ES2259422T3

ES2259422T3 - Optimizacion de celulas para la activacion endogena del gen.

Info

Publication number: ES2259422T3
Application number: ES04006966T
Authority: ES
Inventors: Konrad Honold; Thomas Holtschke; Anne Stern
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2006-10-01
Anticipated expiration: 2018-12-01
Also published as: DK0919619T3; EP1464705A1; CN1240829A; EP0919619A2; EP0957165A3; JP4629813B2; AR018022A1; AR020892A2; CN1232644C; PT957165E; PT1464705E; DK0957165T3; ATE320491T1; DE59813438D1; CA2252970C; KR100367062B1; DE59813413D1; TR199802503A2; CA2252970A1; ATE360067T1

Abstract

Método para preparar una célula eucariótica negativa de DHFR, que se caracteriza porque: (a) la célula es transfeccionada con un primer vector, que comprende (i) al menos una secuencia objetivo para una recombinasa específica del lugar, (ii) las secuencias de ADN que flanquean la secuencia (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y (iii) opcionalmente, un gen marcador de selección positivo y opcionalmente uno negativo b) la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación complementaria del vector, y c) se consigue la célula obtenida según el apartado (b).

Description

Optimización de células para la activación endógena del gen.

La invención se refiere a un método para la optimización de la expresión o manifestación de un gen en las células. La invención hace referencia a un método para preparar una célula eucariótica negativa de DHFR que contiene una secuencia objetivo de recombinasa así como la expresión o manifestación de una secuencia de ácido nucleico insertada en la secuencia objetivo de la recombinasa.

La expresión de un gen en una célula puede efectuarse de forma constitutiva, por ejemplo, en los denominados genes Housekeeping, o bien de forma regulada. La expresión regulada es especialmente necesaria para los genes, los cuales deben ser expresados únicamente en un estadio de desarrollo determinado de la célula o bien en un cambio de las condiciones ambientales.

La expresión se regula a nivel de transcripción a través del promotor unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico codificada, cuya actividad puede ser controlada a través de represores y activadores. Un enlace de los represores o de los activadores a las secuencias de ácido nucleico no codificadas del gen puede producir una disminución o un aumento de la actividad del promotor (L. Stryer, Biochemie, capitulo 12, Spectrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft, Heidelberg, 1990). La cantidad de represores o de activadores contenidos en una célula es regulada de nuevo por factores como, por ejemplo, las condiciones ambientales. Un ejemplo de activadores son los factores que inducen hipoxia (HIF), que son inducidos por una oferta de O_{2} reducida y conducen a una elevada expresión del gen de eritropoyetina (Blanchard K.L, y cols., Hypoxic induction of the human erythropoietin gene: Cooperation between the promotor and enhancer, each of which contains steroid receptor response elements, (1992), Mol. Cell. Biol. 12,5373-5385: Wang G.L. y Semenza G.L., Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia, (1993), J. Biol. Chem., 268, 21513-21518; Wang G.L., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O_{2} tension, (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5510-5514).

Además, la cantidad de una proteína expresada o manifestada depende de la estabilidad del ARNm. En un sector lateral 3' de un ARNm se localizan secuencias de reconocimiento para los enzimas desintegrados del ARNm, que influyen en la estabilidad del ARNm y por tanto en la magnitud de la expresión (Shaw G. y Kamen R., A conserved AU sequence from the 3'untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation, Cell (1986), 659-667). El periodo de semidesintegración del ARNm se correlaciona pues con la cantidad de proteína expresada. Un tercer nivel de la regulación de la expresión es la traslación.

La expresión de un gen se basa por tanto en unos mecanismos de regulación complejos, que pueden ser muy diferentes en cada caso.

Las proteínas pueden obtenerse con ayuda de la tecnología del ADN recombinante, que aprovecha los conocimientos de la regulación de la expresión (Sambrook u cols., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Col Spring Harbor). Para ello se emplean vectores que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína correspondiente bajo el control de un promotor adecuado, así como otras secuencias necesarias para la expresión de la proteína y para la replicación del vector. El vector se introduce entonces mediante un método conocido en una célula anfitriona, la célula se cultiva y la proteína recombinante puede obtenerse a partir de la célula o del medio de cultivo.

Como células anfitrionas se pueden emplear las células procarióticas o eucarióticas. Las procarióticas, en particular las células de E. coli, no son problemáticas en lo que se refiere a su manipulación, pero presentan una serie de inconvenientes en una expresión recombinante de proteínas eucarióticas.

Los procariotos y eucariotos se distinguen por una vía de procesamiento de la expresión, en las condiciones del medio celular así como en el "Chaperon" que interviene en el tratamiento de la proteína. Por eso pueden aparecer diferencias decisivas en una proteína eucariótica fabricada en los procariotos en comparación con la proteína nativa correspondiente. Por ejemplo, la muestra de plegamiento de la proteína y la actividad de la proteína varían. Además las proteínas en una célula procariótica generalmente no se glucosilan. Una muestra de glucosilación correcta equivale en muchos casos, por ejemplo en la síntesis de proteínas para una formula farmacéutica, a una característica decisiva para la eficacia y la tolerancia.

