PT93458B

PT93458B - Processo para a preparacao e purificacao de interleuquina-3 humana recombinante das suas muteinas e de composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT93458B
Application number: PT93458A
Authority: PT
Inventors: Robert Willem Van Leen; Nicolaas Ludovicus; Maria Persoon
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1989-03-15
Filing date: 1990-03-15
Publication date: 1997-01-31
Also published as: ES2092486T3; NO904927L; AU5264490A; ATE140979T1; IE900937L; FI905593A0; FI905593A7; AU633891B2; EP0390252B1; IL93756A0; GR3021140T3; HU902850D0; DE69027948D1; JPH03504561A; NZ232913A; NO179252B; EP0390252A3; CA2028827A1; WO1990010705A3; IE75344B1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N2 93 458

NOME:GIST-BROCADES N.V., holandesa, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos.

EPÍGRAFE:PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE INTERLEUQUINA-3 HUMANA RECOMBINANTE, DAS SUAS MUTElNAS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM

INVENTORES: Nicolaas Ludovicus, Maria Persoon e Robert Willem Van Leen, residentes na Holanda

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo dç> artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

Países Baixos - 15 de Março de 1989 e 25 de Julho de 1989, sob os nSs. 89200660.2 e 89201967.0.

ι.

Descrição referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Oelft, Países Baixos, (inventores: Nicolaas Ludovicus, Maria Persoon e Robert Nillem Van Leen, residentes na Holanda), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE INTERLEUQOINA—3

HUMANA RECOMBINANTE, DAS SOAS MUTEÍNAS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM”.

Descrição

Domínio técnico

A presente invençSo refere-se à produção e à purificação de interleuquina-3 humana (hIL-3) e das suas muteínas. Mais especificamente, a produçSo é levada a efeito por meio da express&o de ADN clonado que codifica para estes compostos numa ampla gama de sistemas vector/hospedeiro. O método de purificação, uma combinação inventiva de operações de cromatografia, dá origem a um produto substancialmente puro. O referido produto purificado é útil, quer isoladamente quer em combinação com outros compostos, como ingrediente activo em composições farmacêuticas. Algumas aplicações consistem no tratamento de: citopenias devidas a infecções, quimioterapia ou irradiação; afecções ósseas como fracturas ósseas ou osteoporose e imunodeficiências.

Técnica anterior

A utilidade clinica da IL—3 humana (hlL-3) não depende apenas das suas características inerentes mas também da respecti- 1

va disponibilidade e da ausência de contaninantes. A literatura relacionada con a purificação de IL-3 murina, de gibão e humana é resumida seguidamente.

Verificou-se que o marcador enzimático de células T murinas, deidrogenase de 204-hidroxi-esteróide (20c{SDH), é inductível in vitro. O factor responsável por esta inducçêo foi parcialmente purificado a partir de linfócitos esplénicos por Ihle et al.. J. Immunol. (1961), 129. 2184-2189. Este factor é distinto de qualquer outra linfoquina conhecida tanto nas suas propriedades bioquímicas como funcionais. Ihle et al., propuseram o termo interleuquina-3 (IL-3) para este factor. A purificação por cromatografia em Sephadex G-100 e DEAE-celulose tem como resultado uma purificação em 9000 vezes, mas o preparado final contém ainda múltiplas proteínas.

Foi apresentado um procedimento melhorado de purificaçSo por Ihle et al,. J. Immunol. (1982), 129. 2431-2436, usando células NEHI-3 que produzem de forma constitutiva IL-3 murina (mIL-3). Neste caso, por meio da extensão do procedimento anterior com hidroxiapatite e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase invertida, foi possível obter o produto final purificado 1 800 000 vezes (Quadro I desta referência). Os autores reivindicaram que este produto era homogéneo.

Mlyajlma et al.. Gene (1987), 58, 273-281, usaram o bicho da seda Bombyx mori. e um vector de baculovírus de insecto para a expressão de alto nível e secreção de IL-3 murina. A purificação da mIL-3 a partir de um meio de cultura de tecido foi levada a efeito por passagem sequencial através de colunas de cromatografia de Sephadex-DEAE, ACA 54 e C8 de fase invertida. A fim de obter uma separação das três espécies de mIL-3 (18, 20 e 22 kDa) foi necessária uma segunda coluna C8 de fase invertida. As diferentes espécies são devidas a glicosilação diferencial, uma vez que o tratamento com N-glicanase deu origem a uma banda final de 15 kDa.

Zlltener et al.. J. Biol.Chem. (1988), 263, 14511-14517 descreveram o isolamento de formas glicosiladas múltiplas de IL-3 por purificação por afinidade. A micro-heterogeneidade

observada era dependente da origem (células T activadas, células WEHI-3B ou células COS 7).

Todos os procedimentos anteriores descrevem a purificação de IL-3 murina. Apesar da semelhança observada entre a IL-3 murina e a IL-3 humana no que se refere à acçeo proliferativa em células progenitoras hematopoiéticas, a homologia estrutural entre as duas proteínas é bastante baixa (28% ao nível dos ácidos aminados). As diferenças estruturais provocam uma diferença na especificidade conforme ilustrado pela ausência total de reactividade da proteína humana em células murinas (e vice versa). Com base na respectiva composição especifica de ácidos aminados, ambas as proteínas requerem diferentes métodos de purificação.

λ purificação de IL-3 de gibão e humana, que apresentam uma homologia estrutural de 93% (ao nível dos ácidos aminados), é apresentada em diversas publicações de patentes. A publicação de pedido de Patente HO 88/00598 descreve o isolamento de uma hIL-3 parcialmente sintética a partir de corpos de inclusão de células de E. coli. As células são em primeiro lugar desintegradas por duas passagens através de uma prensa francesa e os corpos de inclusão são isolados por centrifugação num gradiente de sucrose. Esta referência descreve igualmente três procedimentos para a purificação de um polipeptídeo semelhante a IL-3 humana ou de gibão a partir de meio condicionado de células COS. Em todos os casos usa-se um processo de uma única coluna: uma coluna de permuta iónica ou uma coluna de lectina de lentilhas ou HPLC de fase invertida. A pureza máxima obtida para a IL-3 de gibão, de acordo com a determinação por degradação de Edman automática, foi de 98%. No entanto, esta técnica não é de algum modo uma técnica pela qual se possa determinar com precisão a pureza de proteínas.

A publicação de pedido de Patente HO 88/05469 descreve a purificação de IL-3 humana a partir de estirpes de leveduras por operações de HPLC de fase invertida simples ou sequenciais. O número de fases de HPLC usadas não é especificado. Indica-se que se necessário se podem usar fases adicionais. Não se descrevem ensaios de determinação da pureza final da hIL-3.

Este facto sugere claramente que não foi obtido ura produto homogéneo.

É possível concluir que não foram ainda descritos métodos específicos para a purificação da hIL-3 a de compostos com actividade semelhante. Por conseguinte subsiste ainda uma necessidade de hIL-3 substancíalmente pura que possa ser usada em terapia e de ura método para a preparação deste produto substancialmente puro era rendimento elevado. De preferência este método deve ser facilmente reproductlvel em grande escala.

A clonagem e a expressão da IL-3 humana foram descritas nas seguintes referências.

Foi identificada uma sequência de ADN que codifica para a hIL-3 por Yang et al.. Cell (1986), 47, 3-10, que isolaram o gene da hIL-3 usando um ADNc que codifica para a IL-3 de gibão como sonda e descrevem a sequência dos exões do gene humano.

A publicação de pedido de Patente HO 88/00598 descreve que este gene humano é transcrito em células eucarióticas, enquan to que o ARN é cortado. Após o isolamento do ARN, produz-se ADNc e identifica-se o ADNc de hIL-3 por hibridação com ADNc de IL-3 de gibão.

Dorssers et al.. Gene (1987), 55, 115-124, isolaram um ADNc que codifica para a hIL-3 por hibridação com um ADNc de IL-3 de rato. A publicação de pedido de Patente NO 88/04691 chama a atenção para que esta hibridação é possível devido ao surpreendente alto grau de homologia entre as regiões 3* não codificantes dos genes da IL-3 humana e de rato. Após clonagem do ADNc, a hIL-3 foi expressa subsequentemente numa variedade de células hospedeiras incluindo E. coli, bacilos, leveduras e culturas de tecidos. Geralmente os produtos de expressão eram biologicamente activos. Este pedido de patente é o primeiro a descrever a presença de uma Pro na posição 8 da proteína madura.

