HU225673B1 - Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b - Google Patents

Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b Download PDF

Info

Publication number
HU225673B1
HU225673B1 HU9800091A HUP9800091A HU225673B1 HU 225673 B1 HU225673 B1 HU 225673B1 HU 9800091 A HU9800091 A HU 9800091A HU P9800091 A HUP9800091 A HU P9800091A HU 225673 B1 HU225673 B1 HU 225673B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
carboxypeptidase
procarboxypeptidase
folding
glu
thr
Prior art date
Application number
HU9800091A
Other languages
English (en)
Inventor
Netta Fulga
Marian Gorecki
Jacob Hartman
Simona Mendelovitch
Original Assignee
Ferring Int Ct Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ferring Int Ct Sa filed Critical Ferring Int Ct Sa
Publication of HUP9800091A2 publication Critical patent/HUP9800091A2/hu
Publication of HUP9800091A3 publication Critical patent/HUP9800091A3/hu
Publication of HU225673B1 publication Critical patent/HU225673B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgyát képezi egy eljárás enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B (CPB) előállítására. Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti eljárással előállított emlős-karboxipeptidáz-B.
A találmány szerinti eljárás előnyösen alkalmazható emlőseredetű anyagoktól mentes, enzimatikusan aktív emlős-karboxipeptidáz-B előállítására, amelynek specifikus aktivitása lényegesen nagyobb a kereskedelmi forgalomban beszerezhető sertés-karboxipeptidáz-B aktivitásánál.
A leírásban idézett valamennyi publikációt teljes teijedelmében a technika állását részletező kitanítás részeként kell tekinteni.
A természetben előforduló karboxipeptidáz-B [peptidil-L-lizin (-L-arginin) hidroláz; EC 3.4.17.2] egy cinktartalmú hasnyálmirigy-exopeptidáz, amely a peptidekről specifikusan a C-terminális arginint, lizint vagy ornitint távolítja el [Barrett és McDonald: „Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography”, 2. kötet, Academic Press, Orlando, Florida (1985); és Coll és munkatársai: The EMBO J. 10, 1 (1991)].
A természetben előforduló patkány-karboxipeptidáz-B egy prekurzorproteinből, a pre-pro-karboxipeptidáz-B-ből képződik, mely utóbbi - 13 aminosavas szignálszekvenciából és 95 aminosavas aktiválópeptidből álló - 108 aminosavas N-terminális fragmenst tartalmaz. A pre-pro-karboxipeptidáz-B enzimatikusan inaktív,
A pre-pro-karboxipeptidáz-B endoplazmatikus retikulumba történő transzportja során a szignálpeptid lehasítódik, és az így keletkező - enzimatikusan szintén inaktív - prokarboxipeptidáz-B kiválasztódik a sejtből. Az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B úgy képződik, hogy az aktiválópeptidet a tripszin lehasítja a prokarboxipeptidáz-B-ről [Aviles és munkatársai: Biochem. and Bioph. Rés. Comm. 130, 97 (1985)].
Az érett patkány-karboxipeptidáz-B 307 aminosavat tartalmaz [Clauser és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263(33), 17 837 (1988)], látszólagos molekulatömege pedig 35 kD. Ez a protein hét ciszteint tartalmaz, melyek közül hat (három pár) S-S kötéseket alkot.
A karboxipeptidáz-B-t termelési és kutatási célokra - például inzulin és más biológiai aktivitású polipeptidek előállítására, valamint proteinek szekvenciaanalízisére - széles körben alkalmazzák.
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető - sertés-hasnyálmirigyből tisztított - karboxipeptidáz-B nagyon drága, s ennek ellenére nem teljesen mentes egyéb proteázoktól.
A sertés hasnyálmirigyéből származó prokarboxipeptidáz-B részleges aminosavszekvenciáját, valamint a szarvasmarha-karboxIpeptidáz-B teljes aminosavszekvenciáját korábban már leírták [lásd Burgos és munkatársai: Biochemistry 30, 4082 (1991); illetve Titani és munkatársai: P. N. A. S. 72, 1666 (1975)]. A karboxipeptidáz-B-t kódoló patkánygén, valamint az emberi karboxipeptidáz-B cDNS-ét szintén leírták [Clauser és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263(33), 17 837 (1988); illetve Yamamoto és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 2575 (1992)].
Yamamoto és munkatársai [lásd fentebb] beszámoltak arról, hogy az enzimatikusan inaktív rekombináns emberi prokarboxipeptidáz-B-ből hiányzik az aktiválópeptid első 11 aminosava.
Yamamoto és munkatársai leírták a β-galaktozidázból és - az aktiválópeptid első 11 aminosavát nem tartalmazó - prokarboxipeptidáz-B-ből álló (enzimatikusan inaktív) fúziós protein rekombináns módszerekkel végzett expresszióját.
Eaton és munkatársai egy új, humán plazmaeredetű karboxipeptidáz-B izolálását, molekuláris klónozását és részleges jellemzését ismertetik [Eaton és munkatársai (1991), J. Bioi. Chem. 266(32): 21 833-21 838]. Az US 5,206,161 számú szabadalmi leírás natív humán plazmaeredetű karboxipeptidáz-B tisztítását, klónozását és expresszióját tárja fel. A Márquez-Méndez[(1992), J. Biochem. Biophys. Meth. 24:51-61] féle közlemény eljárást ismertet natív karboxipeptidáz-B tisztítására homárhepatopankreászból, többek között immobilizált fémkelát-affinitáskromatográfia alkalmazásával. Főik és Gladner [(1958), J. Bioi. Chem. 231:379-391] natív karboxipeptidáz-B tisztítását írják le, zsírtalanított száraz marha-hasnyálmirigyporból kiindulva, ismételt extrakció alkalmazásával. Marinkovic és munkatársai [(1979), Biochem. Med. 22:1-10] natív karboxipeptidáz-B kinyerését, tisztítását és részleges jellemzését írják le, humán vékonybélből kiindulva, többek között ammónium-szulfátos kicsapás és kromatográfiás eljárások alkalmazásával. Clausser és munkatársai [(1988), J. Bioi. Chem. 263(33): 17 837-17 845] a patkányeredetű hasnyálmirigy-karboxipeptidáz-B cDNS-ének és génjének izolálását és szerkezeti jellemzését ismertetik, anélkül azonban, hogy utalás történne a gén expresszáltatására, majd a karboxipeptidáz-B-protein azt követő refoldingjára és a proszekvencia lehasítására.
Másrészt a WO 94/00579 számú közzétételi irat egy proteáz dezaktiválását Ismerteti egy vagy több genetikai módosítás végrehajtása útján, melyek a protein proteolitikus aktivitását csökkentik vagy módosítják. A módosított proteáz feltehetően egy Kluyveromyces nemzetséghez tartozó élesztő karboxipeptidáz enzimje volt.
Számos technika állásához tartozó publikáció ismertet eljárásokat proteinek előállítására. Az US 4,511,503 számú szabadalmi leírás például egy általános eljárást ismertet oldhatatlan zárványként termelődött rekombináns proteinek tisztítására, mely eljárás magában foglalja az oldhatatlan proteinek erősen denaturáló közegben történő feloldását, majd az így feloldott proteinek további tisztítását kevéssé denaturáló közegben. Mártson [(1986), Biochem. J. 240:1-12] összefoglalóan ismertet számos eljárást E. coliban expresszált eukariótaeredetü polipeptidtermékek tisztítására. A dokumentum azonban nem említi az emlőseredetű hasnyálmirigy-karboxipeptidáz-B vagy annak proformájának tisztítását. Padfield és Case [(1988), Anal. Biochem. 171:294-299] patkányból származó hasnyálmirigy-váladékban található natív proteinek elválasztását ismerteti hidrofób kölcsönhatáson alapuló
HU 225 673 Β1 kromatográfia alkalmazásával, a publikációban a prokarboxipeptidáz-B is említésre kerül.
Az 5881188 A2 számú európai közzétételi iratban csonttal kapcsolatos karboxipeptidázszerű proteint (OSF-5) írnak le. Úgy vélik, hogy az OSF-5 adhéziós molekulaként vagy növekedési faktorként működik, s felhasználható a csontanyagcserével összefüggő betegségek kezelésére, azonban nem írták le az OSF-5 tényleges funkcióját és aktivitását, s nem bizonyították a természetben előforduló vagy rekombináns, biológiailag aktív protein előállítását.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése során enzimatikusan aktív, nagymértékben tisztított, olcsó rekombináns emlőseredetű hasnyálmirigy-karboxipeptidáz-B előállítását tűztük ki célul. Az enzimatikusan aktív emlőseredetű hasnyálmlrigy-karboxipeptidáz-B előállítását korábban nem írták le.
Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás enzimatikusan aktív emlőseredetü hasnyálmirigy-karboxipeptidáz-B előállítására, melynek során egy - prokarboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-t tartalmazó - rekombináns sejtet úgy kezelünk, hogy a szóban forgó DNS a prokarboxipeptidáz-B-t expresszálja; a sejtből kinyerjük az expresszált prokarboxipeptidáz-B-t; a kinyert prokarboxipeptidáz-B-t a prokarboxipeptidáz „foldingját” (harmadlagos szerkezet kialakulása) elősegítő körülmények között kezeljük; majd a kialakult térszerkezetű prokarboxipeptidáz-B-t enzimatikusan hasítjuk, miáltal enzimatikusan aktív karboxipeptidázt kapunk; s végül a karboxipeptidáz-B-t tisztítjuk.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a patkányhasnyálmirigyből származó prokarboxipeptidáz-B aminosavszekvenciáját, s az azt kódoló cDNS nukleotidszekvenciáját mutatjuk be, melyek az érett karboxipeptidáz-B és az aktiválópeptid aminosavszekvenciáját, illetve megfelelő nukleotidszekvenciáját foglalják magukban. Az ábrán látható DNS-szekvencia négy nukleotidban tér el a Clauser és munkatársai [J. Bioi. Chem. 263(33), 17 837 (1988)] által leírt DNS-szekvenciától. Az eltérések közül kettő aminosavváltozást eredményez (Lys14->Asn és Arg142->Asp).
Az 1. ábrán - nagyobb betűkkel - feltüntetjük a klónozás során (lásd 1. példa) alkalmazott három láncindító oligonukleotid nukleotidszekvenciáját is. A három láncindító a következő; prokarboxipeptidáz-B 5’-vég láncindító; érett karboxipeptidáz-B 5’-vég láncindító; és karboxipeptidáz-B 3'-vég láncindító.
