CN108700568A - 用于改善的生产的蛋白质降解抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本文中公开了可用于评估、选择、鉴定或生成细胞或细胞系的方法和组合物，所述细胞或细胞系具有改善的用于产生较高的产物产率的生产率和/或改善的产生较高的产物质量的能力。如本文所述，产物可以包括由细胞内源表达的多肽、非内源表达的重组多肽、或非天然存在的重组多肽。本文描述的方法包括通过使用蛋白酶体抑制剂、ER相关降解(ERAD)抑制剂或泛素途径抑制剂来调节(例如抑制)蛋白质降解途径。

Description

用于改善的生产的蛋白质降解抑制剂
本申请要求2016年1月6日提交的美国申请62/275,961；和2016年1月8日提交的美国申请62/276,339的优先权，这些申请中每篇的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开涉及用于产生产物，例如重组蛋白的细胞和细胞系，例如真核细胞和细胞系。本公开还涉及调节蛋白质降解途径以实现产物，例如重组蛋白质的改善的生产。
发明背景
高度产生重组CHO细胞系的产生和选择已经强调为细胞系开发过程中的瓶颈。因此，需要鉴定和产生具有高度产生重组蛋白的能力的细胞系的方法。
发明概述
本公开内容部分基于以下发现：细胞，例如真核细胞，例如真核细胞，例如哺乳动物或哺乳动物细胞以外的细胞产生产物，例如重组多肽的能力和对蛋白质降解途径抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂和ERAD抑制剂的易感性之间的相关性。不希望受理论束缚，据信蛋白质降解途径抑制剂可用于选择高度生产率细胞，例如能够产生产物，例如重组多肽的高产率的细胞。因此，本文公开了用于评估、选择、分类或鉴定用于产生产物(例如重组多肽)的细胞的方法和过程。本文还提供了通过鉴定或选择能够有高生产率的细胞来生成用于产生产物(例如重组多肽)的细胞或细胞系的方法和方法。本文所述的这些方法和过程包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触，例如，抑制或降低蛋白质降解途径的活性。因此，本文不仅提供了用于鉴定更好质量的细胞，例如具有更高的生产率，用于生产产物，例如重组多肽的方法，而且还提供产生更好质量产物，例如重组多肽产物，例如，单克隆抗体和难以表达的蛋白质，例如双特异性分子的细胞。
在一方面，本公开内容的特征在于评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
a)任选地提供细胞；
b)使所述细胞(或所述细胞的后代)与蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂、或内质网相关降解(ERAD)抑制剂接触；
c)评估蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂或ERAD抑制剂对所述细胞(或所述细胞的后代)中与细胞功能相关的一个或多个参数的影响；
d)任选地将蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂对所述一个或多个参数的影响的值与参考值比较；并且
e)任选地从所述细胞(或所述细胞的后代)表达产物，例如重组多肽；并且
从而评估、分类、鉴定、生成或选择细胞或后代细胞或后代细胞群体。在一个实施方案中，该方法包括提供细胞。在一个实施方案中，该方法包括将蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对一种或多种参数的影响值与参考值比较。在一个实施方案中，该方法包括从细胞(或细胞的后代)表达产物，例如重组多肽。
由本文描述的细胞和方法产生的产物可以是分子、核酸、多肽或其任何融合物或杂合物。在一个实施方案中，产物是非天然存在的物质或分子。在另一个实施方案中，产物是天然存在的物质或分子。工程化改造或修饰产生本文所述的产物的细胞以控制，例如，增加表达，或产生，例如，编码本文所述的产物。在一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含外源核酸，其控制例如增加内源表达产物的表达。在另一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含编码产物，例如内源表达的产物、不由细胞内源产生的产物、或非天然存在的产物的外源核酸。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括评估细胞或后代细胞或后代细胞群体。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括分类细胞或后代细胞或后代细胞群体。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括鉴定细胞或后代细胞或后代细胞群体。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括生成细胞或后代细胞或后代细胞群体。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括选择细胞或后代细胞或后代细胞群体。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括例如作为步骤(b)的一部分，培养与所述蛋白质降解抑制剂接触的所述细胞(或所述细胞的后代)。
本文的方法包括鉴定或选择具有改善的，例如增加的生产率的细胞，例如产生产物，例如多肽，例如重组多肽的能力。在一个实施方案中，与由尚未被蛋白质降解抑制剂接触的细胞产生的水平、量或数量相比，由鉴定或选择的细胞产生的产物的水平、量或数量增加例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。
本文描述的方法包括鉴定或选择具有改善的，例如增加的产物，例如重组多肽质量的细胞。在一个实施方案中，与由尚未被蛋白质降解抑制剂接触的细胞产生的产物的质量相比，由鉴定或选择的细胞产生的产物的质量增加例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。在一个实施方案中，产物质量的改善包括下列中的一种或多种：期望产物的水平、量或比例增加，例如，相对于不需要的同种型、片段化或截短形式；正确折叠产物的水平、量或比例增加；功能性，例如酶活性产物的水平、数目或比例增加；聚集产物的水平、量或比例下降；或者片段化或不需要的同种型的水平、量或比例降低。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括比较蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)的效果值与参考值。在其中该值与参考值具有预定关系的实施方案中，该方法包括分类或选择细胞或后代细胞或后代细胞群体，例如用于建立培养物，例如细胞合并物。在其中该值满足或超过参考值的一些实施方案中，该方法包括分类或选择后代或后代细胞或后代细胞群体，例如用于建立培养物，例如细胞合并物或用于产生多肽，例如，重组多肽。在其中该值与参考值具有预定关系的实施方案中，该方法包括分类或选择后代或后代细胞或后代细胞群体，例如用于产生多肽，例如重组多肽。在其中该值满足或超过参考值的实施方案中，将细胞或后代细胞或后代细胞群体分类、鉴定或选择为生产细胞或后代细胞或后代细胞群体。在其中所述值与参考值具有预定关系的一些实施方案中，所述方法包括选择细胞(或细胞的后代)，例如用于生成细胞系或细胞群体。
在一个实施方案中，与细胞功能相关的参数包括，例如选自：
i)细胞存活，
ii)培养存活力，
iii)产生产物，例如多肽，例如重组多肽的能力，
iv)蛋白酶体活性；或
v)表达产物，例如多肽，例如重组多肽的质量，例如较同质的产物。
在一个实施方案中，该方法包括评估超过一个参数。在一个实施方案中，该方法包括评估超过一个参数，并且将测量的参数与参考值比较。
本文还提供了用于从细胞或本文所述细胞的后代细胞建立细胞系的方法。在一个实施方案中，该方法还包括培养细胞以提供培养细胞群体，例如后代细胞群体。在一个实施方案中，该方法还包括从培养细胞群体，例如后代细胞群体中选择细胞。在一个实施方案中，该方法包括对所选择的细胞(或细胞的后代)评估与细胞功能相关的参数，例如，提供参数的值，例如与如本文所述的细胞功能相关的参数。在其中该值与参考值具有预定关系的这些实施方案中，选择细胞(或细胞的后代)，例如，用于产生多肽，例如重组多肽。在其中值满足或超过参考值的实施方案中，选择细胞(或细胞的后代)作为生产细胞。在一个实施方案中，该方法还包括从所述细胞建立细胞系。
在一个实施方案中，例如，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括将外源核酸导入细胞中。在一个实施方案中，外源核酸编码产物，例如重组多肽，或控制例如增加产物(例如内源多肽)表达的外源核酸。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之后导入所述外源核酸。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之前导入所述外源核酸。在一个实施方案中，外源核酸编码多肽，例如重组多肽，例如选自表1或2的治疗性多肽或抗体分子。在一个实施方案中，该方法还包括将一种或多种另外的外源核酸(例如第二外源核酸)导入细胞中。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之后导入第二外源核酸。在一个实施方案中，在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之前导入第二外源核酸。在一个实施方案中，在导入第一外源核酸后导入第二外源核酸。在一个实施方案中，在导入第一外源核酸之前导入第二外源核酸。在一个实施方案中，第二外源核酸与第一外源核酸同时导入。在一个实施方案中，第二外源核酸编码选择标志物，例如谷氨酰胺合酶。在一个实施方案中，该方法还包括导入外源核酸，包括转染、电穿孔或转导。
在一个实施方案中，例如，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的后代细胞或后代细胞群体的方法还包括评估细胞的第二特性，例如，确定细胞是否包含外源组分，例如，一种或多种外源核酸，例如整合到细胞核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，该方法包括确定细胞是否包含整合到细胞核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸，包括MSX选择、MTX选择(例如DHFR系统)、抗生素选择、酵母生长选择、基于颜色变化的选择或标志物的表面表达、基于Selexis系统的选择、或基于Catalant系统的选择。在一个实施方案中，抗生素选择包括选择对选自潮霉素、新霉素(G418)、zeocin、嘌呤霉素或杀稻瘟素的抗生素的抗性。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法包括评估蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对与细胞功能相关的参数(例如，存活、存活力、或增殖能力、或产生产物，例如多肽，例如，由外源核酸表达的多肽)的影响；并且，例如，通过MSX选择，确定细胞是否包含整合到细胞的染色体基因组中的外源核酸。在一个实施方案中，其中响应于步骤蛋白质降解抑制剂的影响并步骤确定细胞是否包含整合到细胞的染色体基因组中的外源核酸中的评估，评估、分类、鉴定或选择细胞、后代细胞或后代细胞群体。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括另外的选择步骤，例如通过FACS选择、磁分离，例如磁珠，集落挑选、微流体细胞分选或微流体细胞破坏。在实施方案中，选择步骤包括确定细胞是否包含一种或多种外源核酸。在实施方案中，选择步骤包括确定细胞是否包含整合到细胞核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸。
在一个实施方案中，评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法还包括向细胞中导入辅助蛋白质折叠的试剂，例如伴侣蛋白分子或小化学分子。在一个实施方案中，辅助蛋白质折叠的试剂包含编码伴侣蛋白或蛋白质折叠途径的组分的核酸，例如XBP1、SRP14、BiP/GRP78、PDI、钙联接蛋白或亲环蛋白B。在一个实施方案中，辅助蛋白质折叠的试剂包括选自DMSO、甘油或PBA的小分子。
另一方面，本发明的特征在于生成细胞系或细胞群体的方法，包括通过本文的方法鉴定细胞；并且培养细胞或细胞群体，以提供细胞系或细胞群体。在另一方面，本发明的特征在于生成细胞系或细胞群体的方法，包括通过所述方法鉴定或选择细胞；并培养细胞或细胞群体，以提供细胞系或细胞群体。
另一方面，本发明的特征在于生成产物(例如多肽，例如重组多肽)的方法，其包括：提供通过本文所述方法生成的细胞或细胞群体；在培养物中培养细胞或细胞群体；并且任选地，从细胞或培养细胞的培养基中回收产物，例如多肽，例如重组多肽。
在另一个方面，本公开内容的特征在于通过本文描述的任何方法评估、分类或选择的细胞、后代细胞或后代细胞群体。
另一方面，本发明的特征在于通过本文所述的任何方法生成的细胞、后代细胞或后代细胞群体。
在另一个方面，本公开内容的特征在于细胞，后代细胞或后代细胞群体，其可以通过本文描述的任何方法生成。
在另一个方面，本公开内容的特征在于产物，例如多肽，例如重组多肽，其由本文所述的任何方法或本文所述的任何细胞产生或可产生。
在另一个方面，本公开内容的特征在于包含本文所述产物的制剂，例如，由本文所述的任何方法或本文所述的任何细胞产生或可产生的产物，例如多肽，例如重组多肽。
另一方面，本发明的特征在于包含本文所述细胞和本文所述产物，例如多肽，例如重组多肽的混合物。
在另一个方面，本公开内容的特征在于通过培养本文所述的细胞、后代细胞或后代细胞群体，例如本文所述的细胞，后代细胞或后代细胞群体条件化的培养基的制剂。
另一方面，本发明的特征在于生成产生重组蛋白(例如重组治疗性蛋白质，例如重组治疗性抗体)的细胞或细胞后代的方法，其包括：
a)任选地，提供细胞；
b)在存在外源蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂、或内质网相关降解(ERAD)抑制剂的情况下培养所述细胞或所述细胞后代(例如，达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多代或达至少12、24、48、72小时或1、2、4、8、16、32或更多周)；
c)在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养所述细胞或细胞后代(例如，达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代或达至少12、24、48、72小时)；
d)任选地，评估所述蛋白质降解抑制剂对由所述细胞或所述细胞后代产生的重组蛋白水平的影响，例如，以获得由所述细胞或所述细胞后代产生的重组蛋白的值；并且
e)任选地，将d)中获得的值与参考值比较，其中所述参考值是由在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养的与a)中提供的细胞相同类型的细胞产生的重组蛋白的水平；
从而生成所述细胞或细胞后代。
本文描述的任何方法或组合物的其他特征或实施方案包括以下一种或多种：
蛋白质降解抑制剂
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂是蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂抑制或降低20S核心亚基、19S调节亚基、11S调节颗粒或辅助蛋白酶体组装的伴侣蛋白，例如Hsm3/S5b、Nas2/p27、Rpn14/PAAF1、和Nas6/癌性锚蛋白重复序列中的一种或多种的活性。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂选自MG132(Z-LLL-al、Z-Leu-Leu-Leu-al、Z-Leu-Leu-Leu-CHO)、环氧霉素(epoxomicin)、硼替佐米(bortezomib)、伊沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、双硫仑(disulfiram)、CEP-18770、ONX 0912、盐孢酰胺、LLnV、CEP1612、乳胞素、PS-341、和eponomicin。
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂是ERAD抑制剂。在一个实施方案中，ERAD抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：钙联接蛋白/钙网织蛋白、UDP-葡萄糖-糖蛋白葡萄糖基转移酶、ER降解增强性α-甘露糖苷酶样蛋白(EDEM)、ER甘露糖苷酶I、Sec61、CDC48p(VCP/p97)、Hrd1、Doa10、Ubc6、Ubc1、Cue1、或Ubc7。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂是eeyarestatin I。
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂是泛素途径抑制剂。在一个实施方案中，泛素途径抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：E1泛素激活酶、E2泛素缀合酶或E3泛素连接酶。
在本文所述任何方法的实施方案中，该方法还包括使候选细胞与第二蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、ERAD抑制剂或泛素途径抑制剂接触。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯。在一个实施方案中，第一蛋白质降解抑制剂和第二蛋白质降解抑制剂选自MG132、环氧霉素或eeyarestatin 1。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如，同时或序贯，并且第一抑制剂是蛋白酶体抑制剂，而第二抑制剂是蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是蛋白酶体抑制剂，二第二抑制剂是ERAD抑制剂或泛素途径抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与蛋白质降解的第一和第二抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是ERAD抑制剂，而第二抑制剂是ERAD抑制剂。在实施方案中，第一抑制剂不同于第二抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是ERAD抑制剂，而第二抑制剂是泛素途径抑制剂或蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与第一和第二蛋白质降解抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是泛素途径抑制剂，而第二抑制剂是泛素途径抑制剂。在一个实施方案中，使细胞与蛋白质降解的第一和第二抑制剂接触，例如同时或序贯，并且第一抑制剂是泛素途径抑制剂，而第二抑制剂是ERAD或蛋白酶体抑制剂。
在本文所述的任何方法的实施方案中，使细胞与一定浓度的蛋白质降解抑制剂接触，所述浓度足以将培养物存活力降低约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％、80％、85％、90、95％，例如，与使所述培养物与所述抑制剂接触之前的培养物存活力相比，或与未接触所述抑制剂的培养物相比。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.05％总细胞在与蛋白质降解抑制剂接触后在培养物中存活的浓度。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是一种或多种细胞继续增殖的浓度。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度小于0.5μM MG-132。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为约0.0625μM MG-132。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为小于0.05μM环氧霉素。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为约0.025μM环氧霉素。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为低浓度的eeyarestatin I，例如0.1μM。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度为小于0.5μM的eeyarestatin I，例如约0.1μM的eeyarestatin I。
在本文所述的任何方法的实施方案中，使细胞与蛋白质降解抑制剂接触24、48、72、96、或168小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在存在蛋白质降解抑制剂的情况下将细胞(或细胞后代)培养24、48、72、96、小时或更多小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在存在蛋白质降解抑制剂的情况下将细胞(或细胞的后代)培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10代或更多代或至少12、24、48、72小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在选择步骤，例如MSX选择后使细胞与蛋白质降解抑制剂接触24、48、72、96、或168小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，在选择步骤，例如，MSX选择之前，使细胞与蛋白质降解抑制剂接触24、48、72、96、或168小时。在本文所述的任何方法的实施方案中，与选择步骤(例如MSX选择)同时或并行使细胞与蛋白质降解抑制剂接触。
细胞
