CZ292541B6 - Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy - Google Patents
Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ292541B6 CZ292541B6 CZ19972258A CZ225897A CZ292541B6 CZ 292541 B6 CZ292541 B6 CZ 292541B6 CZ 19972258 A CZ19972258 A CZ 19972258A CZ 225897 A CZ225897 A CZ 225897A CZ 292541 B6 CZ292541 B6 CZ 292541B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- procarboxypeptidase
- carboxypeptidase
- cpb
- procpb
- enzymatically active
- Prior art date
Links
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 25
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 25
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 19
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 10
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100035024 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims 2
- 101000946524 Homo sapiens Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 abstract 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 abstract 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 108090000201 Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 description 10
- 102100035023 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- LPHZOARCSCLGLK-OAHLLOKOSA-N (2R)-2-amino-2-(2-benzamidoacetyl)-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound C(CNC(=O)C1=CC=CC=C1)(=O)[C@](N)(CCCNC(N)=N)C(=O)O LPHZOARCSCLGLK-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 4
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 4
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 4
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 101000946516 Rattus norvegicus Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N Thr-Cys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CUTPSEKWUPZFLV-WISUUJSJSA-N 0.000 description 3
- KKPOGALELPLJTL-MEYUZBJRSA-N Thr-Lys-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKPOGALELPLJTL-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XQJAFSDFQZPYCU-UWJYBYFXSA-N Ala-Asn-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N XQJAFSDFQZPYCU-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 2
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- BDQNLQSWRAPHGU-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N BDQNLQSWRAPHGU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- WZGZDOXCDLLTHE-SYWGBEHUSA-N Ala-Trp-Ile Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 WZGZDOXCDLLTHE-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFNDQEWMNJMQHD-SZMVWBNQSA-N Arg-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RFNDQEWMNJMQHD-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N Arg-Thr-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OGZBJJLRKQZRHL-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- KRQFMDNIUOVRIF-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KRQFMDNIUOVRIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KOWYNSKRPUWSFG-IHPCNDPISA-N Asp-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KOWYNSKRPUWSFG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N Cys-Ser-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LKHMGNHQULEPFY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SBYVDRJAXWSXQL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 2
- BKRQSECBKKCCKW-HVTMNAMFSA-N Glu-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N BKRQSECBKKCCKW-HVTMNAMFSA-N 0.000 description 2
- HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HVYWQYLBVXMXSV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 2
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- ITZOBNKQDZEOCE-NHCYSSNCSA-N Gly-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)CN ITZOBNKQDZEOCE-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- ZHMZWSFQRUGLEC-JYJNAYRXSA-N His-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZHMZWSFQRUGLEC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N Ile-Asp-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XLDYDEDTGMHUCZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N Ile-Gly-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N Ile-Gly-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N DFFTXLCCDFYRKD-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 2
- KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N Ile-His-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N Leu-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JQSXWJXBASFONF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CFZZDVMBRYFFNU-QWRGUYRKSA-N Leu-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O CFZZDVMBRYFFNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N Lys-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- ITWQLSZTLBKWJM-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN ITWQLSZTLBKWJM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N Met-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O AFFKUNVPPLQUGA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- WUYLWZRHRLLEGB-AVGNSLFASA-N Met-Met-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WUYLWZRHRLLEGB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJUMUUXGSXUZJZ-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJUMUUXGSXUZJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PMKIMKUGCSVFSV-CQDKDKBSSA-N Phe-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N PMKIMKUGCSVFSV-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- IHAPJUHCZXBPHR-WZLNRYEVSA-N Thr-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N IHAPJUHCZXBPHR-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 2
- NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N Thr-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O NZRUWPIYECBYRK-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 2
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N Trp-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IMMPMHKLUUZKAZ-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- HRHYJNLMIJWGLF-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 HRHYJNLMIJWGLF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MDXLPNRXCFOBTL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 2
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 108010045383 histidyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108700004896 tripeptide FEG Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- MKZCBYZBCINNJN-DLOVCJGASA-N Ala-Asp-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MKZCBYZBCINNJN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- AUFACLFHBAGZEN-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Cys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O AUFACLFHBAGZEN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N Ala-Ser-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- DCGLNNVKIZXQOJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DCGLNNVKIZXQOJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- USNSOPDIZILSJP-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O USNSOPDIZILSJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DPNHSNLIULPOBH-GUBZILKMSA-N Arg-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DPNHSNLIULPOBH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YSUVMPICYVWRBX-VEVYYDQMSA-N Arg-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YSUVMPICYVWRBX-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JQFJNGVSGOUQDH-XIRDDKMYSA-N Arg-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 JQFJNGVSGOUQDH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N Arg-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RIQBRKVTFBWEDY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N Arg-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WHLDJYNHXOMGMU-JYJNAYRXSA-N Arg-Val-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WHLDJYNHXOMGMU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ANAHQDPQQBDOBM-UHFFFAOYSA-N Arg-Val-Tyr Natural products CC(C)C(NC(=O)C(N)CCNC(=N)N)C(=O)NC(Cc1ccc(O)cc1)C(=O)O ANAHQDPQQBDOBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRVABKHPWDRUJF-UBHSHLNASA-N Asn-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JRVABKHPWDRUJF-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ANPFQTJEPONRPL-UGYAYLCHSA-N Asn-Ile-Asp Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ANPFQTJEPONRPL-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N Asn-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XLDMSQYOYXINSZ-QXEWZRGKSA-N Asn-Val-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XLDMSQYOYXINSZ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- KGAJCJXBEWLQDZ-UBHSHLNASA-N Asp-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KGAJCJXBEWLQDZ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N Asp-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QNMKWNONJGKJJC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 101000946522 Bos taurus Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 102100030613 Carboxypeptidase A1 Human genes 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- SKSJPIBFNFPTJB-NKWVEPMBSA-N Cys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O SKSJPIBFNFPTJB-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N Cys-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- RTOOAKXIJADOLL-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RTOOAKXIJADOLL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BIHMNDPWRUROFZ-JYJNAYRXSA-N Glu-His-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BIHMNDPWRUROFZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMVCSRBOSIUTFC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- DZMVESFTHXSSPZ-XVYDVKMFSA-N His-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DZMVESFTHXSSPZ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- HAPWZEVRQYGLSG-IUCAKERBSA-N His-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HAPWZEVRQYGLSG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N His-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 KHUFDBQXGLEIHC-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FFKJUTZARGRVTH-KKUMJFAQSA-N His-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O FFKJUTZARGRVTH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 101000772551 Homo sapiens Carboxypeptidase A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N Ile-Arg-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N Lys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- IMDJSVBFQKDDEQ-MGHWNKPDSA-N Lys-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IMDJSVBFQKDDEQ-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N Phe-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N Phe-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FIRWJEJVFFGXSH-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N Thr-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CEXFELBFVHLYDZ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N Thr-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UJQVSMNQMQHVRY-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- ZEJBJDHSQPOVJV-UAXMHLISSA-N Thr-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZEJBJDHSQPOVJV-UAXMHLISSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- WEAPHMIKOICYAU-QEJZJMRPSA-N Trp-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WEAPHMIKOICYAU-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 1
- PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PZXUIGWOEWWFQM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N Tyr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- DMWNPLOERDAHSY-MEYUZBJRSA-N Tyr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DMWNPLOERDAHSY-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- AKKYBQGHUAWPJR-MNSWYVGCSA-N Tyr-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)O AKKYBQGHUAWPJR-MNSWYVGCSA-N 0.000 description 1
- HZWPGKAKGYJWCI-ULQDDVLXSA-N Tyr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccc(O)cc1)C(C)C)C(O)=O HZWPGKAKGYJWCI-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LNYOXPDEIZJDEI-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- PTFPUAXGIKTVNN-ONGXEEELSA-N Val-His-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)NCC(=O)O)N PTFPUAXGIKTVNN-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- UOUIMEGEPSBZIV-ULQDDVLXSA-N Val-Lys-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UOUIMEGEPSBZIV-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- JXCOEPXCBVCTRD-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N JXCOEPXCBVCTRD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- -1 triskryl Polymers 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu přípravy enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B, při kterém se rekombinantní hostitelská buňka obsahující DNA kódující prokarboxypeptidázu B zpracuje tak, že DNA řídí expresi prokarboxypeptidázy B; takto exprimovaná prokarboxypeptidáza B se solubilizuje; pH hodnota solubilizované prokarboxypeptidázy B se nastaví na hodnotu 8 až 11, při které se prokarboxypeptidáza B sbalí; načež se sbalená prokarboxypeptidáza B podrobí enzymatickému štěpení, při kterém se vytvoří enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B; a tato enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se čistí. Rovněž se týká purifikované enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B prosté všech dalších látek savčího původu.ŕ
Description
Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy
Oblast techniky
Vynález se týká přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidázy B.
