnico.
La integración casual poco especifica de las
secuencias del vector de expresión en el genoma de la célula puede
llevar a células con un rendimiento de producción escaso o a unas
propiedades celulares inestables. Por ejemplo, puede disminuir el
rendimiento de producción en el transcurso del proceso de producción
o bien la capacidad de las células de expresar la proteína
recombinante puede perderse del todo.
Un método para el incremento de la expresión
del gen es la amplificación del gen, en la cual una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína se acopla a un gen de
amplificación. A través de una etapa de selección se consigue una
replicación de ambas secuencias, que conduce a una expresión elevada
(Schimke R.T. Ed) (1982), Gene amplifikation, Cold Spring Harbor
Lab., Cold Spring Harbor, NY).
La EP 0 747 485 describe un método para la
fabricación de proteínas de mamíferos mediante la transformación de
las células anfitrionas de los mamíferos a través de una
recombinación complementaria. La transformación de las células, que
contienen un gen objetivo endógeno se realiza con ayuda de un
vector, que engloba un gen de amplificación y/o una secuencia de
control de nucleótidos heterológica así como al menos una región de
flanqueo, que es complementaria a una zona del genoma de la célula
anfitriona del interior del gen objetivo endógeno.
Como gen de amplificación puede emplearse, por
ejemplo, un ácido nucleico codificado para una
dihidrofolatoreductasa (DHFR) (Kaufmann R.J., Sharp P.A. (1982),
Amplifikation and expression of sequences contransfected with a
modular dihydrofolatereductase complementary DNA gene, J. Mol.
Biol.. 159:601ff).
Mediante una etapa de selección llevada a cabo
con metotrexato se obtienen células que son resistentes frente al
metotrexato y que contienen en su genoma la secuencia de ácido
nucleico en una amplificación de 20 hasta 50 veces codificada para
una DHFR y acoplada con ella (R. Knippers, 1982, Moleculare Genetik,
Thieme, Stuttgart).
Un método de amplificación del gen de este tipo
se lleva a cabo del modo mas eficaz con una célula negativa de DHFR.
La JP-62265992 describe, por ejemplo, una célula
negativa humana de DHFR. Sin embargo, en esta célula no se halla
ningún indicio de una integración especifica del lugar de un vector
de expresión por medio de una recombinación complementaria y una
amplificación de esta secuencia.
Incluso al llevar a cabo un proceso de
amplificación del gen pueden aparecer los inconvenientes
anteriormente indicados como, por ejemplo la inestabilidad de las
células, debido a la casual integración del vector de expresión en
el genoma.
Únicamente en caso de una integración especifica
del lugar del ADN externo en un locus genético seleccionado a través
de una recombinación complementaria, se pueden evitar los
inconvenientes descritos. Los métodos correspondientes son conocidos
y se conocen como Gentargeting (WO 90/11354; WO 91/09955). Por lo
que la célula es transfeccionada con un vector, que contiene un gen
marcador de selección positivo, flanqueado por secuencias de ácido
nucleico, que son complementarias a las secuencias de un gen locus,
en las que el vector debe integrarse en el genoma de la célula.
Entre las secuencias complementarias del ácido nucleico se halla
otra secuencia de control de la expresión heterológica, para
incrementar la expresión del gen objetivo o específico en la célula,
y si se diera el caso, un gen de amplificación, para incrementar el
numero de copias del gen objetivo.
Un inconveniente del método de Gentargeting
conocido hasta el momento consiste en que la fabricación de células
con propiedades, que facilitan la fabricación de una proteína
deseada en una cantidad y calidad suficientes para los fines
comerciales, frecuentemente esta relacionada con un gasto elevado.
En particular la elección de secuencias de control de la expresión
óptimas o/y genes de amplificación para la expresión de una proteína
objetivo deseada requiere a menudo un numero considerable de series
de ensayo para la recombinación complementaria, las cuales debido
al costoso procedimiento del aislamiento de clones, en los cuales ha
tenido lugar el suceso de recombinación deseado, están unidas a un
gasto muy elevado.
La recombinación complementaria se puede emplear
también para interrumpir la expresión de determinados genes en una
célula y para efectuar estudios de funcionamiento de las proteínas.
Para ello se producen ratones Knockout de manera que para un gen que
codifica la proteína que se va a investigar en las células madre
embrionales se desconecta o interrumpe a través de la recombinación
complementaria. Tras efectuar otras etapas del proceso se obtienen
los ratones, los cuales debido a la inactivación de ambos alelos de
este gen no pueden expresar ninguna proteína funcional antes del
inicio de su desarrollo (Thomas K.R., Capecchi M.R., (1987),
Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse
embryo-derived stem cells, Cell
51:503-512).
