CZ225897A3 - Způsob přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidásy B - Google Patents
Způsob přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidásy B Download PDFInfo
- Publication number
- CZ225897A3 CZ225897A3 CZ972258A CZ225897A CZ225897A3 CZ 225897 A3 CZ225897 A3 CZ 225897A3 CZ 972258 A CZ972258 A CZ 972258A CZ 225897 A CZ225897 A CZ 225897A CZ 225897 A3 CZ225897 A3 CZ 225897A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- procpb
- cpb
- enzymatically active
- glu
- packaging
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 26
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 26
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 48
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 44
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 108090000201 Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 description 12
- 102100035023 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 11
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 11
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 101000946516 Rattus norvegicus Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- LPHZOARCSCLGLK-OAHLLOKOSA-N (2R)-2-amino-2-(2-benzamidoacetyl)-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound C(CNC(=O)C1=CC=CC=C1)(=O)[C@](N)(CCCNC(N)=N)C(=O)O LPHZOARCSCLGLK-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 4
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 4
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N Thr-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-NTSWFWBYSA-N (2s)-2-amino-5-[[(2s)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 Peptidyl L-lysine (L-arginine) Chemical compound 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- MKZCBYZBCINNJN-DLOVCJGASA-N Ala-Asp-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MKZCBYZBCINNJN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 2
- BDQNLQSWRAPHGU-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N BDQNLQSWRAPHGU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- WZGZDOXCDLLTHE-SYWGBEHUSA-N Ala-Trp-Ile Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 WZGZDOXCDLLTHE-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCGLNNVKIZXQOJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DCGLNNVKIZXQOJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JQFJNGVSGOUQDH-XIRDDKMYSA-N Arg-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 JQFJNGVSGOUQDH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N Arg-Thr-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- ANPFQTJEPONRPL-UGYAYLCHSA-N Asn-Ile-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ANPFQTJEPONRPL-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CNKAZIGBGQIHLL-GUBZILKMSA-N Asp-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CNKAZIGBGQIHLL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- KRQFMDNIUOVRIF-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KRQFMDNIUOVRIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 2
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 2
- BKRQSECBKKCCKW-HVTMNAMFSA-N Glu-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N BKRQSECBKKCCKW-HVTMNAMFSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- XUDLUKYPXQDCRX-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XUDLUKYPXQDCRX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HAPWZEVRQYGLSG-IUCAKERBSA-N His-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HAPWZEVRQYGLSG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N His-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N Ile-Arg-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N Ile-Gly-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 2
- KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N Ile-His-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 2
- AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- WUYLWZRHRLLEGB-AVGNSLFASA-N Met-Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WUYLWZRHRLLEGB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- PMKIMKUGCSVFSV-CQDKDKBSSA-N Phe-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N PMKIMKUGCSVFSV-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- IHAPJUHCZXBPHR-WZLNRYEVSA-N Thr-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N IHAPJUHCZXBPHR-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 2
- XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N Thr-Leu-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XIULAFZYEKSGAJ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 2
- UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N Thr-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N 0.000 description 2
- WEAPHMIKOICYAU-QEJZJMRPSA-N Trp-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WEAPHMIKOICYAU-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N Trp-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- HRHYJNLMIJWGLF-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 HRHYJNLMIJWGLF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- AKKYBQGHUAWPJR-MNSWYVGCSA-N Tyr-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)O AKKYBQGHUAWPJR-MNSWYVGCSA-N 0.000 description 2
- GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N Tyr-Thr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GAKBTSMAPGLQFA-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 2
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045383 histidyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 108010034507 methionyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108700004896 tripeptide FEG Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-6-aminohexanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 GJLXVWOMRRWCIB-MERZOTPQSA-N 0.000 description 1
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N Ala-Ser-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- YSUVMPICYVWRBX-VEVYYDQMSA-N Arg-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YSUVMPICYVWRBX-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N Asn-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- HZZIFFOVHLWGCS-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HZZIFFOVHLWGCS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- FHCRKXCTKSHNOE-QEJZJMRPSA-N Asn-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FHCRKXCTKSHNOE-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- QQXOYLWJQUPXJU-WHFBIAKZSA-N Asp-Cys-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O QQXOYLWJQUPXJU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KOWYNSKRPUWSFG-IHPCNDPISA-N Asp-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KOWYNSKRPUWSFG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- NBKLEMWHDLAUEM-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NBKLEMWHDLAUEM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- BOXNGMVEVOGXOJ-UBHSHLNASA-N Asp-Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N BOXNGMVEVOGXOJ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 101000946522 Bos taurus Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N Cys-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- LGYCLOCORAEQSZ-PEFMBERDSA-N Glu-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LGYCLOCORAEQSZ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- ITZOBNKQDZEOCE-NHCYSSNCSA-N Gly-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)CN ITZOBNKQDZEOCE-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- RLAOTFTXBFQJDV-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CN=CN1 RLAOTFTXBFQJDV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- FFKJUTZARGRVTH-KKUMJFAQSA-N His-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O FFKJUTZARGRVTH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ZHMZWSFQRUGLEC-JYJNAYRXSA-N His-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZHMZWSFQRUGLEC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJUMUUXGSXUZJZ-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJUMUUXGSXUZJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N Ser-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100438615 Sus scrofa CPB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- OMRWDMWXRWTQIU-YJRXYDGGSA-N Thr-Tyr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O OMRWDMWXRWTQIU-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- SNJAPSVIPKUMCK-NWLDYVSISA-N Trp-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SNJAPSVIPKUMCK-NWLDYVSISA-N 0.000 description 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N Tyr-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asp-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TZXFLDNBYYGLKA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- USYGMBIIUDLYHJ-GVARAGBVSA-N Tyr-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 USYGMBIIUDLYHJ-GVARAGBVSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Způsob přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidázy B
Oblast techniky
Vynález se týká přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidázy B.
Dosavadní stav techniky
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidáza B [PeptidylL-lysin(L-arginin)hydroláza EC 3.4.17.2] je pankreatickou exopeptidázou obsahující zinek, která z peptidů specificky odštěpuje C-koncovou Arg, Lys nebo Orn (Barrett a McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida.; Coll a kol. (1991), The Embo J., 10.1 až 9).
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidáza B je produktem prekurzorového proteinu, preprokarboxypeptidázy B, obsahujícího 108 aminokyselin dlouhý aminokyselinou zakončený fragment, který zahrnuje signálovou sekvenci (13 aminokyselin) a aktivační peptid (95 aminokyselin). Preprokarboxypeptidáza B je enzymaticky inaktivní.
Během transportu preprokarboxypeptidázy B do endoplasmatického retikula se odštěpí signálový peptid, v důsledku čehož se enzymaticky inaktivní preprokarboxypeptidáza B vyloučí z buňky. Enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se následně vytvoří odštěpením aktivačního peptidů trypsinem (Aviles a kol. (1985), Biochem. and Bioph. Res. Comm. 130: 97 až 103.
• ·
Karboxypeptidáza B dospělé krysy obsahuje 307 aminokyselin (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33) : 17837-17845) a má zdánlivou průměrnou molekulovou hmotnost 35 kD. Karboxypeptidáza B rovněž obsahuje sedm cysteinových zbytků, z nichž šest je spárováno přes S-S vazeb.
»
Karboxypeptidáza B má jak široké komerční uplatnění, tak uplatnění při výzkumech. Používá se například při výrobě inzulínu a dalších biologicky účinných polypeptidů a při proteinové sekvenční analýze.
Komerčně dostupná karboxypeptidáza B, izolovaná ze slinivky prasete, je velmi drahá a není zcela zbavena dalších proteáz.
Byla zveřejněna parciální aminokyselinová sekvence prasečí prekurzorové preprokarboxypeptidázy B a kompletní aminokyselinová sekvence hovězí karboxypeptidázy B (Burgos a kol. (1991), Biochemistry 30: 4082-4089; resp. Titáni a kol. (1975), P.N.A.S. 72: 1666-1670. Rovněž již byla publikována kompletní nukleová sekvence krysího genu a lidská cDNA (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33) :17837-17845) .
Yamamoto a kol. ((1992), J. Bio. Chem. 267: 2575-2581) popsal rekombinantní expresi enzymaticky inaktivní lidské preprokarboxypeptidázy B, postrádající prvních 11 aminokyselin aktivačního peptidu.
Rovněž byla zaznamenána rekombinantní exprese enzymaticky inaktivní β-galaktosidázo-preprokarboxypeptidázového B fúzního proteinu, jehož • · • ·
preprokarboxypeptidáza postrádá prvních jedenáct aminokyselin aktivovaného peptidu.
Evropská patentová přihláška 588118 A2 popisuje z kosti odvozený karboxypeptidáze podobný protein, označený jako OSF-5. Dá se usuzovat, že OSF-5 působí jako adhezivní molekula nebo růstový faktor a že může být použit jako účinná látka pro ošetření metabolických onemocnění kostí. Tato přihláška však neuvádí žádnou skutečnou funkci nebo aktivaci OSR-5 a ani nepopisuje produkci přirozeně se vyskytujícího nebo rekombinantně biologicky aktivovaného proteinu.
Cílem vynálezu je tedy poskytnout způsob přípravy rekombinantní vysoce čisté enzymaticky aktivní a levné karboxy-peptidázy B. Tato příprava enzymaticky aktivní karboxypeptidáz B nebyla dosud popsána a proto lze zde uvedený způsob přípravy považovat za nový.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnout způsob přípravy enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B, který zahrnuje ošetření rekombinantní buňky obsahující DNA kódující preprokarboxypeptidázu B, při kterém DNA řídí expresi preprokarboxypeptidázy B; izolaci z buňky;
za podmínek umožňujících sbalování preprokarbo-xypeptidázy B; vystavení sbalené preprokarboxypeptidázy B enzymatickému štěpení za vzniku enzymaticky aktivní karboxypeptidázy; a čištění enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B.
takto exprimované ošetření izolované preprokarboxy-peptidázy B preprokarboxy-peptidázy B • · » « • · • ·
Předmětem vynálezu je rovněž poskytnutí enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B.
Stručný popis obrázků
Restrikční mapy plazmidů znázorněné na obrázcích 2 a 3 neidentifikují všechna restrikční místa, přítomná na plazmidech. Nicméně ta biologicky významná restrikční místa, která jsou nezbytná pro úplné pochopení vynálezu, jsou znázorněna.
Obr. 1 znázorňuje aminokyselinu a odpovídající cDNA nukleotidovou sekvenci pankreatické krysí preprokarboxypeptidázy B.