Az aminosavak számozását a szarvasmarha-hasnyálmirigyből származó karboxipeptidáz-A-val [Bradshaw és munkatársai: P.N.A.S. 63, 1389 (1969); Gardell és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263(33), 17 828 (1988)] mutatott homológja szerint adjuk meg [az érett patkány-karboxipeptidáz-B első aminosava (Alá) a 4. számú aminosav], A csillaggal (*) jelzett aminosav (Leu) a patkány-karboxipeptidáz-B-ben megtalálható, a karboxipeptidáz-A-ból azonban hiányzik.
A 2. ábrán a pCPB-plazmid és a pCPB-C-plazmid előállításának folyamatát mutatjuk be.
A pABN-plazmidot BamHI- és Ncol-endonukleázzal emésztettük. A kivágott 2500 bp-os fragmenst izoláltuk, és a karboxipeptidáz-B-cDNS - 1. példában leírtak szerint kapott - 940 bp-os BamHI-Ncol fragmensével ligáltuk. A kapott plazmidot pCPB-nek neveztük el, s az E. coli 4300-as törzs transzformálására alkalmaztuk.
A pCPB-plazmidot - két nagy fragmensének izolálása céljából - BamHI-gyel és Ndel-gyel, valamint Asel-gyel és Scal-gyel emésztettük.
A két nagy fragmenst - helyspecifikus mutagenezis céljára előállított - 5’-terminálisán foszforilált oligonukleotiddal (lásd 1. példa) és polimeráz-ligáz pufferrel [ötszörös koncentrációjú puffer: 32,5 mM Tris-HCI (pH=7,5), 40 mM MgCI2, 5 mM 2-merkapto-etanol, 0,5 M NaCI; Morinaga és munkatársai: Bio-Technology, július: 636 (1984)] elegyítve heteroduplexet állítottunk elő. Az elegyet a DNS-szálak denaturálása céljából felforraltuk, majd a DNS renaturálása érdekében lassan lehűtöttük. A reakciótermékekkel - elektroporációs eljárás alkalmazásával - E. coli 1645-ös törzset transzformáltunk. A transzformánsokat ampicillint tartalmazó LB-agaron végzett tenyésztéssel, valamint a mutagenezis céljára előállított, 5’-végén foszforilált oligonukleotiddal végzett in situ telephibridizációval szkríneltük.
A pozitív telepekből plazmid-DNS-t vontunk ki, majd - restrikciós enzimes emésztés és DNS-szekvenálás után - kiválasztottuk a mutáns Spel-helyet tartalmazó kiónt. Az újonnan kapott plazmidot pCPB-C-nek neveztük el. E plazmid nukleotidszekvenciája olyan karboxipeptidáz-B-t kódol, amely a 290. cisztein helyett szerint tartalmaz. A pCPB-C-plazmidot az E. coli 4300-as törzs transzformálására alkalmaztuk.
A 3. ábrán a pProCPB-C- és pXProCPB-plazmid előállításának folyamatát mutatjuk be. Az 1. példában leírtak szerint előállított, prokarboxipeptidáz-B-t kódoló cDNS-t Ndel- és Clal-endonukleázzal hasítottuk, miáltal - az aktiválópeptidet és a karboxipeptidáz-B egy részét kódoló - 470 bp-os fragmenst kaptunk.
A pCPB-C-plazmidot BamHI- és Clal-endonukleázzal hasítva 760 bp-os fragmenst kaptunk, amely a karboxipeptidáz-B fennmaradó részét (benne a 290. ciszteint szerinnel helyettesítő mutációt) kódolja.
A pAB-plazmidot Ndel-gyel és BamHI-gyel hasítva 2500 bp-os fragmenst izoláltunk; ez a fragmens a baktériumokban lejátszódó expresszlóhoz szükséges valamennyi elemet tartalmazza (lásd 1. példa).
A fenti három fragmenst ligálással összekapcsoltuk, s az így kapott plazmidot pProCPB-C-nek neveztük el.
A pProCPB-C- és pCPB-plazmidot Stul-gyel és Xhol-gyel hasítottuk. A pProCPB-C-plazmidból egy 3700 bp-os fragmenst izoláltunk, amely a baktériumokban lejátszódó expresszióhoz szükséges valamennyi elemet (lásd 1. példa) tartalmazza, továbbá a teljes aktiválópeptidet és a karboxipeptidáz-B egy részét kódolja. A pCPB-plazmidból a karboxipeptidáz-B fennmaradó részét kódoló 440 bp-os fragmenst izoláltunk.
A két fragmenst ligálással összekapcsoltuk, s az így kapott plazmidot pXProCPB-nek neveztük el.
HU 225 673 Β1
A 2. és 3. ábrán bemutatott plazmidok restrikciós térképén nem tüntettük fel a plazmidok valamennyi restrikciós felismerési helyét; csak azok a felismerési helyek láthatók, amelyek a találmány szerinti megoldás megértéséhez szükségesek.
A 4. ábrán a rekombináns karboxipeptidáz-B és a természetben előforduló karboxipeptidáz-B aktivitásának összehasonlítását mutatjuk be. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető sertés-karboxipeptidáz-B (Sigma) és az 5. példában leírtak szerint előállított rekombináns karboxipeptidáz-B aktivitását Főik eljárása [Methods in Enzymology 19, 504 (1970)] szerint, szubsztrátként hippuril-L-Arg alkalmazásával határoztuk meg. A katalitikus reakció V0-értékét 0,025 mM és 1,0 mM közötti szubsztrátkoncentrációnál mértük.
A pXProCPB-plazmidot a Budapesti Szerződés értelmében 1994. augusztus 4-én, ATCC 69673 deponálási számon az „American Type Culture Collection” (ATCC) gyűjteménynél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852), E. coliban helyeztük letétbe.
Ahogy itt használjuk, a „karboxipeptidáz-B” (CPB) kifejezés olyan - rekombináns DNS technikával vagy más eljárással előállított - polipeptidet jelöl, amelynek aminosavszekvenciája azonos vagy lényegében azonos a természetben előforduló emlös-karboxipeptidáz-B aminosavszekvenciájával. Ennek megfelelően a CPB-k közé olyan polipeptidek tartoznak, amelyek a természetben előforduló karboxipeptidáz-B-ktől egy vagy több, előnyösen legfeljebb tíz aminosavban térnek el.
Ahogy a leírásban használjuk, a „prokarboxipeptidáz-B” (ProCPB) kifejezés olyan - rekombináns DNS technikával vagy más eljárással előállított - polipeptidet jelöl, amelynek aminosavszekvenciája azonos vagy lényegében azonos a természetben előforduló emlős-prokarboxipeptidáz-B aminosavszekvenciájával. Ilyenformán a CPB-k közé olyan polipeptidek tartoznak, amelyek a természetben előforduló prokarboxipeptidáz-B-ktől egy vagy több, előnyösen legfeljebb tíz aminosavban térnek el.
Szakember számára nem okoz nehézséget annak meghatározása, hogy egy polipeptidben mely aminosavak módosíthatók addícióval, delécióval vagy szubsztitúcióval, illetve hogy szubsztitúció esetén a kérdéses aminosavak milyen aminosavakkal helyettesíthetők. E kérdések megválaszolására jól ismert eljárások alkalmazhatók, így például a baktériumokban expresszálható polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák tervezésére és előállítására szolgáló hagyományos eljárások; a cDNS- és genomi DNS-szekvenciák módosítására alkalmas helyspecifikus mutagenezis; a rekombináns proteinek és expressziós vektorok előállítási eljárásai; a polipeptidek bakteriális expressziója, valamint a polipeptidek biológiai aktivitásának biokémiai vizsgálati eljárásokkal történő mérése.
Ahogy a leírásban használjuk, az „enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B kifejezés olyan enzimre vonatkozik, amely a természetben előforduló emlős-karboxipeptidáz-B biológiai aktivitásával bír. Egy természetben előforduló karboxipeptidáz-B biológiai aktivitása egy adott peptidről C-terminális arginin, lizin vagy ornitin specifikus eltávolításának képességét jelenti.
A „lényegében azonos aminosavszekvencia” kifejezésen olyan aminosavszekvenciát értünk, amely egy vonatkoztatási aminosavszekvenciához képest - a homológ vagy egyenértékű csoportoknak megfelelően legfeljebb tíz aminosavat érintő szubsztitúciót és/vagy deléciót és/vagy addíciót tartalmaz. A homológ vagy egyenértékű csoportok leírását lásd például Lehninger: „Biochemistry, 2. kiadás, 4. fejezet, Worth Pub,, N. Y. (1975); Creighton: „Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Anglia (1989); és Dayhoff: „Atlas of Protein Sequence and Structure”, 5. kötet, 9. fejezet, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972). Az ilyen szubsztitúciók szakember számára ismertek.
A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja értelmében a prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-t emberből, patkányból, szarvasmarhából vagy sertésből nyerjük. A DNS kinyerésére alkalmazhatunk reverz transzkripciót, polimeráz-láncreakciót (PCR), szintetikus vagy félszintetikus eljárásokat, valamint egyéb, jól ismert eljárásokat.
A prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló DNS mutációja szakember számára ismert eljárásokkal [lásd például Bauer és munkatársai; Gene 37, 73 (1985)] valósítható meg. A mutációval módosított szekvenciát a leírásban ismertetett módon megfelelő expressziós vektorokba inszertáljuk, az így kapott vektorokat bejuttatjuk a sejtekbe, és azokat úgy kezeljük, hogy a mutációval módosított DNS a kívánt polipeptidet expresszálja.
