ES2255177T3 - Fabricacion de proteinas mutadas humanas en celulas humanas por medio de la recombinacion homologa. - Google Patents
Fabricacion de proteinas mutadas humanas en celulas humanas por medio de la recombinacion homologa.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para producir proteínas mutantes de polipéptidos eucarióticos en células eucarióticas mediante recombinación homóloga. La invención también se refiere a procedimientos para producir células humanas adecuadas para producir proteínas mutantes humanas. Finalmente, la invención se refiere a células humanas producidas mediante este procedimiento y a las proteínas humanas mutantes obtenidas, así como a las composiciones farmacéuticas que contienen a estas proteínas mutantes.
Description
Fabricación de proteínas mutadas humanas en
células humanas por medio de la recombinación homóloga.
La invención se refiere a un método para la
fabricación de muteínas de polipéptidos eucarióticos en células
eucarióticas por medio de la recombinación homóloga. Además, la
invención hace referencia a un método para la fabricación de
células humanas, que sean adecuadas para la fabricación de proteínas
mutadas humanas. En definitiva, la invención se refiere a las
células humanas fabricadas a través del método y a las proteínas
humanas mutadas que se obtienen a partir de ellas, así como a los
preparados farmacéuticos que contienen estas muteínas.
La fabricación de proteínas humanas recombinadas
en grandes cantidades corresponde al campo de la biotecnología. La
proteínas obtenidas de esta forma se pueden emplear como medios
terapéuticos. Asimismo se conoce también la fabricación
biotecnológica de proteínas humanas mutadas, que se diferencian de
las correspondientes proteínas humanas sencillas por la
eliminación, adición o/y sustitución de algunos aminoácidos o
segmentos peptídicos.
En particular para aplicaciones farmacéuticas, a
menudo resulta preferible fabricar polipéptidos humanos en células
eucarióticas, ya que éstas, contrariamente a los polipéptidos
fabricados en las células procarióticas como la E.coli, son
glucosiladas y por tanto se diferencian menos de los
correspondientes polipéptidos existentes de forma endógena en el
organismo, de manera que la aparición de efectos secundarios no
deseados como, por ejemplo, una elevada inmunogenidad o una mala
tolerancia se observan con menos frecuencia.
Las proteínas humanas mutadas se han fabricado
hasta el momento mediante expresión genética recombinada
heterológica. Para ello se introducía un montaje de ácido nucleico
en la célula eucariótica deseada, que contiene la secuencia de
ácido nucleico codificada para el polipéptido mutado bajo control de
un promotor y un gen marcador de la selección. El montaje de ácido
nucleico se integra en este proceso en el genoma de la célula sin
lugar específico.
Con esta expresión genética recombinada
heterológica pueden producirse con frecuencia fenómenos no deseados
e inconvenientes debido a la integración poco específica del lugar.
Por ejemplo, durante el proceso de integración en el genoma puede
llegarse a mutaciones, en particular a eliminaciones en la secuencia
que codifica la proteína. Además, puede realizarse la integración
en un lugar en un genoma, en el que se encuentren los elementos Cis,
que tienen una influencia reprimida en la secuencia de control de
la expresión del conjunto del ácido nucleico, por lo que se
obtienen células con un rendimiento de producción reducido para la
proteína recombinada. Una integración del grupo de expresión en un
gen importante para la célula conduce o bien a la muerte de esta
célula o bien a una célula recombinada con alteraciones funcionales,
que podrían causar entre otras cosas un rendimiento reducido en
proteína recombinada.
Sin embargo, la inserción puede conducir también
a una estabilidad reducida de las células así obtenidas, de manera
que durante un largo periodo de tiempo pierdan su capacidad para
expresar la proteína recombinada.
El cometido en que se basa la presente invención
consistía por tanto en preparar un método para la fabricación de
muteínas de polipéptidos eucarióticos con una glucosilación lo más
similar posible a la proteína natural o sencilla, en una célula de
producción estable y con un buen rendimiento, para eliminar al menos
parcialmente los inconvenientes de la técnica actual.
Este cometido se resuelve conforme a la invención
mediante un método para la fabricación de muteínas de polipéptidos
eucarióticos en el que
- (i)
- en las células eucarióticas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico capaz de la recombinación homóloga, que comprende
- (a)
- al menos un segmento de la secuencia que es homólogo a las secuencias en el locus genético de la secuencia de ácido nucleico de referencia y presenta una mutación en la región codificada del polipéptido maduro, y
- (b)
- un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de la selección.
