ES2284167T3 - Produccion de carboxipeptidasa b recombinante enzimaticamente activa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR CPB ENZIMATICAMENTE ACTIVA, QUE INCLUYE TRATAR UNA CELULA RECOMBINANTE QUE CONTIENE ADN QUE CODIFICA PROCPB, DE FORMA QUE EL ADN DIRIGE LA EXPRESION DEL PROCPB, RECUPERAR A PARTIR DE LA CELULA EL PROCPB EXPRESADO DE ESTA FORMA, TRATAR EL PROCPB RECUPERADO BAJO UNAS CONDICIONES QUE PERMITEN EL PLEGAMIENTO DEL PROCPB, SOMETER EL PROCPB PLEGADO A UNA ESCISION ENZIMATICA PARA PRODUCIR CPB ENZIMATICAMENTE ACTIVA, Y PURIFICAR LA CPB ENZIMATICAMENTE ACTIVA.
Description
Producción de carboxipeptidasa B recombinante
enzimáticamente activa.
Esta es una continuación en parte de la
solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/378 233
presentada el 25 de enero de 1995, cuyos contenidos se incorporan
aquí por referencia.
A lo largo de esta especificación se mencionan
varias publicaciones mediante números arábigos entre paréntesis.
Las citas completas para estas referencias pueden encontrarse al
final de la descripción inmediatamente antes de las
reivindicaciones. La descripción de estas publicaciones en sus
totalidades se incorpora aquí por referencia dentro de la presente
especificación a fin de describir más completamente el estado de la
técnica a la que pertenece esta invención.
La carboxipeptidasa B de origen natural
[peptidil-L-lisina
(-L-arginina) hidrolasa EC 3.4.17.2] es una
exopeptidasa pancreática que contiene cinc y que elimina
específicamente los aminoácidos Arg, Lys u Orn
C-terminales de los péptidos (1,2).
La carboxipeptidasa B de rata de origen natural
es producida a partir de una proteína precursora, la
preprocarboxipeptidasa B, que contiene un fragmento
N-terminal de 108 aminoácidos de longitud el cual
incluye la secuencia señal (13 aminoácidos) y un péptido de
activación (95 aminoácidos). La preprocarboxipeptidasa B es
enzimáticamente inactiva.
Durante el transporte de la
preprocarboxipeptidasa B al retículo endoplasmático, el péptido
señal es escindido; el precursor de la procarboxipeptidasa B
enzimáticamente inactivo resultante es secretado fuera de la célula.
La carboxipeptidasa B enzimáticamente activa es entonces formada
mediante la escisión del péptido de activación por la tripsina
(7).
La carboxipeptidasa B de rata madura contiene
307 aminoácidos (5) y tiene un peso molecular aparente de 35 kD.
Esta contiene siete residuos cisteína, seis de los cuales están en
parejas mediante enlaces S-S.
La carboxipeptidasa B es ampliamente usada para
propósitos comerciales y de investigación, tales como la producción
de insulina y otros polipéptidos biológicamente activos, y en el
análisis de secuencias de proteínas.
La carboxipeptidasa B comercializada purificada
de páncreas porcino es muy costosa y no está totalmente libre de
otras proteasas.
La secuencia aminoacídica parcial de la
procarboxipeptidasa B precursora porcina y la secuencia aminoacídica
completa de la carboxipeptidasa B bovina se han publicado (3 y 4,
respectivamente). Además, también se ha publicado la secuencia de
nucleótidos completa del gen de rata y del cDNA humano (5 y 6,
respectivamente).
Yamamoto et al. (6) han descrito la
expresión recombinante de la procarboxipeptidasa B humana
enzimáticamente inactiva que carece de los primeros 11 aminoácidos
del péptido de activación.
También informan sobre la expresión recombinante
de una proteína de fusión
\beta-galactosidasa-procarboxipeptidasa
B enzimáticamente inactiva en la que la procarboxipeptidasa carece
de los primeros 11 aminoácidos del péptido de activación.
La Publicación europea núm. 588118 A2 describe
una proteína de tipo carboxipeptidasa relacionada con el hueso
llamada OSF-5. Se especula que la
OSF-5 actúa como una molécula de adhesión o un
factor de crecimiento y que puede usarse como un fármaco para
tratar las enfermedades metabólicas óseas. Sin embargo, no se han
descrito una función o actividad reales de la OSF-5
ni se ha demostrado una producción de la proteína biológicamente
activa, ya sea recombinante o de origen natural.
En Eton et al. (13) se describe el
aislamiento, la clonación molecular y la caracterización parcial de
una nueva carboxipeptidasa B de plasma humano. En la referencia
(14) se describe la purificación de la carboxipeptidasa B de plasma
humano nativa y su clonación y expresión. Un proceso para la
purificación de la carboxipeptidasa B nativa de extracto de
hepatopáncreas de langosta empleando, entre otros, la cromatografía
de afinidad de quelatos metálicos inmovilizados se describe en
(15). En (16) se describe la purificación de la procarboxipeptidasa
B nativa de páncreas bovino en polvos deshidratados y desgrasados
mediante extracción repetida. La recuperación, purificación y
caracterización parcial de la carboxipeptidasa B nativa de intestino
delgado humano mediante, entre otros, el precipitado con sulfato de
amonio y métodos cromatográficos están descritos en (17). El
aislamiento y la caracterización estructural del cDNA y del gen de
la carboxipeptidasa B pancreática de rata se describen en (18) sin
que se haga ninguna referencia a la expresión del gen ni al
plegamiento y la escisión posteriores de la prosecuencia de la
proteína carboxipeptidasa
B.
B.
Por otro lado, en (19) se describe la
desactivación de una proteasa, que puede ser una carboxipeptidasa
del género Kluyveromyces, por la introducción de una o
varias modificaciones genéticas que reducen o modifican la
actividad proteolítica de dicha levadura.
Existen bastantes documentos que hacen
referencia a procesos de producción de proteínas. Así, está descrito
un proceso general de purificación de proteínas producidas de forma
recombinante que comprende la disolución de proteínas insolubles
refráctiles en una solución fuertemente desnaturalizante y el empleo
de una solución ligeramente desnaturalizante para seguir
purificando las proteínas ya disueltas en una solución fuertemente
desnaturalizante (20). Marston (21) ofrece una revisión de los
métodos de purificación de productos polipeptídicos eucariotas
específicos expresados en E. coli. Este documento no hace
referencia a la carboxipeptidasa B pancreática de mamífero o a su
proforma. La separación de las proteínas nativas que se hallan en el
jugo pancreático de rata mediante cromatografía por interacción
hidrofóbica se describe en (22), donde también se hace mención de
la procarboxipeptidasa B.
La presente invención describe la producción de
carboxipeptidasa B pancreática de mamífero no costosa,
enzimáticamente activa, altamente purificada y recombinante.