Tento obrázek tedy ukazuje cDNA nukleotidovou sekvenci a odpovídající aminokyselinovou sekvenci pankreatické krysí preprokarboxypeptidázy B, zahrnující nukleotidovou sekvenci zralé karboxypeptidázy B a aktivační peptidovou nukleotidovou sekvenci. DNA sekvence se liší od DNA sekvence publikované Clauserem a kol. ((1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845) čtyřmi nukleotidy, z nichž dva mají za následek změnu aminokyseliny: Lys14 -> Asn a Arg142 -> Asp.
DNA nukleotidové sekvence tří primerů, používaných během klonování, (příklad 1) jsou rovněž znázorněny (velkými písmeny): preprokarboxypeptidázový B 5'-konečný primer, zralý karboxypeptidázový B 5'-koncový primer a karboxypeptidázový B 3'-koncový primer.
Vyčíslení aminokyselin se provedlo podle homologie karboxypeptidázy A odvozené z hovězí slinivky (Bradshaw a • ·
9999 kol. (1969), P.N.S.S. 63: 1389-1394; Gardell a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33) :17828-1783 6), přičemž první aminokyselina (Ala) zralé krysí karboxypeptidázy B má číslo 4. Hvězdička (*) označuje další aminokyselinu (Leu), kterou má krysí karboxypeptidáza B navíc oproti karboxypeptidáze A.
Obr. 2 znázorňuje konstrukci plazmidového pCPB a plazmidového pCPB-C.
Plazmidový pABN se digeroval BamHI a Ncol. 2500 bp dlouhý fragment se izoloval a ligoval do BamHI a Ncol 940 bp cDNA fragmentu karboxypeptidázy B (získaného způsobem popsaným v příkladu 1) . Nově získaný plazmid byl označen jako pCPB a použil se pro transform E. coli 4300.
Plazmid pCPB se digeroval BamHI a Ndel za účelem izolace většího fragmentu. Za účelem izolovat větší fragment se plazmid pCPB digeroval rovněž Asel a Seal.
Smísením dvou velkých fragmentů s 5'-koncovým fosforylátovaným oligonukleotidem, připraveným pro místně specifickou mutagenezi (příklad 1), a s polymerázoligázovým pufrem (5 x pufr: 32,5 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM MgCl2, 5 mM 2-merkaptoethanol, 0,5M NaCl) (Morinaga a kol. (1984), Bio-Technology July: 636-639) se vytvořil heteroduplex. Denaturace DNA řetězců se dosáhlo vařením směsi, načež postupné ochlazení směsi DNA opět renaturovalo. Reakční produkty se použily pro transform E.coli 1645 elektroporací. Transformanty se sereenovaly růstem LB agaru, který obsahoval ampicilin, a in sítu diferenciální hybridizací kolonií s 5'-koncovým fosforylátovaným oligonukleotidem, připraveným pro mutagenezi.
Z pozitivních kolonií se extrahoval plazmid DNA. Po restrikční enzymové analýze a DNA nukleotidovém sekvencování se zvolil klon obsahující mutantní Spěl místo. Nově získaný plazmid, který se označil jako pCPB-C, kódoval karboxypeptidázu B s mutací z cysteinu na serin na aminokyselině 290. Plazmid pCPB-C se použil pro transform E. coli 4300.
Obr. 3 znázorňuje konstrukci plazmidu pProCPB a plazmidu pXProCPB
Preprokarboxypeptidázová B cDNA, získaná způsobem popsaným v příkladu 1, se odštěpila pomoci Ndel a Clal , čimž se izoloval 470 bp dlouhý fragment, který kódoval aktivační peptid a část karboxypeptidázy B.
Odštěpením Plazmidu pCPB-C pomocí BamHI a Clal se izoloval 760 bp dlouhý fragment, který kódoval zbytek karboxypeptidázy B, zahrnující Cys290->Ser mutaci.
Odštěpením Plazmidu pAB pomocí NdeHI a BamHI se izoloval 2500 bp dlouhý fragment, který kódoval všechny prvky nezbytné pro expresi v bakterii (viz příklad 1).
Tři výše uvedené fragmenty se ligovaly a nově získaný plazmid se označil jako pProCPB-C.
Plazmidy pProCPB-C a pCPB se odštěpily pomocí Stul a Xhol. Z plazmidu pProCPB-Ο se izoloval 3700 bp dlouhý fragment, kódující všechny prvky, nezbytné pro expresi v bakterii (příklad 1), celý aktivační peptid a část karboxypeptidázy B.
Z plazmidu pCPB se izoloval 440 bp dlouhý fragment, kódující zbytek karboxypeptidázy B.
Tyto dva fragmenty se ligovaly a nově vytvořený plazmid se označil jako pÁProCPB.
Obr. 4 znázorňuje srovnání aktivity rekombinantní karboxypeptidázy B a přirozeně se vyskytující karboxypeptidázy B.
Aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B (Sigma) a rekombinantní karboxypeptidázy B, připravené způsobem popsaným v příkladu 5, se stanovila Folkovou metodou (Folk (1970), Methods in Enzymology 19: 504-508) za použití Hippuryl-L-Arg substrátu. Vo katalytické reakce se měřilo za použití koncentrací substrátu, v rozmezí od 0,025 do 1,0 mM.
Aby se splnily požadavky budapešťské mezinárodní dohody o ukládání mikroorganizmů pro účely patentového řízení byl plazmid pÁProCPB 4. srpna 1994 uložen v bakterii E.coli, v American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod ATTC přístupovým čislem 69673. Výraz „CPB, jak je zde použit, znamená polypeptid vyrobený rekombinantními DNA metodami nebo jinými slovy polypeptid, který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako libovolná přirozeně se vyskytující savší karboxypeptidáza B. Výraz „CPB tedy zahrnuje polypeptidy, které se liší jednou nebo více aminokyselinami, výhodně ne více než přibližně 10 aminokyselinami, od přirozeně se vyskytujících karboxypeptidáz B.
Výraz „ProCPB, jak je zde použit, znamená polypeptid připravený rekombinantními DNA metodami nebo polypeptid, ·· ·· který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako libovolná přirozeně se vyskytující savší prokarboxypeptidáza B. Výraz „ProCPB tedy zahrnuje polypeptidy, které se liší jednou nebo více aminokyselinami, výhodně ne více než aminokyselinami, od přirozeně se prokarboxypeptidáz B.
přibližně 10 vyskytuj ících
Odborníci v daném oboru mohou snadno určit, které aminokyselinové zbytky lze přidat,' vynechat nebo substituovat (včetně toho, jakými aminokyselinami lze tyto substituce realizovat) za použití dobře známých metod, zahrnujících například konvenční metody pro navrhování a přípravu DNA sekvencí, kódujících bakteriální expresi polypeptidů, modifikaci cDNA a genomových sekvencí metodami místně směrovanými mutageneze, konstrukci rekombinantních proteinů a expresních vektorů, bakteriální expresi polypeptidů a měření biochemické aktivity polypeptidů za použití běžných biochemických testů.
Výraz „enzymaticky aktivní CPB, jak je zde použit, znamená CPB, která vykazuje biologickou aktivitu přirozeně se vyskytující savčí karboxypeptidázy B. Pro účely této definice „biologická aktivita přirozeně se vyskytující karboxypeptidázy B znamená schopnost karboxypeptidázy B z peptidů specificky odstraňovat C-koncový arginin, lysin nebo ornithin.
V podstatě stejná aminokyselinová sekvence je zde definována jako sekvence zahrnující substituce a/nebo delece a/nebo adice aminokyselin v aminokyselinové sekvenci, které mohou zahrnovat až deset aminokyselinových zbytků homologových nebo ekvivalentních skupin a které jsou popsány například Lehningerem, Biochemistry, 2. vydání, • ··· • · • · · · · · ····
Worth Pub., N. Y. (1975), kapitola 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL tisk oxfordské univerzity, Anglie (19898); a Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure sv. 5, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), kapitola 9. Tyto substituce jsou odborníkům v daném oboru známy.
U výhodného provedení, může DNA, kódující ProCPB nebo CPB, pocházet z člověka, krysy, skotu nebo prasete. Tuto DNA lze získat reverzní transkripcí, reakcí polymerázového řetězce (PCR), syntetickými nebo semisyntetickými prostředky nebo více než jednou z těchto metod, případně dalších, v daném oboru známých, metod.
DNA kódující ProCPB nebo CPB polypeptid lze mutovat způsoby známými v daném oboru, viz například Bauer a kol. (1985), Gene 37: 73-81. Mutovaná sekvence může být zavedena do vhodných expresních vektorů, které, jak je zde popsáno, jsou zavedeny do buněk, které se následně ošetří tak, aby mutovaná DNA řídila expresi polypeptidu.
Odborníkům v daném oboru bude zřejmé, že plazmid, uložený v souvislosti s touto přihláškou, lze snadno upravit známými technikami (například místně směrovanou mutagenezí nebo vložením vazebných činidel) tak, aby kódoval expresi polypeptidu. Tyto techniky jsou popsány například v publikaci autorů Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Příkladem vektorů, které lze použít pro exprimování nukleové kyseliny, kódující CPB nebo ProCPB, jsou viry, jakými jsou bakteriální viry, například bakteriofágy (například fág lambda), kosmidy, plazmidy a další vektory.
···· ·· ·· • · · · • · · φ .*♦ · · ·· · ··· · :
• ···· ··· ···· ·· ·· · *· ·· cDNA, kódující ProCPB nebo CPB, se vloží do vhodných vektorů způsoby známými v oboru. Například použitím konvenční restrikce endonukleázových enzymových míst, mohou být inzerty a vektor DNA odštěpeny tak, že dojde k vytvoření vzájemně komplementárních konců, jejichž bazické páry se následně společně ligují DNA ligázou. Alternativně lze syntetická vazebná činidla, nesoucí bazické sekvence, které jsou komplementární k restrikčnímu místu ve vektorové DNA, ligovat na inzertní DNA, která se následně digeruje restrikčním enzymem. Další prostředky jsou rovněž dostupné.
Vektory podle vynálezu, které obsahují sekvenci, kódující ProCPB nebo CPB, lze upravit pro expresi v celé řadě prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk, např. bakteriích, kvasinkách, houbách, insekticidních buňkách nebo dalších savčích buňkách, například CHO, kuřecího embrya, fibroblastů, ledvin nebo dalších známých buněčných linií.
Tyto vektory dále obsahují regulační prvky, které jsou nezbytné pro expresi klonovaného genu v hostitelské buňce v určité poloze vzhledem k nukleové kyselině, kódující v odezvě na tuto expresi ProCPB nebo CPB.