Para interrumpir o desconectar un determinado
gen especifico de tiempo y tejido, y para investigarlo puede
emplearse el sistema Cre-Lox. Para ello se introduce
un fragmento flanqueado por dos secuencias lox-P a
través de una recombinación complementaria en el genoma de una
célula y seguidamente puede recortarse de nuevo del genoma a través
de una Cre-Recombinasa expresada en la célula (Sauer
B, Henderson N (1989):Site-specific DNA
recombination at loxPsites placed into the genome of mammalian
cells. Nuc Acid Res 17:147-161; Sauer B, Hederson N.
(1990), Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic
genome by the Cre recombinase, New Biol..
5:441-449).
5:441-449).
La WO 96/30498 describe un método para la
fabricación de células, las cuales expresan un anticuerpo modificado
mediante la modificación del locus genético de inmunoglobulinas
específicas de la célula por medio de la recombinación específica
del lugar regida por la cre-recombinasa. Esto se
realiza mediante la transfección de las células con tres vectores
diferentes, que causan la implantación de dos regiones loxP, una
secuencia de nucleótidos modificada y un gen marcador de la
selección en el locus de la inmunoglobulina de las células
productoras de anticuerpos.
El cometido en el que se basaba la presente
invención consistía en preparar un método nuevo para la optimización
de la activación genética endógena por medio de la recombinación
complementaria, en el cual se eliminaran al menos parcialmente los
inconvenientes de la tecnología actual.
La invención se refiere a un método para
preparar una célula eucariótica negativa de DHFR, preferiblemente
una célula de mamífero y en particular una célula humana, que se
caracteriza porque
- a)
- la célula es transfeccionada con un primer vector, que comprende
- (i)
- al menos una secuencia objetivo para una recombinasa específica del lugar,
- (ii)
- las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y
- (iii)
- si fuera preciso, un gen marcador de selección positivo y opcionalmente uno negativo,
- b)
- la célula transfeccionada es cultivada en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación complementaria del vector, y
- c)
- se consigue la célula obtenida según el apartado (b)
El gen marcador de la selección positivo se
dispone, siempre que exista, entre las secuencias complementarias a
un gen DHFR. El gen marcador de la selección negativo se dispone,
siempre que exista, fuera de las secuencias complementarias.
La denominación "recombinasa especifica del
lugar" conforme a la presente invención engloba proteínas y
complejos proteínicos, que permiten los almacenamientos de ADN en
una secuencia de ADN especifica, que incluye recombinasas
especificas del lugar del tipo de integrasas o
resolvasas-invertasas (Stark y cols., Trends. Genet.
8(1992), 432-439; Abremski y Hoess, Protein
Engineering 5(1992), 87-91; Khan et
al., Nucleic Acids Res. 19(1991),
851-860) y la recombinación especifica del lugar
conciliada por las endonucleasas codificadas por los intrones
(Perrin y cols. EMBO J. 12(1993), 2939-2947).
Las proteínas de recombinasa preferidas se eligen del grupo formado
por la FLP-recombinasa de episoma de 2 \mu de
Saccaromyces cerevisiae (por ejemplo, Falco y cols., Cel
29(1982), 573-584; Cox, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80(1983) 4223-4227; Konsolaki y
cols., New Biologist 4(1992), 551-557), la
Cre-recombinasa de E. coli Paguen P1 (por
ejemplo, Sauer y Henderson(1989)supra), la
R-recombinasa de
Zygosaccharomyces rouxii Plasmid pSR1(Matsuzaki y cols., J. Bacteriol. 172(1990), 610-618), la A-recombinasa de Kluyveromyces drososphilarium Plasmid pKD1 (Chen y cols., Nucleic Acids Res. 14(1986), 4471-4481), la A-recombinasa de Kluveromyces waltii-Plasmid pKW1 (Chen y cols., J. Gen. Microbiol. 138(1992), 337-345), de un componente del sistema de recombinación \lambda-Int (Landy, Annu Rev. Biochem. 5(1989), 913-949) y de un componente del sistema de recombinación Gin del Phagen \mu (Klippel y cols., EMBO J. 12(1993), 1047-1057). Además las proteínas de fusión descritas en una patente europea EP-B-O 707 599 de una recombinasa especifica del lugar y de un receptor nuclear o del dominio enlazado a los ligandos son también adecuadas. Se prefieren especialmente secuencias objetivo de la Cre-recombinasa, es decir secuencias loxP para el método conforme a la invención.
Zygosaccharomyces rouxii Plasmid pSR1(Matsuzaki y cols., J. Bacteriol. 172(1990), 610-618), la A-recombinasa de Kluyveromyces drososphilarium Plasmid pKD1 (Chen y cols., Nucleic Acids Res. 14(1986), 4471-4481), la A-recombinasa de Kluveromyces waltii-Plasmid pKW1 (Chen y cols., J. Gen. Microbiol. 138(1992), 337-345), de un componente del sistema de recombinación \lambda-Int (Landy, Annu Rev. Biochem. 5(1989), 913-949) y de un componente del sistema de recombinación Gin del Phagen \mu (Klippel y cols., EMBO J. 12(1993), 1047-1057). Además las proteínas de fusión descritas en una patente europea EP-B-O 707 599 de una recombinasa especifica del lugar y de un receptor nuclear o del dominio enlazado a los ligandos son también adecuadas. Se prefieren especialmente secuencias objetivo de la Cre-recombinasa, es decir secuencias loxP para el método conforme a la invención.
