CN101348789A - 通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白 - Google Patents

通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种通过同源重组在真核细胞中生产真核多肽的突变蛋白的方法。本发明另外还涉及一种生产人细胞的方法，所述人细胞适合生产人突变蛋白。最后，本发明涉及通过所述方法生产的人细胞和可从其获得的突变的人蛋白质以及含这些突变蛋白的药物制剂。

Description

通过同源重组在人细胞中生产人突变蛋白
本申请是专利申请号98807438.9，申请日1998年07月22日的同名专利的分案申请。
本发明涉及一种通过同源重组在真核细胞中生产真核多肽的突变蛋白的方法。本发明另外还涉及一种生产人细胞的方法，所述人细胞适合生产人突变蛋白。最后，本发明涉及通过所述方法生产的人细胞和可从其获得的突变的人蛋白质以及含这些突变蛋白的药物制剂。
重组人蛋白质的大量生产是生物技术领域中已知的。这样获得的蛋白质可用作治疗剂。通过缺失、添加或/和取代个别的氨基酸或整个肽片段生产突变的人蛋白质(它们不同于相应的天然人蛋白质)的重组生产方法也是已知的。
尤其在药物应用方面常需要在真核细胞中生产人多肽，因为与在原核细胞例如大肠埃希氏菌(E.coli)中生产的多肽相比，这些多肽被糖基化了，因而与在体内内源性地出现的多肽差别较小，于是更不常观察到不希望的副作用(例如增大的免疫原性或较差的耐受性)的出现。
以前已通过异源重组基因表达生产了突变的人蛋白质。为此，将核酸构建物引入所期望的真核细胞，该真核细胞含有在启动子和选择标记基因的控制下编码所述突变多肽的核酸序列。在该方法中，所述核酸构建物被位点非特异性地整合入所述细胞的基因组。
在该异源重组基因表达中，可能由于位点非特异性整合而经常出现不希望的、不利的过程。例如，在整合入基因组的过程中可能在编码蛋白质的序列中出现突变且尤其是缺失。此外，所述整合可能在基因组中顺式元件所处的位点上进行，该顺式元件对核酸构建物的表达控制序列有阻抑效果，结果获得的细胞重组蛋白质产率减少了。表达构建物整合入所述细胞的重要基因或者导致该细胞死亡，或者导致有机能障碍的重组细胞，它尤其会导致重组蛋白质产率的减少。
插入也能导致以这种方式获得的细胞稳定性的降低，于是在长时间后它们失去其表达重组蛋白质的能力。
因此，本发明的目的是提供一种在稳定的生产细胞中以良好的产率生产糖基化真核多肽的糖基化的方法，所述糖基化尽可能与天然蛋白的糖基化相似，所以至少部分地消除了现有技术的缺点。
该目的是按本发明通过生产真核多肽的突变蛋白的方法实现的，其中
(i)将一种能同源重组的核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的真核细胞，所述核酸分子包括：
(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基因
座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序列相
比，在成熟多肽的编码区具有突变，以及
(b)一段编码选择标记的核酸片段，
(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，
(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及
(iv)从所述细胞或/和细胞上清液分离突变蛋白。
突变的真核蛋白质(尤其是突变的人蛋白质)可通过本发明的方法在同源细胞中生产。意外地，这使得能以高产率获得具有与天然蛋白质很相似的糖基化型式的突变蛋白。本发明方法的一个优点在于，蛋白质可在真核细胞中被突变，并且通过该细胞合成的突变蛋白与内源性地出现的细胞蛋白质相似。本发明方法进一步的优点在于，生成的细胞(该细胞生产突变蛋白)的性能不因位点非特异性基因整合而被不利地改变。因此，该细胞的基因组除了待表达蛋白质的基因座以外未以任何方式改变，于是排除了相关的不利效果。
通过本发明的方法生产的人突变蛋白由于缺失、添加或/和取代个别的氨基酸或整个肽片段而不同于相应的天然蛋白质。优选生产的突变蛋白在N端和/或C端具有突变，例如缺失、插入、取代或/和与其它蛋白质(例如人蛋白质)融合。
本发明的突变蛋白优选是非天然存在的多肽，并且与待突变的多肽的等位基因变异(这在其它起始细胞中是天然出现的)不同之处在于至少一个氨基酸不同。非天然的突变蛋白特别优选地由于缺失、添加或/和插入个别的氨基酸或肽片段而不同于天然的等位基因变异。
应用于本发明方法中的细胞是任意的真核细胞，它具有待突变的靶基因的至少一个内源性拷贝。该细胞优选是人细胞，特别优选是无限增殖化人细胞，例如HeLa细胞、Namalwa细胞或HT 1080细胞。
意外地发现了，当应用的起始细胞含增大数量的染色体(靶基因处于其上)时，可通过同源重组生产细胞，与只含两个拷贝的靶基因的细胞相比，该细胞生产增大产率的突变的人蛋白质。这类起始细胞的实例是具有基因重排的肿瘤细胞系，例如HeLaS3(Puck等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)103(1996)，273～284)和Namalwa(Nadkarni等，癌(Cancer)，23(1969)，64～79)，它们含增大的染色体7拷贝数。
可进行突变靶基因的内源基因激活以进一步改善突变多肽的表达。
为此，可将另外的积极地影响表达产率的序列引入基因组，其中例如所述靶核酸序列的内源表达控制序列被异源表达控制序列至少部分地替代。该异源表达控制序列可能含一个异源启动子或/和增强子，该异源表达控制序列优选含一个病毒启动子，尤其是CMV启动子。当应用合适的启动子时，内源启动子的替代不但能使表达增强，还容许合成突变蛋白。所述异源启动子可以是可调启动子或构建型启动子。此外，该启动子可用于钝化对内源启动子有阻抑效果的顺式元件。这还可导致产率的增大。
被引入起始细胞的核酸分子包括至少一段序列片段，该序列片段容许在靶基因的基因座中通过同源重组整合，并且适合将突变引入成熟靶多肽的编码区。所述核酸分子优选含两个侧翼序列，它们与靶基因座的区域是同源的。该侧翼序列优选各自具有至少150bp的长度并且含编码成熟靶多肽的靶基因座序列的区域，该序列与天然序列相比被修饰了。