在本文所述的任何方法或组合物的一些实施方案中，该方法包括提供表达多肽，例如重组多肽的细胞，例如包含编码产物，例如多肽，例如重组多肽或控制多肽，例如重组多肽的表达的外源核酸的细胞。
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，细胞包含编码产物，例如多肽，例如重组多肽或控制例如增加多肽，例如重组多肽的表达的外源核酸。在实施方案中，外源核酸包含编码一种或多种(例如两种)重组多肽的核酸序列。在一个实施方案中，细胞是已经在商业上用于产生多肽产物、已经用于产生用于临床前工作的多肽的类型的细胞，或已经用于产生用于临床试验的产物(例如多肽)的细胞。在一个实施方案中，细胞表达多肽，例如重组多肽，选自表1或2。
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，细胞是真核细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞来自小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿(例如包括人)、狗、马、骆驼、雪貂或猫。在一个实施方案中，细胞是CHO细胞，例如CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHODXB11、CHOZN、或CHO衍生细胞。在一个实施方案中，细胞选自HeLa、HEK293、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、EB66、C127、L细胞、COS，例如COS1和COS7、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11、和CHOZN。
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞以外的真核细胞。在一个实施方案中，细胞来自昆虫、植物、鸭、鹦鹉、鱼、酵母或真菌。
产物
如本文所述，由本公开的细胞和方法产生的产物可以是分子、核酸、多肽或其任何融合物或杂合物。在一个实施方案中，产物是非天然存在的物质或分子。在另一个实施方案中，产物是天然存在的物质或分子。工程化改造或修饰产生本文所述产物的细胞以控制例如增加表达，或产生，例如编码本文所述的产物。在一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含外源核酸，其控制例如增加内源表达产物的表达。在另一个实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以包含编码产物的外源核酸，例如内源表达的产物、不由细胞内源产生的产物、或非天然存在的产物。
在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是治疗性多肽，例如，用于对患有疾病或病症的受试者施用。在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是诊断性多肽。
在本文公开的任何方法或组合物中，产物包含抗体分子、双特异性分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素或酶中的一种或多种。
在一个实施方案中，产物包含抗体分子，例如全长抗体或抗体片段。在一个实施方案中，产物包含与第二试剂(例如多肽，例如毒素)偶联，例如共价或非共价偶联的抗体分子或其片段。在一个实施方案中，抗体分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体分子结合肿瘤或癌症相关抗原。在一个实施方案中，抗体分子结合肿瘤相关糖蛋白(TAG72)。在一个实施方案中，产物包含双特异性分子，例如，在表2中提供的双特异性分子。
在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是人多肽，其氨基酸序列与人多肽的天然存在的同种型没有差异。
在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与人多肽的天然存在的同种型相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与人多肽或蛋白质的天然存在的同种型相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15％的其氨基酸残基。
在本文公开的任何方法或组合物中，产物包含选自表1或表2的多肽，例如重组多肽。在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，是来自表1或表2的多肽。
在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与表1或表2的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽，与来自表1或表2的多肽相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15％的其氨基酸残基。
在本文所述的任何方法或组合物中，将包含控制产物表达编码产物(例如重组多肽)的核酸序列的外源核酸导入细胞。在本文所述的任何方法或组合物中，细胞包含外源核酸，其包含编码产物，例如重组多肽的核酸序列。在一个实施方案中，将外源核酸整合到细胞中的核酸中，例如细胞的染色体基因组。在另一个实施方案中，未将外源核酸整合到细胞的染色体基因组中，但是整合在人工染色体或质粒上，例如，使得外源核酸维持在细胞或细胞的后代中。
在本文所述的任何方法或组合物中，外源核酸可以进一步包含一个或多个，例如，两个、三个、四个或五个额外的核酸序列，例如，编码产物或其他序列或多肽以控制产物表达。
在本文所述的任何方法或组合物中，外源核酸包含质粒或载体，例如表达或病毒载体。在一个实施方案中，外源核酸包含谷氨酰胺合酶(GS)表达载体。在一个实施方案中，外源核酸还包含编码选择标志物的核酸序列。在一个实施方案中，选择标志物包含谷氨酰胺合酶、DHFR或赋予抗生素抗性的基因。在一个实施方案中，编码选择标志物的核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且编码产物，例如多肽，例如重组多肽的核酸序列与第二启动子可操作地连接。在一个实施方案中，第一启动子和第二启动子是不同的。在一个实施方案中，与选择标志物可操作连接的启动子是弱启动子，例如SV40E启动子。在一个实施方案中，与编码多肽，例如重组多肽的核酸序列可操作地连接的启动子是强启动子，例如CMV启动子，例如hCMV-MIE启动子。
在本文所述的任何方法中，该方法包括从细胞或后代细胞中表达产物，例如多肽，例如重组多肽。在一个实施方案中，产物，例如多肽，例如重组多肽从细胞或后代细胞分泌到例如培养基中。
在本文所述的任何方法或组合物中，对表达的产物，例如多肽，例如重组多肽评估与物理或功能特性相关的参数，例如，一级序列、糖基化、一级、二级、三级或四级结构、活性、糖基化程度、聚集程度、具有预选性质，例如具有预选的单体、二聚体或三聚体结构的表达产物的比例或水平、或具有预选结构，例如非变性或非聚集结构的表达产物的水平或比例。在实施方案中，该方法包括提供参数的值。在实施方案中，该方法包括将参数的值与参考值比较。
在本文所述的任何方法或组合物的实施方案中，蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对与细胞功能相关的参数的影响值超过参考值达5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在实施方案中，蛋白质降解抑制剂(例如蛋白酶体抑制剂)对与细胞功能相关的参数的影响的值超过参考值达1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或8倍或更多倍。在实施方案中，参考值是蛋白质降解抑制剂对参考细胞的细胞功能相关的参数的影响值或者对与尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞的细胞功能相关的参数的影响值。在实施方案中，参数包括产生产物的能力，例如多肽，例如重组多肽，例如从外源核酸表达的重组多肽。在实施方案中，参数包括产生产物(例如多肽，例如重组多肽)的能力，并且其中通过测量或定量细胞中或由细胞分泌的产物(例如，多肽，例如重组多肽)来确定增加。在实施方案中，参数包括细胞存活，并且其中通过测量或定量凋亡细胞的数目来确定增加或减少。在实施方案中，参数包括培养物存活力，并且其中通过测量或定量活细胞的数目来确定增加或减少。
在重组多肽从细胞分泌的实施方案中，该方法可以包括从细胞、细胞群体或培养细胞的培养基中回收、收集或分离重组多肽的步骤。
在本文所述的任何制剂的某些实施方案中，制剂中按重量或数目计至少70、80、90、95、98或99％的多肽是正确折叠或功能活性的。
在本文所述的任何混合物的某些实施方案中，按重量或数目计，所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽以比尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞中看到的浓度更高的浓度存在，例如，至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的浓度；或
其中按重量或数目计，所述混合物中的所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
在本文所述的任何培养基制剂的某些实施方案中，按重量或数目计，所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽以比尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞中看到的浓度更高的浓度存在，例如，高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或30％的浓度；或
其中按重量或数目计，所述混合物中的所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
在实施方案中，本文所述的任何方法还可以包括步骤(f)、(g)或(f)和(g)两者中任一项：
f)在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养细胞或细胞后代(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代或至少12、24、48、72小时)；
g)评估由细胞或细胞后代产生的重组蛋白的水平，例如，以获得由细胞或细胞后代产生的重组蛋白的值；和
h)任选地，将g)中获得的值与所述参考值比较，其中所述参考值是由在缺乏外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养的与a)中提供的细胞相同类型的细胞产生的重组蛋白的水平。
在实施方案中，例如，本文的生成方法的实施方案，该方法还包括选择用于制备重组蛋白(例如重组治疗性蛋白)的方法的细胞。在实施方案中，该方法还包括将外源核酸导入细胞中(例如，在步骤c)之后、在步骤d)之后、在步骤e)之后或在步骤f)之后)，任选地，其中导入外源核酸包括转染、电穿孔或转导。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。另外，材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等，仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素按字母次序执行，或者步骤或元素必须彼此分离。根据说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图简述
图1A-1C是一系列图，其显示了对各种浓度的指定蛋白质降解抑制剂对重组CHO细胞系生长参数的初步评估。在指定的时间点取样，并在ViCell仪器上测定细胞浓度和培养物存活率(％)。
图2A-2F是一系列图，其显示了对各种浓度的指定蛋白质降解抑制剂对重组CHO细胞系生长参数的进一步评估。在指定的时间点取样，并在ViCell仪器上测定细胞浓度和培养物存活率(％)。
图3A-3D是一系列图，其显示了当在存在MG132的情况下培养时产生CHO抗体的细胞系组的活细胞浓度和培养物存活力。在存在0.5μM MG132(带阴影的条)或DMSO(带虚线阴影的条)的情况下培养24和48小时后的平均活细胞浓度和培养物存活力。误差棒显示在每个时间点取得的一式三份样品的标准偏差。
图4A-4D是一系列图，其显示了当在存在环氧霉素的情况下培养时产生CHO抗体的细胞系组的活培养细胞浓度和培养物存活力。在存在0.05μM环氧霉素(带阴影的条)或DMSO(带虚线阴影的条)的情况下培养24和48小时后的平均活细胞浓度和培养物存活力。误差棒显示在每个时间点取得的一式三份样品的标准偏差。
图5A-5D是一系列图，其显示了当在存在eeyarestatin I的情况下培养时产生CHO抗体的细胞系组的活细胞浓度和培养物存活力。在存在10μM eeyarestatinI(带阴影的条)或DMSO(带虚线阴影的条)的情况下培养24和48小时后的平均活细胞浓度和培养物存活力。误差棒显示在每个时间点取得的一式三份样品的标准偏差。
图6A-6G是一系列图，其显示了在一种蛋白酶体和ERAD抑制剂浓度时，蛋白酶体和ERAD抑制剂的易感性(例如，在存在抑制剂的情况下的培养物存活力和/或活细胞浓度)与来自产生单克隆抗体的CHO细胞系组的补料分批和生物反应器培养物的生产率数据之间的相关性。绘制数据并通过线性回归分析鉴定最佳拟合线。使用皮尔逊积差相关(PearsonProduct Moment Correlation)系数评估参数之间的关系。显示发现统计学显著的相关性(p<0.05)。
图7A-7F是一系列凝胶图像，其显示了使用活性谱分析(profiling)探针和荧光强度分析蛋白酶体活性。使用具有不同反应基团的荧光标记活性探针在一系列抗体产生细胞系中测定蛋白酶体活性。在14％SDS-PAGE上分析与探针一起温育的细胞裂解物，然后使用Cy3和Cy2滤器在Typhoon 9400仪器上测量荧光。图7A和7B显示MV151探针，图7C和7D显示MVB003探针，而图7E和7F显示MVB072探针。右手图像(图7B、7D和7F)显示考马斯蓝染色图像作为加载对照。
图8A-8F是一系列图像，其显示了使用活性谱分析探针和荧光强度分析蛋白酶体活性。使用具有不同反应基团的荧光标记活性探针在一系列抗体产生细胞系中测定蛋白酶体活性。在14％SDS-PAGE上分析与探针一起温育的细胞裂解物，然后使用Cy3和Cy2滤器在Typhoon 9400上测量荧光。图8A和8B显示RUB1001探针，图8C和8D显示RUB1018探针，而图8E和8F显示无探针对照。右手图像(图8B、8D和8F)显示考马斯蓝染色的图像作为加载对照。
图9A-9F是一系列图，其显示了如使用基于活性的谱分析方法和随后的条带强度定量测定的蛋白酶体的不同催化亚基的活性。使用Life TechnologiesImage对来自图7A、7C和7E、8A、8C和8E中的凝胶的条带进行密度测定。图表显示了每种测试探针的条带强度以及总蛋白酶体图中总结的所有探针的总和。
图10是描绘用CHOK1 GS-KO细胞系构建细胞系的方案的示意图。在转染40μg线性化DNA后24小时进行一系列浓度的甲硫氨酸硫酰亚胺(MSX)选择。然后遵循实验计划的设计以一系列浓度和组合在转染后24、96或168小时加入蛋白酶体抑制剂。
图11的图显示了在MSX和不同的蛋白酶体抑制剂选择压力的情况下使用细胞系构建过程产生的细胞群体的生长特征。除了MSX之外，在用蛋白酶体抑制剂构建细胞系后每48-72小时测定表达模型单克隆抗体(抗体A)的GSKO细胞合并物的培养物存活力和活细胞浓度。
图12的图显示了从在MSX和不同的蛋白酶体抑制剂选择压力及不同选择压力的情况下使用细胞系构建过程产生的细胞群体实现的抗体浓度。在分批培养条件下培养表达抗体A的GSKO细胞系，并且除了MSX选择压力之外，用蛋白酶体抑制剂在构建细胞系后培养192小时后收集的上清液进行ELISA测定。
图13描绘了评估在细胞系构建期间本文所述的示例性蛋白酶体抑制剂的使用的实验设计。
图14是条形图，其描绘了从在存在抑制剂的情况下连续培养的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的平均单克隆抗体产物浓度。评估来自上清液样品的cB72.3单克隆抗体浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后20mL分批培养物的48、66和168小时采集。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度(对于37.5μM MSX对照，n ＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。
图15描绘了从在存在抑制剂的情况下连续培养的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的单克隆抗体产物的western印迹分析。评估来自上清液样品的cB72.3浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后培养168小时采集。使用抗重链抗体(Sigma)探测Western印迹。
图16是柱状图，其描绘了从在缺乏抑制剂的情况下培养两代的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的平均单克隆抗体产物浓度。评估来自上清液样品的cB72.3单克隆抗体浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后20mL分批培养物的48、96和168小时采集。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度(对于37.5μM MSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。
图17描绘了从在缺乏抑制剂的情况下培养两代的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后的单克隆抗体产物的western印迹分析。评估来自上清液样品的cB72.3浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后培养168小时采集。在进行取样分批培养物之前，在缺乏抑制剂的情况下将细胞合并物传代两次。使用抗重链抗体(Sigma)探测Western印迹。
图18是柱状图，其描绘了在用抑制剂处理后立即在细胞系构建过程后计算的平均比生产率(average specific productivity)。从在来自上清液样品的活细胞数目(在Vicell上测定)和产物浓度(在octet系统上使用蛋白A探针得出)上收集的数据计算比生产率，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后培养48、96和168小时采集。计算每个细胞合并物的个别比活性，然后测定每个处理的平均值(对于37.5μM MSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。
图19是柱状图，其描绘了从在缺乏抑制剂的情况下培养两代的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的计算的平均细胞单克隆抗体比生产率。从在自上清液样品测定的细胞数目(在Vicell上测定)和产物浓度(在octet系统上使用蛋白A探针得出)计算比生产率，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后分批培养48、96和168小时采集。计算每个细胞合并物的个别比活性，然后测定每个处理的平均值(对于37.5μM MSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。
图20是柱状图，其描绘了在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下培养后，在宿主细胞合并物的分批培养中瞬时转染后实现的抗体产物浓度。在用20μg DNA电穿孔1x107个细胞并重悬浮于20ml培养物中后在转染后48、96和168小时采集的上清液样品中评估cB72.3浓度。在电穿孔之前，在存在指定浓度的指定蛋白酶体和ERAD抑制剂的情况下培养宿主细胞系。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度。
图21是条形图，其描绘了在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下初始培养，然后在缺乏抑制剂的情况下后续传代培养2代，之后瞬时分批培养后瞬时转染CHO宿主细胞合并物后实现的抗体产物浓度。在用20μg DNA电穿孔1x107个细胞并重悬浮于20ml分批培养物中后在转染后48、96和168小时采集的上清液样品中评估cB72.3浓度。在电穿孔之前，最初在存在蛋白酶体和ERAD抑制剂的情况下培养宿主细胞系，然后在缺乏抑制剂的情况下传代两次。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度。
图22描绘了在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下培养后立即(左凝胶)，或者在缺乏抑制剂的情况下传代培养两代后(右凝胶)瞬时转染宿主细胞合并物后分批培养物的上清液中的抗体的Western印迹分析。在用20μg DNA电穿孔1x107个细胞并重悬浮于20ml分批培养物中后，在转染后168小时取得的上清液样品中评估cB72.3浓度。在电穿孔之前，最初在存在蛋白酶体和ERAD抑制剂的情况下培养宿主细胞系，然后在缺乏抑制剂的情况下传代两次。使用抗重链抗体(Sigma)探测Western印迹。
图23是柱状图，其描绘了从在不同传代数目时使用蛋白质降解抑制剂产生的重组细胞合并物的常规培养期间采集的上清液样品测定的估计的细胞比生产率。评估来自上清液样品的cB72.3浓度，所述上清液样品在从添加蛋白酶体抑制剂的情况下的细胞系构建过程中复苏成功的合并物后每3-4天在常规传代培养期间采集。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度，然后使用在ViCell上测定的细胞计数确定每个细胞的产物水平。
发明详述