Las proteínas glucosiladas son fabricadas pues por medio de células anfitrionas eucarióticas o líneas celulares, por ejemplo CHO (Chinese Hamster Ovary). A pesar de la utilización de las células eucarióticas pueden aparecer cambios en la proteína fabricada de forma recombinante debido a las diferentes especies, por ejemplo, en la expresión de una proteína humana en células no humanas, lo que hace que ésta no se pueda utilizar en muchas aplicaciones.

Para la fabricación recombinante de proteínas las células anfitrionas ocasionales o transitorias o bien estables son transfeccionadas con vectores de expresión, donde se emplean células transfeccionadas estables especialmente en un método de fabricación muy técnico.

La integración casual poco especifica de las secuencias del vector de expresión en el genoma de la célula puede llevar a células con un rendimiento de producción escaso o a unas propiedades celulares inestables. Por ejemplo, puede disminuir el rendimiento de producción en el transcurso del proceso de producción o bien la capacidad de las células de expresar la proteína recombinante puede perderse del todo.

Un método para el incremento de la expresión del gen es la amplificación del gen, en la cual una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína se acopla a un gen de amplificación. A través de una etapa de selección se consigue una replicación de ambas secuencias, que conduce a una expresión elevada (Schimke R.T. Ed) (1982), Gene amplifikation, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY).

La EP 0 747 485 describe un método para la fabricación de proteínas de mamíferos mediante la transformación de las células anfitrionas de los mamíferos a través de una recombinación complementaria. La transformación de las células, que contienen un gen objetivo endógeno se realiza con ayuda de un vector, que engloba un gen de amplificación y/o una secuencia de control de nucleótidos heterológica así como al menos una región de flanqueo, que es complementaria a una zona del genoma de la célula anfitriona del interior del gen objetivo endógeno.

Como gen de amplificación puede emplearse, por ejemplo, un ácido nucleico codificado para una dihidrofolatoreductasa (DHFR) (Kaufmann R.J., Sharp P.A. (1982), Amplifikation and expression of sequences contransfected with a modular dihydrofolatereductase complementary DNA gene, J. Mol. Biol.. 159:601ff).

Mediante una etapa de selección llevada a cabo con metotrexato se obtienen células que son resistentes frente al metotrexato y que contienen en su genoma la secuencia de ácido nucleico en una amplificación de 20 hasta 50 veces codificada para una DHFR y acoplada con ella (R. Knippers, 1982, Moleculare Genetik, Thieme, Stuttgart).

Un método de amplificación del gen de este tipo se lleva a cabo del modo mas eficaz con una célula negativa de DHFR. La JP-62265992 describe, por ejemplo, una célula negativa humana de DHFR. Sin embargo, en esta célula no se halla ningún indicio de una integración especifica del lugar de un vector de expresión por medio de una recombinación complementaria y una amplificación de esta secuencia.

Incluso al llevar a cabo un proceso de amplificación del gen pueden aparecer los inconvenientes anteriormente indicados como, por ejemplo la inestabilidad de las células, debido a la casual integración del vector de expresión en el genoma.

Únicamente en caso de una integración especifica del lugar del ADN externo en un locus genético seleccionado a través de una recombinación complementaria, se pueden evitar los inconvenientes descritos. Los métodos correspondientes son conocidos y se conocen como Gentargeting (WO 90/11354; WO 91/09955). Por lo que la célula es transfeccionada con un vector, que contiene un gen marcador de selección positivo, flanqueado por secuencias de ácido nucleico, que son complementarias a las secuencias de un gen locus, en las que el vector debe integrarse en el genoma de la célula. Entre las secuencias complementarias del ácido nucleico se halla otra secuencia de control de la expresión heterológica, para incrementar la expresión del gen objetivo o específico en la célula, y si se diera el caso, un gen de amplificación, para incrementar el numero de copias del gen objetivo.

Un inconveniente del método de Gentargeting conocido hasta el momento consiste en que la fabricación de células con propiedades, que facilitan la fabricación de una proteína deseada en una cantidad y calidad suficientes para los fines comerciales, frecuentemente esta relacionada con un gasto elevado. En particular la elección de secuencias de control de la expresión óptimas o/y genes de amplificación para la expresión de una proteína objetivo deseada requiere a menudo un numero considerable de series de ensayo para la recombinación complementaria, las cuales debido al costoso procedimiento del aislamiento de clones, en los cuales ha tenido lugar el suceso de recombinación deseado, están unidas a un gasto muy elevado.

La recombinación complementaria se puede emplear también para interrumpir la expresión de determinados genes en una célula y para efectuar estudios de funcionamiento de las proteínas. Para ello se producen ratones Knockout de manera que para un gen que codifica la proteína que se va a investigar en las células madre embrionales se desconecta o interrumpe a través de la recombinación complementaria. Tras efectuar otras etapas del proceso se obtienen los ratones, los cuales debido a la inactivación de ambos alelos de este gen no pueden expresar ninguna proteína funcional antes del inicio de su desarrollo (Thomas K.R., Capecchi M.R., (1987), Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells, Cell 51:503-512).

Para interrumpir o desconectar un determinado gen especifico de tiempo y tejido, y para investigarlo puede emplearse el sistema Cre-Lox. Para ello se introduce un fragmento flanqueado por dos secuencias lox-P a través de una recombinación complementaria en el genoma de una célula y seguidamente puede recortarse de nuevo del genoma a través de una Cre-Recombinasa expresada en la célula (Sauer B, Henderson N (1989):Site-specific DNA recombination at loxPsites placed into the genome of mammalian cells. Nuc Acid Res 17:147-161; Sauer B, Hederson N. (1990), Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase, New Biol..
5:441-449).