La elección de las secuencias complementarias
apropiadas se realiza, por ejemplo, según los métodos descritos en
WO90/11354 y WO91/09955.
Además las secuencias complementarias pueden
contener también modificaciones, que conducen a mutaciones en una
proteína expresada, como por ejemplo, mutaciones puntuales,
inserciones o /y deleciones o eliminaciones de algún aminoácido o
del total de segmentos de aminoácidos.
Según la invención puede emplearse cualquier
célula eucariótica, preferiblemente una célula de mamífero, en
particular una célula humana. El método conforme a la invención
puede llevarse a cabo con células no inmortalizadas, por ejemplo,
fibroblastos, pero también con células inmortalizadas, por ejemplo,
líneas celulares tumorales. Se prefieren células inmortalizadas.
Las soluciones y medios empleados en la
realización del método conforme a la invención se eligen
preferiblemente de manera que se presentan unas condiciones óptimas
en la respectiva etapa del proceso. El cultivo de células se realiza
con medios que contienen todas las sustancias necesarias para un
crecimiento celular suficiente y si fuera preciso se tamponan. Las
células se cultivan preferiblemente en un medio libre de suero. Se
prefiere especialmente la célula Namalwa-, HT1080 o HeLa S3.
El gen de amplificación se emplea
preferiblemente en una forma expresable, es decir, en acoplamiento
operativo con un promotor adecuado y se dispone en un vector de
manera que tras la integración complementaria del vector en el
genoma de la célula eucariótica se encuentre cerca del gen objetivo.
La realización de una etapa de amplificación conduce a un aumento
del numero de copias de gen objetivo en la célula. De este modo
puede lograrse otro aumento de expresión de la secuencia de ácido
nucleico endógeno. Ejemplos de genes de amplificación adecuados son
la dihidrofolatoreductasa (DHFR), adenosindeaminasa,
ornitindecarboxilasa o bien muteínas de este gen. Preferiblemente el
gen de amplificación es un gen DHFR o una forma mutada del mismo
(Simonsen y cols., Nucleic Acid Res. 1988,
16(5):2235-2246), en particular en células,
que contienen un gen DHFR endógeno.
Como marcador de selección positivo puede
emplearse cualquier gen de resistencia adecuado para una célula
eucariótica, que conduzca a un fenotipo seleccionable, como por
ejemplo una resistencia de antibiótico. Preferiblemente el gen
marcador de selección positivo es un gen de resistencia a la
neomicina, canamicina, geneticina o higromicina. Preferiblemente el
gen marcador de selección positivo se emplea en forma expresable, es
decir en acoplamiento operativo con un promotor adecuado.
Si se emplea un gen marcador de selección
negativo, se realiza normalmente además de la etapa de selección
positiva una segunda etapa de selección negativa. Esto tiene la
ventaja de que tras la realización de las etapas de selección los
clones identificados contienen una proporción pequeña de clones
falsos positivos, es decir de vectores integrados casualmente en el
genoma. El gen marcador de selección negativo es preferiblemente un
gen de timidina-kinasa (TK) o bien /y un gen de
hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa
(HGPRT).
Todos los vectores conforme a la invención
contienen además preferiblemente los elementos de secuencia
necesarios en las células anfitrionas para una propagación y una
amplificación, como por ejemplo, el origen de una replicación, el
gen marcador de la selección etc. Tras efectuar la recombinación
complementaria en el locus del DHFR ya no se puede sintetizar
ninguna proteína de DHFR funcional. Las secuencias del vector pueden
disponerse de tal manera que el promotor del gen de DHFR quede
inactivado y/o debido a una inserción o deleción en la secuencia
codificada del gen de DHFR ya no se pueda sintetizar ninguna
proteína DHFR funcional más.
Para inactivar ambos alelos de un gen de DHFR
las células son transfeccionadas inicialmente con un vector conforme
a la invención, son seleccionadas y se obtienen. En estas células se
inactiva un alelo del gen de DHFR, es decir, son heterocigotadas
(+/-) para el gen de DHFR. Luego estas células pueden ser
transfeccionadas de nuevo con un vector conforme a la invención, que
contenga preferiblemente un gen marcador de selección positivo del
primer vector. Tras una etapa de selección se obtienen las células
en las cuales ambos alelos DHFR están inactivados. Alternativamente
un aumento de la presión de selección puede conducir a una
conversión genética y por tanto a una inactivación de ambos alelos
(compárese, por ejemplo, Mortensen y cols., Mol. Cell. Biol..