Na publicação de pedido de Patente HO 88/05469 descreve-se o isolamento de um ADNc que codifica para a hIL—3 usando um ADN sintético como sonda, o qual é derivado da sequência genómica descrita por Yang et al. (obra citada). A sequência de

ADNc obtida, no entanto, nSo possui a informação para dois ácidos aminados (números 44 e 45, ou 45 e 46, o que é arbitrário uma vez que o ácido aminado que ladeia qualquer das supressões é um Asp codificado por GAC). No entanto, afirma-se que o sobre* nadante da cultura de um transformante de levedura, que possui a referida sequência de ADNc num bloco integrado (cassete) de expressão que codifica para a hIL-3 madura fundido com uma bandeira (flag) N-terminal de 8 ácidos aminados, apresenta actividade de IL-3 numa análise de proliferação de medula ossea humana.

Na publicação de pedido de Patente WO 88/06161 descreve-se o isolamento da sequência de ADNc de hIL-3 usando como sonda um ADN sintético derivado da sequência genómica descrita por Yang et al. (obra citada). Também se descreve a construção de uma sequência que codifica para a hIL-3 completamente sintética e a construção de duas mutelnas Ile e Leu . NSo é feita qualquer menção à actividade biológica. Para além disso, presumia-se aparentemente que a hIL-3 continha 132 ácidos aminados 1 2 com início na extremidade N-terminal com Pro -Met , sendo no entanto geralmente aceite que a hIL-3 tem uma dimensão de 133 1 2 ácidos aminados e possui uma extremidade N-terminal Ala -Pro Ê de notar que Yang et al. descrevem um resíduo de Ser na posição 8 da hIL-3 madura enquanto que todas as outras referências indicam a presença de uma Pro nesta posição.

Na publicação do pedido de Patente EP-A-285429 descreve-se o isolamento de uma linha de células humana que produz um factor com actividade de factor de crescimento de mastócitos, o qual é incorrectamente designado por IL-3. É geralmente aceite que a hIL-3 não possuí qualquer efeito de proliferação em células e em medula de rato, enquanto que o factor não caracterizado bioquimicamente descrito nesta referência tem a capacidade de estimular estas células formando mastócitos. Por conseguinte este factor não pode ser idêntico à hIL-3.

A fim de conseguir uma melhor compreensão de um dos sistemas de vectores de expressão usado a fim de produzir hIL-3, é essencial a seguinte informação básica referente ao vírus de papiloma bovino.

O Vírus BPV-1 é um dos vírus do papiloma bovino em número de pelo menos seis e encontra-se associado com os fibro— papilomas cutâneos do gado bovino. Estes vírus têm a capacidade de transformar facilmente uma variedade de células de roedor em cultura. 0 ADN do vírus do papiloma bovino cionado molecular mente bem como um fragmento subgenómico a 69% cionado sSo muito eficientes na induçSo de focos transformados. As células transformadas contêm cópias múltiplas (10 a 120 por célula) do ADN virai sob a forma de moléculas nSo integradas (Law et al,, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981), 78. 2727-2731). A genética do vírus do papiloma bovino do tipo I foi intensamente estudada (revista por Lambert et al.. Annu. Rev. Genet. (1988), 22. 235-258) O genoma do BPV-1 é uma molécula de ADN de dupla cadeia circular de 7946 pares de bases. A transcrição é complicada devido à presença de vários promotores e locais de corte e à produção diferencial de espécies de ARN. As actividades de alguns dos promotores estSo sobre um controlo apertado dos intensificadores de transcripção.

Tanto o BPV-1 como o fragmento subgenómico de 69% (BamHI-HindllI) tem sido usados frequentemente para a clonagem de expressão de vários genes em diferentes sistemas de clonagem. A publicação do pedido de Patente EP-A-198386 descreve a expressão de interferão gama em células de rato C127. Na publicação do pedido de Patente EP-A-105141 descreve-se o uso do vector de BPV para a expressão do antigene superficial da hepatite B (HBsAg) em linhas de células de vertebrado. Por exemplo NIH 3T3 fibrobiastos de rato LTK e células de rim de macaco verde africano. A utilização de BPV-1 como parte dos veículos de clonafem é descrita na Patente U.S. NO. 4 419 446.

Sumário da Invenção

De acordo com um aspecto da presente invenção proporciona-se IL-3 produzida por via recombinante purificada até homogeneidade·

A presente invenção proporciona um método para a puri- 6 -

ficação de IL-3 humana até homogeneidade por meio de uma fase inicial de interacçSo hidrofóbica seguida por cromatografia de permuta iónica e, opcionalmente, por filtraçSo em gel. Este método é especialmente útil para a hIL-3 obtida por sistemas de expressSo recombinantes procarióticos e eucarióticos. Este e outros aspectos serão desenvolvidos na descriçSo pormenorizada que se segue.

Num outro aspecto a presente invenção proporciona sistemas de expressão que são constituídos por combinações específicas de hospedeiros e de vectores para a produção de IL-3 humana, quer sob forma não glicosilada a partir de procariontes. Estes sistemas são usados com vantagem para produzir IL-3 que é submetida subsequentemente aos processos de purificação da presente invenção.

A presente invenção descreve também vectores baseados no vírus do papiloma bovino e linhas de células que contêm estes vectores. Os referidos vectores são mutados de tal modo que a quantidade de ARNm que codifica para o gene clonado é muito aumentada. Oe preferência esta operação é realizada por mutação do codão de inicio ATG do E2—ORP (« quadro de leitura livre « ”Open Reading Frarae“).

Breve Descrição doa Desenhos

A Figura 1 apresenta a sequência de ácidos aminados e a sequência nucleotídica do bloco integrado de expressão da hlL—3 que é usado em B. licheniformis. A flecha indica o ponto de partida da proteína madura.

A Figura 2 apresenta o perfil de eluição da cromatografia de interacção hidrofóbica da hlL—3 de Bacillus licheniformis T9 em Fraktogel TSK-butil 650C (dxh « 25x8 ca). As fracções que contêm a hIL-3 estão indicadas com uma barra horizontal

A Figura 3 apresenta o perfil de eluição da cromatografia de permuta aniónica (primeiro tempo) da hlL-3 de Bacillus licheniformis T9 ea Q-Sepharose Fast Flow (dxh » 10x11 cm).

A Figura 4 apresenta o perfil de eluição da cromatografia de permuta aniónica (segundo tempo) da hIL-3 de Bacillus

licheniformis T9 em Q-Sepharose Fast Flow (dxh » 5x90 cm).

A Figura 5 apresenta o perfil de eluição da cromatografia de filtração em gel da hIL-3 de Bacillus licheniformis T9 em Sephacryl S100 HR (dxh » 5x90 cm).

A Figura 6 apresenta o número de linfócitos e de trombócitos em sangue de chimpanzé após injecção subcutânea de 30 pg/kg de IL-3 desde o dia 0 até ao dia 6.

Descrição Pormenorizada

O termo interleuquina-3 humana e os seus equivalentes IL-3 humana ou hIL-3 na presente memória descritiva sSo usados para indicar tanto a interleuquina-3 humana como qualquer proteína com actividade semelhante à da IL-3 humana. Num sentido amplo a designação IL-3 é usada como equivalente a IL-3 de primata. Se bem que a presente memória descritiva se refira especificamente à IL-3 humana, será óbvio para os especialistas na matéria que a IL-3 de primata, tendo um alto grau de homologia com a IL-3 humana, pode ser purificada usando o mesmo método. De preferência a homologia é pelo menos de 70% ao nível dos ácidos aminados, de modo especialmente preferível é de pelo menos 90%. For exemplo, a IL-3 madura do macaco rhesus (Macaca mulatta) possui uma identidade de 80,5% ao nivel dos ácidos aminados com a sequência da IL-3 humana.

Outras variantes da IL-3 de ocorrência natural também sSo candidateis para o procedimento de purificação descrito na presente invenção. Os mutantes que não ocorrem naturalmente também podem ser purificados desde que a identidade não seja demasiadamente baixa (por exemplo 70%). Os mutantes não naturais são proteínas mutadas que conservaram a actividade da IL-3. As mutações incluem adições, supressões e substituições. As proteínas modificadas de modo mais ou menos óbvio conforme mencionado consideram-se também incluídas.