Todavía no se ha descrito la producción de la carboxipeptidasa B
pancreática de mamífero enzimáticamente activa y su descripción aquí
es novedosa.
La presente invención proporciona un método para
producir carboxipeptidasa B pancreática de mamífero enzimáticamente
activa. El método comprende los siguientes pasos: tratar una célula
recombinante que contiene DNA que codifica procarboxipeptidasa B,
de manera que el DNA dirija la expresión de la procarboxipeptidasa
B; recuperar de la célula la procarboxipeptidasa B así expresada;
tratar la procarboxipeptidasa B recuperada bajo condiciones que
permitan el plegamiento de la procarboxipeptidasa B; someter la
procarboxipeptidasa B plegada a la escisión enzimática para
producir carboxipeptidasa enzimáticamente activa; y purificar la
carboxipeptidasa B enzimáticamente activa.
Los mapas de restricción de los plásmidos
mostrados en las figuras 2 y 3 no identifican todos los sitios de
restricción presentes en los plásmidos. Sin embargo, se muestran
aquellos sitios de restricción necesarios para un entendimiento
completo de la invención.
Se muestra la secuencia nucleotídica del cDNA y
la secuencia aminoacídica correspondiente de la procarboxipeptidasa
B pancreática de rata, incluyendo la secuencia nucleotídica de la
carboxipeptidasa B madura y la secuencia nucleotídica del péptido
de activación. La secuencia de DNA difiere de la secuencia de DNA
publicada por Clauser et al. (5) en 4 nucleótidos, dos de
los cuales dan lugar a un cambio de aminoácidos: Lys^{14} ->
Asn y Arg^{142} -> Asp.
La secuencia nucleotídica del DNA de los tres
cebadores usados durante la clonación (ejemplo 1) también se
muestra (en tamaño de fuente grande): cebador del extremo 5' de la
procarboxipeptidasa B, cebador del extremo 5' de la
carboxipeptidasa B madura y cebador del extremo 3' de la
carboxipeptidasa B.
La numeración de los aminoácidos se hizo de
acuerdo a la homología con la carboxipeptidasa A de páncreas bovino
(10,12), donde el primer aminoácido (Ala) de la carboxipeptidasa B
de rata madura se numeró con el número 4. El asterisco (*) indica
el aminoácido adicional (Leu) que posee la carboxipeptidasa B de
rata en comparación con la carboxipeptidasa A.
El plásmido pABN se digirió con BamHI y
NcoI. El fragmento de 2500 pb se aisló y se ligó al fragmento
de cDNA de la carboxipeptidasa B BamHI-NcoI de 940 pb
(obtenido como se describe en el ejemplo 1). El plásmido recién
obtenido fue designado pCPB y se usó para transformar E. coli
4300.
El plásmido pCPB fue digerido con BamHI y
NdeI a fin de aislar el fragmento grande. El plásmido pCPB
también se digirió con AseI y ScaI a fin de aislar el
fragmento grande.
Se formó un heterodúplex al mezclar los dos
fragmentos grandes con un oligonucleótido fosforilado en su extremo
5' terminal preparado para la mutagénesis dirigida (ejemplo 1) y con
tampón de polimerasa-ligasa (5 x tampón:
Tris-HCl 32,5 mM, pH 7,5; MgCl_{2} 40 mM;
2-mercaptoetanol 5 mM; NaCl 0,5 M) (9). La mezcla
fue hervida a fin de desnaturalizar las hebras de DNA y se enfrió
gradualmente a fin de renaturalizar el DNA. Los productos de
reacción se usaron para transformar E. coli 1645 mediante
electroporación. Los transformantes fueron cribados mediante
crecimiento sobre agar LB que contenía ampicilina y mediante
hibridación diferencial in situ de colonias con el
oligonucleótido fosforilado en su extremo 5' terminal preparado para
la mutagénesis.
El DNA del plásmido se extrajo de las colonias
positivas y, después de un análisis por enzimas de restricción y de
la secuenciación de nucleótidos del DNA, se eligió un clon que
contenía el sitio SpeI mutante. El plásmido recién obtenido
fue designado pCPB-C, el cual codifica una
carboxipeptidasa B con una mutación en el aminoácido 290 de
cisteína a serina. El plásmido pCPB-C se usó para
transformar E. coli 4300.
El cDNA de la procarboxipeptidasa B, obtenido
como se describe en el ejemplo 1, se escindió con NdeI y
ClaI a fin de aislar el fragmento de 470 pb que codifica el
péptido de activación y parte de la carboxipeptidasa B.
El plásmido pCPB-C fue escindido
con BamHI y ClaI a fin de aislar el fragmento de 760
pb que codifica el resto de la carboxipeptidasa B incluida la
mutación Cys^{290} -> Ser.
El plásmido pAB fue escindido con NdeI y
BamHI a fin de aislar el fragmento de 2500 pb que codifica
todos los elementos necesarios para la expresión en bacterias (véase
el ejemplo 1).
Los tres fragmentos arriba mencionados fueron
ligados y el plásmido recién obtenido fue designado como
pProCPB-C.
pProCPB-C.
Los plásmidos pProCPB-C y pCPB
se escindieron con StuI y XhoI. Un fragmento de 3700
pb que codifica todos los elementos necesarios para la expresión en
bacterias (ejemplo 1), el péptido de activación completo y parte de
la carboxipeptidasa B, se aisló del plásmido
ProCPB-C.
Un fragmento de 440 pb, que codifica el resto de
la carboxipeptidasa B, se aisló del plásmido pCPB.
Los dos fragmentos fueron ligados y el plásmido
recién formado se designó p\lambdaProCPB.
La actividad de la carboxipeptidasa B porcina
comercial (Sigma) y de la carboxipeptidasa B recombinante producida
como se describe en el ejemplo 5 se determinó de acuerdo con el
método de Folk (11) usando un sustrato
Hipuril-L-Arg. Se midió la V_{0}
de la reacción catalítica usando concentraciones de sustrato de
entre 0,025-1,0 mM.
El plásmido p\lambdaProCPB fue depositado en
E. coli según, y en cumplimiento de, los requerimientos del
Tratado de Budapest Sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos para el Propósito de procedimientos de
patentes con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), en
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20152, bajo el número de
ATCC 69673, el 4 de agosto de 1994.
El término "CPB", como se usa aquí,
significa un polipéptido, ya sea generado mediante métodos de DNA
recombinante o de otra manera diferente, que tiene la misma, o
esencialmente la misma, secuencia de aminoácidos que cualquier
carboxipeptidasa B de mamífero de origen natural. Por tanto, el
término CPB incluye polipéptidos que difieren en uno o más
aminoácidos, preferiblemente no más de unos 10 aminoácidos, respecto
de la carboxipeptidasa Bs de origen natural.