Szakember számára kézenfekvő, hogy a letétbe helyezett pXProCPB-plazmid ismert eljárásokkal (például helyspecifikus mutagenezissel vagy kapcsolószekvenciák inszertálásával) úgy módosítható, hogy egy kívánt polipeptid expresszióját eredményezze. Az ilyen technikák leírása megtalálható például; Sambrook, J., Fritsch, E. F. és Maniatis, T.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
A karboxipeptidáz-B-t vagy prokarboxipeptidáz-B-t kódoló nukleinsavak expresszáltatására alkalmazható vektorok példáiként vírusok, például bakteriális vírusok, mint például a bakteriofágok (például lambda-fág), kozmidok, plazmidok és egyéb vektorok említhetők. A prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló cDNS-t jól ismert eljárások alkalmazásával inszertáljuk a megfelelő vektorokba. Például az inszertálni kívánt fragmenseket és a vektor-DNS-t szokványos restrikciós endonukleázok alkalmazásával hasítjuk, miáltal komplementer végeket kapunk, amelyek a bázispárosodás szabályai szerint hibridizálódhatnak egymással, és DNS-ligázzal egymáshoz ligálhatók. Más módon, az inszertálni kívánt DNS-hez - a vektor-DNS-ben lévő restrikciós hellyel komplementer bázisszekvenciákat tartalmazó - szintetikus kapcsolószekvenciák ligálhatók, s az így kapott DNS olyan restrikciós enzimmel emészthető, amely a kérdéses helyen hasít.
HU 225 673 Β1
A találmány szerinti - prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó - vektorok számos különböző prokarióta és eukarióta gazdasejtben (például baktériumokban, élesztőgombákban, gombákban, rovarsejtekben vagy más emlőssejtekben, így például CHO-sejtekben, csirkeembriósejtekben, fibroblaszt-, vese- vagy egyéb ismert sejtvonalakban) történő expresszáltatás céljaira adaptálhatók.
Az ilyen vektorok a klónozott gén gazdasejtben lejátszódó expressziójához szükséges szabályozóelemeket is tartalmaznak, amelyek a prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló nukleinsavfragmenshez képest úgy helyezkednek el, hogy elősegítsék annak expresszióját.
Az expresszióhoz szükséges szabályozóelemek közé promoter- és operátorszekvenciák, valamint riboszomális kötőhely tartozik. Például egy bakteriális expressziós vektor tartalmazhat promoter-operátor szekvenciát, például XPLOL- vagy deo-promotert. A transzláció beindítására λΟΜ vagy deo riboszomális kötőhely alkalmazható. Az ilyen vektorok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, vagy a találmány leírásában ismertetett szekvenciákból, jól Ismert eljárások alkalmazásával előállíthatok [a XPL-promoterre vonatkozóan lásd például 4,831,120 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1989. május 16.) és 5,143,836 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1992. szept.
1.); a deo-promoterrel kapcsolatban pedig lásd 303972 számú európai közzétételi irat (1989. február 22.)]. A vektorok további szükséges elemeket, például represszorokat és erősítőszekvenciákat is tartalmazhatnak. A különböző expressziós rendszerekben megfelelő szabályozóelemek alkalmazása ismert.
A találmány szerinti expressziós plazmidok a szükséges szabályozóelemeket - a prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-hez képest olyan pozícióban tartalmazzák, hogy adott gazdasejtben elősegítsék a prokarboxipeptidáz-B vagy karboxipeptidáz-B expresszióját. Ilyen szabályozóelemek például a promoterek és operátorok, mint például a deo-PiP2 és a XPL; a riboszomális kötőhelyek (például deo és Cu), valamint a represszorok és az erősítőszekvenciák.
A találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módjai értelmében a vektorokban a szabályozóelemeket a prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-hez közel, attól 5’-irányban helyezzük el.
A találmány szerinti plazmidok transzlációs iniciációs kodont (ATG) is tartalmaznak. A prokarboxipeptidáz-B-t vagy karboxipeptidáz-B-t kódoló DNS az ATG iniciációs kodonnal egy leolvasási keretben van.
A találmány szerinti plazmidok - gazdasejtben önálló replikációra képes - bakteriális plazmidból származó replikációs kezdőhelyet is tartalmaznak. Megfelelő replikációs kezdőhelyet számos forrásból, így például a pBR322-plazmidból (ATCC 37017) nyerhetünk.
A találmány szerinti plazmidok - szelektálható vagy azonosítható fenotípusos sajátsággal kapcsolatos gént tartalmazó - DNS-szekvenciát is hordoznak. Az említett fenotípusos sajátság akkor nyilvánul meg, ha a plazmid jelen van a gazdasejtben; az ilyen fenotípusos sajátságot meghatározó gének közé tartoznak a rezisztenciagének, mint például az ampicillin, klóramfenikol vagy tetraciklin elleni rezisztenciát biztosító gének.
A találmány szerinti plazmidok gazdasejtjeiként előnyösen E. coli sejteket alkalmazunk. Az ilyen célra megfelelő E. coli sejtek egyik példája a 4300-as törzs, de egyéb E. coli törzsek, továbbá más baktériumok is alkalmazhatók.
Gazdasejtként bármilyen törzsbe tartozó baktériumsejt alkalmazható; így például a gazdatörzs lehet auxotróf (például A1645), prototróf (például A4255) vagy litikus törzs; lehet F+ vagy F- törzs, a lambda-profág cl857 represszorszekvenciáját hordozó törzs (például A1645 és A4255), továbbá deo-represszoroktól és/vagy deo-géntől mentes törzs [lásd 0303972 számú európai közzétételi irat (1989. február 22.)]. Az E. coli 4300-as törzs ATCC 69363 deponálási számon van letétbe helyezve.
A fentebb felsorolt E. coli gazdatörzsekből az általuk hordozott plazmidok jól ismert eljárásokkal, például a Novick által leírt etidium-bromidos eljárással [Bacteriol. Review 33, 210 (1969)] távolíthatók el.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B előállítására, melynek során egy prokarboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns sejtet úgy kezelünk, hogy a szóban forgó DNS a prokarboxipeptidáz-B expresszióját irányítsa; a sejtből kinyerjük az expresszált prokarboxipeptidáz-B-t; a kinyert prokarboxipeptidáz-B-t a prokarboxipeptidáz „foldingját” (harmadlagos szerkezet kialakulása) elősegítő körülmények között kezeljük; majd a kialakult térszerkezetű prokarboxipeptidáz-B-t enzimatikusan hasítjuk, miáltal enzimatikusan aktív karboxipeptidázt kapunk; s végül a karboxipeptidáz-B-t tisztítjuk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a rekombináns sejtből úgy nyerjük ki a prokarboxipeptidáz-B-t, hogy a rekombináns sejt vagy annak darabjainak falát szétroncsolva lizátumot hozunk létre, a lizátumból centrifugálással intracelluláris precipitátumot izolálunk, és az intracelluláris precipitátumot megfelelő pufferben szolubilizáljuk.
Egy másik megvalósítási mód szerint a kinyert prokarboxipeptidáz-B kezelése úgy történik, hogy szobahőmérsékleten 20-24 óra hosszat 9-9,5-es pH-η inkubáljuk.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a kinyert prokarboxipeptidáz-B-t szobahőmérsékleten, 9-9,5-es pH-n 20-24 óra hosszat ZnCI2, oxidált glutation (GSSG) és redukált glutation (GSH) jelenlétében inkubáljuk.
A kialakított térszerkezetű prokarboxipeptidáz-B enzimatikus hasítása során a pH-t körülbelül 8,5-re állítjuk be, és a prokarboxipeptidáz-B-t 37 °C-on 60 percig tripszinnel emésztjük.
Az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B-t ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk.
HU 225 673 Β1
A karboxipeptidáz-B tisztítására bármilyen ioncserélő kromatográfia alkalmazható. A tisztítási eljárás során előnyösen gyenge anioncserélő oszlopot, például „DEAE-Sepharose”-oszlopot alkalmazunk. A gyenge anioncserélő oszlopok funkciós csoportja rendszerint tercier amincsoport (dietil-amino-etil-csoport), de kvaterner amino-etil- vagy kvaterner amincsoportot tartalmazó oszlop is alkalmazható.
Az anioncserélő közeg alapját szervetlen vegyületek, szintetikus gyanták, poliszacharidok vagy szerves polimerek képezhetik; az alkalmazható közegek példái az agaróz, cellulóz, triszakril, dextrán, üveggyöngyök, oxirán akrilgyöngyök, akrilamid, agaróz/poliakrilamid kopolimer vagy hidrofil vinilpolimer.
Egy másik előnyös megvalósítási módban az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B tisztítását ioncserélő kromatográfiával és hidrofób kromatográfiával végezzük.
Szakember számára kézenfekvő, hogy ilyen célra bármilyen hidrofób oszlop alkalmazható, melyek közül a „Phenyl-Sepharose”-t részesítjük előnyben. A hidrofób oszlop funkciós csoportja lehet fenil-, benzil-, oktilvagy butilcsoport, míg közegként a fentebb felsoroltak bármelyike alkalmazható.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B tisztítását ioncserélő kromatográfiával, hidrofób kromatográfiával és diafiltrációval végezzük.
A találmány szerinti megoldás egy speciális megvalósítási módjában a prokarboxipeptidáz-B-t az ATCC 69673 deponálási számon letétbe helyezett pXProCPBplazmiddal expresszáltatjuk.
Szintén ismertetjük az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B-t (CPB), amely egyéb, emlőseredetű anyagoktól mentes.
Az alábbiakban a találmány szerinti megoldást kísérleti példákon keresztül szemléltetjük. A példákban a vektorok előállítására, a polipeptideket kódoló gének vektorokba történő inszertálására és az így kapott plazmidok gazdasejtekbe történő bejuttatására, valamint a gazdasejt-vektor rendszerekben termelt polipeptidek vizsgálatára alkalmazott hagyományos eljárásokat nem írjuk le részletesen; az ilyen eljárások szakember számára ismertek, s leírásuk számos publikációban megtalálható. Az ilyen publikációkat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni [lásd például Sambrook, J., Fritsch, E. F, és Maniatis, T.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
1. példa
Patkány-karboxipeptidáz-B-cDNS klónozása polimeráz-láncreakcióval
I) DNS-amplifikáció „Sprague-Dawley”-patkányok hasnyálmirigyéből teljes RNS-t vontunk ki. A teljes RNS-ből - oligo-dTcellulóz oszlopon - 40 pg poliA+-mRNS-t izoláltunk. Az így kapott poliA+-mRNS 10 pg-ját templátként alkalmaztuk a karboxipeptidáz-B 3’-végének megfelelő szintetikus láncindító [Clauser és munkatársai: J. Bioi.
Chem. 263(33), 17 837 (1988); 1. ábra] jelenlétében végzett reverz transzkripciós reakcióban.
Az egyszálú komplementer DNS (cDNS) szintézise után az mRNS-t etanollal kicsaptuk. Az egyszálú cDNS egy részét polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk.