12(1992), 2391-2395).
El método conforme a la invención prepara una
célula negativa de DHFR, cuyo uso en un método de amplificación del
gen tiene la ventaja de que no sintetiza ninguna proteína endógena
de DHFR. Al realizar una etapa de selección para la amplificación de
una secuencia de ácido nucleicos heterológica, que se acople a una
secuencia de ácidos nucleicos codificada para una proteína de DHFR,
no se producen influencias o efectos perjudiciales del producto de
expresión del gen endógeno de DHFR y por tanto se produce un aumento
de la eficacia de la amplificación del gen.
Como gen marcador de selección positivo se puede
emplear cualquier gen marcador de selección apropiado, que conduzca
a un fenotipo seleccionable, por ejemplo, la resistencia al
antibiótico. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico
codificadora para el gen marcador de selección positivo es un gen de
resistencia a la neomicina, canamicina, geneticina o
higromicina.
Se puede emplear cualquier gen marcador de la
selección negativo conocido por el técnico, preferiblemente la
secuencia de ácido nucleico codificadora para el gen marcador de
selección negativo es un gen de timidina-kinasa (TK)
o /y un gen de
hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa
(HGPRT).
La secuencia flanqueada por las secuencias
objetivo de recombinasa puede ser recortada del genoma de la célula
a través de la activación transitoria de la recombinasa
correspondiente, por ejemplo, mediante
- (a)
- La transfección de la célula con un vector, que engloba una secuencia de ácido nucleico codificadora para una recombinasa unida operativamente a una secuencia de control de la expresión activa o activable en esta célula y
- (b)
- El cultivo de la célula así transfeccionada en las condiciones en las cuales la recombinasa se expresa y es activa y
- (c)
- La obtención de la célula si ello fuera preciso.
Con el método conforme a la invención no es sólo
posible inactivar un gen de DHFR, sino que a través de una reacción
mediada por una recombinasa, recortar también secuencias de un gen
de DHFR, que se encuentren entre las secuencias objetivo de
recombinasa, así como el gen marcador de selección del genoma de una
célula implantado.
Si la secuencia flanqueada por secuencias
objetivo de recombinasa contiene un gen marcador de selección
positivo, la célula que contiene esta secuencia es resistente al
antibiótico. Por tanto puede ser fácilmente seleccionada según el
método conocido por el técnico.
Otra ventaja de una célula negativa de DHFR
fabricada conforme al método conforme a la invención es que sus
propiedades pueden ser caracterizadas por métodos conocidos por el
técnico y las células pueden ser finalmente empleadas para otros
métodos. Además pueden integrarse secuencias de ácidos nucleicos
específicas del lugar en el genoma a través de la secuencia objetivo
de recombinasa implantada en el locus genético del DHFR.
Otra forma de ejecución preferida equivale a un
método para introducir un gen de DHFR heterológico en una célula
eucariótica, que se caracteriza porque una célula negativa de DHFR
obtenida según el método descrito anterior-
mente
mente
- (a)
- es transfeccionada con un tercer vector, que engloba
- (i)
- si fuera preciso un gen marcador de selección positivo, que se diferencia del gen marcador de selección positivo del primer vector,
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para DHFR
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína que se va a amplificar en forma expresable y donde la secuencia de ácido nucleico está flanqueada por las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) en el lado 5' y 3', respectivamente, de al menos una secuencia objetivo de recombinasa,
- (b)
- la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se realiza una integración de la secuencia de ácido nucleico flanqueada por las secuencias objetivo de la recombinasa en la secuencia objetivo de recombinasa que ya se encuentra en un genoma de la célula y
- (c)
- se consigue la célula obtenida según el apartado (b).
El gen marcador de selección positivo, el gen
del DHFR y el gen objetivo codificador para la proteína deseada
están preferiblemente unidos de forma operativa, respectivamente,
con una secuencia de control de la expresión activa o activable en
la célula. En principio, también es posible un elemento
policistrónico con lugares de unión ribosomales internos. La
secuencia de ácido nucleico del gen objetivo que se va a amplificar
debería sin embargo ser accionada por medio de un promotor aparte.
Las secuencias de control de la expresión especialmente preferidas
son los promotores/intensificadores víricos. Lo que más se prefiere
es un promotor CMV para la expresión de la
proteína.
proteína.
Resulta preferible que la integración conforme a
la invención de secuencias heterológicas se realice en el genoma de
una célula de forma específica al lugar y por tanto se excluyan las
interferencias de secuencias heterológicas con secuencias genómicas.
Se pueden evitar así los inconvenientes ya descritos y como
resultado de ello, como por ejemplo, los clones de fabricación
inestables.
Para incrementar la velocidad de expresión de
una secuencia de ácido nucleico heterológica codificadora para una
proteína se puede llevar a cabo una etapa de amplificación con
metotrexato conforme a unas etapas conocidas del proceso.
