JP2008522629A

JP2008522629A - リコンビナーゼ／トランスポザーゼを用いた改良されたｄｎａ免疫

Info

Publication number: JP2008522629A
Application number: JP2007545721A
Authority: JP
Inventors: ロナルドビューロー，; ヨーゼフプラッツァー，
Original assignee: セラピューティックヒューマンポリクローナルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-12
Publication date: 2008-07-03
Also published as: US20060153800A1; WO2006065821A8; CA2589698A1; CN101123981A; WO2006065821A3; WO2006065821A2; EP1824512A2

Abstract

本発明は、一つ以上のタンパク質／ペプチド抗原および／またはアジュバントをコードする発現カセットを含むベクター、また、リコンビナーゼ媒介性の組込みを用いて、免疫／ワクチン接種、またはヒトを含む動物の免疫系を刺激するための改良された方法に関する。上記アジュバントは、特に、ＧＭＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、インターロイキンなどのサイトカインであり、上記アジュバントも、ＤＮＡによりコードされ得る。ＤＮＡワクチン接種に従って、免疫応答を追加免疫することが公知のアジュバント。さらに、上記ベクターは、リコンビナーゼ／トランスポザーゼにより認識される一つ以上の部位を含む。上記リコンビナーゼ／トランスポザーゼは、トランスフェクションされた細胞のゲノムへの上記ベクターの組込みを触媒する。

Description

（発明の分野）
本発明は、ＤＮＡワクチンおよびアジュバントの分野に関する。具体的には、本発明は、ベクターを用いた、免疫／ワクチン接種またはヒトを含む動物の免疫系の刺激のための方法に関する。上記ベクターは、一つ以上のタンパク質抗原／ペプチド抗原および／またはアジュバントをコードする発現カセット、ならびに上記動物のゲノムへのＤＮＡの組込みを媒介するリコンビナーゼを含む。本発明は、また、新規のポリペプチドであるウサギＧＭＣＳＦを含む、ウサギ内での抗体産生を追加免疫するためのアジュバント組成物に関する。

動物の免疫のためのワクチンの使用は、タンパク質抗原の再現可能な生成を必要とする。このことは、困難、且つ、高価であり得る。生物体、毒素または抗原の全体、あるいは、通常その全体の一部分が、免疫のために用いられ得る。ワクチンは、その宿主内で一定レベルの免疫を維持するために、投与される抗原について、高用量、または、ほとんどの場合、繰り返し行われる用量を必要とする。さらに、ワクチン開発は、動物内で適切な応答を誘発し得る有用な抗原の利用可能性により、厳しく制限されている。動物内での免疫応答の増加のためのアジュバントの使用は、当該分野において周知である。広範に種々のアジュバントが、用いられてきた。例えば、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント、Ｔｉｔｅｒｍａｘなどのような鉱油または油含有アジュバント、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、リピドＡ、リポ多糖類（ＬＰＳ）などのような細菌由来のアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびリン酸化カルシウムなどのような無機化合物、リポソーム、膜タンパク質抗原（免疫刺激複合体）に複合されたサポニンなどである。多くのアジュバントが、毒性であるかまたは軽度から重度の副作用を引き起こす一方、いくつかのアジュバントのみが、宿主内で弱い免疫応答を誘発し得る。従って、安全であり、且つ、有効なアジュバントの開発は、継続的な課題である。アジュバント開発における一つのより新しいアプローチは、サイトカインのような生物学的免疫刺激アジュバントの、アジュバントとしての使用である。

遺伝的免疫またはＤＮＡ免疫は、当該分野において公知であり、そして、免疫原の供給源として、そのポリペプチド自体よりもむしろ、目的の抗原性タンパク質をコードする遺伝子またはＤＮＡを用いる。これは、製造するために容易であり、且つ、費用のかからない原材料に基づいていて、そして再現可能に生成され得る。宿主細胞は、上記ＤＮＡを取込み、そして、通常の細胞機構によりコードされた抗原を発現する。その後、上記抗原は、上記細胞表面に、宿主のＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子と共に提示され、ここで、免疫応答性細胞の接触が、免疫応答を引き起こす。従って、初回のワクチン中の抗原の量を増加させることなく、または、上記ワクチンを繰り返し投与することなく、免疫は、長期間持続する。ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）タンパク質をコードする裸のＤＮＡを用いたマウスの免疫は、非特許文献１により報告された。非特許文献２は、ＤＮＡ免疫が、急速なＣＴＬ応答を引き起こし、そして、伝統的なタンパク質免疫よりも高いアビディティの抗体を産生することを報告した。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ用のＤＮＡワクチンは、非ヒト霊長類動物を含む様々な動物モデル内で産生および試験され、そして、ヒト臨床試験において試験されている。例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５を参照のこと。感染性疾患に加えて、ＤＮＡ免疫は、癌免疫治療の手段として可能性を有すると考えられている（例えば、非特許文献６を参照のこと）。ＤＮＡ免疫はまた、アレルギーの処置のためにも推奨されている（例えば、非特許文献７を参照のこと）。

いくつかの要因が、ＤＮＡワクチン接種の結果に影響する。これらの要因としては、免疫方法および免疫の場所、免疫原の形態、免疫レジメン、アジュバントの存在または不在、あるいはサイトカインのような生物学的アジュバントの共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、他の共刺激分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ）の共投与、上記ＤＮＡ内の免疫刺激配列（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＳＳ）の存在または不在などが挙げられる。例えば、脊椎動物ではなく、細菌に由来するＤＮＡは、非特異的な免疫応答を引き起こすことが観察された。このことは、二つのゲノムで見出される、メチル化されていないシトシン−ホスフェート−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）の頻度の違いに起因すると考えられている。さらに、ＣｐＧおよびＩＳＳ配列を含むプラスミドＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種は、ＩＳＳ配列を含まない点以外では同一のワクチンよりも、強い抗体応答およびＣＴＬ応答を引き起こすことが見出された。ＤＮＡワクチン接種に対する免疫応答にも影響する他の要因は、上記のコードされた抗原の形態、特に、上記抗原が細胞質タンパク質または分泌タンパク質として発現されるか否か、ならびに、上記コードされた抗原および／またはアジュバントの発現レベルである。一般に、発現が高く、長く持続するほど、免疫応答は強くなる。

静脈内経路、筋肉内経路、脾臓内経路および肝臓内経路を含む多数の異なる経路を介して、成功したＤＮＡワクチン接種が実証されている。抗体応答の生成について、複数の研究が、遺伝子銃による免疫が針による注入よりもはるかに効率的であり、１００倍〜５０００倍少ないＤＮＡで同様のレベルの抗体応答を誘発することを報告している。ＤＮＡワクチンを投与するための最適のレジメン（例えば、用量、回数および／または免疫の頻度）は、何ら決定されておらず、個々の抗原各々について最適化を必要する。ほとんどの研究は、複数の注入が、免疫応答を最大化するために必要であることを示している。

ＤＮＡ免疫を介して免疫応答を調節する異なる方法のうち、最も見込みのある方法は、サイトカインのような生物学的アジュバントの共投与によるものであり得る。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、最も研究されている遺伝的アジュバントのうちの一つであり、そして、ＤＮＡワクチン接種に従った有効な免疫刺激因子であることが示された。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）遺伝子またはＩＬ−４遺伝子のような他のアジュバントと組み合わされた場合、付加的な追加免疫効果（ｂｏｏｓｔｅｒｅｆｆｅｃｔ）が観察された。最近、ＧＭ−ＣＳＦとＦｌｔ３Ｌとの組み合わせが、試験された１３０個より多い抗原のほとんど（８４％）について、マウス内での高い抗体力価を生じることが示された；非特許文献８。
Ｍａｎｉｃｋａｎら著、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ、１９９７年、第１００巻、ｐ．２３７１−２３７５Ｂｏｙｌｅら著、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９７年、第９４巻、ｐ．１４６２６−１４６３１Ｒｏｂｉｎｓｏｎら著、ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ、１９９５年、第１１１巻、ｐ．２０９−２１１Ｙａｓｕｔｏｍｉら著、ＪＶｉｒｏｌ、１９９６年、第７０巻、ｐ．６７８−６８１ＭａｃＧｒｅｇｏｒら著、ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、１９９８年、第１７８巻、ｐ．９２−１００ＳｒｉｎｉｖａｓａｎおよびＷｏｌｃｈｏｋ著、ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ、２００４年、第２巻、ｐ．１２Ｈａｒｔｌら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４年、第３２巻、ｐ．３２８−３９Ｃｈａｍｂｅｒｓら著、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年、第２１巻、第９号、ｐ．１０８８−９２