Como se usa aquí, "ProCPB" significa un
polipéptido, ya sea producido mediante métodos de DNA recombinante
o de otra manera, que tienen la misma, o esencialmente la misma,
secuencia de aminoácidos que cualquier procarboxipeptidasa B de
mamífero de origen natural. Por tanto, el término ProCPB incluye
polipéptidos que difieren en uno o más aminoácidos, preferiblemente
no más de unos 10 aminoácidos, respecto de la procarboxipeptidasa Bs
de origen natural.
Las personas expertas en la materia pueden
fácilmente determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser
agregados, suprimidos o sustituidos (incluyendo con qué aminoácidos
pueden hacerse tales sustituciones) usando procedimientos
establecidos ampliamente conocidos que incluyen, por ejemplo,
métodos convencionales para el diseño y la fabricación de
secuencias de DNA que codifican la expresión bacteriana de
polipéptidos, para la modificación de las secuencias de cDNA y
genómicas mediante técnicas de mutagénesis dirigida, para la
construcción de proteínas recombinantes y vectores de expresión, la
expresión bacteriana de los polipéptidos y la medición de la
actividad bioquímica de los polipéptidos usando ensayos bioquímicos
convencionales.
Como se usa aquí, un CPB "enzimáticamente
activo" significa un CPB que posee la actividad biológica de la
carboxipeptidasa B de mamífero de origen natural. Para el propósito
de esta definición, la actividad biológica de una carboxipeptidasa
B de origen natural es su capacidad de eliminar de forma específica
una arginina, lisina u ornitina C-terminal de un
péptido.
Esencialmente la misma secuencia de aminoácidos
se define aquí que comprende sustituciones, deleciones o adiciones
de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, y puede abarcar hasta
diez (10) residuos de acuerdo con grupos homólogos o equivalentes,
descritos por ejemplo por Lehninger en Biochemistry, 2a. Edición,
Worth Pub., Nueva York (1975), Capítulo 4; Creighton en Protein
Structure, a Practical Approach, IRL Press en Oxford University
Press, Oxford, Inglaterra (1989); y Dayhoff en Atlas of Protein
Sequence and Structure, Vol. 5, The National Biomedical Research
Foundation, Maryland (1972), Capítulo 9. Tales sustituciones son de
conocimiento general para los expertos en el ámbito.
En una realización preferida, el DNA que
codifica ProCPB o CPB puede ser de origen humano, de rata, bovino o
porcino. El DNA puede obtenerse mediante transcripción inversa,
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sistemas sintéticos o
semisintéticos, a través de varios de estos métodos o de otros
métodos conocidos en el campo.
El DNA que codifica el polipéptido ProCPB o la
CPB puede ser mutado por métodos conocidos por los expertos en el
ámbito, por ejemplo Bauer et al. (1985), Gene 37:
73-81. La secuencia mutada puede ser insertada
dentro de vectores de expresión adecuados como los aquí descritos
que se introducen dentro de células que a continuación son tratadas
de manera que el DNA mutado dirija la expresión de un
polipéptido.
Aquellos expertos en la materia entenderán que
el plásmido depositado en relación con esta solicitud puede ser
fácilmente modificado por técnicas conocidas (por ejemplo mediante
mutagénesis dirigida o mediante la inserción de ligadores) para
codificar la expresión de un polipéptido. Tales técnicas están
descritas por ejemplo en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Los ejemplos de los vectores que pueden usarse
para expresar el ácido nucleico que codifica la CPB o la ProCPB son
virus como virus bacterianos, por ejemplo bacteriófagos (como el
fago lambda), cósmidos, plásmidos u otros vectores. El cDNA que
codifica la ProCPB o la CPB es insertado dentro de los vectores
apropiados por métodos muy conocidos en el campo. Por ejemplo,
usando dianas para las enzimas de restricción endonucleasas
convencionales, se pueden escindir tanto los insertos como el DNA
del vector para crear extremos complementarios que hibriden y
entonces son ligados con una ligasa de DNA. Alternativamente, los
ligadores sintéticos que contienen secuencias de bases
complementarias a un sitio de restricción del DNA del vector pueden
ligarse al DNA del inserto, el cual entonces es digerido con la
enzima de restricción que corta en ese sitio. También se dispone de
otros medios diferentes.
Los vectores de la invención que contienen una
secuencia que codifica la ProCPB o la CPB pueden ser adaptados para
la expresión en células huésped procariotas o eucariotas; por
ejemplo en bacterias, levaduras, hongos, células de insectos u
otras células de mamífero como las células CHO, de embrión de pollo,
fibroblastos, de riñón u otras líneas celulares.
Estos vectores adicionalmente comprenden los
elementos reguladores necesarios para la expresión del gen clonado
en la célula huésped, por lo que se localizan en relación con el
ácido nucleico que codifica ProCPB o CPB para efectuar la expresión
de los mismos.
Los elementos reguladores requeridos para la
expresión incluyen secuencias promotoras y operadoras y un sitio de
unión a ribosomas. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriano
puede incluir una secuencia promotora-operadora tal
como \lambdaP_{L}O_{L} o promotores deo. Para la
iniciación de la traducción pueden utilizarse los sitios de unión a
ribosomas \lambdaC_{II} o deo. Estos vectores pueden
adquirirse comercialmente o construirse a partir de las secuencias
descritas mediante métodos muy conocidos en el ámbito. Por ejemplo,
la Patente estadounidense conjuntamente cedida núm. 4 831 120,
expedida el 16 de mayo de 1989, y la patente estadounidense
conjuntamente cedida núm. 5 143 836, expedida el 1 de septiembre de
1992, describen métodos relacionados con el promotor
\lambdaP_{L}; y la Publicación de solicitud de patente europea
conjuntamente cedida núm. 303 972, publicada el 22 de febrero de
1989, describe métodos que se refieren al promotor deo.
También pueden estar presentes elementos adicionales apropiados,
como represores o potenciadores. Aquellos expertos en el ámbito
saben cómo usar los elementos reguladores apropiados para sistemas
de expresión diversos.
Los plásmidos de expresión de esta invención
comprenden elementos reguladores adecuados que están colocados
dentro del plásmido en relación con el DNA que codifica el
polipéptido ProCPB o CPB para efectuar la expresión del polipéptido
ProCPB o CPB en una célula huésped adecuada. Tales elementos
reguladores son promotores y operadores, por ejemplo deo
P_{1}P_{2} y \lambdaP_{L}, y sitios de unión a ribosomas,
por ejemplo deo y C_{II}, así como represores y
potenciadores.
En las realizaciones preferidas de la invención,
los elementos reguladores están colocados cerca del DNA que
codifica la ProCPB o la CPB y en dirección 5' respecto del
mismo.
Los plásmidos de la invención también contienen
un codón de iniciación ATG. El DNA que codifica la ProCPB o la CPB
está en fase con el codón de iniciación ATG.
