JP2501307B2 - 新規ヒト・膵臓トリプシン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なヒト・膵臓トリプ
シンIII およびトリプシノーゲンIII に関する。

【０００２】

【従来の技術】トリプシンは、トリプシンの酵素前駆体
であるトリプシノーゲンが膵臓で生合成され、膵液の一
成分として十二指腸に分泌された後、十二指腸粘膜に存
在するエンテロキナーゼの作用で、Ｎ末のペプチドが切
断、除去されて活性化し、トリプシンとなる。

【０００３】ところで、現在医薬品として使用されてい
るトリプシンは、牛起源であり、ヒトにとっては異種蛋
白であるので、局所にのみ使用することが許されている
が、しかし、静脈内、皮下、筋肉内に投与することはで
きない。その上に、広範囲の病巣に長期間使用すること
もできない。また、このような制限下におかれても、な
お異種蛋白なるが故に、感作されるおそれがあるので観
察を十分に行い、感作されたことを示す兆候が現われた
場合は、たとえ治療なかばでも、投与を中止しなければ
ならない。事実、牛膵臓トリプシンに対する過敏症を示
す患者もしばしば報告されている。

【０００４】一方、ヒト・膵臓トリプシンの場合は、上
述の異種蛋白による障害はなく、安心して広範囲に使用
することができる。

【０００５】ヒト・膵臓トリプシノーゲンについては、
既にMitsuru Emi らにより IおよびIIの２種のcDNAクロ
ーンが報告されており(Gene,41,305〜310(1986))、それ
らはO.Guy らが報告しているトリプシノーゲン１および
２に相当する(Biochemistry,17,1669 〜1675(1978)) 。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】今回、本発明者らはヒ
ト・膵臓トリプシン（トリプシノーゲン）について、更
に研究した結果、本発明を完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、 （１）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列のう
ち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ酸配列を含む
ことから成るヒト・膵臓トリプシンIII をコードするＤ
ＮＡ、 （２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （３）配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列
のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列
のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （５）以下に記述する（イ）〜（ニ）の工程から成る、
（１）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列のう
ち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ酸配列を含む
ことから成るヒト・膵臓トリプシンIII をコードするＤ
ＮＡ、（２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
ド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌ
クレオチド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮ
Ａ、（３）配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド
配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌク
レオチド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、
（４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列
のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、より
選択されるＤＮＡの製造法、 （イ） ヒトの膵臓より、ｍＲＮＡを分離する。

【０００８】（ロ） このｍＲＮＡおよび逆転写酵素を
用いてｃＤＮＡバンクを作製する。

【０００９】（ハ） 作製したｃＤＮＡバンクから、プ
ローブを用いてヒト・膵臓トリプシノーゲンをコードす
るｃＤＮＡを含有するプラスミドを単離する。

【００１０】（ニ） このプラスミドから目的とするク
ローン化ＤＮＡを切り出す。

【００１１】（６）（１）配列表の配列番号４に示され
るアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜２２４までの
アミノ酸配列を含むことから成るヒト・膵臓トリプシン
III をコードするＤＮＡ、（２）配列表の配列番号１に
示されるヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド番号７
０〜７４４までのヌクレオチド配列を含むことから成る
（１）記載のＤＮＡ、（３）配列表の配列番号２に示さ
れるヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜
７４４までのヌクレオチド配列を含むことから成る
（１）記載のＤＮＡ、（４）配列表の配列番号３に示さ
れるヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜
７４４までのヌクレオチド配列を含むことから成る
（１）記載のＤＮＡ、より選択されるＤＮＡを含むこと
から成る発現ベクター、 （７）（１）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配
列のうち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ酸配列
を含むことから成るヒト・膵臓トリプシンIII をコード
するＤＮＡ、（２）配列表の配列番号１に示されるヌク
レオチド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４ま
でのヌクレオチド配列を含むことから成る（１）記載の
ＤＮＡ、（３）配列表の配列番号２に示されるヌクレオ
チド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までの
ヌクレオチド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮ
Ａ、（４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド
配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌク
レオチド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、
より選択されるＤＮＡを含むことから成る発現ベクター
で形質転換せしめた宿主、 （８）大腸菌、枯草菌、酵母または動物細胞であること
を特徴とする（７）記載の宿主、に関する。

【００１２】本発明者らがクローニングに成功したヒト
・膵臓トリプシンIII （トリプシノーゲンIII ）のcDNA
クローンは、既に報告のある前記cDNAとは明らかに異な
り、まったく新規の蛋白である。なお、それらの間の相
同性は、DNA 配列レベルで９２％、それらから定められ
たアミノ酸配列レベルでは８６％である。