La WO 96/30498 describe un método para la fabricación de células, las cuales expresan un anticuerpo modificado mediante la modificación del locus genético de inmunoglobulinas específicas de la célula por medio de la recombinación específica del lugar regida por la cre-recombinasa. Esto se realiza mediante la transfección de las células con tres vectores diferentes, que causan la implantación de dos regiones loxP, una secuencia de nucleótidos modificada y un gen marcador de la selección en el locus de la inmunoglobulina de las células productoras de anticuerpos.

El cometido en el que se basaba la presente invención consistía en preparar un método nuevo para la optimización de la activación genética endógena por medio de la recombinación complementaria, en el cual se eliminaran al menos parcialmente los inconvenientes de la tecnología actual.

La invención se refiere a un método para preparar una célula eucariótica negativa de DHFR, preferiblemente una célula de mamífero y en particular una célula humana, que se caracteriza porque

a): la célula es transfeccionada con un primer vector, que comprende

(i): al menos una secuencia objetivo para una recombinasa específica del lugar,

(ii): las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y

(iii): si fuera preciso, un gen marcador de selección positivo y opcionalmente uno negativo,

b): la célula transfeccionada es cultivada en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación complementaria del vector, y

c): se consigue la célula obtenida según el apartado (b)

El gen marcador de la selección positivo se dispone, siempre que exista, entre las secuencias complementarias a un gen DHFR. El gen marcador de la selección negativo se dispone, siempre que exista, fuera de las secuencias complementarias.

La denominación "recombinasa especifica del lugar" conforme a la presente invención engloba proteínas y complejos proteínicos, que permiten los almacenamientos de ADN en una secuencia de ADN especifica, que incluye recombinasas especificas del lugar del tipo de integrasas o resolvasas-invertasas (Stark y cols., Trends. Genet. 8(1992), 432-439; Abremski y Hoess, Protein Engineering 5(1992), 87-91; Khan et al., Nucleic Acids Res. 19(1991), 851-860) y la recombinación especifica del lugar conciliada por las endonucleasas codificadas por los intrones (Perrin y cols. EMBO J. 12(1993), 2939-2947). Las proteínas de recombinasa preferidas se eligen del grupo formado por la FLP-recombinasa de episoma de 2 \mu de Saccaromyces cerevisiae (por ejemplo, Falco y cols., Cel 29(1982), 573-584; Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983) 4223-4227; Konsolaki y cols., New Biologist 4(1992), 551-557), la Cre-recombinasa de E. coli Paguen P1 (por ejemplo, Sauer y Henderson(1989)supra), la R-recombinasa de
Zygosaccharomyces rouxii Plasmid pSR1(Matsuzaki y cols., J. Bacteriol. 172(1990), 610-618), la A-recombinasa de Kluyveromyces drososphilarium Plasmid pKD1 (Chen y cols., Nucleic Acids Res. 14(1986), 4471-4481), la A-recombinasa de Kluveromyces waltii-Plasmid pKW1 (Chen y cols., J. Gen. Microbiol. 138(1992), 337-345), de un componente del sistema de recombinación \lambda-Int (Landy, Annu Rev. Biochem. 5(1989), 913-949) y de un componente del sistema de recombinación Gin del Phagen \mu (Klippel y cols., EMBO J. 12(1993), 1047-1057). Además las proteínas de fusión descritas en una patente europea EP-B-O 707 599 de una recombinasa especifica del lugar y de un receptor nuclear o del dominio enlazado a los ligandos son también adecuadas. Se prefieren especialmente secuencias objetivo de la Cre-recombinasa, es decir secuencias loxP para el método conforme a la invención.

La elección de las secuencias complementarias apropiadas se realiza, por ejemplo, según los métodos descritos en WO90/11354 y WO91/09955.

Además las secuencias complementarias pueden contener también modificaciones, que conducen a mutaciones en una proteína expresada, como por ejemplo, mutaciones puntuales, inserciones o /y deleciones o eliminaciones de algún aminoácido o del total de segmentos de aminoácidos.

Según la invención puede emplearse cualquier célula eucariótica, preferiblemente una célula de mamífero, en particular una célula humana. El método conforme a la invención puede llevarse a cabo con células no inmortalizadas, por ejemplo, fibroblastos, pero también con células inmortalizadas, por ejemplo, líneas celulares tumorales. Se prefieren células inmortalizadas.

Las soluciones y medios empleados en la realización del método conforme a la invención se eligen preferiblemente de manera que se presentan unas condiciones óptimas en la respectiva etapa del proceso. El cultivo de células se realiza con medios que contienen todas las sustancias necesarias para un crecimiento celular suficiente y si fuera preciso se tamponan. Las células se cultivan preferiblemente en un medio libre de suero. Se prefiere especialmente la célula Namalwa-, HT1080 o HeLa S3.