重组蛋白或多肽可以通过重组DNA技术产生，由宿主细胞表达，并且可以从宿主细胞(例如，大肠杆菌)中纯化或分泌到培养宿主细胞的流体中，例如细胞培养基，并且从流体纯化。在本领域中非常期望能够以高产率和适当质量产生重组蛋白或多肽的细胞。本文公开的用于评估、分类、鉴定、生成或选择用于产生重组多肽的细胞的方法可用于鉴定或生成高生产率细胞，获得重组多肽产物的高产率或提供更高质量的重组多肽产物制剂。本文公开的方法特别可用于重组治疗性多肽的生产，其中需要有效的细胞系开发，大量的重组治疗性多肽产物，以及用于患者的治疗用途的高质量等级。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践和/或测试，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，以下定义应当根据其如何定义，定义在何处提供而使用。
还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意图为限制性的。
冠词“一种”和“一个”在本文中用于指该冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“细胞”可以指一个细胞或超过一个细胞。
如本文中可互换使用，术语“蛋白质降解抑制剂”或“蛋白质降解途径抑制剂”是指降低(例如，减缓、减弱、改变)蛋白质降解，例如在蛋白质合成和细胞分泌期间将蛋白质部分或完全还原为其多肽、肽或氨基酸成分的试剂，例如化合物。举例来说，蛋白质降解抑制剂可以通过预防或减少(例如，缓慢、减弱或改变)以下一种或多种的能力来鉴定：鉴定用于降解的蛋白质；标记用于降解的蛋白质；将蛋白质从ER逆移位(retrotranslocation)到胞质溶胶；蛋白质与蛋白酶体的结合或蛋白酶体与蛋白质的结合；蛋白质进入蛋白酶体；蛋白质解折叠以进入蛋白酶体；蛋白酶体加工蛋白质；从蛋白酶体释放加工的肽；蛋白酶体与内质网的结合；和/或细胞的蛋白酶体能力；例如，与未用候选抑制剂处理的类似细胞相比，在用候选抑制剂处理的细胞中。在另一个实施方案中，与未用候选抑制剂处理的类似细胞相比，蛋白质降解抑制剂导致细胞中出现阻止或降低蛋白酶体活性的条件，例如在用候选抑制剂处理的细胞中。在另一个实施方案中，与未用候选抑制剂处理的类似细胞相比，蛋白质降解抑制剂使细胞的蛋白酶体活性饱和，例如在用候选抑制剂处理的细胞中。蛋白质，例如内源或外源表达的蛋白质的蛋白酶体降解可以通过重/轻同位素脉冲标记方法测量或定量，例如通过细胞培养物中的氨基酸进行稳定同位素标记(SILAC)，然后进行质谱术(MS)。在Alvarez-Castelao等,Biochemistry Research International,Volume 2012(2012),文章ID 823597,第11页(其通过引用并入本文)中进一步描述了本领域可用于评估蛋白质降解的其他方法。
如本文所用，术语“蛋白质降解途径”是指导致蛋白质部分或完全还原为其多肽、肽或氨基酸成分的细胞过程，例如错误折叠、过剩、截短或非功能蛋白质的降解。蛋白质降解途径的示例性元件包括但不限于蛋白酶体(例如26S蛋白酶体或其组分，例如20S核心或催化亚基、19S调节亚基或11S调节亚基)、促进要降解或泛素化的蛋白质的鉴定的酶(例如，E1泛素激活酶、E2泛素缀合酶或E3泛素连接酶)；或促进蛋白质从ER移位或逆移位至蛋白质降解途径的另一元件，例如胞质溶胶或蛋白酶体(例如逆移位酶/复合物)的酶。
如本文所用，术语“蛋白酶体抑制剂”是指防止或降低蛋白酶体或蛋白酶体组分的活性的分子。在一个实施方案中，蛋白酶体包含20S催化或蛋白水解核心亚基，和一种或多种调节亚基，例如一种或多种19S调节颗粒和/或一种或多种11S调节颗粒。在实施方案中，蛋白酶体或蛋白酶体组分的活性包括以下一种或多种：蛋白质与蛋白酶体的结合或蛋白酶体与蛋白质的结合；蛋白质进入蛋白酶体；蛋白质的解折叠以进入蛋白酶体；通过蛋白酶体加工蛋白质(例如，将蛋白质部分或完全还原为肽或氨基酸成分)；从蛋白酶体释放源自蛋白质加工的加工肽或氨基酸；和蛋白酶体与内质网的结合。在一个实施方案中，与在缺乏抑制剂的情况下蛋白酶体或其组分活性相比，蛋白酶体抑制剂使蛋白酶体或蛋白酶体组分的活性降低约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
如本文所用，术语“泛素途径抑制剂”是指防止或降低泛素途径的一种或多种组分的活性的分子。泛素途径是鉴定待降解的靶蛋白并用泛素分子标记以供蛋白酶体识别而降解的过程。泛素途径的组分包括泛素激活酶(E1)、泛素缀合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。在实施方案中，泛素途径的一种或多种组分的活性包括以下一种或多种：鉴定用于降解的蛋白质，例如通过E3泛素连接酶或底物鉴定复合物；激活泛素，例如通过E1活化酶；将泛素从E1转移到E2酶；以及将泛素与蛋白质或蛋白质上的泛素分子或链(例如，延长泛素链)缀合，例如，通过E3泛素连接酶；通过去泛素化酶(deubiquitinating enzyme)去泛素化。在一个实施方案中，与在缺乏泛素途径抑制剂的情况下泛素途径的一种或多种组分的活性相比，泛素途径抑制剂将泛素途径的一种或多种组分的活性降低约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、95％或99％或更多。
如本文所用，术语“ERAD抑制剂”是指防止或降低内质网相关降解(ERAD)途径的一种或多种组分的活性的分子。ERAD途径靶向内质网的错误折叠、突变或非功能性蛋白质，用于泛素化和随后由蛋白酶体降解。ERAD途径的组分包括伴侣蛋白，例如Hsp70家族成员、Hsp40家族成员、Hsp90家族成员、核苷酸交换因子、小热休克蛋白、凝集素样伴侣蛋白；鉴定或标记错误折叠蛋白质的酶，例如α-甘露糖苷酶；辅助错误折叠蛋白质的逆移位的酶或蛋白质复合物，例如逆移位复合物(RTC)；泛素化逆移位蛋白的酶或蛋白质复合物，例如Hrd-Der泛素连接酶复合物；以及将泛素化蛋白质递送至蛋白酶体的酶或蛋白质复合物，例如Cdc48-Ufd1-Np14复合物。在实施方案中，ERAD途径的一种或多种组分的活性包括以下一种或多种：鉴定或标记错误折叠的非功能性蛋白质以用于降解；将蛋白质从ER逆移位到胞质溶胶；在ER膜处，例如，整合到ER膜中的蛋白质的泛素化；将泛素化蛋白质递送至蛋白酶体；或蛋白质的去泛素化。在一个实施方案中，与在缺乏ERAD抑制剂的情况下ERAD途径的一种或多种组分的活性相比，ERAD抑制剂将ERAD途径的一种或多种组分的活性降低约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多。
如本文所用，当与蛋白质降解抑制剂结合使用时表述“低浓度”，例如“低浓度的蛋白酶体抑制剂”、“低浓度的泛素化途径抑制剂”或“低浓度的ERAD抑制剂”是指与尚未用蛋白质降解抑制剂处理的培养物相比，当用蛋白质降解抑制剂处理时导致培养物存活力降低，例如降低30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的蛋白质降解抑制剂的浓度。由于使用蛋白质降解抑制剂的目的是鉴定或选择具有改善的生产率或改善的生产质量的细胞，低浓度的蛋白质降解抑制剂是比为了治疗益处而杀死患病细胞，例如癌细胞所使用的浓度小的浓度。应当理解的是，低于30％，例如20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％的培养物存活率仍可以导致具有改善的生产率并产生更好质量的产物的选定细胞的群体，并且也在本公开的范围内。在另一个实施方案中，低浓度的蛋白质降解抑制剂是部分但不完全抑制蛋白质降解，例如与蛋白质降解相关的蛋白质或过程的浓度。举例来说，低浓度的蛋白酶体抑制剂是部分但不完全抑制蛋白质降解的浓度。本文描述了测定蛋白酶体活性(例如抑制蛋白酶体活性)的方法。
如本文所用，术语“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内部天然产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源”是指导入生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。因此，“外源核酸”是指导入生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的核酸。在一个实施方案中，外源核酸的序列不是在导入有外源核酸的生物体、细胞、组织或系统内部天然产生的，或者不是在导入有外源核酸的生物体、细胞、组织或系统内部天然找到的。在一个实施方案中，外源核酸的序列是非天然存在的序列，或编码非天然存在的产物。
如本文所用，术语“异源”是指当导入来自不同物种的生物体、细胞、组织或系统时来自一种物种的任何物质。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可互换使用，并且指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、或其DNA或RNA的组合、和其聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因、cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如，化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限定，否则该术语包括含有具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然或非天然存在的核苷酸相似的方式代谢的天然核苷酸的类似物或衍生物的分子。除非另有指示，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键或通过肽键以外的方式共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的最大氨基酸数目没有限制。在一个实施方案中，蛋白质可包含超过一种，例如，两种、三种、四种、五种或更多种多肽，其中每种多肽通过共价或非共价键/相互作用与另一种多肽结合。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含两个或多个通过肽键或通过肽键以外的方式彼此连接的氨基酸。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其通常在本领域中一般称为蛋白质，其中存在有多种类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽，衍生物、类似物，融合蛋白等。
如本文所用，“产物”是指由经过修饰或工程化改造以产生产物的细胞产生，例如表达的分子、核酸、多肽或其任何杂合物。在一个实施方案中，产物是天然存在的产物或非天然存在的产物，例如合成产物。在一个实施方案中，产物的一部分是天然存在的，而产物的另一部分是非天然存在的。在一个实施方案中，产物是多肽，例如重组多肽。在一个实施方案中，该产物适用于诊断或临床前使用。在另一个实施方案中，该产物适用于治疗用途，例如用于治疗疾病。在一个实施方案中，产物选自表1或表2。在一个实施方案中，经修饰的或工程化的细胞包含控制表达或编码产物的外源核酸。在其他实施方案中，经修饰或改造化的细胞包含控制细胞中产物的表达或构建的其他分子，例如其不是核酸。
在一个实施方案中，细胞的修饰包括导入外源核酸，所述外源核酸包含控制或改变(例如，增加)内源核酸序列(例如内源基因)表达的核酸序列。在此类实施方案中，经修饰的细胞产生由细胞天然或内源表达的内源多肽产物，但是与未修饰的细胞相比，例如与多肽的内源产生或质量相比修饰增加产物的产生和/或产物的质量。
在另一个实施方案中，细胞的修饰包括导入编码如本文所述的重组多肽的外源核酸。在此类实施方案中，经修饰的细胞产生可以是天然存在的或非天然存在的重组多肽产物。在此类实施方案中，经修饰的细胞产生重组多肽产物，其也可以由细胞内源表达或不由细胞内源表达。在重组多肽产物也由细胞内源表达的实施方案中，与未修饰的细胞相比，例如，与多肽的内源产生或质量相比，修饰增加产物的产生和/或质量。
如本文所用，“重组多肽”或“重组蛋白”是指可以由本文所述的细胞产生的多肽。重组多肽是编码多肽的序列的至少一个核苷酸或控制多肽表达的序列的至少一个核苷酸通过(细胞或前体细胞)的遗传工程形成的多肽；例如，改变至少一个核苷酸，例如，将其导入细胞中或者它是遗传工程化重排的产物。在一个实施方案中，重组多肽的序列不与多肽或蛋白质的天然存在的同种型不同。在一个实施方案中，重组多肽的氨基酸序列不同于多肽或蛋白质的天然存在的同种型的序列。在一个实施方案中，重组多肽和细胞来自相同物种。在一个实施方案中，重组多肽对细胞是内源的，换言之，细胞来自第一物种，并且重组多肽对于所述第一物种是天然的。在一个实施方案中，重组多肽的氨基酸序列与由细胞的内源基因组编码的多肽相同或基本上相同，或相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。在一个实施方案中，重组多肽和细胞来自不同的物种，例如，重组多肽是人多肽，而细胞是非人细胞，例如啮齿类细胞，例如CHO，或昆虫细胞。在一个实施方案中，重组多肽对细胞是外源的，换言之，细胞来自第一物种，而重组多肽来自第二物种。在一个实施方案中，多肽是合成多肽。在一个实施方案中，多肽衍生自非天然存在的来源。在一个实施方案中，重组多肽是人多肽或蛋白质，其在氨基酸序列上不与人多肽或蛋白质的天然存在的同种型不同。在一个实施方案中，重组多肽与人多肽或蛋白质的天然存在的同种型在不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基处不同。在一个实施方案中，重组多肽与人多肽的天然存在的同种型相差其氨基酸残基的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或15％。
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。虽然已经参考具体方面公开了本发明，但是显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域技术人员可以设计出本发明的其他方面和变化。所附权利要求书意图解释为包括所有这些方面和等同变化。
调节蛋白质降解途径
在细胞系构建，例如重组细胞系构建期间，当超过细胞的折叠和修饰能力时，在细胞内触发细胞过程。ER应激期间的未折叠蛋白应答(UPR)和ER相关降解(ERAD)是处理蛋白质合成期间的错误折叠或未组装蛋白质的关键细胞过程。通过这些过程激活的关键应答包括ER伴侣蛋白上调、通过减少翻译起始减少全局蛋白质合成、以及最终(如果应激持续的话)凋亡(Schroder和Kaufman 2005；Chakrabarti等人2011)。提出30％的新翻译的多肽被靶向降解，可能是错误折叠的结果(Du等人2013；Schubert等人2000；Yewdell和Nicchitta2006)。认为这些过程不仅有助于维持蛋白质质量，而且还提供“再循环”氨基酸的重要来源，作为新多肽合成的新构件。因此，重要的是细胞具有适当的机制来处理和再循环错误折叠的多肽的组分并维持质量控制过程。
ERAD要求注定用于破坏的ER中的多肽/蛋白质从ER转运回到细胞溶质，例如逆移位，其中它们被蛋白酶体降解(Olzmann等人，2013)。如果不能恢复稳态，那么UPR激活的过程最终可以导致凋亡。UPR给细胞提供在高需求期期间调节ER容量的能力，并且认为UPR诱导的元件有益于重组蛋白质产率，然而过量且长期的激活对细胞和培养物存活力可以是有害的。
本公开内容部分基于以下研究的结果，即确定细胞从ER起始蛋白质周转(turnover)的能力是否与细胞产生重组多肽的能力相关，并且进一步地，抑制蛋白质降解途径(例如通过抑制ERAD期间蛋白酶体活性或多肽转运出ER)是否可以用于选择具有这些过程的增强的能力的细胞，所述过程继而将反映它们产生重组蛋白质的能力。本公开提供了方法和组合物，用于使用蛋白质降解抑制剂来鉴定或选择具有产物，例如重组多肽的高产量的能力的细胞，以及产生具有增加产量的重组细胞系，例如产生更高产率的重组多肽产物，和/或可以产生更高质量的重组多肽产物。
蛋白质降解抑制剂
本文描述的方法包括使细胞或细胞群体与蛋白质降解抑制剂接触。在一个实施方案中，本文所述的蛋白质降解抑制剂抑制或降低参与蛋白质降解途径，例如蛋白酶体降解、ER相关降解途径和/或泛素途径的过程或蛋白质的活性。如本文所述，蛋白质降解抑制剂可以包括但不限于蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂或ERAD抑制剂。在一个实施方案中，抑制剂可以是可逆的或不可逆的。在实施方案中，抑制剂可以是小分子、核酸或多肽。
蛋白酶体是大的多酶复合物，其包含一种或多种蛋白质消化酶，例如蛋白酶。26S蛋白酶体包含20S蛋白水解核心亚基和一个或两个19S调节颗粒。20S核心包含三种类型的活动位点，例如蛋白水解或肽酶位点。在实施方案中，本文所述的蛋白酶体抑制剂可以抑制或降低蛋白酶体的任何组分的活性。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂结合和/或抑制蛋白酶体组分的一个或多个活性位点，例如20S蛋白水解核心的一个或多个活性位点。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂抑制或降低20S蛋白水解核心的活性。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂抑制或降低19S调节颗粒的活性。在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂抑制或降低蛋白酶，例如胰蛋白酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶蛋白酶或钙蛋白酶(calpain)的活性。在一个实施方案中，与在缺乏抑制剂的情况下的蛋白酶体或其组分的活性相比，蛋白酶体抑制剂将蛋白酶体或蛋白酶体组分的活性降低约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂选自MG132或环氧霉素。其他示例性蛋白酶体抑制剂是本领域已知的，包括但不限于Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)2(MG262)、硼替佐米(PS-341，Velcade，吡嗪羰基-Phe-Leu-硼酸盐)、卡非佐米(carfilzomib)(PR-171)、marizomib、MLN9708(Ninlaro)、埃沙佐米(ixazomib)(MLN2238)、oprozomib(ONX 0912)、delanzomib(CEP-18770)、CEP1612、南蛇藤醇(celastrol)、ONX-0914(PR-957)、双硫仑(disulfiram)、epigallocatchin-3-gallate、盐孢酰胺A、AM114、乳胞素(lactacystin)、ps-341、eponomicin、Z-Leu-Leu-LeuVS、MG115、钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)、PSI和钙蛋白酶(calpain)抑制剂II。其他示例性蛋白酶体抑制剂包括NVLS、PS-519、antiprotealide、氟盐孢酰胺(fluorosalinosporamide)和cinnabaramides(例如Cinnabaramides A-G)。
蛋白酶体抑制剂可以是Dick等,Biochem.30:2725(1991)；Goldberg等,Nature357:375(1992)；Goldberg,Eur.Biochem.203:9(1992)；Orlowski,Biochem.29:10289(1989)；Rivett等,Archs.Biochem.Biophys.218:1(1989)；Rivett等,J.Biol.Chem.264:12,215(1989)；Tanaka等,New Biol.4:1(1992),和美国专利No.5,693,617中描述的任一种。
蛋白酶体抑制剂可以是肽醛或在P1位置中含有疏水残基的肽α-酮酯，如记载于Vinitsky等(Biochem.31:9421(1992)，也参见Orlowski等,Biochem.32:1563(1993))，其表征为蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制剂。蛋白酶体抑制剂可以是三肽，例如Ac-Leu-Leu-Leu-H、Ac-Leu-Leu-Met-OR、Ac-Leu-Leu-Nle-OR、Ac-Leu-Leu-Leu-OR、Ac-Leu-Leu-Arg-H、Z-Leu-Leu-Leu-H、Z-Arg-Leu-Phe-H和Z-Arg-Ile-Phe-H其中OR与前面的氨基酸残基的羰基一起代表酯基。
如由Siman等人(WO 01/13904)所公开，蛋白酶体抑制剂可以是糜蛋白酶样蛋白酶的抑制剂。这些抑制剂具有式R-A4-A3-A2-Y，其中R是氢，或N-末端封闭基团；A4是共价键、氨基酸或肽；A3是共价键、D-氨基酸、Phe、Tyr、Val或Val的保守氨基酸取代；A2是疏水性氨基酸或赖氨酸或其保守氨基酸取代，或者当A4包括至少两个氨基酸时，A2是任何氨基酸；并且Y是与所述蛋白酶的活性位点有反应的基团。蛋白酶体抑制剂也可以是可用于抑制丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的肽酮酰胺、酮酸或酮酯，如Powers(WO 92/12140)中所述。蛋白酶体抑制剂也可以是如Bartus等人(WO 92/1850)描述的钙蛋白酶抑制剂化合物。
其他蛋白酶体抑制剂包括但不限于：钙蛋白酶抑制剂I、MG101、钙蛋白酶抑制剂II、级份I(FrI，Hela)、级份II(FII)、诱裂-乳酶素β-内酯(clasto-Lactacystin beta-lactone)(omuralide)、乳胞素(Lactacystin)、MG-115、针对NEDD8的抗血清、PA28活化剂、20S蛋白酶体、针对蛋白酶体20Sα-1型亚基的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S10B的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S2的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S4的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S5A的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S6的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S6'的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S7的多克隆抗体、针对蛋白酶体26S亚基S8的多克隆抗体、针对蛋白酶体活化剂PA28α的多克隆抗体、针对蛋白酶体激活剂PA28γ的多克隆抗体、针对蛋白酶体激活剂PA700亚基10B的多克隆抗体、26S蛋白酶体级份、蛋白酶体抑制剂I、蛋白酶体抑制剂II、蛋白酶体底物I(产荧光)、蛋白酶体底物II(产荧光)、蛋白酶体底物III(产荧光)、蛋白酶体底物IV(产荧光)、S-100级份、SUMO-1/Sentrin-1(1-101)、SUMO-1/Sentrin-1(1-97)、针对SUMO-1/Sentrin-1的抗血清、Ubc10、Ubc5b、Ubc5c、Ubc6、Ubc7、针对Ubc9的抗血清、Ubc9、UbCH2/E2-14K、UbCH3/Cdc34、UbCH5a、泛素激活酶(E1)、泛素激活酶(E1)、泛素醛、泛素缀合酶级份、泛素C-末端水解酶、泛素K48R、甲基化泛素、GST-泛素、(His)6泛素、泛素-AMC、泛素-Sepharose。