Dosavadní stav techniky
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidáza B [Peptidyl-L-lysin(L-arginin)hydrolyza EC 3.4.17.2] je pankreatickou exopeptidázou obsahující zinek, která z peptidů specificky odštěpuje C-koncovou Arg, Lys nebo Om (Barrett a McDonald (175), Mammilian proteases, aGlossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida.; Coli a kol. (1991), The Embo J. 10. l.až 9).
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidáza B je produktem prekurzorového proteinu, preprokarboxypeptidázy B, obsahujícího N-koncový fragment 108 aminokyselin, který obsahuje signální sekvenci (13 aminokyselin) a aktivační peptid (95 aminokyselin). Preprokarboxypeptidáza B je enzymaticky inaktivní.
Během transportu preprokarboxypeptidázy B do endoplazmatického retikula se odštěpí signální peptid, v důsledku čehož se enzymaticky inaktivní preprokarboxypeptidáza B vyloučí z buňky. Enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se následně vytvoří odštěpením aktivačního peptidu trypsinem (Aviles a kol. (1985), Biochem. And Bioph. Res. Comm, 130: 97 až 103.
Karboxypeotidáza B dospělé krysy obsahuje 307 aminokyselin (Clauser a kol. (1988). J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845) a má zdánlivou průměrnou molekulovou hmotnost 35 kD. Karboxypeptidáza B rovněž obsahuje 7 cysteinových zbytků, z nichž 6 je spárováno přes S-S vazby.
Karboxypeptidáza B má jak široké komerční uplatnění, tak uplatnění při výzkumech. Používá se například při výrobě inzulínu a dalších biologicky účinných polypeptidů a při proteinové sekvenční analýze.
Komerčně dostupná karboxypeptidáza B izolovaná ze slinivky prasete je velmi drahá a není zcela zbavena dalších proteáz.
Byla zveřejněna parciální aminokyselinová sekvence prasečí prekurzorové preprokarboxypeptidázy B a kompletní aminokyselinová sekvence hovězí karboxypeptidázy B (Burgos a kol. (1991), Biochemistry 30: 4082-4089; resp. Titáni a kol. (1975), P.N.A.S. 72: 1666-1670). Rovněž již byla publikována kompletní nukleová sekvence krysího genu a lidská cDNA (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17745).
Yomamoto a kol. ((1991), J. Bio. Chem. 267: 2575-2581) popsal rekombinantní expresi enzymaticky inaktivní lidské preprokarboxypeptidázy B, postrádající prvních 11 aminokyselin aktivačního peptidu.
Rovněž byla zaznamenána rekombinantní exprese enzymaticky inaktivního β-galaktosidázopreprokarboxypeptidázového B fúzního proteinu, jehož preprokarboxypeptidáza postrádá prvních jedenáct aminokyselin aktivovaného peptidu.
Evropská patentová přihláška EP 588 118 A2 popisuje z kosti odvozený karboxypeptidáze podobný protein, označený jako OSF-5. Dá se usuzovat, že OSF-5 působí jako adhezívní
-1 CZ 292541 B6 molekula nebo růstový faktor a že může být použit jako účinná látka pro ošetření metabolických onemocnění kostí. Tato přihláška však neuvádí žádnou skutečnou funkci nebo aktivaci OSR—5 a ani nepopisuje produkci přirozeně se vyskytujícího nebo rekombinantně biologicky aktivovaného protienu.
Cílem vynálezu je tedy poskytnout způsob přípravy rekombinantní vysoce čisté enzymaticky aktivní a levné karboxypeptidázy B. Tato příprava enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B nebyla dosud popsána a proto lze zde uvedený způsob přípravy považovat za nový.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu přípravy enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B, při kterém se rekombinantní hostitelská buňka obsahující DNA kódující prokarboxypeptidázu B zpracuje tak, že DNA řídi expresi prokarboxypeptidázy B; takto exprimovaná prokarboxypeptidáza B se solubilizuje; pH hodnota solubilizované prokarboxypeptidázy B se nastaví na hodnotu 8 až 11, při které se prokarboxypeptidáza B sbalí; načež se sbalená prokarboxypeptidáza B podrobí enzymatickému štěpeni, při kterém se vytvoří enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B; a tato enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se čistí.
Předmětem vynálezu je rovněž samotná purifíkovaná enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B prostá všech dalších látek savčího původu.
Stručný popis obrázků
Restrikční mapy plazmidů znázorněné na obrázcích 2 a 3 neidentifikují všechna restrikční místa přítomná na plazmidech. Nicméně ta biologicky významná restrikční místa, která jsou nezbytná pro úplné pochopení vynálezu jsou znázorněna.
Obr. 1 znázorňuje aminokyselinu a odpovídající cDNA nukleotidovou sekvenci pankreatické krysí preprokarboxypeptidázy B.
Tento obrázek tedy ukazuje cDNA nukleotidovou sekvenci a odpovídající aminokyselinovou sekvenci panteatické krysí preprokarboxypeptidázy B, zahrnující nukleotidovou sekvenci zralé karboxypeptidázy B a aktivační peptidovou nukleotidovou sekvenci. DNA sekvence se liší od DNA sekvence publikované Clauserem a kol. ((1988), J.Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845) čtyřmi nukleotidy, z nichž mají dva mají za následek změnu aminokyseliny: Lys14 -> Asn a Arg142 -> Asp.
