JP2020533967A - 改良されたトランスポザーゼポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
Description
(a)標的細胞のゲノムに挿入される目的の配列に隣接する、逆方向末端反復配列(ITR)または直接末端反復配列(DTR)を含むトランスポゾンユニット、および
(b)トランスポザーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または上記の発現構築物、
を含むトランスポゾンシステムに関する。
を含む、標的細胞への遺伝子送達方法も提供される。
(a)標的細胞のゲノムに挿入される目的の配列に隣接する逆方向末端反復(ITR)またはDTRを含むトランスポゾンユニット、および
(b)本明細書に記載の本発明のトランスポザーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および/または発現構築物、
を含むキットに関する。
a)多様な細胞タイプで同等の遺伝子組換え率。
b)トランスポザーゼ遺伝子またはプロモーターの組み込みのリスクはなく、標的細胞での制御されていない長期の転位および望ましくない転写活性化(例えば、癌遺伝子)を回避。
c)標的細胞での転写および翻訳が不要。これにより、タンパク質の過剰発現が困難である、および/または細胞生存率を損なう細胞へのSB媒介操作の適用性が拡大。
d)hsSBタンパク質は送達後48時間以内に分解される、高速細胞操作および迅速なタンパク質代謝回転。したがって、hsSBタンパク質はヒットアンドラン方式で作用し、非特異的な活性を最小限に抑える(以下参照)。
e)転位の一時的なウィンドウが限られていることによる、細胞毒性の低下、挿入変異誘発および導入遺伝子の再移動のリスクの減少。
f)同じ遺伝子組換え率で細胞あたりの挿入数を低減し、ゲノム摂動(genome perturbation)を最小限に抑える。
g)用量依存的効率。トランスフェクトされたhsSBタンパク質の濃度を変えることにより、陽性クローンの数を厳密に制御可能。
h)挿入イベントの離散的で調整可能な数。 hsSB媒介操作により、ゲノムごとに個別の挿入数を持つクローンが生成され、これはタンパク質の投与量を変えることで調整可能。対照的に、発現プラスミドからの制御されていないレベルおよび転位の時間は、異種のマルチコピークローンをもたらす。
i)細胞の翻訳効率と制御からの独立。
j)SBトランスポザーゼは翻訳を必要とせずにトランスフェクション後すぐに機能するため、転位の効率をさらに厳密かつ直接制御する。
k)適用前にin vitroでタンパク質の品質と活性を評価可能(刊行物に記載され、本明細書の図1hに示されるアッセイ)。これは、商業または臨床環境での品質管理手順に特に関連する。
Lysate 細胞溶解液
Soluble fraction 可溶性画分
Flowthrough フロースルー
Wash 1(100mM imidazole) 洗浄1(100mM イミダゾール)
Elution (150mM imidazole) 溶出(150mM イミダゾール)
hsSB (after SEC) hsSB (SEC後)
SB (after SEC) SB (SEC後)
UV absorbance at 280 nm 280nmでのUV吸収
Elution volume 溶出量
Before conc. 前の濃度
After conc. 後の濃度
18 fold, 1:20 dilution 18倍、1:20希釈
18 fold conc. in R buffer, soluble fraction 18倍濃度、Rバッファー中、可溶性画分
18 fold conc. in R buffer, pellet 18倍濃度、Rバッファー中、ペレット
50 fold, 1:20 dilution 50倍、1:20希釈
50 fold conc. in R buffer, soluble fraction 50倍濃度、Rバッファー中、可溶性画分
50 fold conc. in R buffer, pellet 50倍濃度、Rバッファー中、ペレット
Incubation time at 37℃ 37℃でのインキュベーション時間
Wavelength 波長
Temperature 温度
number of identifications 確認数
amino acid sequence and position アミノ酸配列および位置
av. score. p. aa アミノ酸あたりの平均スコア
Transgene delivery 導入遺伝子送達
transfection トランスフェクション
protein delivery タンパク質送達
electroporation エレクトロポレーション
Neon (R); system Neon(登録商標)システム
Drug selection (2 weeks) 薬剤選択(2週間)
Neomycin resistance colonies quantificationネオマイシン耐性コロニーの定量化
hsSB protein hsSBタンパク質
Neo-resistant colonies ネオマイシン耐性コロニー
dilution 1:10 希釈1:10
Number of neo-resistant colonies ネオマイシン耐性コロニー数
Single Insertions sequence 単一挿入配列
Chromosome 染色体