除了已知的蛋白酶体抑制剂之外，可以对可用于本文所述的方法的蛋白酶体抑制剂常规测试其抑制蛋白酶体活性的能力。本领域举例说明了用于鉴定此类抑制剂的各种策略。例如，可以对通常包含来自植物或更简单生物体的提取物的小分子文库筛选其抑制蛋白酶体或特定蛋白酶类型的能力。或者，可以使用例如专门设计用于与蛋白酶体组分的活性位点相互作用的肽或拟肽化合物来应用合理的设计方法(参见例如Siman等,WO91/13904；Powers等,于Proteinase Inhibitors,Barrett等(编),Elsevier,第55-152页(1986))。抑制剂可以是催化过渡态的稳定类似物，例如Z-Gly-Gly-Leu-H，其抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性(Orlowski,Biochemistry 29:10289(1990)；还可见Kennedy andSchultz,Biochem.18:349(1979))。
此外，文献中报道的多种天然和化学蛋白酶体抑制剂或其类似物意图包括在本发明中，包括但不限于含有α-二酮或α-酮酯的肽、肽氯甲基酮、肽环氧酮、肽乙烯基砜、含β-内酯的化合物、肽硼酸盐异香豆素、肽磺酰氟、肽基硼酸酯、肽环氧化物和肽基重氮甲烷。Angelastro等,J.Med.Chem.33:11(1990)；Bey等,EPO 363,284；Bey等,EPO 363,284；Bey等,EPO 364,344；Grubb等,WO 88/10266；Higuchi等,EPO 393,457；Ewoldt等,Mol.Immunol.29(6):713(1992)；Hernandez等,J.Med.Chem.35(6):1121(1992)；Vlasak等,J.Virol.63(5):2056(1989)；Hudig等,J.Immunol.147(4):1360(1991)；Odakc等,Biochem.30(8):2217(1991)；Vijayalakshmi等,Biochem.30(8):2175(1991)；Kam等,Thrombosis and Haemostasis64(1):133(1990)；Powers等,J.Cell.Biochem.39(1):33(1989)；Powers等,Proteinase Inhibitors,Barrett等,Eds.,Elsevier,pp.55-152(1986)；Powers等,Biochem 29(12):3108(1990)；Oweida等,Thrombosis Res.58(2):391(1990)；Hudig等,Mol.Immunol.26(8):793(1989)；Orlowski等,Arch.Biochem.andBiophys.269(1):125(1989)；Zunino等,Biochem.et Biophys.Acta 967(3):331(1988)；Kam等,Biochem.27(7):2547(1988)；Parkes等,Biochem.J.230:509(1985)；Green等,J.Biol.Chem.256:1923(1981)；Angliker等,Biochem.J.241:871(1987)；Puri等,Arch.Biochem.Biophys.27:346(1989)；Hanada等,Proteinase Inhibitors:Medical andBiological Aspects,Katunuma等编,Springer-Verlag pp.25-36(1983)；Kajiwara等,Biochem.Int.15:935(1987)；Rao等,Thromb.Res.47:635(1987)；Tsujinaka等,Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1201(1988))。
蛋白酶体活性可以通过本领域已知并且如本文所述，例如在实施例1和4中所述的蛋白酶体活性测定法测量。
泛素化在蛋白质降解中起关键作用。泛素是一种小的8.5kDa蛋白质，其通过泛素甘氨酸的羧酸基团与底物蛋白质中赖氨酸的ε氨基之间的异肽键附着到底物蛋白质。底物蛋白的泛素化发生在三个主要步骤中：1)通过ATP依赖性E1泛素激活酶(在本文中也称为E1)激活泛素；2)泛素从E2转移到E2泛素缀合酶(在本文中也称为E2)的活性位点；3)通过E3泛素连接酶(在本文中也称为E3)将泛素连接到底物蛋白，例如在泛素分子和底物蛋白之间形成异肽键。泛素化的蛋白质被蛋白酶体靶向降解。在一个实施方案中，与缺乏泛素途径抑制剂的情况下泛素途径的一种或多种组分的活性相比，泛素途径抑制剂将泛素途径的一种或多种组分的活性降低约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多。
在一个实施方案中，本文所述的泛素途径抑制剂可以抑制泛素化级联中涉及的任何步骤或酶。例如，泛素化抑制剂可以抑制或降低E1、E2或E3中的一种或多种，例如一种、两种或全部的活性。在一个实施方案中，泛素途径抑制剂抑制或降低本领域已知的任何E1、E2或E3的活性。例如，E3泛素连接酶包括但不限于APC/C泛素连接酶、HECT E3泛素连接酶、β-TrCP1连接酶、MDM2和SCF泛素连接酶。
在一个实施方案中，泛素途径抑制剂是(-)-小白菊内酯(parthenolide)、沙利度胺(thalidomide)、TAME、A01(Tocris,产品目录编号5397)、Apcin(R&D Systems,产品目录编号I-444)、GS143(Tocris,产品目录编号5636)、Heclin(Tocris,产品目录编号5433)、HLI373(Tocris,产品目录编号3503)、NSC 66811(Tocris,产品目录编号2936)、NSC-687852(Biovision,产品目录编号2021-5)、NAB 2(R&D Systems,产品目录编号5131)、Nutlin-3(Tocris,产品目录编号3984)、PRT 4165(Tocris,产品目录编号5047)、PTC 209(Tocris,产品目录编号5191)、RITA(Tocris,产品目录编号2443)、SKPin C1(Tocris,产品目录编号4817)、SMER3(Tocris,产品目录编号437)、SP141(Tocris,产品目录编号5332)、SZL P1-31(Tocris,产品目录编号5076)、盐酸TAME(Tocris,产品目录编号4506)、proTAME(R&DSystems,Cat No.I-440)或TCID(Biovision,Cat.No.2204-5)。
可以通过本领域已知的泛素化测定法来测量泛素化。
通过ER相关降解从ER中消除错误折叠的蛋白质涉及例如鉴定和标记待降解的错误折叠蛋白质，错误折叠的蛋白质从ER腔逆移位到胞质溶胶中，蛋白质泛素化，以及递送到蛋白酶体进行降解。蛋白质复合物，p97-Ufd1-Npl4ATP酶复合物水解ATP以使泛素化的蛋白质移位到胞质溶胶中。p97相关的去泛素化酶防止p97-Ufd1-Np14βATP酶复合物自身的组分被蛋白酶体靶向，例如泛素化并降解。因此，在一个实施方案中，ERAD抑制剂抑制或降低p97-Ufd1-Np14ATP酶复合物的一种或多种组分的活性，例如，抑制或降低p97-Ufd1-Np14ATP酶复合物的ATP酶活性。在一个实施方案中，与在缺乏ERAD抑制剂的情况下ERAD途径的一种或多种组分的活性相比，ERAD抑制剂将ERAD途径的一种或多种组分的活性降低约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多。
在一个实施方案中，ERAD抑制剂抑制或降低ERAD途径的一种或多种组分的活性。ERAD途径的组分包括但不限于Hsp70家族成员、Hsp40家族成员、Hsp90家族成员、核苷酸交换因子(NEF)(例如Nhs、Bag-1)、Rot1、钙联接蛋白、钙网织蛋白(calnexin)、α-甘露糖苷酶(Mns1)、ER降解增强性α-甘露糖苷酶样蛋白(EDEM)、Kar2、Sec61复合物(成分包括例如Sec61α和Sec61γ)、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、Yos9、Cdc48p、p97、VCP/p97复合物、Hrd1、Doa10、Ubc1、Cue1、Ubc6、和Ubc7。
在一个实施方案中，ERAD抑制剂包括但不限于eeyarestatin I(也称为ESI)、cotransin、CAM741、阿普拉毒素(apratoxin)A、外毒素A、HUN-7293、decatransin、缬氨霉素、霉内酯(mycolactone)、NSC 630668-R/1(也称为R/1)、MAL3-39、MAL3-101、E6小檗胺、蛇孢假壳素(Ophiobolin)A、CADA环三唑二磺酰胺(cyclotriazadisulfoniamide)，例如Kalies等,2015,Traffic,16:1027-1038(其通过引用并入本文)中描述的抑制剂。
在一个实施方案中，在本文的方法中使用如本文所述的一种或多种蛋白质降解抑制剂。例如，使用如本文所述的两种、三种、四种或五种或更多种蛋白质降解抑制剂。在一个实施方案中，两种或更多种蛋白质降解抑制剂可以破坏蛋白质降解途径中的相同过程，例如，两种或更多种抑制剂抑制或降低蛋白酶体活性。在一个备选实施方案中，两种或更多种蛋白质降解抑制剂破坏蛋白质降解途径中的不同过程，例如，一种抑制剂抑制或降低蛋白酶体活性，而另一种抑制剂抑制或降低ERAD活性或泛素途径。
确定蛋白质降解抑制剂的适当浓度完全在普通技术人员的技能范围内。用于测定此类抑制剂的浓度，例如测定适当浓度的抑制剂以获得期望的培养物存活力和/或蛋白质降解抑制，例如蛋白酶体抑制的测定法记载于本文和本文的实施例中。用于本文所述方法的蛋白质降解抑制剂的适当浓度可以在不同细胞类型或来自不同物种的细胞中不同。在本文所述的实施方案中，与尚未与蛋白酶体抑制剂接触的细胞相比，或与已与蛋白酶体抑制剂接触的参照细胞相比，测定蛋白酶体活性的抑制或降低。
在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用低浓度的蛋白质降解抑制剂。对于在接触，例如暴露于如本文所述的蛋白质降解抑制剂之前已经经历一个或多个选择步骤的细胞，低浓度的蛋白质降解抑制剂可以是优选的。举例来说，在进行选择以鉴定已将外源核酸稳定整合到基因组中的细胞后，向细胞施用低浓度的蛋白质降解抑制剂。
在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是导致蛋白质降解的抑制或降低，例如如本文中所述的蛋白酶体的一种或多种组分的活性、泛素途径或ERAD途径的抑制或降低的浓度。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是导致由蛋白质降解抑制剂接触，例如在存在蛋白质降解抑制剂的情况下培养的培养物或细胞群体中的约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多的培养物存活力(例如20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多的细胞在由本文所述的蛋白质降解抑制剂接触，例如在存在蛋白质降解抑制剂的情况下培养的细胞群体中是存活的或存活)的浓度。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂的浓度是由蛋白质降解抑制剂接触的细胞的某个部分继续增殖的浓度，例如，当由蛋白质降解抑制剂接触，在存在蛋白质降解抑制剂的情况下培养时，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多的细胞继续增殖。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质降解抑制剂的浓度导致在使细胞与蛋白质降解抑制剂接触，例如在存在蛋白质降解抑制剂的情况下培养细胞后剩余细胞的总数目的小于20％，例如15％、10％、5％、1％、0.5％、或0.1％。
在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂是MG-132。MG-132已经以1.5μM使用以诱导凋亡(Meriin等人，1998)。在一个实施方案中，适用于本文所述方法的MG-132的浓度小于1.5μM、小于1.25μM、小于1.0μM、小于0.9μM、小于0.8μM、小于0.7μM、小于0.6μM、小于0.5μM、小于0.4μM、小于0.3μM、小于0.2μM、小于0.1μM、小于0.09μM、小于0.08μM、小于0.07μM、小于0.06μM、小于0.05μM、小于0.04μM、小于0.03μM、小于0.02μM、小于0.01μM、或小于0.005μM。在一个实施方案中，MG-132的浓度为约0.1μM或0.0625μM。
在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂是环氧霉素。已经显示了0.04-0.08μM的环氧霉素浓度抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶活性(Meng等人，1999)。在一个实施方案中，适用于本文所述方法的环氧霉素浓度小于0.08μM、小于0.07μM、小于0.06μM、小于0.05μM、小于0.04μM、小于0.03μM、小于0.02μM、小于0.01μM、小于0.009μM、小于0.008μM、小于0.007μM、小于0.006μM、小于0.005μM、小于0.004μM、小于0.003μM、小于0.002μM、小于0.001μM、小于0.009μM、小于0.008μM、小于0.007μM、小于0.006μM、小于0.005μM、小于0.004μM、小于0.003μM、小于0.002μM、或小于0.001μM。在一个实施方案中，环氧霉素的浓度为约0.05μM或0.025μM。
在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂是eeyarestatin I。先前已经在体内显示了8μM的eeyarestatin I的浓度足以阻断ER移位(Cross等人2009)。在一个实施方案中，适用于本文所述方法的eeyarestatin I的浓度小于20μM、小于15μM、小于14μM、小于13μM、小于12μM、小于11μM、小于10μM、小于9μM、小于8μM、小于7μM、小于6μM、小于5μM、小于4μM、小于3μM、小于2μM、小于1μM、或小于0.5μM。
在本文所述的用于评估或鉴定具有某些特征，例如对蛋白质降解抑制剂的易感性的细胞的任何方法中，可以以高通量形式同时筛选一种或多种细胞。例如，可以以分开的等分试样培养细胞，例如在多孔板的不同孔中培养，其中在不同条件下培养或选择每种单独的细胞等分试样。不同的条件可以包括不同浓度的蛋白质降解抑制剂、额外的选择步骤或导入不同的外源核酸。在此类实施方案中，可以使用从每个等分试样确定的与细胞功能相关的一个或多个参数的值的比较来将细胞鉴定、选择或分类为高生产者，或用于进一步开发成高生产细胞系的细胞。
产物和其编码核酸
本文提供了用于鉴定、选择或生成能够产生高产物产率的细胞或细胞系的方法。本公开内容涵盖的产物包括但不限于可以通过例如在细胞中表达产生的分子、核酸、多肽(例如重组多肽)或其杂合物。在一些实施方案中，对细胞进行工程化改造或修饰以产生产物。此类修饰包括导入控制或导致产物产生的分子。例如，通过导入编码多肽(例如重组多肽)的外源核酸来修饰细胞，并在适于产生(例如表达和分泌)多肽(例如重组多肽)的条件下培养细胞。在另一个实例中，通过导入外源核酸来修饰细胞，所述外源核酸控制例如增加由细胞内源表达的多肽的表达，使得所述细胞产生比例如在未修饰的细胞中内源产生的水平或量更高水平或量的多肽。
在实施方案中，通过本文描述的方法鉴定、选择或产生的细胞或细胞系产生可用于治疗医学状况、病症或疾病的产物，例如重组多肽。医学状况、病症或疾病的实例包括但不限于代谢疾病或病症(例如代谢酶缺乏)、内分泌病症(例如激素缺乏)、止血(haemostasis)、血栓形成、造血病症、肺病、胃肠道疾病、免疫调节(如免疫缺陷)、不育、移植，癌症和传染病。
在一些实施方案中，产物是外源蛋白质，例如非由细胞天然表达的蛋白质。产物可以是治疗性蛋白质或诊断蛋白质，例如可用于药物筛选。治疗或诊断蛋白质可以是抗体分子，例如抗体或抗体片段、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、报告蛋白、治疗性肽、或任何这些的结构和/或功能片段或杂合物。
在一个实施方案中，产物(例如重组多肽)是抗体分子。本文包括的产物包括诊断和治疗性抗体分子。诊断抗体分子包括可用于成像技术的抗体，例如单克隆抗体或其抗体片段。治疗性抗体分子适合施用于受试者，例如用于治疗或预防疾病或病症。
抗体分子是衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。在一个实施方案中，抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白质可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。抗体可以是人或人源化抗体。在一个实施方案中，抗体是IgA、IgG、IgD或IgE抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分或其重组变体，并且是指抗原结合结构域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶物，如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体，例如包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，以及抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。抗原结合片段也可以掺入单结构域抗体、maxibodies、微型抗体(minibodies)、纳米抗体(nanobodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-NAR和bis-scFv(参见例如Hollinger andHudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以基于多肽例如III型纤连蛋白(Fn3)将抗原结合片段移植到支架中(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
在下表中提供了在本文描述的方法或细胞中产生的示例性产物，例如多肽，例如重组多肽。
表1.示例性产物
在另一个实施方案中，产物是双特异性分子。如本文所述，双特异性分子包括可结合两种或更多种不同抗原或靶物的分子。在一个实施方案中，双特异性分子包含抗体片段。在一个实施方案中，双特异性分子包含双特异性抗体、双特异性抗体融合蛋白或双特异性抗体缀合物、双特异性T细胞结合剂(BiTE)分子、双重亲和力再靶向(DART)分子、双重作用Fab(DAF)分子、纳米抗体或抗体片段的其他排列，其导致具有识别或结合两种不同抗原的能力的分子。
表2.示例性产物，例如双特异性分子
其他示例性治疗或诊断蛋白质包括但不限于Leader等,“Protein therapeutics:a summary and pharmacological classification”,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:21-39(通过引用并入本文)的表1-10中描述的任何蛋白质；或本文所述的重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能片段。
其他重组产物包括非抗体支架或替代蛋白质支架，例如但不限于：DARPins、affibodies和adnectins。可以工程化改造此类非抗体支架或替代蛋白质支架以识别或结合一种或两种或更多种，例如1、2、3、4或5种或更多种不同的靶物或抗原。
本文还提供了核酸，例如编码产物，例如多肽，例如本文所述的重组多肽的外源核酸。编码期望的重组多肽的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达期望的核酸序列(例如基因)的细胞中筛选文库，通过从已知包含核酸序列的载体中获得该核酸序列，或通过使用标准技术直接从含有核酸序列的细胞和组织中分离。或者，编码重组多肽的核酸可以合成产生，而不是克隆。重组DNA技术和工艺是高度先进的并且在本领域中是完善建立的。因此，具有本文所述的重组多肽的氨基酸序列知识的普通技术人员可以容易地设想或产生编码重组多肽的核酸序列。
在一些实施方案中，外源核酸控制由宿主细胞内源表达的产物的表达。在此类实施方案中，外源核酸包含一种或多种增加内源产物表达的核酸序列(在本文中也称为“内源产物反式激活序列”)。例如，增加内源产物表达的核酸序列包含组成型活性启动子或更强的启动子，例如增加期望位点处的转录，例如增加期望内源基因产物的表达。在导入包含内源产物反式激活序列的外源核酸后，将所述外源核酸整合到细胞的染色体基因组中，例如，在编码内源产物的基因组序列附近的预选位置处，使得内源产物反式激活序列增加期望内源产物的反式激活或表达。用于修饰细胞，例如导入外源核酸以增加内源产物的表达的其它方法记载于例如美国专利号5,272,071，其通过引用整体并入本文。
本文描述的产物的表达通常通过将编码重组多肽或其部分的核酸可操作地连接到启动子上，并将构建体掺入表达载体中来实现。载体可适用于复制和整合真核生物或原核生物。典型的克隆载体含有其他调节元件，例如转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节期望的核酸序列表达的启动子。
