ES2255177T5

ES2255177T5 - Fabricación de proteínas mutadas humanas en células humanas por medio de la recombinación homóloga.

Info

Publication number: ES2255177T5
Application number: ES98942591T
Authority: ES
Inventors: Anne Stern; Konrad Honold
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2011-07-12
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: CN101348789A; PT1000167E; EP1000167B2; DK1000167T3; EP1000167B1; US6444441B1; ATE313643T1; JP2001511341A; US20020177195A1; ZA986517B; WO1999005264A3; KR100512018B1; AR013251A1; CN101348789B; DE59813296D1; CA2297660C; DK1000167T4; AR068104A2; KR20010022127A; AU729489B2

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para producir proteínas mutantes de polipéptidos eucarióticos en células eucarióticas mediante recombinación homóloga. La invención también se refiere a procedimientos para producir células humanas adecuadas para producir proteínas mutantes humanas. Finalmente, la invención se refiere a células humanas producidas mediante este procedimiento y a las proteínas humanas mutantes obtenidas, así como a las composiciones farmacéuticas que contienen a estas proteínas mutantes.

Description

La invención se refiere a un método para la fabricación de muteínas de polipéptidos eucarióticos en células eucarióticas por medio de la recombinación homóloga. Además, la invención hace referencia a un método para la fabricación de células humanas, que sean adecuadas para la fabricación de proteínas mutadas humanas. En definitiva, la invención se refiere a las células humanas fabricadas a través del método y a las proteínas humanas mutadas que se obtienen a partir de ellas, así como a los preparados farmacéuticos que contienen estas muteínas.

La fabricación de proteínas humanas recombinadas en grandes cantidades corresponde al campo de la biotecnología. La proteínas obtenidas de esta forma se pueden emplear como medios terapéuticos. Asimismo se conoce también la fabricación biotecnológica de proteínas humanas mutadas, que se diferencian de las correspondientes proteínas humanas sencillas por la eliminación, adición o /y sustitución de algunos aminoácidos o segmentos peptídicos.

En particular para aplicaciones farmacéuticas, a menudo resulta preferible fabricar polipéptidos humanos en células eucarióticas, ya que éstas, contrariamente a los polipéptidos fabricados en las células procarióticas como la E.coli, son glucosiladas y por tanto se diferencian menos de los correspondientes polipéptidos existentes de forma endógena en el organismo, de manera que la aparición de efectos secundarios no deseados como, por ejemplo, una elevada inmunogenidad o una mala tolerancia se observan con menos frecuencia.

Las proteínas humanas mutadas se han fabricado hasta el momento mediante expresión genética recombinada heterológica. Para ello se introducía un montaje de ácido nucleico en la célula eucariótica deseada, que contiene la secuencia de ácido nucleico codificada para el polipéptido mutado bajo control de un promotor y un gen marcador de la selección. El montaje de ácido nucleico se integra en este proceso en el genoma de la célula sin lugar específico.

Con esta expresión genética recombinada heterológica pueden producirse con frecuencia fenómenos no deseados e inconvenientes debido a la integración poco específica del lugar. Por ejemplo, durante el proceso de integración en el genoma puede llegarse a mutaciones, en particular a eliminaciones en la secuencia que codifica la proteína. Además, puede realizarse la integración en un lugar en un genoma, en el que se encuentren los elementos Cis, que tienen una influencia reprimida en la secuencia de control de la expresión del conjunto del ácido nucleico, por lo que se obtienen células con un rendimiento de producción reducido para la proteína recombinada. Una integración del grupo de expresión en un gen importante para la célula conduce o bien a la muerte de esta célula o bien a una célula recombinada con alteraciones funcionales, que podrían causar entre otras cosas un rendimiento reducido en proteína recombinada.

Sin embargo, la inserción puede conducir también a una estabilidad reducida de las células así obtenidas, de manera que durante un largo periodo de tiempo pierdan su capacidad para expresar la proteína recombinada.