DNA Nukleotidové sekvence tří primerů, používaných během klonování, (příklad 1) jsou rovněž znázorněny (velkými písmeny): preprokarboxypeptidázový B 5’-konečný primer, zralý karboxypeptidázový B 5'-koncový primer a karboxypeptidázový B 3'-koncový primer.
Očíslování aminokyselin se provedlo v souladu s homologií karboxypeptidázy A odvozené z hovězí slinivky (Bradshaw a kol. (1969), P.N.A.S. 63: 1389-1394; Gardell a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17828-17836), přičemž první aminokyselina (Ala) zralé krysí karboxypeptidázy B má číslo 4. Hvězdička (*) označuje další aminokyselinu (Leu), kterou má krysí karboxypeptidáza B navíc oproti karboxypeptidáze A.
Obr. 2 znázorňuje konstrukci plazmidového pCPGB a plazmidového pCPB-C.
Plazmidový pABN se digeroval Βα/nHI a Nco. Fragment tvořený 2500 bp se izoloval a ligoval do BamH a Nco\ 940 bp cDNA fragmentu karboxypeptidázy B (získaného způsobem popsaným
-2CZ 292541 B6 v příkladu 1). Nově získaný plazmid byl označen jako pCPB a použil se pro transformaci E. coli
4300.
Plazmid pCPB se digeroval BamHl a Ndel za účelem izolace většího fragmentu. Za účelem izolovat větší fragment se plazmid pCPB digeroval rovněž Asel a Scal.
Smísením dvou velkých fragmentů s 5'-koncovým fosforylovaným oligonukleotidem připraveným pro místně specifickou mutagenezi (příklad 1) a s polymerázoligázovým pufrem (5x pufr: 32,5 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM MgCl2, 5 mM 2-merkaptoethanol, 0,5M NaCl) (Morinaga a kol. (1984), Bio-Technology July: 636-639) se vytvořil heteroduplex. Denaturace DNA řetězců se dosáhlo vařením směsi, načež postupné ochlazení směsi DNA opět denaturovalo. Reakční produkty se použily pro transformaci E. coli 1645 elektroporací. Transformanty se screenovaly růstem LB agaru, který obsahoval ampicilin, a in šitu diferenciální hybridizací kolonií s 5'-koncovým fosforylovaným oligonukleotidem připraveným pro mutagenezi.
Z pozitivních kolonií se extrahoval plazmid DNA. pro restrikční enzymové analýze a DNA nukleotidovém sekvencování se zvolil klon obsahující mutantní Spěl místo. Nově získaný plazmid, který se označil jako pCPB-C, kódoval karboxypeptidázu B s mutací z cysteinu na serin na aminokyselině 290. Plazmid pCPB-C se použil pro tranformaci E. coli 4300.
Obr. 3 znázorňuje konstrukci plazmidu pProCPB a plazmidu pXProCPB
Preprokarboxypeptidázová B cDNA, získaná způsobem popsaným v příkladu 1, se odštěpila pomocí Ndel a Clal, čímž se izoloval 470 bp dlouhý fragment, který kódoval aktivační peptid a část karboxypeptidázy B.
Odštěpením plazmidu pCPB-C pomocí BamHl a Clal se izoloval 760 bp dlouhý fragment, který kódoval zbytek karboxypeptidázy B, zahrnující Cys290 -> Ser mutaci.
Odštěpením plazmidu pAB pomoci NdeHl a BamH\ se izoloval 2500 bp fragment, který kódoval všechny prvky nezbytné pro expresi v bakterii (viz příklad 1).
Tři výše uvedené fragmenty se ligovaly a nově získaný plazmid se označil jako pProCPB-C.
Plazmid pROCPB-C a pCPB se odštěpily pomocí Stul a Xhól. Z plazmidu pProCPB-C se izolovat 3700 bp fragment, kódující všechny prvky, nezbytné pro expresi v bakterii (příklad 1), celý aktivační peptid a část karboxypeptidázy B.
Z plazmidu pCPB se izoloval 440 bp fragment kódující zbytek karboxypeptidázy B.
Tyto dva fragmenty se ligovaly a nově vytvořený plazmid se označil jako pXProCPB.
Obr. 4 znázorňuje srovnání aktivity rekombinantní karboxypeptidázy B a přirozeně se vyskytující karboxypeptidázy B.
Aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B (Sigma) a rekombinantní karboxypeptidázy B, připravené způsobem popsaným v příkladu 5, se stanovila Folkovou metodou (Folk) (1970), Methods in Enzymology 19. 504-508) za použití Hippuryl-L-Arg substrátu. Vo katalytické reakce se měřilo za použití koncentrací substrátu, v rozmezí od 0,025 mM do 1,0 mM:
Aby se splnily požadavky budapešťské mezinárodní dohody o ukládání mikroorganizmů pro účely patentového řízení, byl plazmid pXProCPB 4. srpna 1994 uložen v bakterii E. coli. v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod ATTC depozitním číslem 69673. Výraz „CPB“, jak je zde použit, znamená polypeptid vyrobený
-3CZ 292541 Β6 rekombinantními DNA metodami nebo jinými slovy polypeptid, který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako libovolná přirozené se vyskytující savčí karboxypeptidáza B. Výraz „CPB“ tedy zahrnuje polypeptidy, které se liší jednou nebo více aminokyselinami, výhodně ne více než přibližně 10 aminokyselinami, od přirozeně se vyskytujících karboxypeptidáz B.
Výraz „ProCPB“, jak je zde použit, znamená polypeptid připravený rekombinantními DNA metodami nebo polypeptid, který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako libovolná přirozeně se vyskytující savčí prokarboxypeptidáza B. Výraz „ProCPB“ tedy zahrnuje polypeptidy, které se liší jednou nebo více aminokyselinami, výhodně ne více než přibližně 10 aminokyselinami, od přirozeně se vyskytujících prokarboxypeptidáz B.
Odborníci v daném oboru mohou snadno určit, které aminokyselinové zbytky lze přidat, vynechat nebo substituovat (včetně toho, jakými aminokyselinami lze tyto substituce realizovat) za použití dobře známých metod, zahrnujících například konvenční metody pro navrhování a přípravu DNA sekvencí kódujících bakteriální expresi polypeptidů, modifikaci cDNA a genomových sekvencí technikami místně směrované mutageneze, konstrukci rekombinantních proteinů a expresních vektorů, bakteriální expresi polypeptidů a měření biochemické aktivity polypeptidů za použití běžných biochemických testů.
Výraz „enzymaticky aktivní“ CPB, jak je zde použit, znamená CPB, která vykazuje biologickou aktivitu přirozeně se vyskytující savčí karboxypeptidázy B. Pro účely této definice „biologická aktivita“ přirozeně se vyskytující karboxypeptidázy B znamená schopnost karboxypeptidázy B z peptidu specificky odstraňovat C-koncový arginin, lysin nebo omithin.