可以将编码产物(例如重组多肽)或包含可以控制内源产物表达的核酸序列的本文描述的核酸序列克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。在实施方案中，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等，2012，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)，以及其他病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。衍生自病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)，允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件，例如选择标志物或报告基因。
在一个实施方案中，包含编码多肽(例如LMM或重组多肽)的核酸序列的载体还包含启动子序列，其负责募集聚合酶以使得能够转录起始以表达多肽，例如LMM或重组多肽。在一个实施方案中，适合于本文所述方法的启动子序列通常与增强子结合，以驱动大量转录并且因此递送大拷贝的靶外源mRNA。在一个实施方案中，启动子包含巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子(Chernajovsky,Moryetal.1984)，衍生自其同名病毒或自其衍生的启动子。已经成功采用几种其它不太常见的病毒启动子以在表达载体中纳入后驱动转录，包括劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)和Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)LTR(Papadakis,Nicklinetal.2004)。在另一个实施方案中，可以利用特定的内源哺乳动物启动子来驱动感兴趣基因的组成性转录(Pontiller,Grossetal.2008)。CHO特异性中国仓鼠延长因子1-α(CHEF1α)启动子已经提供了基于病毒的序列的高产备选(Deer,Allison2004)。在启动子外，本文中所述的载体还包含上文描述的增强子区；核心启动子附近的特定核苷酸基序区，其可以募集转录因子以调节转录速率(Riethoven 2010)。与启动子序列类似，这些区域经常衍生自病毒并且在启动子序列内涵盖，诸如CMV和SV40增强子序列，或者可以包括在内，诸如腺病毒衍生的序列(Gaillet,Gilbertetal.2007)。
在一个实施方案中，本文所述的包含编码产物(例如多肽，例如重组多肽)的核酸序列的载体还包含编码选择标志物的核酸序列。在一个实施方案中，选择标志物包含谷氨酰胺合酶(GS)；二氢叶酸还原酶(DHFR)，例如赋予对甲氨蝶呤(MTX)的抗性的酶；或抗生素标志物，例如赋予抗生素抗性的酶，例如：潮霉素、新霉素(G418)、zeocin、嘌呤霉素或杀稻瘟素。在另一个实施方案中，选择标志物包含Selexis选择系统(例如，SUREtechnologyPlatformTM和Selexis Genetic ElementsTM，可从Selexis SA商购)或Catalant选择系统或与之兼容。
在一个实施方案中，包含编码本文所述重组产物的核酸序列的载体包含可用于鉴定一种或多种细胞的选择标志物，所述细胞包含编码本文所述重组产物的核酸。在另一个实施方案中，选择标志物可用于鉴定包含编码重组产物的核酸序列整合到基因组中的一种或多种细胞，如本文所述。已整合编码重组蛋白的核酸序列的一种或多种细胞的鉴定可以用于选择和工程化改造稳定表达产物的细胞或细胞系。
适合于使用的载体是商品化的，并且包括与GS Expression SystemTM、GS XceedTMGene Expression System、或可购自Lonza Biologics,Inc的CHOK1SV技术相关的载体，例如Fan等,Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502(其通过引用完整并入本文)中描述的载体。GS表达载体包含GS基因或其功能片段(例如，GS小基因)，和一个或多个，例如1、2或3个或更多个用于表达感兴趣基因的高效转录盒，例如，编码本文所述重组多肽的核酸。GS小基因包含基因组CHO GS基因的内含子6，例如，由基因组CHO GS基因的内含子6组成。在一个实施方案中，GS载体包含与SV40L启动子和一个或两个polyA信号可操作连接的GS基因。在另一个实施方案中，GS载体包含与SV40E启动子、SV40剪接和多腺苷酸化信号可操作连接的GS基因。在此类实施方案中，例如用于表达感兴趣基因或本文所述重组多肽的转录盒包括hCMV-MIE启动子和来自包括第一内含子的hCMV-MIE基因的5'非翻译序列。可以基于GS表达载体构建其他载体，例如，其中用其他选择标志物取代本文所述表达载体中的GS基因。
适用于本文所述方法的载体包括但不限于其他商品化载体，诸如pcDNA3.1/Zeo,pcDNA3.1/CAT,pcDNA3.3TOPO(Thermo Fisher,以前为Invitrogen)；pTarget,HaloTag(Promega)；pUC57(GenScript)；pFLAG-CMV(Sigma-Aldrich)；pCMV6(Origene)；pEE12或pEE14(Lonza Biologics),或pBK-CMV/pCMV-3Tag-7/pCMV-Tag2B(Stratagene)。
细胞和细胞培养
在一个方面，本公开涉及用于评估、分类、鉴定、选择或生成产生产物(例如如本文所述的重组多肽)的细胞或细胞系的方法。另一方面，本发明涉及用于评估、分类、鉴定、选择或生成具有改善的，例如增加的生产率和产物质量的细胞或细胞系的方法和组合物。
在实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在其他实施方案中，细胞是哺乳动物细胞以外的细胞。在一个实施方案中，细胞来自小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、狗、马、雪貂或猫。在实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或啮齿类细胞，例如仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在另一个实施方案中，细胞来自鸭、鹦鹉、鱼、昆虫、植物、真菌或酵母。在一个实施方案中，细胞是古细菌。在一个实施方案中，细胞是放线菌属(Actinobacteria)物种，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
在一个实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHOFUT8GS敲除细胞、CHOZN或CHO衍生细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SVGS敲除细胞(Lonza Biologics，Inc.)。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1 SV(Lonza Biologics，Inc.)。
在另一个实施方案中，细胞是HeIa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS，例如COS1和COS7、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SVGS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11、和CHOZN，或任何由其衍生的细胞。在一个实施方案中，细胞是干细胞。在一个实施方案中，细胞是本文所述任何细胞的分化形式。在一个实施方案中，细胞是衍生自培养中的任何原代细胞的细胞。
在一个实施方案中，细胞是本文所述的任何一种细胞，其包含编码重组多肽的外源核酸，例如，表达重组多肽，例如选自表1或2的重组多肽。
在一个实施方案中，细胞培养物作为分批培养、补料分批培养、吸出和填充培养(draw and fill culture)或连续培养进行。在一个实施方案中，细胞培养物是悬浮培养物。在一个实施方案中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模型生物体或人类受试者中。
在一个实施方案中，培养基不含血清。无血清和无蛋白质的培养基是商品化的，例如Lonza Biologics。
适用于哺乳动物细胞系的培养基和培养方法是本领域公知的，如例如记载于美国专利号5,633,162。用于实验室烧瓶或低密度细胞培养并适应特定细胞类型需要的标准细胞培养基的实例是例如：Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Morre,G.,The Journal of the American Medical Association,199,p.519f.1967)、L-15培养基(Leibovitz,A.等,Amer.J.of Hygiene,78,1p.173ff,1963)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Eagle最小必需培养基(MEM)、Ham F12培养基(Ham,R.等,Proc.Natl.Acad.Sc.53,p288ff.1965)或缺乏清蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的Iscoves改良DMEM(Iscoves等,J.Exp.med.1,p.923ff.,1978)。例如，Ham的F10或F12培养基专门为CHO细胞培养而设计。EP-481 791中描述了特别适用于CHO细胞培养的其他培养基。已知此类培养基可以补充有胎牛血清(FBS，也称为胎牛血清FCS)，后者提供多种激素和生长因子的天然来源。哺乳动物细胞的细胞培养现在是科学教科书和手册中充分描述的常规操作，其在例如R.IanFresney,Culture of Animal cells,手册,第4版,Wiley-Liss/N.Y.,2000中详细覆盖。
其他合适的培养方法是熟练技术人员已知的，并且可以取决于重组多肽产物和所用的宿主细胞。确定或优化适于表达和产生待由细胞表达的重组多肽的条件在普通技术人员的技能范围内。
在一个方面，细胞或细胞系包含编码产物，例如重组多肽的外源核酸。在一个实施方案中，细胞或细胞系表达产物，例如治疗或诊断产物。用于遗传修饰或工程化改造细胞以表达期望的多肽或蛋白质的方法是本领域公知的，并且包括例如转染、转导(例如病毒转导)或电穿孔。
用于将核酸(例如本文所述的外源核酸或载体)导入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见例如Sambrook等,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。
用于将核酸(例如本文所述的外源核酸或载体)导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其他方法是可用的，诸如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米尺寸的递送系统递送多核苷酸。
在实施方案中，期望将外源核酸整合到宿主细胞的核酸中，例如宿主细胞的基因组或染色体核酸中。用于确定是否已经发生外源核酸整合到宿主细胞的基因组中的方法可以包括GS/MSX选择方法。GS/MSX选择方法使用重组GS基因对谷氨酰胺营养缺陷型的互补来选择来自细胞的蛋白质的高水平表达。简而言之，GS/MSX选择方法包括在载体上包含编码谷氨酰胺合酶的核酸，所述载体包含编码重组多肽产物的外源核酸。甲硫氨酸硫酰亚胺(MSX)的施用选择已经将编码重组多肽和GS两者的外源核酸稳定整合到基因组中的细胞。由于GS可以由一些宿主细胞(例如CHO细胞)内源表达，因此可以优化用MSX选择的浓度和持续时间以鉴定高产细胞，其中编码重组多肽产物的外源核酸稳定整合到宿主基因组中。GS选择及其系统在Fan等,Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502(其通过引用完整并入本文)中进一步描述。
用于鉴定和选择已将外源核酸稳定整合到宿主细胞基因组中的细胞的其他方法可以包括但不限于在外源核酸上包含报告基因和评估细胞中报告基因的存在，以及外源核酸的PCR分析和检测。
在一个实施方案中，使用本文描述的方法选择、鉴定或产生的细胞能够产生比仅使用稳定表达的选择方法，例如整合编码重组多肽的外源核酸选择的细胞更高的蛋白质产物产率。在一个实施方案中，与未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞或仅选择编码重组多肽的外源核酸的稳定表达(例如整合)的细胞相比，使用本文描述的方法选择、鉴定或产生的细胞产生2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多的产物(例如重组多肽)。
评估、分类、选择或鉴定细胞
在一个方面，本公开内容的特征在于评估细胞(例如候选细胞)的产物生产(例如重组多肽生产)能力的方法。此类评估的结果可以提供可用于选择或鉴定细胞的信息，所述细胞用于产生作为高产细胞或细胞系的细胞或细胞系。在另一个实施方案中，响应于本文所述的评估，细胞或细胞系可以分类为例如具有高生产率的细胞或细胞系。
与参考细胞或尚未通过本文所述的方法选择或产生的细胞相比，高产细胞或细胞系能够产生更高的重组多肽产物产率。在一个实施方案中，高产细胞系能够产生25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600g/L、700g/L、800g/L、900g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、或100g/L或更多的产物，例如重组多肽产物。在一个实施方案中，高产细胞系产生100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600g/L、700g/L、800g/L、900g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、或100g/L或更多的产物，例如重组多肽产物。产生的产物的量可以随细胞类型(例如物种)和待表达的重组多肽而变化。举例来说，高产细胞能够产生至少1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L或25g/L或更多的重组多肽，例如，如本文所述。
在产物难以表达的实施方案中，高产细胞可以产生较低浓度的产物，例如小于1g/L，然而，生产率与对尚未接触蛋白质降解抑制剂的细胞所观察到的生产率相比更高或增加。例如，与由尚未被蛋白质降解抑制剂接触的细胞产生的水平、量或数量相比，由所鉴定或选择的细胞产生的产物的水平、量或数量增加，例如增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。
本文描述的用于评估细胞的方法包括评估蛋白质降解抑制剂对与细胞功能相关的一个或多个参数的影响。与细胞功能相关的参数包括但不限于细胞存活、培养物存活力、增殖能力、产生产物的能力和蛋白质降解。在实施方案中，将蛋白质降解抑制剂对与细胞功能相关的一个或多个参数的影响值与参考值比较，以确定抑制剂对与细胞功能相关的参数的影响，例如，用于确定使细胞与抑制剂接触是否导致与细胞功能相关的参数之一的增加或减少。在一个实施方案中，响应于确定与细胞功能相关的一个或多个参数的增加或减少，可以选择或鉴定细胞用于开发为细胞生产系。在一个实施方案中，响应于确定与细胞功能相关的一个或多个参数的增加或减少，可以将细胞鉴定为高产细胞，例如能够产生更高产物产率的细胞。
在本文所述的任何实施方案中，参考值可以是蛋白质降解抑制剂对参考细胞(例如具有预定生产率的细胞)的与细胞功能相关的参数的影响的值。或者/另外，在本文描述的任何实施方案中，参考值可以是所测试的相同细胞的与细胞功能相关的参数的值，其中细胞尚未与抑制剂接触，例如在使细胞与蛋白质降解抑制剂接触之前测量参数值，或者尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞的不同等分试样的与细胞功能相关的参数的值。
在一个实施方案中，细胞存活可以通过测定或定量细胞凋亡来测量，例如，响应于本文所述的蛋白质降解抑制剂浓度而已被杀死或死亡的细胞的数目或量。细胞存活的增加包括与蛋白质降解抑制剂接触后剩余的细胞，例如完整细胞或活细胞数目增加1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。或者，细胞存活的增加包括与蛋白质降解抑制剂接触后凋亡细胞的数目减少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。用于检测细胞存活或凋亡的方法是本领域已知的，例如膜联蛋白V测定法，并且在本文实施例中描述。
在一个实施方案中，培养物存活力可以通过测定或定量活细胞的数目或量来测量，例如培养物或细胞群体中的活细胞，或具有与存活力相关的特征，例如增殖标志物，完整的DNA的细胞，或不显示凋亡标志物的细胞。培养物存活力的增加包括与蛋白质降解抑制剂接触后剩余的细胞，例如完整细胞或活细胞数目增加1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。用于确定培养物存活力的方法是本领域已知的，并且在本文的实施例1和3中描述。用于评估培养物存活力的其他方法包括但不限于锥虫蓝排除法，然后使用血细胞计数器或Vi-CELL(Beckman-Coulter)计数。用于评估培养物存活力的其他方法可以包括确定存活的生物量，并且包括使用射频阻抗或电容(例如，如记载于Carvell and Dowd,2006,Cytotechnology,50:35-48)，或使用拉曼光谱术(例如，如记载于Moretto等,2011,American Pharmaceutical Review,第14卷)。
在一个实施方案中，细胞增殖的能力可以通过定量或计数细胞数、细胞倍增或细胞生长速率来测量。或者，可以通过分析细胞的基因组含量(例如，复制DNA)(例如通过流式细胞术分析)，或增殖标志物，例如Ki67，参与细胞周期的磷酸化细胞周期蛋白-CDK复合物来鉴定增殖细胞。增殖能力的增加包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触后细胞数目或表达增殖标志物的细胞数目增加1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。或者，增殖能力的增加包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触后细胞的倍增或生长速率增加1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。
本文提供的方法可用于鉴定、选择或生成具有改善的产生重组多肽(例如产物)的能力的细胞或细胞系。在一个实施方案中，本文提供的方法还可用于鉴定、选择或生成产生改善的重组多肽质量的细胞或细胞系。
在一个实施方案中，细胞产生产物的能力可以通过测定或定量产生的产物的量或浓度来测量。生产产物的能力增加包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触后蛋白质产量增加1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。
在一个实施方案中，产物(例如表达的重组多肽)的质量可以通过测定或定量正确折叠的产物、功能性产物或非聚集产物的量或浓度来测量。由细胞产生的产物的质量的提高包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触后正确折叠的产物、功能性产物或非聚集产物(例如表达的重组多肽)的量或浓度增加1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更多。
测量增加的蛋白质产量的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过ELISA测量组织培养基中的滴度以小规模确定重组蛋白质产量的增加(Smales等2004Biotechnology Bioengineering 88:474-488)。它也可以通过ForteBio Octet定量测定，例如用于培养基中重组单克隆抗体(mAb)浓度的高通量测定(Mason等2012Biotechnology Progress 28:846-855)或以更大规模通过蛋白质A HPLC测定(Stansfield等2007Biotechnology Bioengineering 97:410-424)。用于确定产物(例如，本文所述的重组多肽)的产量的其他方法可以指细胞中产物，特别是重组多肽的比生产速率(qP)和/或活细胞浓度的时间积分(IVC)。重组多肽产生或生产率(定义为培养基中多肽的浓度)是根据Porter等(Porter等2010Biotechnology Progress 26:1446-1455)计算的这两个参数(qP和IVC)的函数。用于测量蛋白质产量的方法也在本文提供的实施例，例如实施例1和5中进一步详细描述。
用于测量由如本文所述产生的细胞系产生的改善的产物质量的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，用于确定表达的重组多肽产物的一级序列的保真度的方法是本领域已知的，例如质谱法。可以通过圆二色性或评估表达的重组多肽的内在荧光来确定正确折叠的产物(例如表达的重组多肽)的量或浓度的增加。可以使用各种功能测定来测试功能产物的量或浓度的增加，这取决于重组多肽的特性。例如，可以通过ELISA或其他免疫亲和测定来测试抗体。
细胞系和重组多肽产生的方法
哺乳动物和微生物选择系统两者中的现有技术水平是在DNA到RNA的转录水平上施加选择压力。感兴趣的基因与选择标志物紧密连锁，使选择标志物的高水平表达可能导致感兴趣的基因的高表达。以高水平表达选择标志物的细胞能够存活和增殖，那些不太可能存活和增殖的细胞例如凋亡和/或死亡。以这种方式，可以对细胞群体富集以高水平表达选择标志物且暗示以高水平表达感兴趣的基因的细胞。该方法对于表达直接蛋白质已经证明非常成功。
然而，对于某些蛋白质，表达的瓶颈不是将DNA转录成RNA，而是正确的折叠和在必要的情况下蛋白质的翻译后修饰。目前靶向转录的选择系统不施加压力以选择在产生和正确加工蛋白质上良好的细胞系。事实上，高水平的转录可以通过使细胞产生和加工这些蛋白质的能力过载来加剧下游蛋白质合成步骤的问题。在蛋白质生产的替代阶段施加选择压力的选择系统的使用可以极大地改善选择的严格性。此类选择系统可以称为正交选择系统，因为它们的作用模式不依赖于在基因转录水平上操作的现有技术选择系统。这些替代选择系统也可以彼此独立地操作，因此彼此正交。例如，靶向转录、翻译、翻译后修饰和分泌的选择系统在作用模式中可能彼此独立。正交选择系统可以一起使用以增加选择的严格性并在选择中击中多个靶标。