此外，所述核酸分子含一种选择标记基因。这可以是真核细胞的任意合适的选择标记基因，它导致在表达时的可选择表型，例如抗生素抗性、辅源营养，表面蛋白的表达等。新霉素磷酸转移酶基因是特别优选的选择标记基因。
此外，所述核酸分子可以任选地含一种负选择标记基因，例如HSV胸苷激酶基因，在选择剂的存在下，它的表达破坏细胞。
如果希望在细胞中扩增修饰的靶基因，则所述核酸分子含一种扩增基因。合适的扩增基因的实例有二氢叶酸还原酶、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。二氢叶酸还原酶基因是特别优选的扩增基因。
当存在扩增基因时，可在同源重组后扩增突变靶核酸序列以便增大细胞中的拷贝数。
本发明的方法能使应用的细胞基因组中存在的全部内源性基因突变。所述靶核酸序列优选是组织纤溶酶原激活物(tPA)、促红细胞生成素、胰岛素、肿瘤坏死因子、白细胞介素或白细胞介素受体序列。通过本发明的方法获得的突变蛋白特别优选是一种其生物性质与相应的天然蛋白质的性质不同的多肽，例如得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽(EP 0 382 174)。
可应用已知技术分离所述突变蛋白。该突变蛋白优选是从在悬浮液中培养的细胞的上清液分离的。可在悬浮液中培养的细胞对于大规模生产是特别有利的。这大为简化了在生产过程中所需的培养细胞的转移。这导致大为节省生产时间和生产资源，于是显著减少了费用。所述突变蛋白特别优选是从在无血清培养基中培养的细胞的上清液分离的。与存在血清时培养的细胞相比，从无血清培养基中培养的细胞可以更简便、更廉价地分离突变蛋白，因为需要更少的纯化步骤。
本发明进一步的主题是可通过前述方法之一从人细胞获得的突变的人多肽，其特征在于人糖基化和不存在所述物种的外源多肽。“不存在所述物种的外源多肽”表示相对于所需蛋白质的量来说少于3wt％的所述物种的外源多肽杂质，优选少于1wt％，最优选少于0.1wt％。
本发明进一步的主题是生产一种表达人靶多肽的突变蛋白的人细胞的方法，其特征在于：
(i)将一种核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的人细胞，所述核酸分子包括：
(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的编码区具有突变，
(b)任选地一种所述靶核酸序列的异源表达控制序列，以及
(c)一段编码选择标记的核酸片段，
(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，
(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及
(iv)分离这样选择的细胞。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子另外还含一种扩增基因，并且所述突变靶核酸序列在同源重组后被扩增了。
本发明又一主题是可通过前述方法获得的人细胞，它含至少一个编码突变的人多肽的内源基因。
本发明的细胞可在合适的培养条件下培养，并且它优选是在悬浮液中生长的细胞，特别优选是在无血清培养基中生长的细胞。
本发明又一主题是通过前述方法生产的人细胞在生产人多肽的突变蛋白方面的应用。
本发明又一主题是一种药物制剂，其特征在于，它含作为活性物质的前述突变蛋白，以及任选含其它活性物质或/和常规药物载体、辅助物质或添加剂。
实施例
含K2域和P域的t-PA突变体的构建：
a)载体构建
导向载体包括如下元件(按5′-3′顺序列出)：
A：6kb BgIII片段，它含约3.5kb的t-PA基因5′上游区(Friezner等，1986，生物化学杂志(JBC)261(15)：6972)。
B：大约5.2基因激活序列(作为AgeI片段)，它含处于RSV启动子和作为终止子的SV40的晚期聚腺苷酸化位点控制下的新霉素磷酸转移酶(NEO)基因，编码鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)的精氨酸突变体(Simonsen等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80(1983)，2495)的基因，该基因受早期SV40启动子和作为终止子的早期SV40聚腺苷酸化位点(Kaufmann等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，2(1982)，1304；Okayama等，分子细胞生物学，3(1983)，280以及Schimke，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，263(1988)，5989)和巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等，细胞(Cell)，41(1995)，p21)的控制。
C：从t-PA cDNA分离的大约200bp片段，它相应于核苷酸位置1～199，并且它含信号序列的编码区和成熟t-PA的最先三个氨基酸(Pennica等，1983，自然(Nature)301：214)。
D：大约1.5kb EcoRI片段，它含tPA基因的内含子G的大部分(Friezner等，在上面所引的文献中，Ny等，1984，PNAS，81：5355)。
这些元件是从合适的起始原料分离的，并且是通过PCR和适当的融合PCR引物装配的。接着将融合的元件连接入pBR322并引入大肠埃希氏菌。还可将所述片段从相应的起始原料切割下来再通过接头连接。
b)人细胞系
将HeLa用作进行内源性基因激活的细胞系，其中证实t-PA基因的转录可通过添加醋酸佛波豆蔻酯来诱导(Waller和Schleuning，1985，生物化学杂志，260：6354)。在通过电穿孔法引入导向载体后，通过添加G418选择含该载体的细胞。通过用能检测所需多肽的表达的ELISA(Imubind-Total tPA，American Diagnostics)测试所述细胞的上清液鉴定由于同源重组而分泌了具有t-PA的K2域和P域的多肽的细胞。