El cometido en que se basa la presente invención consistía por tanto en preparar un método para la fabricación de muteínas de polipéptidos eucarióticos con una glucosilación lo más similar posible a la proteína natural o sencilla, en una célula de producción estable y con un buen rendimiento, para eliminar al menos parcialmente los inconvenientes de la técnica actual.

Este cometido se resuelve conforme a la invención mediante un método para la fabricación de muteínas de polipéptidos eucarióticos que se caracteriza por que

(i): en las células eucarióticas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico capaz de la recombinación homóloga, que comprende

(a): dos secuencias flanqueantes que son homólogas a las secuencias en el locus genético de la secuencia de ácido nucleico de referencia, de forma que las secuencias flanqueantes tienen respectivamente una longitud de al menos 150 bp, y contienen zonas o regiones de las secuencias del locus genético de referencia codificadas para el polipéptido de referencia maduro, las cuales presentan una mutación en la región codificada del polipéptido de referencia maduro frente a la secuencia de ácidos nucleicos de referencia endógena, y

(b): un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de la selección,

(ii): se cultivan las células en unas condiciones tales que, se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, en la que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia de ácido nucleico de referencia mutada, que es capaz de provocar la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,

(iii) se seleccionan las células, en las cuales se ha hallado una recombinación homóloga y

(iv) se obtiene la muteína de las células o /y del residuo celular, de manera que además se activa la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia por la entrada de una secuencia de control de la expresión heterológica.

A través del método conforme a la invención se pueden fabricar proteínas eucarióticas mutadas, en particular proteínas humanas mutadas en una célula homóloga. Sorprendentemente, se logra obtener una proteína mutada lo más similar posible a una proteína natural respecto a la muestra de glucosilación, con un alto rendimiento. Una ventaja del procedimiento conforme a la invención es que una proteína puede ser mutada en una célula eucariótica y esta muteína será sintetizada por esta célula como la proteína endógena existente de la célula. Otra ventaja del método conforme a la invención es que las propiedades de las células resultantes que producen la proteína mutada no se ven alteradas por una integración genética inespecífica del lugar. Por tanto, el genoma de la célula no se altera de ningún modo salvo en el locus genético de la proteína que va a ser expresada, por lo que se excluyen los efectos negativos ligados a ello.

La proteína mutada humana fabricada según el método conforme a la invención se distingue de la proteína natural o sencilla correspondiente por la eliminación, adición o /y sustitución de algunos aminoácidos o del total de segmentos peptídicos. Se fabrican preferiblemente muteínas que presentan mutaciones en el terminus-N y /o terminus C como, por ejemplo, las eliminaciones, inserciones, sustituciones y /o fusiones con otras proteínas humanas, por ejemplo.

Las muteínas conforme a la invención son preferiblemente polipéptidos que existen de forma no natural y se diferencian de las variaciones alélicas existentes en otras células de partida del polipéptido que va a ser mutado en como mínimo un aminoácido. Se diferencian preferiblemente de las muteínas que existen de forma no natural por las eliminaciones, adiciones o /y inserciones de algunos aminoácidos o segmentos peptídicos de variaciones alélicas existentes de forma natural.

La célula empleada en un método conforme a la invención es una célula eucariótica cualquiera, que al menos presenta una copia endógena del gen de referencia que va a ser mutado. La célula es preferiblemente una célula humana, se prefiere especialmente una célula humana inmortalizada como una célula HeLa, una célula Namalwa o una célula HT1080.

Sorprendentemente se ha constatado que en la utilización de las células de partida, que contienen un número elevado de cromosomas, en las que se localiza el gen de referencia, pueden crearse células por recombinación homóloga, que producen un elevado rendimiento en proteínas humanas mutadas en comparación con las células que únicamente contienen dos copias de gen de referencia. Ejemplos de dichas células de partida son las líneas celulares tumorales con transposiciones genéticas como, por ejemplo, HeLaS3 (Puck y cols., J.Exp.Med.103(1996), 273284) y Namalwa (Nadkarni y cols., Cancer 23(1969), 64-79), que contienen un número elevado de copias del cromosoma 7.