V podstatě stejná aminokyselinová sekvence je zde definována jako sekvence zahrnující substituce a/nebo delece a/nebo adice aminokyselin v aminokyselinové sekvenci, které mohou zahrnovat až deset aminokyselinových zbytků homologových nebo ekvivalentních skupin a které jsou popsány například Lehningerem, Biochemistiy, 2. vydání, Worth Pub., N. Y. (1975), kapitola 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL tisk oxfordské univerzity, Anglie (1989); a Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure sv. 5, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), kapitola 9. Tyto substituce jsou odborníkům v daném oboru známy.
U výhodného provedení může DNA, kódující ProCPB nebo CPB, pocházet z člověka, krysy, skotu nebo prasete. Tuto DNA lze získat reverzní transkripcí, reakcí polymerázového řetězce (PCR), syntetickými nebo semisyntetickými prostředky nebo více než jednou z těchto metod, případně dalších, v daném oboru známých, metod.
DNA kódující ProCPB nebo CPB polypeptid lze mutovat způsoby známými v daném oboru, viz například Bauer a kol. (1985), Gene 37: 73-81. Mutovaná sekvence může být zavedena do vhodných expresních vektorů, které, jak je zde popsáno, jsou zavedeny do buněk, které se následně ošetří tak, aby mutovaná dna řídila expresi polypeptidů.
Odborníkům v daném oboru bude zřejmé, že plazmid, uložený v souvislosti s touto přihláškou, lze snadno upravit známými technikami (například místně směrovanou mutagenezí nebo vložením vazebných činidel) tak, aby kódoval expresi polypeptidů. Tyto techniky jsou popsány například v publikaci autorů Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Příkladem vektorů, které lze použít pro exprimaci nukleové kyseliny, kódující CPB nebo ProCPB, jsou viry, jakými jsou bakteriální viry, například bakteriofágy (například fág lambda), kosmidy, plazmidy a další vektory. cDNA, kódující ProCPB nebo CPB, se vloží do vhodných vektorů způsoby známými v oboru. Například použitím konvenční restrikce endonukleázovým enzymových míst mohou být inzerty a vektor DNA odštěpeny tak, že dojde k vytvoření vzájemně
-4CZ 292541 B6 komplementárních konců, jejichž bazické páry se následně společně ligují DNA ligázou. Alternativně lze syntetická vazebná činidla, nesoucí bazické sekvence, které jsou komplementární k restrikčnímu místu ve vektorové DNA, ligovat na inzertní DNA, která se následně digeruje restrikčním enzymem. Další prostředky jsou rovněž dostupné.
Vektory podle vynálezu, které obsahují sekvenci, kódující ProCPB nebo CPB, lze upravit pro expresi v celé řadě prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk, např. bakteriích, kvasinkách, houbách, insekticidních buňkách nebo dalších savčích buňkách, například CHO, kuřecího embrya, fibroblastu, ledvin nebo dalších známých buněčných linií.
Tyto vektory dále obsahují regulační prvky, které jsou nezbytné pro expresi klonovaného genu v hostitelské buňce v určité poloze vzhledem k nukleové kyselině, kódující v odezvě na tuto expresi ProCPB nebo CPB.
Regulační prvky, potřebné pro expresi, zahrnující sekvence promotoru a operátoru a ribozomové vazebné místo. Vektor bakteriální exprese může například zahrnovat promotor-operátorovou sekvenci, jakou je například XPLOL, nebo deo promotory. Pro iniciaci translace lze použít XCn nebo deo ribozomová vazebná místa. Tyto vektory lze získat komerčně nebo sestavit z popsaných sekvencí způsoby, známými v daném oboru. Související patent US 4 831 120, udělený 16. května 20 1989 a patent US 5 143 836, podaný 1. září 1992, popisují například způsoby, které se týkají XPL promotoru, a evropská patentová přihláška EP 303 972, publikovaná 22. února 1989, popisuje způsoby, týkající se deo promotoru. Rovněž mohou být přítomny další vhodné prvky, například represory a zesilovače transkripce. Odborníci v daném oboru jsou seznámeni s tím, jakým způsobem regulační prvky vhodné pro různé expresní systémy použít.
Expresní plazmidy podle vynálezu obsahují vhodné regulační prvky, které se nacházejí uvnitř plazmidu v takové poloze vhledem kDNA, kódující ProCPB nebo CPB polypeptid, ve které způsobí expresi ProCPB nebo CPB polypeptidu ve vhodné hostitelské buňce. Těmito regulačními prvky jsou promotory a operátory, např. deo PiP2 a XPL, a ribozomová vazebná místa, například 30 deo a Cn, a rovněž represory a zesilovače transkripce.
U výhodných provedení vynálezu jsou regulační prvky umístěny v blízkosti DNA kódující ProCPVB nebo CPB, a to před touto DNA.
Plazmidy podle vynálezu rovněž obsahují ATG iniciační kodon. DNA kódující ProCPB nebo CPB je ve fázi s ATG iniciační kodonem.
Plazmidy podle vynálezu rovněž zahrnují DNA sekvenci, obsahující počátek replikace z bakteriálního plazmidu, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce. Vhodné počátky replika40 ce lze získat z celé řady zdrojů, například z plazmidu pBR322 (ATCC depozitní číslo 37017).
Plazmidy podle vynálezu rovněž zahrnují DNA sekvenci, která obsahuje gen související s volitelným nebo identifikovatelným fenotypovým znakem, který se projeví, jakmile je plazmid přítomen v hostitelské buňce, jako drogově rezistentní gen, například rezistencí proti ampicilinu, 45 chloramfenicolu nebo tetracyclinu.
Výhodnými bakteriálními hostitelskými buňkami jsou E. coli buňky. Příkladem vhodné E. coli buňky je kmen 4300, ale jako hostitelské buňky pro plazmidy je možné použít i další kmeny E coli a další bakterie.
Bakteriemi použitými jako hostitelské buňky mohou být libovolné bakteriální kmeny včetně auxotrofních (například A1645), prototrofních (například A4255) a lytických kmenů; F+ a F~ kmenů; kmenů obsahujících Cl857 represorovou sekvenci Xprofágu (například A1645 aA4255) a kmenů, postrádajících deo represory a/nebo deo gen (viz evropská patentová
-5CZ 292541 B6 přihláška EP 0 303 972, publikovaná 22. února 1989). Bakteriální kmen E. coli 4300 byl uložen pod ATCC depozitním číslem 69363.
Všechny výše popsané E. coli hostitelské bakteriální kmeny mohou být „ošetřeny“ uvedenými plazmidy, které jsou v nich obsaženy způsoby známými v daném oboru, například ethidiumbromidovou metodou, popsanou R.P. Novickem v Bacteriol, Review 33, 210 (1969).