【００１３】本発明者らがクローニングに成功したヒト
・膵臓トリプシンIII （トリプシノーゲンIII ）のcDNA
クローンの塩基配列および、それより推定されるアミノ
酸配列は表１のとおりである。

【００１４】

【表１】

【００１５】ここで得られたクローンを用いて、活性型
のトリプシンをつくることができる。即ち、表１中のト
リプシンで表わされている塩基配列またはそれと同効の
塩基配列を含有するDNA を用いる。このDNA の５’末端
には、ATG または、トリプシノーゲンのプロ部分または
プレ・プロ部分をコードする塩基配列または同効の塩基
配列を付けてもよい。なお、ATG を５’末端に有する時
には、トリプシンのＮ末にMet を有するポリペプチドを
コードする。

【００１６】表１で表わされる塩基配列またはそれと同
効の塩基配列を含有する本発明のDNA は、例えば以下に
示す（イ）〜（ニ）のステップにより製造することがで
きる。

【００１７】（イ） ヒトの膵臓より、mRNAを分離す
る。

【００１８】（ロ） このmRNAおよび逆転写酵素を用い
てcDNAバンクを作製する。

【００１９】（ハ） 作製したcDNAバンクから、例え
ば、ブタ・膵臓トリプシノーゲンcDNAをプローブに用
い、目的とするヒト・膵臓トリプシノーゲンをコードす
るcDNAを含有するプラスミドを単離する。

【００２０】（ニ） このプラスミドから目的とするク
ローン化DNA を切り出す。膵臓のRNA 抽出にあたって
は、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール
法、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法等も
採用し得るがグアニジン・チオシアネート−グアニジン
・塩酸法が以下の点で、上述２法より優れている。

【００２１】(1) 操作が簡単である。(2) 抽出・回収率
が高い。(3) 比較的大量の臓器からの抽出が可能であ
る。(4) DNA が混入してこない。(5) RNA の分解が少な
い。

【００２２】真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多く
は、その３’末端にポリＡ配列をもつことが知られてい
るので、この特徴を利用して、オリゴ(dT)セルロースの
カラムにmRNAを吸着せしめて、次に、これを溶出して精
製する。

【００２３】得られたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を
用いて相補的二重鎖DNA を合成するが、その方法として
はS1ヌクレアーゼ法 [Efstratiadis, A.et al.: Cell,
7,279(1976)] 、Land法[Land,H.et al.: Nucleic Acids
Res.,9,2251(1981)]、Okayama-Berg法 [Okayama, H.an
d P.Berg: Mol.Cell.Biol.,2,161(1982)]、O.Joon Yoo
法[O.Joon Yoo,et al.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,10
49(1982)] など採用しうるが、本発明の目的には、Okay
ama-Berg法が好適であった。

【００２４】次に、得られた組換えプラスミドを大腸
菌、例えばRR1 株に導入して形質転換させる。テトラサ
イクリン耐性あるいはアンピシリン耐性を、指標とし
て、組換え体を選択することができる。

【００２５】得られた組換え体の中からヒト・膵臓トリ
プシノーゲンをコードするDNA を含有するクローンを選
択するためには、³²P でラベルしたブタ・膵臓トリプシ
ノーゲンcDNAをプローブに用いるコロニーハイブリダイ
ゼーション法を用いた。

【００２６】ここで、選択されたクローンについて、次
に、ヒト・膵臓トリプシノーゲンをコードするDNA 断片
をきり出し、制限酵素地図をつくり、既に報告のあるヒ
ト・膵臓トリプシノーゲンI およびIIと同一の制限酵素
地図を有するクローンは取り除き、目的とする新規なヒ
ト・膵臓トリプシノーゲンIII をコードするクローンを
選出した。

【００２７】選択されたクローンに含有される塩基配列
の決定は、ファージM13 を用いたジデオキシヌクレオチ
ド合成鎖停止の方法[Messing,J. ら：Nucleic Acids Re
s.,9,309(1981)] およびMaxam-Gilbert 法［Maxam,A.M.
and Gilbert,W.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560(197
7)]で実施しうるが、本発明ではジオキシヌクレオチド
合成鎖停止の方法を採用し、新規なヒト・膵臓トリプシ
ノーゲンIII を完全にコードするDNA を有するクローン
を決定した。

【００２８】次に、得られたクローンからヒト・膵臓ト
リプシノーゲンIII をコードするDNA 断片をきり出し、
これを適当な発現ベクターにつないで、適当な宿主に導
入して発現せしめることができる。