- (ii)
- se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, en la que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia de ácido nucleico de referencia mutada, que es capaz de provocar la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,
- (iii)
- se seleccionan las células, en las cuales se ha hallado una recombinación homóloga y
- (iv)
- se obtiene la muteina de las células o/y del residuo celular.
A través del método conforme a la invención
pueden fabricarse proteínas eucarióticas mutadas, en particular
proteínas humanas mutadas en una célula homóloga. Sorprendentemente,
se logra obtener una proteína mutada lo más similar posible a una
proteína natural respecto a la muestra de glucosilación, con un alto
rendimiento. Una ventaja del procedimiento conforme a la invención
es que una proteína puede ser mutada en una célula eucariótica y
esta muteína será sintetizada por esta célula como la proteína
endógena existente de la célula. Otra ventaja del método conforme a
la invención es que las propiedades de las células resultantes que
producen la proteína mutada no se ven alteradas por una integración
genética inespecífica del lugar. Por tanto, el genoma de la célula
no se altera de ningún modo salvo en el locus genético de la
proteína que va a ser expresada, por lo que se excluyen los efectos
negativos ligados a ello.
La proteína mutada humana fabricada según el
método conforme a la invención se distingue de la proteína natural
o sencilla correspondiente por la eliminación, adición o/y
sustitución de algunos aminoácidos o del total de segmentos
peptídicos. Se fabrican preferiblemente muteínas que presentan
mutaciones en el terminus-N y/o terminus C como, por
ejemplo, las eliminaciones, inserciones, sustituciones y/o fusiones
con otras proteínas humanas, por ejemplo.
Las muteínas conforme a la invención son
preferiblemente polipéptidos que existen de forma no natural y se
diferencian de las variaciones alélicas existentes en otras células
de partida del polipéptido que va a ser mutado en como mínimo un
aminoácido. Se diferencian preferiblemente de las muteínas que
existen de forma no natural por las eliminaciones, adiciones o/y
inserciones de algunos aminoácidos o segmentos peptídicos de
variaciones alélicas existentes de forma natural.
La célula empleada en un método conforme a la
invención es una célula eucariótica cualquiera, que al menos
presenta una copia endógena del gen de referencia que va a ser
mutado. La célula es preferiblemente una célula humana, se prefiere
especialmente una célula humana inmortalizada como una célula HeLa,
una célula Namalwa o una célula HT1080.
Sorprendentemente se ha constatado que en la
utilización de las células de partida, que contienen un número
elevado de cromosomas, en las que se localiza el gen de referencia,
pueden crearse células por recombinación homóloga, que producen un
elevado rendimiento en proteínas humanas mutadas en comparación con
las células que únicamente contienen dos copias de gen de
referencia. Ejemplos de dichas células de partida son las líneas
celulares tumorales con transposiciones genéticas como, por ejemplo,
HeLaS3 (Puck y cols., J.Exp.Med.103(1996),
273-284) y Namalwa (Nadkarni y cols., Cancer
23(1969), 64-79), que contienen un número
elevado de copias del cromosoma 7.
Para mejorar la expresión del polipéptido mutado
puede realizarse una activación genética endógena del gen de
referencia mutado.
Para ello pueden introducirse en el genoma
secuencias adicionales, que influyen positivamente en la magnitud
de la expresión, por lo que, por ejemplo, la secuencia de control de
la expresión endógena de la secuencia de ácido nucleico de
referencia es sustituida al menos parcialmente por una secuencia
heterológica de control de la expresión. Esta secuencia de control
de la expresión heterológica puede englobar un promotor o/y elevador
heterológico, que englobe preferiblemente la secuencia heterológica
de control de la expresión de un promotor vírico, en particular de
un promotor de CMV. Sustituyendo el promotor endógeno no solo puede
incrementarse la expresión sino que puede sintetizarse la muteína
empleando un promotor adecuado. El promotor heterológico puede ser
un promotor regulable o constructivo. Además los elementos Cis que
actúan de forma represiva en el promotor endógeno pueden ser
ineficaces. Esto puede producir un incremento del rendimiento.
La molécula de ácido nucleico introducida en la
célula de partida comprende al menos un trozo o segmento de la
secuencia, el cual permite una integración a través de una
recombinación homóloga en un locus del gen de referencia y consigue
que se inicie la mutación en la región codificada del polipéptido de
referencia maduro. La molécula de ácido nucleico contiene
preferiblemente dos secuencias que flanquean respectivamente una
longitud de 150 bp, como mínimo, y contienen zonas de las
secuencias codificadas del locus del gen de referencia para el
polipéptido de referencia maduro, que han sido modificadas respecto
a la secuencia nativa.