Los plásmidos de la invención también incluyen
una secuencia de DNA que contiene un origen de replicación de un
plásmido bacteriano capaz de replicarse de forma autónoma en la
célula huésped. Los orígenes de replicación adecuados pueden
obtenerse de numerosas fuentes, como por ejemplo del plásmido pBR322
(Núm. de ATCC 37017).
Los plásmidos de la presente invención también
incluyen una secuencia de DNA que contiene un gen asociado a un
rasgo fenotípico identificable o seleccionable que se manifiesta
cuando el plásmido está presente en la célula huésped, como un gen
resistente a fármacos, por ejemplo resistente a ampicilina,
cloranfenicol o tetraciclina.
Las células huésped bacterianas preferidas son
células de E. coli. Un ejemplo de una célula de E.
coli adecuada es la cepa 4300, pero también pueden usarse como
huésped para los plásmidos otras cepas de E. coli y otras
bacte-
rias.
rias.
Las bacterias usadas como huésped pueden ser de
cualquier cepa incluyendo las cepas auxotróficas (como A1645),
prototróficas (como A4255) y líticas; cepas F^{+} y F^{-}; cepas
que contienen la secuencia del represor cI^{857} del profago
\lambda (como A1645 y A4255); y cepas desprovistas de los
represores deo o del gen deo (véase la Publicación de
solicitud de patente Europea núm. 0303972, publicada el 22 de
febrero de 1989). La cepa de E. coli 4300 está depositada
bajo el número de ATCC 69363.
Todas las cepas huésped de E. coli arriba
descritas pueden ser "curadas" de los plásmidos que albergan
por métodos muy conocidos en el campo, como por ejemplo el método
del bromuro de etidio descrito por R.P. Novick en Bacteriol.
Review 33, 210 (1969).
La presente invención proporciona un método para
producir CPB enzimáticamente activa que comprende los siguientes
pasos: tratar una célula recombinante que contiene DNA que codifica
ProCPB de manera que el DNA dirija la expresión de la ProCPB,
recuperar de la célula la ProCPB así expresada, tratar la ProCPB
recuperada bajo condiciones que permitan el plegamiento de la
ProCPB, someter la ProCPB plegada a escisión enzimática para
producir CPB enzimáticamente activa y purificar la CPB
enzimáticamente activa.
En una realización preferida, la recuperación de
la ProCPB de la célula recombinante comprende la alteración de la
pared celular de la célula recombinante, o de fragmentos de la
misma, para producir un lisado, el aislamiento del precipitado
intracelular del lisado mediante centrifugación y la solubilización
del precipitado intracelular en un tampón apropiado.
En otra realización, el tratamiento de la ProCPB
recuperada comprende la incubación de la ProCPB a temperatura
ambiente durante un periodo de unas 20-24 horas a un
pH de entre 9-9,5.
En aún otra realización, el tratamiento de la
ProCPB recuperada comprende la incubación de la ProCPB a temperatura
ambiente durante un periodo de unas 20-24 horas a
un pH de entre 9-9,5 en presencia de ZnCl_{2},
glutatión oxidado (GSSG) y glutatión reducido (GSH).
Se prevé que el someter la ProCPB plegada a
escisión enzimática comprende el ajuste del pH a alrededor de 8,5 y
la escisión de la ProCPB con tripsina a 37ºC durante unos 60
minutos.
Se prevé además que la purificación de la CPB
enzimáticamente activa comprende la cromatografía de intercambio
iónico.
Los expertos en el campo apreciarán que es
posible utilizar cualquier método de cromatografía de intercambio
iónico. Se prefiere una columna de intercambio de aniones débiles,
como una de DEAE-sefarosa. Las columnas de
intercambio de aniones débiles normalmente tienen como grupo
funcional una amina terciaria (dietilaminoetilo), pero también
pueden usarse el aminoetilo cuaternario o la amina cuaternaria.
La matriz puede estar basada en compuestos
inorgánicos, resinas sintéticas, polisacáridos o polímeros
orgánicos; son posibles matrices las siguientes: agarosa, celulosa,
trisacrilo, dextrano, microesferas de vidrio, microesferas
acrílicas de oxirano, acrilamida, copolímero de
poliacrilamida/agarosa o un polímero de vinilo hidrófilo.
También se prevé que la purificación de la CPB
enzimáticamente activa comprende la cromatografía de intercambio
iónico y la cromatografía hidrofóbica.
Aquellos expertos en el ámbito podrán apreciar
que es posible utilizar cualquier columna hidrofóbica. La preferida
es la de fenil sefarosa. El grupo funcional puede ser fenilo,
bencilo, octilo o butilo. La matriz puede ser cualquiera de las
antes descritas.
En otras realizaciones preferidas, la
purificación de la CPB enzimáticamente activa comprende la
cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrofóbica y
la diafiltración.
En una realización especialmente preferidamente,
la ProCPB es expresada mediante un plásmido p\lambdaProCPB
depositado bajo el número de ATCC 69673.
La invención además describe una CPB
enzimáticamente activa, libre de otras sustancias de origen
mamífero.
Los ejemplos que siguen se exponen para ayudar
en la comprensión de la invención pero no pretenden, ni deben
interpretarse de esa forma, limitar su alcance en ninguna manera.
Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de los métodos
convencionales empleados en la construcción de vectores, la
inserción de genes que codifican polipéptidos en tales vectores o
la introducción de los plásmidos resultantes dentro de huéspedes.
Los ejemplos tampoco incluyen la descripción detallada de los
métodos convencionales empleados para realizar pruebas con los
polipéptidos producidos por tales sistemas
vector-huésped. Tales métodos son muy conocidos por
los profesionales de estas técnicas y están descritos en numerosas
publicaciones, cuyas descripciones se incorporan en esta
especificación mediante referencia, incluida, por ejemplo, la
siguiente:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T.
(1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a. Edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
El RNA total fue extraído del páncreas de ratas
Sprague-Dawley. Del RNA total, 40 \mug de
mRNA-poli A^{+} fueron aislados (mediante columna
de oligo dT-celulosa). Una alícuota (10 \mug) del
mRNA-poli A^{+} así obtenido se usó como un molde
en una reacción de transcripción inversa en presencia de un cebador
sintético del extremo 3' de la carboxipeptidasa B (5) (figura
1).
Después de la síntesis del DNA complementario de
cadena única (ss-cDNA), el mRNA se precipitó con
etanol. Una alícuota del ss-cDNA fue entonces
sometida a una amplificación por PCR.
Para la amplificación del DNA que codifica CPB
(940 pb), se empleó un cebador sintético correspondiente al extremo
3' de la carboxipeptidasa B y un cebador sintético correspondiente
al extremo 5' de la carboxipeptidasa B madura (figura 1).