El gen de amplificación se emplea preferiblemente en una forma expresable, es decir, en acoplamiento operativo con un promotor adecuado y se dispone en un vector de manera que tras la integración complementaria del vector en el genoma de la célula eucariótica se encuentre cerca del gen objetivo. La realización de una etapa de amplificación conduce a un aumento del numero de copias de gen objetivo en la célula. De este modo puede lograrse otro aumento de expresión de la secuencia de ácido nucleico endógeno. Ejemplos de genes de amplificación adecuados son la dihidrofolatoreductasa (DHFR), adenosindeaminasa, ornitindecarboxilasa o bien muteínas de este gen. Preferiblemente el gen de amplificación es un gen DHFR o una forma mutada del mismo (Simonsen y cols., Nucleic Acid Res. 1988, 16(5):2235-2246), en particular en células, que contienen un gen DHFR endógeno.

Como marcador de selección positivo puede emplearse cualquier gen de resistencia adecuado para una célula eucariótica, que conduzca a un fenotipo seleccionable, como por ejemplo una resistencia de antibiótico. Preferiblemente el gen marcador de selección positivo es un gen de resistencia a la neomicina, canamicina, geneticina o higromicina. Preferiblemente el gen marcador de selección positivo se emplea en forma expresable, es decir en acoplamiento operativo con un promotor adecuado.

Si se emplea un gen marcador de selección negativo, se realiza normalmente además de la etapa de selección positiva una segunda etapa de selección negativa. Esto tiene la ventaja de que tras la realización de las etapas de selección los clones identificados contienen una proporción pequeña de clones falsos positivos, es decir de vectores integrados casualmente en el genoma. El gen marcador de selección negativo es preferiblemente un gen de timidina-kinasa (TK) o bien /y un gen de hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa (HGPRT).

Todos los vectores conforme a la invención contienen además preferiblemente los elementos de secuencia necesarios en las células anfitrionas para una propagación y una amplificación, como por ejemplo, el origen de una replicación, el gen marcador de la selección etc. Tras efectuar la recombinación complementaria en el locus del DHFR ya no se puede sintetizar ninguna proteína de DHFR funcional. Las secuencias del vector pueden disponerse de tal manera que el promotor del gen de DHFR quede inactivado y/o debido a una inserción o deleción en la secuencia codificada del gen de DHFR ya no se pueda sintetizar ninguna proteína DHFR funcional más.

Para inactivar ambos alelos de un gen de DHFR las células son transfeccionadas inicialmente con un vector conforme a la invención, son seleccionadas y se obtienen. En estas células se inactiva un alelo del gen de DHFR, es decir, son heterocigotadas (+/-) para el gen de DHFR. Luego estas células pueden ser transfeccionadas de nuevo con un vector conforme a la invención, que contenga preferiblemente un gen marcador de selección positivo del primer vector. Tras una etapa de selección se obtienen las células en las cuales ambos alelos DHFR están inactivados. Alternativamente un aumento de la presión de selección puede conducir a una conversión genética y por tanto a una inactivación de ambos alelos (compárese, por ejemplo, Mortensen y cols., Mol. Cell. Biol.. 12(1992), 2391-2395).

El método conforme a la invención prepara una célula negativa de DHFR, cuyo uso en un método de amplificación del gen tiene la ventaja de que no sintetiza ninguna proteína endógena de DHFR. Al realizar una etapa de selección para la amplificación de una secuencia de ácido nucleicos heterológica, que se acople a una secuencia de ácidos nucleicos codificada para una proteína de DHFR, no se producen influencias o efectos perjudiciales del producto de expresión del gen endógeno de DHFR y por tanto se produce un aumento de la eficacia de la amplificación del gen.

Como gen marcador de selección positivo se puede emplear cualquier gen marcador de selección apropiado, que conduzca a un fenotipo seleccionable, por ejemplo, la resistencia al antibiótico. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico codificadora para el gen marcador de selección positivo es un gen de resistencia a la neomicina, canamicina, geneticina o higromicina.

Se puede emplear cualquier gen marcador de la selección negativo conocido por el técnico, preferiblemente la secuencia de ácido nucleico codificadora para el gen marcador de selección negativo es un gen de timidina-kinasa (TK) o /y un gen de hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa (HGPRT).

La secuencia flanqueada por las secuencias objetivo de recombinasa puede ser recortada del genoma de la célula a través de la activación transitoria de la recombinasa correspondiente, por ejemplo, mediante

(a): La transfección de la célula con un vector, que engloba una secuencia de ácido nucleico codificadora para una recombinasa unida operativamente a una secuencia de control de la expresión activa o activable en esta célula y

(b): El cultivo de la célula así transfeccionada en las condiciones en las cuales la recombinasa se expresa y es activa y

(c): La obtención de la célula si ello fuera preciso.

Con el método conforme a la invención no es sólo posible inactivar un gen de DHFR, sino que a través de una reacción mediada por una recombinasa, recortar también secuencias de un gen de DHFR, que se encuentren entre las secuencias objetivo de recombinasa, así como el gen marcador de selección del genoma de una célula implantado.

Si la secuencia flanqueada por secuencias objetivo de recombinasa contiene un gen marcador de selección positivo, la célula que contiene esta secuencia es resistente al antibiótico. Por tanto puede ser fácilmente seleccionada según el método conocido por el técnico.

Otra ventaja de una célula negativa de DHFR fabricada conforme al método conforme a la invención es que sus propiedades pueden ser caracterizadas por métodos conocidos por el técnico y las células pueden ser finalmente empleadas para otros métodos. Además pueden integrarse secuencias de ácidos nucleicos específicas del lugar en el genoma a través de la secuencia objetivo de recombinasa implantada en el locus genético del DHFR.