A karboxipeptidáz-B-t kódoló 940 bp-os DNS amplifikálására a karboxipeptidáz-B 3’-végének megfelelő szintetikus láncindítót, valamint az érett karboxipeptidáz-B 5’-végének megfelelő szintetikus láncindítót alkalmaztuk (lásd 1. ábra).
A prokarboxipeptidáz-B-t kódoló 1230 bp-os DNS amplifikálására a karboxipeptidáz-B 3'-végének megfelelő szintetikus láncindítót, valamint a prokarboxipeptidáz-B 5’-végének megfelelő szintetikus láncindítót (lásd 1. ábra) alkalmaztuk.
A polimeráz-láncreakciót a következő feltételekkel végeztük:
1. 3'-vég láncindító 2 pg
2. 5'-vég láncindító 2 pg
3. Egyszálú cDNS 5 pg
4. Puffer:
dNTP-k 0,2 mM
Tris-HCI 50 mM
KCI 20 mM
MgClz 8 mM
5. Taq-polimeráz 2,5 egység
Teljes térfogat 100 pl
6. Ásványi olaj (párolgásgátló) 50 pl
Amplifikálási ciklusok:
7. 1 ciklus (92 °C-on egy perc, 40 °C-on két perc és 72 °C-on négy perc);
8. 35 ciklus (92 °C-on egy perc, 53 °C-on két perc és 72 °C-on három perc); végül
9. 1 ciklus (92 °C-on egy perc, 53 °C-on két perc és 72 °C-on 15 perc).
A PCR-amplifikációval kapott termékeket 1%-os agarózgélen analizáltuk, amelyekhez nem amplifikált kontrollt és méretmarkereket is alkalmaztunk. A gélen két, kb. 940 bp-nak, illetve 1230 bp-nak megfelelő sávot találtunk. A 940 bp-os sáv a karboxipeptidáz-B-t kódoló nukleotidszekvenciát, az 1230 bp-os sáv pedig - az aktiválópeptidet is magában foglaló - prokarboxipeptidáz-B-t kódoló nukleotidszekvenciát reprezentálja.
A polimeráz-láncreakcióval végzett amplifikáció után a DNS-t kloroformmal és fenollal végzett extrakcióval, valamint ammónium-acetáttal és izopropanollal végzett kicsapással választottuk el a reakcióelegytől, illetve tisztítottuk.
II) pCPB-plazmid
A pCPB-plazmid (2. ábra) előállítása céljából a karboxipeptidáz-B-t kódoló cDNS-t (CPB-cDNS) BamHIés Ncol-endonukleázzal emésztettük, a kapott fragmenst gélelektroforézissel tisztítottuk, majd a pABN-plazmid 2500 bp-os BamHI-Ncol-fragmensébe szubklónoztuk. A pABN-plazmid a következő - baktériumokban lejátszódó expresszióhoz szükséges - elemeket tartalmazza:
1. XPL-promoter, amely E. coliban indukció hatására lehetővé teszi a génexpressziót. Az indukció a hőmér6
HU 225 673 Β1 séklet 30 °C-ről 42 °C-ra történő emelésével történik, ami inaktiválja a hőérzékeny cl857-represszort;
2. „deo riboszóma-kötőhely;
3. „trp” transzkripciós terminátor [Yanofsky és munkatársai: Nucleic Acid Rés. 9, 6647 (1981)];
4. pBR322-plazmidból származó ampicillinrezisztencia-gén;
5. pBR322-plazmidból származó replikációs kezdőhely.
Ili) pCPB-C-plazmid
A természetben előforduló karboxipeptidáz-B aminosavszekvenciája hét ciszteint tartalmaz, amelyből hat (három párban) S-S kötéseket alkot, egy pedig (a 290.) szabad [Barrett és McDonald: „Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography”, 2. kötet, Academic Press, Orlando, Florida (1985)]. Úgy véljük, hogy ez a szabad cisztein a rekombináns karboxipeptidáz-B refoldingja során nemkívánatos inter- és intramolekuláris S-S kötéseket képezhet. A 290. cisztein a karboxipeptidáz-B katalitikus helyében és szubsztrátkötőhelyében sem játszik szerepet, s nyilvánvalóan nincs szerepe az enzim aktivitásában [Barrett és McDonald: „Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography,
2. kötet, Academic Press, Orlando, Florida (1985); Coll és munkatársai: The EMBO J. 10, 1 (1991)]. Ennek megfelelően olyan karboxipeptidáz-B előállítását tűztük ki célul, amely a 290. cisztein helyett szerint tartalmaz. Ezt a karboxipeptidáz-B-t CPB-C-nek neveztük el.
5'-végükön foszforilált - kétnukleotidos szubsztitúciót tartalmazó - olígonukleotidot állítottunk elő:
Thr Cys
...ACC TGT... eredeti karboxipeptidáz-B szekvencia Thr Ser
5’ ATC CGC CAG ACT AGT GAG GAG ACA ATG 3’ mutáns szekvencia
Ezt az olígonukleotidot arra a célra alkalmaztuk, hogy a 290. ciszteint kódoló nukleotidszekvenciát a pCPB-plazmidban helyspecifikus mutagenezissel [lásd
2. ábra; Morinaga és munkatársai: Bio-Technology, július: 636 (1984)] szerint kódoló nukleotidszekvenciával helyettesítsük. Az így kapott plazmidot pCPB-C-nek neveztük el.
IV) pProCPB-C-plazmid
A Cys290-»Ser mutációt tartalmazó ProCPB-C nukleotidszekvenciát tartalmazó pProCPB-C-plazmidot a
3. ábra ismertetésében leírtak szerint állítottuk elő, és az E. coli 4300-as törzs transzformálására alkalmaztuk.
V) p/ProCPB-plazmid
A prokarboxipeptidáz-B nukleotidszekvenciáját tartalmazó pXProCPB-plazmidot a 3. ábra ismertetésében leírtak szerint állítottuk elő, és E. coli 4300-as törzs transzformálására alkalmaztuk. Ezt a plazmidot 1994. augusztus 4-én az „American Type Culture Collection gyűjteményben ATCC 69673 deponálási számon helyeztük letétbe.
A pCPB-, pCPB-C-, pXProCPB- és pProCPB-Cplazmidból plazmid-DNS-eket állítottunk elő, melyeket - a pontos szekvencia igazolása céljából - restrikciós endonukleázos emésztéssel és nukleotidszekvenálással vizsgáltunk.
2. példa
Fermentálás, tenyésztési feltételek; a prokarboxipeptidáz-B és karboxipeptidáz-B tisztítása
I) Törzstenyészetek
A pXProCPB-plazmidot tartalmazó E. coli 4300-as törzs törzstenyészetét 100 Mg/ml ampicillint tartalmazó LB-táptalajon szaporítottuk.
II) Oltóanyag
Az oltóanyagot 100 pg/ml ampicillint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben 30 °C-on addig szaporítottuk, míg az oldat 660 nm hullámhossznál mért optikai denzitása el nem érte a 2,0 értéket.
A fermentációs tápközeget (LB-tápközeg+100 pg/ml ampicillin) beoltottuk a baktériumokkal, levegőztetés és keverés mellett 30 °C-on inkubáltuk, miközben a pH-t ammónia hozzáadásával 7,2 értéken tartottuk. A tenyészethez a sejtek szaporodása során 20 gramm glükózt adtunk. Amikora sejtkoncentráció OD66o=12-es értéket ért el, a tenyészet hőmérsékletét - a prokarboxipeptidáz-B expressziójának elősegítése céljából - 42 °C-ra emeltük. Két óra elteltével a sejtkoncentráció OD66o=22-29-es értéket ért el, s a baktériumokat betakarítottuk.
Ili) A polipeptidek tisztítása
Az intracelluláris precipitátumban felhalmozódott, pXProCPB-plazmid által expresszáltatott prokarboxipeptidáz-B-t a következők szerint izoláltuk. 40 gramm (nedves tömeg) összetömörített baktériumsejtet 450 ml pufferben [1 mM PMSF (Sigma), 50 mM Tris-HCI (pH=8), 10 mM EDTA] szuszpendáltunk, s a szuszpenzióhoz 50 pg/ml végkoncentrációban lizozimot (Sigma) adtunk, s 37 °C-on két óra hosszat inkubáltuk.
Az elegyet ultrahangoztuk, 2% végkoncentrációban „Triton X-100-at (Merck) adtunk hozzá, majd szobahőmérsékleten két óra hosszat kevertük. A nyers intracelluláris precipitátumot 14 000-es percenkénti fordulattal, 4 °C-on 30 percig végzett centrifugálással leülepítettük, majd vízzel mostuk.
A prokarboxipeptidáz-B-t tartalmazó intracelluláris precipitátumot B-pufferben [25 mM NaCI, 8 M karbamid, 10 mM STT, 20 mM Bis-Tris (pH=7)] feloldottuk, s a kapott oldatot - előzetesen B-pufferrel ekvilibrált „DEAE-Sepharose Fast-Flow” oszlopon kromatografáltuk, melynek során a proteint kb. 100 mM NaCI-ot tartalmazó B-pufferrel eluáltuk. A prokarboxipeptidáz-B-t 40%-os telítettségű ammónium-szulfát-oldattal 0 °C-on precipitáltuk.
Felismertük, hogy az enzimatikusan aktív CPB csak a prekurzorprotein termelése révén is előállítható. Ennek ellenére a karboxipeptidáz-B-t és a CPB-C-t, illetve a proCPB-C-t eleinte hasonló módon állítottuk elő, mint a prokarboxipeptidáz-B-t. Az előállításhoz a pCPB-, pCPB-C-, illetve pProCPB-C-plazmidot alkalmaztuk (lásd 1. példa). Az e plazmidokat tartalmazó E. coli sejtek tenyésztését, valamint a polipeptidek tisztítását a prokarboxipeptidáz-B előállításával kapcsolatban fentebb leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy a rekombináns karboxipeptidáz-B-t vagy CPB-C-t tartalmazó intracelluláris precipitátum feloldására 20 mM etanol-amint (pH=9),
HU 225 673 Β1 mM DTT-t és 8 M karbamidot tartalmazó puffért alkalmaztunk.
Megjegyezzük, hogy a fentebb leírtak szerint előállított és tisztított polipeptideknek nem volt enzimatikus aktivitása.
A polipeptidek harmadlagos szerkezetének - enzimatikusan aktív proteinek előállítása érdekében végzett - kialakítását (folding) a 3. példában írjuk le.