Para la amplificación del DNA que codifica
ProCPB (1230 pb), se empleó un cebador sintético correspondiente al
extremo 3' de la carboxipeptidasa B y un cebador sintético
correspondiente al extremo 5' de la procarboxipeptidasa B (figura
1).
Las siguientes condiciones de amplificación por
PCR fueron como sigue:
| 1. Cebador del extremo 3' | 2 \mug |
| 2. Cebador del extremo 5' | 2 \mug |
| 3. ss-cDNA | 5 \mul |
| 4. Tampón: | |
| \hskip0.35cmdNTP | 0,2 mM |
| \hskip0.35cmTris-HCl | 50 mM |
| \hskip0.35cmKCl | 20 mM |
| \hskip0.35cmMgCl_{2} | 8 mM |
| 5. Taq Polimerasa I | \underline{2.5 \ unidades} |
| \hskip0.35cmVolumen Total: | 100 \mul |
| 6. Aceite Mineral (para evitar la evaporación) | 50 \mul |
| 7. 1 ciclo x [1' a 92ºC; 2' a 40ºC y 4' a 72ºC] | |
| 8. 35 ciclos x [1' a 92ºC; 2' a 53ºC y 3' a 72ºC] | |
| 9. 1 ciclo x [1' a 92ºC; 2' a 53ºC y 15' a 72ºC] |
Los productos de la amplificación por PCR fueron
analizados sobre un gel de agarosa al 1%. Los controles no
amplificados y los marcadores de tamaño también fueron incluidos. Se
observaron dos bandas distintas de alrededor de 940 pb y 1230 pb.
La banda de 940 pb representa la secuencia nucleotídica de la CPB y
la banda de 1230 pb representa la secuencia nucleotídica de la
ProCPB, la cual incluye la secuencia nucleotídica del péptido de
activación.
Después de la amplificación por PCR, el DNA fue
purificado de la mezcla de reacción mediante extracciones con
cloroformo y fenol y precipitación con acetato de amonio e
isopropanol.
El plásmido pCPB (figura 2) fue construido
mediante la digestión del cDNA de CPB con BamHI y NcoI
y, tras la purificación en gel, la subclonación del fragmento en el
fragmento de 2500 pb BamHI y NcoI del plásmido pABN,
el cual codifica los siguientes elementos necesarios para la
expresión en bacterias:
(i) promotor \lambdaP_{L} que permite la
expresión génica en células de E. coli mediante inducción,
por ejemplo mediante el cambio de la temperatura de 30ºC a 42ºC que
inactiva el represor cI^{857} sensible a la temperatura;
(ii) sitio de unión a ribosomas deo
(rbs);
(iii) terminador de transcripción trp (8);
(iv) gen de resistencia a la ampicilina del
plásmido pBR322; y
(v) origen de replicación pBR322.
La secuencia de aminoácidos de la
carboxipeptidasa B de origen natural contiene siete residuos de
cisteína, seis de los cuales están en parejas mediante enlaces
S-S y uno de los cuales (Cys^{290}) es un residuo
de cisteína libre (1). Nosotros pensábamos que este residuo de
cisteína libre podía formar enlaces S-S inter o
intramoleculares no deseados durante el plegamiento de la CPB
recombinante. El residuo de Cys^{290} no está presente en el
sitio catalítico ni en el sitio de unión de sustrato de la
carboxipeptidasa B y aparentemente no se requiere para la actividad
enzimática de la enzima (1,2). Por lo tanto, se decidió producir una
CPB en la que esta cisteína es reemplazada por serina; esta CPB es
designada CPB-C.
Se preparó un oligonucleótido fosforilado en su
extremo 5' que contenía dos sustituciones de nucleótido:
Este oligonucleótido fue usado a fin de
sustituir la secuencia de nucleótidos que codifica Cys^{290} con
una secuencia de nucleótidos que codifica serina en el plásmido pCPB
mediante mutagénesis dirigida como se describe en la figura 2 (9).
El plásmido recientemente obtenido fue designado
pCPB-C.
Se construyó un plásmido designado
pProCPB-C que alberga la secuencia nucleotídica de
la ProCPB-C (que contiene la mutación Cys^{290}
-> Ser) (figura 3) y se usó para transformar E. coli
4300.
Se construyó un plásmido designado
p\lambdaProCPB que contiene la secuencia de nucleótidos de la
ProCPB (figura 3) y se usó para transformar E. coli 4300.
Este plásmido fue depositado en el ATCC bajo el número de ATCC
69673 el 4 de agosto de 1994.
El DNA del plásmido se preparó de los plásmidos
pCPB, pCPB-C, p\lambdaProCPB,
pProCPB-C, y se sometió a análisis de enzimas de
restricción y a la secuenciación de nucleótidos para verificar la
presencia de las secuencias correctas.
El cultivo madre de E. coli 4300 que
alberga el plásmido p\lambdaProCPB se cultivó en medio LB
complementado con ampicilina (100 \mug/ml).
El inóculo se propagó en 100 ml de medio LB
complementado con ampicilina (100 \mug/ml) a 30ºC hasta que la
concentración de células alcanzó una D.O._{660} de 2,0.
El medio de producción (medio LB + ampicilina
(100 \mug/ml)) fue inoculado, incubado a 30ºC, aireado, agitado y
el pH se mantuvo a 7,2 con NH_{3}. Se agregaron veinte gramos de
glucosa al cultivo durante el crecimiento. Una vez que la
concentración de células alcanzó una D.O._{660} de 12, la
temperatura se aumentó a 42ºC para permitir la expresión de ProCPB.
Después de dos horas, la concentración de células alcanzó una
D.O._{660} de 22-29 y se recogieron las
bacterias.
La ProCPB expresada por el plásmido
p\lambdaProCPB acumulada en el precipitado intracelular se aisló
mediante el siguiente procedimiento: 40 gramos (peso fresco) de
pastilla bacterial se suspendió en 450 ml de tampón que contenía
PMSF 1 mM (Sigma), Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 10 mM
y se trató con lisozima (Sigma) a una concentración final de 50
\mug/ml a 37ºC durante dos horas.
La mezcla fue entonces sonicada y se agregó
Triton X-100 (Merck) a una concentración final del
2%. Entonces se agitó durante dos horas a temperatura ambiente. El
precipitado intracelular crudo fue peletizado mediante
centrifugación (14.000 rpm, 30 min, 4ºC) y se lavó con agua.
El precipitado intracelular que contenía ProCPB
fue disuelto en tampón B que contenía NaCl 25 mM, urea 8 M, DTT 10
mM y Bis-Tris 20 mM a pH 7. La solución se
cromatografió sobre una columna Fast Flow de
DEAE-Sefarosa equilibrada en tampón B, la proteína
fue eluida con NaCl 100 mM (aproximadamente) en tampón B y la ProCPB
fue precipitada con (NH_{4})_{2}SO_{4} a una
saturación del 40% a 0ºC.