Vynález poskytuje způsob přípravy enzymaticky aktivní CPB, který zahrnuje ošetření rekombinantní buňky' obsahující DNA, kódující ProCPB, které způsobí, že DNA směruje expresi ProCPB; izolaci takto exprimované ProCPB z buňky; ošetření izolované ProCPB za podmínek umožňujících sbalování ProCPB, vystavení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení za vzniku enzymaticky aktivní CPB a čištění enzymaticky aktivní CPB.
U výhodného provedení zahrnuje izolaci ProCPB z rekombinantní buňky porušení buněčné stěny rekombinantní buňky nebo jejího fragmentu, které vede ke vzniku lyzátu, izolaci intracelulámí sraženiny z lyzátu odstřeďováním a rozpuštění intracelulámí sraženiny ve vhodném pufru. U dalšího provedení zahrnuje ošetření izolovaného ProCPB inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 h až 24 h při pH přibližně 9 až 9,5.
U ještě dalšího provedení zahrnuje ošetření izolovaného ProCPB inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 h až 24 h při pH přibližně 9 až 9,5 v přítomnosti ZnCU, zoxidovaného glutathionu (GSSG) a redukovaného glutathionu (GSH). Dá se předpokládat, že toto podrobení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení bude zahrnovat nastavení pH na přibližně 8,5 a přibližně 60min štěpení ProCPB trypsinem při 37 °C.
Dále se dá předpokládat, že čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografii.
Pro tyto účely lze zvolit libovolnou iontoměničovou chromatografíckou metodu. Výhodná je slabá iontoměničová kolona, například DEAE Sepharose. Slabé iontoměničové sloupce mají zpravidla jako funkční skupinu terciární amin (diethylaminoethyl), ale rovněž lze použít kvartérní aminoethyl nebo kvartémí amin.
Jako matrici lze použít matrici na bázi anorganických sloučenin, syntetických pryskyřic, polysacharidů nebo organických polymerů. Vhodnými matricemi jsou matrice na bázi agarózy, celulózy, triskrylu, dextranu, skleněných kuliček, oxiran-akrylových kuliček, akrylamidu, kopolymerů agarózy a polyakrylamidu nebo hydrofilního vinylového polymeru.
Rovněž se dá předpokládat, že čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografii a hydrofobní chromatografii.
Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že lze použít libovolný hydrofobní sloupec. Výhodným sloupcem je fenylsefarózový sloupec. Funkční skupinou může být fenyl, benzyl, oktyl nebo butyl. Matricí může být libovolná výše diskutovaná matrice.
U dalšího výhodného provedení čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografii, hydrofobní chromatografii a diafiltraci.
U zvláště výhodného provedení je ProCPB extrahována plazmidem pXProCPB, uloženým pro ATCC depozitním číslem 69673.
Vynález dále poskytuje enzymaticky aktivní CPB, prostou ostatních látek savčího původu.
-6CZ 292541 B6
Příklady provedení vynálezu
Níže uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky. Příklady nezahrnují detailní popisy konvenčních metod, používaných pro konstrukci vektorů, vložení genů kódujících polypeptidy do těchto vektorů nebo zavádění výsledných plazmidů do hostitelských buněk. Příklady rovněž nezahrnují podrobní popis konvenčních metod, používaných pro testování polypeptidů, připravených těmito hostitelskými vektorovými systémy. Tyto metody jsou odborníkům v daném oboru dobře známy a jsou popsány v celé řadě publikací, které jsou v předložené přihlášce zmíněny formou odkazů.
Příklad 1
Klonování krysí karboxypeptidázové B cDNA pomocí PCR
I. DNA amplifíkace
Ze slinivky Sprague-Dawleyových krys se extrahovala kompletní RNA. Z této kompletní RNA se izolovala 40 pg póly A' mRNA (pomocí sloupce oligo dT-Celulóze). Takto získaný alikvotní podíl (10 pg) polyA+ mRNA se použil jako matrice při reverzní transkripční reakci, prováděné v přítomnosti 3'-koncového primeru syntetické karboxypeptidázy B (5) (obrázek 1).
Po ukončení syntézy jednořetězcové komplementární DNA (ss-cDNA), se mRNA vysrážela ethanolem. Alikvotní ss-cDNA se následně podrobila PCR amplifikaci:
Pro amplifikaci DNA kódující CPB (940 bp) se použily syntetický primer, odpovídající 3'-konci karboxypeptidázy B, a syntetický primer, odpovídající 5'-konci zralé karboxypeptidázy B (obrázek 1).
Pro amplifikaci DNA kódující ProCPB (1230 bp) se použily syntetický primer, odpovídající 3'-konci karboxypeptidázy B, a syntetický primer, odpovídající 5'-konci prokarboxypeptidázy B (obr. 1).
PCR amplifikační podmínky byly následující:
1. Příměrový 3 '-konec | 2 Pg |
2. Primerový 5'-konec | 2 pg |
3. ss-cDNA | 5 pl |
4. Pufr: | |
dNTP's | 0,2 mM |
Tris-HCL | 50 mM |
KC1 | 20 mM |
MgCl2 | 8 mM |
5. Tag Polymeráza I | 5 jednotek |
Celkový objem: | 100 pl |
6. Minerální olej (proti odpařování) | 50 pl |
7. 1 cyklus χ [Γ při 92 °C; 2' při 40 °C: | ; a 4' při 72 °C] |
8. 35 cyklů χ [Γ při 92 °C; 2' při 53 °C; | a 3' při 72 °C] |
9. 1 cyklus χ [Γ při 92 °C; 2'při 53 °C; | a 15' při 72 °CJ. |
Produkty PCR amplifíkace se analyzovaly na 1% agarózovém gelu. Neamplifikované kontrolní vzorky a velikostní markéry byly rovněž přítomny. Bylo možné pozorovat dva distinktní pásy přibližně 940 bp a 1230 bp. 940 bp pás reprezentoval CPB nukleotidovou sekvenci a 1230 bp pás
-7CZ 292541 B6 reprezentoval ProCPG nukleotidovou sekvenci, který zahrnoval aktivační peptidovou nukleotidovou sekvenci.
Po ukončení PCR amplifikace se DNA vyčistila z reakční směsi chloroformovou a fenolovou extrakcí a vysrážením octanem amonným a izopropanolem.
II. Plazmid pCPB
Plazmid pCPB (obr. 2) se konstruoval digerací CPB cDNA pomocí BamH\ a Ncol. Po následné genové purifikaci se fragment subklonoval do BamHl a Ncol fragmentu plazmidu pABN o délce 2500 bp, který kódoval následující prvky, nezbytné pro expresi v bakterii:
(i) XPL promotor, umožňující genovou expresi zE. coli buněk indukcí, tj. posunem teploty z 30 °C na teplotu 42 °C, která inaktivuje teplotně senzitivní represor cl857;
(ii) deo ribozomové vazebné místo (rbs);
(iii) trp transkripční terminátor (8);
(iv) ampicilinově rezistentní gen z plazmidu pBR322; a (v) pBR322 počátek replikace.