Además la molécula de ácido nucleico contiene un
gen marcador de selección. Este puede ser un gen marcador de
selección cualquiera adecuado para células eucarióticas, el cual en
la expresión conduzca a un fenotipo seleccionable, por ejemplo,
resistencia a antibióticos, auxotrofia, expresión de una proteína
superficial etc. Un gen marcador de selección especialmente
preferido es el gen de la neomicinafosfotransferasa.
Además la molécula de ácido nucleico puede
contener asimismo un gen marcador de selección negativo, por ejemplo
un gen de HSV-timidinacinasa, a través de cuya
expresión se alteran las células en presencia de un medio
selectivo.
Si se desea una amplificación del gen de
referencia modificado en la célula, la molécula de ácido nucleico
contiene un gen de amplificación. Ejemplos de genes de amplificación
apropiados son la dihidrofolatoreductasa, adenosindeaminasa,
ornitindecarboxilasa, etc. Un gen de amplificación preferida es el
gen de dihidrofolatoreductasa.
Si existe gen de amplificación se puede realizar
una amplificación de la secuencia de ácido nucleico de referencia
mutada tras la recombinación homóloga, para incrementar el número de
copias en la célula.
Con el método conforme a la invención pueden
mutarse todos los genes endógenos existentes en un genoma de la
célula empleada. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de
referencia es una secuencia de receptor de interleucina o de
interleucina, de factor necroso del tumor, de insulina, de
eritropoyetina, de activador de plasminógeno tisular (tPA). Se
prefiere especialmente la muteína que se obtiene con el método
conforme a la invención, un polipéptido, que se diferencia de la
proteína natural correspondiente por sus propiedades biológicas,
como por ejemplo un polipéptido derivado de t-PA,
que comprende los dominios K2 y P de t-PA (EP 0 382
174).
Para la obtención de la muteína pueden utilizarse
las técnicas conocidas para ello. Preferiblemente, la obtención de
la muteína se realiza a partir del residuo de células cultivadas en
suspensión. Se prefieren las células cultivadas en suspensión para
una producción a gran escala. La transferencia necesaria de células
cultivadas se simplifica considerablemente en el transcurso del
proceso de fabricación. Esto lleva a un ahorro considerable de
tiempo de producción y de medios de producción y por tanto a una
clara reducción de costes. La obtención de la muteína se realiza
preferiblemente a partir del residuo o sobrante de células
cultivadas en un medio sin suero. La muteína puede aislarse más
fácilmente y más económicamente de las células cultivadas en un
medio sin suero que en un medio con suero, puesto que se necesitan
menos etapas de limpieza.
Otro objetivo de la presente invención es un
polipéptido humano mutado a partir de una célula humana, que se
obtenga conforme a uno de los métodos anteriormente descritos, que
se caracterice por la carencia de polipéptidos extraños a la
especie. La carencia o ausencia de polipéptidos extraños a la
especie significa impurezas de polipéptidos extraños a la especie
en una proporción menor al 3% en peso, preferiblemente menor al 1%
en peso, y si es posible menor al 0,1% en peso, respecto a la
cantidad de proteína deseada.
Otro objetivo de la invención es un método para
la fabricación de una célula humana, que exprese una muteína de un
polipéptido de referencia humano, que se caracterice por que
(i) en las células humanas, que contienen una
secuencia de ácido nucleico de referencia condificada para un
polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de
ácido nucleico, que comprende
- (a)
- al menos un segmento de la secuencia, que es homólogo a las secuencias en un locus genético de la secuencia del ácido nucleico de referencia y presenta frente a la secuencia de ácido nucleico de referencia endógeno, una mutación en una zona codificada del polipéptido de referencia maduro,
- (b)
- una secuencia de control de la expresión heterológica para la secuencia de ácido nucleico de referencia y,
- (c)
- un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de selección,
(ii) se cultiven las células en unas
condiciones en las que se produzca una recombinación homóloga de
la molécula de ácido nucleico introducida, por lo que la célula tras
la recombinación homóloga contenga una secuencia mutada de ácido
nucleico de referencia, que sea capaz de llevar a la expresión de
una muteína del polipéptido de referencia,
(iii) se seleccionen las células en las que haya
tenido lugar una recombinación homóloga y
(iv) se obtengan las células así
seleccionadas.