たとえそうだとしても、ＤＮＡ免疫は、上記のコードされた抗原タンパク質および／またはアジュバントの、より高い、且つ、より長期間持続する発現を生じるより有効な方法を必要とする。

（本発明の要旨）
本発明は、ワクチン接種された動物内のトランスフェクションされた細胞のゲノムへの、発現カセットのリコンビナーゼ／トランスポザーゼ媒介性の組込みを用いて、ＤＮＡ免疫またはワクチン接種するための方法または動物の免疫系を刺激するための方法に関する。上記発現カセットは、一つまたは数個の抗原および／またはアジュバントをコードする。本発明はまた、ＤＮＡ免疫された動物の抗体産生を追加免疫するためのアジュバント組成物も提供する。

一局面では、本発明は、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦポリペプチドという新規のアジュバント配列を提供する。さらに、本発明は、異種アミノ酸配列に融合された、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。一実施形態では、上記異種アミノ酸配列は、エピトープ配列である。別の実施形態では、上記異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン配列である。この実施形態のさらなる局面では、上記免疫グロブリン配列は、免疫グロブリンのＦｃ領域である。

本発明は、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も提供する。さらに、本発明は、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現カセットを提供する。

本発明は、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された、単離された宿主細胞も提供する。

別の局面では、本発明は、以下の工程を包含する、動物を免疫する方法または動物にワクチン接種する方法に関する：（ｉ）抗原をコードする少なくとも一つの発現カセットと、第一組換え部位とを含む少なくとも一つのＤＮＡ構築物を投与する工程；（ｉｉ）上記動物に少なくとも一つのアジュバントを投与することにより、上記動物の免疫系を刺激する工程；ならびに（ｉｉｉ）第二組換え部位を含む上記動物のゲノムへの上記発現カセットの組込みを媒介するリコンビナーゼを投与する工程であって、ここで、上記抗原が発現される工程。

本発明の全ての局面では、上記アジュバントは、慣習的に用いられるアジュバントであってもよいし、ポリペプチドとしてかまたは上記アジュバントをコードする核酸として導入されてもよい。上記アジュバントがＤＮＡとして導入される場合、その方法は、（ｉ）アジュバントをコードする発現カセットと第一組換え部位とを含むＤＮＡ構築物としての、上記動物への上記アジュバントの投与；ならびに（ｉｉ）第二組換え部位を含む上記動物のゲノムへの上記発現カセットの組込みを媒介するリコンビナーゼの投与を含み、ここで、上記アジュバントが発現。

全ての局面では、好ましい抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、古細菌性抗原および以下のような疾患と関連した抗原を含むが、これらに限定されない：感染、炎症、癌、ぜん息／アレルギー、自己免疫疾患、多発性硬化症、セプシス／中毒性ショック、慢性関節リウマチ、同種移植拒絶、乾癬など。好ましい実施形態では、上記抗原は、ＣＤ２０である。

全ての局面では、好ましいアジュバントは、ＧＭＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、（ＩＬ−ｌαおよびＩＬ−ｌβ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０のような）インターロイキン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−γなど、ならびに（ＴＣＡ３、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどのような）共刺激分子を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、上記アジュバントは、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦである。

一実施形態では、上記の抗原をコードする発現カセットおよび上記のアジュバントをコードする発現カセットは、一つのＤＮＡ構築物の一部分である。別の実施形態では、上記の抗原をコードする発現カセットおよび上記のアジュバントをコードする発現カセットは、別々のＤＮＡ構築物上に存在する。

本発明の全ての局面では、上記リコンビナーゼは、ポリペプチドとして、または上記リコンビナーゼをコードするＲＮＡ分子として、または上記リコンビナーゼをコードする発現カセットを含むＤＮＡ構築物として投与され得る。

一実施形態では、上記リコンビナーゼは、ファージにより発現される部位特異的リコンビナーゼであり得る。この実施形態のさらなる局面では、上記ファージリコンビナーゼは、ΦＣ３１、ファージＲ４およびＴＰ９０１−１からなる群から選択され得る。

別の実施形態では、上記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｃｒｅ様リコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＲリコンビナーゼからなる群から選択される部位特異的リコンビナーゼであり得る。

さらなる別の実施形態では、上記リコンビナーゼは、トランスポザーゼまたはレトロトランスポザーゼであり得る。さらなる局面では、上記トランスポザーゼは、ＡＣ７、Ｔｎ５、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００、Ｔｎｌ６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、Ｄｏｔｔｅｄトランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ＥｎトランスポゾンおよびＩトランスポゾンからなる群から選択される。

一実施形態では、第一組換え部位および第二組換え部位は、少なくとも９０％の配列同一性を共有する。別の実施形態では、第一組換え部位および第二組換え部位は、９０％未満の配列同一性を共有する。さらなる実施形態では、第一組換え部位は、細菌ゲノム組換え部位を含み、第二組換え部位は、ファージ組換え部位を含む。さらなる別の実施形態では、上記の細菌ゲノム組換え部位は、ａｔｔＢであり、上記ファージ組換え部位は、ａｔｔＰである。さらなる別の実施形態では、第一組換え部位は、ａｔｔＢ部位を含み、第二組換え部位は、偽ａｔｔＰ部位を含む。さらなる別の実施形態では、第一組換え部位は、偽ａｔｔＢ部位を含み、第二組換え部位は、ａｔｔＰ部位を含む。

特定の実施形態では、上記リコンビナーゼを介した組換えは、もはやリコンビナーゼの基質ではない部位をもたらす。

本発明の一実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、環状であり得る。別の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、線状であり得る。

一定の局面では、本発明は、以下の工程を包含する、動物内で抗体を産生する方法を提供する：（ｉ）抗原をコードする少なくとも一つのＤＮＡ発現カセット、組換え部位、および、上記動物のゲノムへの上記ＤＮＡ発現カセットの組込みを媒介するリコンビナーゼを投与する工程；（ｉｉ）必要に応じて、少なくとも一つのアジュバントを投与する工程；（ｉｉｉ）上記動物から数日後に血清試料を採取する工程；（ｉｖ）上記血清試料から上記の投与された抗原に対する抗体を同定し、必要に応じて、この抗体を精製する工程。

上記の通り、上記アジュバントは、慣習的に用いられるアジュバントであってもよいし、あるいは、ポリペプチドとして、または上記アジュバントをコードする核酸として導入されてもよい。

全ての局面では、好ましい動物は、ヒト、ならびに、ウサギ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）、齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマのような非ヒト動物を含む。好ましい実施形態では、上記非ヒト動物は、ウサギである。

非ヒト動物の好ましい群は、外来性免疫グロブリンのトランスローカス（ｔｒａｎｓｌｏｃｕｓ）を有する、非ヒトトランスジェニック動物を含む。一実施形態では、上記非ヒトトランスジェニック動物は、遺伝子変換動物である。好ましい実施形態では、上記外来性免疫グロブリンのトランスローカスは、ヒト免疫グロブリン重鎖および／もしくはヒト免疫グロブリン軽鎖の配列、あるいはヒト化免疫グロブリン重鎖および／もしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖の配列である。

（発明の詳細な説明）
Ａ．（定義）
別に定義されない限り、本明細書中に用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら著,ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第二版,Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ１９９４）；ＬｏｗｒｉｅおよびＷｌｉａｌｅｎ著，ＤＮＡＶａｃｃｉｎｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（１９９９）；ＣｏｎｓｔａｎｔｉｎＡ．ＢｏｎａおよびＡｄｒｉａｎＢｏｔ著，ＧｅｎｅｔｉｃＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ／ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ２０００）；ＫｏｐｒｏｗｓｋｉおよびＷｅｉｎｅｒ著，ＤＮＡＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ／ＧｅｎｅｔｉｃＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９８）；“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”,第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら著，１９８９）；“ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”(ＭＪ．Ｇａｉｔ編集，１９８４）；“ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集，１９８７）；および“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集，１９８７）は、当業者に、本発明の適用に用いられる多くの用語、方法およびプロトコールの一般的な指針を提供する。

当業者は、本発明の実行において用いられ得る、本明細書中に記載されているものと類似または等価な多くの方法および材料を認識し得る。実際は、本発明は絶対に、記載されている方法および材料に限定されない。本発明の目的のため、以下の用語は、下に記載される。