Otra forma de ejecución preferida equivale a un método para introducir un gen de DHFR heterológico en una célula eucariótica, que se caracteriza porque una célula negativa de DHFR obtenida según el método descrito anterior-
mente

(a): es transfeccionada con un tercer vector, que engloba

(i): si fuera preciso un gen marcador de selección positivo, que se diferencia del gen marcador de selección positivo del primer vector,

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para DHFR

(iii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína que se va a amplificar en forma expresable y donde la secuencia de ácido nucleico está flanqueada por las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) en el lado 5' y 3', respectivamente, de al menos una secuencia objetivo de recombinasa,

(b): la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se realiza una integración de la secuencia de ácido nucleico flanqueada por las secuencias objetivo de la recombinasa en la secuencia objetivo de recombinasa que ya se encuentra en un genoma de la célula y

(c): se consigue la célula obtenida según el apartado (b).

El gen marcador de selección positivo, el gen del DHFR y el gen objetivo codificador para la proteína deseada están preferiblemente unidos de forma operativa, respectivamente, con una secuencia de control de la expresión activa o activable en la célula. En principio, también es posible un elemento policistrónico con lugares de unión ribosomales internos. La secuencia de ácido nucleico del gen objetivo que se va a amplificar debería sin embargo ser accionada por medio de un promotor aparte. Las secuencias de control de la expresión especialmente preferidas son los promotores/intensificadores víricos. Lo que más se prefiere es un promotor CMV para la expresión de la
proteína.

Resulta preferible que la integración conforme a la invención de secuencias heterológicas se realice en el genoma de una célula de forma específica al lugar y por tanto se excluyan las interferencias de secuencias heterológicas con secuencias genómicas. Se pueden evitar así los inconvenientes ya descritos y como resultado de ello, como por ejemplo, los clones de fabricación inestables.

Para incrementar la velocidad de expresión de una secuencia de ácido nucleico heterológica codificadora para una proteína se puede llevar a cabo una etapa de amplificación con metotrexato conforme a unas etapas conocidas del proceso.

Otro objetivo de la presente invención es un vector, que engloba

(i): opcionalmente un gen marcador de selección positivo

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR, y

(iii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada en forma expresable,

donde la secuencia de ácido nucleico a base de secuencias parciales (i), (ii) y (iii) en el lado 5' y 3', respectivamente, esté flanqueada por como mínimo una secuencia objetivo de recombinasa.

Otro objetivo de la presente invención es un vector para la recombinación complementaria, que englobe

(i): opcionalmente un gen marcador de selección positivo

(ii): al menos una secuencia objetivo de recombinasa que flanquee la secuencia (i) y

(iii): las secuencias de ADN que flanqueen las secuencias (i) e (ii), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en una célula, para permitir una recombinación complementaria, y

(iv): si fuera preciso, un gen marcador de selección negativo fuera, preferiblemente en el lado 3' de la secuencia homóloga (iii).

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Además la invención se refiere a una célula eucariótica, preferiblemente una célula humana, que se obtiene a través de un método anteriormente descrito. Esta célula se caracteriza porque

a): al menos una secuencia endógena de ácido nucleico codificadora para una DHFR es inactivada, preferiblemente dos alelos endógenos y

b): en la zona de esta secuencia de ácido nucleico codificadora para el DHFR al menos una secuencia objetivo de recombinasa está integrada en el genoma.

Finalmente otro objetivo de la invención es una célula eucariótica, preferiblemente una célula humana, que se caracteriza por una secuencia de ácido nucleico heterológica en la región de un locus genético endógeno de DHFR que engloba

(i): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada y

(iii): al menos una secuencia objetivo de recombinasa.

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Descripción de las figuras Figura 1

(A): muestra un vector para la recombinación complementaria que se emplea como primer vector. HR: secuencia complementaria, sec 1:primera secuencia de control de la expresión heterológica, R1:gen marcador de selección positivo, loxP: secuencia loxP con orientación,

(B): muestra secuencias genómicas

(a): tras la recombinación complementaria realizada

(b): tras el recorte catalizado por una Cre-recombinasa de una secuencia flanqueada por secuencias loxP,

(C): muestra un vector para una integración intervenida por la Cre-recombinasa, que engloba una secuencia dispuesta entre las secuencias loxP,

(a): muestra secuencias genómicas tras la integración de un segundo vector en la secuencia loxP. R2: gen marcador de selección positivo, que se diferencia del R1, sec 2: segunda secuencia de control de la expresión heterológica.

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Figura 2

(A): muestra un vector para la recombinación complementaria HR: secuencia complementaria, R-box: gen marcador de selección positivo y si se diera el caso negativo, loxP: secuencia loxP con orientación, HSV-tk: herpes simplex-timidinkinasa;

(B): muestra un vector para la recombinación complementaria con una secuencia complementaria unilateral.

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Figura 3

(A): muestra el vector pNDI para la recombinación complementaria en un locus genético de DHFR. Un gen marcador de selección positivo (Neo) es flanqueado por dos secuencias loxP. En el lado 5' de una secuencia loxP o bien en el lado 3' de otra secuencia loxP se encuentran las secuencias complementarias (región 5', 3' de DHFR) a un gen de DHFR.