Recombinante deve ser interpretado como produzido por organismos microbianos ou por culturas de células que normalmente não produzem a proteína em questão ou, pelo menos, não produzem a proteína em questão em quantidades que permitam uma

aplicação industrial. Os organismos microbianos incluem bactérias, leveduras e fungos. Para além disso, é possível usar também células de cultura de tecidos gue sSo especialmente importantes guando se pretende uma glicosilaçSo apropriada.

A presente invençêa proporciona um raétodc eficaz para a purificação de IL-3 humana recombinante até homogeneidade.

Este método é constituído por uma série de fases gue inclui interacção hidrofóbica, cromatografia de permuta iénica e filtração por gel. Uma combinação específica dos referidos métodos mostrou surpreendentemente ser extremamente poderosa para a obtenção de hIL-3 substancialmente pura. Para além disso, este método de purificação dá como resultado um produto isento de pirogénios. Este método é especialmente apropriado para utilização em grande escala, o gue constitui uma grande vantagem, uma vez que se torna necessário purificar grandes volumes de caldo de fermentação que contêm hIL-3 após a secreção pelas células para a separaçSo dos componentes contaminantes do meio nutriente. Este método é especialmente útil para a purificação da hIL-3 produzida por hospedeiros transformados, tanto procarióticos como eucarióticos.

Em princípio os métodos de purificação referidos podem ser usados por qualquer ordem arbitrária. Cada método mencionado só por si terá como resultado uma purificação considerável.

Os inventores, no entanto, foram os primeiros a mostrar a combinação específica descrita em seguida.

De preferência a fase inicial da purificação é uma interacção hidrofóbica. Esta fase é usual e por conseguinte é surpreendente que se tenha verificado ser muito eficaz para o objectivo da presente invenção. Presumivelmente esta fase causa uma separação selectiva na base da estrutura da própria proteína. Nesta fase eliminara-se substancialmente càntaminantes como outrat proteínas, componentes do meio e substâncias coradas.

De preferência usa-se uma cromatografia de permuta iónica para segunda fase. A hIL-3 encontra-se nas fraeções obtidas separada da maioria das proteínas contaminantes. Esta • fase também provoca uma eliminação de cor residual. Para além . disso, a quantidade de ADN e de endotoxina é consideravelmente

reduzida quando se usa cromatografia de permuta aniõnica.

Quando estão presentes produtos de degradação da IL-3 no material de partida a ser purificado, por exemplo de Bacillus licheniformis, estas proteínas podem ser com vantagem separadas da hIL-3 nativa por meio de uma segunda fase de cromatografia de permuta aniónica. De preferência usa-se Q Sepharose Fast-Flow a fira de obter o resultado pretendido. São exemplos de outras técnicas eficazes para a separação dos produtos de degradação da hIL-3 a cromatografia em hidroxiapatite e a cromatofocagem em pBE94.

Como fase final de purificação usa-se cora vantagera a filtração era gel. Neste procedimento separam-se proteínas de baixo peso molecular ou produtos de agregação de IL-3 madura.

A interacção hidrofóbica é levada a efeito com vantagem usando uma coluna de TSK-butilo ou de octil-Sepharose, da qual a hIL-3 pode ser eluida por exemplo com gradientes de em tris.HCl ou de etileno-glicol.

A eliminação de proteínas contaminantes (e de outras substâncias) por cromatografia de permuta iónica pode implicar a utilização de colunas por exemplo de TSK-DEAE, Q Sepharose Fast-FlOW OU TSK—CM.

Finalmente, uma filtração por gel usando, de preferência, Biogel A ou Sephacryl S100 HR constitui uma fase final excelente na purificação de hIL-3 não glicosilada.

O ponto de partida para a purificação pode ser tanto hIL-3 intracelular ou hIL-3 contina no caldo de fermentação.

A purificação de hIL-3 intracelular (conforme se ilus< tra na presente memória descritiva após expressão de hlL-3 em E. coli) é facilitada substancialmente quando a proteína está contida nos designados corpos de inclusão. O primeiro passo será então o isolamento destes corpos de inclusão que contêm o produto numa forma relativaroente pura e numa concentração eleva· da. Após solubilização a hIL—3 pode ser ainda purificada por cromatografia.

A purificação da hIL-3 contida no caldo de fermentação (conforme ilustrado na presente menória descritiva por meio

da utilização de culturas de B. licheniformis, leveduras e células eucarióticas, respectivamente) inicia-se com a obtenção de um meio isento de células.

A fim de ilustrar a aplicabilidade geral do presente método à purificação de hIL-3 obtida por via recombinante, foram preparados vários vectores de expressão. Estes vectores são exemplos de uma ampla gama de vectores que podem ser usados a fira de obter a expressão da hIL-3 em bactérias, fungos, leveduras e outras células eucarióticas. A construção destes vectores de expressão é descrita seguidamente em termos gerais.

Na publicação do pedido de Patente WO 88/04691, que ee considera como aqui reproduzida por referência, apresentam-se várias vias para a produção de hIL-3. A produção por expressão de genes heterólogos de acordo com a presente invenção baseia-se por um lado na combinação da fusão perfeita de sequências de sinal do hospedeiro com sequências que codificam para a hIL-3 madura, em conjunção com promotores fortes em bacilos, e por outro lado na utilização de combinações promotores fortes/intensificadores e de sequências de estabilização de ARNm em vectores derivados de BPV-1 em células C127, FR3T3 e CHO.

Todos os elementos usados para a expressão da hIL-3 em espécies de bacilos encontram-se descritos na publicação de pedido de Patente WO 88/04691. No entanto, as combinações óptimas dos promotores, das sequências de sinal e das sequências que codificam para a hIL-3 madura foram determinadas por rearranjo dos diferentes elementos genéticos. Para uma secreção apropriada da hIL-3 por espécies de bacilos verificou-se ser crucial uma ligação perfeita entre a sequência de sinal da <X-amilase e a sequência que codifica para a hIL-3. Já usando o promotor tf43 (conforme descrito em WO 88/04691) foi possível detectar a hIL-3 no meio de cultura, mas apenas depois de se ter obtido a inclusão do promotor forte da o(-amilase ou Hpall na expressão de alto nível de plasmídeos de expressão.

A WO 88/04691 descreve também a expressão de hIL-3 activa por células C127. No entanto os níveis de expressão são relativamente baixos quando se usa o vector pLB4/BPV. A utiliza11

ção da combinação do intensificador do Vírus do Sarcoma Murino de Moloney (MSV) e do promotor da metalotioneína I de rato, ou do intensificador/promotor do Citomegalovírus Humano, em vez do intensificador/promotor de SV40 presente em pLB4/BPV, tem como resultado altos níveis de expressão da hIL-3 por células de mamífero.

A substituição da sequência de ADNc da hIL-3 pela sequência de hIL-3 genómica tem um efeito benéfico no nível do estado estacionário do ARNm da hIL-3 e na produção da hIL-3 em células de mamífero.

Pode conseguir-se um aumento adicional no nível de ARNm usando vectores que contêm BPV. Conforme mencionado na descrição, o genoma do BPV-1 é uma molécula de ADN de dupla cadeia circular de 7946 pares de bases. A transcrição é complicada devido à presença de promotores múltiplos, locais de corte e produção diferencial de espécies de ARN. As actividades de alguns dos promotores encontram-se sob um controlo rígido de intensificadores de transcrição. 0 designado E2 (= precoce, early“) ORF é muito importante a este respeito. O comprimento integral do E2 ORF codifica para uma proteína de transactivação (E2-ta) que pode estimular a transcrição de genes precoces.

Esta proteína é constituída por dois domínios conservados, o domínio amino-terminal (que possui actividade de transactivação) e o domínio carboxi-terminal (que possui tanto uma actividade de ligação de ADN como uma actividade de formação de dímeros). 0 E2 ORF codifica para uma segunda proteína de regulação, o repressor de transcrição de E2 (E2-tr), que é uma forma truncada na extremidade amino-terminal da prcteína E2-ta.

repressor E2-tr é codificado por um outro ARNm, em que o cc-dão de início de tradução é um codão ATG interno de E2 ORF. Por mutação do referido codão de início suprime-se claramente a produção de E2-ir (a proteír.a repressora). Sem esta actividade repressora a transcrição do gene precoce é consideravelmente aumentada provocando um aumento no número de cópias plasmídicas. Esta circunstância tem como resultado um aumento da transcrição do gene clonado (a quantidade de ARNm que codifica para o gene clonado aumenta) e deste modo uma produção de proteína mais ele12 -

vada.