【００２９】プロモーターとしては、トリプトフアン(t
rp) プロモーター、ラクトース(lac) プロモーター、ト
リプトフアン・ラクトース(tac) プロモーター、外膜主
要蛋白(lpp) プロモーター、バクテリオファージ由来の
ラムダ（λ）P_Lプロモーター、蛋白質鎖伸長因子Tu(tuf
B)プロモーター等を使用しうる。

【００３０】宿主としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、
酵母等の微生物の他、動物細胞を採用しうる。本発明に
おいて、大量生産せしめるためには大腸菌(LE392,YA21
等）が宿主としては好適である。また、天然と同程度の
活性をもつ、ヒト・膵臓トリプシノーゲンを生産せしめ
るためには、動物細胞および枯草菌が好適である。

【００３１】本発明のDNA を宿主に、形質転換、導入す
る方法としては、Hanahan の方法[Hanahan,D.: J.Mol.B
iol.,166,557(1983)] 、塩化カルシウム法[Dagert,M.an
d S.D.Ehrlich: Gene,6,23(1979)] 、低pH法［高木康敬
編著：遺伝子操作マニュアル，ｐ．４９，講談社サイエ
ンティフイク(1982)］等を採用しうる。本発明において
は、Hanahan の方法が好適であった。

【００３２】組換え体の培養は、通常、１５〜４３℃
で、３〜２４時間行い、必要に応じて、通気や攪拌を加
えることができる。なお、動物細胞を宿主とする場合に
は、３〜１０日間の培養を必要とする。

【００３３】培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、
例えば遠心分離等で集める。宿主として、枯草菌、酵
母、動物細胞等を用いる場合、ベクターの選択によって
は、生産されたトリプシン等は細胞外に出て、上澄液に
含まれる。

【００３４】一方、大腸菌を宿主とした場合、生産され
たトリプシン等は、不溶性の蛋白として、その細胞内の
inclusion bodyに含まれる場合が多い。この場合には、
菌体を破壊して遠心分離することにより、生産されたト
リプシン等は沈殿物として得られる。

【００３５】菌体の破壊の方法としては、超音波処理、
リゾチーム処理、凍結融解処理等を採用することができ
る。該上澄液または沈殿物からのトリプシン等の単離
は、通常知られている蛋白質の精製方法により実施しう
る。

【００３６】

【作用】本発明により製造されるトリプシン等は、ヒト
膵液より抽出精製したトリプシンと同等の生物学的活性
を示し、これと同様の目的に、同様の用法により使用す
ることができる。

【００３７】即ち、例えば膿瘍、潰瘍、火傷、褥創、壊
疽 血腫、汚染せる創面、呼吸器疾患に伴う喀痰喀出困
難等の症状に有用である。

【００３８】トリプシンの投与は、現在、粉末のまま局
所に散布するか、または、その溶液に浸漬したガーゼで
局所を湿布する方法がよく用いられているが、目的によ
っては、カテーテル等により、その溶液を患部に注入、
または、噴霧して吸入する方法も採用される。

【００３９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００４０】実施例１ ヒト・膵臓トリプシノーゲンcD
NAのクローニング (1) ブタ・膵臓トリプシノーゲンcDNAのクローニング ヒト・膵臓トリプシノーゲンcDNAをクローニングするた
めのプローブに供するため、最初にブタ・膵臓トリプシ
ノーゲンcDNAのクローニングを行った。ブタ膵臓よりCh
irgwinらの方法[Biochemistry,18,5294(1979)]によって
膵臓全RNA を分離し、オリゴ(dT)カラムによってmDNAを
精製した。次に、O.Joon Yooらの方法[Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,79,1049(1982)]に従って、精製mRNAよりcDNAバ
ンクを作成し、そのcDNAバンクから任意の５０クローン
を選び、BirmboimとDolyの方法[Nucleic Acids Res.,7,
1513(1979)] を用いてプラスミドを分離した。これらの
プラスミドについて、トリプシノーゲンmRNAを多量に含
む１kbのmRNAより合成したcDNAをプローブに使用し、サ
ウザーンプロット解析[Southern,E.M.: J.Mol.Biol.,9
8,503(1975)] を行った。ハイブリダイゼーション後、
プローブと強く会合したプラスミドを選択し、それらに
含まれるcDNAの塩基配列をMaxam-Gilbert の方法[Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,74,560(1977)] に従って決定した。
決定した塩基配列からそのcDNAによってコードされるア
ミノ酸配列を推定し、既知のブタ・膵臓トリプシンのア
ミノ酸配列と比較したところ、pPT52 と命名したプラス
ミドがブタ・膵臓トリプシノーゲンをコードするcDNAを
含むことが明らかとなった。