(B): muestra el vector pHDI para la recombinación complementaria en un locus genético de DHFR. Un gen marcador de selección positivo (Hyg) es flanqueado por dos secuencias loxP. En el lado 5' de una secuencia loxP o bien en el lado 3' de otra secuencia loxP se encuentran las secuencias complementarias a un gen de DHFR (región 5', 3' de DHFR).

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Figura 4

(A): muestra la estructura genómica de un gen de DHFR con Exon 1, Exon 2 y Exon 3, así como los intrones situados entre ellos,

(B): muestra de un modo esquemático un vector que corresponde a una figura 3, elemento de referencia,

(C): muestra la estructura genómica conforme a la recombinación complementaria del vector realizada para la recombinación complementaria en un gen de DHFR. La distancia entre los puntos de corte EcoRI es de 2,9 kb si se utiliza el vector pNDI o bien 3,7 al utilizar el vector pHDI. Neo: neomicina, Hyg: higromicina, kb: kilobases

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Figura 5

Muestra un vector, que engloba una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína X y una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína de DHFR e incluye respectivamente las secuencias reguladoras, que están flanqueadas por dos secuencias loxP. Este vector puede emplearse en una secuencia de loxP para la integración catalizada por la Cre-recombinasa en el genoma.

SEC ID Nº 1 muestra una secuencia loxP.

Ejemplos Ejemplo 1 Fabricación de células negativas de DHFR

En una primera etapa se fabrican vectores conforme a la invención para la recombinación. Estos vectores son transfeccionados en una segunda etapa en líneas celulares humanas y son detectados en episodios de recombinación complementaria. De este modo puede inactivarse primero un alelo, luego el segundo alelo para el gen de DHFR.

Vector de DHFR para la recombinación complementaria

El gen humano de DHFR se localiza en el cromosoma 5 y engloba 30 kb, que se clasifican o subdividen en 6 exones. Un fragmento de EcoR1 de 1,8 kb, que contiene partes del promotor, partes del exón 2 y el exón 1 completo se empleará para la fabricación del vector para la recombinación complementaria. El exón 1 se separa mediante una digestión de Aapl y en el espacio o abertura formada (0,45 kb) se coloca el gen de resistencia Neo(1,4 kb) o bien Hyg(2,2 kb). Estos enlaces contienen además la secuencia mínima a los nucleótidos adaptadores TAT TG AAG CAT ATT ACA TAC GAT ATG CTT CAA TA (secuencia loxP). Las secuencias de enlace están dispuestas en la misma orientación, el gen de resistencia preferiblemente en el sentido opuesto al gen de DHFR. Una vez colocado el gen de resistencia, se amplifica la región complementaria. Para ello se dilata el fragmento EcoRI de la zona 3’ (6,0 kb). Se obtienen con ello los elementos de referencia conforme a la invención pNDI (11,5 kb) y pHDI (12,3 kb). Tras una recombinación complementaria satisfactoria se separa el exón 1 completo (aminoácidos 1-28) y partes del promotor del gen de DHFR. La célula no puede expresar ahora ninguna proteína de DHFR funcional.

Transfección de células

Las líneas celulares humanas empleadas no deberían ser poliploides para el cromosoma 5 y no han sido mantenidas bajo la selección MTX. En ambos casos tuvieron que activarse más de 2 alelos.

Células HeLa S3 (ATCC CCL-2.2)

Las células son cultivadas en frascos de cultivo de tejido en un medio RPMI 1640, un 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM y MEM 1 mM (aminoácidos no esenciales). La incubación se realiza a 37ºC y con un 5% de CO_{2}. El tampón de electroporación contiene Hepes 20 mM, NaCl 138 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM, D-glucosa-monohidrato 6 mM, pH 7,0. Se efectúa la electroporación de 0,10 \mug de ADN vector linearizado (pNDI) en 1 x 10^{7} células a 960 \muF y 250 V (Biorad Gene Pulser). Tras la electroporación, las células se colocan en un medio con 600 \mug/ml de G418 (Geneticin Boehringer Mannheim) y se cultivan. Al cabo de 10 días de selección (cambio de medio cada 2 días) se aislan los clones positivos y se expanden.

Células HT1080 (ATCC CCL-121)

El cultivo y la selección de células se realiza tal como se ha descrito para las células HeLa S3 con un medio de DMEM con un 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM y piruvato sódico 1 mM.

Células Namalwa (ATCC CRL-1432)

Esta línea celular es una línea celular de suspensión y debe ser cultivada del modo correspondiente. El medio corresponde al descrito para las células HeLa S3. Después de la transfección, las células son distribuidas o repartidas en cuarenta placas de 96 pocillos. Las clonas positivas son expandidas en placas de 48, 24, 12 y 6 pocillos. La selección se realiza con 1 mg/ml de G418.

Detección de células negativas de DHFR (+/-)

La detección de la inserción del vector se realiza por medio del análisis de Southern Blot o PCR. En una recombinación complementaria efectuada correctamente se detecta una banda de 2,9 kb tras la digestión del EcoR1 adicionalmente a una banda de 1,8 kb, que representa el gen de DHFR intacto, la cual se ha formado mediante la inserción del neo-gen (Figura 4c). Las clonas mixtas (relación desigual de la intensidad de bandas en Southern Blot) se separan, subclonan y seguidamente se expanden sobre un depósito celular en un FACS. En las clonas identificadas como positivas un alelo del gen de DHFR está inactivado.