En otra forma de ejecución preferida, la molécula
de ácido nucleico contiene además un gen de amplificación y tras la
recombinación homóloga se produce una amplificación de la secuencia
del ácido nucleico de referencia.
Otro objetivo de la invención es una célula
humana, que se obtendrá según un método anteriormente descrito, que
contenga al menos un gen endógeno codificado para un polipéptido
humano mutado.
La célula conforme a la invención es cultivada en
unas condiciones apropiadas de cultivo, preferiblemente una
suspensión, en particular se prefiere una célula que crezca en un
medio sin suero.
Otro objetivo de la invención es la utilización
de una célula humana, fabricada conforme a uno de los métodos
anteriormente descritos para la fabricación de una muteína de un
polipéptido humano.
Otro objetivo de la invención es un preparado
farmacéutico, que se caracteriza por que contiene una muteína como
la anteriormente descrita, como sustancia activa con otras
sustancias activas o/y sustancias adicionales habituales desde el
punto de vista farmacéutico.
El vector de referencia se compone de los
elementos siguientes (enumerados en la secuencia
5'-3'):
A: un fragmento BgIII grande de 6 kb, que
contiene unos 3,5 kb de la región 5' en adelante del gen
t-PA (Friezner y cols. 1986, JBC
261(15):6972).
B: una secuencia de activación genética grande de
unos 5,2 (como fragmento Agel), que contiene el gen
Neomicinafosfo-transferasa-(NEO) bajo el control
del promotor RSV y del posterior lugar del poliadenilo de SV40 como
terminador, un gen codificado para un mutante de arginina de la
dihidrofolatoreductasa murina (DHFR)(Simonsen y cols., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80(1983), 2495) bajo el control del promotor
anterior SV40 y del anterior lugar del poliadenilo SV40 como
terminador (Kaufmann y cols., Mol. Cell. Biol..2(1982), 1304;
Okayama y cols., Mol. Cell. Biol..3(1983), 280 y Schimke,
J.Biol..Chem.263(1988), 5989) y el promotor del
citomegalovirus (CMV) (Boshart y cols., Cell 41(1995), S
21).
C: un fragmento de unos 200 bp de tamaño, aislado
del t-PA cDNA, que equivale a las posiciones de
nucleótido 1-199 y que contiene la región
codificada para la secuencia de señales y los tres primeros
aminoácidos del t-PA maduro (Penca y cols. 1983,
Nature 301:214).
D. un fragmento de EcoRI de 1,5 kb, que comprende
una gran parte de Intron G del gen tPA (Friezner y cols.op.cit., Ny
y cols.1984, PNAS 81:5355).
Estos elementos se aislaban y ensamblaban a
partir de los correspondientes materiales de partida a través de
PCR y de cebadores de PCR de fusión adecuados. A continuación, se
ligaban los elementos fusionados en el pBR322 y se introducían en
E.coli. Alternativamente, los fragmentos pueden ligarse a
partir de los respectivos materiales de partida recortados y por
medio de un ligamento.
Como línea celular para realizar la activación
genética endógena se empleaba la HeLa, de la que se podía deducir
que la transcripción del gen t-PA puede ser inducida
mediante la adición de miristacetato de forbol (Waller y Schleuning
1985, J.Biol.Chem. 260:6354). Tras introducir el vector de
referencia vía electroporación se seleccionaban las células que
contenían el vector mediante la adición del G418. Se descubrían las
células, las cuales debido a una recombinación homóloga cortaban un
polipéptido con los dominios t-PA K2 y P,
comprobándose el sobrante de las células con un ELISA
(Imubind-total t-PA, American
Diagnostics), que podía detectar la expresión del polipéptido
buscado.
Claims (19)
1. Procedimiento para la fabricación de muteinas
de polipéptidos eucarióticos, que se caracteriza porque
- (i)
- en las células eucarióticas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico capaz de la recombinación homóloga, que comprende
- (a)
- dos secuencias flanqueantes con una longitud de cómo mínimo 150 bq, respectivamente, que son homólogas a las secuencias en el locus genético de la secuencia de ácido nucleico de referencia y presentan una mutación en la región codificada del polipéptido maduro frente a la secuencia de ácido nucleico de referencia endógena, y
- (b)
- un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de la selección,
- (ii)
- se cultivan las células en unas condiciones tales que, se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, en la que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia de ácido nucleico de referencia mutada, que es capaz de provocar la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,
- (iii)
- se seleccionan las células, en las cuales se ha hallado una recombinación homóloga y
- (iv)
- se obtiene la muteína de las células o /y del residuo celular.