Regulační prvky, potřebné pro expresi, zahrnují sekvence promotoru a operátoru a ribozomové vazebné místo. Vektor bakteriální exprese může například zahrnovat promotor-operátorovou sekvenci, jakou je například XPLOL, nebo deo promotory. Pro iniciaci translace lze použít %Cn nebo deo ribozomová vazebná místa. Tyto vektory lze získat komerčně nebo sestavit z popsaných sekvencí způsoby, známými v daném oboru. Související patent US 4,831,120, udělený 16. května 1989 a patent US 5,143,836, podaný 1.
• · · • · « • ··· · září, 1992 popisují například způsoby, které se týkají ÁPL promotoru, a evropská patentová přihláška 303,972, publikovaná 22. února 1989, popisuje způsoby, týkající se deo promotoru. Rovněž mohou být přítomny další vhodné prvky, například represory a zesilovače transkripce. Odborníkům v daném oboru jsou seznámeni s tím, jakým způsobem regulační prvky vhodné pro různé expresní systémy použít.
Expresní plazmidy podle vynálezu obsahují vhodné regulační prvky, které se nacházejí uvnitř plazmidu v takové poloze vzhledem k DNA, kódující ProCPB nebo CPB polypeptid, ve které způsobí expresi ProCPB nebo CPB polypeptidu ve vhodné hostitelské buňce. Těmito regulační prvky jsou promotory a operátory, např. deo P1P2 a ÁPL, a ribozomová vazebná místa, například deo a Cn, a rovněž represory a zesilovače transkripce.
U výhodných provedení vynálezu jsou regulační prvky umístěny v blízkosti DNA kódující ProCPVB nebo CPB a to před touto DNA.
Plazmidy podle vynálezu rovněž obsahují ATG iniciační kodon. DNA kódující ProCPB nebo CPB je ve fázi s ATG iniciačním kodonem.
Plazmidy podle vynálezu rovněž zahrnují DNA sekvenci, obsahující počátek replikace z bakteriálního plazmidu, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce. Vhodné počátky replikace lze získat z celé řady zdrojů, například z plazmidu pBR322 (ATCC depozitní číslo 37017).
Plazmidy podle vynálezu rovněž zahrnují DNA sekvenci, která obsahuje gen související s volitelným nebo •a ···« ·* ··
• » • » · · • · ·· ·· · · · • · · • · ·· identifikovatelným fenotypovým znakem, který se projeví, jakmile je plazmid přítomen v hostitelské buňce, jako drogově rezistentní gen, například rezistencí proti ampicilinu, chloramfenicolu nebo tetracyklinu.
Výhodnými bakteriálními hostitelskými buňkami jsou E. coli buňky. Příkladem vhodné E. coli buňky je kmen 4300, ale jako hostitelské buňky pro plazmidy je možné použít i další kmeny E. coli a další bakterie.
Bakteriemi použitými jako hostitelské buňky mohou být libovolné bakteriální kmeny včetně auxotrofních (například A1645), prototrofních (například A4255) a lytických kmenů; F+ a F~ kmenů; kmenů obsahujících Cl857 represorovou sekvenci Xprofágu (například A1645 a A4255) a kmenů, postrádajících deo represory a/nebo deo gen (viz evropská patentová přihláška 0303972, publikovaná 22. února 1989). Bakteriální kmen E. coli 4300 byl uložen pod ATCC depozitním číslem 69363.
Všechny výše popsané E. coli hostitelské bakteriální kmeny mohou být „ošetřeny uvedenými plazmidy, které jsou v nich obsaženy způsoby známými v daném oboru, například ethidium-bromidovou metodou, popsanou R. P. Novickem v Bacteriol. Review 33, 210 (1969).
Vynález poskytuje způsob přípravy enzymaticky aktivní CPB, který zahrnuje ošetření rekombinantní buňky obsahující DNA, kódující ProCPB, které způsobí, že DNA směruje expresi ProCPB; izolaci takto exprimované ProCPB z buňky; ošetření izolované ProCPB za podmínek umožňujících sbalování ProCPB, vystavení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení za vzniku enzymaticky aktivní CPB a čištění enzymaticky aktivní CPB.
99
9 4
I 9 99 ··· · • · « 99 99 »» ···· ·· ·· • · < · • · · • ··· • · •r·· ··
U výhodného provedení, zahrnuje izolace ProCPB z rekombinantní buňky porušení buněčné stěny rekombinantní buňky nebo jejího fragmentu, které vede ke vzniku lyzátu, izolaci intracelulární sraženiny z lyzátu odstřeďováním a rozpuštění intracelulární sraženiny ve vhodném pufru. U dalšího provedení, zahrnuje ošetření izolovaného ProCPB inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 až 24 hodin při pH přibližně 9 až 9,5.
U ještě dalšího provedení, zahrnuje ošetření izolovaného ProCPB inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 až 24 hodin při pH přibližně 9 až 9,5 v přítomnosti ZnCl2, zoxidovaného glutathionu (GSSG) a redukovaného glutathionu (GSH). Dá se předpokládat, že toto podrobení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení bude zahrnovat nastavení pH na přibližně 8,5 a přibližně šedesátiminutové štěpení ProCPB trypsinem při 37 °C.
Dále se dá předpokládat, že čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografií.
Pro tyto účely lze zvolit libovolnou iontoměničovou chromatografickou metodu. Výhodná je slabá iontoměničová kolona, například DEAE Sepharose. Slabé iontoměničové sloupce mají zpravidla jako funkční skupinu terciální amin (diethylaminoethyl), ale rovněž lze použít kvarterní aminoethyl nebo kvarterní amin.
Jako matrici lze použít matrici na bázi anorganických sloučenin, syntetických pryskyřic, polysacharidů nebo organických polymerů. Vhodnými matricemi jsou matrice na bázi agarózy, celulózy, trisakrylu, dextranu, skleněných kuliček, oxiran-akrylových kuliček, akrylamidu, kopolymerů • · • · • « agarózy a polyakrylamidu nebo hydrofilního vinylového polymeru.
Rovněž se dá předpokládat, že čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografií a hydrofobni chromatografií.
Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že lze použít libovolný hydrofobni sloupec. Výhodným sloupcem je FenylSepharózový sloupec. Funkční skupinou, může být fenyl, benzyl, oktyl nebo butyl. Matricí může být libovolná výše diskutovaná matrice.
U dalšího výhodného provedení čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografií, hydrofobni chromatografií a diafiltraci.
U zvláště výhodného provedení je ProCPB exprimována plazmidem pÁProCPB, uloženým pod ATCC depozitním číslem 69673.
Vynález dále poskytuje enzymaticky aktivní CPB, prostou ostatních látek savčího původu.
Příklady provedení vynálezu
Níže uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter, a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky. Příklady nezahrnují detailní popisy konvenčních metod, používaných pro konstrukci vektorů, vložení genů kódujících polypeptidy do těchto vektorů nebo zavádění výsledných plazmidů do hostitelských buněk. Příklady rovněž nezahrnují podrobný popis konvenčních metod, používaných pro testování • · • · · · • · · a • · · • · • ·« • · a • 9 9 t>9 9 9 <
• · a k· 99 polypeptidú, připravených těmito hostitelskými vektorovými systémy. Tyto metody jsou odborníkům v daném oboru dobře známy a jsou popsány v celé řadě publikací, které jsou v předložené přihlášce zmíněny formou odkazů.
Příklad 1
Klonování krysí karboxypeptidázové B cDNA pomocí PCR
I. DNA amplífikace
Ze slinivky Sprague-Dawleyových krys se extrahovala kompletní RNA. Z této kompletní RNA se izolovalo 40 gg póly A+ mRNA (pomocí sloupce oligo dT-Celulose). Takto získaný alikvotní podíl (10 μg) polyA+ mRNA se použil jako matrice při reverzní transkripční reakci, prováděné v přítomnosti 3'-koncového primeru syntetické karboxypeptidázy B (5) (obrázek 1).
Po ukončení syntézy jednořetězcové komplementární DNA (ss-cDNA), se mRNA vysrážela ethanolem. Alikvot ss-cDNA se následně podrobil PCR amplifikaci:
Pro amplifikaci DNA kódující CPB (940 bp) se použily syntetický primer, odpovídající 3'-konci karboxypeptidázy B, a syntetický primer, odpovídající 5'-konci zralé karboxypeptidázy B (obrázek 1).
Pro amplifikaci DNA kódující ProCPB (1230 bp) se použily syntetický primer, odpovídající 3'-konci karboxypeptidázy B, a syntetický primer, odpovídající 5'konci prokarboxypeptidázy B (obrázek 1) .
• · · · « · • · •·«· ·· ··
PCR amplifikační podmínky byly následující:
1. Příměrový 3'-konec 2 gg
2. Primerový 5'-konec 2 gg
3. ss-cDNA 5 μΐ
4. Pufr:
dNTP' s
Tris-HCL
KC1
MgCl2
5. Tag Polymeráza I Celkový objem:
6. Minerální olej (proti
7. 1 cyklus x [1' při 92
8. 35 cyklů x[l' při 92°'
9. 1 cyklus x [1' při 92
0,2mM
50mM
20mM
8mM jednotek 100 gl odpařování) 50 gl
C,; 2' při 40°C; a 4' při 72°C]
2' při 53°C; a 3' při 72°C]
C, ; 2' při 53°C; a 15' při 72°C]
Produkty PCR amplifikace se analyzovaly na 1% agarózového gelu. Neamplifikované kontrolní vzorky a velikostní markéry byly rovněž přítomny. Bylo možné pozorovat dva distinktni pásy přibližně 940 bp a 1230 bp. 940 bp pás reprezentoval CPB nukleotidovou sekvenci a 1230 bp pás reprezentoval ProCPB nukleotidovou sekvenci, který zahrnoval aktivační peptidovou nukleotidovou sekvenci.
Po ukončení PCR amplifikace se DNA vyčistila z reakční směsi chloroformovou a fenolovou extrakcí a vysrážením octanem amonným a isopropanolem.
• · • »
II. Plazmid pCPB
Plazmid pCPB (obrázek 2) se konstruoval digerací CPB cDNA pomocí BamHI a Ncol Po následné gelové purifikaci, se fragment subklonoval do BamHI a Ncol fragmentu plazmidu pABN o délce 2500 bp, který kódoval následující prvky, nezbytné pro expresi v bakterii:
(i) ÁPL promotor, umožňující genovou expresi z E. coli buněk indukcí, tj. posunem teploty.z 30°C na teplotu 42 °C, která inaktivuje teplotně senzitivní represor cl857;
(ii) deo ribozomové vazebné místo (rbs);
(iii) trp transkripční terminátor (8);
(iv) ampicilinově rezistentní gen z plazmidu pBR322; a (v) pBR322 počátek replikace.