Producción de células negativas (-/-) de DHFR

Las clonas celulares, en las cuales un alelo de DHFR (+/-) está inactivado, pueden ser sometidas a una nueva recombinación complementaria. Para ello son transfeccionadas tal como se ha descrito con 10 \mug de ADN linearizado del vector pHDI. La selección se realiza en un medio con 500 \mug/ml de higromicina B (Boehringer Mannheim).

Mediante un incremento de la concentración de G418 en un medio puede incrementarse la presión de selección en las células de DHFR^{+/-} y se obtendrán células de DHFR^{-/-}. Una conversión genética conduce a una recombinación intercromosómica, a través de la cual se inactiva el segundo alelo de DHFR.

Las células de DHFR^{-/-} contienen dos alelos de DHFR inactivados y no pueden sintetizar ningún tetrahidrofolato más. Por ello debe añadirse al medio timidina, glicina y purina (suplemento). Si fuera preciso se cultivan las células en un medio Gibco BRL.

La detección de las células de DHFR^{-/-} se realiza tal como se ha descrito antes. En el caso de células negativas de DHFR homocigotos no se detecta ninguna banda del tipo Wild (1,8 kb). Las células, que han sido transfeccionadas con pHDI, muestran tras la recombinación complementaria una nueva banda de 3,7 kb en EcoR1 Southern Blot (Figura 4c).

Uso de células negativas de DHFR(-/-)

Las células conforme a la invención pueden ser empleadas para la producción elevada de proteínas. Para ello se tranfecciona un vector conforme a la invención (conforme a la figura 5) y un vector de expresión codificador de una Cre-recombinasa en las células de DHFR^{-/-}. La Cre-recombinasa elimina la resistencia al antibiótico del locus genético del DHFR e integra el vector conforme a la invención en la secuencia de loxP en un genoma de la célula de DHFR^{-/-}. Las células son de nuevo sensibles al antibiótico e independientes de un suplemento de timidina, glicina y purina.

La selección puede realizarse mediante el empleo de un medio sin suplemento o mediante la adición de un antibiótico adecuado al medio de cultivo. El antibiótico corresponde por ello al gen de resistencia, que es eliminado mediante la Cre-recombinasa del genoma de la célula. Si el vector integrado contiene un gen marcador de selección positivo, entonces la selección puede realizarse mediante la adición de este antibiótico al medio.

Aumento de la potencia de producción mediante la amplificación del gen

Para incrementar la potencia de producción de las células para la proteína recombinante, se realiza una selección del metotrexato (MTX), a través de la cual el gen de DHFR introducido en la célula y la secuencia de ácido nucleico heterológica codificadora para una proteína se amplifican.

Para conseguir una amplificación, se cultivan las células en presencia de unas concentraciones crecientes (100-1000 mM) de MTX. El grado de amplificación se realiza a través de la evaluación densitométrica de Southern blots comparables (antes, durante y después de la adición de MTX).

Las células conforme a la invención obtenidas tras la etapa de amplificación contienen muchas copias del gen de DHFR introducido en el locus de loxP y de la secuencia de ácido nucleico heterológica introducida. Se caracterizan por una elevada potencia de producción del ácido nucleico heterológico.

A continuación se presentan las formas de ejecución preferidas de la invención como componentes de la descripción:

1. Método para la preparación de una célula eucariótica negativa de DHFR, que se caracteriza porque,

(a) la célula es transfeccionada con un primer vector, que engloba

(ii): las secuencias de ADN que flanquean la secuencia (i), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en la célula, para permitir una recombinación complementaria, y

(iii): si se diera el caso, un gen marcador de selección positivo y si fuera preciso negativo,

(b) la célula transfeccionada es cultivada en unas condiciones, en las cuales se realiza una recombinación complementaria del vector, y

(c) se consigue la célula obtenida conforme al apartado (b).

2. Método según el punto 1, que se caracteriza por,

que se emplean las secuencias de loxP como secuencias objetivo de recombinasa.

3. Método conforme a uno de los puntos 1 ó 2, que se caracteriza por, que la secuencia de ácido nucleico codificadora para el gen marcador de selección positivo, es un gen de resistencia de neomicina, canamicina, geneticina o higromicina.

4. Método conforme a uno de los puntos 1 hasta 3, que se caracteriza por, que la secuencia flanqueada por las secuencias objetivo de recombinasa es recortada del genoma de la célula mediante una activación transitoria de la recombinasa correspondiente.

5. Método conforme a uno de los puntos 1 hasta 4, que se caracteriza por, que la secuencia flanqueada por las secuencias objetivo de recombinasa es recortada del genoma de la célula mediante una activación transitoria de la recombinasa correspondiente.

6. Método para introducir un gen de DHFR heterológico en una célula eucariótica, que se caracteriza por,

que una célula obtenida mediante el método conforme al punto 5

(a) es transfeccionada con un tercer vector, que engloba

(i): si se diera el caso un gen marcador de selección positivo, que preferiblemente se diferencia del gen marcador de selección positivo del primer vector

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,

(iii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína que va a ser amplificada y donde la secuencia de ácido nucleico de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) es flanqueada por el lado 5' y 3', respectivamente, por como mínimo una secuencia objetivo de recombinasa,

(b) la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se realiza una integración de la secuencia de ácido nucleico flanqueada por las secuencias objetivo de recombinasa en la secuencia objetivo de recombinasa que ya se encuentra en un genoma de la célula y

c) se obtiene la célula conseguida según el apartado (b).