用語「免疫」は、最も広い意味で用いられ、そして、免疫の発達を刺激するための体内への抗原の導入を表す。「ＤＮＡ免疫」または「遺伝的免疫」は、免疫を生じる、および／または高めるために、そのタンパク質／ポリペプチド自体の代わりに一つ以上の抗原および／またはアジュバントをコードするＤＮＡを用いる。

用語「ワクチン接種」は、通常、防御免疫を促進するために、体内に死滅した病原体または弱毒化された病原体を導入することを表す。

「ＤＮＡワクチン接種」（「遺伝的ワクチン接種」としても公知）では、上記死滅した病原体または弱毒化された病原体の代わりに、一つの病原体または異なる病原体の一つ以上の遺伝子が、体内に導入される。結果として、同一の病原体の改変体または数種の異なる病原体を同時にワクチン接種することが可能である。

本明細書中に用いられる用語「ＤＮＡ構築物」は、一つまたは数個の関心のある遺伝子、組換え配列、および上記ＤＮＡ構築物の維持、複製、選択に必要な他のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド分子を表す。ＤＮＡ構築物は、一つ以上の下記の「発現カセット」を含み得る。ＤＮＡ構築物は、プラスミドのような任意のベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスを含むがこれらに限定されない任意のウイルスベクター、コスミドなどであり得る。用語「レトロウイルスベクター」は、ＤＮＡ構築物も表し、かつ、レトロウイルスまたはレトロウイルスの粒子を表す。上記レトロウイルスまたはレトロウイルス粒子は、細胞に侵入する能力および上記レトロウイルスゲノムを上記宿主細胞のゲノムに組み込む能力を有する。上記ＤＮＡ構築物は、線状、または好ましくは、環状のうちのいずれかであり得る。

用語「発現カセット」は、ポリヌクレオチド分子をいう。このポリヌクレオチドは、目的の一つまたは数個の構造遺伝子であって、この目的のコードされた遺伝子の発現を促進する各々の制御配列と作動可能に連結している構造遺伝子、および必要に応じて、適時な発現、適切なタンパク質フォールディングの促進、抗原提示細胞による取込み、Ｂ細胞の活性化、Ｔヘルパー細胞の認識などのような多様な機能に必要なドメインをコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。

本明細書中で用いられる用語「リコンビナーゼ」は、「組換え部位」と呼ばれる規定された部位間での組換え（好ましくは、部位特異的組換え）を促進し得る酵素群を表す。ここで、上記二つの組換え部位は、単一の核酸分子内または別々の核酸分子上において、物理的に離れている。上記二つの規定された組換え部位の配列は、必ずしも同一ではない。上記リコンビナーゼ群の中には、「インテグラーゼ」（例えば、Ｃｒｅインテグラーゼ、Ｃｒｅ様インテグラーゼ、ＦＬＰインテグラーゼ、およびλインテグラーゼ）、「レソルバーゼ／インベルターゼ」（例えば、ΦＣ３１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、およびＴＰ−９０１インテグラーゼ）を含む数個のサブファミリーが、存在する。上記の用語「リコンビナーゼ」はまた、原核生物のトランスポザーゼまたは真核生物のトランスポザーゼ、ウイルス性レトロトランスポゾンまたはショウジョウバエのコピア様レトロトランスポゾンまたは哺乳動物のレトロトランスポゾンを含むウイルス性でないレトロトランスポゾンを含むが、これらに限定されない。典型的な原核生物のトランスポザーゼは、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１０００、Ｔｎｌ６８１、Ｔｎ２９０１などの、転位可能なエレメントにコードされているトランスポザーゼを含む。真核生物のトランスポザーゼは、ショウジョウバエのｍａｒｉｎｅｒ、ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、ショウジョウバエのＰエレメント、トウモロコシのＡｃエレメントおよびＤｓエレメントなどの転位可能なエレメントにコードされているトランスポザーゼを含む。レトロトランスポザーゼは、Ｌ１、Ｔｏｌ２Ｔｃ１、Ｔｃ３、Ｍａｒｉｎｅｒ（Ｈｉｍａｒ１）、Ｍａｒｉｎｅｒ（ｍｏｓ１）、Ｍｉｎｏｓなどのエレメントにコードされているレトロトランスポザーゼを含む。トランスポザーゼは、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、Ｄｏｔｔｅｄ、Ｍｕ、およびＩ転位エレメントからも選択され得る。

本明細書中に用いられる用語「野生型組換え部位」は、インテグラーゼのようなリコンビナーゼにより通常用いられる組換え部位を表す。

「偽組換え部位」によって、上記部位がその野生型組換え部位と同一の配列を有さない可能性があるとしても、リコンビナーゼが組換えを促進し得る部位、が意味される。

本発明についての文脈では、用語「第一組換え部位」または「第二組換え部位」は、例えば、ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、偽ａｔｔＢ部位または偽ａｔｔＰ部位のような、任意の野生型組換え部位または偽組換え部位であり得る。

用語「リコンビナーゼ媒介性の発現カセットの組込み」は、コードされ、かつ、発現されたリコンビナーゼにより媒介される組込みであって、無作為の組込みよりもむしろ、細胞のゲノムへの上記発現カセットの特異的組込みを促進する組込みを表すために用いられる。

「アジュバント」は、特定の関心のある抗原に対する免疫応答を高めることを目的とする任意の化合物または組成物である。アジュバントがその免疫応答を高める機構と無関係に、任意のアジュバントが、本発明では有用である。

「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を表す一方、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子との両者を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで、および骨髄腫により増加されたレベルで産生される。

本明細書中で用いられる用語「非ヒト動物」としては、例えば、非ヒト霊長類動物、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ならびに、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバのような非齧歯類が挙げられるが、これらに限定されない。上記用語「非ヒト動物」は、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）も含む。本明細書中に用いられる用語「霊長類でない動物」は、霊長類以外の哺乳動物を表し、特に上に列挙された哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、交換可能に用いられ、そして、単数形または複数形で用いられる場合、一般的に、改変されていないＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。上記ＤＮＡの起源は、ゲノムＤＮＡ由来、ｃＤＮＡ由来であってもよいし、または遺伝子合成によってもよい。従って、例えば、本明細書中に定義されるポリヌクレオチドは、限定することなく、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖領域であってもよいし、より典型的には、二本鎖領域であり得るかまたは一本鎖領域と二本鎖領域とを含んでもよい）を含む。さらに、本明細書中で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両者を含む三本鎖領域を表す。そのような領域内の鎖は、同一分子に由来してもよいし、または異なる分子に由来してもよい。上記領域は、一つ以上の上記分子を全て含み得るが、より典型的には、いくつかの上記分子のうちの一領域のみを含み得る。三重らせん状領域の分子のうちの一つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、ｃＤＮＡを含む。上記用語は、一つ以上の改変された塩基を含む（ｃＤＮＡを含む）ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」であって、その用語が本明細書中に意図される通りである。さらに、イノシンのような通常ではない塩基、またはトリチウム原子を含む塩基のような改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中に定義される用語「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれる。一般的に、用語「ポリヌクレオチド」は、改変されていないポリヌクレオチドが化学的、酵素的および／または代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞の特徴を有するＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を全て包含する。ここで、上記細胞は、単一細胞および複合細胞を含む。

Ｂ．（詳細な説明）
本発明は、ヒトを含む哺乳動物のような動物におけるＤＮＡ免疫またはワクチン接種のための改良された方法に関する。上記方法は、長期間持続する免疫を生じるために、その抗原自体よりもむしろ、（病原体由来のタンパク質またはその部分、腫瘍抗原などのような）抗原をコードするＤＮＡ発現カセットを用いる。上記の改良された方法は、遺伝的アジュバント、すなわちＤＮＡ発現カセットによりコードされた、より長期間持続する免疫の増強のためのアジュバントを用いて、動物内で免疫を増強または促進するためにも用いられ得る。この方法では、上記抗原または上記アジュバントをコードするＤＮＡが導入され、続いて、リコンビナーゼ、好ましくは、部位特異的リコンビナーゼを媒介して上記動物のゲノムに組み込まれる。上記リコンビナーゼは、上記ゲノムへのこの組込みを促進する。本発明は、さらに、ウサギＧＭＣＳＦアジュバントのための新規の核酸配列およびポリペプチド配列を提供する。従って、例えば、ヒト化抗体を含む抗体は、このアジュバントを用いて、ウサギのような動物内で産生され得る。