Posteriormente, se describió que la CPB
enzimáticamente activa puede ser producida solo mediante la
producción de la proteína precursora. Sin embargo, inicialmente,
los polipéptidos CPB y CPB-C fueron producidos de
una manera similar a la producción de la ProCPB antes descrita; la
ProCPB-C también fue producida de forma similar.
Los plásmidos empleados fueron pCPB, pCPB-C y
pProCPB-C, respectivamente (como se describió en el
ejemplo 1). Las condiciones de cultivo de E. coli que
albergaba estos plásmidos y la purificación de los polipéptidos
fueron esencialmente como los descritos anteriormente para la ProCPB
aparte del tampón usado para disolver el precipitado intracelular,
que comprendía CPB recombinante o CPB-C, que
contenía etanolamina 20 mM a pH 9, DTT 10 mM y urea 8 M.
Nótese que en cada caso, los polipéptidos
producidos y purificados como se ha descrito antes no presentaron
actividad enzimática.
El plegamiento de los polipéptidos en un intento
de producción de proteínas enzimáticamente activas está descrito en
el ejemplo 3.
Los polipéptidos CPB y CPB-C se
produjeron como se describe en el ejemplo 2, pero se encontró que no
presentaban actividad enzimática. Se emplearon métodos conocidos de
plegamiento (como los descritos más adelante), pero no se obtuvo
ninguna proteína enzimáticamente activa.
A fin de resolver el problema de la incapacidad
para obtener proteína enzimáticamente activa, se desarrolló un
procedimiento alternativo en el que intervenía la expresión y el
plegamiento de la proteína precursora seguidos de un tratamiento
para eliminar la porción del péptido de activación de la proteína
precursora plegada. Esto resultó en el proceso descrito a
continuación.
La ProCPB-C, producida como se
indica en el ejemplo 2, se disolvió a 10 mg/ml en urea 8 M y HCl 5
mM y se diluyó a 1 mg/ml en glicina 100 mM y ZnCl_{2} 0,2 mM a un
pH de 9, 10 y 11. Estas fueron las soluciones de plegamiento.
El plegamiento fue llevado a cabo mediante
incubación de estas soluciones de plegamiento durante 17 horas a
temperatura ambiente. La ProCPB-C así producida no
presentaba actividad enzimática en esta fase (véase la Tabla
1).
El pH de la solución que contenía
ProCPB-C plegada fue entonces ajustado a cerca de
8,5 con HCl y se trató con tripsina (1:200 p/p) durante 30 minutos
a 37ºC para eliminar el péptido de activación. Para terminar la
reacción, se agregó PMSF a una concentración final de 0,1 mM.
La actividad enzimática de la
CPB-C plegada así obtenida fue ensayada (Tabla 1)
según Folk (1970) (11): una unidad de actividad (u) se define como
la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de 1 \mumol de
sustrato Hipuril-L-Arg por minuto a
25ºC, provocando un aumento en la absorbancia de 0,12 a 254 nm y una
longitud de trayectoria de 1 cm. La actividad específica de la
carboxipeptidasa B porcina comercial (Sigma) es de 230 u/mg.
La Tabla I indica que la CPB-C
enzimáticamente activa fue obtenida después del plegamiento de la
ProCPB-C y del tratamiento con tripsina de la
ProCPB-C plegada usando las condiciones preliminares
antes descritas.
La Tabla I además indica que la actividad
específica de la CPB-C cuando el pH de la mezcla de
plegamiento es de 9 es superior a la actividad cuando el pH de la
misma mezcla es de 10 u 11.
Los siguientes experimentos fueron llevados a
cabo para establecer las condiciones óptimas de activación y de
plegamiento.
Nosotros asumimos que cuanto mayor fuera la
actividad específica de la CPB-C obtenida mediante
escisión por tripsina de la ProCPB-C plegada, más
óptimas serían las condiciones de plegamiento de la
ProCPB-C. Los controles de "solo sustrato" y
"carboxipeptidasa porcina comercial" se llevaron a cabo además
de los siguientes experimentos.
Inicialmente, los resultados (descritos en el
ejemplo 3) fueron mejorados cuando el plegamiento se llevó a cabo
usando 0,05-0,1 mg/ml de ProCPB-C a
un pH de 9,5.
El plegamiento de la ProCPB-C se
llevó a cabo mediante la incubación de 0,05 mg/ml de polipéptido en
glicina 100 mM, a pH 9,5, durante 90 horas y a temperaturas de
entre 10 y 37ºC. Las muestras de ProCPB-C plegada
se trataron con tripsina (1:200 p/p) y la actividad específica de la
CPB-C así obtenida se midió como se describe en el
ejemplo 3. La mayor actividad específica de la CPB-C
se obtuvo cuando el plegamiento de la ProCPB-C se
llevó a cabo entre 20 y 30ºC.
El plegamiento de la ProCPB-C se
llevó a cabo mediante incubación de 0,05 mg/ml de polipéptido en
tampón de glicina 100 mM (pH 9,5) y ZnCl_{2} 0,01 mM, a 25ºC en
presencia de glutatión oxidado o reducido (GSSG/GSH) o de ácido
ascórbico (Tabla II). A continuación, las soluciones incubadas
fueron tratadas con tripsina (1:200 p/p) durante 1 hora a 37ºC y la
actividad específica de la CPB-C así obtenida se
midió (como se describe en el ejemplo 3) después de 18 y 45
horas.
La Tabla II indica que la adición combinada de
GSSG y GSH provoca un aumento pronunciado de la actividad específica
de la CPB-C y, por tanto, presumiblemente de la
eficiencia de plegamiento de la ProCPB-C. El GSSH
individualmente también aumentó la eficiencia de plegamiento de la
ProCPB-C, igual que el ácido ascórbico, aunque en
menor medida.
En otra serie de experimentos se encontró que el
plegamiento óptimo de la ProCPB-C se obtiene
mediante la adición de GSSG 0,1 mM y GSH 0,5 mM a la solución de
plegamiento.
Se estableció que la CPB-C más
activa se obtenía mediante la digestión tríptica de la
ProCPB-C para eliminar el péptido de activación
cuando la solución de plegamiento incubada se trataba con tripsina
1:50 p/p durante 1 hora a 37ºC.
El efecto del pH sobre el plegamiento de la
ProCPB-C fue determinado en una serie de reacciones
bajo condiciones previamente optimizadas.
El plegamiento de la ProCPB-C se
llevó a cabo a 0,1 mg/ml en glicina 100 mM, ZnCl_{2} 0,02 mM,
glutatión reducido 0,5 mM (GSH) y glutatión oxidado 0,1 mM (GSSG),
a 25ºC, durante 24 horas y a varios valores de pH (entre 8,75 y
10,00). Las muestras de ProCPB-C plegada se trataron
con tripsina (1:50 p/p; se disolvieron en HCl 1 mM, CaCl_{2} 10
mM) y la actividad específica de la CPB-C así
obtenida se midió como se describe en el ejemplo 3.