本发明是正交选择系统的一个实例，其在蛋白质折叠和翻译后修饰的水平上操作。然而，可以设想正交选择系统的其他实例，其在抑制群体内在转录下游的蛋白质表达步骤中表现不佳的细胞生长的相同的广泛原理上起作用。
在一个方面，本公开内容提供了用于产生用于产生产物(例如重组多肽)的细胞或细胞系的方法。在另一方面，本公开提供了使用本文所述方法鉴定、分类、选择或产生的细胞产生产物(例如本文所述重组多肽)的方法。任何前述方法包括评估、鉴定、分类或选择如本文所述的细胞，例如通过使细胞与蛋白质降解抑制剂接触，以鉴定或生成具有高产物(例如重组多肽)产量能力的细胞。本文的方法增加重组多肽的产量，例如表达和/或分泌。
不希望受理论束缚，认为能够具有较高生产率的细胞对蛋白质降解抑制剂不太易感，因此，认为使细胞与包含本文所述的外源核酸的蛋白质降解抑制剂接触导致有较高生产率能力的细胞的选择。
在一个方面，利用两个或更多个选择步骤，例如选择外源核酸的稳定整合和选择抑制蛋白质降解的敏感性，导致比通过单一选择步骤产生的细胞更高产的细胞和细胞系。因此，本发明的特征在于用于产生高产细胞的方法，包括：
i)提供包含编码重组多肽产物的外源核酸的细胞；
ii)施用第一选择压力，例如选择第一性质，例如，选择具有外源核酸稳定整合的细胞；和
iii)施用第二选择压力，例如，进行第二性质的选择，例如，选择对蛋白质降解抑制具有较低易感性的细胞。
在实施方案中，在施用第二选择压力之前、同时或之后施用第一选择压力。在一个实施方案中，在第二选择压力之前施用第一选择压力。在一个实施方案中，在开始第二选择压力之前完成第一选择压力。在一个实施方案中，在第一选择压力之前施用第二选择压力。在一个实施方案中，在开始第一选择压力之前完成第二选择压力。在一个实施方案中，同时施用第一选择压力和第二选择压力。在一个实施方案中，第一和第二选择压力的施用完全或部分重叠。在一个实施方案中，在完成第一选择压力之前12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或168小时或更长开始第二选择压力。在一个实施方案中，在完成第一选择压力后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或168小时或更长开始第二选择压力。
在一个实施方案中，第一选择压力包括选择外源核酸的稳定整合，例如GS/MSX选择。在一个实施方案中，第二选择压力包括选择对蛋白质降解的抑制的易感性包括使细胞与蛋白质降解抑制剂接触。在一个实施方案中，蛋白质降解抑制剂在选择压力之前、同时或之后施用，所述选择压力包括鉴定包含外源核酸的基因组整合的细胞。在一个实施方案中，在完成在先选择步骤以鉴定包含外源核酸的基因组整合的细胞后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或168小时或更长施用蛋白质降解抑制剂。
以选择具有改善的产生重组多肽的能力，和/或具有产生具有改善的质量的重组多肽的能力的细胞的方式施加选择压力。在一个实施方案中，施加每种选择压力，例如本文所述的第一和/或第二选择压力达至少24小时、48小时、72小时、96小时或120小时、或168小时。如本文所述，蛋白质降解抑制剂的浓度导致至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％的培养物存活力，例如，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的细胞数目在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养后保留，例如存活。在一些实施方案中，本文的方法，例如，特别是在施加两种或更多种选择压力之后导致在选择后剩余小于20％，例如15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％或更少的总细胞。与在缺乏蛋白质降解抑制剂的情况下培养物存活力或细胞存活的百分比相比，确定在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下选择后培养物存活力或细胞存活的百分比。在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养后剩余的活细胞可以进一步培养以产生细胞系。
在实施方案中，在两次选择压力，例如选择包含外源核酸的稳定整合体和选择对蛋白质降解抑制剂的低易感性后保留的活细胞具有增加的蛋白质产生能力。例如，与仅施用一种选择压力或未施用任何选择压力的细胞相比，具有增加的蛋白质产生能力的细胞产生2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多或至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多的产物，例如，重组多肽。
在实施方案中，在如本文所述的两次选择压力后保留的活细胞产生表达的重组多肽的改善的质量。例如，产物的改善的质量包括以下一种或多种：更同质的产物、正确折叠的表达的重组多肽的比例增加、或功能性重组多肽的比例增加、聚集的重组多肽的比例减少。例如，与仅施用一种选择压力或未施用任何选择压力的细胞相比，产生改善的产物质量的细胞产生2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多或至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多的正确折叠或功能性重组多肽。
在一个实施方案中，本文中用于产生具有改善的生产率或改善的产生产物质量的细胞系的方法与表达本文所述，例如选自表1或2的重组多肽的预先存在的或商品化的细胞系一起是有用的。在此类方法中，在存在有效浓度的本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养细胞，所述有效浓度适合于鉴定具有改善的生产率或改善的产物质量的细胞，例如蛋白质降解抑制剂的浓度导致至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％的培养物存活力，例如至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的细胞数目在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养后保留，例如存活。在一些实施方案中，在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养细胞导致在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养后保留小于20％，例如15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、或更少的总细胞。在存在本文所述的蛋白质降解抑制剂的情况下培养后剩余的活细胞可以进一步培养以产生细胞系，例如改善的细胞系。
在一些实施方案中，可以进行另外的步骤以改善产物的表达，例如产物的转录、翻译和/或分泌，或产物的质量，例如，一级序列的正确折叠和/或保真度。这些额外的步骤包括导入改善产物表达或产物质量的试剂。在一个实施方案中，改善产物表达或产物质量的试剂可以是小分子、多肽或编码改善蛋白质折叠的多肽，例如伴侣蛋白的核酸。在一个实施方案中，核酸包含抑制性核酸，例如微小RNA或lncRNA。在一个实施方案中，有助于蛋白质折叠的试剂包含编码伴侣蛋白，例如BiP、PD1或ERO1的核酸(Chakravarthi&Bulleid 2004；Borth等人2005；Davis等人2000)。改善产物产率和质量的其他额外步骤包括转录因子如SBP1和ATF6的过表达(Tigges&Fussenegger 2006；Cain等人2013；Ku等人2008)和凝集素结合伴侣蛋白如钙联接蛋白和钙网织蛋白的过表达(Chung等人，2004)。可以通过导入编码蛋白质的外源核酸实现辅助或改善蛋白质折叠和产物质量以及产生本文所述蛋白质的药剂的过表达。在另一个实施方案中，改善产物表达或产物质量的试剂是可以添加到细胞培养物以增加产物表达或产物质量的小分子。在一个实施方案中，在较低温度下培养细胞，例如比通常培养细胞的温度低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、或10℃。
本文描述的任何方法可以还包括用于鉴定具有高生产率或产生高质量产物的细胞的额外选择步骤。例如，可以利用FACS选择来选择和分离具有期望特征的特定细胞，例如蛋白质折叠蛋白质，例如伴侣蛋白的较高表达；或改善的产物表达。
在一个方面，本公开内容提供了包括用于回收或取出重组多肽产物的步骤的方法。在从细胞分泌重组多肽的实施方案中，该方法可以包括从细胞、细胞群体或培养细胞的培养基中回收、收集或分离重组多肽的步骤。在重组多肽在细胞内的实施方案中，重组多肽产物的纯化包括将由细胞产生的重组多肽与以下任何一种或多种的分离：宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、宿主细胞脂质和/或来自宿主细胞的其他碎片。
在实施方案中，本文描述的方法提供基本上纯的蛋白质产物。如本文所用，“基本上纯的”是指基本上不含热原材料、基本上不含核酸、和/或基本上不含来自宿主细胞的内源细胞蛋白酶和组分，例如聚合酶、核糖体蛋白和伴侣蛋白。基本上纯的蛋白质产物包含例如小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％的来自宿主细胞的污染内源蛋白质、核酸或其他大分子。
用于回收和纯化产物(例如重组多肽)的方法在本领域中是完善建立的。为了回收重组多肽产物，使用物理或化学或物理-化学方法。物理或化学或物理-化学方法可以是过滤方法、离心方法、超速离心方法、提取方法、冻干方法、沉淀方法、结晶方法、层析方法或两种或更多种其方法的组合。在一个实施方案中，层析法包括以下一种或多种：尺寸排阻层析(或凝胶过滤)、离子交换层析，例如阴离子或阳离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析和/或多元层析。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且并不意图为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应当解释为限于以下实施例，而是应该解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，认为本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例生成和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。
实施例1：方法
本实施例中提供的方法和测定法涉及评估蛋白质降解抑制剂对与细胞功能相关的参数(例如细胞存活和培养物存活力)的影响。这些方法和测定法用于以下实施例中描述的实验。
96DWP形式的抑制剂杀死曲线
以4x 106个细胞/ml每孔300μl接种96深孔板(Nunc)，用于分析蛋白酶体和ERAD抑制剂。对于细胞系组中的每种，针对每种抑制剂生成一式三份的孔。对每孔添加1μl每种抑制剂原液以使最终浓度为0.05μM环氧霉素、0.5μM MG-132和10μM eeyarestatin I。将板在36.5oC在5％CO2和90％湿度的情况下以375rpm摇动速度温育，直到适当的24小时时间点。将100μl孔体积与900μl PBS组合，并使用ViCell装置进行细胞计数。将剩余的200μl以1000rpm离心5分钟，并将上清液和团粒在-20℃贮存，然后进一步分析。
蛋白酶体活性分析
通过以1000rpm离心所需培养体积5分钟，从所需细胞系以5x 106个细胞制备细胞团粒。然后将团粒在-20℃贮存，直至进行活性评估。将团粒重悬于裂解缓冲液(20mM HEPESNaOH pH 7.2,100mM NaCl,10mMβ-甘油磷酸钠,0.5％w/v Triton X-100)中。然后进行Bradford测定法以确定裂解物材料中的总蛋白质，并计算每个反应获得100μg总蛋白质所需的体积。在需要时合并多个团粒以确保对于活性探针评估和随后的抑制剂攻击足够的材料。对于合并的材料重复Bradford测定法。将100μg蛋白质与1μl探针或DMSO组合，并用裂解缓冲液将反应体积补足至200μl。将混合物涡旋振荡并在室温下在黑暗中摇动1小时(用箔包裹)。然后加入1ml冰冷的100％丙酮，涡旋振荡，然后以13000rpm旋转5分钟。除去丙酮，并且将团粒重悬于20μl 2xSDS样品缓冲液中。将样品在95℃加热5分钟，偶尔摇动，然后在13000rpm下短暂离心，然后在-20℃储存，然后进一步分析。用来自相同裂解物材料的样品重复用环氧霉素进行的抑制剂攻击。以与以前相同的方式用100μg蛋白质和1μl探针制备反应混合物，最终反应体积为200μl。然而，在将探针添加到反应之前，加入1μl 50μM或20μM的环氧霉素，并将反应在室温下在黑暗中摇动温育30分钟。在与抑制剂预温育后，加入探针并如前所述继续反应以进行活性探针评估。如前所述使用丙酮沉淀制备样品并在-20℃贮存直至进行分析。将20μl体积加载到具有5％堆积凝胶的14％SDS-PAGE解析凝胶上。在加载凝胶之前，将样品在95℃再加热5分钟并以13,000rpm短暂离心。在200V下将凝胶运行约1小时直至完成。然后使用Typhoon 9400分析凝胶的荧光。RUB1001探针使用Cy2分析(滤器：520BP40，激光：蓝色2(488nm)，灵敏度：正常)。探针MV151、MVB003、MVB072、RUB1018和无探针使用Cy3分析(滤器：580BP30，激光：绿色(532nm)，灵敏度：正常)，具有100微米和600PMT的典型图像分辨率。荧光分析后，将凝胶置于考马斯染料中过夜，并且次日在脱色剂中放置以提供总蛋白的加载对照。
用于细胞系构建实验的多克隆稳定合并物生成
在GSKO悬浮细胞系中进行电穿孔。在指数中期对培养物进行计数，并将剩余的培养物以1000rpm离心并除去上清液。在700μl体积中每个电穿孔杯需要1x 107个细胞。因此，将团粒重悬浮以达到所需电穿孔次数的细胞浓度。使用20μg线性化质粒以300V，电容900μF并使用具有4mm间隙的杯进行电穿孔。将每个杯加入20ml新鲜培养基，其中用该体积的2ml冲洗杯。对于细胞系构建实验，然后将所有电穿孔合并在一起，得到最终体积为300ml。将这彻底混合，然后在30x T75组织培养瓶间以10ml体积分配。然后将烧瓶在36.5℃在5％CO2的情况下静态温育。转染后24小时，加入谷氨酰胺合酶抑制剂(MSX)以提供成功摄取质粒并表达选择标志物GS的细胞的选择。加入5ml体积的具有CD-CHO培养基的MSX原液，得到最终培养物浓度为25、37.5或50μM MSX。然后在MSX选择后的适当时间点进行蛋白酶体抑制剂的加入，如通过表3中详述的实验布局设计所确定的。加入过滤灭菌的DMSO作为对照，其中组合中不需要药物。然后在加入MSX后，将培养物在36.5℃和5％CO2下静态培养约两周。在观察到培养物的细胞浓度增加时或至少每周一次进行存活力计数。一旦达到至少0.2x 106个细胞/ml的活细胞浓度，于36.5oC和5％CO2在以140rpm摇动的情况下将培养物移至20ml摇瓶培养物中。从这一点开始，每3-4天进行常规传代培养。
表3：体外最佳响应表面设计
上清液样品的酶联免疫吸附测定法(ELISA)以确定抗体浓度
将AffiniPureF(ab')2片段山羊抗人IgG Fc片段特异性(对牛、马、小鼠血清蛋白的最小交叉反应)(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)在包被缓冲液(15mMNa2CO3和35mM NaHCO3,pH 9.7)中稀释以得到2.2μg/ml的浓度。然后将100μl原液用于包被96孔板(Nunc)的每孔。用箔覆盖板并在4℃贮存过夜。将板在洗涤缓冲液(0.1M NaCl,8.1mMNa2HPO4,2.4mM NaH2PO4.H2O,12.7mM EDTA,0.02％v/v Tween-20和1％L-丁醇,pH 7.2)中洗涤两次，然后对每孔加入200μl封闭溶液(15mM Na2CO3和35mM NaHCO3,pH 9.7中的0.5％w/v酪蛋白)并在室温下振荡温育1小时。通过在样品缓冲液(0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl和0.02％v/v Tween-20,pH 7.0)中连续稀释以得到250ng/ml-3.9ng/ml的范围来制备人IgG试剂级(Sigma)的IgG标准品。还进行样品缓冲液中上清液样品的连续稀释。封闭后，将板在洗涤缓冲液中洗涤两次，然后将100μl样品/标准品加入相关孔。然后将板在室温下在摇动的情况下再温育1小时。将板洗涤两次，然后加入100μl/孔的二抗溶液(在洗涤缓冲液中以1:10000稀释的山羊中生成的抗人κ轻链(结合和游离)HRP缀合物(Sigma))。加入二抗后，将板在室温下在摇动的情况下温育1小时。再次洗涤板并加入现成的TMB底物(Cellsignalling technology#7004)(100μl/孔)。一旦发生标准品的显著蓝色着色，使用50μl/孔的2.5M H2SO4终止反应。然后在450nm处测量每个孔的光密度。然后从已知IgG浓度的标准曲线确定上清液样品的浓度。
蛋白A高效液相层析测定抗体浓度
按照Lonza标准操作程序，使用Chemstation软件和Agilent 1260仪器，用蛋白A柱进行HPLC。使用浓度为1008mg/L的蛋白A HPLC标准品(批次号L27336/07/02)，用结合缓冲液以1/2稀释。还使用浓度为3700mg/L的通用IAC(批次号L27336/7/1)，用结合缓冲液以1/10稀释以提供对照。发现IAC结果在方案要求的设定限度内。将上清液样品用结合缓冲液以1/2稀释，然后在柱上运行。
实施例2：确定合适的浓度以确定细胞系对不同抑制剂的易感性
使用一种模型重组CHO抗体产生细胞系(CHO149)在两个实验间进行初始评估，以确定用于评估整个组的每种抑制剂的合适浓度(图1A-1C和2A-2F)。基于先前报道并在文献中使用的那些浓度分析一系列浓度；先前已在体内显示8μM eeyarestatin足以阻断ER移位(Cross等人，2009)；已显示0.04-0.08μM环氧霉素抑制蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶活性(Meng等人，1999)；已显示1.5μM MG-132诱导凋亡(Meriin等人，1998)。
在用0.5和1μM MG-132温育CHO149细胞系后，观察到的效果几乎相同，与对照样品相比添加药物后48小时，培养物存活力降低至约50％，并且活细胞数大致降低40％(图2A-2F)。0.1μM浓度的MG-132对培养物存活力和细胞数目的影响较小，而由5和10μM浓度产生的影响是严重的，细胞数目和培养物存活力两者在加入药物后48小时显著降低(图1A-1C和2A-2F)。
0.5和1μM浓度的环氧霉素导致加入药物后48小时的活细胞数减少90％(图1A-1C)，而0.01、0.005和0.001μM的浓度导致活细胞数增加，药物没有显示任何有害作用，直至加入药物后72小时(图2A-2F)。到加入药物后48小时，在两个实验间，0.05μM浓度的环氧霉素导致范围为30-60％的培养物存活力下降和30-50％的活细胞数下降(图1A-图1C和2A-2F)。
添加抑制剂eeyarestatin I导致两个实验间的不同效果，从而导致在以浓度1μM添加后48小时范围为15-30％的活细胞数减少。10μM浓度始终显示两个实验间对培养物存活力参数的影响，尽管效果的幅度较大。基于图1A-1C和2A-2F中的结果，进一步研究确定的浓度对于MG-132为0.5μM，对于环氧霉素为0.05μM，对于eeyarestatin I为10μM。与对照样品相比，在这些浓度下，对细胞浓度和培养物存活力的影响观察到30-60％降低。
实施例3：在一组生产细胞系间评估ERAD和蛋白酶体抑制剂
使用如实施例2中测定的抑制剂浓度，在一组产生CHO mAb的细胞系上研究设定浓度的抑制剂的影响。使用的所有细胞系均衍生自CHOK1SV宿主细胞系，并以不同的产率表达模型IgG4分子。先前已经确定了细胞系的生产率，并且这些历史滴度用于选择涵盖一系列生产率的组以确定对抑制剂的易感性。然后在96深孔板形式中加入抑制剂后评估细胞，在加入抑制剂后进行每日细胞计数。
培养48小时后，培养物存活力和活细胞数在不同生产率的细胞系之间变化。在添加后48小时观察到抑制剂的最大作用幅度，因此该时间点用于进行相关性分析。
将药物对细胞系存活力的影响与细胞的生产率比较，以确定生产率与对所研究的药物浓度的易感性之间是否存在强相关性。使用来自补料分批和生物反应器数据的产物浓度和比生产速率(specific production rate)的历史试验性生产数据，以使用线性回归和Pearson相关分析以96DWP形式进行与抑制剂影响的相关性分析。在细胞系生产率和对蛋白酶体抑制剂的易感性之间确定统计学上显著的相关性(p<0.05)。
在存在0.5μM MG-132的情况下48小时后，确定从补料分批培养物确定的活细胞浓度与比生产速率之间以及从补料分批和生物反应器培养物确定的培养物存活力和比生产速率之间的正相关性(图3A-3D和6A-6G；和表4)。当在存在0.05μM环氧霉素的情况下培养细胞时，从补料分批和生物反应器培养物确定的活细胞数和比生产速率之间以及从补料分批和生物反应器培养物确定的活细胞数和产物浓度之间再一次存在正相关(图4A-4D和6A-6G；和表4)。在0.05μM环氧霉素的情况下培养物存活力和生产率数据之间没有确定统计学上显著的相关性。当在存在Eeyarestatin I的情况下培养细胞时，细胞培养参数和生产率特征之间也没有显著的相关性。
表4：抑制剂对产生CHO抗体的细胞系的培养物存活力和活细胞浓度的影响与细胞系产率的相关系数的总结。(阴影表示统计上显着的相关性)。
实施例4：测定生产细胞系中的蛋白酶体活性
如实施例3中所述，所研究的细胞系组显示出它们对蛋白酶体抑制剂的易感性的差异。因此，为了进一步分析这点，在细胞系组间确定蛋白酶体活性水平。这使用来自vander Hoorn实验室(Kolodziejek等人，2011)的蛋白酶体活性谱分析探针进行。这些探针具有荧光标签，并且基于抑制剂分子设计，其活性基团不同。重要的是，探针仅在处于活性状态时才能与其靶物结合，因此可以确定活性蛋白酶体。本研究中使用的探针包括MV151，其含有乙烯基砜反应性基团和MVB003和MVB072，两者都基于抑制剂分子环氧霉素并具有环氧酮反应性基团。这些探针的反应基团通过不同的机制与蛋白酶体催化亚基的N-末端活性位点Thr结合。这些探针证明蛋白酶体的三个催化亚基β1，β2和β5的活性(Kolodziejek等人，2011)。此外，利用含有环氧酮反应性基团并突出显示β1活性的探针RUB1001，以及具有乙烯基砜反应性基团并突出显示β5催化亚基活性的RUB1018。用活性探针分析允许在细胞系组间确定蛋白酶体活性以及发现蛋白酶体的各种催化亚基的活性在这些间是否不同的研究。