Claims (20)

1.生产真核多肽的突变蛋白的方法，
其中
(i)将一种能同源重组的核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的真核细胞，所述核酸分子包括：
(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的编码区具有突变，以及
(b)一段编码选择标记的核酸片段，
(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，
(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及
(iv)从所述细胞或/和细胞上清液分离突变蛋白。
2.权利要求1的方法，
其中
所述细胞是人细胞。
3.权利要求2的方法，
其中
所述细胞是HeLa细胞、Namalwa细胞或HT 1080细胞。
4.权利要求1～3之一的方法，
其中
应用了在复染色体上含靶核酸序列的起始细胞。
5.前述权利要求之一的方法，
其中
另外，所述靶核酸序列的表达是通过引入异源表达控制序列而激活的。
6.权利要求5的方法，
其中
所述异源表达控制序列是病毒启动子，并且特别是CMV启动子。
7.前述权利要求之一的方法，
其中
所述编码选择标记的核酸片段是新霉素磷酸转移酶基因。
8.前述权利要求之一的方法，
其中
所述被引入细胞的核酸分子另外还含一种扩增基因，并且所述突变靶核酸序列在同源重组后被扩增了。
9.权利要求8的方法，
其中
二氢叶酸还原酶基因被用作扩增基因。
10.前述权利要求之一的方法，
其中
所述靶核酸序列是组织纤溶酶原激活物(t-PA)、促红细胞生成素、胰岛素、肿瘤坏死因子、白细胞介素或白细胞介素受体序列。
11.权利要求1～9之一的方法，
其中
所述突变蛋白是得自t-PA、包括t-PA的K2域和P域的多肽。
12.前述权利要求之一的方法，
其中
所述突变蛋白是从在悬浮液中培养的细胞的上清液分离的。
13.前述权利要求之一的方法，
其中
所述突变蛋白是从在无血清培养基中培养的细胞的上清液分离的。
14.可通过权利要求1～13之一的方法从人细胞获得的突变的人多肽，其特征在于人糖基化和不存在所述种的外源多肽。
15.生产一种表达人靶多肽的突变蛋白的人细胞的方法，
其中
(i)将一种核酸分子引入含编码内源性靶多肽的靶核酸序列的人细胞，所述核酸分子包括：
(a)至少一段序列片段，该序列片段与所述靶核酸序列的基因座中的序列是同源的，并且，与所述内源性靶核酸序列相比，在成熟靶多肽的编码区具有突变，
(b)任选地一种所述靶核酸序列的异源表达控制序列，以及
(c)一段编码选择标记的核酸片段，
(ii)将所述细胞在使得被引入的核酸分子发生同源重组的条件下培养，于是在同源重组后该细胞含有能表达靶多肽的突变蛋白的突变靶核酸序列，
(iii)选择在其中发生了同源重组的细胞，以及
(iv)分离这样选择的细胞。
16.权利要求15的方法，
其中
所述核酸分子另外还含一种扩增基因，并且所述突变靶核酸序列在同源重组后被扩增了。
17.权利要求16的方法，
其中
二氢叶酸还原酶基因被用作扩增基因。
18.可通过权利要求15～17之一的方法获得的人细胞，它含至少一种编码突变的人多肽的内源性基因。
19.权利要求18的人细胞在生产人多肽的突变蛋白方面的应用。
20.药物制剂，
其中
它含有作为活性物质的、权利要求14的突变蛋白以及任选含其它活性物质或/和常规药物载体、辅助物质或添加剂。
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