【００４１】(2) ヒト・膵臓トリプシノーゲンcDNAの
クローニング ヒト膵臓（剖検試料）よりChirgwinらの方法によって膵
臓全RNA を分離後、オリゴ(dT)カラムによってmRNAを精
製し、Okayama-Bergの方法[Mol.Cell.Biol.,2,161(198
2)]を用いてcDNAバンクを作成した。次に、そのcDNAバ
ンクよりヒト・膵臓トリプシノーゲンcDNAを含むクロー
ンを得るため、Grunstein とHogness の方法[Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,72,3961(1975)] に従ってコロニーハ
イブリダイゼーションを行った。プローブには、pPT52
を制限酵素KpnlとSau3A によって消化して得たブタ・膵
臓トリプシノーゲンcDNAを含むDNA 断片を、Rigby らの
方法［J.Mol.Biol.,113,237(1977)]を用いて³²P 標識し
て用いた。2400クローンをスクリーニングしたところ、
そのうちの５６クローンがプローブと強く会合し、これ
らがヒト・膵臓トリブシノーゲンのcDNAを含むことが明
らかとなった。

【００４２】(3) ヒト・膵臓トリプシノーゲンIII cD
NAの選択 ヒト膵臓中には、三種類のトリプシノーゲンが存在して
いることが報告されている[Guy,O.et al.: Biochemistr
y,17,1669(1978)]。そのうちの二種類のトリプシノーゲ
ンI 及びIIに対するcDNAは既にクローニングされている
[Emi,M.et al.:Gene,41,305(1986)] 。スクリーニング
の結果ブタ・膵臓トリプシノーゲンｃＤＮＡプローブと
会合した５６クローンの制限酵素による切断パターンを
解析したところ、多くは既知のヒト・膵臓トリプシノー
ゲンＩ 及びII cDNA の切断パターンと一致したが、５
クローンp#6 , p#10 , p#20 , p#41 , p#47 については
そのどちらの切断パターンとも一致しないことが判明し
た。これらのクローンは等しい切断パターンを示したの
で、同一の未知のヒト・膵臓トリプシノーゲンをコード
するcDNAを含むと考えられた。そこで、これらの５クロ
ーンのうちのp#10について含まれるcDNAの塩基配列をダ
イデオキシ法[Messing,J.et al.: Nucleic Acids Res.,
9,309(1981)]を用いて決定したところ、p#10は既知のヒ
ト・膵臓トリプシノーゲンI 及びII cDNA のそれぞれと
約９２％の塩基配列の相同性を持つ第三のトリプシノー
ゲンをコードするcDNAを含むことが明らかとなった。我
々はこのcDNAによってコードされる新規のヒト・膵臓ト
リプシノーゲンをヒト・膵臓トリプシノーゲンIII と命
名した。

【００４３】実施例２ トリプシノーゲンcDNAの動物細
胞での発現 1) 発現ブラスミドpSV2-Trpの構築 動物細胞を宿主に用いて、ヒト・膵臓トリプシノーゲン
III cDNAを発現させるため、図１に示す手順によって発
現用ベクターと連結した。

【００４４】図中、pSV2- βG はpSV2ベクターにβグロ
ビンcDNAが挿入されているプラスミドであり、p#10はヒ
ト・膵臓トリプシノーゲンIII cDNAが挿入されているプ
ラスミドである。リガーゼ等による酵素反応は“モレキ
ュラークローニング”[ Maniatis, T. et al.(ed)"Mole
cular cloning"(1980)Cold Spring Harbor Lab.]に記載
の方法に従った。pSV2- βG プラスミドの太矢印はSV40
由来のプロモーターを示す。また、p#10プラスミドの斜
線図および黒塗部および白抜部はヒト・膵臓トリプシノ
ーゲンIII cDNA部を示し、そのうち斜線部はシグナルペ
プタイド領域を、黒塗はプロペプタイド領域を示す。発
現用ベクターには、SV40のプロモーター、エンハンサ
ー、ポリＡシグナル、small T antigen 遺伝子の介在配
列を含むpSV2プラスミドを使用した。まず、p#10をPstl
で消化したのちに、ヒト・膵臓トリプシノーゲンIII cD
NAを含む７７０bpのDNA 断片をアガロースゲル電気泳動
にて分離した。次に、分離したDNA 断片をS1ヌクレアー
ゼで処理することにより、その末端を平滑末端に変化さ
せた。また、発現用ベクターpSV2−βG プラスミドをHi
nd 3およびBgl 2 で消化したのちに、プロモーターを含
む 4.2 kb のDNA 断片を分離し、DNA ポリメラーゼＩ処
理を行い、そのDNA 末端を平滑末端に変換させた。以上
のようにして得た平滑末端をもつ２つのDNA 断片をリガ
ーゼによって連結し、大腸菌RR1 を形質転換した。得ら
れた形質転換菌からプラスミドを分離し、それらのプラ
スミドの制限酵素切断パターンを解析することにより、
プロモーターとcDNAが順の向きに連結したトリプシン発
現プラスミドpSV2-Trpを選択した。