3. példa
A proCPB-C foldingja és aktiválása
A 2. példában leírtak szerint előállított CPB- és CPB-C-polipeptid nem mutatott enzimatikus aktivitást. Az ismert foldingeljárások (lásd később) nem eredményeztek enzimatikusan aktív proteint.
Az enzimatikusan aktív protein sikertelen előállítása miatt egy alternatív eljárást fejlesztettünk ki, amely a prekurzorprotein expresszáltatását és foldingját, valamint - a kialakított harmadlagos szerkezetű („földed”) prekurzorprotein aktiválópeptid-részének eltávolítását célzó - kezelését foglalja magában. Az eljárást a következőkben ismertetjük.
A 2. példában leírtak szerint előállított ProCPB-Cpolipeptidet 10 mg/ml koncentrációban 8 M karbamid és 5 mM HCI elegyében oldottuk, majd 100 mM glicin és 0,2 mM ZnCI2 - 9-es, 10-es és 11-es pH-jú - elegyében 1 mg/ml koncentrációra hígítottuk. Ezek az úgynevezett foldingoldatok.
A folding végrehajtása céljából a foldingoldatokat szobahőmérsékleten 17 óra hosszat inkubáltuk. Az így előállított ProCPB-C ebben a stádiumban nem mutatott enzimatikus aktivitást (lásd 1. táblázat).
A kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C-t tartalmazó oldat pH-ját sósav hozzáadásával körülbelül 8,5-re állítottuk be, majd - az aktiválópeptid eltávolítása érdekében - 37 °C-on 30 percig tripszinnel (1:200 m/m) kezeltük. A reakciót 0,1 mM végkoncentrációjú PMSF hozzáadásával állítottuk le.
A kialakított harmadlagos szerkezetű CPB-C enzimatikus aktivitását Főik eljárása szerint [Methods in Enzymology 19, 504 (1970)] teszteltük (lásd 1. táblázat). Egy aktivitási egységen definíció szerint az enzim azon mennyiségét értjük, amely 25 °C-on percenként 1 pmol hippuríl-L-Arg szubsztrát hidrolízisét katalizálja, ami 254 nm hullámhossznál és 1 cm úthossznál 0,12-es abszorbancianövekedést eredményez. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető sertés-karboxipeptidáz-B (Sigma) specifikus aktivitása 230 egység/mg.
1. táblázat
A ProCPB-C (és a belőle származó CPB-C) különböző körülmények között mért specifikus aktivitása
Reakció Specifikus aktivitás (E/mg)
1. Csak szubsztrát 0,0
2. 9-es pH-η végzett folding, tripszines kezelés, ProCPB-C nélkül 0,0
Reakció Specifikus aktivitás (E/mg)
3. 9-es pH-η végzett folding, tripszines kezelés 4,3
4. 9-es pH-η végzett folding 0,0
5.10-es pH-η végzett folding, tripszines kezelés 1,7
6.11-es pH-η végzett folding, tripszines kezelés 0,3
7. Sertés-CPB (Sigma) 230
Az 1. táblázatban látható, hogy az enzimatikusan aktív CPB-C-t a ProCPB-C foldingja és a kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C tripszines kezelése után kaptuk (a fentebb leírt kiindulási feltételek alkalmazásával).
Az 1. táblázatban látható továbbá, hogy a CPB-C specifikus aktivitása nagyobb, ha a foldingoldat pH-ja 9-es, mint ha 10-es vagy 11-es.
4. példa
A foldingreakció javított feltételei
A következő kísérteteket a folding és az aktiválás optimális feltételeinek megállapítása céljából végeztük.
Abból indultunk ki, hogy minél nagyobb a kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C tripszines hasításával kapott CPB-C specifikus aktivitása, annál optimálisabbak voltak a foldingreakció feltételei.
Kezdetben az eredmények (lásd 3. példa) javultak, ha a foldingot 0,05-0,1 mg/ml koncentrációjú ProCPB-C alkalmazásával, 9,5-es pH-η végeztük.
/) A hőmérséklet hatása a ProCPB-C foldingjára
A ProCPB-C harmadlagos szerkezetének kialakítása érdekében 0,05 mg/ml polipeptidet 10 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten, 100 mM glicinpufferben (pH=9,5) 90 óra hosszat inkubáltunk. A kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C mintáit tripszinnel (1:200 m/m) kezeltük, és a CPB-C specifikus aktivitását a 3. példában leírtak szerint mértük. A CPB-C legnagyobb specifikus aktivitását akkor kaptuk, ha a ProCPB-C foldingját 20 ’C és 30 ’C közötti hőmérsékleten végeztük.
//) Az oxidált és redukált glutation hatása a
ProCPB-C foldingjára
A ProCPB-C harmadlagos szerkezetének kialakítása érdekében 0,05 mg/ml polipeptidet - 0,01 mM ZnCI2-ot tartalmazó - 100 mM glicinpufferben (pH=9,5), oxidált és/vagy redukált glutation (GSSG/GSH) vagy aszkorbinsav jelenlétében, 25 °C-on 90 óra hosszat inkubáltuk. Ezután az oldatokat 37 ’C-on egy óra hosszat tripszinnel (1:200 m/m) kezeltük, és 18, illetve 45 óra elteltével a 3. példában leírtak szerint mértük a kapott CPB-C specifikus aktivitását (2. táblázat).
HU 225 673 Β1
2. táblázat
A CPB-C specifikus aktivitása a foldingoldatban jelen lévő oxidáló-, illetve redukálószerek függvényében
A foldingoldathoz adott oxidáns/reduktáns Specifikus aktivitás (E/mg)
18 óra 45 óra
0,1 mM GSSG 2,18 16,39
0,1 mM GSSG 1 mM GSH 16,37 26,90
16,5 μΜ aszkorbinsav* 4,06 9,24
Kontroll (oxidáns/reduktáns nélkül) 1,19 5,39
* Az aszkorbinsavat egy mól SH-csoportra vonatkoztatva 2,5 mól mennyiségben adtuk az oldathoz
A 2. táblázat alapján látható, hogy a GSSG és GSH együttes alkalmazása a CPB-C specifikus aktivitásának - s feltehetően a ProCPB-C foldingja hatékonyságának - ugrásszerű növekedését eredményezi. Az önmagában alkalmazott GSSH szintén növelte a ProCPB-C foldingjának hatékonyságát, és ugyanilyen hatása volt az aszkorbinsavnak is, csak kisebb mértékben.
Ili) A kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C aktiválása tripszinnel
A legnagyobb aktivitású CPB-C-t akkor kaptuk, ha az inkubált foldingoldatot - az aktiválópeptid ProCPB-C-polipeptidből történő eltávolítása érdekében - 37 ’C-on egy óra hosszat 1:50 tömegarányú tripszinnel kezeltük.
IV) A pH hatása a ProCPB-C foldingjára
A pH ProCPB-C foldingjára gyakorolt hatását előzetesen optimalizált körülmények között végzett reakciósorozattal határoztuk meg.
A Pro-CPB-C foldingjának megvalósítása érdekében a polipeptidet 100 mM glicint, 0,02 mM ZnCI2-ot, 0,5 mM redukált glutationt (GSH) és 0,1 mM oxidált glutationt (GSSG) tartalmazó pufferben, különböző pH-értékek mellett (8,75-10,00) 0,1 mg/ml koncentrációban 25 °C-on 24 óra hosszat inkubáltuk. A kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C mintáit - 1 mM HCI és 10 mM CaCI2 elegyében oldott - 1:50 tömegarányú tripszinnel kezeltük, és az így kapott CPB-C specifikus aktivitását a 3. példában leírtak szerint mértük.
A CPB-C legnagyobb aktivitását akkor kaptuk, ha a ProCPB-C foldingját 9,25-os pH-η végeztük,
V) A ZnCI2 hatása a ProCPB-C foldingjára
A foldingoldat ZnCI2-koncentrációjának ProCPB-C foldingjára gyakorolt hatását - az előzőekben optimalizált körülmények között végzett - reakciók sorozatával teszteltük. A képződött CPB-C specifikus aktivitása a becsült CPB-C-koncentrációnál (mol/mol) 2-20-szor nagyobb ZnCI2-koncentrációnál volt a legnagyobb. Amikor a foldingot ZnCI2 hiányában - a maradék kétértékű ionok kelátképzése érdekében EDTA hozzáadásával - végeztük, a CPB-C specifikus aktivitása nullára csökkent.
VI) A proteinkoncentráció hatása a ProCPB-C foldingjára
A ProCPB-C foldingját a fentebb meghatározott optimális feltételek mellett, 24 óra hosszat, a 3. táblázatban megadott proteinkoncentrációk alkalmazásával végeztük. A tripszines emésztés után kapott CPB-C aktivitását a 3. példában leírtak szerint mértük.
3. táblázat
A CPB-C specifikus aktivitása a foldingoldat proteinkoncentrációjának függvényében
Proteinkoncentráció (mg/ml) Specifikus aktivitás (E/mg)
0,05 35,1
0,10 31,8
0,20 20,3
A táblázatból látható, hogy a 0,05 mg/ml proteinkoncentrációnál előállított CPB-C specifikus aktivitása volt a legnagyobb.
VII) A folding idejének hatása a CPB-C specifikus aktivitására
A ProCPB-C optimális foldingidejét a korábban optimalizált feltételek mellett végzett reakciók sorozatával határoztuk meg.
A ProCPB-C foldingját - 100 mM glicint (pH=9,25), 0,01 mM ZnCI2-ot, 0,5 mM redukált glutationt (GSH) és 0,1 mM oxidált glutationt (GSSG) tartalmazó pufferben -0,1 mg/ml koncentrációnál végeztük. A kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C mintáit 1:50 tömegarányú tripszinnel kezeltük, és az így kapott CPB-C specifikus aktivitását - a foldingreakció megkezdésétől számítva 0-40 óra elteltével - a 3. példában leírtak szerint mértük.
A legnagyobb aktivitású CPB-C-t akkor kaptuk, amikor a kialakított harmadlagos szerkezetű ProCPB-C-t a foldingreakció megkezdése után 20 órával kezeltük a tripszinnel. A 20 óránál hosszabb foldingidő nem változtatott a CPB-C specifikus aktivitásán.