如方法章节中所述，通过在标记样品后观察到的各种条带的荧光强度确定活性。在确定荧光水平后，对凝胶进行考马斯染色以提供加载对照。在图7A-7F中观察到的约27kDa的上部条带代表β2催化活性。约24kDa的较低条带代表β5和β1催化活性(图7A-7F)，RUB1018仅指示β5活性。MV151探针指示β2和β5/β1活性两者。在细胞系组间，较低β5/β1条带的强度通常具有比β2条带更强的强度(图7A-7F和9A-9F)，提示这些亚基的更高活性。然而，当使用MVB003探针时，与CHOK1SV相比在许多产生抗体的细胞系中似乎存在不太强的β5/β1条带并因此较小的活性(图7A-7F和9A-9F)。产生重组抗体的细胞系的β2活性通常与CHOK1SV宿主细胞系中观察到的β2活性相当。如可以预期的，当利用MVB072探针时，观察到与MVB003探针的活性模式相似的活性模式(图7A-7F)，尽管观察到β5/β1条带的较小变化。
当RUB1001探针用于研究蛋白酶体活性(其可以个别允许β5和β1活性的评估)时，这两个亚基的催化活性在细胞系组间相互反映(图8A-8F)。当与CHOK1SV对照相比时，发现如使用RUB1018探针测定的蛋白酶体活性水平在许多重组细胞系中更低(图8A-8F和9A-9F)。也在不对裂解物样品添加探针的情况下以及在添加探针前环氧霉素抑制的情况下进行荧光分析，以确认获得的条带模式是从探针与催化亚基的结合确定的而不是非特异性结合的结果。这以这些经处理的样品在凝胶上没有条带确认(图8A-8F)
还通过组合使用光密度测定法分析用每个探针观察到的所有条带的强度来研究针对每个探针确定的“总”活性。因此，总蛋白酶体活性从所有探针的所有强度的总和导出。细胞系CHO142、CHO71、CHO77、CHO137和CHO46相对于非生产性对照CHOK1SV宿主均显示总蛋白酶体活性的升高的水平(图9A-9F)。所有细胞系最初都衍生自CHOK1SV细胞系，因此这应当提供合适的蛋白酶体活性基线，而没有重组蛋白质生产的压力。显示总蛋白酶体活性增加的细胞系在所研究的那些细胞系的生产率范围中通常为中间至高。然而，与宿主中观察到的相比，其他细胞系如CHO149、CHO42和CHO150均显示总蛋白酶体活性降低，并且通常归类为高生产者。
实施例5：将蛋白酶体选择压力应用于细胞系构建过程
已观察到细胞系生产率与细胞系对蛋白酶体抑制剂的易感性之间的相关性(参见实施例3)。因此，研究了蛋白酶体抑制剂可用于在细胞系构建过程中选择高产重组细胞系的假设。因此，细胞系构建过程设计为产生生成模型抗体A的CHOK1 GS-KO重组细胞系，其包括加入蛋白酶体抑制剂作为甲硫氨酸砜亚胺(MSX)的额外的选择压力。在图10中概述了细胞系构建过程设计。MSX用于通过选择谷氨酰胺合酶(GS)表达来选择成功表达转染质粒的细胞。尽管CHO细胞内源表达少量的GS，但MSX可以用作抑制剂以选择那些含有GS的构建体已稳定掺入基因组中的细胞(Fan等人，2012)。此外，该实施例中使用的宿主是缺乏任何内源GS蛋白表达的CHOK1 GS-KO宿主细胞系。除了典型的选择之外加入蛋白酶体抑制剂以测试包括基于蛋白酶体抑制的选择是否选择作为抗体产物的高产生者的细胞群体。实施例3中呈现的数据提示那些具有较高生产率的细胞对蛋白酶体抑制剂的易感性较低，因此应当在存在抑制剂的情况下进行选择。为了测试此假设，使用测定要研究的那些抑制剂浓度的实验方法设计对用编码抗体A的质粒转染的CHOK1 GS-KO宿主细胞系使用一系列MSX和蛋白酶体抑制剂浓度的组合。这些在图10中描述。加入MSX后24、96或168小时加入蛋白酶体抑制剂，以允许基于质粒摄取的选择在抑制蛋白酶体之前发生。
出于细胞系构建过程的目的，使用的MG-132的浓度低于用于产生实施例2中报道的数据的浓度。先前在实施例2中报道的数据中研究的浓度导致电穿孔和细胞系构建过程后较差的活细胞计数。因此，降低用于细胞系构建评估的浓度。
评估的30个细胞系构建过程中的8个在细胞系构建过程中存活。这些是仅用不同MSX浓度处理的四种对照(即没有加入蛋白酶体抑制剂)和下述四种，其中过程与MSX的纳入一起含有MG-132或环氧霉素。培养并扩增这些细胞群体，直到在悬浮分批培养物中培养它们以评估来自这些细胞群体的生长和抗体浓度。为此目的，在不加入蛋白酶体抑制剂的情况下在一式三份烧瓶中以0.2x 106个细胞/ml的浓度接种细胞，并且在Kuhner培养箱中以140rpm摇动的情况下于37oC温育，并且每48-72小时取样以在ViCell仪上测定细胞浓度和培养物存活力。一般地，生长特征在所有细胞群体间是相似的，如图11所示。CLC18(此种细胞系构建在存在0.025μM环氧霉素和37.5μM SMSX的情况下进行)比其他培养物具有更慢的生长速度并且没有达到如此高的活细胞数，与其他细胞系构建群体的8-10x 106个细胞/ml相比获得5.328x 106个细胞/ml的最大活细胞数。与其他群体相比，在仅存在MSX的情况下产生的CLC6和CLC27细胞系构建在更早的时间点时在培养物存活力上下降，在培养192小时时存活力分别为5.8％和24.2％。
当分析不同细胞合并物的上清液中的抗体浓度时，使用蛋白质降解抑制剂或不使用蛋白质降解抑制剂构建时，不同细胞系之间的产物浓度存在大的差异。从分批培养192小时时采集的上清液测定抗体浓度，并通过ELISA(图12)和蛋白A HPLC测定。从蛋白A HPLC获得的结果与通过ELISA测定观察到的结果相似。在通常的MSX选择之上用蛋白酶体抑制剂的额外选择压力制备的所有培养物显示相对于从单独MSX产生的合并物观察到的抗体浓度的抗体浓度增加。实际上，用0.0625μM MG-132和37.5μM MSX产生的那些合并物显示细胞培养上清液中存在的抗体量的约4倍增加，而用0.025μM环氧霉素和37.5μM MSX产生的那些相对于仅用MSX产生的不同对照合并物显示抗体浓度的3-7倍增加。因此，这些数据指示与MSX选择一起使用蛋白酶体抑制剂导致产生更高的模型重组单克隆抗体产率的细胞合并物。
发现表达模型单克隆抗体的重组CHO细胞系对蛋白酶体抑制剂MG-132和环氧霉素的易感性在一组工业相关的模型抗体生产型GS-CHO重组细胞系间不同(如实施例2中所述)。在存在所研究的浓度的蛋白酶体抑制剂的情况下培养细胞时，发现培养物存活力或活细胞数和生产率之间存在正相关。
本文公开的数据证明了高产细胞系中的蛋白酶体受抑制效应的影响较小，表明较少的多肽或蛋白质需要降解，可能是由于存在较少错误折叠的蛋白质并因此导致更高的产率。高产细胞系先前已经与表达重组蛋白的哺乳动物细胞系中伴侣蛋白的量增加相关，因此折叠的保真度在这些细胞中可以得到改善，从而使它们更好地促进高水平的重组蛋白产生(Smales等人2004；Dinnis等人，2006)，潜在经由由于ER应激所致的UPR激活。
由于实施例3中观察到的蛋白酶体抑制和抗体生产率之间的正相关性，假设蛋白酶体抑制的影响可以在细胞系构建期间用于选择较高的重组蛋白产生群体。MSX目前是用于抑制CHO细胞的内源谷氨酰胺合酶(GS)的主要选择系统之一，并选择在导入的重组质粒上表达外源GS的细胞，从而导致不同重组蛋白表达水平的异质群体。基于图6A-6G中报道的相关性数据，研究是否添加蛋白酶体抑制剂以及MSX将促进具有增强的生产率和潜在地产物质量的异质细胞群体的出现和选择。因此，当用含有GS基因和模型IgG4抗体A的重链和轻链的模型抗体A质粒转染时，将环氧霉素和MG-132加入到GSKO细胞系的细胞系构建过程。当应用于转染的选择过程时，MSX和环氧霉素和MG-132浓度的大多数组合不能在选择过程和随后的培养中幸存。在来自该实验的培养物中实现<6％的细胞存活力，除了进行到本文所述实验结束的8种培养物外。然而，在通过ELISA或蛋白A HPLC分析时，当与仅用MSX培养的那些群体相比时，那些的确在存在0.0625μM MG-132或0.025μM环氧霉素以及37.5μM MSX的情况下出现的群体在分批培养192小时后产生更高的cB72.3抗体量。因此，额外的选择压力似乎确实选择较高生产性群体，与先前报道的相关性数据一致。该数据具有用于工业背景中的细胞系构建过程以帮助开发较高生产性GS-CHO重组细胞群体的潜在益处。
实施例6.在细胞系构建过程中蛋白酶体和ERAD抑制剂的用途
在1x107个活GS KO Lonza宿主细胞的情况下用20μg线性化的含有GS cB72.3单克隆抗体的构建体进行多次电穿孔并合并。然后将该合并物设置成10ml培养物，每个培养物含有约0.25x 106个细胞和10μg DNA，并立即置于37℃，5％CO2的静态培养箱中。细胞培养基由没有谷氨酰胺和如下文概述的MSX和抑制剂添加的商品化CD-CHO培养基组成。转染后24小时，将MSX加入培养基中以使培养物体积达到15ml并提供37.5μM的最终MSX浓度。然后在加入MSX后再24小时将不同的抑制剂加入合并物中。如图13中所述，为每种抑制剂添加一系列浓度以在烧瓶中给出最终浓度。每个烧瓶仅进行一次抑制剂处理(没有组合处理)，并且均与37.5μM MSX组合进行，如图13中概述。
然后将细胞合并物留于37℃和5％CO2的静态培养箱中，直至烧瓶中的活细胞浓度达到约0.2x 106个细胞/ml。当达到该活细胞数时，将细胞合并物移入125mL Erlenmeyer摇瓶中，并在包含MSX和适当浓度的抑制剂的20mL体积的CD-CHO中于37℃在5％CO2下在空气环境中在以140rpm摇动的情况下培养。最终将33个转染/合并物中的24个移至摇瓶中，因为它们超过上述描述的所需的活细胞浓度。与37.5μMMSX一起导致细胞合并物的出现的最终抑制剂浓度如下：MG-132：15.625和31.25nM；环氧霉素：6.25、12.5和25nM；EeyarestatinI：0.1、0.5和1μM浓度。
然后在存在适当的抑制剂(和抑制剂浓度和37.5μM MSX)的情况下在20mL的CD-CHO中将细胞合并物培养几代(每次以0.2x 106个活细胞/ml接种)，然后对每次设置分批培养以评估合并物的生长并在培养期间针对产物浓度进行取样。为此目的，在48、96和168小时取样20ml分批培养物(以0.2x106个活细胞/ml接种)以得到生长和滴度信息。然后在缺乏抑制剂(但含有MSX)的情况下将细胞合并物再传代两代以确定是否观察到生长或生产率的任何变化，即若抑制剂连续存在，则仅维持改善的培养物滴度。得到的发现和数据在图13-18中呈现。
第一，评估从在存在抑制剂的情况下连续培养的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的平均单克隆抗体产物浓度(图14)。评估来自上清液样品的cB72.3单克隆抗体浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后20mL分批培养物的48、66和168小时采集。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度(对于37.5μMMSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。如图14所示，在存在31.25nM MG-132和37.5μM MSX的情况下构建的细胞合并物表现出增强的单克隆抗体滴度，比分批培养168小时后从对照合并物中观察到的单克隆抗体滴度几乎高4倍。
第二，通过western印迹进行从在存在抑制剂的情况下连续培养的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的单克隆抗体产物的分析(图15)。测定来自上清液样品的cB72.3浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后培养168小时采集。使用抗重链抗体(Sigma)探测Western印迹。如图15所示，在存在不同抑制剂的情况下产生的细胞合并物通常显示比来自对照、单独MSX产生的细胞合并物更强烈的抗体条带，因此更高的抗体生产率。
第三，评估从在缺乏抑制剂的情况下培养两代的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的平均单克隆抗体产物浓度(图16)。评估来自上清液样品的cB72.3单克隆抗体浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后20mL分批培养物的48、96和168小时采集。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度(对于37.5μMMSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。如图16所示，在存在31.25nM MG-132和37.5μM MSX的情况下构建的细胞合并物表现出增强的单克隆抗体滴度，比分批培养168小时后从对照合并物观察到的单克隆抗体滴度几乎高4倍。
第四，经由western印迹测定从在缺乏抑制剂的情况下培养两代的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后的单克隆抗体产物的分析(图17)。评估来自上清液样品的cB72.3浓度，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后培养168小时采集。在进行取样分批培养物之前，在缺乏抑制剂的情况下将细胞合并物传代两次。使用抗重链抗体(Sigma)探测Western印迹。如图17所示，在存在不同抑制剂的情况下产生的细胞合并物通常显示出比来自对照，单独MSX产生的细胞合并物更强烈的抗体条带，因此更高的抗体生产率。
第五，评估在用抑制剂处理后立即在细胞系构建过程后计算的平均比生产率(图18)。从在来自上清液样品的活细胞数目(在Vicell上测定)和产物浓度(在octet系统上使用蛋白A探针得出)上收集的数据计算比生产率，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后培养48、96和168小时采集。计算每个细胞合并物的个别比活性，然后测定每个处理的平均值(对于37.5μM MSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。如图18所示，当在存在MG-132，特别是31.25nM浓度，和各种浓度的环氧霉素和eeyarestatin的情况下产生细胞合并物时，与MSX对照合并物相比，细胞比生产率增强。
第六，评估从在缺乏抑制剂的情况下培养两代的细胞设置的分批培养物中用各种抑制剂的重组GS-CHO细胞系构建过程后实现的计算的平均细胞单克隆抗体比生产率(图19)。从在自上清液样品测定的细胞数目(在Vicell上测定)和产物浓度(在octet系统上使用蛋白A探针得出)计算比生产率，所述上清液样品在以除了MSX选择压力外从用蛋白酶体抑制剂的细胞系构建产生的细胞合并物的0.2x106个活细胞/ml接种后分批培养48、96和168小时采集。计算每个细胞合并物的个别比活性，然后测定每个处理的平均值(对于37.5μM MSX对照，n＝3，对于抑制剂处理，n＝2，除了25nM环氧霉素n＝1外)。如图19所示，当在存在MG-132，特别是31.25nM浓度，和各种浓度的环氧霉素和eeyarestatin的情况下产生细胞合并物时，与MSX对照库相比，细胞比生产率增强。
结论
总体而言，图14-19中描述的数据证明了具有增加的蛋白酶体和ERAD抑制剂选择压力的细胞合并物可以产生细胞合并物，其具有比仅用MSX选择的等同对照增强的生产率。这提供了进一步的证据，即将蛋白酶体或ERAD抑制剂添加到细胞系构建过程提供了额外的选择压力，导致具有改善的比生产率和过度的重组产物底物的培养群体的出现。
实施例7.用细胞系构建过程期间使用的抑制剂产生的重组CHO细胞合并物的稳定 性
在冷冻保存后恢复来自使用GS选择系统在存在作为额外的选择压力的蛋白酶体抑制剂和MSX的情况下产生的先前的细胞系构建的细胞合并物。然后将这些合并物每3-4天传代15次以确定额外选择压力的有益效果是否随时间得到维持。每3-4天进行常规传代培养，并从后面的传代中取样，以确定对产物产率的影响是否随时间得到维持。在每次传代中，在20ml CD-CHO和如下文概述的MSX中在125ml Erlenmeyer摇瓶中于37oC在5％CO2下在空气环境中在以140rpm摇动的情况下(使用0.2x 106个活细胞/mL)设置表达模型单克隆抗体的重组细胞合并物的分批培养物。如图23所示，不同细胞合并物之间的相对细胞比生产率在不同的传代数内得到保留。
实施例8.通过在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下培养来选择/适应GS-KO CHO细胞宿主以产生具有增强的生产率特征的新宿主。
为了确定是否可以通过在存在蛋白质降解抑制剂的情况下培养Lonza GS-KO CHO宿主细胞系来产生具有产生增强的重组蛋白质产率和质量的能力的适应/选择的宿主细胞，在存在各种蛋白质降解抑制剂的情况下培养GS-KO宿主细胞以进行一系列传代。因此，在20ml CD-CHO+6mM谷氨酰胺+如下文概述的适当抑制剂中于125ml Erlenmeyer摇瓶中于37℃在5％CO2下在空气环境中在以140rpm摇动的情况下培养宿主细胞系。在每次传代时，将新培养物以0.2x 106个活细胞/ml接种。当细胞数超过每mL 1x 106个活细胞时传代细胞。
采用以下浓度和传代：宿主细胞用DMSO，或用终浓度15.6nM的MG132、终浓度1和0.1μM的Eeyarestatin I，以及终浓度6.25nM的环氧霉素，并且在向宿主加入药物后进行9次传代。最终MG132浓度62.5nM中的宿主细胞在加入药物后进行5次传代，并且在终浓度25nM的环氧霉素中的宿主细胞在加入药物后进行8次传代。然后，所有上述细胞在缺乏药物的情况下再具有2次传代以进行瞬时表达实验，从而除去选择/适应压力。在存在终浓度125nM的MG132的情况下培养的宿主细胞的情况下，第一次实验没有足够的细胞，其中在存在药物的情况下培养后立即进行含有模型单克隆抗体的载体的转染。然而，在存在该浓度的MG132的情况下的细胞在该浓度下进行4次传代，然后在缺乏药物的情况下再进行2次传代。此时，对于要进行的在没有药物的情况下传代细胞后的转染(两个中的第二项实验)有足够的细胞。
然后通过用20μg模型cB72.3质粒和1x 107个活细胞电穿孔进行上文描述的出现的细胞宿主合并物的瞬时转染，并将细胞置于20ml新鲜CD-CHO培养基加6mM谷氨酰胺的125ml Erlenmeyer摇瓶中，并在37℃在5％CO2下在空气环境中在以140rpm摇动的情况下培养。这对一直连续在存在抑制剂的情况下的宿主细胞合并物和那些已经在缺乏抑制剂的情况下再传代2代的宿主细胞合并物进行。从这些分批培养物中取样以监测转染后48、96和168小时的生长和抗体滴度。在图20-23中呈现得出的结果和数据。
第一，评估在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下培养后在宿主细胞合并物的分批培养中瞬时转染后实现的抗体产物浓度(图20)。在用20μg DNA电穿孔1x107个活细胞并重悬浮于20ml培养物中后，在转染后48、96和168小时取得的上清液样品中评估cB72.3浓度。在电穿孔之前，在存在指定浓度的指定蛋白酶体和ERAD抑制剂的情况下培养宿主细胞系。在Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度。如图20所示，在存在终浓度0.1μM的Eeyarestatin I的情况下培养的细胞产生比DMSO对照细胞更高的瞬时滴度，提供了在存在蛋白酶体抑制剂的情况下培养宿主细胞可以用于适应/选择具有较高重组蛋白产生能力的细胞的证据。
第二，评估在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下初始培养，然后在缺乏抑制剂的情况下后续传代培养2代，之后瞬时分批培养后瞬时转染CHO宿主细胞合并物后实现的抗体产物浓度(图21)。在用20μgDNA电穿孔1x107个活细胞并重悬浮到20ml分批培养物中后，在转染后48、96和168小时取得的上清液样品中评估cB72.3浓度。在电穿孔之前，最初在存在蛋白酶体和ERAD抑制剂的情况下培养宿主细胞系，然后在不存在抑制剂的情况下传代两次。再Octet系统上使用蛋白A传感器评估产物滴度。如图21所示，最初在存在EeyarestatinI或6.25nM环氧霉素的情况下培养的细胞比DMSO对照细胞产生更高的瞬时滴度，提供了在存在蛋白酶体抑制剂的情况下培养宿主细胞可以用于适应/选择具有较高重组蛋白产生能力的细胞的证据。
第三，经由western印迹评估在存在蛋白酶体或ERAD抑制剂的情况下培养后立即或在缺乏抑制剂的情况下传代培养两代后瞬时转染宿主细胞合并物后分批培养物的上清液中的抗体(图22)。在用20μg DNA电穿孔1x107个活细胞并重悬浮到20ml分批培养物中后，在转染后168小时取得的上清液样品中评估cB72.3浓度。在电穿孔之前，最初在存在蛋白酶体和ERAD抑制剂的情况下培养宿主细胞系，然后在缺乏抑制剂的情况下传代两次。使用抗重链抗体(Sigma)探测Western印迹。如图22所示，蛋白质降解抑制剂的各种组合产生比DMSO对照细胞更强的抗体条带，提供了在存在蛋白酶体抑制剂的情况下培养宿主细胞可以用于适应/选择具有较高重组蛋白产生能力的细胞的证据。
结论
在转染前培养宿主细胞群体期间蛋白酶体或ERAD抑制剂存在的效果特别显示当向培养基中加入低浓度的Eeyarestatin I(0.1μM)进行细胞选择/适应时细胞比生产率和滴度增加。这提示了在存在蛋白质降解抑制剂的情况下CHO宿主细胞系的选择/适应可以用于产生具有增强的产生重组蛋白的能力的宿主群体。然而，为了使蛋白酶体或ERAD抑制剂选择最有效，需要生产重组产物的需求。为了使群体以稳定表型(例如，增强的产物滴度和质量)出现，可以将宿主培养更长的时间段和较高的世代数。

Claims (61)

1.评估、分类、鉴定、生成或选择用于例如产生产物，例如多肽、重组多肽的细胞或后代细胞或后代细胞群体的方法，所述方法包括：
a)任选地提供细胞；
b)使所述细胞(或所述细胞的后代)与蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂、或内质网相关降解(ERAD)抑制剂接触；
c)评估蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂或ERAD抑制剂对所述细胞(或所述细胞的后代)中与细胞功能相关的一个或多个参数的影响；
d)任选地将蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂对所述一个或多个参数的影响的值与参考值比较；并且
e)任选地从所述细胞(或所述细胞的后代)表达产物，例如重组多肽；并且
从而评估、分类、鉴定、生成或选择细胞或后代细胞或后代细胞群体。
2.权利要求1的方法，其还包括例如作为步骤(b)的一部分，培养与所述蛋白质降解抑制剂接触的所述细胞(或所述细胞的后代)，例如以提供培养细胞群体，例如后代细胞群体。