【００４５】2) COS １細胞への発現プラスミドpSV2-T
rpの導入（トランスフェクション） pSV2-Trpの動物細胞への導入（トランスフェクション）
は、リン酸カルシウム法で行った[Graham and VanDer E
b: Virology,52,456(1973)] 。トランスフェクションに
使用したCOS １細胞は直径１０cmのシャーレあたりに１
×１０⁶ 細胞をまき、１０％牛胎児血清を含むダルベッ
コ変法イーグル培地で一晩培養した。次に、３００μg
のpSV2-Trpプラスミドを12.55 mlの滅菌蒸留水に懸濁
し、0.75mlの2.5 MCaCl₂を加え、よく混合した後に、ピ
ペットを用いて溶液中に泡をたてながら、1.5 mlの１０
×HeBS溶液（２１０mMのHEPES 緩衝液、1.37ＭのNaCl、
4.7mMのKCl 、10.6mMのNa₂PO₄、55.5mMのブドウ糖pH7.0
5) を滴下してDNA とリン酸カルシウムの沈殿を形成さ
せた。３０分間室温で放置して沈殿を熟成させた後、そ
の１ml（シャーレ１枚あたり）を１０％牛胎児血清を含
む新鮮な培地に置換したCOS １細胞へ加えた。３７℃、
５％ CO₂存在下にて１２時間培養した後、培養液を捨
て、牛胎児血清を含まない新しいダルベッコ変法イーグ
ル培地に置換して更に４８時間培養した。

【００４６】3) 培地上清中のトリプシン活性の測定 図１の手順でpSV2に組み込んだヒト・膵臓トリプシノー
ゲンcDNAはシグナルペプタイド領域、およびプロペプタ
イド領域を保持しているので、発現されるトリプシンは
プロペプタイドをもつトリプシノーゲンとして培地中へ
分泌されることが期待される。そこで、４８時間培養後
の培養液中のトリプシン活性を合成基質D - Val - Leu
- Arg −アミノフルオロクマリンを用いて測定した。

【００４７】培養上清をエンテロペプチダーゼで処理
し、トリプシノーゲンを活性化したのちに、５０mMトリ
ス塩酸、１０mM CaCl₂、１％ジメチルホルムアミド存在
下にてD - Val - Leu - Arg - アミノフルオロクマリン
と反応させた。その結果、COS１細胞のみの培養液では
全くトリプシン活性が検出されなかったのに対し、pSV2
-TrpをトランスフェクションしたCOS １細胞の培養液で
は培養液中にトリプシン活性が認められた。しかも、検
出されたトリプシン活性は、トリプシンの阻害剤である
Phe - Ala - Arg - クロロメチルケトン(FARCK) によっ
て完全に阻害された。また、エンテロペプチダーゼによ
る活性化処理を行わなかった場合には、培養上清中にト
リプシン活性は検出されなかった。以上の結果から、pS
V2-TrpをトランスフェクションしたCOS １細胞はヒト・
膵臓トリブシノーゲンを培地中に分泌生産すると結論さ
れた。

【００４８】pSV2-TrpをCOS １細胞へ導入した本実施例
においてはヒト・膵臓トリプシノーゲンIII の生産は短
期的(transient expression)であるが、pSV2-Trpプラス
ミドに適当な選択マーカー（例えば、neo 遺伝子、dihy
drofolate reductase 遺伝子など）を連結してCHO 細胞
等に導入すれば長期的にヒト・膵臓トリプシノーゲンII
I を生産可能な細胞株を得ることが可能である。また、
培地中に分泌生産されたヒト・膵臓トリプシノーゲン
は、例えば膵臓トリプシンインヒビター・セファロース
カラムによって容易に精製可能である。