5. példa
A különböző CPB-proteinek foldingja és aktiválása
A 2. példában leírtak szerint előállított CPB, CPB-C, ProCPB és ProCPB-C foldingját az adott polipeptid 0,1 mg/ml koncentrációjának jelenlétében 0,1 mM ZnCI2-ot, 0,5 mM GSH-t és 0,1 mM GSSG-t tartalmazó - 100 mM glicinpufferben (pH=9,25) szobahőmérsékleten 24 óra hosszat végeztük (vagyis a foldingreakció során lényegében a 4. példában megállapított optimális feltételeket alkalmaztuk.
A kialakított harmadlagos szerkezetű CPB-t, CPB-C-t, ProCPB-t vagy ProCPB-t tartalmazó oldatok pH-ját sósavval 8,5-re állítottuk be, és a ProCPB-t, illetve ProCPB-C-t tartalmazó oldatokat - az aktiválópeptid lehasítása érdekében - 1:50 tömegarányú tripszinnel 37 ’C-on egy óra hosszat kezeltük. A reakció leállítása céljából az oldatokhoz 0,1 mM végkoncentrációban PMSF-et adtunk. A CPB, CPB-C, ProCPB és
HU 225 673 Β1
ProCPB-C specifikus aktivitását a 3. példában leírtak szerint végeztük.
4. táblázat
A CPB, CPB-C, ProCPB és ProCPB-C specifikus aktivitása az optimális körülmények között végzett folding és aktiválás után
Folding Specifikus aktivitás (E/mg)
Kontroll* - tripszin nélkül 0,00
- protein nélkül 0,00
Folding - CPB 0,00
- CPB-C 0,08
- ProCPB 42,90
- ProCPB-C 20,90
* A tripszines kezelés nélküli kontrollvizsgálatot csak a ProCPB-C esetében végeztük el.
A 4. táblázat eredményei alapján látható, hogy csak olyan sejtekből állítható elő enzimatikusan aktív CPB, amelyek expresszálják az aktiválópeptidet tartalmazó prekurzorproteint. Ez azt jelenti, hogy a karboxipeptidáz-B pontos foldingjához szükség van az aktiválópeptidre.
A 4. táblázat eredményeiből látható továbbá, hogy az optimális specifikus aktivitású karboxipeptidáz-B a 290. helyen szabad ciszteint tartalmazó (és a pXProCPB-plazmíddal expresszáltatott) prokarboxipeptidáz-B foldingjával és aktiválásával, s nem a Cys290->Ser mutációt tartalmazó ProCPB-C foldingjával és aktiválásával állítható elő. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy a 290. cisztein fontos szerepet játszik a karboxipeptidáz-B pontos foldingjában és/vagy optimális aktivitásában.
6. példa
A prokarboxipeptídáz-B foldingjának tökéletesítése I) A prokarboxipeptidáz-B foldingja nyers intracelluláris precipitátumból
Megállapítottuk, hogy a prokarboxipeptidáz-B (ProCPB) optimális foldingfeltételei lényegében azonosak a ProCPB-C 4. példában meghatározott foldingfeltételei vei.
A prokarboxipeptidáz-B foldingját és aktiválását egy egyszerűsített eljárással, nyers intracelluláris precipitátum alkalmazásával valósítottuk meg. Ez az eljárás szükségtelenné teszi a 2. példa (III) részében leírt tisztítási lépést.
Azt találtuk, hogy prokarboxipeptidáz-B-t tartalmazó - a 2. példában leírtak szerint előállított - nyers intracelluláris precipitátum nagy koncentrációban oldható a 8 M karbamidot tartalmazó 100 mM glicinpufferben (pH=9,5; lásd 5. táblázat).
A foldingot a korábban optimalizált feltételek mellett szobahőmérsékleten 24 órán át végeztük. A pH-t a korábban meghatározott 9,5-es optimális pH-ra állítottuk be. A kialakított harmadlagos szerkezetű prokarboxipeptidáz-B-t 1:50 tömegarányú tripszinnel kezeltük, és a karboxipeptidáz-B specifikus aktivitását a 3. példában leírtak szerint mértük.
5. táblázat
A nyers intracelluláris precipitátumot tartalmazó foldingoldat proteinkoncentrációjának hatása a karboxipeptidáz-B specifikus aktivitására
Proteinkoncentráció (mg/ml) Specifikus aktivitás (E/mg)
0,1 10,5
0,2 10,9
0,5 11,9
1,0 12,1
2,0 11,4
Az 5. táblázatban felsorolt eredményekből látható, hogy a prokarboxipeptidáz-B nyers intracelluláris precipitátumban végzett foldingjával és az azt követő tripszines emésztéssel enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B állítható elő. Ezen túlmenően az előállított karboxlpeptidáz-B enzimatikus aktivitása a vizsgált proteinkoncentrációknál lényegében azonos. Ez váratlan eredmény, ugyanis a folding előtt „DEAE-Sepharose”-oszlopon tisztított karboxipeptidáz-B (lásd 2. példa) specifikus aktivitása a foldingoldat proteinkoncentrációjának csökkenésével mérséklődött. Nyilvánvaló, hogy az intracelluláris precipitátum olyan faktorokat tartalmaz, amelyek elősegítik a prokarboxipeptidáz-B foldingját.
II) A karboxipeptidáz-B nagy mennyiségű előállítása a prokarboxipeptidáz-B nyers intracelluláris precipitátumból történő foldingjával (i) Előállítás
A pXProCPB-plazmidot hordozó és prokarboxipeptidáz-B-t expresszáló E. coli 4300-as törzs 42 liter térfogatú tenyészetéből majdnem homogén állapotú karboxipeptidáz-B-t tisztítottunk. A fermentálás és szaporítás feltételei lényegében azonosak voltak a 2. példában leírtakkal.
A nyers intracelluláris precipitátumot vízben mostuk és 20 mg/ml koncentrációban - 8 M karbamidot tartalmazó - 100 mM glicinpufferben (pH=9,5) oldottuk, majd a kapott oldatot 100 mM glicinpufferrel (pH=9,5) 1 mg/ml koncentrációra hígítottuk. Az oldathoz 0,1 mM ZnCl2-ot, 0,5 mM GSH-t és 0,1 mM GSSG-t adtunk, és a kapott foldingoldatot 25 °C-on 24 órán át inkubáltuk. A pH-t ezután sósavval 8,5-re állítottuk be, majd a kialakított harmadlagos szerkezetű prokarboxipeptidáz-B-t 37 °C-on egy óráig tripszinnel (20 pg/ml) emésztettük. A tripszint 0,1 mM PMSF alkalmazásával inaktiváltuk.
(ii) Tisztítás
Az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B-t (a gyanta térfogatára vonatkoztatva 20 mg/ml mennyiségben) „DEAE-Sepharose Fast-Flow” oszlopra (Pharmacia) töltöttük. Az oszlopot előzetesen 20 mM Tris-HCI-pufferrel (pH=8) ekvilibráltuk. A karboxipepti10
HU 225 673 Β1 dáz-B-t 80 mM NaCI-ot tartalmazó 20 mM Tris-HCI-pufferrel (pH=8) eluáltuk. Az összegyűjtött eluátumhoz 0,8 M ammónium-szulfát-oldatot adtunk, majd - előzetesen 0,8 M ammónium-szulfátot tartalmazó 20 mM Tris-HCI-pufferrel (pH=8) ekvilibrált - „Phenyl-Sepharose Fast-Flow oszlopon (Pharmacia) tovább kromatografáltuk. A karboxipeptidáz-B-t 0,4 M ammónium-szulfát-oldattal eluáltuk, töményítettük, majd 100 mM NaCI-ot tartalmazó 20 mM Tris-HCI-pufferrel (pH=8) szemben diafiltráltuk, és -20 °C-on tároltuk.
A fenti tisztítási eljárásban a pXProCPB-plazmidot tartalmazó E. coli 4300-as törzs tenyészetének 42 literét (OD660=36) dolgoztuk fel, és összesen 1,25 gramm enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B-t kaptunk, melynek specifikus aktivitása 637 E/mg volt. A tisztítási eljárás kitermelése kb. 60%-os volt.
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető sertés-karboxipeptidáz-B - azonos kísérleti feltételek mellett mért - specifikus aktivitása 298 E/mg.
7. példa
Az enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B karakterizálása
Az 5. és 6. példában leírtak szerint előállított karboxipeptidáz-B biokémiai és enzimatikus tulajdonságai hasonlóak a sertés-karboxipeptidáz-B tulajdonságaihoz.
A rekombináns karboxipeptidáz-B - aminosavösszetétele alapján számított - extinkciós koefficiense: ε1%280=19,7· A kereskedelmi forgalomban beszerezhető sertés-karboxipeptidáz-B extinkciós koefficiense: ε1%28ο=21,4 [Barrett és McDonald: „Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, 2. kötet, Academic Press, Orlando, Florida (1985)].
A rekombináns karboxipeptidáz-B specifikus aktivitása (szubsztrátként hippuril-L-Arg alkalmazásával végzett meghatározással) 637 E/mg. A rekombináns enzim - atomabszorbciós vizsgálat eredménye alapján - mólonként 1 mól cinket tartalmaz.
A karboxipeptidáz-B N-terminális aminosavszekvenciája a következő: Ala-Ser-Gly-His-Ser, ami az érett patkány-karboxipeptidáz-B aminosavszekvenciájának vizsgálata alapján várható volt [Clauser és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263(33), 17 837 (1988)].
A rekombináns karboxipeptidáz-B aktivitása szempontjából optimális pH a különböző (25 mM koncentrációjú) pufferek esetében a következők szerint alakul:
NaOAc: pH=4-6; Bis-Tris: pH=6-7,5; Tris-HCI:
pH=7,5-9; glicin; pH=9-12. A karboxipeptidáz-B specifikus aktivitását a 3. példában leírtak szerint mértük. A karboxipeptidáz-B optimális enzimatikus aktivitását 8-as pH-nál kaptuk. A karboxipeptidáz-B 55 °C-on végzett inkubálása 50%-os aktivitáscsökkenést eredmé10 nyezett; a teljes inaktiválás 65 °C-on következett be.
A rekombináns karboxipeptidáz-B kinetikai vizsgálatát hippuril-L-Arg-szubsztrát alkalmazásával végeztük (4. ábra). A karboxipeptidáz-B aktivitásának gátlását 0,5 mM feletti szubsztrátkoncentrációknál figyeltük meg. 15 További vizsgálatokkal kimutattuk, hogy a rekombináns karboxipeptidáz-B-t gátolja az arginin katalízistermék, amely az enzim kompetitív inhibitora. A megfelelő „Lineweaver-Burk-görbe alapján a Km-értékre
0,38 mM-t kaptunk.