III. Plazmidová pCPB-C
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidázová B aminokyselinová sekvence obsahuje 7 cysteinových zbytků, z nichž šest je napárováno na S-S vazby a jeden z nich (Cys290) je volným cysteinovým zbytkem (Barrett a McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida). Dá se předpokládat, že tento volný cysteinový zbytek může v průběhu sbalování rekombinantní CPB tvořit nežádoucí intermolekulární nebo intramolekulární S-S vazby. Cys290 se nenachází ani v katalytickém místě, ani v substrátovém vazebném místě karboxypeptidázy B a zdánlivě není potřebný pro enzymatickou aktivitu tohoto enzymu (Barrett a McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida.; Coli a kol. (1991), The Embo J., 10.1 až 9,). Proto bylo rozhodnuto, že ·· <4 44 4444 ·· · *
444· 4 4 » 444 ·
444 44 ♦ 4444
4444· 4 * · 4444 4 ·4·| 4 4 ·
4444 ·4 *· O ·· ·* se vyrobí CPB, ve které bude tento cystein nahrazen serinem a takto připravená CPB se označila jako CPB-C.
Připravil se 5'-koncový fosforylátovaný oligonukleotid, obsahující 2 nukleotidové substituce:
Thr Cys
......ACC TGT......původní sekvence v karboxypeptidáze B
Thr Ser
5' ATC CGC CAG ACT AGT GAG GAG ACA ATG 3' mutantní
Spěl sekvence
Tento oligonukleotid se použil při substituci nukleotidové sekvence, kódující Cys290 nukleotidovou sekvencí, kódující serin v plazmidové pCPB místně specifickou mutagenezí, která je znázorněna na obrázku 2 (Morinaga a kol. (1984), Bio-Technology July: 636-639). Nově získaný plazmid se označil jako pCPB-C.
IV. Plazmid pProCPB-C
Sestrojila se plazmidem značená pProCPB-C, nesoucí ProCPB-C nukleotidovou sekvenci (obsahující Cys290 -> Ser mutaci] (viz obrázek 3), která se použila pro transformaci do hostitelských buněk E. coli 4300.
V. Plazmidová pXProCPB
Sestrojil se plazmid označený jako pXProCPB, obsahující ProCPB nukleotidovou sekvenci (obrázek 3), který se použil pro transformaci do hostitelských buněk E. coli • · • · • · · · • · ··« ·· ♦ 9 9 99 » 999 9 · · · · 9999 ♦ fr ·«·· ··· ······ ♦· » ·· ·
4300. Tento plazmid se uložil 4. srpna 1994 do sbírky ATCC pod ATCC depozitním číslem 69673.
Z plazmidů pCPB, pCPB-C, pXProCPB a pProCPB-C se připravila plazmidová DNA. K ověření přítomnosti správných sekvencí se použila restrikční enzymová analýza plazmidové DNA a nukleové sekvencování.
Příklad 2
Fermentace, růstové podmínky a purifikace ProCPB a CPB
I Zásobní kultury
Zásobní kultura E, coli 4300, ve které je přítomen plazmid pXProCPB, se nechala růst na LB médiu doplněném ampicillinem (100 gg/ml).
II Inokulum
Inokulum se propagovalo ve 100 ml LB media, doplněného ampicillinem (100 gg/ml), při 30°C, dokud buněčná koncentrace nedosáhla O.D.6So 2,0.
Produkční médium (LB médium + ampicillin (100 gg/ml)) se naočkovalo, inkubovalo při 30°C, provzdušnilo, míchalo a udržovalo při pH 7,2 přidáním amoniaku. Do kultury se během růstu přidalo dvacet gramů glukózy. Po dosažení buněčné koncentrace O.D. 660 12, se teplota zvýšila na teplotu 42°C, která umožnila expresi ProCPB. Po dvou hodinách buněčná koncentrace dosáhla O.D.gso 22 až 29 a bakterie se sklidily.
• · • » • · • ·
III Čištěni
ProCPB se exprimovala plazmidem pXProCPB, v intracelulární sraženině, která se izolovala postupem: 40 gramů (hmotnost za vlhka) suspendovalo ve 450 ml pufru, (Sigma), 50 mM Tris-HCl, pH 8, ošetřovalo lysozymem (Sigma) gg/ml při 37°C.
shromážděné následuj ícím koláče se 1 mM PMSF a 2 hodiny koncentrace obsahuj ícího 10 mM EDTA do konečné
Do směsi, která se následně sonifikovala, se přidával Triton X-100 (Merck) do konečné koncentrace 2% a míchal dvě hodiny při pokojové teplotě. Surová intracelulární sraženina se peletovala odstřeďováním (14 000 ot/min, 30 min., 4°C) a promyla vodou.
Intracelulární sraženina, obsahující ProCPB, se rozpustila v pufru B, obsahujícím 25 mM NaCl, 8M močoviny, lOmM DTT, 20mM Bis-Tris pH 7. Roztok se chromatografoval na DEAE-Sepharozovém rychloproudém sloupci, uvedeném do rovnovážného stavu v pufru B a protein se eluoval přibližně lOOmM NaCl v pufru B a ProCPB se vysrážela pomocí (NH4)2SO4 při 40% nasycení při 0°C.
Později se ukázalo, že enzymaticky aktivní CPB by se dal získat pouze přes produkci prekurzorového proteinu. Nejprve se podobným způsobem jako výše popsaná ProCPB připravily polypeptidy CPB a CPB-C. Stejně tak byla podobným způsobem připravená ProCPB. Použitými plazmidy byly pCPB, pCPB-C resp. pProCPB-C (viz příklad 1). Růstové podmínky hostitelských buněk E. coli, které obsahovaly tyto plazmidy, a čištění polypeptidů byly v podstatě popsány výše v souvislosti s izolováním ProCPB z pufru, který se · 0 0 0 0 • · ·
« 0 0 0 <
0 4
0 0«
0 0 0 · · ·
0« 0 * · • 00000 *0 * • · 0 0 0 • 0 · · ·0 *· * použil pro rozpuštění intracelulární sraženiny, obsahující rekombinantní CPB nebo CPB-C, a který obsahoval 20mM ethanolaminu pH 9, lOmM DTT a 8M močoviny.
Je třeba poznamenat, že v tomto případě nebyly připravené a vyčištěné polypeptidy enzymaticky aktivní. Balení polypeptidů, které poskytuje enzymaticky účinných proteiny, je popsáno v příkladu 3.
Příklad 3
Balení a aktivace ProCPB-C
Způsobem popsaným v příkladu 2 se připravily Polypeptidy CPB a CPB-C, které, jak se ukázalo, nebyly enzymaticky aktivní. Běžné metody (popsané níže), které se použily pro balení polypeptidů, neposkytly enzymaticky aktivní protein.
Tento problém, spočívající v neschopnosti získat enzymaticky aktivní protein, vyřešilo vyvinutí alternativní metody, která zahrnuje expresi a balení prekurzorového proteinu po ošetření, odstraňujícím aktivní peptidovou část sbaleného prekurzorového proteinu.
Součástí tohoto alternativního postupu jsou následující kroky:
ProCPB-C připravená způsobem popsaným v příkladu 2, se rozpustila v koncentraci 10 mg/ml v 8M močovině, 5mM HC1 a naředila na 1 mg/ml ve lOOmM glycinu, 0,2mM ZnCl2 při pH 9, 10 a 11. Tyto roztoky tvořily balící roztoky.
• · » 4 • · « · » · · « • · <
Sbalení se dosáhlo sedmnáctihodinovou inkubací výše popsaných balících roztoků při pokojové teplotě. V tomto stadiu neměla sbalená ProCPB-C ještě žádnou enzymatickou aktivitu (viz tabulka I).
Hodnota pH roztoku, obsahujícího sbalenou ProCPB-C, se následně nastavila přidáním HC1 přibližně na 8,5 a ošetřovala 30 minut při 37°C trypsinem (1:200 hm./hm.), v důsledku čehož došlo k odstranění aktivačního peptidu. Reakce se ukončila přidáváním PMSF do konečné koncentrace 0, lmM.
Enzymatická aktivita takto získané sbalené CPB-C se určila (tabulka I) Folkovou metodou (Folk (1970), Methods in Enzymology 19: 504-508): Jedna jednotka aktivity (u) je definována jako množství enzymu, které katalyzuje hydrolýzu 1 gmolu Hippuryl-L-Arg substrátu za minutu při 25°C, a které způsobuje 0,12 zvýšení absorbance při 254 nm a 1 cm délce dráhy. Specifická aktivita komerční prasečí karboxypeptidáza’B (Sigma) je 230 u/mg.
»··· ·» ·· • · · • · *· « ·
9999 ·· ♦ ·« ·· · * • 9 ·’
Tabulka I: Specifická aktivita ProCPB-C (a z ní odvozené
CPB-C) za různých podmínek
| Reakce | Specifická aktivita (u/mg) |
| 1. Samotný substrát | 0,0 |
| 2. Balení při pH 9, trypsinové ošetření, není přítomná žádná ProCPB-C | 0, 0 |
| 3. Balení při pH 9, trypsinové ošetření | 4,3 |
| 4. Pouze balení při pH 9 | 0, 0 |
| 5. Balení při pH 10, trypsinové ošetření | 1,7 |
| 6. Balení při pH 11, trypsinové ošetření | 0, 3 |
| 7. Komerční prasečí CPB | 230 |
Tabulka I naznačuje, že sbalení ProCPB-C a ošetření sbalené ProCPB-C trypsinem za použití výše popsaných předem stanovených podmínek poskytlo enzymaticky aktivovanou CPBC.
Tabulka I dále ukazuje, že v případě, že je pH hodnota v balící směsi rovna 9, je specifická aktivita CPB-C vyšší, než v případě, kdy je pH v balící směsi rovna 10 nebo 11.
Příklad 4
Zlepšené balící podmínky
Cílem Následujících experimentů bylo stanovit optimální balící a aktivační podmínky. Předpokládalo se, že čím vyšší bude specifická aktivita CPB-C, získané trypsinovým odštěpením sbalené ProCPB-C, tím optimálnější • ·
• · » · ♦ φ
Φ 9 • · • · budou balicí podmínky ProCPB-C. Pro níže uvedené experimenty se jako kontrolní materiál použily „samotný substrát a „komerční prasečí karboxypeptidáza.
Výsledky (které byly popsány v příkladu 3) se zlepšily, pokud se balení provádělo za použití 0,05 až 0,1 mg/ml ProCPB při pH 9,5.
I. Vliv teploty na balení PriCPB-C
Sbalení ProCPB-C se dosáhlo inkubací 0,05 mg/ml polypeptidů ve 100 mM glycinu, pH 9,5 po dobu 90 hodin při teplotách, pohybujících se v teplotním rozmezí 10 až 37 °C. Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:200 hm./hm.) a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3. Nejvyšší specifická aktivita se získala v případě, kdy se balení ProCPB-C provádělo při teplotách 20°C až 30°C.