Otro objetivo de la presente invención es un
vector, que engloba
- (i)
- opcionalmente un gen marcador de selección positivo
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR, y
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada en forma expresable,
donde la secuencia de ácido
nucleico a base de secuencias parciales (i), (ii) y (iii) en el lado
5' y 3', respectivamente, esté flanqueada por como mínimo una
secuencia objetivo de
recombinasa.
Otro objetivo de la presente invención es un
vector para la recombinación complementaria, que englobe
- (i)
- opcionalmente un gen marcador de selección positivo
- (ii)
- al menos una secuencia objetivo de recombinasa que flanquee la secuencia (i) y
- (iii)
- las secuencias de ADN que flanqueen las secuencias (i) e (ii), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en una célula, para permitir una recombinación complementaria, y
- (iv)
- si fuera preciso, un gen marcador de selección negativo fuera, preferiblemente en el lado 3' de la secuencia homóloga (iii).
\newpage
Además la invención se refiere a una célula
eucariótica, preferiblemente una célula humana, que se obtiene a
través de un método anteriormente descrito. Esta célula se
caracteriza porque
- a)
- al menos una secuencia endógena de ácido nucleico codificadora para una DHFR es inactivada, preferiblemente dos alelos endógenos y
- b)
- en la zona de esta secuencia de ácido nucleico codificadora para el DHFR al menos una secuencia objetivo de recombinasa está integrada en el genoma.
Finalmente otro objetivo de la invención es una
célula eucariótica, preferiblemente una célula humana, que se
caracteriza por una secuencia de ácido nucleico heterológica en la
región de un locus genético endógeno de DHFR que engloba
- (i)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada y
- (iii)
- al menos una secuencia objetivo de recombinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
- (A)
- muestra un vector para la recombinación complementaria que se emplea como primer vector. HR: secuencia complementaria, sec 1:primera secuencia de control de la expresión heterológica, R1:gen marcador de selección positivo, loxP: secuencia loxP con orientación,
- (B)
- muestra secuencias genómicas
- (a)
- tras la recombinación complementaria realizada
- (b)
- tras el recorte catalizado por una Cre-recombinasa de una secuencia flanqueada por secuencias loxP,
- (C)
- muestra un vector para una integración intervenida por la Cre-recombinasa, que engloba una secuencia dispuesta entre las secuencias loxP,
- (a)
- muestra secuencias genómicas tras la integración de un segundo vector en la secuencia loxP. R2: gen marcador de selección positivo, que se diferencia del R1, sec 2: segunda secuencia de control de la expresión heterológica.
\vskip1.000000\baselineskip
- (A)
- muestra un vector para la recombinación complementaria HR: secuencia complementaria, R-box: gen marcador de selección positivo y si se diera el caso negativo, loxP: secuencia loxP con orientación, HSV-tk: herpes simplex-timidinkinasa;
- (B)
- muestra un vector para la recombinación complementaria con una secuencia complementaria unilateral.
\vskip1.000000\baselineskip
- (A)
- muestra el vector pNDI para la recombinación complementaria en un locus genético de DHFR. Un gen marcador de selección positivo (Neo) es flanqueado por dos secuencias loxP. En el lado 5' de una secuencia loxP o bien en el lado 3' de otra secuencia loxP se encuentran las secuencias complementarias (región 5', 3' de DHFR) a un gen de DHFR.
- (B)
- muestra el vector pHDI para la recombinación complementaria en un locus genético de DHFR. Un gen marcador de selección positivo (Hyg) es flanqueado por dos secuencias loxP. En el lado 5' de una secuencia loxP o bien en el lado 3' de otra secuencia loxP se encuentran las secuencias complementarias a un gen de DHFR (región 5', 3' de DHFR).
\vskip1.000000\baselineskip
- (A)
- muestra la estructura genómica de un gen de DHFR con Exon 1, Exon 2 y Exon 3, así como los intrones situados entre ellos,
- (B)
- muestra de un modo esquemático un vector que corresponde a una figura 3, elemento de referencia,
- (C)
- muestra la estructura genómica conforme a la recombinación complementaria del vector realizada para la recombinación complementaria en un gen de DHFR. La distancia entre los puntos de corte EcoRI es de 2,9 kb si se utiliza el vector pNDI o bien 3,7 al utilizar el vector pHDI. Neo: neomicina, Hyg: higromicina, kb: kilobases
\vskip1.000000\baselineskip
Muestra un vector, que engloba una secuencia de
ácido nucleico codificadora para una proteína X y una secuencia de
ácido nucleico codificadora para una proteína de DHFR e incluye
respectivamente las secuencias reguladoras, que están flanqueadas
por dos secuencias loxP. Este vector puede emplearse en una
secuencia de loxP para la integración catalizada por la
Cre-recombinasa en el genoma.
SEC ID Nº 1 muestra una secuencia loxP.