より具体的には、上記抗原および／またはアジュバントの発現カセットの部位特異的組込みは、（ｉ）一つまたは数個の抗原および／またはアジュバントならびに部位特異的リコンビナーゼにより認識される第一組換え部位をコードする発現カセットと（ｉｉ）部位特異的リコンビナーゼと、の投与を含む。下記の方法のうちのいずれかを用いた、上記ＤＮＡ構築物の動物内への投与は、細胞のトランスフェクションとなる。トランスフェクションされた細胞のゲノムは、上記ゲノム本来の第二組換え部位を含む。従って、リコンビナーゼにより促進される、第一組換え部位と第二組換え部位との間の部位特異的組換えは、上記動物の細胞ゲノムへの上記ＤＮＡ発現カセットの組込みにおける、安定した高い発生率を生じる。従って、リコンビナーゼ媒介性のＤＮＡ免疫方法は、コードされた抗原タンパク質および／またはアジュバントタンパク質における、高く、かつ長期間持続する発現を生じる。

本発明の一つの局面では、上記方法は、抗原をコードするＤＮＡを含む。抗原ＤＮＡの起源としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは遺伝子合成により得られる配列が挙げられるが、これらに限定されない。抗原は、当該分野において公知の戦略を用いた、遺伝子全域にわたる新規有用配列の検索によるか、またはバイオインフォマティクス探索により同定され得る。

抗原ＤＮＡにより、細菌、ウイルス、原生動物、クラミジア、リーシュマニア、トキソプラズマ、マラリア原虫、酵母を含む真菌など、またはその抗原の一部を含むがこれらに限定されない感染性病原体に由来するＤＮＡ配列が、意味される。

典型的な細菌性抗原であって、本発明におけるそれらのＤＮＡによりコードされる細菌性抗原は、黄色ブドウ球菌、以下のような組換え型病原因子に由来する抗原を含む：アルファ毒素、アドヘジン結合性タンパク質、コラーゲン結合性タンパク質、およびフィブロネクチン結合性タンパク質。典型的な細菌性抗原としてはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、エンテロコッカス属、エンテロバクター属、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ボルデテラ属（ｃｙａＣ遺伝子およびｃｙａＡ遺伝子）などの他のタンパク質も挙げられる。さらなる典型的な細菌性抗原としては、莢膜抗原、組換え型外膜タンパク質、フィブロネクチン結合性タンパク質、抗原、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、エンテロコッカス属、エンテロバクター属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の毒素などをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。

真菌に対する抗体の産生のための典型的な抗原としては、例えば、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｎｄｉｄａｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのような真菌の外膜タンパク質が挙げられる。

典型的な抗原であって、それらをコードする配列がウイルスに対する抗体を産生するために用いられ得る抗原としては、エンベロープタンパク質およびウイルスの弱毒化型が挙げられるが、これらに限定されない。このウイルスとしては、インフルエンザ、ＨＩＶ−１／２（特に、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｎｅｆおよびｇｐ１２０様エンベロープタンパク質、ｅｎｖなど）、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）（特に、そのＦタンパク質）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、ロタウイルス、エボラウイルスならびにＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（単純疱疹ウイルス）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の別の局面では、抗原により、癌のような疾患の治療上の処置に有用である、抗体応答を誘発する抗原もまた意味される。治療抗体の調製に有用な、典型的な癌関連抗原としては、結腸癌における癌胎児抗原（ＣＥＡ）および１７−１Ａ；皮膚のＴ細胞リンパ腫におけるＴ細胞受容体Ｖβ；乳癌におけるＨｅｒ−２−ｎｅｕ抗原；Ｂ細胞リンパ腫におけるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ５３抗原；前立腺癌における前立腺特異膜抗原（ＰＭＳＡ）；（一般的に）ＶＥＧＦ；卵巣癌におけるＣＡ１２５；結腸直腸癌におけるＥｐＣＡＭなどが挙げられるが、これらに限定されない。

抗原によって、抗体応答を誘発する抗原がさらに意味される。ここで、上記抗体は、癌以外の疾患における、治療上の処置に有用である。この疾患としては、ＣＤ２３、ＩｇＥ、ＩＬ−５、ＩＬ−４などのような典型的抗原を有するぜん息／アレルギー；（Ｉ型糖尿病における）グリコシルＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、（ＳＬＥまたは狼瘡における）ＣＤ４０Ｌなどのような典型的抗原を有する自己免疫疾患；ＶＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１１／１８などのような典型的抗原を有する多発性硬化症；ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＣＤ１４などのような典型的抗原を有する炎症および／またはセプシス／中毒性ショック；補体Ｃ５、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＣＤ４などのような典型的抗原を有する慢性関節リウマチ；ＣＤ１４７、ＣＤ１８、ＣＤ４０Ｌ、β２インテグリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５などのような典型的抗原を有する同種移植拒絶；ＩＬ−８、ＣＤ１１ａ、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ８０、ＣＤ２、ＣＤ３のような典型的抗原を有する乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、そのような生じた免疫応答は、上記疾患と闘うための免疫ワクチンの調製において用いられ得る。

抗原によって、抗体応答を誘発する抗原が意味される。その抗体は、例えば、血小板減少症のような疾患を処置するために有用な拮抗抗体または擬似抗体である。ここで、上記擬似抗体である、抗ｃ−ＭＰＬ抗体は、血小板産生の原因であるＴＰＯ（トロンボポエチン）の活性を模倣することが示されている。よって、上記抗ｃ−ＭＰＬ抗体は、治療用抗体として有用である。

本発明のさらなる別の局面では、ＤＮＡ免疫の方法は、アジュバントを用いる。本発明のアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント、Ｔｉｔｅｒｍａｘなどのような鉱油または油含有アジュバント、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、リピッドＡ、リポ多糖類（ＬＰＳ）などのような細菌由来のアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびリン酸化カルシウムなどのような無機化合物、リポソーム、膜タンパク質抗原（免疫刺激複合体）に複合されたサポニン、サイトカイン、共刺激分子、細菌ＤＮＡ、細菌ＣｐＧなどのような、慣習的に用いられるアジュバント。

一実施形態では、本発明のアジュバントは、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−ｌαおよびＩＬ−ｌβ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−γなどのような任意のサイトカインである。別の実施形態では、上記アジュバントは、ＴＣＡ３、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどのような共刺激分子である。

本発明の別の実施形態では、上記サイトカインまたは共刺激分子は、ポリペプチドとして、ｍＲＮＡとして、または上記アジュバントまたは共刺激分子をコードするＤＮＡとして導入され得る。さらに、アジュバントの組み合わせまたは１より多いアジュバントの共送達の組み合わせも、用いられ得る。理想的には、種々の経路によって投与される場合であっても、使用されるアジュバントの組み合わせ間での相乗作用が評価され、そして体液性免疫応答および細胞性免疫応答の双方を誘発するそれらの組み合わされた能力が評価される。

本発明の重要な局面では、上記方法は、抗原の発現カセットおよび／またはアジュバント発現カセット（あるいはリコンビナーゼの発現カセットまでも）の上記動物のゲノムへの組込みを促進するために、リコンビナーゼを利用する。発現カセットのゲノム性組込みは、部位特異的組換えまたは無作為の組換えにより促進され得る。好ましい実施形態では、上記方法は、特異的部位で上記動物のゲノムへ任意の上記発現カセットのゲノム性組込みを促進する、部位特異的リコンビナーゼを必要とする。

部位特異的リコンビナーゼは、二つのＤＮＡ断片の間での相互の二本鎖ＤＮＡ組換えを触媒する、酵素的に活性なタンパク質である。そのようなリコンビナーゼは、組換えの両者のパートナーにおける特異的配列を認識し、そして単独のタンパク質として機能し得、または機能のためにアクセサリー因子の存在を必要とし得る。触媒作用の機構は、異なる型の部位特異的リコンビナーゼによって異なり得るが、上記部位特異的リコンビナーゼは全て、その基礎となる機構に関わらず本明細書中に含まれ、そして、本発明の実行において適切である。

部位特異的リコンビナーゼは、排他的ではないが、典型的に、原核生物に由来する。部位特異的リコンビナーゼにおける二つの最も大きいファミリーは、λインテグラーゼ様酵素およびレソルバーゼ／インベルターゼである。上記の二つのファミリーのメンバーは、それらのアミノ酸配列、およびそれらの触媒作用の機構について顕著に異なる。上記λインテグラーゼファミリーのメンバーによる組換えは、ホリデイジャンクション中間体の形成および分解と関係する。ここで、上記ホリデイジャンクション中間体の形成および分解の間、ＤＮＡは、ホスホチロシン結合を通じて、一時的に上記酵素に結合している。上記レソルバーゼ／インベルターゼファミリーの酵素は、協調した、四本の不安定な解離および再連結機構を介して作用し、そして、この間に、ホスホリセリン結合がその酵素とＤＮＡとの間に形成される。