II. Vliv zoxidovaného a zredukovaného glutathionu na balení
ProCPB-C
Sbalení ProCPB-C se dosáhlo inkubací 0,05 mg/ml polypeptidů ve 100 mM glycinového pufru pH 9,5, 0,01mM ZnCl2 při 25°C v přítomnosti zoxidovaného a/nebo zredukovaného glytathionu (GSSG/GSH) nebo kyseliny askorbové (tabulka II). Následně se inkubované roztoky ošetřovaly jednu hodinu trypsinem (1:200 hm./hm.) při 37°C a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila (jak popisuje příklad 3) po 18 hodinách a po 45 hodinách.
•0 0000 • ♦ « » 000
0 0 0 • 0 0 ·
0 0* * 0000 ♦
0 0
Tabulka II: Specifická aktivita CPB-C jako funkce přítomnosti oxidačního/redukčního činidla v balícím roztoku
| Oxidační/redukční činidlo přidané do balícího roztoku | Specifická aktivita (u/mq) | |
| 18 hodin | 45 hodin | |
| 0,1 mM GSSG | 2,18 | 16,39 |
| 0,lmM GSSG, lmM GSH | 16,37 | 26,90 |
| 16,5 μΜ kyseliny askorbové | 4,06 | 9,24 |
| Kontrolní (bez přidání ox./red.činidel) | 1,19 | 5,39 |
* Kyselina askorbová se přidala v koncentraci 2,5 molu do jednoho molu SH skupiny.
Tabulka II ukazuje, že kombinované přidání GSSG a GSH způsobí prudké zvýšení specifické aktivity CPB-C a pravděpodobně tedy i balící účinnosti ProCPB-C. GSSH samotný rovněž zvyšuje balící účinnost ProCPB-C a rovněž tak kyselina askorbová, i když nižší měrou.
U další řady experimentů se zjistilo, že optimálního sbalení ProCPB-C se dosáhne přidáním 0,lmM GSSG a 0,5mM GSH do balícího roztoku.
III. Aktivace sbalené ProCPB-C trypsinem
Zjistilo se, že nejaktivnější CPB-C se získala odštěpením ProCPB-C trypsinem, které odstranilo aktivační peptid, pokud se inkubovaný balící roztok jednu hodinu ošetřoval trypsinem 1:50 hm./hm při teplotě 37°C.
• · · 9 ·9 · · 9 · ·· * ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 · «···
9·· 99 9» * ···* ♦
9999 9 9 · «999·« 9 · · ·9 ··
IV. Vliv pH na balení ProCPB-C
Vliv pH na balení ProCPB-C se určil v řadě reakcí, prováděných za již optimalizovaných podmínek.
Balení ProCPB-C se provádělo 24 hodin při koncentraci 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinu, 0,02mM ZnCl2, 0,5 mM redukovaného glytathionu (GSH), 0,1 mM zoxidovaného glytathionu (GSSG) při 25 °C a při různých hodnotách pH (hodnoty pH se pohybovaly v rozmezí oď 8,75 do 10,00). Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:50 hm./hm.; rozpustily v lmM HCI, lOmM CaCl2) a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
Nejvyšší specifická aktivita byla zjištěna v případě, kdy se balení ProCPB-C provádělo za pH hodnoty 9,25.
V. Vliv ZnCl2 na balení ProCPB-C
Účinek ZnCl2 koncentrace v balícím roztoku na balení ProCPB-C se stanovil v řadě reakcí, prováděných za již optimalizovaných podmínek. Při koncentraci ZnCl2 2 až 20krát vyšší než určená koncentrace CPB-C (mol/mol), se dosáhlo nejvyšší specifické aktivity připravené CPB-C. Pokud se balení provádělo v nepřítomnosti dalšího ZnCl2 a do balící směsi se přidala EDTA, která chelatovala veškeré zbytkové divalentní ionty, potom se specifická aktivita CPB-C snížila na nulu.
VI. Vliv proteinové koncentrace na balení ProCPB-C
Balení ProCPB-C se provádělo 24 hodin za optimálních podmínek (které byly uvedeny výše) při koncentracích
·· ···· • 999 9 9 • · « · · · • ··· · · · 9
9 9 9 9
9999 99 99 · naznačených v tabulce III. Po digeraci trypsinem se aktivita CPB-C měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
Tabulka III: Specifická aktivita CPB-C jako funkce proteinové koncentrace v balícím roztoku
| proteinová koncentrace (mg/ml) | Specifická aktivita (u/mg) |
| 0, 05 | 35,1 |
| 0,10 | 31,8 |
| 0, 20 | 20,3 |
Tabulka III ukazuje, že nejvyšší specifická aktivita připravené CPB-C se získá při proteinové koncentraci 0,05 mg/ml.
VII. Doba balení jako funkce specifické aktivity CPB-C
Optimální doba balení se určila v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek.
Balení Pro CPB-C se provádělo při koncentraci 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinu, pH 9,25, 0,lmM GSSG, 0,5mM GSH a 0,01 mM ZnCl2. Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:50 hm./hm.) a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3 v různých časových okamžicích (mezi O až 40 hodinami) od iniciace balení.
Nejvyšší aktivita CPB-C se naměřila, v případě, kdy se sbalená ProCPB-C odštěpila pomocí trypsinu po 20 hodinách, ·· ···· 99 »9
9 9 99 9 9 9 9 ·
999 9 9 · 99 99
99999 9 · 9 9 9 9 9 ·
9999 999
999999 99 9 99 9· měřeno od počátku balení. Balení trvající déle než 20 minut již hodnotu specifické aktivity neovlivnilo.
Příklad 5
Balení a aktivita různých CPB proteinů
CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C připravené a čištěné způsobem popsaným v příkladu 2, se balily 24 hodin 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinového pufru, pH 9,25, 0,01mM ZnCl2,
0,5mM GSSH při pokojové teplotě tj. za použití optimálních podmínek, určených v příkladu 4.
pH každého roztoku, obsahujícího sbalenou CPB , CPB-C, ProCPB nebo ProCPB-C se nastavila pomocí HC1 na 8,5 a roztoky, obsahující ProCPB a ProCPB-C se ošetřovaly jednu hodinu trypsinem (1:50 hm./hm.) při teplotě 37 °C , v důsledku čehož došlo k odstranění aktivačního peptidu. Reakce se ukončila přidáváním PMSF do konečné koncentrace 0,lmM. Specifická aktivita CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
• · • · ··· · · · »··· ·« ·· *« • · · < • · ·· • ··· · 4 • · 4 ·· ··
Tabulka IV: Specifická aktivita CPB, CPB-C, ProCPB a
ProCPB-C po sbalení a aktivita při optimálních podmínkách
| Balení | Specifická aktivita (u/mg) |
| Kontrolní1 bez trypsinového ošetření | 0, 00 |
| bez proteinu | 0, 00 |
| Balení - CPB | 0,00 |
| - CPB-C | 0, 08 |
| - ProCPB | 42,90 |
| - ProCPB-C | 20, 90 |
1 Kontrola „bez trypsinu se provedla pouze pro ProCPB-C.
Tabulka IV ukazuje, že enzymaticky účinnou CPB lze produkovat pouze z buněk, exprimujících prekurzor, který obsahuje aktivační peptid. Aktivační peptid je tedy nezbytný pro správné sbalení CPB.
Tabulka IV rovněž naznačuje, že CPB s optimální specifickou aktivitou se získá sbalením a aktivací ProCPB (exprimované plazmidovou pÁProCPB), která obsahuje tři Cys290 zbytky a nikoliv sbalením a aktivací ProCPB-C, která obsahuje Cys290 -> Ser mutaci. Cys290 je tedy zřejmě potřebná pro optimální sbalení a/nebo dosažení nejvyšší aktivity CPB.
• 4 · 4 • · ·
4 4 4 · ·
4 4 4 4 «
444 44 4 444
4·· · · ··
Příklad 6
Zlepšené balení ProCPB
I. Balení ProCPB ze surové intracelulární sraženiny
Zjistilo se, že optimální balící podmínky pro ProCPB jsou v podstatě identické s optimálními balícími podmínkami pro ProCPB-C, které se určily v příkladu 4.
Zjednodušený způsob balení a aktivace ProCPB se prováděly za použití surové intracelulární sraženiny, s tím, že se vynechal počáteční purifikační krok, popsaný v části III, příkladu 2.
Ukázalo se, že surová intracelulární sraženina, obsahující ProCPB (připravené způsobem popsaným v příkladu 2), by mohla být rozpuštěna při vysokých proteinových koncentracích (tabulka V) ve lOOmM glycinu, pH 9,5 a 8M močovině.
Balení se provádělo za optimalizovaných podmínek při pokojové teplotě 24 hodin. Hodnota pH se zvýšila na optimálních 9,5 (tato optimální hodnota byla stanovena již dříve). Sbalená ProCPB se odštěpila pomocí trypsinu (1:50 hm./hm.) a specifická aktivita CPB se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
• · · · · · • ·
Tabulka V: Specifická aktivita CPB jako funkce proteinové koncentrace v balícím roztoku, obsahujícím surovou intracelulární sraženinu
| Proteinová koncentrace (mg/ml) | Specifická aktivita (u/mg) |
| 0,1 | 10, 5 |
| 0,2 | ' 10,9 |
| 0,5 | 11, 9 |
| 1,0 | 12,1 |
| 2,0 | 11, 4 |
Tabulka V ukazuje, že enzymaticky aktivní CPB lze získat sbalením ProCPB, získané ze surové intracelulární sraženiny, a následnou trypsinovou digerací. Kromě toho CPB má při všech měřených proteinových koncentracích podobné hodnoty enzymatické aktivity. To je neočekávaný výsledek, vzhledem k tomu, že specifická aktivita CPB, čištěné na DEAE Sepharose před jejím sbalením (příklad 2), s růstem proteinové koncentrace v balící směsi klesá. Intracelulární sraženina pravděpodobně obsahuje faktory, které napomáhají sbalení ProCPB.
II. Kalibrování CBB sbalováním ProCPB ze surové intracelulární sraženiny (i) Příprava
Ze 42 litrů hostitelských buněk E. coli 4300, obsahujících plazmid pÁProCPB a exprimujících ProCPB, se
Β · Β • ΒΒΒ • Β ΒΒ··
Β Β Β • Β · ·
vyčistila téměř homogenní CPB. Fermentační a růstové podmínky byly v podstatě popsány v příkladu 2.