7. Vector, que engloba

(i): opcionalmente, un gen marcador de selección positivo

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR y

donde la secuencia de ácido nucleico está flanqueada por como mínimo una secuencia objetivo de recombinasa de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) en el lado 5' y 3', respectivamente.

8. Vector para la recombinación complementaria, que engloba

(i): opcionalmente, un gen marcador de selección positivo,

(ii): al menos una secuencia objetivo de recombinasa, que flanquea la secuencia (i),

(iii): las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i) y (ii), que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en una célula, para permitir una recombinación complementaria y

(iv): opcionalmente, un gen marcador de selección fuera de las secuencias complementarias (iii).

\newpage

9. Células eucarióticas, preferiblemente células humanas, que se obtienen a través de un método según uno de los puntos 1 hasta 6.

10. Células eucarióticas, preferiblemente células humanas, que se caracterizan porque

(a) al menos una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR, endógena, es inactivada y

(b) en la zona de esa secuencia de ácido nucleico codificadora para el DHFR al menos una secuencia de ácido nucleico de recombinasa está integrada en el genoma.

11. Células eucarióticas, preferiblemente células humanas, que se caracterizan por

una secuencia de ácido nucleico heterológica en la zona de un locus genético endógeno de DHFR, que engloba

(i): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,

(iii): al menos una secuencia objetivo de recombinasa.

(1) DATOS GENERALES:

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(i): Inscripción:

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(a): Nombre: Boehringer Mannheim GMBH

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(b): Calle: Sandhofer Strasse 112-132

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(c): Lugar: Mannheim

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(d): País: Alemania

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(e): Código postal: D-68305

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(ii): Nombre de la invención: Optimización de células para la activación genética endógena

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(iii): Número de secuencias: 1

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(iv): Versión legible del ordenador:

\vskip0.500000\baselineskip

(a): Soporte de datos: Floppy Disk

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(b): Ordenador: IBM PC compatible

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(c): Sistema de funcionamiento: PC-DOS/MS-DOS

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(d): Software: PatentIn Release nº 1.0, versión 1.30(EPA)

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(2) Datos respecto a la sec. ID nº 1:

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: Características de la secuencia:

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(a): Longitud: 34 pares de bases

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(b): Tipo: nucleótido

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(c): Forma de ramificación: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(d): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): Descripción de la secuencia: Sec ID nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGCTTC AATA

\hfill

Claims

1. Método para preparar una célula eucariótica negativa de DHFR, que se caracteriza porque

(a) la célula es transfeccionada con un primer vector, que comprende

(iii): opcionalmente, un gen marcador de selección positivo y opcionalmente uno negativo

b) la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones, en las cuales se efectúa una recombinación complementaria del vector, y

c) se consigue la célula obtenida según el apartado (b)

2. Método para introducir un gen de DHFR heterológico en una célula eucariótica, que se caracteriza por,

que una célula obtenida según el método conforme a la reivindicación 1

(a) es transfeccionada con un tercer vector, que incluye

(i): opcionalmente un gen marcador de selección positivo, que se diferencia preferiblemente del gen marcador de selección positivo del primer vector,

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,

(iii): una secuencia de ácido nucleico en forma expresable, codificadora para una proteína que va a ser amplificada y

: por la que la secuencia de ácido nucleico de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) es flanqueada en el lado 5' y 3' respectivamente, por al menos una secuencia objetivo de recombinasa,

(c) se obtiene la célula conseguida según el apartado (b).

3. Vector, que incluye

(i): opcionalmente un gen marcador de selección positivo,

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR

(iii): una secuencia de ácido nucleico en forma expresable, codificadora para una proteína deseada,

: por lo que la secuencia de ácido nucleico de las secuencias parciales (i), (ii) y (iii) está flanqueada en el lado 5' y 3', respectivamente, por al menos una secuencia objetivo de recombinasa.

4. Vector para la recombinación complementaria, que comprende

(i): opcionalmente, un gen marcador de selección positivo

(ii): al menos una secuencias objetivo de recombinasa flanqueando la secuencia (i),

(iii): las secuencias de ADN que flanquean las secuencias (i) y (ii) que son complementarias a un segmento de ácido nucleico de DHFR presente de forma endógena en una célula, para permitir una recombinación complementaria, y

(iv): si fuera preciso un gen marcador de selección negativo fuera de las secuencias complementarias (iii).

\newpage

5. Célula eucariótica, preferiblemente célula humana, que se caracteriza porque,

(a) al menos una secuencia de ácido nucleico endógena, codificadora para un DHFR, es inactivada y

(b) en la zona de esta secuencia de ácido nucleico codificadora para el DHFR al menos una secuencia objetivo de recombinasa está integrada en el genoma.

6. Célula eucariótica, preferiblemente célula humana, que se caracteriza por

una secuencia de ácido nucleico heterológica, en la zona de un locus genético endógeno de DHFR, que incluye

(i): una secuencia de ácido nucleico codificadora para un DHFR,

(ii): una secuencia de ácido nucleico codificadora para una proteína deseada

(iii): al menos una secuencia objetivo de recombinasa.