III. Plazmidová pCPB-C
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidázová B aminokyselinová sekvence obsahuje 7 cysteinových zbytků, z nichž šest je napárována na S-S vazby a jeden z nich (Cys290) je volným cysteinovým zbytkem (Barrett a McDonald (1985), Mammlian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida). Dá se předpokládat, že tento volný cysteinový zbytek může v průběhu sbalování rekombinantní CPB tvořit nežádoucí intermolekulámí nebo intramolekulámí S-S vazby. Cys290 se nenachází ani v katalytickém místě, ani v substrátovém vazebném místě karboxypeptidázy B a zdánlivě není potřebný pro enzymatickou aktivitu tohoto enzymu (Barrett a McDonald (1985), Mammilian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida.; Coli a kol. (1991), The Embo J., 10.1 až 9,). Proto bylo rozhodnuto, že se vyrobí CPB, ve které bude tento cystein nahrazen serinem a takto připravená CPB se označila jako CPB-C.
Připravil se 5'-koncový fosforylovaný oligonukleotid, obsahující 2-nukleotidové substituce:
Thr Cys
... .ACC TGT.... původní sekvence v karboxypeptidáze B
Thr Ser
5' ATCC CGC CAG ACT AGT GAG GAG ACA ATG 3' mutantní sekvence
Spěl
Tento oligonukleotid se použil při substituci nukleotidové sekvence, kódující Cys290 nukleotidovou sekvencí, kódující serin v plazmidové pCPB místně specifickou mutagenezí, která je znázorněna na obrázku 2 (Morinaga a kol. (1984), Bio-Technology July: 636-639). Nově získaný plazmid se označil jako pCPB-C.
-8CZ 292541 B6
IV. Plazmid pProCPB-C
Sestrojila se plazmidem značená pProCPB-C, nesoucí ProCPB-C nukleotidovou sekvenci 5 (obsahující Cys290 -> Ser mutaci] (viz obrázek 3), která se použila pro transformaci do hostitelských buněk E. coli 4300.
V. Plazmidová pXProCPB
Sestrojil se plazmid označený jako pXProCPB, obsahující ProCPB nukleotidovou sekvenci (obrázek 3), který se použil pro transformaci do hostitelských buněk E. coli 4300. Tento plazmid se uložil 4. srpna 1994 do sbírky ATCC pod ATCC depozitním číslem 69673.
Z plazmidů pCPB, pCPB-C, pXProCPB a pProCPB-C se připravila plazmidová DNA. K ověření 15 přítomnosti správných sekvencí se použila restrikční enzymová analýza plazmidové DNA a nukleové sekvencování.
Příklad 2
Fermentace, růstové podmínky a purifikace ProCPB a CPB
I. Zásobní kultury
Zásobní kultura E. coli 4300, ve které je přítomen plazmid pXProCPB, se nechala růst na LB médiu doplněném ampicillinem (100 pg/ml).
II. Inokulum
Inokulum se propagovalo ve 100 ml LB média, doplněného ampicillinem (100 pg/ml), při 30 °C, dokud buněčná koncentrace nedosáhla O.D.660 2,0.
Produkční médium (LB médium + ampicillin (100 pg/ml)) se naočkovalo, inkubovalo při 30 °C, provzdušnilo, míchalo a udržovalo při pH 7,2 přidáním amoniaku. Do kultury se během růstu 35 přidalo dvacet gramů glukózy. Po dosažení buněčné koncentrace O.D.660 12, se teplota zvýšila na teplotu 42 °C, která umožnila expresi ProCPB. Po 2 h buněčná koncentrace dosáhla O.D.66o 22 až 29 a bakterie se sklidily.
III. Čištění
ProCPB se exprimovala plazmidem pXProCPB, shromážděným v intracelulámí sraženině, která se izolovala následujícím postupem: 40 g (hmotnost za vlhka) koláče se suspendovalo ve 450 ml pufru, obsahujícího 1 mM PMSF (Sigma), 50 mM Tris-HCl, pH 8, lOmM EDTA a 2h ošetřovalo lysozymem (Sigma) do konečné koncentrace 50 pg/ml při 37 °C.
Do směsi, která se následně sonifikovala, se přidával Triton X-100 (Měrek) do konečné koncentrace 2 % a míchal 2 h při pokojové teplotě. Surová intracelulámí sraženina se peletovala odstřeďováním (frekvence otáčení 14 000 min'1,30 min, 4 °C) a promyla vodou.
Intracelulámí sraženina obsahující pro CPB se rozpustila v pufru B, obsahujícím 25 mM NaCl, 8M močoviny, 10 mM DTT, 20mM Bis-Tris pH 7. Roztok se chromatografoval na DEAESepharozovém rychloproudém sloupci, uvedeném do rovnovážného stavu v pufru B a protein se eluoval přibližně lOOmM NaCl v pufru B a ProCPB se vysrážela pomocí (NH^SOt při 40% nasycení při 0 °C.
-9CZ 292541 B6
Později se ukázalo, že enzymaticky aktivní CPB by se dal získat pouze přes produkci prekurzorového proteinu. Nejprve se podobným způsobem jako výše popsaná ProCPB připravily polypeptidy CPB a CPB-C. Stejně tak byla podobným způsobem připravená ProCPB. Použitými plazmidy byly pCPB, pCPB-C, resp. pProCPB-C (viz příklad 1). Růstové podmínky hostitelských buněk E. coli, které obsahovaly tyto plazmidy, a čištění polypeptidů byly v podstatě popsány výše v souvislosti s izolováním ProCPB z pufru, který se použil pro rozpuštění intracelulámí sraženiny, obsahující rekombinantní CPB nebo CPB-C, a který obsahoval 20mM ethanolaminu pH 9, lOmM DTT a 8M močoviny.
Je třeba poznamenat, že v tomto případě nebyly připravené a vyčištěné polypeptidy enzymaticky aktivní. Balení polypeptidů, které poskytuje enzymaticky účinné proteiny, je popsáno v příkladu 3.
Příklad 3
Balení a aktivace ProPCB-C
Způsobem popsaným v příkladu 2 se připravily polypeptidy CPB a CPB-C, které, jak se ukázalo, nebyly enzymaticky aktivní, běžné metody (popsané níže), které se použily pro balení polypeptidů, neposkytly enzymaticky aktivní protein.
Tento problém, spočívající v neschopnosti získat enzymaticky aktivní protein, vyřešilo vyvinutí alternativní metody, která zahrnuje expresi a balení prekurzorového proteinu po ošetření, odstraňujícím aktivní peptidovou část sbaleného prekurzorového proteinu.
Součástí tohoto alternativního postupu jsou následující kroky:
ProCPB-C připravená způsobem popsaným v příkladu 2, se rozpustila v koncentraci lOmg/ml v 8M močovině, 5mM HC1 a naředila na 1 mg/ml ve lOOmM glycinu, 0,2mM ZnCl2 při pH 9, 10 a 11. Tyto roztoky tvořily balicí roztoky.
Sbalení se dosáhlo 17h inkubací výše popsaných balicích roztoků při pokojové teplotě. V tomto stadiu neměla sbalená ProCPB-C ještě žádnou enzymatickou aktivitu (viz tabulka I).