Surová intracelulární sraženina se omyla ve vodě a rozpustila v koncentraci 20 mg/ml ve lOOmM glycinu, pH 9,5, 8M močoviny. Tato směs se naředila do koncentrace 1 mg/ml lOOmM glycinu, pH 9,5, 0,lmM ZnCl2, 0,5mM GSH, do takto naředěné směsi se přidalo Ο,ΙχηΜ GSSG a výsledný balící roztok se inkuboval 24 hodin při teplotě 25°C. Hodnota pH se následně nastavila pomocí HC1 na 8,5 á sbalená ProCPB se digerovala jednu hodinu při 37 °C trypsinem (20 gg/ml). Trypsin se inaktivoval Ο,ΙχηΜ PMSF.
(ii) Čištění
Enzymaticky aktivní CPB se aplikovala na DEAE Sepharose Fast-Flow sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu 20 mM Tris-HCl, pH 8 při 20 mg na 1 ml pryskyřice. CPB se eluovala 80mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8. Do DEAE eluční frakce se přidal síran amonný (0,8M) a frakce se dále chromatografovala na Fenyl-Sepharose FastFlow sloupci (Pharmacia), vyváženém pomocí 20mM Tris-HCl pH 8, 0,8M síranu amonného. CPB se eluovala 0,4M síranem amonným, zahustila, diafiltrovala proti lOOmM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8 a skladovala při -20°C.
U výše popsaného čistícího postupu se 42 litrů hostitelských buněk E.coli 4300, obsahujících plazmidovou pXProCPB při O.D. 660 = 36, zpracovalo výše popsaným způsobem a poskytlo 1,25 gramu enzymaticky aktivní CPB se specifickou aktivitou 637 u/mg. Celkový výtěžek činil 60%.
φφ ···· ·· ·· • 9 9 · • · · φ ΦΦΦ • · ··*· ΦΦ • · ·
Φ Φ · • ·
ΦΦ ·· • Φ · 9
9 ··
Φ ··· · 9
9 9
ΦΦ 99
Specifická aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B, měřené za identických experimentálních podmínek, byla 298 u/mg.
Příklad 7
Charakteristika enzymaticky aktivní CPB
CPB, připravená způsoby, popsanými v příkladech 5 a 6, má biologické a enzymatické vlastnosti srovnatelné s prasečí karboxypeptidázou B. Extinkční koeficient rekombinantní CPB, vypočtený na základě jejího složení aminokyselin, je ε1%280 = 19, 7 . Extinkční koeficient komerční prasečí karboxypeptidázy B je ε1%280 = 21,4 (Barrett a McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida).
Rekombinantní CPB má specifickou aktivitu 637 u/mg (Hippuryl-L-Arg substrát) a obsahuje 1 mol Zinku na mol enzymu, stanoveno atomovou absorpcí.
Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence poskytla Ala-Ser-Gly-His-Ser, jak bylo možné očekávat na základě analýzy aminokyselinové sekvence zralé krysí karboxypeptidázy B (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845).
Optimální pH pro rekombinantní CPB aktivitu se určila za použití 25mM následujících pufrů: NaOAc, pH 4 až 6; BisTris, pH 6 až 7,5; Tris-HCl, pH 7,5 až 9; a glycinu, pH 9 až 12. CPB specifická aktivita se měřila způsobem, popsaným v příkladu 3. Optimální enzymatická aktivita CPB byla dosažena při pH 8. Inkubace CPB při 55°C způsobila 50% ztrátu aktivity a úplné inaktivace se dosáhlo při 65°C.
• β • · · · · · • · · 9 9 · • · · 9 · · 9 9
9 9 9 9
9999 99 9 9 9
Kinetická analýza rekombinantní CPB se prováděla za použití Hippuryl-L-Arg substrátu (obrázek 4). Inhibice CPB aktivity při koncentracích substrátu vyšších než 0,5mM.
Další studie ukázaly, že rekombinantní CPB byla inhibována katalytickým produktem argininu, který je konkurenčním inhibitorem karboxypeptidázy B. Odpovídající Lineweaver-Burkova křivka ukázala pro Km hodnotu 0,38mM.
Rekombinantní CPB byla rovněž inhibována 1,10fenantrolinem, silným divalentním iontovým chelatorem, což demonstruje důležitost Zn iontů pro enzymatickou aktivitu CPB. V přítomnosti lmM 1,10-fenantrolin, byla pozorována 50% ztráta aktivity 1 mg/ml rekombinantní CPB.
Příklad 8
Konverze proinzulínu na inzulín pomocí CPB
Mini-proinzulín, který popisuje EP 347781 Bl, lze převést na inzulín zpracováním za použití trypsinu a rekombinantní CPB, připravenou způsobem popsaným v příkladech 5 a 6.
Trypsin štěpí proinzulín specificky v místě mezi argininovým zbytkem a A řetězcem. CPB následně specificky hydrolyzuje argininový zbytek z C-konce B řetězce.
Komerční lidský inzulín (Boehringer-Mannheim) lze použít jako standard, pokud jde o mini-proinzulín, štěpený trypsinem a komerční prasečí karboxypeptidázou B, a miniproinzulín, štěpený samotným trypsinem.
• ·
INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:
| (i) | SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární | |
| (ii) | TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii; | i HYPOTETICKÁ: | žádná |
| (iv) | PROTISMYSLNÁ: | žádná |
(xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 1:
GCGCATATGC ATGCTTCCGA GGAGCACTTT GATGGC 36
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 285 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
| (D) TOPOLOGIE: Lineární | ||
| (ii) | TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) | HYPOTETICKÁ: | žádná |
| (iv) | PROTISMYSLNÁ: | žádná |
(ix) ZNAKY:
(A) NAZEV/KLÍC: CDS (B) LOKALITA: 1..285 (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
| CAT His 1 | GCT TCC | GAG Glu | GAG CAC | TTT Phe | GAT GGC AAC CGG | GTG Val | TAC Tyr | CGT Arg | GTC Val 15 | AGT Ser | 48 | |||||
| Ala | Ser | Glu 5 | His | Asp | Gly | Asn 10 | Arg | |||||||||
| GTA | CAT | GGT | GAA | GAT | CAC | GTC | AAC | TTA | ATT | CAG | GAG | CTA | GCC | AAC | ACC | 96 |
| Val | His | Gly | Glu | Asp | His | Val | Asn | Leu | Ile | Gin | Glu | Leu | Ala | Asn | Thr | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| AAA | GAG | ATT | GAT | TTC | TGG. | AAA | CCA | GAT | TCT | GCT | ACA | CAA | GTG | AAG | CCT | 144 |
| Lvs | Glu | Ile | Asp | Phe | Trp | Lys | Pro | Asp | Ser | Ala | Thr | Gin | Val | Lys | Pro | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| CTC | ACT | ACA | GTT | GAC | TTT | CAT | GTT | AAA | GCA | GAA | GAT | GTT | GCT | GAT | GTG | 192 |
| Leu | Thr | Thr | Val | Asp | Phe | His | Val | Lys | Ala | Glu | Asp | Val | Ala | Asp | Val | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GAG | AAC | TTT | CTG | GAG | GAG | AAT | GAA | GTT | CAC | TAT | GAG | GTA | CTG | ATA | AGC | 240 |
| Glu | Asn | Phe | Leu | Glu | Glu | Asn | Glu | Val | His | Tyr | Glu | Val | Leu | Ile | Ser | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| AAC | GTG | AGA | AAT | GCT | CTG | GAA | TCC | 'CAG | TTT | GAT | AGC | CAC | ACC | CGT | 285 | |
| Asn | Val | Arg | Asn | Ala | Leu | Glu | Ser | Gin | Phe | Asp | Ser | His | Thr | Arg | ||
| 85 | 90 | 95 |
INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 95 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
| His 1 | Ala | Ser Glu | Glu 5 | His | Phe | Asp | Gly | Asn 10 | Arg | Val | Tyr | Arg | Val 15 | Ser |
| Val | His | Gly Glu 20 | Asp | His | Val | Asn | Leu 25 | Ile | Gin | Glu | Leu | Ala 30 | Asn | Thr |
• · · · • ··
| Lys | Glu | Ile 35 | Asp | Phe | Trp | Lys | Pro 40 | Asp | Ser | Ala | Thr | Gin 45 | Val | Lys | Pro |
| Leu | Thr 50 | Thr | Val | Asp | Phe | His 55 | Val | Lys | Ala | Glu | Asp 60 | Val | Ala | Asp | Val |
| Glu 65 | Asn | Phe | Leu | Glu | Glu 70 | Asn | Glu | Val | His | Tyr 75 | Glu | Val | Leu | Ile | Ser 80 |
| Asn | Val | Arg | Asn | Ala 85 | Leu | Glu | Ser | Gin | Phe 90 | Asp | Ser | His | Thr | Arg 95 |
INFORMACE PRO SEQ ID NO:4: ; (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC
INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 927 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA ·· ·· ·· ···· »· ·· « · · · ♦· · ··· • · · · · · · · · · • · · · · · · · · ···· * · · · · · · ······ · · · ·· · · (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: Žádná (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) LOKALITA: 1..927 (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
| GCA Ala | AGT GGA | CAC His | AGC Ser 100 | TAC ACC AAG | TAC AAC AAC TGG GAA ACG ATT GAG | 48 | ||||||||||
| Ser | Gly | Tyr Thr | Lys | Tyr | Asn 105 | Asn | Trp | Glu | Thr | Ile 110 | Glu | |||||
| GCG | TGG | ATT | CAA | CAA | GTT | GCC | ACT | GAT | AAT | CCA | GAC | CTT | GTC | ACT | CAG | 96 |
| Ala | Trp | Ile | Gin | Gin | Val | Ala | Thr | Asp | Asn | Pro | Asp | Leu | Val | Thr | Gin | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| AGC | GTC | ATT | GGA | ACC | ACA | TTT | GAA | GGA | CGT | AAC | ATG | TAT | GTC | CTC | AAG | 144 |
| Ser | Val | Ile | Gly | Thr | Thr | Phe | Glu | Gly | Arg | Asn | Met | Tyr | Val | Leu | Lys | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| ATT | GGT | AAA | ACT | AGA | CCG | AAT | AAG | CCT | GCC | ATC | TTC | ATC | GAT | TGT | GGT | 192 |
| Ile | Gly | Lys | Thr | Arg | Pro | Asn | Lys | Pro | Ala | Ile | Phe | Ile | Asp | Cys | Gly | |
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| TTC | CAT | GCA | AGA | GAG | TGG | ATT | TCT | CCT | GCA | TTC | TGT | CAG | TGG | TTT | GTG | 240 |