A rekombináns karboxipeptidáz-B-t az 1,10-fenantrolin is gátolja, amely egy erős kétértékű ionkelátképző; ez a tény bizonyítja, hogy a karboxipeptidáz-B aktivitása szempontjából milyen fontos szerepet töltenek be a cinkionok. 1 mM 1,10-fenantrolin jelenlétében az
1 mg/ml koncentrációjú rekombináns karboxipeptidáz-B aktivitásának 50%-os csökkenését tapasztaltuk.
8. példa
A proinzulin inzulinná alakítása karboxipepti30 dáz-B-vel
Az EP 347781 B1 számú európai szabadalmi leírásban feltárt „míníproínzulin tripszinnel és az 5. és 6. példában leírtak szerint előállított rekombináns karboxipeptidáz-B-vel végzett kezeléssel inzulinná alakítható.
A tripszin specifikusan az arginin és az A-lánc között hasítja a proinzulínt, a karboxipeptidáz-B pedig specifikus hidrolízissel eltávolítja az arginint a B-lánc C-terminálisáról.
Standardként kereskedelmi forgalomban beszerez40 hető emberi inzulin (Boehringer Mannheim); tripszinnel és kereskedelmi forgalomban beszerezhető sertés-karboxipeptidáz-B-vel hasított „miniproinzulin; valamint csak tripszinnel hasított „miniproinzulin” alkalmazható.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 36 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUSA: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCATATGC ATGCTTCCGA GGAGCACTTT GATGGC 36
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 285 bázispár
HU 225 673 Β1
TfPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUSA: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
SAJÁTSÁG:
NÉV/KULCS: cds
ELHELYEZKEDÉS: 1...285
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAT His 1 GCT Ala TCC Ser GAG Glu GAG Glu 5 CAC His TTT Phe GAT Asp GGC Gly AAC Asn 10 CGG Arg GTG Val TAC Tyr CGT Arg GTC Val 15 AGT Ser 48
GTA CAT GGT GAA GAT CAC GTC AAC TTA ATT CAG GAG CTA GCC AAC ACC 96
Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gin Glu Leu Ala Asn Thr
20 25 30
ATYA GAG ATT GAT TTC TGG AAA CCA GAT TCT GCT ACA CAA GTG AAG CCT 144
Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gin Val Lys Pro
35 40 45
CTC ACT ACA GTT GAC TTT CAT GTT AAA GCA GAA GAT GTT GCT GAT GTG 192
Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val
50 55 60
GAG AAC TTT CTG GAG GAG AAT GAA GTT CAC TAT GAG GTA CTG ATA AGC 240
Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser
65 70 75 80
AAC GTG AGA AAT GCT CTG GAA TCC CAG TTT GAT AGC CAC ACC CGT 285
Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gin Phe Asp Ser His Thr Arg
90 95
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 95 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUSA: fehérje A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
His 1 Ala Ser Glu Glu His 5 Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser
10 15
Val His Gly Glu Asp His 20 Val Asn Leu 25 Ile Gin Glu Leu Ala Asn 30 Thr
Lys Glu Ile Asp Phe Trp 35 Lys Pro 40 Asp Ser Ala Thr Gin Val Lys 45 Pro
Leu Thr Thr Val Asp Phe 50 His 55 Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp 60 Val
Glu 65 Asn Phe Leu Glu Glu 70 Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile 75 Ser 80
Asn Val Arg Asn Ala Leu 85 Glu Ser Gin Phe 90 Asp Ser His Thr Arg 95
HU 225 673 Β1
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 38 bázispár
TlPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUSA: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC 38
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 927 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUSA: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
SAJÁTSÁG:
NÉV/KULCS: cds
ELHELYEZKEDÉS: 1...927
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCA Alá AGT Ser GGA CAC AGC Ser 100 TAC Tyr ACC Thr AAG Lys TAC Tyr AAC Asn 105 AAC Asn TGG Trp GAA Glu ACG Thr ATT Ile 110 GAG Glu 48
Gly His
GCG TGG ATT CAA CAA GTT GCC ACT GAT AAT CCA GAC CTT GTC ACT CAG 96
Alá Trp Ile Gin Gin Val Alá Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gin
115 120 125
AGC GTC ATT GGA ACC ACA TTT GAA GGA CGT AAC ATG TAT GTC CTC AAG 144
Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys
130 135 140
ATT GGT AAA ACT AGA CCG AAT AAG CCT GCC ATC TTC ATC GAT TGT GGT 192
Ile Gly Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Alá Ile Phe Ile Asp Cys Gly
145 150 155
TTC CAT GCA AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA TTC TGT CAG TGG TTT GTG 240
Phe His Alá Arg Glu Trp Ile Ser Pro Alá Phe Cys Gin Trp Phe Val
160 165 170 175
AGA GAG GCT GTC CGT ACC TAT AAT CAA GAG ATC CAC ATG AAA CAG CTT 288
Arg Glu Alá Val Arg Thr Tyr Asn Gin Glu Ile His Met Lys Gin Leu
180 185 190
CTA GAT GAA CTG GAT TTC TAT GTT CTG CCT GTG GTC AAC ATT GAT GGC 336
Leu Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly
195 200 205
TAT GTC TAC ACC TGG ACT AAG GAC AGA ATG TGG AGA AAA ACC CGC TCT 384
Tyr Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser
210 215 220
ACT ATG GCT GGA AGT TCC TGC TTG GGT GTA GAC CCC AAC AGG AAT TTT 432
Thr Met Alá Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe
225 230 235
HU 225 673 Β1
AAT Asn 240 GCT Alá GGC dy TGG Trp TGT Cys GAA Glu 245 GTG Val GGA Gly GCT Alá TCT Ser CGG Arg 250 AGT Ser CCC Pro TGC Cys TCT Ser GAA Glu 255 480
ACT TAC TGT GGA CCA GCC CCA GAG TCT GAA AAA GAG ACA AAG GCC CTG 528
Thr Tyr Cys Gly Pro Alá Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Alá Leu
260 265 270
GCA GAT TTC ATC CGC AAC AAC CTC TCC ACC ATC AAG GCC TAC CTG ACC 576
Alá Asp Phe He Arg Asn Asn Leu Ser Thr He Lys Alá Tyr Leu Thr
275 280 285
ATC CAC TCA TAC TCA CAG ATG ATG CTC TAC CCT TAC TCC TAT GAC TAC 624
lle His Ser Tyr Ser Gin Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
290 295 300
AAA CTG CCT GAG AAC TAT GAG GAA TTG AAT GCC CTG GTG AAA GGT GCG 672
Lys Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Alá Leu Val Lys Gly Alá
305 310 315
GCA AAG GAG CTT GCC ACT CTG CAT GGC ACC AAG TAC ACA TAT GGC CCA 720
Alá Lys Glu Leu Alá Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro
320 325 330 335
GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG GGA TCT GAC GAC TGG TCT 768
Gly Alá Thr Thr He Tyr Pro Alá Alá Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser
340 345 350
TAT GAT CAG GGA ATC AAA TAT TCC TTT ACC TTT GAA CTC CGG GAT ACA 816
Tyr Asp Gin Gly He Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr
355 360 365
GGC TTC TTT GGC TTT CTC CTT CCT GAG TCT CAG ATC CGC CAG ACC TGT 864
Gly Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin He Arg Gin Thr Cys
370 375 380
GAG GAG ACA ATG CTT GCA GTC AAG TAC ATT GCC AAT TAT GTC CGA GAA 912
Glu Glu Thr Met Leu Alá Val Lys Tyr He Alá Asn Tyr Val Arg Glu
385 390 395
CAT CTA TAT TAG TGA 927
His Leu Tyr * *
400
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 309 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUSA: fehérje
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Alá 1 Ser Gly His Ser 5 Tyr Thr Lys Tyr Asn 10 Asn Trp Glu Thr He 15 Glu
Alá Trp He Gin Gin Val Alá Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gin
20 25 30
Ser Val He Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys
40 45
HU 225 673 Β1
lle Gly 50 Lys Thr Arg Pro Asn Lys 55 Pro Alá lle Phe 60 lle Asp Cys Gly
Phe His Alá Arg Glu Trp lle Ser Pro Alá Phe Cys Gin Trp Phe Val
65 70 75 80
Arg Glu Alá Val Arg Thr Tyr Asn Gin Glu lle His Met Lys Gin Leu
85 90 95
Leu Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn lle Asp Gly
100 105 110
Tyr Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser
115 120 125
Thr Met Alá Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe
130 135 140
Asn Alá Gly Trp Cys Glu Val Gly Alá Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu
145 150 155 160
Thr Tyr Cys Gly Pro Alá Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Alá Leu
165 170 175
Alá Asp Phe lle Arg Asn Asn Leu Ser Thr He Lys Alá Tyr Leu Thr
180 185 190
He His Ser Tyr Ser Gin Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
195 200 205
Lys Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Alá Leu Val Lys Gly Alá
210 215 220
Alá Lys Glu Leu Alá Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro
225 230 235 240
Gly Alá Thr Thr He Tyr Pro Alá Alá Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser
245 250 255
Tyr Asp Gin Gly He Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr
260 265 270
Gly Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin lle Arg Gin Thr Cys
275 280 285
Glu Glu Thr Met Leu Alá Val Lys Tyr He Alá Asn Tyr Val Arg Glu
290 295 300
His Leu Tyr * *
305
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár TlPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUSA: cDNS HIPOTETIKUS: nem
HU 225 673 Β1
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT 39
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 27 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUSA: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG 27
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iii) lépésben a prokarboxipeptidáz-B-t szobahőmérsékleten, körülbelül 9-9,5-es pH-n, 20-24 óra hosszat inkubálva kezeljük.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iii) lépésben a prokarboxipeptidáz-B-t ZnCl2, oxidált glutation és redukált glutation jelenlétében, szo25 bahőmérsékleten, körülbelül 9-9,5-es pH-n, 20-24 óra hosszat inkubálva kezeljük.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iv) lépésben
- az oldat pH-ját körülbelül 8-as értékre állítjuk be; és
- a prokarboxipeptidáz-B-t tripszinnel hasítjuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (v) lépésben a karboxipeptidáz-B-t ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (v) lépésben a karboxipeptidáz-B-t ioncserélő kromatográfiával és hidrofób kromatográfiával tisztítjuk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (v) lépésben a karboxipeptidáz-B-t ioncserélő kromatográfiával, hidrofób kromatográfiával és diafiltrá40 lássál tisztítjuk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prokarboxipeptidáz-B-t az ATCC 69673 deponálási számon letétbe helyezett pXProCPB-plazmiddal expresszáltatjuk.