Hodnota pH roztoku, obsahujícího sbalenou ProCPB-C, se následně nastavila přidáním HC1 přibližně na 8,5 a ošetřovala 30 min při 37 °C trypsinem (1:200 hmotn./hmotn.), v důsledku čehož došlo k odstranění aktivačního peptidu. Reakce se ukončila přidáním PMSF do konečné koncentrace 0,1 mM.
Enzymatická aktivita takto získané sbalené CPB-C se určila (tabulka I) Folkovou metodou (Folk (1970), methods in Enzymology 19: 504-508): Jedna jednotka aktivity (u) je definována jako množství enzymu, které katalyzuje hydrolýzu 1 pmol Hippuryl-L-Arg substrátu za 1 min při 25 °C a které způsobuje 0,12 zvýšení absorbance při 254 nm a 1 cm délky dráhy. Specifická aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B (Sigma) je 230 u/mg.
-10CZ 292541 B6
Tabulka I. Specifická aktivita proCPB-C (a z ní odvozené CPB-C) za různých podmínek
Reakce | Specifická aktivita (u/mg) |
1. Samotný substrát | 0,0 |
2. Balení při pH 9, trypsinové ošetření, není přítomná žádná ProCPB-C | 0,0 |
3. Balení při pH 9, trypsinové ošetření | 4,3 |
4. Pouze balení při pH 9 | 0,0 |
5. Balení při pH 10, trypsinové ošetření | 1,7 |
6. Balení při pH 11, trypsinové ošetření | 0,3 |
7. Komerční prasečí CPB | 230 |
Tabulka I naznačuje, že sbalení ProCPB-C a ošetření sbalené ProCPB-C trypsinem za použití výše popsaných předem stanovených podmínek poskytlo enzymaticky aktivovanou CPB-C.
Tabulka I dále ukazuje, že v případě, že je pH hodnota v balicí směsi rovna 9, je specifická aktivita CPB-C vyšší než v případě, kdy je pH v balicí směsi rovna 10 nebo 11.
Příklad 4
Zlepšené balicí podmínky
Cílem následujících experimentů bylo stanovit optimální balicí a aktivační podmínky. Předpokládalo se, že čím vyšší bude specifická aktivita CPB-C, získané trypsinovým odštěpením sbalené ProCPB-C, tím optimálnější budou balicí podmínky ProCPB-C. Pro níže uvedené experimenty se jako kontrolní materiál použily „samotný substrát“ a „komerční prasečí karboxypeptidáza“.
Výsledky (které byly popsány v příkladu 3) se zlepšily, pokud se balení provádělo za použití 0,05 až 0,01 mg/ml ProCPB pro pH 9,5.
I. Vliv teploty na balení PriCPB-C
Sbalení ProCPB-C se dosáhlo inkubací 0,05 mg/ml polypeptidů ve 100 mM glycinu, pH 9,5 po dobu 90 h při teplotách, pohybujících se v teplotním rozmezí 10 °C až 37 °C. Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:200 hmotn./hmotn.) a specifická aktivita takto získaní CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3. Nej vyšší specifická aktivita se získala v případě, kdy se balení ProCPB-C provádělo při teplotách 20 °C až 30 °C.
II. Vliv zoxidovaného a zredukovaného glutathionu na balení ProCPB-C
Sbalení ProCPB-C se dosáhlo inkubací 0,05 nm/ml polypeptidů ve 100 mM glycinového pufru pH 9,5, 0,01mM ZnCL při 25 °C v přítomnosti zoxidovaného a/nebo zredukovaného glytathionu 35 (GSSG/GSH) nebo kyseliny askorbové (tabulka II). Následně se inkubované roztoky ošetřovaly 1 h trypsinem (1:200 hmotn./hmotn.) při 37 °C a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila (jak popisuje příklad 3) po 18 h a po 45 h.
-11 CZ 292541 B6
Tabulka II: Specifická aktivita CPB-C jako funkce přítomnosti oxidačního/redukčního činidla v balicím roztoku
Oxidační/redukční činidlo přidané do | Specifická aktivita (u/mg) | |
balicího roztoku | ||
18 h | 45 h | |
0,1 mMGSSG | 2,18 | 16,39 |
0,lmMGSSG, lmM GSH | 16,37 | 26,90 |
16,5 μΜ kyseliny askorbové | 4,06 | 9,24 |
Kontrolní (bez přidání ox./red. činidel) | 1,19 | 5,39 |
* Kyselina askorbová se přidala v koncentraci 2,5 mol do 1 mol SH skupiny.
Tabulka II ukazuje, že kombinované přidání GSSG a GSH způsobí prudké zvýšení specifické aktivity CPB-C a pravděpodobně tedy i balicí účinnosti ProCPB-C. GSSH samotný rovněž zvyšuje balicí účinnost ProCPB-C a rovněž tak kyselina askorbová, i když nižší měrou.
U další řady experimentů se zjistilo, že optimálního sbalení Pro CPB-C se dosáhne přidáním 0,1 mM GSSG a 0,5mM GSH do balicího roztoku.
III. Aktivace sbalené ProCPB-C trypsinem
Zjistilo se, že nejaktivnější CPB-C se získala odštěpením ProCPB-C trypsinem, které odstranilo aktivační peptid, pokud se inkubovaný balicí roztok 1 h ošetřoval trypsinem 1:50 hmotn./hmotn. při teplotě 37 °C.
IV. Vliv pH na balení ProCPB-C
Vliv pH na balení ProCPB-C se určil v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek.
Balení ProCPB-C se provádělo 24 h při koncentraci 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinu, 0,02mM ZnCl2, 0,5 mM redukovaného glytathionu (GSH), 0,1 mM zoxidovaného glytathionu (GSSG) při 25 °C a při různých hodnotách pH (hodnoty pH se pohybovaly v rozmezí od 8,75 do 10,00). Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:50 hmotn./hmotn.; rozpustily v 1 mM HC1, lOmM CaCl2) a specifická aktivita takto získané CPb-C se měřila způsobem popsaným v příkla30 du3.
Nej vyšší specifická aktivita byla zjištěna v případě, kdy se balení PriCPB-C provádělo za pH hodnoty 9,25.
V. Vliv ZnCl2 na balení ProCPB-C f φ
Účinek ZnCl2 koncentrace v balicím roztoku na balení ProCPB-C se stanovil v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek. Při koncentraci ZnCl2 2 až 20x vyšší než určená koncentrace CPB-C (mol./mol.), se dosáhlo nejvyšší specifické aktivity připravené CPB-C.
Pokud se balení provádělo v nepřítomnosti dalšího ZnCl2 a do balicí směsi se přidala EDTA, která chelátovala veškeré zbytkové divalentní ionty, potom se specifická aktivita CPB-C snížila na nulu.