| Phe | His | Ala | Arg | Glu | Trp | Ile | Ser | Pro | Ala | Phe | Cys | Gin | Trp | Phe | Val | |
| 160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| AGA | GAG | GCT | GTC | CGT | ACC | TAT | AAT | CAA | GAG | ATC | CAC | ATG | AAA | CAG | CTT | 288 |
| Arg | Glu | Ala | Val | Arg | Thr | Tyr | Asn | Gin | Glu | Ile | His | Met | Lys | Gin | Leu | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| CTA | GAT | GAA | CTG | GAT | TTC | TAT | GTT | CTG | CCT | GTG | GTC | AAC | ATT | GAT | GGC | 336 |
| Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | Tyr | Val | Leu | Pro | Val | Val | Asn | Ile | Asp | Gly | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| TAT | GTC | TAC | ACC | TGG | ACT | AAG | GAC | AGA | ATG | TGG | AGA | AAA | ACC | CGC | TCT | 384 |
| Tyr | Val | Tyr | Thr | Trp | Thr | Lys | Asp | Arg | Met | Trp | Arg | Lys | Thr | Arg | Ser | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| ACT | ATG | GCT | GGA | AGT | TCC | TGC | TTG | GGT | GTA | GAC | CCC | AAC | AGG | AAT | TTT | 432 |
| Thr | Met | Ala | Gly | Ser | Ser | Cys | Leu | Gly | Val | Asp | Pro | Asn | Arg | Asn | Phe | |
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| AAT | GCT | GGC | TGG | TGT | GAA | GTG | GGA | GCT | TCT | CGG | AGT | CCC | TGC | TCT | GAA | 480 |
| Asn | Ala | Gly | Trp | Cys | Glu | Val | Gly | Ala | Ser | Arg | Ser | Pro | Cys | Ser | Glu | |
| 240 | 245 | • | 250 | 255 |
• · • · • · · · ·· · · • · ·· I
| ACT TAC | TGT Cys | GGA Gly | CCA GCC Pro Ala 260 | CCA Pro | GAG Glu | TCT Ser | |
| Thr | Tyr | ||||||
| GCA | GAT | TTC | ATC | CGC AAC | AAC | CTC | TCC |
| Ala | Asp | Phe | Ile | Arg Asn | Asn | Leu | Ser |
| 275 | 280 | ||||||
| ATC | CAC | TCA | TAC | TCA CAG | ATG | ATG | CTC |
| Ile | His | Ser | Tyr | Ser Gin | Met | Met | Leu |
| 290 | 295 | ||||||
| AAA | CTG | CCT | GAG | AAC TAT | GAG | GAA | TTG |
| Lys | Leu | Pro | Glu | Asn Tyr | Glu | Glu | Leu |
| 305 | 310 | ||||||
| GCA | AAG | GAG | CTT | GCC ACT | CTG | CAT | GGC |
| Ala | Lys | Glu | Leu | Ala Thr | Leu | His | Gly |
| 320 | 325 | ||||||
| GGA | GCT | ACA | ACA | ATC TAT | CCT | GCT | GCT |
| Gly | Ala | Thr | Thr | Ile Tyr | Pro | Ala | Ala |
| 340 | |||||||
| TAT | GAT | CAG | GGA | ATC AAA | TAT | TCC | TTT |
| Tyr | Asp | Gin | Gly | Ile Lys | Tyr | Ser | Phe |
| 355 | 360 | ||||||
| GGC | TTC | TTT | GGC | TTT CTC | CTT | CCT | GAG |
| Gly | Phe | Phe | Gly | Phe Leu | Leu | Pro | Glu |
| 370 | 375 | ||||||
| GAG | GAG | ACA | ATG | CTT GCA | GTC | AAG | TAC |
| Glu | Glu | Thr | Met | Leu Ala | Val | Lys | Tyr |
| 385 | 390 | ||||||
| CAT | CTA | TAT | TAG | TGA | |||
| His | Leu | Tyr | * | * | |||
| 400 |
| GAA AAA GAG | ACA Thr | AAG Lys | GCC Ala 270 | CTG Leu | 528 | ||
| Glu 265 | Lys | Glu | |||||
| ACC | ATC | AAG | GCC | TAC | CTG | ACC | 576 |
| Thr | Ile | Lys | Ala | Tyr 285 | Leu | Thr | |
| TAC | CCT | TAC | TCC | TAT | GAC | TAC | 624 |
| Tyr | Pro | Tyr | Ser 300 | Tyr | Asp | Tyr | |
| AAT | GCC | CTG | GTG | AAA | GGT | GCG | 672 |
| Asn | Ala | Leu 315 | Val | Lys | Gly | Ala | |
| ACC | AAG | TAC | ACA | TAT | GGC | CCA | 720 |
| Thr | Lys 330 | Tyr | Thr | Tyr | Gly | Pro 335 | |
| GGG | GGA | TCT | GAC | GAC | TGG | TCT | 768 |
| Gly 345 | Gly | Ser | Asp | Asp | Trp 350; | Ser | |
| ACC | TTT | GAA | CTC | CGG | GAT | ACA | 816 |
| Thr | Phe | Glu | Leu | Arg 365 | Asp | Thr | |
| TCT | CAG | ATC | CGC | CAG | ACC | TGT | 864 |
| Ser | Gin | Ile | Arg 380 | Gin | Thr | Cys | |
| ATT | GCC | AAT | TAT | GTC | CGA | GAA | 912 |
| Ile | Ala | Asn 395 | Tyr | Val | Arg | Glu |
927 • 9 ·
Φ 9
9 · · · 999
999999 99 9 99 99
INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 309 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
| SEQ | ID | NO: | 6: | ||||||||||||
| Ala | Ser | Gly | His | Ser | Tyr | Thr | Lys | Tyr | Asn | Asn | Trp | Glu | Thr | Ile | Glu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ala | Trp | Ile | Gin. | Gin | Val | Ala | Thr | Asp | Asn | Pro | Asp | Leu | Val | Thr | Gin |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ser | Val | Ile | Gly | Thr | Thr | Phe | Glu | Gly | Arg | Asn | Met | Tyr | Val | Leu | Lys |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ile | Gly | Lys | Thr | Arg | Pro | Asn | Lys | Pro | Ala | Ile | Phe | Ile | Asp | Cys | Gly |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Phe | His | Ala | Arg | Glu | Trp | Ile | Ser | Pro | Ala | Phe | Cys | Gin | Trp | Phe | Val |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Arg | Glu | Ala | Val | Arg | Thr | Tyr | Asn | Gin | Glu | Ile | His | Met | Lys | Gin | Leu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | Tyr | Val | Leu | Pro | Val | Val | Asn | Ile | Asp | Gly |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Tyr | Val | Tyr | Thr | Trp | Thr | Lys | Asp | Arg | Met | Trp | Arg | Lys | Thr | Arg | Ser |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Thr | Met | Ala | Gly | Ser | Ser | Cys | Leu | Gly | Val | Asp | Pro | Asn | Arg | Asn | . Phe |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Asn | Ala | Gly | Trp | Cys | Glu | Val | Gly | Ala | Ser | Arg | Ser | Pro | Cys | Ser | Glu |
| 145 | 150 | 155 | 160 |
4444 • · * · 4 4
4 4 · · • 4 4 4 4 4 4
4 4 4
4444 44 «4
| Thr Tyr | Cys | Gly | Pro Ala 165 | Pro | Glu Ser Glu 170 | Lys | Glu | Thr | Lys | Ala Leu 175 | |||||
| Ala | Asp | Phe | Ile | Arg | Asn | Asn | Leu | Ser | Thr | Ile | Lys | Ala | Tyr | Leu | Thr |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ile | His | Ser | Tyr | Ser | Gin | Met | Met | Leu | Tyr | Pro | Tyr | Ser | Tyr | Asp | Tyr |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Lys | Leu | Pro | Glu | Asn | Tyr | Glu | Glu | Leu | Asn | Ala | Leu | Val | Lys | Gly | Ala |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ala | Lys | Glu | Leu | Ala | Thr | Leu | His | Gly | Thr | Lys | Tyr | Thr | Tyr | Gly | Pro |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Gly | Ala | Thr | Thr | Ile | Tyr | Pro | Ala | Ala | Gly | Gly | Ser | Asp | Asp | Trp | Ser |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Tyr | Asp | Gin | Gly | Ile | Lys | Tyr | Ser | Phe | Thr | Phe | Glu | Leu | Arg | Asp | Thr |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Gly | Phe | Phe | Gly | Phe | Leu | Leu | Pro | Glu | Ser | Gin | Ile | Arg | Gin | Thr | Cys |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Glu | Glu | Thr | Met | Leu | Ala | Val | Lys | Tyr | Ile | Ala | Asn | Tyr | Val | Arg | Glu |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| His | Leu | Tyr | ★ | * |
305
INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
| (D) TOPOLOGIE: | Lineární | ||
| (ii) | TYP MOLEKULY: | cDNA | |
| (iii) | i HYPOTETICKÁ: | žádná | |
| (iv) | PROTISMYSLNÁ: | žádná |
(xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
CGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT
INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy enzymaticky aktivní savčí CPB, vy značený tím, že zahrnuje:(a) ošetření rekombinantní buňky obsahující DNA, kódující ProCPB, které způsobí, že DNA řídí expresi ProCPB;(b) izolaci takto exprimované ProCPB z buňky;(c) ošetření izolované ProCPB za podmínek umožňujících sbalování ProCPB;(d) vystavení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení za vzniku enzymaticky aktivní CPB; a (e) čištění enzymaticky aktivní CPB.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že izolační krok (b) zahrnuje:(i) porušení buněčné stěny rekombinantní buňky za vzniku lyzátu;
(ii) izolaci intracelulární sraženiny z lyzátu - odstředováním; (iii) rozpuštění intracelulární sraženiny ve vhodném pufru. 3. Způsob podle nároku 1, v y z n a č e n ý tím, že provozní krok (c) zahrnuje inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 až 24 hodin při pH přibližně 9 až 9,5.49 9 9 9 · • · · 9 9 • 999 94 99 9 9 99999 9 9 9 9 - 4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že provozní krok (c) zahrnuje inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 až 24 hodin při pH přibližně 9 až 9,5 v přítomnosti ZnCl2/ zoxidovaného glytathionu a zredukovaného glytathionu.
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že provozní krok (d) zahrnuje:(i) nastavení pH hodnoty přibližně na 8,5; a (ii) odštěpení ProCPB pomocí trypsinu při 37°C v průběhu přibližně 60 minut.
- 6. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že purifikační krok (e) zahrnuje iontoměničovou chromatografií.
- 7. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že purifikační krok (e) zahrnuje iontoměničovou chromatografií a hydrofobní chromatografií.