SSo proporcionadas duas novas linhas de células derivadas de FR3T3 e de CHO. As linhas de células derivadas de FR3T3 que foram estabelecidas usando um novo vector de expressão com um inteneificador de MSV/promotor de MT mostraram logo um aumento na produção de hIL-3 com respeito às linhas de células estáveis C127-pLB4/BPV anteriormente descritas (WO 88/04691). Verificou-se que quando este novo vector de expressão é usado a fim de estabelecer linhas de células estáveis a partir de células C127, é possível obter um aumento de mais de 20 vezes. Estas últimas linhas de células permitem uma produção eficaz da hIL-3 co» uma glicosilação do tipo da que ocorre em mamíferos (complexa) .

Para além disso, são proporcionadas linhas de células CHO estáveis. A utilização de células CHO em combinação cora vectores BPV para a produção de proteínas farmacêuticas não tinha sido anteriormente descrita. A produção de hIL-3 com estas linhas de células atinge níveis iguais aos do melhor sistema de produção conhecido. Uma outra vantagem da utilização de células CHO pode ser a facilidade com que estas células podem ser adaptadas ao crescimento em suspensão e portanto cultivadas em ferraentadores de grande dimensão. Para além disso, a ampla gama de hospedeiros de vectores BPV facilita a escolha de uma linha de células em função da glicosilação pretendida.

É interessante notar-se que a hIL-3 de Kluyveromyces lactis obtida após purificação em Fraktogel TSK-Ch 650M apresentava uma afinidade de ligação baixa mas distinta para a heparina-Sepharose, conforme foi detectado por SDS^Page e por análise de mancha imunitária. A afinidade da hIL-3 para a heparina pode indicar uma possível ligação in vivo a matrizes semelhantes (os glicosaminoglicanos, por exemplo) que estão presentes no interior do estroma da medula óssea Humana. A ligação da hIL-3 a esta matriz pode ser uma parte da sua função fisiológica.

A presença de um local ou de locais de ligação semelhantes a heparina ou a glicosaminoglícano em factores de crescimento ou outras proteínas pode ser um mecanismo importante

para o direccionamento in vivo destas proteínas para matrizes específicas no interior do estroma da medula óssea ou noutros locais do corpo em que a sua acçSo seja necessária. O desenvolvimento de proteínas de segunda geração com locais de ligaçSo novos ou melhores para as matrizes referidas pode tornar-se importante na formulaçSo e no direccionamento de proteínas farmacêuticas como a hIL-3.

A IL-3 humana foi exaustivaraente definida no que respeita às suas propriedades biológicas em WO 88/04691 (obra citada). Esta referência também mostra que algumas modificações da proteína IL-3, tais como extensão N-terminal, supressão de Ala^ ou de Ala -Pro , não eliminam a actividade biológica da proteína No entanto, se bem que se afirme que é possível suprimir ou alterar partes da proteína hIL-3 sem efeitos prejudiciais para a sua função, é possível também prever que as proteínas semelhantes a hIL—3 com sequências de ácidos aminados alteradas possuem efeitos alterados nas células visadas. Estas moléculas podem funcionar quer como agonistas quer como antagonistas. Para as duas classes de proteínas é possível prever aplicações clínicas. Algumas destas proteínas semelhantes a hIL-3 conservam a sua função biológica, enquanto que outras moléculas perderam esta função. As primeiras proteínas podem ainda servir como agonistas e podem apresentar propriedades benéficas na utilização clínica, tais como melhor estabilidade, melhor ligação ao receptor de hIL-3, etc., enquanto que as últimas podem servir de antagonistas, por exemplo quando a ligação desta proteína ao receptor de hIL-3 não dá origem a uma transdução de sinal.

Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar mais completamente a presente invenção e nSo limitam o seu âmbito.

Exemplo 1

Expressão de IL-3 humana por espécies de Bacilos

A fim de obter uma expressão melhorada era bacilos para a IL-3 humana preparou-se um derivado do plasmídeo pGE/lL^317 (WO 88/04691). Este plasmídeo contém a jusante do promotor forte de 0(-amilase, nuina direcção de 5’ para 3*, informação de codi

ficação para a sequência de sinal de o(-amilase de bacilos - ácidos aminados extra - a sequência de sinal da IL-3 - o gene da IL-3 e a extremidade 3* do gene da amilase.

Em primeiro lugar fez-se uma junção perfeita entre a sequência de ADN que codifica para a sequência de sinal da amilase e a sequência de ADN que codifica para a IL-3 humana madura no plasmíóeo lançadeira E. coli-Bacillus pGE/IL-311 (WO 88/04691) Este plasmídeo foi cortado com as enzimas de restrição Sall e Ciai.

fragmento menor que continha a informação para a sequência de sinal da IL-3 humana foi permutado com um fragmento Sall-Clal sintético que continha a informação de codificação para a sequência de sinal da o(-amilase fundida à sequência que codifica para a IL-3. O plasmídeo resultante pGE/IL-321 foi utilizado para a transformação de B. licheniformis T9. Os tran3formantes sintetizavam apenas pequenas quantidades de IL-3, mas nenhuma proteína foi segregada para o meio.

fragmento menor PstI-Clal de pGB/IL-321 foi isolado e inserido no plasmídeo pGB/IL-317 cortado com PstI-Clal. substituindo deste modo a sequência de ADN que codifica para os ácidos aminados extra e a sequência de sinal de IL-3 com a junção perfeita da sequência de sinal de d(-amilase e a sequência que codifica para a IL-3 madura. O plasmídeo resultante, que foi designado por pGE/IL-322, deu origem a uma produção elevada de IL-3 por transformantes de E.licheniformis. Mais de 95% da proteína é segregada para o meio de cultura. Por sequenciação N-terminal da proteína purificada verificou-se que a IL-3 sintetizada por estes transformantes tem a extremidade amino-terminal correcta (Ala -Pro -Met ). A Figura 1 mostra a sequência de ácidos aminados completa e a sequência de nucleótidos do bloco integrado de expressão da hIL-3 conforme se apresenta no plasmídeo pGB/IL-322.

Outro novo vector de expressão pGB/IL-326 foi construído do modo seguinte: clonou-se o fragmento HindIII-SalI (com a extremidade HindlII preenchida usando polimerase de Klenow) de pGB/ir-311 em pTZ!8R (Pharmacia) cortado com Sall e Smal, dando

origem ao vector pGB/IL-323. 0 ADN que codifica para a sequência de sinal da IL-3 foi substituído por um fragmento sintético de ADN que codifica para a sequência de sinal de d(-amilase de Bacillus. Nesta fracçSo sintética de ADN o codão de início ATG encontra-se precedido pela sequência CAT dando origem a um local de corte para a enzima de restrição Ndel. Clonou-se em seguida o fragmento Sphl-Kpnl deste plasmídeo pGB/IL-324, que contém a sequência de sinal da c(-amilase - IL-3 madura - terminador de amilase, em pBHAl cortado com Sphl e Kpnl (o plasmídeo pBAH3 é um derivado do plasmídeo pBAHl (WO 88/04691) a que falta o local p

PstI no gene Ap ). O plasmídeo resultante pGB/IL—325 foi cortado com Ndel e religado, fundindo deste modo o promotor designado por Hpall com a sequência de sinal de g-amilase - sequência que codifica para a IL-3 madura. O plasmídeo resultante pGB/IL-326 foi usado para transformar B. licheniformis T9. Os transformantes produziam elevadas quantidades de IL-3 de que mais de 95% era segregada para o meio de cultura.