Para mejorar la expresión del polipéptido mutado se lleva a cabo una activación genética endógena del gen de referencia mutado.

Para ello se introducirán en el genoma secuencias adicionales, que influyen positivamente en la magnitud de la expresión, por lo que, por ejemplo, la secuencia de control de la expresión endógena de la secuencia de ácido nucleico de referencia es sustituida al menos parcialmente por una secuencia heterológica de control de la expresión. Esta secuencia de control de la expresión heterológica puede englobar un promotor o /y elevador heterológico, que englobe preferiblemente la secuencia heterológica de control de la expresión de un promotor vírico, en particular de un promotor de CMV. Sustituyendo el promotor endógeno no solo puede incrementarse la expresión sino que puede sintetizarse la muteína empleando un promotor adecuado. El promotor heterológico puede ser un promotor regulable

o constructivo. Además los elementos Cis que actúan de forma represiva en el promotor endógeno pueden ser ineficaces. Esto puede producir un incremento del rendimiento.

La molécula de ácido nucleico introducida en la célula de partida comprende al menos un trozo o segmento de la secuencia, el cual permite una integración a través de una recombinación homóloga en un locus del gen de referencia y consigue que se inicie la mutación en la región codificada del polipéptido de referencia maduro. La molécula de ácido nucleico contiene preferiblemente dos secuencias flanqueantes que son homólogas a las regiones del locus del gen de referencia. Las secuencias flanqueantes tienen respectivamente una longitud de 150 bp, como mínimo, y contienen zonas de las secuencias codificadas del locus del gen de referencia para el polipéptido de referencia maduro, que han sido modificadas respecto a la secuencia nativa.

Además la molécula de ácido nucleico contiene un gen marcador de selección. Este puede ser un gen marcador de selección cualquiera adecuado para células eucarióticas, el cual en la expresión conduzca a un fenotipo seleccionable, por ejemplo, resistencia a antibióticos, auxotrofia, expresión de una proteína superficial etc. Un gen marcador de selección especialmente preferido es el gen de la neomicinafosfotransferasa.

Además la molécula de ácido nucleico puede contener asimismo un gen marcador de selección negativo, por ejemplo un gen de HSV-timidinacinasa, a través de cuya expresión se alteran las células en presencia de un medio selectivo.

Si se desea una amplificación del gen de referencia modificado en la célula, la molécula de ácido nucleico contiene un gen de amplificación. Ejemplos de genes de amplificación apropiados son la dihidrofolatoreductasa, adenosindeaminasa, ornitindecarboxilasa, etc. Un gen de amplificación preferida es el gen de dihidrofolatoreductasa.

Si existe gen de amplificación se puede realizar una amplificación de la secuencia de ácido nucleico de referencia mutada tras la recombinación homóloga, para incrementar el número de copias en la célula.

Con el método conforme a la invención pueden mutarse todos los genes endógenos existentes en un genoma de la célula empleada. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia de receptor de interleucina o de interleucina, de factor necroso del tumor, de insulina, de eritropoyetina, de activador de plasminógeno tisular (tPA). Se prefiere especialmente la muteína que se obtiene con el método conforme a la invención, un polipéptido, que se diferencia de la proteína natural correspondiente por sus propiedades biológicas, como por ejemplo un polipéptido derivado de t-PA, que comprende los dominios K2 y P de t-PA (EP 0 382 174).