La actividad específica más elevada de la
CPB-C se obtuvo cuando el plegamiento de la
ProCPB-C se llevó a cabo a un pH de 9,25.
El efecto de la concentración de ZnCl_{2} en
la solución de plegamiento sobre el plegamiento de la
ProCPB-C se determinó en una serie de reacciones
bajo condiciones previamente optimizadas. A una concentración de
ZnCl_{2} de 2 a 20 veces superior a la concentración de
CPB-C estimada (mol/mol), la actividad específica de
la CPB-C producida fue la más elevada. Cuando el
plegamiento se llevó a cabo sin la adición de ZnCl_{2}, y se
agregó EDTA a la mezcla de plegamiento para quelar cualquier ión
divalente residual, la actividad específica de la
CPB-C disminuyó hasta cero.
El plegamiento de la ProCPB-C se
llevó a cabo durante 24 horas bajo condiciones óptimas (como las
antes determinadas) a las concentraciones de proteína indicadas en
la Tabla III. Después de la digestión tríptica, la actividad de la
CPB-C se midió como se describe en el ejemplo 3.
La Tabla III indica que la actividad específica
más elevada de la CPB-C producida fue a una
concentración de proteína de 0,5 mg/ml.
El tiempo de plegamiento de la
ProCPB-C se determinó en una serie de reacciones
bajo condiciones previamente optimizadas.
El plegamiento de la ProCPB-C se
llevó a cabo a 0,1 mg/ml en glicina 100 mM (pH 9,25), GSSG 0,1 mM,
GSH 0,5 mM y ZnCl_{2} 0,01 mM. Las muestras de
ProCPB-C plegada se trataron con tripsina (1:50 p/p)
y la actividad específica de la CPB-C así obtenida
se midió como se describe en el ejemplo 3 a diversos tiempos (entre
0 y 40 horas) desde el comienzo del plegamiento.
La actividad más alta de la
CPB-C se obtuvo cuando la ProCPB-C
plegada fue escindido con tripsina 20 horas después del inicio del
plegamiento. El proceso de plegamiento de más de 20 horas no cambió
la actividad específica de la CPB-C.
Cada una de las proteínas CPB,
CPB-C, ProCPB y ProCPB-C, producidas
y purificadas como se describió en el ejemplo 2, fueron plegadas a
0,1 mg/ml en tampón de glicina 100 mM, (pH 9,25), ZnCl_{2} 0,01
mM, GSH 0,5 mM y GSSG 0,1 mM a temperatura ambiente durante 24
horas; es decir, las condiciones de plegamiento usadas fueron
esencialmente las condiciones óptimas establecidas en el ejemplo
4.
El pH de cada solución que contenía las
proteínas CPB, CPB-C, ProCPB o
ProCPB-C plegadas se ajustó a 8,5 con HCl y las
soluciones que contenían ProCPB y ProCPB-C fueron
tratadas con tripsina (1:50 p/p) durante 1 hora a 37ºC para
eliminar el péptido de activación. Para terminar la reacción se
añadió PMSF a una concentración final de 0,1 mM. La actividad
específica de CPB, CPB-C, ProCPB y
ProCPB-C se midió como se describe en el ejemplo
3.
La Tabla IV indica que la CPB enzimáticamente
activa solamente se puede producir en células que expresan el
precursor que contiene el péptido de activación. Por tanto, el
péptido de activación es necesario para el plegamiento correcto de
la CPB.
La Tabla IV también indica que la CPB con una
actividad específica óptima se produce a partir del plegamiento y
la activación de la ProCPB (expresada por el plásmido
p\lambdaProCPB), que contiene el residuo Cys^{290} libre, y no
del plegamiento y la activación de la ProCPB-C, que
contiene la mutación Cys^{290} -> Ser. Por tanto, el residuo
Cys^{290} es aparentemente necesario para que el plegamiento de la
CPB sea óptimo o su actividad la más elevada.
Se encontró que las condiciones de plegamiento
óptimas para la ProCPB eran esencialmente idénticas a las
condiciones de plegamiento óptimas para la ProCPB-C
determinadas en el ejemplo 4.
Un método simplificado para el plegamiento y la
activación de la ProCPB se llevó a cabo mediante el uso de
precipitado intracelular crudo, omitiendo la necesidad del paso de
purificación inicial descrito en el ejemplo 2, parte III.
Se encontró que el precipitado intracelular
crudo que contenía ProCPB (producido como se describió en el ejemplo
2) puede ser disuelto a concentraciones altas de proteína (Tabla V)
en glicina 100 mM (pH 9,5) y urea 8 M.
El plegamiento se llevó a cabo bajo condiciones
optimizadas durante 24 horas a temperatura ambiente. El pH se elevó
a un pH óptimo de 9,5 (previamente determinado). La ProCPB plegada
fue escindida con tripsina (1:50 p/p) y la actividad específica de
la CPB se midió como se describe en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla V indica que la CPB enzimáticamente
activa puede obtenerse mediante el plegamiento de la ProCPB de un
precipitado intracelular crudo, seguido de una digestión tríptica.
Además, la CPB es enzimáticamente activa en un nivel similar en
todas las concentraciones de proteína medidas. Esto es un resultado
inesperado, ya que la actividad específica de la CPB, purificada
con DEAE-Sefarosa antes del plegamiento (ejemplo 2),
disminuía cuando la concentración de proteína aumentaba en la
mezcla de plegamiento. Aparentemente, el precipitado intracelular
contiene factores que ayudan al plegamiento de la ProCPB.
La CPB fue purificada casi hasta la homogeneidad
a partir de 42 litros de E. coli 4300 que albergaban el
plásmido p\lambdaProCPB y expresaban ProCPB. Las condiciones de
fermentación y crecimiento fueron esencialmente las descritas en el
ejemplo 2.
El precipitado intracelular crudo se lavó en
agua y se disolvió a 20 mg/ml en glicina 100 mM (pH 9,5) y urea 8 M
y se diluyó a 1 mg/ml con 100 mM de glicina, pH 9,5, 0,1 mM de
ZnCl_{2}, 0,5 mM de GSH y 0,1 mM de GSSG se agregaron y la
solución de plegamiento resultante se incubó a 25ºC durante 24
horas. El pH fue entonces ajustado a 8,5 con HCl y la ProCPB
plegada fue digerida con tripsina (20 \mug/ml) a 37ºC durante 1
hora. La tripsina fue inactivada con PMSF 0,1 mM.