【００４９】

【発明の効果】本発明のＤＮＡを使用することにより、
新規蛋白質であるヒト・膵臓トリプシンが提供され、該
蛋白質は医薬品として使用することができる。

【００５０】

【配列表】

［配列番号１］ 配列の長さ：７４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 配列の特徴 １−７１４ ＣＤＳ １−４５ ｓｉｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ ７０−７１４ ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ 配列 ATG AAT CCA TTC CTG ATC CTT GCC TTT GTG GGA GCT GCT GTT GCT GTC 48 Met Asn Pro Phe Leu Ile Leu Ala Phe Val Gly Ala Ala Val Ala Val -23 -20 -15 -10 CCC TTT GAC GAT GAT GAC AAG ATT GTT GGG GGC TAC ACC TGT GAG GAG 96 Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Glu Glu -5 1 5 AAT TCT CTC CCC TAC CAG GTG TCC CTG AAT TCT GGC TCC CAC TTC TGC 144 Asn Ser Leu Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys 10 15 20 25 GGT GGC TCC CTC ATC AGC GAA CAG TGG GTG GTA TCA GCA GCT CAC TGC 192 Gly Gly Ser Leu Ile Ser Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 30 35 40 TAC AAG ACC CGC ATC CAG GTG AGA CTG GGA GAG CAC AAC ATC AAA GTC 240 Tyr Lys Thr Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Lys Val 45 50 55 CTG GAG GGG AAT GAG CAG TTC ATC AAT GCG GCC AAG ATC ATC CGC CAC 288 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His 60 65 70 CCT AAA TAC AAC AGG GAC ACT CTG GAC AAT GAC ATC ATG CTG ATC AAA 336 Pro Lys Tyr Asn Arg Asp Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys 75 80 85 CTC TCC TCA CCT GCC GTC ATC AAT GCC CGC GTG TCC ACC ATC TCT CTG 384 Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu 90 95 100 105 CCC ACC GCC CCT CCA GCT GCT GGC ACT GAG TGC CTC ATC TCC GGC TGG 432 Pro Thr Ala Pro Pro Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp 110 115 120 GGC AAC ACT CTG AGC TTT GGT GCT GAC TAC CCA GAC GAG CTG AAG TGC 480 Gly Asn Thr Leu Ser Phe Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Lys Cys 125 130 135 CTG GAT GCT CCG GTG CTG AGG GAG GCT GAG TGT AAA GCC TCC TGC CCT 528 Leu Asp Ala Pro Val Leu Arg Glu Ala Glu Cys Lys Ala Ser Cys Pro 140 145 150 GGA AAG ATT ACC AAC AGC ATG TTC TGT GTG GGC TTC CTT GAG GGA GGC 576 Gly Lys Ile Thr Asn Ser Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 155 160 165 AAG GAT TCC TGG AAG CGT GAC TCT GGT GGC CCT GTG GTC TGC AAC GGA 624 Lys Asp Ser Trp Lys Arg Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 170 175 180 185 CAG CTC CAA GGA GTT GTC TCC TGG GGC CAT GGC TGT GCC TGG AAG AAC 672 Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly His Gly Cys Ala Trp Lys Asn 190 195 200 AGG CCT GGA GTC TAC ACC AAG GTC TAC AAC TAT GTG GAC TGG ATT AAG 720 Arg Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Asp Trp Ile Lys 205 210 215 GAC ACC ATC GCT GCC AAC AGC TAA 744 Asp Thr Ile Ala Ala Asn Ser 220 ［配列番号２］ 配列の長さ：７４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 配列の特徴 １−７１４ ＣＤＳ １−４５ ｓｉｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ ７０−７１４ ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ 配列 ATG AAT CCA TTC CTG ATC CTT GCC TTT GTG GGA GCT GCT GTT GCT GTC 48 Met Asn Pro Phe Leu Ile Leu Ala Phe Val Gly Ala Ala Val Ala Val -23 -20 -15 -10 CCC TTT GAC GAT GAT GAC AAG ATT GTT GGG GGC TAC ACC TGT GAG GAG 96 Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Glu Glu -5 1 5 AAT TCT CTC CCC TAC CAG GTG TCC CTG AAT TCT GGC TCC CAC TTC TGC 144 Asn Ser Leu Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys 10 15 20 25 GGT GGC TCC CTC ATC AGC GAA CAG TGG GTG GTA TCA GCA GCT CAC TGC 192 Gly Gly Ser Leu Ile Ser Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 30 35 40 TAC AAG ACC CGC ATC CAG GTG AGA CTG GGA GAG CAC AAC ATC AAA GTC 240 Tyr Lys Thr Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Lys Val 45 50 55 CTG GAG GGG AAT GAG CAG TTC ATC AAT GCG GCC AAG ATC ATC CGC CAC 288 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His 60 65 70 CCT AAA TAC AAC AGG GAC ACT CTG GAC AAT GAC ATC ATG CTG ATC AAA 336 Pro Lys Tyr Asn Arg Asp Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys 75 80 85 CTC TCC TCA CCT GCC GTC ATC AAT GCC CGC GTG TCC ACC ATC TCT CTG 384 Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu 90 95 100 105 CCC ACC GCC CCT CCA GCT GCT GGC ACT GAG TGC CTC ATC TCC GGC TGG 432 Pro Thr Ala Pro Pro Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp 110 115 120 GGC AAC ACT CTG AGC TTT GGT GCT GAC TAC CCA GAC GAG CTG AAG TGC 480 Gly Asn Thr Leu Ser Phe Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Lys Cys 125 130 135 CTG GAT GCT CCG GTG CTG AGG GAG GCT GAG TGT AAA GCC TCC TGC CCT 528 Leu Asp Ala Pro Val Leu Arg Glu Ala Glu Cys Lys Ala Ser Cys Pro 140 145 150 GGA AAG ATT ACC AAC AGC ATG TTC TGT GTG GGC TTC CTT GAG GGA GGC 576 Gly Lys Ile Thr Asn Ser Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 155 160 165 AAG GAT TCC TGG AAG CGT GAC