3.权利要求1或2的方法，其包括将所述蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂的影响的值与参考值比较，例如其中当所述值满足或超过所述参考值时，鉴定、分类或选择细胞或后代细胞或后代细胞群体，例如用于建立培养物，例如细胞合并物或用于产生产物，例如多肽，例如重组多肽。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其还包括从所述细胞或后代细胞建立细胞系。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中与细胞功能相关的参数包括选自：
i)细胞存活，
ii)培养存活力，
iii)产生产物，例如多肽，例如重组多肽的能力，
iv)蛋白酶体活性；或
v)表达产物，例如多肽，例如重组多肽的质量，例如较同质的产物。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂是蛋白酶体抑制剂，任选地其中所述蛋白酶体抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：20S核心亚基、19S调节亚基、11S调节颗粒、或辅助蛋白酶体组装的伴侣蛋白，例如Hsm3/S5b、Nas2/p27、Rpn14/PAAF1和Nas6/癌性锚蛋白重复序列(gankyrin)，任选地其中所述蛋白酶体抑制剂选自MG132、环氧霉素(epoxomicin)、硼替佐米(bortezomib)、伊沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、双硫仑(disulfiram)、CEP-18770、ONX 0912、盐孢酰胺(salinosporamide)、LLnV、CEP1612、乳胞素、PS-341、和eponomicin。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂是ERAD抑制剂，任选地，其中所述ERAD抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：钙联接蛋白/钙网织蛋白、UDP-葡萄糖-糖蛋白葡萄糖基转移酶、ER降解增强性α-甘露糖苷酶样蛋白(EDEM)、ER甘露糖苷酶I、Sec61、CDC48p(VCP/p97)、Hrd1、Doa10、Ubc6、Ubc1、Cue1、或Ubc7，任选地，其中所述蛋白质降解抑制剂是eeyarestatin I。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂是泛素途径抑制剂，任选地，其中所述泛素途径抑制剂抑制或降低以下一种或多种的活性：E1泛素激活酶、E2泛素缀合酶、或E3泛素连接酶。
9.权利要求6-8中任一项的方法，其还包括：
使所述细胞与第二蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、ERAD抑制剂或泛素途径抑制剂接触，任选地，其中所述细胞与蛋白质降解的第一和第二抑制剂接触，例如同时或序贯。
10.权利要求9的方法，其中：
(i)所述第一蛋白质降解抑制剂和第二蛋白质降解抑制剂选自MG132、环氧霉素或eeyarestatin 1；
(ii)所述第一抑制剂是蛋白酶体抑制剂，并且所述第二抑制剂是蛋白酶体抑制剂；
(iii)所述第一抑制剂是蛋白酶体抑制剂，并且所述第二抑制剂是ERAD抑制剂或泛素途径抑制剂；
(iv)所述第一抑制剂是ERAD抑制剂，并且所述第二抑制剂是ERAD抑制剂；
(v)所述第一抑制剂是ERAD抑制剂，并且所述第二抑制剂是泛素途径抑制剂或蛋白酶体抑制剂；
(vi)所述第一抑制剂是泛素途径抑制剂，并且所述第二抑制剂是泛素途径抑制剂；或
(vii)所述第一抑制剂是泛素途径抑制剂，并且所述第二抑制剂是ERAD抑制剂或蛋白酶体抑制剂。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中使所述细胞与一定浓度的所述蛋白质降解抑制剂接触，所述浓度足以将培养物存活力降低约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％，例如，与使所述培养物与所述抑制剂接触之前的培养物存活力相比，或与未接触所述抑制剂的培养物相比，任选地其中所述蛋白质降解抑制剂的浓度是一种或多种细胞继续增殖的浓度。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂的浓度小于0.5μM MG-132，例如约0.0625μM MG-132；或小于0.05μM环氧霉素，例如约0.025μM环氧霉素。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中由所述蛋白质降解抑制剂接触所述细胞，例如在所述蛋白质降解抑制剂中培养所述细胞达24、48、72、96小时或更多小时。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中在选择步骤，例如MSX选择之前，之后24、48、72、96、或168小时或同时或并行由所述蛋白质降解抑制剂接触所述细胞。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其包括：
提供表达所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的细胞，例如包含编码所述多肽，例如所述重组多肽或控制所述多肽，例如，所述重组多肽的表达的外源核酸的细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述产物包含重组多肽，例如抗体分子(例如，单克隆抗体)、双特异性分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素、或酶，例如，选自表1或2。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述细胞来自小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、人、狗、骆驼、马、雪貂或猫；或者是除哺乳动物细胞以外的真核细胞，例如，所述细胞来自昆虫、植物、鸭、鹦鹉、鱼或酵母。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述细胞是CHO细胞，例如CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN、或CHO衍生的细胞。
20.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述细胞选自HeIa、HEK293、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、EB66、C127、L细胞、COS，例如COS1和COS7、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11、和CHOZN。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其包括从所述细胞或后代细胞中表达所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽，任选地，其中对表达的产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽评估与物理或功能特性相关的参数，例如，一级序列、糖基化、一级、二级、三级或四级结构、活性、糖基化程度、聚集程度、具有预选性质，例如具有预选的单体、二聚体或三聚体结构的表达产物的比例或水平、或具有预选结构，例如非变性或非聚集结构的表达产物的水平或比例。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其还包括将外源核酸导入所述细胞中，任选地，其中在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之前或之后导入所述外源核酸。
23.权利要求22的方法，其中所述外源核酸编码多肽，例如重组多肽，例如选自表1或2的治疗性多肽或抗体分子。
24.权利要求1-23的方法，其还包括将一种或多种另外的外源核酸，例如第二外源核酸导入所述细胞中，任选地，其中导入外源核酸包括转染、电穿孔或转导，任选地，其中在步骤a)、b)、c)和d)中的一个或多个之前或之后导入所述第二外源核酸。
25.权利要求22-24的方法，其中在导入所述第一外源核酸之前、之后或同时导入所述第二外源核酸，任选地，其中所述第二外源核酸编码选择标志物，例如谷氨酰胺合酶。
26.权利要求1-25的方法，其还包括对所述细胞评估第二特性，例如，确定所述细胞是否包含外源组分，例如一种或多种外源核酸，例如整合到所述细胞的核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到所述细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸，任选地其中确定所述细胞是否包含整合到所述细胞的核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到所述细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸包括MSX选择、MTX选择(例如，DHFR系统)、抗生素选择、酵母生长选择、基于颜色变化的选择或标记物的表面表达、基于Selexis系统的选择、或基于Catalant系统的选择，任选地，其中抗生素选择包括选择对选自潮霉素、新霉素(G418)、zeocin、嘌呤霉素或杀稻瘟素的抗生素的抗性。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述细胞包含编码所述产物，例如所述重组多肽的外源核酸，或控制所述产物，例如内源多肽表达的外源核酸。
28.权利要求22-27中任一项的方法，其中所述外源核酸还包含编码选择标志物的核酸序列，任选地，其中所述选择标志物包含谷氨酰胺合酶、DHFR或赋予抗生素抗性的基因。
29.权利要求28的方法，其中编码所述选择标志物的核酸序列与第一启动子可操作地连接，并且编码所述多肽，例如所述重组多肽的核酸序列与第二启动子可操作地连接，任选地，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
30.权利要求29的方法，其中：
(i)与所述选择标志物可操作连接的启动子是弱启动子，例如SV40E启动子；和/或
(ii)与编码所述多肽，例如重组多肽的核酸序列可操作连接的启动子是强启动子，例如CMV启动子，例如hCMV-MIE启动子。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述产物，例如多肽，例如重组多肽，具有相同的氨基酸序列在不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基处与人多肽的天然存在的同种型不同，例如其中所述产物，例如多肽，例如重组多肽是来自表1或表2的多肽。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其包括：
c)评估所述蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂对与细胞功能，例如存活、存活力、或增殖能力、或产生产物，例如多肽，例如从外源核酸表达的多肽的能力相关的参数的影响；并且
d)通过例如MSX选择确定所述细胞是否包含整合到所述细胞的染色体基因组中的外源核酸。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂对所述与细胞功能相关的参数的作用的值超过参考值达5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多，或1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或8倍或更多，其中所述参考值是所述蛋白质降解抑制剂对与参考细胞的细胞功能相关的参数的影响的值或对与尚未与所述蛋白质降解抑制剂接触的细胞的细胞功能相关的参数的影响的值。
34.权利要求33的方法，其中所述参数包括以下中的一个或多个：
(i)产生产物，例如多肽，例如重组多肽，例如从外源核酸表达的重组多肽的能力；
(ii)产生产物，例如多肽，例如重组多肽的能力，并且其中通过测量或定量所述细胞中或由所述细胞分泌的产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽来确定增加；
(iii)细胞存活，并且其中通过测量或定量凋亡细胞的数目来确定增加或减少；或
(iv)培养物存活力，并且其中通过测量或定量活细胞的数目来确定增加或减少。
35.权利要求1-34中任一项的方法，其还包括另外的选择步骤，例如通过FACS的选择、磁分离(例如，使用磁珠)、菌落挑选、微流体细胞分选或微流体细胞破坏。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其还包括向细胞导入辅助蛋白质折叠的试剂，例如伴侣分子或小化学分子，任选地，其中所述辅助蛋白质折叠的试剂包括核酸，所述核酸编码伴侣蛋白或蛋白质折叠途径的组分，例如XBP1、SRP14、BiP/GRP78、PDI、钙联接蛋白或亲环蛋白B；或选自DMSO、甘油或PBA的小分子。
37.生成细胞系或细胞群体的方法，其包括：
a)通过权利要求1-36中任一项的方法鉴定或选择细胞；并且
b)培养所述细胞或细胞群体以提供细胞系或细胞群体。
38.权利要求37的方法，其中所述鉴定或选择细胞包括使所述细胞或细胞群体与蛋白质降解抑制剂，例如根据权利要求6-12的蛋白质降解抑制剂接触。
39.权利要求37或38的方法，其还包括向所述细胞导入编码产物，例如重组多肽的外源核酸，或控制例如增加产物，例如内源多肽的表达的外源核酸。
40.权利要求37-39中任一项的方法，其包括从所述细胞或后代细胞中表达所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽，任选地，其中对表达的产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽评估与物理或功能特性相关的参数，例如，一级序列、糖基化、一级、二级、三级或四级结构、活性、糖基化程度、聚集程度、具有预选性质，例如具有预选的单体、二聚体或三聚体结构的表达产物的比例或水平、或具有预选结构，例如非变性或非聚集结构的表达产物的水平或比例。
41.权利要求37-40中任一项的方法，其中所述鉴定或选择细胞还包括进行选择步骤，例如，用于确定所述细胞是否包含一种或多种外源核酸的步骤，任选地，其中所述选择步骤包括：
(i)确定所述细胞是否包含整合到所述细胞的核酸中的一种或多种外源核酸，例如整合到所述细胞的染色体基因组中的一种或多种外源核酸；或
(ii)MSX选择、MTX选择、抗生素选择、酵母生长选择、基于颜色变化的选择或标志物的表面表达、基于Selexis系统的选择、或基于Catalant系统的选择。
42.权利要求37-41中任一项的方法，其还包括从所述细胞建立细胞系。
43.权利要求37-42中任一项的方法，其中所述产物包含多肽，例如重组多肽，例如包含抗体分子(例如，单克隆抗体)、双特异性抗体)、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素或酶，例如，具有相同氨基酸序列或与来自表1或表2中的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基的多肽。
44.权利要求37-43中任一项的方法，其中所述细胞是真核细胞，例如根据权利要求17-20中任一项的细胞。
45.生成产物，例如多肽，例如重组多肽的方法，其包括：
a)提供通过权利要求37-44中任一项的方法生成的细胞或细胞群体；
b)在培养基中培养所述细胞或细胞群体；并且
c)任选地，从所述细胞、细胞群体或培养基中回收所述产物，例如多肽。
46.权利要求45的方法，其包括从所述细胞或培养所述细胞的培养基分离所述多肽，例如所述重组多肽。
47.权利要求45-46的方法，其中所述产物包含抗体分子(例如，单克隆抗体)、双特异性分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素或酶，例如，具有相同氨基酸序列或与来自表1或表2中的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基的多肽。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其还包括步骤(f)、(g)或(f)和(g)两者中任一项：
f)在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养细胞或细胞后代(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代或至少12、24、48、72小时)；
g)评估由细胞或细胞后代产生的重组蛋白的水平，例如，以获得由细胞或细胞后代产生的重组蛋白的值；和
h)任选地，将g)中获得的值与所述参考值比较，其中所述参考值是由在缺乏外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养的与a)中提供的细胞相同类型的细胞产生的重组蛋白的水平。
49.生成产生重组蛋白(例如重组治疗性蛋白质，例如重组治疗性抗体)的细胞或细胞后代的方法，其包括：
a)任选地，提供细胞；
b)在存在外源蛋白质降解抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂、泛素途径抑制剂、或内质网相关降解(ERAD)抑制剂的情况下培养所述细胞或所述细胞后代(例如，达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多代或达至少12、24、48、72小时或1、2、4、8、16、32或更多周)；
c)在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养所述细胞或细胞后代(例如，达至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代或达至少12、24、48、72小时)；
d)任选地，评估所述蛋白质降解抑制剂对由所述细胞或所述细胞后代产生的重组蛋白水平的影响，例如，以获得由所述细胞或所述细胞后代产生的重组蛋白的值；并且
e)任选地，将d)中获得的值与参考值比较，其中所述参考值是由在缺乏所述外源蛋白质降解抑制剂的情况下培养的与a)中提供的细胞相同类型的细胞产生的重组蛋白的水平；
从而生成所述细胞或细胞后代。
50.权利要求49的方法，其还包括f)选择所述细胞以用于制备重组蛋白(例如重组治疗性蛋白质)的方法。
51.权利要求49或50的方法，其还包括g)将外源核酸导入所述细胞中(例如，在步骤c)之后、在步骤d)之后、在步骤e)之后或在步骤f)之后)，任选地，其中导入所述外源核酸包括转染、电穿孔或转导。
52.通过权利要求1-51中任一项的方法评估、分类、选择或生成的细胞、后代细胞或后代细胞群体。
53.权利要求52的细胞，其中所述细胞是真核细胞，例如根据权利要求17-20中任一项的细胞。
54.权利要求52或53中任一项的细胞，其中所述细胞包含外源核酸，其控制例如增加产物，例如多肽，例如内源多肽的表达。
55.权利要求54的细胞，其中所述产物包含重组多肽，例如抗体分子(例如，单克隆抗体或双特异性抗体)、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素、酶或双特异性分子，例如，具有相同氨基酸序列或与来自表1或表2中的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基的多肽。
56.通过权利要求1-51中任一项的方法或由权利要求52-55中任一项的细胞产生或可产生的产物，例如多肽，例如重组多肽。
57.权利要求56的产物，例如多肽，例如重组多肽，其中所述产物，例如多肽，例如重组多肽，包含抗体分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素、酶或双特异性分子，例如，具有相同氨基酸序列或与来自表1或表2中的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基的多肽。
58.制剂，其包含通过权利要求1-51中任一项的方法或由权利要求52-55中任一项的细胞产生或可产生的产物，例如多肽，例如重组多肽，任选地，其中，按重量或数目计，所述制剂中所述多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
59.混合物，其包含权利要求52-55中任一项的细胞和产物，例如多肽，例如重组多肽，其中：
按重量或数目计，所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽以比尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞中看到的浓度更高的浓度存在，例如，至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的浓度；或
其中按重量或数目计，所述混合物中的所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
60.由本文所述的细胞、后代细胞或后代细胞群体，例如权利要求52-55中任一项的细胞、后代细胞或后代细胞群体的培养物条件化的培养基制剂，其中
按重量或数目计，所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽以比尚未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞中看到的浓度更高的浓度存在，例如，高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或30％的浓度；或
其中按重量或数目计，所述混合物中的所述产物，例如所述多肽，例如所述重组多肽的至少70、80、90、95、98或99％是正确折叠或功能活性的。
61.权利要求58-60中任一项所述的制剂或混合物，其中所述产物包含抗体分子、凝血因子、抗凝血剂、激素、干扰素、白细胞介素、酶或双特异性分子，例如，具有相同氨基酸序列或与来自表1或表2中的多肽相差不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基。
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