Efectuaram-se as seguintes operações a fim de obter o plasmídeo pGB/IL-341. A inserção de pGB/IL-341 codifica para uma IL-3 truncada na extremidade C-terminal (constituída por 129 ácidos aminados). O ADNc da IL-3 3* não codificante e a sequência estrutural da q-amilase entre o codão de paragem no ADNc e o terminador de q-amilase foram suprimidos da pGB/IL-324 por formação de uma laçada exterior (looping-out“) usando o seguinte oligonucleótido:

5' TGA GCC TGC CGA TCT TTT GAC TGC AGT AGA AGA GCA GAG AGG ACG G 3*

Este oligonucleótido também introduziu um local Xhol imediatamente a jusante do codão de paragem da IL-3. 0 plasmídeo resultante foi designado por pGE/IL-337. O fragmento Ndel-Kpnl de pGE/IL-337 foi clonado no vector de E. coli cortado por Ndel-Kpnl pTZISRN. 0 vector pTZl8RN é o plasmídeo pTZ18R modificado imediatamente a montante do codão de início de lacZ ATG a fim de introduzir um local Ndel, usando um oligonucleótido com a seguinte sequência:

5’ CAG GAA ACA CAT ATG ACC ATG ATT 3’

plasmídeo resultante, em que o promotor lacZ é seguido imediatamente pela sequência que codifica para o peptídeo de sinal da o(-amilase de Bacillus fundido de modo preciso à IL-3 madura, é designado por pGB/IL-340. Neste vector a sequência que codifica para a IL-3 foi aparada por laçada exterior usando um oligonucleótido com a seguinte sequência:

5' CTC AAC AGA CGA CTT TGA GCT GAC TCG AGT AGA AGA

GCA GAG 3'

O plasmídeo resultante foi designado por pGB/IL-340/1455. Este plasmídeo de E. coli codifica deste modo apenas para os ácidos aminados de 1 a 129 da hIL-3.

Construiu-se um vector de expressão em bacilos para esta muteína por substituição do fragmento Pstl-HindlII em pGB/ IL-322 pelo fragmento Pstl-HindlII de pGB/IL-340/1455. O plasmídeo resultante pGB/IL-341 deu origem a uma produção elevada da muteína de IL-3 de 129 ácidos aminados por transformantes de B. licheniformis T9.

A IL-3 produzida por transformantes de B. licheniformis T9 obtidos com os vectores de expressão pGB/IL-322, pGB/IL-326 e pGB/IL-341 possui a sequência términal de ácidos aminados correcta, não estava glicosilada e apresentava uma alta actividade biológica em ensaios de AML e de medula óssea humana.

Exemplo 2

Expressão de IL-3 Humana em Células de Mamífero

Construiu-se um vector de expressão pGE/IL-328 com elementos semelhantes aos do plasmídeo p8-4 de Sarvar et al♦ (Papilloma viruses: Molecular and Clinicai Aspects, 515-527 (1985), Alan R. Liss Inc.). Este vector contém uma sequência de pML2 (BamHI-Clal, 2623 pb), o intensificador MSV fundido ao promotor MT c.e rato (esta fusão é descrita por Sarver et.al. , obra citada), ADNc de IL-3, o sinal de poliadenilação de SV40 (como em Sarver et al,, obra citada) e o genoma de BPV-1 completo.

’ A fim de obter o vector de expressão de hIL-3 preten• dido, numa primeira fase clonou-se o fragmento Avall-Aval de

pLB4 que codifica para a hIL-3 (com o local Aval preenchido por polimerase de Klenow) em pTZl8R cortado com EcoRI-Smal (Pharmacia) , juntamente com um fragmento de ADN sintético constituído pelos seguintes oligonucleótidos:

5'-AATTCAGATC GTCCTGCTCC TGCTCCAACT

50

5-GACCAGGAGT CAGGCGGCTC ATTTTTAGAT

50

TAAAAATGAG

CCTG-3*

CCGCCTGCCC

TGGAGCAGGA CTG-3'

GCAGGACGGG

O plasmídeo resultante, pGB/IL-327, foi cortado com BglII e BamHI, isolou-se o fragmento de ADN que codifica para a hIL-3 e clonou-se no local BglII singular a jusante do intensificador/promotor MSV/mMT descrito anteriormente. No vector de expressão de hIL-3 final pGB/IL-328 a sequência de reconhecimento BglII é seguida por 4 resíduos A após os quais se coloca o codão de início ATG. Usando o local Aval na região não codificante 3' da sequência de ADNc para a construção do novo vector de expressão a repetição ATTTA que foi apontada como responsável pela instabilidade do ARNm (Shaw e Kamen, Cell (1986), 46, 659-667) não está incluída em pGB/IL-328. Depois da introdução do plasmídeo pGB/IL-328 em células C127 por métodos tradicionais e já publicados (por exemplo em WO 88/04691) foram estabelecidas linhas de células estáveis que produzem níveis elevados de hlL-3. Estas linhas de células possuem um nível de produção mais de 20 vezes superior de hIL-3 do que as linhas de células estáveis anteriormente descritas derivadas de células C127 que contêm o plasmídeo pLB4/BPV (WO 88/04691).

Introduziu-se também o plasmídeo pGB/IL-328 em células FR3T3 (seif e Cuzin, Virology (1977), 52., 721-728) usando o método descritc anteriormen ce. Foi té..nbém possível estabelecer linhas de células estáveis, se bem que com menor frequência.

As linhas de células obtidas apresentavam uma menor produtividade de hIL-3 do que as linhas de células transformadas com pGB/IL-328.

Introduziu-se também o plasmídeo pGE/IL-328 em células CHO (Wood, R.D. e Bur.ki, J.H., Mutat. Res. (1984) , 95, 505) usando o método descrito anteriormente. Uma vez que as células CHO não formam focos por transformação com um vector que possua as sequências de BPV-1 efectuou-se uma co-transfecção com pSV2nec (Southern, P.J. e Berg, Ρ. , J. Mol. Appl. Gennet. (1982), JL, 327-341) numa proporção de 10:1, (sendo o plasmídeo pSV2neo o componente minoritário), permitindo uma selecção em função da resistência a G418. As colónias resistentes a G418 foram isoladas e experimentadas para verificação da produção de IL-3. Uma quantidade significativa destes clones produziam hIL-3. Em seguida, efectuou-se um procedimento de clonagem de uma célula única a fim de estabelecer linhas de células estáveis. Foram estabelecidas várias linhas de células com níveis de produção equivalentes e melhores do que os das linhas C127-pGB/IL-328 de melhor produção. Este resultado inesperado não tem qualquer precedente na técnica anterior.

Usou-se a combinação intensificador/promotor IE de citomegalovírus para a expressão de hIL-3. Clonou-se o fragmento Bal-Sphl do plasmídeo pES (Boom, Z. et al., J. Virol. (1986),

58, 851-859) em pTZl8R cortado com Smal-Sphl (Pharmacia). Em seguida introduziu-se um local BglII logo a jusante do local de início de transcrição por utilização de mutagénese dirigida a um local com o seguinte oligonucleótido:

5' GAG CTC GTT TAG TGA ACC GTC AGA TCT CCT GGA GAC GCC ATC CAC GCT GTT T 3*

Construiu-se um vector, pGB/IL-329 que contém a sequência pML2 de pGB/IL-328 (BamHI-EcoRI), o intensificafor/promotor de CMV (EcoRI-BglII) e o sinal de poliadenilação de SV40 (BglTI-BamHI) como em Sarver et al., obra citada. Preparou-se a construção de expressão de IL-3 final pGB/IL-330 por introdução do fragmento Eam/I-BglII que codifica p._ra IL-3 de pGB/IL-327 no local BglII singular de pGB/IL-329, seguido da introdução do genoma de BPV-1 cortado com BamHI no local BamHI singular deste vector de expressão.

Após introdução do vector pGB/IL-330 em células C127, foram estabelecidas linhas de células estáveis que produziam

altos níveis de IL-3. Ê certo que a expressão é 2 a 4 vezes inferior a obtida com a construção pGL/IL-327, mas o vector pGB/IL-330 deu origem a um ARNm com uma região 5' não traduzida extremamente curta de 12 nucleótidos. A introdução de uma região 5' não traduzida maior pode facilitar a tradução, intensificando deste modo o nível de produção.

Introduziu-se também o plasmídeo pGE/IL-330 em células CHO (Wood, R.D. e Burki, J.H., Nutat. Res. (1984), 95, 505) usando o método de co-transfecção descrito anteriormente. Colheram-se colónias resistentes a G418 e experimentaram-se para se determinar a produção de nIL-3. Foram estabelecidas linhas de células estáveis por clonagem de células isoladas dos clones positivos. Surpreendentemente as linhas de células que apresentaram uma produção mais elevada tinham produções semelhantes às melhores linhas CHO-pGB/IL-328, indicando que a região não traduzida 5’ curta do ARNm nao tem qualquer efeito na produção de hIL-3 ou então que o intensificador/promotor de CMV é mais efectivo nas células CHO.