TCT GGT GGC CCT GTG GTC TGC AAC GGA 624 Lys Asp Ser Trp Lys Arg Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 170 175 180 185 CAG CTC CAA GGA GTT GTC TCC TGG GGC CAT GGC TGT GCC TGG AAG AAC 672 Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly His Gly Cys Ala Trp Lys Asn 190 195 200 AGG CCT GGA GTC TAC ACC AAG GTC TAC AAC TAT GTG GAC TGG ATT AAG 720 Arg Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Asp Trp Ile Lys 205 210 215 GAC ACC ATC GCT GCC AAC AGC TGA 744 Asp Thr Ile Ala Ala Asn Ser 220 ［配列番号３］ 配列の長さ：７４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源 生物名：ホモ サピエンス(Homo sapiens) 配列の特徴 １−７１４ ＣＤＳ １−４５ ｓｉｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ ７０−７１４ ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ 配列 ATG AAT CCA TTC CTG ATC CTT GCC TTT GTG GGA GCT GCT GTT GCT GTC 48 Met Asn Pro Phe Leu Ile Leu Ala Phe Val Gly Ala Ala Val Ala Val -23 -20 -15 -10 CCC TTT GAC GAT GAT GAC AAG ATT GTT GGG GGC TAC ACC TGT GAG GAG 96 Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Glu Glu -5 1 5 AAT TCT CTC CCC TAC CAG GTG TCC CTG AAT TCT GGC TCC CAC TTC TGC 144 Asn Ser Leu Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys 10 15 20 25 GGT GGC TCC CTC ATC AGC GAA CAG TGG GTG GTA TCA GCA GCT CAC TGC 192 Gly Gly Ser Leu Ile Ser Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 30 35 40 TAC AAG ACC CGC ATC CAG GTG AGA CTG GGA GAG CAC AAC ATC AAA GTC 240 Tyr Lys Thr Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Lys Val 45 50 55 CTG GAG GGG AAT GAG CAG TTC ATC AAT GCG GCC AAG ATC ATC CGC CAC 288 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His 60 65 70 CCT AAA TAC AAC AGG GAC ACT CTG GAC AAT GAC ATC ATG CTG ATC AAA 336 Pro Lys Tyr Asn Arg Asp Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys 75 80 85 CTC TCC TCA CCT GCC GTC ATC AAT GCC CGC GTG TCC ACC ATC TCT CTG 384 Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu 90 95 100 105 CCC ACC GCC CCT CCA GCT GCT GGC ACT GAG TGC CTC ATC TCC GGC TGG 432 Pro Thr Ala Pro Pro Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp 110 115 120 GGC AAC ACT CTG AGC TTT GGT GCT GAC TAC CCA GAC GAG CTG AAG TGC 480 Gly Asn Thr Leu Ser Phe Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Lys Cys 125 130 135 CTG GAT GCT CCG GTG CTG AGG GAG GCT GAG TGT AAA GCC TCC TGC CCT 528 Leu Asp Ala Pro Val Leu Arg Glu Ala Glu Cys Lys Ala Ser Cys Pro 140 145 150 GGA AAG ATT ACC AAC AGC ATG TTC TGT GTG GGC TTC CTT GAG GGA GGC 576 Gly Lys Ile Thr Asn Ser Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 155 160 165 AAG GAT TCC TGG AAG CGT GAC TCT GGT GGC CCT GTG GTC TGC AAC GGA 624 Lys Asp Ser Trp Lys Arg Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 170 175 180 185 CAG CTC CAA GGA GTT GTC TCC TGG GGC CAT GGC TGT GCC TGG AAG AAC 672 Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly His Gly Cys Ala Trp Lys Asn 190 195 200 AGG CCT GGA GTC TAC ACC AAG GTC TAC AAC TAT GTG GAC TGG ATT AAG 720 Arg Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Asp Trp Ile Lys 205 210 215 GAC ACC ATC GCT GCC AAC AGC TAG 741 Asp Thr Ile Ala Ala Asn Ser 220 ［配列番号４］ 配列の長さ：２４７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：Ｎｏ 起源 生物名：ホモサピエンス(Homo sapiens) 配列の特徴 −２３−−１５ ｓｉｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ １−２２４ ｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ 配列 Met Asn Pro Phe Leu Ile Leu Ala Phe Val Gly Ala Ala Val Ala Val -23 -20 -15 -10 Pro Phe Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Glu Glu -5 1 5 Asn Ser Leu Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys 10 15 20 25 Gly Gly Ser Leu Ile Ser Glu Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 30 35 40 Tyr Lys Thr Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Lys Val 45 50 55 Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Arg His 60 65 70 Pro Lys Tyr Asn Arg Asp Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys 75 80 85 Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Asn Ala Arg Val Ser Thr Ile Ser Leu 90 95 100 105 Pro Thr Ala Pro Pro Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp 110 115 120 Gly Asn Thr Leu Ser Phe Gly Ala Asp Tyr Pro Asp Glu Leu Lys Cys 125 130 135 Leu Asp Ala Pro Val Leu Arg Glu Ala Glu Cys Lys Ala Ser Cys Pro 140 145 150 Gly Lys Ile Thr Asn Ser Met Phe Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly 155 160 165 Lys Asp Ser Trp Lys Arg Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly 170 175 180 185 Gln Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly His Gly Cys Ala Trp Lys Asn 190 195 200 Arg Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Tyr Asn Tyr Val Asp Trp Ile Lys 205 210 215 Asp Thr Ile Ala Ala Asn Ser 220