Para la obtención de la muteína se pueden utilizar las técnicas conocidas para ello. Preferiblemente, la obtención de la muteína se realiza a partir del residuo de células cultivadas en suspensión. Se prefieren las células cultivadas en suspensión para una producción a gran escala. La transferencia necesaria de células cultivadas se simplifica considerablemente en el transcurso del proceso de fabricación. Esto lleva a un ahorro considerable de tiempo de producción y de medios de producción y por tanto a una clara reducción de costes. La obtención de la muteína se realiza preferiblemente a partir del residuo o sobrante de células cultivadas en un medio sin suero. La muteína puede aislarse más fácilmente y más económicamente de las células cultivadas en un medio sin suero que en un medio con suero, puesto que se necesitan menos etapas de limpieza.

Se ha publicado o informado sobre un polipéptido humano mutado a partir de una célula humana, que se obtiene conforme a uno de los métodos anteriormente descritos, que se caracteriza por la carencia de polipéptidos extraños a la especie. La carencia o ausencia de polipéptidos extraños a la especie significa impurezas de polipéptidos extraños a la especie en una proporción menor al 3% en peso, preferiblemente menor al 1% en peso, y si es posible menor al 0,1% en peso, respecto a la cantidad de proteína deseada.

Otro objetivo de la invención es un método para la fabricación de una célula humana, que expresa una muteína de un polipéptido de referencia humano, que se caracteriza por que en las células humanas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico, que comprende dos secuencias flanqueantes, que son homólogas a las secuencias en el locus del gen de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia, donde las secuencias flanqueantes tienen respectivamente una longitud de 150 bp como mínimo y contienen regiones de las secuencias del locus del gen de referencia codificadas para el polipéptido de referencia maduro, las cuales presentan una mutación en una zona codificada del polipéptido de referencia maduro frente a la secuencia de ácidos nucleicos de referencia endógena, una secuencia de control de la expresión heterológica para la secuencia del ácido nucleico de referencia y, un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de selección,

se cultivan las células en unas condiciones en las que se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, por lo que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia mutada de ácido nucleico de referencia, que será capaz de llevar a la expresión de una muteína del polipéptido de referencia, se seleccionan las células en las que haya tenido lugar una recombinación homóloga y se obtienen las células así seleccionadas.

En otra forma de ejecución preferida, la molécula de ácido nucleico contiene además un gen de amplificación y tras la recombinación homóloga se produce una amplificación de la secuencia del ácido nucleico de referencia.

Otro objetivo de la invención es una célula humana, que se obtendrá según un método anteriormente descrito, que contenga al menos un gen endógeno codificado para un polipéptido humano mutado.

La célula conforme a la invención es cultivada en unas condiciones apropiadas de cultivo, preferiblemente una suspensión, en particular se prefiere una célula que crezca en un medio sin suero.

Otro objetivo de la invención es la utilización de una célula humana, fabricada conforme a uno de los métodos anteriormente descritos para la fabricación de una muteína de un polipéptido humano. Se ha publicado o informado sobre un preparado farmacéutico, que se caracteriza por que contiene una muteína como la anteriormente descrita, como sustancia activa con otras sustancias activas o / y sustancias adicionales habituales desde el punto de vista farmacéutico.

Ejemplo

Construcción de un mutante t-PA, que posee los dominios K2 y P: a) Construcción del vector

El vector de referencia se compone de los elementos siguientes (enumerados en la secuencia 5’-3’):

A: un fragmento BgIII grande de 6 kb, que contiene unos 3,5 kb de la región 5’ en adelante del gen t-PA (Friezner y cols. 1986, JBC 261(15):6972)

B: una secuencia de activación genética grande de unos 5,2 (como fragmento Agel), que contiene el gen Neomicinafosfo-transferasa-(NEO) bajo el control del promotor RSV y del posterior lugar del poliadenilo de SV40 como terminador, un gen codificado para un mutante de arginina de la dihidrofolatoreductasa murina (DHFR)(Simonsen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983), 2495) bajo el control del promotor anterior SV40 y del anterior lugar del poliadenilo SV40 como terminador (Kaufmann y cols., Mol. Cell. Biol..2(1982), 1304; Okayama y cols., Mol. Cell. Biol..3(1983), 280 y Schimke, J.Biol..Chem.263(1988), 5989) y el promotor del citomegalovirus (CMV) (Boshart y cols., Cell 41(1995), S 21).