A IL-3 presente no meio condicionado das linhas de células estabelecidas apresentava uma alta actividade nas análises biológicas oescritas em WO 68/04691.

Exemplo 3

Expressão de IL-3 humana em Células Humanas usando um veator que contém um qenoma de BPV modificado

O genoma do BPV codifica para 3 proteínas com sequências do quaaro ãe leitura livre E2 designadas por E2-ta, E2-tr e E6/B2 respectivamente (Lambert et al., Annu. Rev. Genet. (1988) 22, 235-258). O codão ATG na posição 3091-3093 pode ser substituído por um codão GCG (Ala) ou por um codão ACG (Thr), proibindo deste modo por um lado o início da tradução da proteína E2-tr e por outro laao substituindo a toet °² em E2-ta por Ala^^² ou Thr^². O genoma do BPV em pGB/IL-328 e pGL/IL-330 pode ser substituído pelos genoraas de BPV mutante E2-tr. Os equivalentes de pGB/IL-328 são designados por pGB/IL-331 (Ala) e pGB/IL-332 (Thr). Os equivalentes de pGB/IL-330 são designados por pGB/IL20

-333 (Ala) e pGB/IL-334 (Thr). Os novos vectores de expressão podem ser introduzidos em células C127 e CHO, conforme descrito. £ de prever que o nivel de produção de hIL-3 seja substancialmente aumentado nos dois tipos de células em relação às combinações C127-pGB/IL—328, CHO-pGB/IL-328 e Cl27-pGB/IL-330, CHO-pGB/· IL-330 respectivamente.

A IL-3 presente no meio condicionado das linhas de células estabelecidas apresentará uma alta actividade nas análises biológicas descritas em WO 88/04691.

Exemplo 4

Purificação de IL-3 humana obtida a partir de expressão em bactérias

a. Bacillus licheniformls

Seguiu-se o procedimento seguinte a fim de obter hlL-3 homogénea e de alta pureza a partir de transformantes de Bacillus llcheniformis T9 (HO 88/04691). Os transformantes continham o plasmídeo pGB/IL-322. No entanto também se usou o plasmídeo pGB/IL-341 neste procedimento.

Levou-se um meio isento de células de B. licheniformls T9 a uma concentração 1 M em (NH^^SO^ e ajustou-se a pH 7,0 com NaOH. Fez-se passar através de uma coluna de Fractogel TSK-butilo 650C, equilibrada em (BH^^SO^ 1 M em tampão de tris.HCl 10 mM de pH 7,0. Usou-se fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como inibidor de proteinase.

Se bem que a maior parte da proteína tivesse sido encontrada nas fraeções recolhidas directamente, a hIL-3 ficou adsorvida na coluna. Após lavagem intensa desta coluna com o mesmo tampão, eluiu-se a hIL-3 por meio de um gradiente de 1 M a 0 M de (NH^)^SO^ em tris.HCl 10 mM de pH 7,0. Concentraram— -se as fraeções ricas em hIL-3 por precipitação com (NH^i^SO^a 70% de saturação. Em seguida eliminaram-se do precipitado obtido os sais até uma condutividade de 0,7 mS ou inferior e fez-se passar numa coluna de Fractogel TSK-DEAE 650M que tinha sido equilibrada com o mesmo tampão (tris.HCl, pH 7,8). Se bem que a actividade de hIL-3 tenha sido encontrada nas fraeções recolhi

das directamente, a maior parte das proteínas contaminantes ficou ligada na coluna. As fracções recolhidas directamente ricas em hIL-3 foram concentradas (por adsorçSo e separação numa pequena coluna de Practogel TSK-butilo 650C conforme descrito acima ou por precipitação com (NH₄)₂SO₄) e purificadas até homogeneidade por filtração em gel com Biogel A (0,5 M; 100 a 200 mesh) com NaCl 200 mM em tris.HCl 20 mM de pH 7,0 para tampão de carga (verificou-se que Sephacryl S100 HR também era uma matriz eficaz para a filtração por gel de hIL-3). Este procedimento de purificação em três fases; 1) interacção hidrofóbica, 2) cromatografia de permuta aniõnica e 3) filtração por gel, deu como resultado um preparado de hIL-3 isento de proteínas não semelhantes a hIL-3, conforme determinado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida por coloração com prata e por análise de mancha imunitária usando anticorpos anti-hIL-3.

Se estavam presentes produtos de degradação de hIL-3 no meio de partida obtido a partir de B. licheniformis. a remoção selectiva destes produtos de degradação das fracções de interesse foi levada a efeito pelos seguintes procedimentos de purificação:

1. Concentraram-se fracções ricas em hIL-3 derivadas da fase 1 do procedimento de purificação como descrito anteriormente, ajustaram-se a pH 7,8 e levaram-se a uma condutividade de 0,7 mS. Em seguida £ez-se passar a hIL-3 numa coluna de Q Sepharose Fast Flow (50x5 cm) que foi equilibrado num tampão de tris com pH e condutividade idênticos (com um caudal de cerca de 600 ml/h). Nesta fase de purificação, o volume da solução concentrada com hIL-3 que foi passado pela coluna era constituído por apenas 6 a 8% do total do volume da coluna. Todas as formas activas de hIL-3 foram encontradas nas fracções que passaram directamente. A forma maioritária de hIL-3 foi separada das outras proteínas mais pequenas semelhantes a hIL-3 que também eram positivas na análise de mancha de Western usando anticorpos anti—IL—3 humanos. Quando nas fracções do pico de interesse se encontravam ainda produtos de degradação da hlL-3, este procedimento de isolamento foi repetido. Por análise de sequência amino-terminal dos pri22 -

meíros 30 ácidos aminados da forma maioritária de hIL-3 verificou-se que a sequência era idêntica & da proteína madura.

2. Verificou-se que a cromatografia em hidroxiapatite era uma ferramenta poderosa para a separação de vários produtos de degradação de hIL-3 de B.licheniforais T9. Fez-se passar a hIL-3 numa coluna de Biogel hidroxiapatite em NaH₂PO₄ 10 mM, CaCl₂ 0,01 mM e NaH^ a 0,02% em pH 6,8 e eluiu-se da coluna com um gradiente de 10 a 350 mM em Na^PO* na mesma solução. Este método foi eficaz tanto em escala analítica como em escala preparativa.

3. Foi também possível separar os produtos de degradação de hlL- 3 de B> llchenlformis T9 por melo de cromatofocagem no permutado r de politampão pBE94. Pela aplicação de um gradiente de pH na coluna, eluiram-se diferentes produtos de degradação de hIL-3 entre pH 6,5 e pH 8,5.

Nua procedimento semelhante de isolamento baseado em interacção hidrofóbica de hIL-3 obtida a partir de B. lichenlforais em octil-Sepharose em vez de Fractogel TSK-butil, eluiu-se a hlL-3 pela aplicação de um gradiente de 0% (v/v) a 100% (v/v) de etlleno-glicol, que ilustra as características de ligação maia forte para esta matriz.

Todos os preparados de hIL-3 obtidos pelos procedimentos de isolamento descritos anteriormente deram resultados positivos na análise de AML descrita em HO 88/04691.

b. E. coli

Para o isolamento de um produto de fusão lacZ/hIL-3 que era expresso intracelularmente em Eacherichia coli (pGB/IL-302) e armazenado em corpos de inclusão, as células foram Usadas num tampão de tris de pH 8,0 que continha 1% (v/v) de octanol, 1% (p/v) de TxlOO, 0,1% (p/v) de EDTA e 0,025% (p/v) de lisozima. Utilizou-se PMSF 1 mM como inibidor de proteinase.

o.

Depois de uma incubação adicional com ADNase e Mg , centtifugaram-se os corpos de inclusão brutos (10 min, 4000 g) e lavaram-se no mesmo tampão de tris conforme mencionado ante* riormente. Após uma nova operação de centrifugação (30 min.

OOOg), solubilizou-se a proteína derivada dos corpos de inclusão em ureia 8 M em tampão de tris sob condições redutoras (ditiotreitol 5 mM, DTT). Por fim, por centrifugação (30 min,

OOOg) obteve-se um sobrenadante com a maior parte da hIL-3 que estava originalmente presente nos corpos de inclusão. Esta solução de hIL-3 foi ajustada a pH 5,0 e feita passar numa coluna de Fractogel TSK-CM 650M, equilibrada num tampão que continha ureia 8 M e DTT 5 mM 5,0. Eluiu-se a IL-3 desta coluna por meio de um gradiente linear de sal desde 0 a 300 mM de NaCl no mesmo tampão. A IL-3 de Escherichia coli. renaturada e solubilizada em ureia e parcialmente purificada por cromatografia de permuta iónica era positiva na análise de AML.