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＳＶ２−Ｔｒｐプラスミド構築図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/76 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/76 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/24

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配
   列のうち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ酸配列
   を含むことから成るヒト・膵臓トリプシンIII をコード
   するＤＮＡ。
2. 【請求項２】配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
   ド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌ
   クレオチド配列を含むことから成る請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】配列表の配列番号２に示されるヌクレオチ
   ド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌ
   クレオチド配列を含むことから成る請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】配列表の配列番号３に示されるヌクレオチ
   ド配列のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌ
   クレオチド配列を含むことから成る請求項１記載のＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】以下に記述する（イ）〜（ニ）の工程から
   成る、（１）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列のう
   ち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ酸配列を含む
   ことから成るヒト・膵臓トリプシンIII をコードするＤ
   ＮＡ、 （２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （３）配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 より選択される ＤＮＡの製造法。 （イ） ヒトの膵臓より、ｍＲＮＡを分離する。 （ロ） このｍＲＮＡおよび逆転写酵素を用いてｃＤＮ
   Ａバンクを作製する。 （ハ） 作製したｃＤＮＡバンクから、プローブを用い
   てヒト・膵臓トリプシノーゲンをコードするｃＤＮＡを
   含有するプラスミドを単離する。 （ニ） このプラスミドから目的とするクローン化ＤＮ
   Ａを切り出す。
6. 【請求項６】（１）配列表の配列番号４に示されるアミ
   ノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ
   酸配列を含むことから成るヒト・膵臓トリプシンIII を
   コードするＤＮＡ、 （２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （３）配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 より選択される ＤＮＡを含むことから成る発現ベクタ
   ー。
7. 【請求項７】（１）配列表の配列番号４に示されるアミ
   ノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜２２４までのアミノ
   酸配列を含むことから成るヒト・膵臓トリプシンIII を
   コードするＤＮＡ、 （２）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （３）配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 （４）配列表の配列番号３に示されるヌクレオチド配列
   のうち、ヌクレオチド番号７０〜７４４までのヌクレオ
   チド配列を含むことから成る（１）記載のＤＮＡ、 より選択されるＤＮＡを含むことから成る 発現ベクター
   で形質転換せしめた宿主。
8. 【請求項８】大腸菌、枯草菌、酵母または動物細胞であ
   ることを特徴とする請求項７記載の宿主。