Double insertions sequence 二重挿入配列
red=left IR 赤=左IR
blue=right IR 青=右IR
hsSB delivered as protein タンパク質として送達されたhsSB
hsSB expressed from plasmid DNA プラスミドDNAから発現されたhsSB
time (h) 時間(h)
anti-hsSB 抗hsSB
anti-GAPDH 抗GAPDH
hsSB persistence in HeLa cells HeLa細胞中のhsSB残存性
intensity 強さ
Protein タンパク質
Plasmid プラスミド
Colony number コロニー数
Venus+ cells sorting Venus陽性細胞選別
3 weeks post-trasfection トランスフェクション後3週間
Venus+ cells quantification Venus陽性細胞定量化
Venus+ Venus陽性
Number of colonies コロニー数
Venus+ cells 21 days after electroporation エレクトロポレーション後21日のVenus陽性細胞
Claims (15)
- トランポザーゼポリペプチドが、スリーピングビューティー(Sleeping Beauty、SB)トランスポゾンであり、配列番号2に示される配列を含む参照非変異SBトランポザーゼの150〜250番目のアミノ酸配列と比較して少なくとも1つの変異アミノ酸を含む、トランポザーゼポリペプチド。
- 該少なくとも1つの変異アミノ酸が少なくとも2つの変異アミノ酸である、請求項1に記載のトランポザーゼポリペプチド。
- 該少なくとも1つの変異アミノ酸が、SB100Xを含むSBトランスポザーゼのアミノ酸170〜180および/または207〜217のいずれか1つで変異しているアミノ酸である、請求項1または2に記載のトランポザーゼポリペプチド。
- 該少なくとも1つの変異アミノ酸が、SB100Xを含むSBトランスポザーゼのアミノ酸176および/または212から選択される位置での変異アミノ酸である、請求項3に記載のトランポザーゼポリペプチド。
- 該少なくとも1つの変異アミノ酸が、セリン残基に変異しているものであり、またはC176SおよびI212Sである、請求項1〜4のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド。
- 配列番号1または3に示される全長アミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドがRNAまたはDNAである、ポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載の発現可能なポリヌクレオチドおよびプロモーター配列を含む発現構築物であって、該プロモーター配列が発現可能なポリヌクレオチドに作動可能に連結され、該ポリヌクレオチドの発現を可能にするものである、発現構築物。
- 請求項1〜6のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド、請求項7に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項8に記載の発現構築物を含む、組換え細胞。
- (a)標的細胞のゲノムに挿入される目的の配列に隣接する、逆方向末端反復配列(ITR)または直接末端反復配列(DTR)を含むトランスポゾンユニット、および
(b)請求項1〜6のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド、請求項7に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項8に記載の発現構築物、
を含むトランスポゾンシステム。 - 標的細胞に遺伝子送達するための請求項10に記載のトランスポゾンシステムのインビトロ使用。
- (a)標的細胞と請求項10に記載のトランスポゾンシステムを接触させる工程、
(b)前記標的細胞の培養を許容する条件下で前記標的細胞を培養する工程、
を含む、標的細胞への遺伝子送達インビトロ方法。 - 請求項1〜6のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド、請求項7に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項8に記載の発現構築物を薬学的に許容される担体および/または賦形剤と共に含む医薬組成物。
- (a)標的細胞のゲノムに挿入される目的の配列に隣接する逆方向末端反復(ITR)またはDTRを含むトランスポゾンユニット、および
(b)請求項1〜6のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド、請求項7に記載のポリヌクレオチド、および/または請求項8に記載の発現構築物、
を含むキット。 - 疾患の治療における使用のための化合物であって、該化合物が、請求項1〜6のいずれか1に記載のトランポザーゼポリペプチド、請求項7に記載のポリヌクレオチド、請求項8に記載の発現構築物、請求項9に記載の組換え細胞、請求項10に記載のトランスポゾンシステム、請求項13に記載の医薬組成物、および/または請求項14に記載のキットからなる群から選択される、化合物。
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