従って、例えば、広い宿主領域を有するゲノムであるストレプトミセス属のテンプレートファージ、ΦＣ３１は、部位特異的リコンビナーゼのレソルバーゼ／インベルターゼファミリーのメンバーである酵素の助けを借りて、宿主染色体へ組み込むことが公知である。さらなる詳細のため、例えば、ＴｈｏｒｐｅおよびＳｍｉｔｈ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１０）：５５０５−５５１０（１９９８）を参照のこと。上記ファージＣ３１インテグラーゼは、ヒト細胞環境内にて染色体外ベクター上のａｔｔＢというファージ結合部位およびａｔｔＰというファージ結合部位で効率的な組込みを媒介することが示された。ΦＣ３１およびＲ４は、部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリー内に属する一方、ＴＰ９０１−１は、広範なレソルバーゼのファミリーに属する。上記Ｒ４インテグラーゼは、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐａｒｖｕｌｕｓのファージＲ４のゲノムに由来する単方向性の部位特異的リコンビナーゼである。部位特異的インテグラーゼＴＰ９０１−１は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓのファージＴＰ９０１−１によりコードされている。λは、Ｅ．ｃｏｌｉに感染するテンプレートバクテリオファージである。上記ファージは、組換えのための一つの結合部位（ａｔｔＰ）を有し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉの細菌ゲノムは、組換えのための一つの結合部位（ａｔｔＢ）を有する。本発明についての文脈では、野生型組換え部位は、例えば、同種系に由来し、かつ、異種配列に結合される。従って、上記ａｔｔＢ部位は、他のシステム内に置かれてインテグラーゼの基質として作用し得る。一実施形態では、上記リコンビナーゼは、細菌ゲノム組換え部位（ａｔｔＢ）とファージゲノム組換え部位（ａｔｔＰ）の間の組換えを触媒し得、あるいは、上記第一部位は、偽ａｔｔＢ部位を含み得、および／または上記第二部位は、偽ａｔｔＰ部位を含み得、あるいは逆もまた同じである。別の実施形態では、上記リコンビナーゼは、もはや上記リコンビナーゼの基質ではない組換え部位の生成を媒介する（Ｇｒｏｔｈら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７：５９９５−６０００；Ｏｌｉｖａｒｅｓら著，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０（１１）：１１２４−８）；（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら著，Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，２１：３９２６−３９３４）；Ｈｏｌｌｉｓら著，Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００３，１：７９。従って、本発明では、上記リコンビナーゼは、λインテグラーゼであるΦＣ３１、ＴＰ９０１−１、およびＲ４からなる群から選択される、ファージによりコードされる部位特異的リコンビナーゼであり得る。他の公知の、かつ、頻繁に用いられる部位特異的リコンビナーゼとしては、ＣｒｅおよびＦＬＰなどが挙げられる（例えば、Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａら著，Ｂｌｏｏｄ８８（Ｓｕｐｐｌ．１），１９０ａ（１９９６）；Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａら著，Ｂｌｏｏｄ９０：３３３２−３３４４（１９９７）；ＳｅｉｂｌｅｒａｎｄＢｏｄｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６：１７４０−１７４７（１９９７）；Ｓｅｉｂｌｅｒら著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：６２２９−６２３４（１９９８）；ＢｅｔｈｋｅａｎｄＳａｕｅｒ，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：２８２８−２８３４（１９９７）を参照）。Ｃｒｅリコンビナーゼの標的は、二つの逆向きの１３塩基のＣｒｅ結合部位からなる３４塩基の配列、ｌｏｘＰ部位である。上記Ｃｒｅ結合部位は、８塩基のスペーサーにより分離され、上記Ｃｒｅ結合部位内にて、組換えが生じる（ＨｏｅｓｓａｎｄＡｂｒｅｍｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１０２６−１０２９（１９８４）)。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰに基づいたクローニングシステムは、例えば、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｃｒｅａｔｏｒ^ＴＭ）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｅｃｈｏ^ＴＭ）から市販されている。Ｆｌｐは、ｆｒｔ部位を標的とする。真核生物中でのＤＮＡの部位特異的組換えのためのＣｒｅリコンビナーゼの使用は、米国特許第４，９５９，３１７号明細書に開示されている。真核生物の形質導入のための部位特異的リコンビナーゼの使用は、米国特許第６，６３２，６７２号明細書に開示されている。一般的な部位特異的組換えは、米国特許第４，６７３，６４０号明細書に開示されている。

さらなる別の実施形態では、上記リコンビナーゼは、トランスポザーゼまたはレトロトランスポザーゼであり得る。トランスポザーゼまたはレトロトランスポザーゼは、切り取りおよび貼り付けの機構によって、それらの転位を触媒する酵素であり、従って、任意の発現カセットの転移または挿入に用いられ得る。上記のトランスポザーゼまたはレトロトランスポザーゼは、ヒト、鳥類、齧歯類などのような脊椎動物を含む広範な種のゲノムへの任意のＤＮＡの挿入または転移のための、非ウイルス性かつ同種でない方法を提供する。例えば、上記のショウジョウバエのエレメントであるｍａｒｉｎｅｒは、ニワトリの生殖細胞系へ上記エレメント自身を転位させることが示された（Ｓｈｅｒｍａｎら著，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：１０５０−１０５３（１９９８））。ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼを用いた、マウスゲノムおよびヒトゲノムのような哺乳動物系への、長期間の導入遺伝子発現およびトランスポゾンＤＮＡの効率的な挿入は、Ｙａｎｔら著，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，２５：３５−４１（２０００）；Ｄｕｐｕｙら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：４４９５−４４９９（２００２）およびＧｅｕｒｔｓら著，ＭｏｌＴｈｅｒａｐｙ，８：１０８−１１７（２００３）により明らかにされている。Ｌ１、Ｔｏｌ２、Ｔｃ１、Ｔｃ３、Ｍａｒｉｎｅｒ（Ｈｉｍａｒ１）、Ｍａｒｉｎｅｒ（ｍｏｓ１）、Ｍｉｎｏｓのような他のトランスポザーゼは、脊椎動物種内で活性であることが示されており、従って、遺伝子転移において、または挿入的変異誘発ベクターとして有用である（Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，ＤａｖｉｄＡ．著，Ｒｅｐｒｏ．Ｂｉｏｌ，ａｎｄＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１：８０（２００３））。典型的なトランスポザーゼとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：原核生物のトランスポザーゼまたは真核生物のトランスポザーゼ、ウイルス性レトロトランスポゾン、ショウジョウバエのコピア様レトロトランスポゾン、または哺乳動物のレトロトランスポゾンを含むウイルス性でないレトロトランスポゾンなど。原核生物のトランスポザーゼとしては、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１０００、Ｔｎｌ６８１、Ｔｎ２９０１などの、転位可能なエレメントにコードされているトランスポザーゼが挙げられる。真核生物のトランスポザーゼとしては、ショウジョウバエのｍａｒｉｎｅｒ、ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、ショジョウバエのＰエレメント、トウモロコシのＡｃエレメントおよびＤｓエレメントなどの転位可能なエレメントにコードされているトランスポザーゼが挙げられる。レトロトランスポザーゼとしては、Ｌ１、Ｔｏｌ２Ｔｃ１、Ｔｃ３、Ｍａｒｉｎｅｒ（Ｈｉｍａｒ１）、Ｍａｒｉｎｅｒ（ｍｏｓ１）、Ｍｉｎｏｓなどのエレメントにコードされているレトロトランスポザーゼが挙げられる。トランスポザーゼは、Ｍｐ、Ｓｐｍ、Ｅｎ、Ｄｏｔｔｅｄ、Ｍｕ、およびＩ転位エレメントからも選択され得る。

特定の実施形態では、上記トランスポザーゼは、ＡＣ７、Ｔｎ５、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎｌ７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎｌ６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００、Ｔｎｌ６８１、ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、Ｄｏｔｔｅｄトランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、Ｉトランスポゾンなどの群から選択されるトランスポザーゼであり得る。代替的に、ショウジョウバエのＰエレメント、ショウジョウバエのＭａｒｉｎｅｒエレメント、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼなどのような、改変された標的部位のトランスポザーゼまたは真核生物のトランスポザーゼも、用いられ得る。