En una primera etapa se fabrican vectores
conforme a la invención para la recombinación. Estos vectores son
transfeccionados en una segunda etapa en líneas celulares humanas y
son detectados en episodios de recombinación complementaria. De este
modo puede inactivarse primero un alelo, luego el segundo alelo para
el gen de DHFR.
El gen humano de DHFR se localiza en el
cromosoma 5 y engloba 30 kb, que se clasifican o subdividen en 6
exones. Un fragmento de EcoR1 de 1,8 kb, que contiene partes del
promotor, partes del exón 2 y el exón 1 completo se empleará para la
fabricación del vector para la recombinación complementaria. El exón
1 se separa mediante una digestión de Aapl y en el espacio o
abertura formada (0,45 kb) se coloca el gen de resistencia
Neo(1,4 kb) o bien Hyg(2,2 kb). Estos enlaces
contienen además la secuencia mínima a los nucleótidos adaptadores
TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA (secuencia loxP). Las
secuencias de enlace están dispuestas en la misma orientación, el
gen de resistencia preferiblemente en el sentido opuesto al gen de
DHFR. Una vez colocado el gen de resistencia, se amplifica la región
complementaria. Para ello se dilata el fragmento EcoRI de la zona 3’
(6,0 kb). Se obtienen con ello los elementos de referencia conforme
a la invención pNDI (11,5 kb) y pHDI (12,3 kb). Tras una
recombinación complementaria satisfactoria se separa el exón 1
completo (aminoácidos 1-28) y partes del promotor
del gen de DHFR. La célula no puede expresar ahora ninguna proteína
de DHFR funcional.
Las líneas celulares humanas empleadas no
deberían ser poliploides para el cromosoma 5 y no han sido
mantenidas bajo la selección MTX. En ambos casos tuvieron que
activarse más de 2 alelos.
Las células son cultivadas en frascos de cultivo
de tejido en un medio RPMI 1640, un 10% de suero bovino fetal,
L-glutamina 2 mM y MEM 1 mM (aminoácidos no
esenciales). La incubación se realiza a 37ºC y con un 5% de
CO_{2}. El tampón de electroporación contiene Hepes 20 mM, NaCl
138 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM,
D-glucosa-monohidrato 6 mM, pH 7,0.
Se efectúa la electroporación de 0,10 \mug de ADN vector
linearizado (pNDI) en 1 x 10^{7} células a 960 \muF y 250 V
(Biorad Gene Pulser). Tras la electroporación, las células se
colocan en un medio con 600 \mug/ml de G418 (Geneticin Boehringer
Mannheim) y se cultivan. Al cabo de 10 días de selección (cambio de
medio cada 2 días) se aislan los clones positivos y se expanden.
El cultivo y la selección de células se realiza
tal como se ha descrito para las células HeLa S3 con un medio de
DMEM con un 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2
mM y piruvato sódico 1 mM.
Esta línea celular es una línea celular de
suspensión y debe ser cultivada del modo correspondiente. El medio
corresponde al descrito para las células HeLa S3. Después de la
transfección, las células son distribuidas o repartidas en cuarenta
placas de 96 pocillos. Las clonas positivas son expandidas en placas
de 48, 24, 12 y 6 pocillos. La selección se realiza con 1 mg/ml de
G418.
La detección de la inserción del vector se
realiza por medio del análisis de Southern Blot o PCR. En una
recombinación complementaria efectuada correctamente se detecta una
banda de 2,9 kb tras la digestión del EcoR1 adicionalmente a una
banda de 1,8 kb, que representa el gen de DHFR intacto, la cual se
ha formado mediante la inserción del neo-gen (Figura
4c). Las clonas mixtas (relación desigual de la intensidad de bandas
en Southern Blot) se separan, subclonan y seguidamente se expanden
sobre un depósito celular en un FACS. En las clonas identificadas
como positivas un alelo del gen de DHFR está inactivado.
Las clonas celulares, en las cuales un alelo de
DHFR (+/-) está inactivado, pueden ser sometidas a una nueva
recombinación complementaria. Para ello son transfeccionadas tal
como se ha descrito con 10 \mug de ADN linearizado del vector
pHDI. La selección se realiza en un medio con 500 \mug/ml de
higromicina B (Boehringer Mannheim).
Mediante un incremento de la concentración de
G418 en un medio puede incrementarse la presión de selección en las
células de DHFR^{+/-} y se obtendrán células de DHFR^{-/-}. Una
conversión genética conduce a una recombinación intercromosómica, a
través de la cual se inactiva el segundo alelo de DHFR.
Las células de DHFR^{-/-} contienen dos alelos
de DHFR inactivados y no pueden sintetizar ningún tetrahidrofolato
más. Por ello debe añadirse al medio timidina, glicina y purina
(suplemento). Si fuera preciso se cultivan las células en un medio
Gibco BRL.