Verificou-se que o processo anterior de purificação era muito eficaz para o isolamento da interleuquina-3 proveniente de outros primatas. Consegui-se a expressão e a secreção de IL-3 de macaco Rhesus por Bacillus licheniformis. Aplicou-se um filtrado isento de células de Bacillus licheniformis numa coluna de TSK butilo conforme descrito anteriormente. A IL-3 de Rhesus foi eluída desta coluna por meio de um gradiente de (NH₄)₂SO₄ (1 a 0 M). As fracçSes que continham a IL-3 foram concentradas e submetidas a cromatografia em DEAE Sepharose Fast Flow conforme descrito para a IL-3 humana em Q—Sepharose Fast Flow. A fracção não ligada da IL-3 foi reunida e experimentada para determinação da respectiva pureza por electoforese em gel de poliacrilamida e análise de mancha de Western.

Exemplo 5

Purificação da IL-3 humana obtida por expressão em leveduras

Após centrifugação de uma cultura de transformantes de Kiuyveromyces lactis que continham pGB/IL-316 (WO 88/04691), filtrou-se o sobrenadante que continha a hIL-3 para remoção das células residuais, levou-se a uma concentração de 1 M em (NH₄)^5O e ajustou-se a pH 7,0. (Usou-se PMSF 1 M como inibidor de proteinase). Fez-se passar esta solução numa coluna de octil-Sepha rose equilibrada em (NH₄>₂SO₄ 1 M em tampão de fosfato de pH 7,0 Se bem que a maior parte da proteina tenha sido encontrada nas

fracções recolhidas directamente, a hIL-3 foi adsorvida pela coluna. Após um procedimento de lavagem com o mesmo tampão, a hIL-3 foi parcialmente libertada da coluna com um gradiente de 1 H a 0 M de (NH^J^SO^ em tampão de fosfato de pH 7,0.

A maior parte da hIL-3 que estava ainda adsorvida pela coluna foi eluída por meio da aplicação de um gradiente de 0% (v/v) a 100% (v/v) de etileno-glicol. Verificou-se que a técnica da interacçSo hidrofóbica da IL-3 em octil-Sepharose (ou Frac> togel TSK-butilo 650C) é um procedimento de alta eficácia para o primeiro isolamento. Esta técnica seguida por cromatografia de permuta iónica e filtraçSo em gel dá como resultado um preparado homogéneo de hIL-3 de Kluyveromyces lactis.

Num procedimento semelhante usando um meio de transfor mantes de Saccharomycea cerevislae que continham pGB/IL-316, a hIL-3 foi também eluída a partir de octil-Sepharose coa um gradiente de 0% (v/v) a 100% (v/v) de etileno-glicol.

Num procedimento alternativo, iniciou-se o isolamento da hIL-3 a partir do meio isento de células de uma cultura de Kluyveromyces lactis com precipitação por (NH^Í^SO^ (a 75% da saturaçSo). Este método deu como resultado a precipitação da maior parte da hIL-3 incluindo uma fracção minoritária da quantidade total que estava originalmente presente. O precipitado separado foi ressuspenso em tamj>ão de fosfato e dialisado contra o mesmo tampão, λ solução que continha a hIL-3 foi ajustada a pH 5,0 com NaOH e foi feita passar numa coluna de permuta catiónica de Fractogel TSK-CM 650M equilibrada com o mesmo tampão.

Se bem que toda a hIL-3 estivesse adsorvida na coluna, a maior parte da proteína restante contaminante foi encontrada nas fracções de saída directa. A IL-3 humana foi eluída da coluna pela aplicação de um gradiente de 0 mM a 300 mH de NaCl no mesmo tampão.

A hlL-3 fraccionada obtida por meio deste procedimento em duas fases era quase homogénea. Como resultado da natureza da glicosilação inerente quando se usa Kluyveromyces lactis para sistema de expressão, verificou-se que a hIL-3 purificada até homogeneidade era composta por diferentes formas da proteína

em relação aos seus pesos moleculares. Todos os preparados de hIL-3 obtidos a partir dos sistemas de expressão de leveduras acima mencionados eram positivos na análise de AML.

Exemplo 6

Purificação de IL-3 humana obtida a partir de expressão em células de Mamífero

Purificou-se a hlL-3 obtida a partir de uma cultura de células de mamífero a partir do meio de cultura usando métodos semelhantes aos descritos para a hIL-3 obtida por expressão em

B. licheniformis (Exemplo 4). Levou-se a concentração do meio de células C127 transformadas que continham pGB/IL-328 a 1 M em (NH^J^SO^, ajustou-se a pH 7,0 com MaOH e fez-se passar numa coluna de Fractogel TSK-butilo 650C (Osou-se PMSF 1 mM como inibidor de proteínase). As fracções ricas em hIL-3 (com cerca de 10% da proteína total que foi carregada na coluna) foram eluídas com um gradiente desde 1 M a 0 M em (NH^JjSO^ em tris.BCl 10 mM de pH 7,0. Estas fracções foram concentradas por precipitação coa sulfato de amónio a 60% de saturação. O precipitado proteico foi dissolvido e dialisado contra HjO, depois do que se adicionou tris.HCl 20 mH de pH 7,8 até uma condutividade de 1,4 mS ou menos. O preparado de hlL-3 foi subsequentemente feito passar numa coluna de Fractogel TSK-DEAE 650M. A hIL-3 foi encontrada parcialmente nas fracções recolhidas directamente e foi também eluída com um gradiente desde 0 até 200 mM em NaCl. A maior parte da proteína contaminante estava ligada na coluna e foi eluída depois das fracções de hIL-3.

Este procedimento em duas fases combinado com uma precipitação por (NH₄)₂SO₄ deu como resultado novamente um preparado de hIL-3 concentrado de exactamente 1% da quantidade total de proteína que estava originariamente presente no material de partida. Este preparado era positivo na análise de AML (HO 88/04691).

Exemplo 7

Purificação em grande escala de hIL-3 de

Bacillus licheniformis T9 (pGB/IL-322)

A hIL-3 foi purificada a partir de B. licheniformis T9 (pGB/IL-322) usando o seguinte esquema de purificação em larga escala com quatro fases.

Fase um; Cromatografia de interacção hidrofóbica

O sobrenadante isento de células derivado de 6 fermentações de Bacillus licheniformis T9 (WO 88/04691) com um volume total de 48 litros foi levado a uma concentração 1 M em (NH^^SO^ a pH 7,0. Adsorveu-se a IL-3 humana numa coluna de Fractogel TSK-butilo 650M (dxh = 25x8 cm) equilibrada com (NH^^SO^ era tris a pH 7,0 (q = 8 1/h). Lavou-se a coluna várias vezes com o mesmo tampão. A hIL-3 foi eluída com um gradiente linear de sal desde 1,0 até 0,1 M de (NH₄)₂SO₄ em tris 10 mM a pH 7,0 (Figura 2). As fracções ricas em hIL-3 foram ainda concentradas por precipitação com a 60% de saturação e o precipitado foi desionizado por diálise (Spektra/Por, limiar de separação 3 500 D) contra água Milli-Q até uma condutividade de 0,70 ras ou menor.

Fase dois: Cromatografia de permuta aniónica (primeira vez)

As fracções ricas em hlL-3 foram ajustadas a pH « 7,8 usando tris sólido e até uma condutividade menor do que 0,70 mS. Em seguida fizeram-se passar numa coluna de Q-Sepharose Fast Flow (dxh =* 10x11 cm, q « 3 1/h) equilibrada num tampão de tris de pH 7,8 e ajustou-se a uma condutividade menor do que 0,70 mS.

A hIL-3 foi recolhida nas fracções que passaram directamente e a maior parte da proteína contaminante ficou ligada na coluna (Figura 3). Concentrou-se a hIL-3 até 25 a 30 mg/ml por ultrafiltração (filtro Amicon ym6).