La CPB enzimáticamente activa se cargó sobre una
columna Fast Flow de DEAE-Sefarosa (Pharmacia)
equilibrada con Tris-HCl 20 mM (pH 8) a 20 mg por
ml de resina. La CPB se eluyó con NaCl 80 mM y
Tris-HCl 20 mM, pH 8. Se agregó sulfato de amonio
(0,8 M) a la solución de elución en DEAE que a continuación fue
cromatografiada sobre una columna Fast Flow de
fenil-sefarosa (Pharmacia) equilibrada con
Tris-HCl 20 mM (pH 8) y sulfato de amonio 0,8 M. La
CPB se eluyó con sulfato de amonio 0,4 M; se concentró, se diafiltró
frente a NaCl 100 mM y Tris-HCl 20 mM (pH 8) y se
conservó a -20ºC.
En el proceso de purificación mencionado arriba,
se procesaron 42 litros de E. coli 4300 que albergaba el
plásmido p\lambdaProCPB a D.O._{660} = 35 del modo arriba
descrito y se obtuvieron 1,25 gramos de CPB enzimáticamente activa
con una actividad específica de 637 u/mg. El rendimiento general del
proceso fue de alrededor del 60%.
La actividad específica de la carboxipeptidasa B
porcina comercial, medida bajo condiciones experimentales
idénticas, fue de 298 u/mg.
La CPB producida como se ha comentado en los
ejemplos 5 y 6 tiene propiedades bioquímicas y enzimáticas
comparables a las de la carboxipeptidasa B porcina.
El coeficiente de extinción de la CPB
recombinante calculado sobre la base de su composición de
aminoácidos es de \varepsilon^{1%}_{280} = 19,7. El
coeficiente de extinción de la carboxipeptidasa B porcina comercial
es de \varepsilon^{1%}_{280} = 21,4 (1).
La CPB recombinante tiene una actividad
específica de 637 u/mg (sustrato de
Hipuril-L-Arg) y contiene 1 mol de
Zn por mol de enzima, determinado mediante absorción atómica.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del
extremo N-terminal reveló
Ala-Ser-Gly-His-Ser,
como se espera del análisis de la secuencia de aminoácidos de la
carboxipeptidasa B madura de rata (5).
El pH óptimo para la actividad de la CPB
recombinante fue determinado empleando 25 mM de los siguientes
tampones: NaOAc, pH 4-6; Bis-Tris,
pH 6-7,5; Tris-HCl pH
7,5-9; y Glicina, pH 9-12. La
actividad específica de la CPB fue medida como se describe en el
ejemplo 3. La actividad enzimática óptima de la CPB se obtuvo a un
pH de 8. La incubación de la CPB a 55ºC causó un 50% de pérdida de
actividad y la inactivación completa ocurrió a 65ºC.
El análisis cinético de la CPB recombinante se
llevó a cabo usando el sustrato
Hipuril-L-Arg (figura 4). Hubo
inhibición de la actividad de la CPB a concentraciones de sustrato
superiores a 0,5 mM.
Los estudios adicionales revelaron que la CPB
recombinante era inhibida por el producto de catálisis arginina, el
cual es un inhibidor competitivo de la carboxipeptidasa B. La curva
de Lineweaver-Burk correspondiente mostró un valor
K_{m} de 0,38 mM.
La CPB recombinante también era inhibida por la
1,10-fenantrolina, un fuerte quelante iónico
divalente, demostrando por tanto la importancia de los iones de Zn
en la actividad enzimática de la CPB. En presencia de
1,10-fenantrolina 1 mM se observó un 50% de pérdida
de la actividad de la CPB recombinante a 1 mg/ml.
La mini-proinsulina, como se
describe en la patente europea EP 347781 B1, puede convertirse a
insulina mediante el tratamiento con tripsina y CPB recombinante
como la producida en los ejemplos 5 y 6.
La tripsina escinde específicamente entre el
residuo de arginina y la cadena A. A continuación la CPB hidroliza
de forma específica el residuo de arginina del extremo
C-terminal de la cadena B.
La insulina humana comercial
(Boehringer-Mannheim) puede usarse de forma
estándar, así como la mini-proinsulina escindida
mediante tripsina y carboxipeptidasa B porcina comercial y la
mini-proinsulina escindida solamente mediante
tripsina.
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22. Padfield y Case (1988),
Anal. Biochem. 171: 294-299.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Bio-Technology General Corp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCCIÓN DE CARBOXIPEPTIDASA B ENZIMÁTICAMENTE ACTIVA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Cooper & Dunham LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1185 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE. UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10036
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: No conocido aún
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 de enero de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: White, John P.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 28,678
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ASUNTO: 0336/43847-A-PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 278-0400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 391-0525
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCATATGC ATGCTTCCGA GGAGCACTTT GATGGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 285 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..285
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoacídica
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 927 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..927
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 309 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoacídica
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. DE SEC. NÚM.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG
\hfill27
Claims (9)
1. Un método para producir CPB pancreática de
mamífero enzimáticamente activa, el cual comprende:
(a) tratar una célula recombinante que contiene
DNA que codifica ProCPB, de manera que el DNA dirija la expresión
de la ProCPB;
(b) recuperar de la célula la ProCPB así
expresada;
(c) tratar la ProCPB recuperada bajo condiciones
que permitan el plegamiento de la ProCPB.
(d) someter la ProCPB plegada a escisión
enzimática para producir CPB enzimáticamente activa;
(e) purificar la CPB enzimáticamente activa.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
en el cual la recuperación del paso (b) comprende:
(i) alterar la pared celular de la célula
recombinante para producir un lisado;
(ii) aislar el precipitado intracelular del
lisado mediante centrifugación;
(iii) solubilizar el precipitado intracelular en
un tampón adecuado;
3. Un método según la reivindicación 1 en el
cual el tratamiento del paso (c) comprende el incubar la ProCPB a
temperatura ambiente por un periodo de alrededor de
20-24 horas a un pH de alrededor de
9-9,5.
4. Un método según la reivindicación 1 en el
cual el tratamiento del paso (c) comprende incubar la ProCPB a
temperatura ambiente por un periodo de alrededor de
20-24 horas a un pH de alrededor de
9-9,5 en presencia de ZnCl_{2}, glutatión oxidado
y glutatión reducido.
5. Un método según la reivindicación 1 en el
cual el paso de someter (d) comprende:
(i) ajustar el pH a 8,5; y
(ii) segmentar la ProCPB con tripsina a 37ºC
durante alrededor de 60 minutos.
6. Un método según la reivindicación 1 en el
cual la purificación del paso (e) comprende la cromatografía de
intercambio iónico.
7. Un método según la reivindicación 1 en el
cual la purificación del paso (e) comprende la cromatografía de
intercambio iónico y la cromatografía hidrofóbica.
8. Un método según la reivindicación 1 en el
cual la purificación del paso (e) comprende la cromatografía de
intercambio iónico, la cromatografía hidrofóbica y la
diafiltración.
9. Un método según la reivindicación 1 en el
cual la ProCPB es expresada por el plásmido p\lambdaProCPB
depositado bajo el número de ATCC 69673.
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