さらなる別の実施形態では、抗原および／またはアジュバントをコードする、複数コピーの発現カセットが、「ローリング複製」転位により真核細胞のゲノムへ挿入され得る。Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ９、Ｔｎ２１、Ｔｎ５０１、Ｔｎ５５１、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０およびＴｎ２６０３は、ローリング複製型トランスポゾンの例である。

上記リコンビナーゼは、酵素的に活性なタンパク質としてか、または上記リコンビナーゼをコードする組換え型発現プラスミドの形態として導入され得る。代替的に、リコンビナーゼの発現は、リコンビナーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡの導入により達成され得る。

従って、本発明は、ワクチン接種された動物内のトランスフェクションされた細胞のゲノムへのトランスポザーゼ媒介性の発現カセットの組込みを含む、ＤＮＡワクチン接種の方法に関する。ここで、上記発現カセットは、一つまたは数個の抗原および／またはアジュバントをコードする。

本発明によると、上記抗原、上記リコンビナーゼ、上記アジュバントをコードする核酸は、同時にまたは任意の順序で添加され得る。例えば、上記抗原および上記アジュバントをコードするＤＮＡは、上記リコンビナーゼの添加の前に添加され得る。代替的に、上記リコンビナーゼは、上記の望ましい一つの抗原もしくは複数の抗原のコード配列および／または上記の望ましいアジュバントのコード配列、ならびに上記のリコンビナーゼ特異的認識配列を含む発現カセットの導入の前、あるいは上記発現カセットの導入と同時に、上記レシピエント細胞へ導入され得る。あるいは、上記抗原、上記リコンビナーゼおよび上記リコンビナーゼ特異的認識配列をコードする核酸は、最初に添加され得、そして上記アジュバントまたは上記アジュバントをコードするＤＮＡが、次いで添加され得る。

一実施形態では、上記リコンビナーゼは、上記細胞にｍＲＮＡとして、例えば、マイクロマニピュレータの助けを借りた、雄の前核への注入により導入される。代替的に、上記リコンビナーゼは、上記リコンビナーゼをコードする組換え型発現カセット（例えば、プラスミド）により、上記レシピエント細胞へ導入され得る。そのようなプラスミドは、当該分野において公知であり、市販されているかまたは容易に調製され得るかのいずれかであり、そして、市販の発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３およびその改変体を含む。Ｃｒｅ発現プラスミドも、市販されており、そして、例えば、ｐＢＳ１８５（ＣＭＶ−ＣＲＥ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。さらなる実施形態では、上記リコンビナーゼは、酵素的に活性なタンパク質として、上記レシピエント動物に導入される。

本発明では、上記ＤＮＡ構築物は、プラスミドのような任意のベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むがこれらに限定されない任意のウイルスベクター、コスミド、ファージなどであり得る。さらに、上記ＤＮＡ構築物は、線状、または好ましくは、環状のうちのいずれかであり得る。本発明のＤＮＡ構築物は、一つの構築物、二つ以上の構築物において、または別個の構築物において、抗原ＤＮＡ、アジュバントＤＮＡおよび／またはリコンビナーゼＤＮＡをコードし得る。各ＤＮＡ構築物は、上記動物に同時に投与されてもよいし、または好ましくは、上記アジュバント構築物は、上記抗原ＤＮＡの発現カセットの導入および発現の後、投与されてもよい。本発明のＤＮＡ構築物は、さらに、例えば、その維持、複製、抗生物質による選択などのために必要なＤＮＡ配列を含み得る。さらに、上記ＤＮＡ構築物は、様々な機能的ＤＮＡ配列、例えば、より強力な免疫応答を引き起こすＣｐＧモチーフのような免疫刺激配列（ＩＳＳ）などをコードし得る。

本発明のＤＮＡ構築物の投与の経路は、注入、経口送達または経鼻送達などを含むか、あるいは、当該分野において公知の任意の他の経路によるか、または、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号明細書、米国特許第５，６４１，５１５号明細書、および米国特許第５，３９９，３６３号明細書に記載されている通りであり、そして、これらの経路は、免疫応答を誘発する機構とは関係しない。上記明細書の全ては、参考として本明細書により援用されている。注入は、皮下、皮内、筋肉内、腹膜内、脾臓内、経皮性などであり得る。本発明のＤＮＡ構築物を注入するための好ましい方法は、遺伝子銃を介する。

上記ＤＮＡは、上記動物に裸のＤＮＡとして、リポフェクション試薬を用いて、キャリアを用いて、または上記細胞によるＤＮＡの取込みを促進することが公知の任意の組成物を用いて、例えば、米国特許第４，６０８，２５１号明細書；米国特許第４，６０１，９０３号明細書；米国特許第４，５９９，２３１号明細書；米国特許第４，５９９，２３０号明細書；米国特許第４，５９６，７９２号明細書；および米国特許第４，５７８，７７０号明細書に記載されている通り注入され得る。キャリアとしては、上記ワクチン組成物の作用に必要な任意の他の活性成分、任意の溶剤、分散媒質、媒体、コーティング剤、賦形剤、殺菌剤または抗真菌剤、緩衝液、等張溶液、吸収遅延剤、コロイド、懸濁媒質などが挙げられる。

注入されるＤＮＡ構築物の有効量は、例えば、抗原の型およびその発現レベル（各抗原について標準化される必要がある）、投与の経路、大きさ（上記宿主の体重）、コードされている抗原の形態、すなわち、上記抗原が細胞質タンパク質、膜結合型タンパク質または分泌型タンパク質のいずれであるかなどによって変化する。動物に注入されるＤＮＡの有効量または有効用量は、任意の投与された抗原における最適な免疫または免疫治療上の処置を効率的に達成するＤＮＡの量である。例えば、およそ１μｇのＤＮＡ／Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃弾／動物の注入用量は、本発明において用いられるいくつかの抗原にとって最適であるが、他の適切な用量も、用いられ得る。上記ＤＮＡ免疫は、適切な計画に従って、当業者によって機械的に決定され得るような、処置されている障害の型、免疫の保護レベルを維持するために必要な用量などに依存して、繰り返して行われ得る。

目的のＤＮＡの構造的配列をコードすることに加えて、発現カセットはさらに、上記コードされた抗原の分泌を保証するための分泌リーダー配列をコードする配列、抗原提示細胞（例えば、４６残基のＣＯＭＰドメイン）による上記抗原の取り込みを促進するためにタンパク質の溶解性および／またはタンパク質のフォールディングを改良するドメイン、Ｔヘルパー非依存性Ｂ細胞活性化のためのエピトープなどを含み得る。

本発明は、さらに、アジュバントとして有用であるウサギＧＭＣＳＦのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの配列をコードする核酸配列を提供する。ＧＭＣＳＦの発現は、構成的に活性なプロモーター、組織特異的なプロモーターまたは誘導可能なプロモーターの制御下にあり得る。

所定のウサギＧＭＣＳＦのための核酸配列は、わずかに異なる核酸配列を有するが、それにも関わらず、同一のタンパク質をコードする、天然の改変体により表され得ることも、意図される。さらに、用語「機能的に等価なコドン」は、本明細書中では、アルギニンまたはセリンについての六つのコドン（表１）のような同一のアミノ酸をコードするコドンを表すために用いられ、且つ、本明細書中に議論されている通りの、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンも表す。

（表１）

本発明で用いられるＤＮＡ断片は、生物学的機能を有する等価な改変されたポリペプチドおよびペプチドである。そのような配列は、核酸配列およびコードされるそのタンパク質内において自然に存在することが公知である、コドンの重複性および機能的等価性の結果として生じ得る。代替的に、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製され得る。上記の組換えＤＮＡ技術の適用において、上記タンパク質の改変は、アミノ酸が交換されるという性質の考慮に基づいてなされ得る。ヒトにより設計される改変は、特定部位の突然変異誘発により、例えば、上記タンパク質の免疫原性に改良を導入するために、上記タンパク質を与えられた被験者に対する上記タンパク質のインビボでの毒性効果を減らすために、または上記タンパク質に関する任意の処置の効力を増加させるために、導入され得る。

上記遺伝的コード（表１）の縮重を考慮に入れると、本発明は、配列番号２のヌクレオチドと同一なヌクレオチドのうちの少なくとも約５０％、通常少なくとも約６０％、より通常的には約７０％、最も通常的には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましく約９５％を有する配列を含む。