La detección de las células de DHFR^{-/-} se
realiza tal como se ha descrito antes. En el caso de células
negativas de DHFR homocigotos no se detecta ninguna banda del tipo
Wild (1,8 kb). Las células, que han sido transfeccionadas con pHDI,
muestran tras la recombinación complementaria una nueva banda de 3,7
kb en EcoR1 Southern Blot (Figura 4c).
Las células conforme a la invención pueden ser
empleadas para la producción elevada de proteínas. Para ello se
tranfecciona un vector conforme a la invención (conforme a la figura
5) y un vector de expresión codificador de una
Cre-recombinasa en las células de DHFR^{-/-}. La
Cre-recombinasa elimina la resistencia al
antibiótico del locus genético del DHFR e integra el vector conforme
a la invención en la secuencia de loxP en un genoma de la célula de
DHFR^{-/-}. Las células son de nuevo sensibles al antibiótico e
independientes de un suplemento de timidina, glicina y purina.
La selección puede realizarse mediante el empleo
de un medio sin suplemento o mediante la adición de un antibiótico
adecuado al medio de cultivo. El antibiótico corresponde por ello al
gen de resistencia, que es eliminado mediante la
Cre-recombinasa del genoma de la célula. Si el
vector integrado contiene un gen marcador de selección positivo,
entonces la selección puede realizarse mediante la adición de este
antibiótico al medio.
Para incrementar la potencia de producción de
las células para la proteína recombinante, se realiza una selección
del metotrexato (MTX), a través de la cual el gen de DHFR
introducido en la célula y la secuencia de ácido nucleico
heterológica codificadora para una proteína se amplifican.
Para conseguir una amplificación, se cultivan
las células en presencia de unas concentraciones crecientes
(100-1000 mM) de MTX. El grado de amplificación se
realiza a través de la evaluación densitométrica de Southern blots
comparables (antes, durante y después de la adición de MTX).
Las células conforme a la invención obtenidas
tras la etapa de amplificación contienen muchas copias del gen de
DHFR introducido en el locus de loxP y de la secuencia de ácido
nucleico heterológica introducida. Se caracterizan por una elevada
potencia de producción del ácido nucleico heterológico.
A continuación se presentan las formas de
ejecución preferidas de la invención como componentes de la
descripción:
1. Método para la preparación de una célula
eucariótica negativa de DHFR, que se caracteriza porque,
(a) la célula es transfeccionada con un primer
vector, que engloba
- (i)
- al menos una secuencia objetivo para una recombinasa específica del lugar,
- (ii)
- las secuencias de ADN que flanquean la secuencia (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y
- (iii)
- si se diera el caso, un gen marcador de selección positivo y si fuera preciso negativo,
(b) la célula transfeccionada es cultivada en
unas condiciones, en las cuales se realiza una recombinación
complementaria del vector, y
(c) se consigue la célula obtenida conforme al
apartado (b).
2. Método según el punto 1, que se caracteriza
por,
que se emplean las secuencias de loxP como
secuencias objetivo de recombinasa.
3. Método conforme a uno de los puntos 1 ó 2,
que se caracteriza por, que la secuencia de ácido nucleico
codificadora para el gen marcador de selección positivo, es un gen
de resistencia de neomicina, canamicina, geneticina o
higromicina.
4. Método conforme a uno de los puntos 1 hasta
3, que se caracteriza por, que la secuencia flanqueada por las
secuencias objetivo de recombinasa es recortada del genoma de la
célula mediante una activación transitoria de la recombinasa
correspondiente.
5. Método conforme a uno de los puntos 1 hasta
4, que se caracteriza por, que la secuencia flanqueada por las
secuencias objetivo de recombinasa es recortada del genoma de la
célula mediante una activación transitoria de la recombinasa
correspondiente.
6. Método para introducir un gen de DHFR
heterológico en una célula eucariótica, que se caracteriza por,
que una célula obtenida mediante el método
conforme al punto 5
(a) es transfeccionada con un tercer vector, que
engloba
- (i)
- si se diera el caso un gen marcador de selección positivo, que preferiblemente se diferencia del gen marcador de selección positivo del primer vector
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína que va a ser amplificada y donde la secuencia de ácido nucleico de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) es flanqueada por el lado 5' y 3', respectivamente, por como mínimo una secuencia objetivo de recombinasa,
(b) la célula transfeccionada se cultiva en unas
condiciones, en las cuales se realiza una integración de la
secuencia de ácido nucleico flanqueada por las secuencias objetivo
de recombinasa en la secuencia objetivo de recombinasa que ya se
encuentra en un genoma de la célula y
c) se obtiene la célula conseguida según el
apartado (b).
7. Vector, que engloba
- (i)
- opcionalmente, un gen marcador de selección positivo
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR y
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada en forma expresable,
donde la secuencia de ácido
nucleico está flanqueada por como mínimo una secuencia objetivo de
recombinasa de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) en el lado
5' y 3',
respectivamente.