C:: un fragmento de unos 200 bp de tamaño, aislado del t-PA cDNA, que equivale a las posiciones de nucleótido 1199 y que contiene la región codificada para la secuencia de señales y los tres primeros aminoácidos del t-PA maduro (Penca y cols. 1983, Nature 301:214).

D.: un fragmento de EcoRI de 1,5 kb, que comprende una gran parte de Intron G del gen tPA (Friezner y cols.op.cit.,Ny y cols.1984, PNAS 81:5355).

Estos elementos se aislaban y ensamblaban a partir de los correspondientes materiales de partida a través de PCR y de cebadores de PCR de fusión adecuados. A continuación, se ligaban los elementos fusionados en el pBR322 y se introducían en E.coli. Alternativamente, los fragmentos pueden ligarse a partir de los respectivos materiales de partida recortados y por medio de un ligamento.

b) Línea celular humana

Como línea celular para realizar la activación genética endógena se empleaba la HeLa, de la que se podía deducir que la transcripción del gen t-PA puede ser inducida mediante la adición de miristacetato de forbol (Waller y Schleuning 1985, J.Biol..Chem. 260:6354). Tras introducir el vector de referencia vía electroporación se seleccionaban las células que contenían el vector mediante la adición del G418. Se descubrían las células, las cuales debido a una recombinación homóloga cortaban un polipéptido con los dominios t-PA K2 y P, comprobándose el sobrante de las células con un ELISA (Imubind-total t-PA, American Diagnostics), que podía detectar la expresión del polipéptido buscado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la fabricación de muteínas de polipéptidos eucarióticos, que se caracteriza por, que

(i)

en las células eucarióticas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico capaz de la recombinación homóloga, que comprende

(a)

dos secuencias flanqueantes, que son homólogas a las secuencias en el locus genético de la secuencia de ácido nucleico de referencia, de forma que las secuencias flanqueantes tienen respectivamente una longitud de 150 bp como mínimo, y contienen regiones de las secuencias del locus del gen de referencia codificadas para el polipéptido de referencia maduro, las cuales presentan una mutación en la región codificada del polipéptido maduro frente a la secuencia de ácido nucleico de referencia endógena, y

(b)

un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de la selección, ii) se cultivan las células en unas condiciones tales que, se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, en la que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia de ácido nucleico de referencia mutada, que es capaz de provocar la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,

(iii) se seleccionan las células, en las cuales se ha hallado una recombinación homóloga y

(iv) se obtiene la muteína de las células o /y del residuo celular, de forma que además se activa la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia por la entrada de una secuencia de control de la expresión heterológica.
2.

Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por, que la célula es una célula humana.
3.

Método conforme a la reivindicación 2, que se caracteriza por, que la célula es una célula HeLa, una célula Namalwa o una célula HT1080.
4.

Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza por, que se emplea una célula de partida que contiene la secuencia de ácido nucleico de referencia en múltiples cromosomas.
5.

Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza por, que la secuencia de control de la expresión heterológica es un promotor vírico, en particular un promotor CMV.
6.

Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que el segmento de ácido nucleico que codifica el marcador de selección es un gen de neomicinafosfotransferasa.
7.

Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que la molécula de ácido nucleico introducida en la célula contiene adicionalmente un gen de amplificación, y tras la recombinación homóloga se produce una amplificación de la secuencia de ácido nucleico de referencia mutada.
8.

Método conforme a la reivindicación 7, que se caracteriza por, que se emplea un gen de dihidrofolatoreductasa como gen de amplificación.
9.

Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia del receptor de interleucina o de interleucina, del factor necroso del tumor, de insulina, de eritropoyetina, de t-PA, del activador del plasminógeno tisular.
10.

Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 8, que se caracteriza por, que la muteína es un polipéptido derivado del t-PA, que engloba los dominios K2 y P de t-PA.
11.

Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que la obtención de la muteína se realiza a partir del sobrante de células cultivadas en suspensión.
12.

Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza por, que la obtención de la muteína se realiza a partir del sobrante de células cultivadas en un medio sin suero.
13.

Procedimiento para la fabricación de una célula humana que expresa una muteína de un polipéptido de referencia humano, que se caracteriza por, que

(i)

en las células humanas, que contienen una secuencia de ácido nucleico de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, se introduce una molécula de ácido nucleico, que comprende

(a)

dos secuencias flanqueantes que son homólogas a las secuencias en un locus genético de la secuencia del ácido nucleico de referencia, de manera que las secuencias flanqueantes tienen respectivamente una longitud de 150 bp y contienen regiones de las secuencias del locus del gen de referencia codificadas para el polipéptido de referencia maduro, las cuales presentan frente a la secuencia de ácido nucleico de referencia endógeno, una mutación en una zona codificada del polipéptido de referencia maduro,

(b)

una secuencia de control de la expresión heterológica para la secuencia del ácido nucleico de referencia y

(c)

un segmento de ácido nucleico codificado para un marcador de selección

(ii)

se cultivan las células en unas condiciones en las que se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, por lo que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia mutada

de ácido nucleico de referencia, que será capaz de llevar a la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,

(iii) se seleccionan las células en las que haya tenido lugar una recombinación homóloga y

(iv) se obtienen las células así seleccionadas.
14.

Procedimiento conforme a la reivindicación 13, que se caracteriza por, que la molécula de ácido nucleico contiene un gen de amplificación y tras la recombinación homóloga se realiza una amplificación de la secuencia de ácido nucleico de referencia mutada.
15.

Procedimiento conforme a la reivindicación 14, que se caracteriza por, que se emplea un gen de dihidrofolatoreductasa como gen de amplificación.
16.

Célula humana que se obtiene mediante un método conforme a una de las reivindicaciones 13 hasta 15, que contiene al menos un gen endógeno codificado para un polipéptido humano mutado, de manera que la célula se puede obtener

(i)

introduciendo una molécula de ácido nucleico en las células humanas que contienen una secuencia de ácidos nucleicos de referencia codificada para un polipéptido de referencia endógeno, de forma que dicha molécula de ácido nucleico comprende

(a)

dos secuencias flanqueantes que son homólogas a las secuencias en el locus del gen de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia, de manera que las secuencias flanqueantes tienen respectivamente una longitud de 150 bp como mínimo, las cuales presentan una mutación en la región codificada del polipéptido de referencia maduro frente a la secuencia de ácidos nucleicos de referencia,

(b)

una secuencia de control de la expresión heterológica para la secuencia de ácidos nucleicos de referencia y

(c)

un segmento de ácidos nucleicos codificado para un marcador de selección

(ii)

se cultivan las células en unas condiciones en las que se produce una recombinación homóloga de la molécula de ácido nucleico introducida, por lo que la célula tras la recombinación homóloga contiene una secuencia mutada de ácido nucleico de referencia, que será capaz de llevar a la expresión de una muteína del polipéptido de referencia,

(iii) se seleccionan las células en las que haya tenido lugar una recombinación homóloga y

(iv) se obtienen las células así seleccionadas.
17.

Utilización de una célula humana conforme a la reivindicación 16 para la fabricación de una muteína de un polipéptido humano.
18.

Utilización de una muteína conforme a la reivindicación 17 para la fabricación de un preparado farmacéutico, que se caracteriza por que, contiene la muteína como una sustancia activa, opcionalmente junto con otras sustancias activas, o / y portadores farmacéuticos frecuentes, sustancias auxiliares o aditivos.