用語「機能的に等価なコドン」は、当該分野において周知であり、そして、さらに本明細書中に詳細に定義されている。従って、ウサギＧＭＣＳＦポリペプチドのアミノ酸と同一または機能的に等価であり、上記タンパク質の生物学的活性を提供されているアミノ酸のうちの、約７０％と約８０％の間；またはより好ましくは、約８１％と約９０％の間；またはより一層好ましくは、約９１％と約９９％の間を有する配列が、維持されている。

用語「機能的に等価なコドン」は、本明細書中で、アルギニンまたはセリンについての六つのコドン（表１）のような同一のアミノ酸をコードするコドンを表すために用いられ、且つ、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをも表す。

以下は、等価な、またはさらに改良された第二世代の分子を作製するためのタンパク質のアミノ酸改変に基づいた議論である。例えば、特定のアミノ酸は、タンパク質構造内における他のアミノ酸の代わりに、反応性結合能の感知可能なほどの損失を伴わずに、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造で置換され得る。上記タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、タンパク質の反応性および本質であるという理由から、特定のアミノ酸置換は、タンパク質配列内、そしてその基礎となるＤＮＡコード配列内において行われるが、それにも関わらず、類似の性質を有するタンパク質を生じる。従って、本発明により、様々な改変は、遺伝子のＤＮＡ配列内で、それらの生物学的有用性または活性の感知可能なほどの損失を伴わずに、下記に議論されている通り行われ得ることが、意図される。表１は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。

そのような改変を行う場合に、アミノ酸の疎水親水指数が考慮され得る。タンパク質における反応性生物学的機能を与えるという点における、疎水親水アミノ酸指数の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水親水特性が、生じたタンパク質の二次構造に寄与し、次には、上記タンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との反応を規定することも、許容されている。

当該分野において、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行われ得ることも、理解されている。本明細書中に参考として援用されている米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、その隣接するアミノ酸の親水性により決定される、タンパク質の最も大きい局所的な平均の親水性が、そのタンパク質の生物学的性質と相関することを記述する。米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳述されている通り、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０．＋−．１）；グルタメート（＋３．０．＋−．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。

アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換され得、それにも関わらず、生物学的に等価、且つ、免疫学的に等価なタンパク質を生じることが、理解されている。そのような改変では、親水性値が．＋−．２の範囲内であるアミノ酸の置換は、好ましく、親水性値が．＋−．１の範囲内であるアミノ酸の置換は、特に好ましく、ならびに、親水性値が．＋−．０．５の範囲内であるアミノ酸の置換は、なお一層特に好ましい。

本明細書中に概説されている通り、アミノ酸の置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づいている。様々な上記の特徴を考慮する典型的な置換は、当業者に周知であって、以下のものが挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびに、バリン、ロイシンおよびイソロイシン。

本発明によるペプチドの調製のための別の実施形態は、ペプチド模倣物の使用である。模倣物は、タンパク質の二次構造のエレメントを模倣するペプチド含有分子である（Ｊｏｈｎｓｏｎ１９９３）。ペプチド模倣物の使用を支持する基礎となる原理説明は、タンパク質のペプチド骨格が、主に抗体と抗原との反応のような分子反応を促進するような様式でアミノ酸側鎖を方向付けるために存在しているということである。ペプチド模倣物は、その天然の分子と類似する分子反応を許容することが期待されている。これらの原理は、上記の原理概要と組み合わせて、改変および改良された特徴と共にアジュバントの多くの天然の性質を有する第二世代分子を作るために、用いられ得る。

従って、ウサギＧＭＣＳＦをコードし、且つ、ウサギＧＭＣＳＦの機能的に等価なポリペプチドである改変体の核酸配列は、本発明におけるアジュバントとして有用である。

本発明の別の局面では、本発明のＤＮＡ構築物が投与され得る動物としては、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒトでない霊長類動物、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、非齧歯類（例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバ））ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＤＮＡ構築物が投与され得る動物としては、遺伝子変換動物、すなわち、実質的に遺伝子変換および／または体細胞超突然変異により抗体多様性を創出する動物（例えば、ウサギ、トリ、ウシ、イノシシなど）、ならびに、抗体の再構成が、生涯の初期、すなわち、生涯の初めの月の内に止まる動物（例えば、ウサギ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ類、イノシシ、ウマなど）を含む。

さらに、本発明のＤＮＡ構築物が投与され得る動物は、任意の上記非ヒト動物であって、さらに、外来性免疫グロブリンのトランスローカス、好ましくは、ヒト免疫グロブリン重鎖および／もしくはヒト免疫グロブリン軽鎖の配列またはヒト化免疫グロブリン重鎖および／もしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖の配列あるいはそれらの一部分を有する動物が挙げられる。この導入遺伝子の位置は、生殖細胞系形態かまたは再構成された形態のいずれかであり得る。上記導入遺伝子は、ヒト免疫グロブリンもしくはヒト化免疫グロブリンまたはそれらの一部分をコードするので、上記導入遺伝子は、ヒト化抗体の産生をもたらす。従って、例えば、上記のＤＮＡ免疫方法を介したリコンビナーゼを用いて、ヒト化抗体を含む抗体は、本発明において記載されているウサギＧＭＣＳＦアジュバントを用いたヒトでない標的動物内で、産生され得る。

本発明は、さらに、決してそれらに限定されないが、以下の実施例に挙げられる一定の実施形態により図示される。当業者は、本発明の種々の改変が、本発明が実行する過程において実質的な変化を伴わずに行われ得ることを理解する。そのような改変は全て、特に、本明細書中に請求される発明の範囲内であることが意図されている。

（実施例１）
（ウサギＧＭＣＳＦのクローニング）
ＺＩＫＡウサギ由来の腹膜マクロファージを、３０〜６０ｍｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ；ＰＥＴ１０２７００９８）を用いた腹膜腔の洗浄によって収集し、そして二回洗浄した。上記細胞を計数し、２４ウェルプレートの１ウェル内に１〜３×１０^５細胞／ウェルの密度でＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中にプレーティングし、そして、加湿した５％ＣＯ^２インキュベーター内で３７℃５時間、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ；Ｌ２６３０）で刺激した。細胞を収集し、そして、全ＲＮＡを、ＱＩＡ_ＡｍｐＲＮＡ−Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離した。

３〜６μｌの全ＲＮＡを、３’−ＲＡＣＥＣＤＳプライマーＡ（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣ（Ｔ）_３０ＶＮ−３’）（配列番号３）によりＢＤＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、上記製造業者の説明書に従って逆転写した。ウサギＧＭＣＳＦを、最初のｃＤＮＡ鎖から、プライマー対であるＧＭＣＳＦｕｐ３（５’−ａａｇｇｃｔａａｇｇｔｃｃｔｇａｇｇａｇｇ-３')（配列番号４）および１０×ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒＡｍｉｘ（５’ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ-３’（配列番号５）および５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号６）の混合物）により、ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液でＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴｒｉｐｌｅＭａｓｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ複製を行った。ＰＣＲ条件は：９４℃で５０秒間の変性、６０℃で５０秒間のアニーリングおよび７２℃で５０秒間３５サイクルの伸長、であった。ＰＣＲ産物を、電気泳動により１．２％アガロースゲル中にて解析した。特異的なバンドを、切り出して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＴｕｒｂｏｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｂｉｏ１０１）により抽出し、そして、ＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列を解読した（Ａｇｏｗａ）。

（実施例２）
（遺伝的免疫によるウサギ内での抗ＣＤ２０抗体の産生）
ＬＰＳで刺激したウサギの腹膜マクロファージおよび腹膜リンパ球に由来するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し、そして逆転写する。ウサギＧＭＣＳＦおよびウサギＦｌｔ３ＬのｃＤＮＡを、ＰＣＲにより複製する。続いて、上記ｃＤＮＡを、発現プラスミドにクローニングする。ヒトＣＤ２０の可溶性部分をコードするｃＤＮＡを合成し、そして上記の同一発現プラスミドにクローニングする。上記の最終構築物を、図１に示す。プラスミドＤＮＡを精製し、Ｃ３１インテグラーゼをコードする同等量のプラスミドと混合する。プラスミドＤＮＡ（約１μｇ／銃弾）を、上記製造業者の説明書に従って、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝銃弾上にコーティングする。ウサギを緩和に麻酔し、そして０日目および１４日目において各耳に撃つ。血液を回収し、そして凝固させる。血清を、遠心により回収する。抗ＣＤ２０抗体を、フローサイトメトリによりヒト腹膜血リンパ球を用いて検出する。ウサギＧＭＣＳＦで免疫した動物とウサギＧＭＣＳＦで免疫していない動物との比較は、ウサギＧＭＣＳＦの投与が免疫応答を有意に増加させることを示す。