8. Vector para la recombinación complementaria,
que engloba
- (i)
- opcionalmente, un gen marcador de selección positivo,
- (ii)
- al menos una secuencia objetivo de recombinasa, que flanquea la secuencia (i),
- (iii)
- las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i) y (ii), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en una célula, para permitir una recombinación complementaria y
- (iv)
- opcionalmente, un gen marcador de selección fuera de las secuencias complementarias (iii).
\newpage
9. Células eucarióticas, preferiblemente células
humanas, que se obtienen a través de un método según uno de los
puntos 1 hasta 6.
10. Células eucarióticas, preferiblemente
células humanas, que se caracterizan porque
(a) al menos una secuencia de ácido nucleico
codificadora para un DHFR, endógena, es inactivada y
(b) en la zona de esa secuencia de ácido
nucleico codificadora para el DHFR al menos una secuencia de ácido
nucleico de recombinasa está integrada en el genoma.
11. Células eucarióticas, preferiblemente
células humanas, que se caracterizan por
una secuencia de ácido nucleico heterológica en
la zona de un locus genético endógeno de DHFR, que engloba
- (i)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada y
- (iii)
- al menos una secuencia objetivo de recombinasa.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Inscripción:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Nombre: Boehringer Mannheim GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Calle: Sandhofer Strasse 112-132
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Lugar: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- País: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (e)
- Código postal: D-68305
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Nombre de la invención: Optimización de células para la activación genética endógena
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Número de secuencias: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Versión legible del ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Soporte de datos: Floppy Disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Ordenador: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Sistema de funcionamiento: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Software: PatentIn Release nº 1.0, versión 1.30(EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Datos respecto a la sec. ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- Longitud: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- Tipo: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- Forma de ramificación: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- Descripción de la secuencia: Sec ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA
\hfill
Claims (6)
1. Método para preparar una célula eucariótica
negativa de DHFR, que se caracteriza porque
(a) la célula es transfeccionada con un primer
vector, que comprende
- (i)
- al menos una secuencia objetivo para una recombinasa específica del lugar,
- (ii)
- las secuencias de ADN que flanquean la secuencia (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y
- (iii)
- opcionalmente, un gen marcador de selección positivo y opcionalmente uno negativo
b) la célula transfeccionada se cultiva en unas
condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación
complementaria del vector, y
c) se consigue la célula obtenida según el
apartado (b)
2. Método para introducir un gen de DHFR
heterológico en una célula eucariótica, que se caracteriza
por,
que una célula obtenida según el método conforme
a la reivindicación 1
(a) es transfeccionada con un tercer vector, que
incluye
- (i)
- opcionalmente un gen marcador de selección positivo, que se diferencia preferiblemente del gen marcador de selección positivo del primer vector,
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico en forma expresable, codificadora para una proteína que va a ser amplificada y
- por la que la secuencia de ácido nucleico de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) es flanqueada en el lado 5' y 3' respectivamente, por al menos una secuencia objetivo de recombinasa,
(b) la célula transfeccionada se cultiva en unas
condiciones, en las cuales se realiza una integración de la
secuencia de ácido nucleico flanqueada por las secuencias objetivo
de recombinasa en la secuencia objetivo de recombinasa que ya se
encuentra en un genoma de la célula y
(c) se obtiene la célula conseguida según el
apartado (b).
3. Vector, que incluye
- (i)
- opcionalmente un gen marcador de selección positivo,
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR
- (iii)
- una secuencia de ácido nucleico en forma expresable, codificadora para una proteína deseada,
- por lo que la secuencia de ácido nucleico de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) está flanqueada en el lado 5' y 3', respectivamente, por al menos una secuencia objetivo de recombinasa.
4. Vector para la recombinación complementaria,
que comprende
- (i)
- opcionalmente, un gen marcador de selección positivo
- (ii)
- al menos una secuencias objetivo de recombinasa flanqueando la secuencia (i),
- (iii)
- las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i) y (ii) que son complementarias a un segmento de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en una célula, para permitir una recombinación complementaria, y
- (iv)
- si fuera preciso un gen marcador de selección negativo fuera de las secuencias complementarias (iii).
\newpage
5. Célula eucariótica, preferiblemente célula
humana, que se caracteriza porque,
(a) al menos una secuencia de ácido nucleico
endógena, codificadora para un DHFR, es inactivada y
(b) en la zona de esta secuencia de ácido
nucleico codificadora para el DHFR al menos una secuencia objetivo
de recombinasa está integrada en el genoma.
6. Célula eucariótica, preferiblemente célula
humana, que se caracteriza por
una secuencia de ácido nucleico heterológica, en
la zona de un locus genético endógeno de DHFR, que incluye
- (i)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,
- (ii)
- una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada
- (iii)
- al menos una secuencia objetivo de recombinasa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121075 | 1997-12-01 | ||
| EP97121075 | 1997-12-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2259422T3 true ES2259422T3 (es) | 2006-10-01 |
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Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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