2. Método conforme a la reivindicación 1 que se
caracteriza porque la célula es una célula humana.
3. Método conforme a la reivindicación 2
que se caracteriza porque la célula es una célula HeLa,
una célula Namalwa o una célula HT1080.
4. Método conforme a una de las
reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza porque se
emplea una célula de partida que contiene la secuencia de ácido
nucleico de referencia en múltiples cromosomas.
5. Método conforme a una de las anteriores
reivindicaciones, que se caracteriza porque además la
expresión de la secuencia del ácido nucleico de referencia se
activa introduciendo una secuencia de control de la expresión
heterológica.
6. Método conforme a la reivindicación 5, que se
caracteriza porque la secuencia de control de la expresión
heterológica es un promotor vírico, en particular un promotor
CMV.
7. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque el segmento de ácido
nucleico que codifica el marcador de selección es un gen de
neomicinafosfotransferasa.
8. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la molécula de ácido
nucleico introducida en la célula contiene adicionalmente un gen de
amplificación, y tras la recombinación homóloga se produce una
amplificación de la secuencia de ácido nucleico de referencia
mutada.
9. Método conforme a la reivindicación 8, que se
caracteriza porque se emplea un gen de dihidrofolatoreductasa
como gen de amplificación.
10. Método conforme a una de la reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la secuencia de ácido
nucleico de referencia es una secuencia del receptor de
interleucina o de interleucina, del factor necroso del tumor, de
insulina, de eritropoyetina, de t-PA, del activador
del plasminógeno tisular.
11. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la muteína es un
polipéptido derivado del t-PA, que engloba los
dominios K2 y P de t-PA.
12. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la obtención de la
muteína se realiza a partir del sobrante de células cultivadas en
suspensión.
13. Método conforme a una de la reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la obtención de la
muteína se realiza a partir del sobrante de células cultivadas en
un medio sin suero.
14. Procedimiento para la fabricación de una
célula humana que expresa una muteina de un polipéptido de
referencia humano, que se caracteriza porque
- (i)
- en las células humanas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia condificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico, que comprende
- (a)
- dos secuencias flanqueantes con una longitud respectiva de cómo mínimo 150 bp, que son homólogas a las secuencias en un locus genético de la secuencia del ácido nucleico de referencia y presenta frente a la secuencia de ácido nucleico de referencia endógeno, una mutación en una zona codificada del polipéptido de referencia maduro,
- (b)
- una secuencia de control de la expresión heterológica para la secuencia del ácido nucleico de referencia y
- (c)
- un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de selección
- (ii)
- se cultiven las células en unas condiciones en las que se produzca una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, por lo que la célula tras la recombinación homóloga contenga una secuencia mutada de ácido nucleico de referencia, que sea capaz de llevar a la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,
- (iii)
- se seleccionen las células en las que haya tenido lugar una recombinación homóloga y
- (iv)
- se obtengan las células así seleccionadas.
15. Procedimiento conforme a la reivindicación
14, que se caracteriza porque la molécula de ácido nucleico
contiene un gen de amplificación y tras la recombinación homóloga
se realiza una amplificación de la secuencia de ácido nucleico de
referencia mutada.
16. Procedimiento conforme a la reivindicación
15, que se caracteriza porque se emplea un gen de
dihidrofolatoreductasa como gen de amplificación.
17. La célula humana que se obtiene mediante un
método conforme a una de las reivindicaciones 14 hasta 16, contiene
al menos un gen endógeno codificada para una polipéptido humano
mutado, comprende
- a)
- dos secuencias flanqueantes con una longitud respectiva a 150 bp como mínimo, que son homólogas a la secuencias en un locus genético de la secuencia de ácido nucleico de referencia y presentan un mutación en una zona codificada del polipéptido de referencia maduro frente a la secuencia de ácido nucleico de referencia endógena, y
- b)
- una secuencia de control de la expresión heterológica para la secuencia del ácido nucleico de referencia.
18. Utilización de una célula humana conforme a
la reivindicación 17 para la fabricación de una muteina de un
polipétido humano.
19. Utilización de una célula humana conforme a
la reivindicación 17 o/y de una muteina conforme a la reivindicación
18 para la fabricación de un preparado farmacéutico, que se
caracteriza porque la muteína contiene como sustancia activa,
si se diera el caso con otras sustancias activas, o/y las
sustancias adicionales o auxiliares habituales desde el punto de
vista farmacéutico.
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