図１は、ウサギＧＭＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。図２は、上記のウサギＧＭＣＳＦのポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号２）を示す。上記コード配列は、色を変えて強調されている。図３は、種々の動物に由来する他のＧＭＣＳＦ分子（配列番号７〜１９）との、ウサギＧＭＣＳＦ（配列番号１）のアミノ酸のアライメントを示す。図４は、ウサギＧＭＣＳＦ、ウサギＦＬＴ３−ＬおよびヒトＣＤ２０をコードする三つの発現カセットを有する発現プラスミドを示す。上記プラスミドは、トランスフェクションされた細胞のゲノムへの上記発現カセットのリコンビナーゼ媒介性組込みのための、リコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）も含む。

Claims

配列番号１のウサギＧＭＣＳＦポリペプチド。
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１に記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
請求項２に記載のキメラ分子であって、ここで、前記異種アミノ酸配列は、エピトープ配列である、キメラ分子。
請求項２に記載のキメラ分子であって、ここで、前記異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン配列である、キメラ分子。
請求項４に記載のキメラ分子であって、ここで、前記免疫グロブリン配列は、免疫グロブリンのＦｃ領域である、キメラ分子。
請求項１に記載のウサギＧＭＣＳＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列。
請求項６に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクターまたは発現カセット。
請求項６に記載の核酸で形質転換された、単離された宿主細胞。
動物を免疫するかまたはワクチン接種する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）抗原をコードする少なくとも一つの発現カセットと第一組換え部位とを含む、少なくとも一つのＤＮＡ構築物を投与する工程；
（ｉｉ）少なくとも一つのアジュバントを該動物に投与することにより、該動物の免疫系を刺激する工程；
（ｉｉｉ）第二組換え部位を含む該動物のゲノムへの該発現カセットの組込みを媒介するリコンビナーゼを投与する工程、
を包含し、ここで、該抗原が発現される、方法。
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、ポリペプチドとして導入される、方法。
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントの投与は、前記動物に以下：（ｉ）該アジュバントをコードする発現カセットと第一組換え部位とを含むＤＮＡ構築物としての該アジュバント；および（ｉｉ）第二組換え部位を含む該動物のゲノムへの該発現カセットの組込みを媒介するリコンビナーゼ、を導入する工程を包含し、ここで、該アジュバントが発現される、方法。
請求項９に記載の方法であって、前記抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、古細菌性抗原、ならびに、感染、炎症、癌、ぜん息／アレルギー、自己免疫疾患、多発性硬化症、セプシス／中毒性ショック、慢性関節リウマチ、同種移植拒絶、乾癬などのような疾患と関連した抗原からなる群から選択される、方法。
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記抗原は、ＣＤ２０である、方法。
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、インターロイキンであって、ＩＬ−ｌαおよびＩＬ−ｌβ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０のようなインターロイキン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−γなど、ならびに共刺激分子であって、ＴＣＡ３、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどのような共刺激分子からなる群から選択される、方法。
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦである、方法。
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記抗原をコードする発現カセット、および前記のアジュバントをコードする発現カセットは、一つのＤＮＡ構築物の一部分である、方法。
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記抗原をコードする発現カセット、および前記のアジュバントをコードする発現カセットは、別々のＤＮＡ構築物上に存在する、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記リコンビナーゼは、ポリペプチドとして投与される、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記リコンビナーゼは、該リコンビナーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ分子として投与される、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記リコンビナーゼは、該リコンビナーゼをコードする発現カセットを含むＤＮＡ構築物として投与される、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記リコンビナーゼは、ファージにより発現される部位特異的リコンビナーゼである、方法。
請求項２１に記載の方法であって、前記リコンビナーゼは、ΦＣ３１、ファージＲ４およびＴＰ９０１−１からなる群から選択される、方法。
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記部位特異的リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｃｒｅ様リコンビナーゼ、ＦｌｐリコンビナーゼおよびＲリコンビナーゼからなる群から選択される、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記リコンビナーゼは、トランスポザーゼまたはレトロトランスポザーゼである、方法。
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記トランスポザーゼは、ＡＣ７、Ｔｎ５、Ｔｎ９１６、Ｔｎ９５１、Ｔｎ１７２１、Ｔｎ２４１０、Ｔｎ１６８１、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ３０、Ｔｎ１０１、Ｔｎ９０３、Ｔｎ５０１、Ｔｎ１０００、Ｔｎｌ６８１、Ｔｎ２９０１、ＡＣトランスポゾン、Ｍｐトランスポゾン、Ｓｐｍトランスポゾン、Ｅｎトランスポゾン、Ｄｏｔｔｅｄトランスポゾン、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｓトランスポゾン、ＥｎトランスポゾンおよびＩトランスポゾンからなる群から選択される、方法。
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記トランスポザーゼは、真核生物のトランスポザーゼである、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記第一組換え部位および前記第二組換え部位は、少なくとも９０％の配列同一性を共有する、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記第一組換え部位および前記第二組換え部位は、９０％未満の配列同一性を共有する、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記第一組換え部位は、細菌ゲノム組換え部位を含み、前記第二組換え部位は、ファージ組換え部位を含む、方法。
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記細菌ゲノム組換え部位は、ａｔｔＢであり、前記ファージ組換え部位は、ａｔｔＰである、方法。
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第一組換え部位は、ａｔｔＢ部位を含み、前記第二組換え部位は、偽ａｔｔＰ部位を含む、方法。
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第一組換え部位は、偽ａｔｔＢ部位を含み、前記第二組換え部位は、ａｔｔＰ部位を含む、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記のリコンビナーゼを介した組換えは、もはや該リコンビナーゼの基質ではない部位を生じる、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記ＤＮＡ構築物は、環状である、方法。
請求項９または請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記ＤＮＡ構築物は、線状である、方法。
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記動物は、非ヒト動物である、方法。
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記非ヒト動物は、ウサギである、方法。
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記動物は、ヒトである、方法。
動物内で抗体を産生する方法であって、以下：
（ｉ）抗原をコードする少なくとも一つのＤＮＡ発現カセット、組換え部位、ならびに該動物のゲノムへの該ＤＮＡ発現カセットの組込みを媒介するリコンビナーゼを投与する工程；
（ｉｉ）必要に応じて、少なくとも一つのアジュバントを投与する工程；
（ｉｉｉ）該動物から、数日後に血清試料を採取する工程；
（ｉＶ）該血清試料から、該投与された抗原に対する抗体を同定し、必要であれば、精製する工程、
を包含する、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、ポリペプチドとして導入される、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、該アジュバントをコードする発現カセット、組換え部位、ならびに、該アジュバントをコードするＤＮＡ発現カセットの前記動物のゲノムへの組込みを媒介するリコンビナーゼを含む核酸として導入される、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記動物は、ヒトである、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記動物は、非ヒト動物である、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記動物は、外来性免疫グロブリンのトランスローカスを有する、非ヒトトランスジェニック動物である、方法。
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記外来性免疫グロブリンのトランスローカスは、ヒト免疫グロブリン重鎖および／またはヒト免疫グロブリン軽鎖の配列、あるいはヒト化免疫グロブリン重鎖および／またはヒト化免疫グロブリン軽鎖の配列である、方法。
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記ヒトでないトランスジェニック動物は、遺伝子変換動物である、方法。
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記非ヒトトランスジェニック動物は、齧歯類、ウサギ、鳥類であって、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウを含む鳥類からなる群から選択される、方法。
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記非ヒト動物は、ウサギである、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記抗原は、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、古細菌性抗原、ならびに、癌、ぜん息／アレルギー、自己免疫疾患、多発性硬化症、炎症／セプシス／中毒性ショック、慢性関節リウマチ、同種移植拒絶、乾癬などのような疾患と関連した抗原からなる群から選択される、方法。
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記抗原は、ＣＤ２０である、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、ＧＭＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、インターロイキンであって、ＩＬ−ｌαおよびＩＬ−ｌβ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０のようなインターロイキン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−γなど、ならびに共刺激分子であって、ＴＣＡ３、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどのような共刺激分子からなる群から選択される、方法。
請求項３９に記載の方法であって、ここで、前記アジュバントは、配列番号１のウサギＧＭＣＳＦである、方法。