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás enzimatikusan aktív emlőseredetű has- 20 nyálmirigy-karboxipeptidáz-B előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy prokarboxipeptidáz-B-t kódoló DNS-t tartalmazó sejtet úgy kezelünk, hogy a DNS a prokarboxipeptidáz-B expresszióját irányítsa;
    (ii) a sejtből kinyerjük az expresszált prokarboxipeptidáz-B-t;
    (iii) a kinyert prokarboxipeptidáz-B-t olyan feltételek mellett kezeljük, amelyek elősegítik a prokarboxipeptidáz-B harmadlagos szerkezetének kialakulását (föl- 30 ding);
    (iv) a kialakított harmadlagos szerkezetű prokarboxipeptidáz-B enzimatikus hasításával enzimatikusan aktív karboxipeptidáz-B-t állítunk elő; és (v) a kapott enzimatikusan aktív karboxipepti- 35 dáz-B-t tisztítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ii) lépésben
    - a rekombináns sejt falát szétroncsolva sejtlizátumot állítunk elő;
    - a sejtlizátumból centrifugálással intracelluláris precipitátumot izolálunk; és
    - az intracelluláris precipitátumot megfelelő pufferben szolubilizáljuk.
HU9800091A 1995-01-25 1996-01-25 Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b HU225673B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37823395A 1995-01-25 1995-01-25
PCT/US1996/000995 WO1996023064A1 (en) 1995-01-25 1996-01-25 Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9800091A2 HUP9800091A2 (hu) 1998-05-28
HUP9800091A3 HUP9800091A3 (en) 2004-03-29
HU225673B1 true HU225673B1 (en) 2007-06-28

Family

ID=23492292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9800091A HU225673B1 (en) 1995-01-25 1996-01-25 Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5948668A (hu)
EP (1) EP0871718B1 (hu)
JP (1) JP4250716B2 (hu)
KR (1) KR100566136B1 (hu)
CN (1) CN1144874C (hu)
AT (1) ATE358717T1 (hu)
AU (1) AU698889B2 (hu)
BR (1) BR9606795A (hu)
CA (1) CA2210242C (hu)
CZ (1) CZ292541B6 (hu)
DE (1) DE69637011T2 (hu)
DK (1) DK0871718T3 (hu)
ES (1) ES2284167T3 (hu)
HK (1) HK1014986A1 (hu)
HU (1) HU225673B1 (hu)
IL (1) IL116696A (hu)
MX (1) MX9705279A (hu)
NZ (1) NZ302874A (hu)
PL (1) PL183228B1 (hu)
PT (1) PT871718E (hu)
WO (1) WO1996023064A1 (hu)
ZA (1) ZA96515B (hu)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL325017A1 (en) 1995-08-16 1998-07-06 Zeneca Ltd Chemical compounds
DK1588716T3 (da) 1998-08-06 2011-05-23 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uratoxidase-konjugater og anvendelse deraf
US20040117863A1 (en) * 1998-09-18 2004-06-17 Edge Michael D. Transgenically produced fusion proteins
DE19915938A1 (de) 1999-04-09 2000-10-19 Aventis Pharma Gmbh Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung
BR0014527A (pt) * 1999-09-17 2002-06-18 Genzyme Transgenics Corp Proteìnas de fusão produzidas transgenicamente
DE60023928T2 (de) 1999-09-29 2006-07-27 Lexicon Genetics Inc., The Woodlands Humane carboxypeptidasen und diese kodierende polynukleotide
EP1632575B1 (en) * 1999-09-29 2009-01-28 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Human carboxypeptidases and polynucleotides encoding the same
WO2001051624A2 (en) * 2000-01-12 2001-07-19 Eli Lilly And Company Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity
EP1538203B1 (en) * 2003-12-05 2010-01-20 Roche Diagnostics GmbH Recombinantly expressed carboxypeptidase B and purification thereof
DE602004025192D1 (de) * 2003-12-05 2010-03-11 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung
WO2006035008A1 (de) * 2004-09-27 2006-04-06 Merck Biosciences Ag Rekombinante carboxypeptidase b
SI3321359T1 (sl) 2005-04-11 2021-07-30 Horizon Pharma Rheumatology Llc Variantne oblike urat oksidaze in uporaba le-teh
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
BRPI0612942A2 (pt) 2005-04-11 2012-10-09 Savient Pharmaceuticals Inc forma variante de oxidase de urato e uso do mesmo
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
WO2006125452A1 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 Universite De Geneve Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant
JP5033177B2 (ja) 2006-04-12 2012-09-26 サビエント ファーマセウティカルズ インク． 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製
CN101058805B (zh) * 2007-03-21 2011-09-07 北京贯虹科技有限公司 突变羧肽酶原b及突变羧肽酶b的生产方法
US8993714B2 (en) * 2007-10-26 2015-03-31 Imiplex Llc Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof
US9102526B2 (en) 2008-08-12 2015-08-11 Imiplex Llc Node polypeptides for nanostructure assembly
US9285363B2 (en) 2009-05-11 2016-03-15 Imiplex Llc Method of protein nanostructure fabrication
HUP1200205A3 (en) 2009-06-25 2012-09-28 Savient Pharmaceuticals Method and kits for perdicting infusion reaction risk and antibody-mediated low of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricare therapy
CN101967467B (zh) * 2009-07-28 2012-11-14 上海雅心生物技术有限公司 一种高稳定性的重组羧肽酶b的生产及应用
US11918624B2 (en) * 2020-06-10 2024-03-05 Kelsius Laboratories LLC Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK124483B (da) * 1967-12-04 1972-10-23 Bayer Ag Fremgangsmåde til rensning af carboxypeptidase B.
US4511503A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
HU190129B (en) * 1983-07-11 1986-08-28 Reanal Finomvegyszergyar,Hu Process for the isolation of carboxypeptidase b enzyme from mammal pancreas
US5206161A (en) * 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
FR2692907B1 (fr) * 1992-06-25 1995-06-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation.
JP3472587B2 (ja) * 1992-08-28 2003-12-02 アベンティス ファーマ株式会社 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法
HU220879B1 (en) * 1993-11-16 2002-06-29 Lilly Co Eli Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b

Also Published As

Publication number Publication date
ES2284167T3 (es) 2007-11-01
WO1996023064A1 (en) 1996-08-01
KR19980701652A (ko) 1998-06-25
US5948668A (en) 1999-09-07
JPH11503002A (ja) 1999-03-23
EP0871718A1 (en) 1998-10-21
AU698889B2 (en) 1998-11-12
PT871718E (pt) 2007-06-26
CN1177377A (zh) 1998-03-25
CA2210242C (en) 2010-04-27
CA2210242A1 (en) 1996-08-01
HK1014986A1 (en) 1999-10-08
AU4903496A (en) 1996-08-14
DE69637011D1 (de) 2007-05-16
JP4250716B2 (ja) 2009-04-08
CZ292541B6 (cs) 2003-10-15
EP0871718A4 (en) 2000-06-07
IL116696A0 (en) 1996-05-14
PL183228B1 (pl) 2002-06-28
DK0871718T3 (da) 2007-07-02
KR100566136B1 (ko) 2006-11-10
EP0871718B1 (en) 2007-04-04
DE69637011T2 (de) 2007-12-13
BR9606795A (pt) 1997-12-30
MX9705279A (es) 1998-06-30
NZ302874A (en) 1998-11-25
CN1144874C (zh) 2004-04-07
ATE358717T1 (de) 2007-04-15
IL116696A (en) 1999-08-17
HUP9800091A2 (hu) 1998-05-28
ZA96515B (en) 1996-08-15
CZ225897A3 (cs) 1998-10-14
HUP9800091A3 (en) 2004-03-29
PL321499A1 (en) 1997-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU225673B1 (en) Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b
RU2103364C1 (ru) Последовательность днк, белок и способ получения белка
KR960015264B1 (ko) 데아세톡시세팔로스포린 c합성효소 및 데아세틸 세팔로스포린 c합성효소를 암호화하는 재조합 dna 발현 벡터 및 dna 화합물
JPH0787788B2 (ja) イソペニシリンｎ合成酵素をコ−ドしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクタ−
AU628265B2 (en) Cloned n-methylhydantoinase
JPH05268972A (ja) Ｄｎａおよびその用途
AU636500B2 (en) Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus
JP4880859B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
EP0157604A2 (en) Porcine pancreatic elastase
JP3442392B2 (ja) 微生物由来の酵素、フタリルアミダーゼ
JP3463951B2 (ja) 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子
JPH07231788A (ja) リパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片及びリパーゼの製造法
JP2001501466A (ja) ロドスポリジウム・トルロイド由来のセファロスポリンエステラーゼ遺伝子
JPH11313683A (ja) 新規キシロシダーゼ遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体及びその利用
JP3330670B2 (ja) アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法
AU7062700A (en) D-gluconolactone oxidase gene and method for producing recombinant d-gluconolactone oxidase
JP3044325B2 (ja) グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子及びそれを用いたグルコシルトランスフェラーゼの製造法
JP2001321178A (ja) 耐熱性α−ガラクトシダーゼ
JP2001321177A (ja) 新規耐熱性α−ガラクトシダーゼ遺伝子
El-Adawi et al. Overexpression of protein disulfide isomerase in Aspergillus
JPH0675509B2 (ja) ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉｉｉ▼ｂ
JPH10257890A (ja) 新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ
JPH11299491A (ja) 改変セリンアセチルトランスフェラーゼ、改変セリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び改変セリンアセチルトランスフェラーゼの製造法
JPH05268951A (ja) グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を用いたグルコシルトランスフェラーゼの製造法
JPH09191885A (ja) Ｎｓｐ７５２４ＩＩＩ制限・修飾系酵素及びその遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: FERRING INTERNATIONAL CENTER S.A., CH

Free format text: FORMER OWNER(S): BIOTECHNOLOGY GENERAL CORPORATION, US; SAVIENT PHARMACEUTICALS, INC., US