Fase três: Cromatografia de permuta aniónica (segunda vez)

Fizeram-se passar 60 ml da solução obtida na fase anterior (que continha 1,5 a 1,8 g de hIL-3) numa coluna de Q-Sepharose Fast Flow (dxh « 5x90 cm, q = 0,3 1/h). Detectaram-se vários picos nas fracções que passaram directamente (Figura 4). Separou-se deste modo a fracção da proteína hIL-3 de interes se dos produtos de degradação de hIL-3. A hIL-3 foi concentrada como descrito anteriormente.

Fase quatro: Cromatografia de filtração em gel

Fez-se passar uma quantidade de cerca de 0,9 g de hlL-3 (obtida nas fases anteriores) numa coluna de Sephacryl S100 HR (dxh » 5x90 cm, q = 0,15 1/h) equilibrada com NaH^PO^lO mM e NaCl 140 mM a pH 7,0. Recolheu-se a hIL-3 num único pico que se separou de uma pequena quantidade de agregados de hIL-3 que foram eluldos imediatamente antes da hIL-3 (Figura 5).

A hIL-3 obtida por este procedimento de purificação estava isenta de quantidades detectáveis de proteínas contaminan tes e de ácidos nucleicos. A solução que continha a hIL-3 foi desionizada e em seguida concentrada por ultrafiltração até à concentração apropriada.

Exemplo 8

Caracterização da interleuquina-3 recombinante

a. Espectrometria de Massa de desabsorção de Plasma da IL-3

A hIL-3 recombinante derivada de pGB/IL-341 e purificada conforme descrito no Exemplo 4 foi caracterizada por mapeamento de peptídeos e espectrometria de massa.

Subsequentemente degradou-se por via proteolítica a hIL-3 por várias proteases específicas e em seguida separaram-se os peptídeos obtidos por HPLC numa coluna C18. Analisaram-se os peptídeos de hIL-3 por Espectrometria de Massa de desabsorção de Plasma. Os pesos moleculares dos peptídeos de hIL-3 obtidos puderam ser todos explicados na base da sequência e das especificidades das enzimas conhecidas. Deste modo verificou-se que a informação da sequência primária da proteína purificada era idêntica à da proteína nativa (129 resíduos para pGB/IL-341).

£ possível concluir-se que, com base em análise dos peptídeos C-terminais, o processo de purificação descrito dá origem a ura produto constituído por IL-3 recombinante com uma pureza superior a 98£.

b« Efeito in vivo da hIL-3 em chimpanzés

A hIL-3 recombinante produzida pelas células de

B.licheniformis foi purificada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4. Em seguida diluiu-se a solução de IL-3 em água isenta de pirogénios até à concentração final pretendida. Injectaram-se chimpanzés por via subcutânea com esta solução. A administração de 30 ug de IL-3 por kg por dia durante um período de sete dias deu como resultado um aumento de trombócitos e uma tendência para a leucocitose (figura 6). Este resultado surpreendente da actividade da IL-3 como agente único não era esperado e pode indicar uma aplicação clínica da IL-3 em trombocitopenia.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- I^a Processo para a preparação de uma proteína substancialmente pura que possui actividade de IL-3 de primata a partir de um produto proteico bruto obtido a partir de uma célula recombinante que expressa uma sequência de ADN que corresponde a uma IL-3 de primata, caracterizado por compreender:

(a) efectuar uma cromatografia de interacção hidrofóbica do referido produto proteico bruto e separar as fracções que contêm proteína que possui actividade de IL-3; e, (b) efectuar uma cromatografia de permuta iónica das fracções da fase (a) e separar as fracções que contêm proteína que possui actividade de IL-3; e (c) efectuar uma cromatografia de filtração em gel das fracções que contêm proteína da fase (b) e separar a proteína purificada.

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a IL-3 de primata ser IL-3 humana.

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a referida célula recombinante ser uma célula de Bacillus que contém uma sequência de ADN que corresponde a IL-3.

- 4^a Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida célula de Bacillus ser seleccionada do grupo constituído por B. licheniformis T9 contendo pGB/lL-322, B. licheniformis T9 contendo pGB/IL-326 ou B. licheniformis T9 contendo pGB/IL-341.

- 5^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a referida célula recombinante ser uma célula de levedura que contém uma sequência de ADN que corresponde a IL-3.

- 6^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida célula de levedura ser seleccionada do grupo constituído por K, lactis contendo pGB/IL-316 e S. cerevisiae contendo pGB/IL-316.

- 7^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a referida célula recombinante ser uma célula de mamífero que contém uma sequência de ADN que corresponde a IL-3 num vector que contém parte do genoma de BPV.

8^a

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida célula de mamífero ser seleccionada do grupo constituído por células C127 contendo pGB/lL-328, células CHO contendo pGB/lL-328, células FR3T3 contendo pGB/lL-328, células C127 contendo pGB/lL-330 e células CHO contendo pGB/IL-330.

- 9^a Processo para a preparação de uma proteína substancialmente pura que possui actividade de IL-3 de primata de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase de cromatografia de permuta iónica ser precedida pelas seguintes fases:

(a) precipitação da referida proteína usando (NH₄)₂SO₄; e (b) ressuspensão do precipitado que contém a referida proteína.

- 10^a Proteína substancialmente pura que possui actividade de IL-3 de primata, caracterizada por possuir uma pureza superior a 98 % por determinação por mapeamento do peptídeo C-terminal em combinação com espectrometria de massa.

A requerente reivindica as prioridades dos pedidos de patente europeia apresentados em 15 de Março de 1989 e em 25 de Julho de 1989, sob os n°s. 89200660.2 e 89201967.0, respectivamente.

Lisboa, 15 de Março de 1990

ΛΟΤλ'Τί· OrKTÍAL i’!A ΆΟΠΑί.ΑΛΑΕ IXíX-tARLAL

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE INTERLEUQUINA-3 HUMANA RECOMBINANTE, DAS SUAS MUTElNAS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM

A invenção refere-se a um processo para a purificação de uma proteína recombinante dotada de actividade de IL-3 de primata que compreende as fases de cromatografia de interacção hidrofóbica e de cromatografia de permuta iónica.

10 20 30 4ο 50 60

ATATCGGCGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGG

70 80 90 100 110 120

AATATTTATACAATATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAA MetLysGlnGln

130 140 150 160 170 180

AAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCAT LysArgLeuTyrAlaArgLeuLeuThrLeuLeuPheAlaLeuIlePheLeuLeuProHis

190 200 210 220 230 240

TCTGCAGCAGCGGCGGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTTAAC SerAlaAlaAlaAl^llaProMetThrGlnThrThrProLeuLysThrSerTrpValAsn

250 260 270 280 290 300 TGCTCTAACATGATCGATGAAATTATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTTTGCTG CysSerAsnMetlleAspGluIlelleThrHisLeuLysGlnProProLeuProLeuLeu

310 320 330 340 350 360

GACTTCAACAACCTCAATGGGGAAGACCAAGACAITCTGATGGAAAATAACCTrCGAAGG AspPheAsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsnLeuArgArg

370 380 390 400 410 420

CCAAACCTGGAGGCATTCAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAACGCATCAGCAATTGAG ProAsnLeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSerAlalleGlu

430 440 450 460 470 480

AGCATTCTTAAAAATCTCCTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACAT SerlleLeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHis

490 500 510 520 530 540

CCAATCCATATCAAGGACGCTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTG ProIleHisIleLysAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThrPheTyrLeu

550 560 570 580 590 600

AAAACCCTTGAGAATGCGCAGGCTCAACAGACGACTTTGAGCCTCGCGATCTTTTGAGTC LysThrLeuGluAsnAIaGlnAlaGlnGlnThrThrLeuSerLeuAlallePheEnd

610 620 63O 640

CAACGTCCAGCTCGTTCTCTGGGCCITCTCACCACAGAGCCTCGGG

FIGURA 1

Absorvência a 280nm

Concentração de (11114)2^04 (M) cromatografia de interacção hiprofóbica

Fractogel TSK-butilo650C (d=25cra, h=8cm)

FIGURA 2

CROMATOGRAFIA DE PERMUTA ANIÓNICA

Q-Sepharose Fast Flow (d=10cm, h=llcm)

FIGURA 3

CROMATOGRAFIA de PERMUTA ANIÓNICA

Q-Sepharose Fast Flow (d=5cm, h=90c m)

FIGURA 4

CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇAO EM GEL

Sephacryl S100HR (d=5cm, h=90cm)

FIGURA 5