- 8. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že purifikační krok (e) zahrnuje iontoměničovou chromatografií, hydrofobní chromatografií a diafiltraci.φφ φφφφ φφ φφ φφφφ φφ φ φφφφ φφφ φφ φ φφφφ φ φφφ φφφφ · φφφ φ φ φ φφφφ φφφ φφφφφφ φφ φ φφ φφ
- 9. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že ProCPB je exprimována plazmidovou pXProCPB, uloženou pod ATCC depozitním číslem 69673.
- 10. Enzymaticky účinná savčí CPB, připravená způsobem podle nároku 1, prostá všech dalších látek savčího původu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37823395A | 1995-01-25 | 1995-01-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ225897A3 true CZ225897A3 (cs) | 1998-10-14 |
| CZ292541B6 CZ292541B6 (cs) | 2003-10-15 |
Family
ID=23492292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19972258A CZ292541B6 (cs) | 1995-01-25 | 1996-01-25 | Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5948668A (cs) |
| EP (1) | EP0871718B1 (cs) |
| JP (1) | JP4250716B2 (cs) |
| KR (1) | KR100566136B1 (cs) |
| CN (1) | CN1144874C (cs) |
| AT (1) | ATE358717T1 (cs) |
| AU (1) | AU698889B2 (cs) |
| BR (1) | BR9606795A (cs) |
| CA (1) | CA2210242C (cs) |
| CZ (1) | CZ292541B6 (cs) |
| DE (1) | DE69637011T2 (cs) |
| DK (1) | DK0871718T3 (cs) |
| ES (1) | ES2284167T3 (cs) |
| HU (1) | HU225673B1 (cs) |
| IL (1) | IL116696A (cs) |
| MX (1) | MX9705279A (cs) |
| NZ (1) | NZ302874A (cs) |
| PL (1) | PL183228B1 (cs) |
| PT (1) | PT871718E (cs) |
| WO (1) | WO1996023064A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA96515B (cs) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1193278A (zh) | 1995-08-16 | 1998-09-16 | 曾尼卡有限公司 | 化合物 |
| ATE298251T1 (de) | 1998-08-06 | 2005-07-15 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-uricase konjugate und verwendung davon |
| US20040117863A1 (en) * | 1998-09-18 | 2004-06-17 | Edge Michael D. | Transgenically produced fusion proteins |
| DE19915938A1 (de) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
| JP2003509040A (ja) * | 1999-09-17 | 2003-03-11 | ジェンジム トランスジェニックス コーポレイション | 遺伝子導入により産生された融合タンパク質 |
| EP1220932B1 (en) * | 1999-09-29 | 2005-11-09 | Lexicon Genetics Incorporated | Human carboxypeptidases and polynucleotides encoding the same |
| EP1632575B1 (en) * | 1999-09-29 | 2009-01-28 | Lexicon Pharmaceuticals, Inc. | Human carboxypeptidases and polynucleotides encoding the same |
| AU2001229253A1 (en) * | 2000-01-12 | 2001-07-24 | Eli Lilly And Company | Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity |
| EP1538203B1 (en) * | 2003-12-05 | 2010-01-20 | Roche Diagnostics GmbH | Recombinantly expressed carboxypeptidase B and purification thereof |
| DE602004025192D1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung |
| SI1794294T1 (sl) * | 2004-09-27 | 2011-11-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Rekombinantna karboksipeptidaza B |
| AU2006235437B2 (en) | 2005-04-11 | 2011-11-24 | Horizon Therapeutics Usa, Inc. | A variant form of urate oxidase and use thereof |
| US20080159976A1 (en) * | 2005-04-11 | 2008-07-03 | Jacob Hartman | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| US8148123B2 (en) | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| CA2604399A1 (en) | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Variant forms of urate oxidase and use thereof |
| US20090081122A1 (en) * | 2005-05-23 | 2009-03-26 | Universite De Geneve | Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant |
| JP5033177B2 (ja) | 2006-04-12 | 2012-09-26 | サビエント ファーマセウティカルズ インク． | 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製 |
| CN101058805B (zh) * | 2007-03-21 | 2011-09-07 | 北京贯虹科技有限公司 | 突变羧肽酶原b及突变羧肽酶b的生产方法 |
| US8993714B2 (en) * | 2007-10-26 | 2015-03-31 | Imiplex Llc | Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof |
| US9102526B2 (en) | 2008-08-12 | 2015-08-11 | Imiplex Llc | Node polypeptides for nanostructure assembly |
| WO2010132363A1 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Imiplex Llc | Method of protein nanostructure fabrication |
| SG176897A1 (en) | 2009-06-25 | 2012-01-30 | Savient Pharmaceuticals Inc | Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy |
| CN101967467B (zh) * | 2009-07-28 | 2012-11-14 | 上海雅心生物技术有限公司 | 一种高稳定性的重组羧肽酶b的生产及应用 |
| US20200237881A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-07-30 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Reducing immunogenicity to pegloticase |
| US12121566B2 (en) | 2019-01-30 | 2024-10-22 | Horizon Therapeutics Usa, Inc. | Methods for treating gout |
| US11918624B2 (en) * | 2020-06-10 | 2024-03-05 | Kelsius Laboratories LLC | Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders |
| US12269875B2 (en) | 2023-08-03 | 2025-04-08 | Jeff R. Peterson | Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3625829A (en) * | 1967-12-04 | 1971-12-07 | Bayer Ag | Purification of carboxypeptidase b |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| HU190129B (en) * | 1983-07-11 | 1986-08-28 | Reanal Finomvegyszergyar,Hu | Process for the isolation of carboxypeptidase b enzyme from mammal pancreas |
| US5206161A (en) * | 1991-02-01 | 1993-04-27 | Genentech, Inc. | Human plasma carboxypeptidase B |
| FR2692907B1 (fr) * | 1992-06-25 | 1995-06-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation. |
| JP3472587B2 (ja) * | 1992-08-28 | 2003-12-02 | アベンティス ファーマ株式会社 | 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法 |
| HU220879B1 (en) * | 1993-11-16 | 2002-06-29 | Lilly Co Eli | Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b |
-
1996
- 1996-01-08 IL IL11669696A patent/IL116696A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-01-23 ZA ZA96515A patent/ZA96515B/xx unknown
- 1996-01-25 AU AU49034/96A patent/AU698889B2/en not_active Expired
- 1996-01-25 BR BR9606795A patent/BR9606795A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-25 EP EP96905218A patent/EP0871718B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 DK DK96905218T patent/DK0871718T3/da active
- 1996-01-25 JP JP52300096A patent/JP4250716B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 KR KR1019970705046A patent/KR100566136B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 PT PT96905218T patent/PT871718E/pt unknown
- 1996-01-25 WO PCT/US1996/000995 patent/WO1996023064A1/en not_active Ceased
- 1996-01-25 HU HU9800091A patent/HU225673B1/hu unknown
- 1996-01-25 CA CA2210242A patent/CA2210242C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 DE DE69637011T patent/DE69637011T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 AT AT96905218T patent/ATE358717T1/de active
- 1996-01-25 NZ NZ302874A patent/NZ302874A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-01-25 CZ CZ19972258A patent/CZ292541B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-25 ES ES96905218T patent/ES2284167T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 PL PL96321499A patent/PL183228B1/pl unknown
- 1996-01-25 CN CNB961923679A patent/CN1144874C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-13 US US08/782,760 patent/US5948668A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 MX MX9705279A patent/MX9705279A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT871718E (pt) | 2007-06-26 |
| NZ302874A (en) | 1998-11-25 |
| PL321499A1 (en) | 1997-12-08 |
| MX9705279A (es) | 1998-06-30 |
| IL116696A0 (en) | 1996-05-14 |
| HK1014986A1 (en) | 1999-10-08 |
| KR100566136B1 (ko) | 2006-11-10 |
| ES2284167T3 (es) | 2007-11-01 |
| HUP9800091A3 (en) | 2004-03-29 |
| JP4250716B2 (ja) | 2009-04-08 |
| PL183228B1 (pl) | 2002-06-28 |
| CN1177377A (zh) | 1998-03-25 |
| JPH11503002A (ja) | 1999-03-23 |
| CZ292541B6 (cs) | 2003-10-15 |
| EP0871718A1 (en) | 1998-10-21 |
| HU225673B1 (en) | 2007-06-28 |
| US5948668A (en) | 1999-09-07 |
| CA2210242C (en) | 2010-04-27 |
| DE69637011T2 (de) | 2007-12-13 |
| KR19980701652A (ko) | 1998-06-25 |
| CA2210242A1 (en) | 1996-08-01 |
| IL116696A (en) | 1999-08-17 |
| ZA96515B (en) | 1996-08-15 |
| CN1144874C (zh) | 2004-04-07 |
| AU4903496A (en) | 1996-08-14 |
| EP0871718A4 (en) | 2000-06-07 |
| DE69637011D1 (de) | 2007-05-16 |
| ATE358717T1 (de) | 2007-04-15 |
| BR9606795A (pt) | 1997-12-30 |
| WO1996023064A1 (en) | 1996-08-01 |
| DK0871718T3 (da) | 2007-07-02 |
| HUP9800091A2 (hu) | 1998-05-28 |
| EP0871718B1 (en) | 2007-04-04 |
| AU698889B2 (en) | 1998-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ225897A3 (cs) | Způsob přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidásy B | |
| Verhaert et al. | Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis | |
| US5948659A (en) | Recombinant fructosyl amino acid oxidase | |
| AU628265B2 (en) | Cloned n-methylhydantoinase | |
| US5496719A (en) | Polypeptide from Humicola insolens possessing protein disulfide isomerase activity gene encoding the same | |
| FI93125B (fi) | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa | |
| KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조 | |
| JPH06225775A (ja) | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 | |
| US6723543B1 (en) | Mutant kanamycin nucleotidyltransferases from S. aureus | |
| HUT69769A (en) | Recombinant dna compounds and expression vectors encoding para-nitrobenzyl esterase activity from bacillus | |
| US5993807A (en) | Truncated aspartase enzyme derivatives and uses thereof | |
| JP3477746B2 (ja) | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 | |
| JP3257119B2 (ja) | プロティンジスルフィドイソメラーゼ活性物質およびその製造方法 | |
| EP1334183B1 (en) | NOVEL SOLUBLE ENDOPROTEASES FOR THE i IN VITRO /i PROCESSING OF RECOMBINANT PROTEINS | |
| HK1014986B (en) | Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b | |
| JPS62175173A (ja) | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ３ｂ | |
| JPH06292574A (ja) | α−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質及びその遺伝情報を有するＤＮＡ並びにα−グルコシダーゼの製造法 | |
| MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use | |
| JPH05308964A (ja) | α−グルコシダーゼ活性を有する蛋白質及びその遺伝情報を有するＤＮＡ並びにα−グルコシダーゼの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160125 |