VI. Vliv proteinové koncentrace na balení ProCPB-C
Balení ProCPB-C se provádělo 24 h za optimálních podmínek (které byla uvedeny výše) při koncentracích naznačených v tabulce II. Po digeraci trypsinem se aktivita CPB-C měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
-12CZ 292541 B6
Tabulka III: Specifická aktivita CPB-C jako funkce proteinové koncentrace v balicím roztoku.
Proteinová koncentrace (mg/ml) | Specifická aktivita (u/mg) |
0,05 | 35,1 |
0,10 | 31,8 |
0,20 | 20,3 |
Tabulka III ukazuje, že nejvyšší specifická aktivita připravené CPB-C se získá při proteinové koncentraci 0,05 mg/ml.
VII. Doba balení jako funkce specifické aktivity CPB-C
Optimální doba balení se určila v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek.
Balení ProCPB-C se provádělo při koncentraci 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinu, pH 9,25, 0,1 mM GSSG, 0,5mM GSH a 0,01 mM ZnCl2. Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem 15 (1:50 hmotn./hmotn.) a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3 v různých časových okamžicích (mezi 0 h až 40 h) od iniciace balení.
Nejvyšší aktivita CPB-C se naměřila v příkladě, kdy se sbalení ProCPB-C odštěpila pomocí trypsinu po 20 h, měřeno od počátku balení. Balení trvající déle než 20 min již hodnotu speci20 fícké aktivity neovlivnilo.
Příklad 5
Balení a aktivita různých CPB proteinů
CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C připravené a čištěné způsobem popsaným v příkladu 2, se balily 24 h 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinového pufru, pH 9,25, 0,0lmM ZnCl2, 0,5mM GSSH při pokojové teplotě, tj. za použití optimálních podmínek určených v příkladu 4.
Hodnota pH každého roztoku obsahujícího sbaleno CPB, CPB-C, ProCPB nebo ProCPB-C se nastavila pomocí HC1 na 8,5 a roztoky, obsahující ProCPB a ProCPB-C se ošetřovaly 1 h tiypsinen (1:50 hmotn./hmotn.) při teplotě 37 °C, v důsledku čehož došlo k odstranění aktivačního peptidů. Reakce se ukončila přidáním PMSF do konečné koncentrace 0,1 mM. Specifická 35 aktivita CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
Tabulka IV: Specifická aktivita CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C po sbalení a aktivita při optimálních podmínkách
Balení | Specifická aktivita (u/mg) |
Kontrolní1 bez trypsinového ošetření | 0,00 |
bez proteinu | 0,00 |
Balení - CB | 0,00 |
-CPB-C | 0,08 |
-ProCPB | 42,90 |
-ProCPB-C | 20,90 |
Kontrola „bez trypsinu“ se provedla pouze pro ProCPB-C.
-13CZ 292541 B6
Tabulka IV ukazuje, že enzymaticky účinnou CPB lze produkovat pouze z buněk, exprimujících prekurzor, který obsahuje aktivační peptid. Aktivační peptid je tedy nezbytný pro správné sbalení
CPB.
Tabulka IV rovněž naznačuje, že CPB s optimální specifickou aktivitou se získá sbalením a aktivací ProCPB (exprimované plazmidovou pXProCPB), která obsahuje tři Cys290 zbytky a nikoliv sbalením a aktivací ProCPB-C, která obsahuje Cys290 -> Ser mutaci. Cys290 je tedy zřejmě potřebná pro optimální sbalení a/nebo dosažení nejvyšší aktivity CPB.
Příklad 6
Zlepšení balení ProCPB
I. Balení proCPB ze surové intracelulámí sraženiny
Zjistilo se, že optimální balicí podmínky pro ProCPB jsou v podstatě identické s optimální balicími podmínkami pro ProCPB-C, které se určily v příkladu 4.
Zjednodušený způsob balení a aktivace ProCPB se prováděl za použití surové intracelulámí sraženiny s tím, že se vynechal počáteční purifikační krok popsaný v části III příkladu 2.
Ukázalo se, že surová intracelulámí sraženina obsahující proCPB (připravené způsobem popsaným v příkladu 2), by mohla být rozpuštěna při vysokých proteinových koncentracích (tabulka V) ve lOOmM glycinu, pH 9,5 a 8M močovině.
Balení se provádělo za optimalizovaných podmínek při pokojové teplotě 24 h. Hodnota pH se zvýšila na optimálních 9,5 (tato optimální hodnota byla stanovena již dříve). Sbalená ProCPB se odštěpila pomocí trypsinu (1:50 hmotn./hmotn.) a specifická aktivita CPB se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
Tabulka V: Specifická aktivita CPB jako funkce proteinové koncentrace v balicím roztoku, obsahujícím surovou intracelulámí sraženinu
Proteinová koncentrace (mg/ml) | Specifická aktivita (u/mg) |
0,1 | 10,5 |
0,2 | 10,9 |
0,5 | 11,9 |
1,0 | 12,1 |
2,0 | 11,4 |
Tabulka V ukazuje, že enzymaticky aktivní CPB lze získat sbalením ProCPB, získané ze surové intracelulámí sraženiny, a následnou trypsinovou digerací. Kromě toho CPB má při všech měřeních proteinových koncentracích podobné hodnoty enzymatické aktivity. To je neočekávaný výsledek, vzhledem ktomu, že specifická aktivita CPB, čištěné na DEAE Sepharose před jejím sbalením (příklad 2), s růstem proteinové koncentrace v balicí směsi klesá. Intracelulámí sraženina pravděpodobně obsahuje faktory, které napomáhají sbalení ProCPB.
-14CZ 292541 B6
II. Kalibrace CPB sbalováním ProCPB ze surové intracelulámí sraženiny (i) Příprava
Ze 42 litrů hostitelských buněk £. coli 4300, obsahujících plazmid pXProCPB a exprimujících ProCPB, se vyčistila téměř homogenní CPB. Fermentační a růstové podmínky byly v podstatě popsány v příkladu 2.
Surová intracelulámí sraženina se omyla ve vodě a rozpustila v koncentraci 20 mg/ml ve lOOmM glycinu, pH 9,5, 8M močoviny. Tato směs se naředila do koncentrace 1 mg/ml lOOmM glycinu, pH 9,5, 0,1 mM ZnCl2, 0,5mM GSH. do takto naředěné směsi se přidalo 0,1 mM GSSG a výsledný balicí roztok se inkuboval 24 h při teplotě 25 °C. Hodnota pH se následně nastavila pomocí HC1 na 8,5 a sbalená ProCPB se digerovala 1 h při 37 °C trypsinem (20 pg/ml). Trypsin se inaktivoval 0,1 mM PMSF.
(ii) Čištění
Enzymaticky aktivní CPB se aplikovala na DEAE Sepharose Fast-Flow sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu 20 mM Tris-HCl, pH 8 při 20 mg na 1 ml pryskyřice. CPB se eluovala 80mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8. Do DEAE eluční frakce se přidal síran amonný (0,8M) a frakce se dále chromatografovala na Fenyl-Sepharose Fast-Flow sloupci (Pharmacia), vyváženém pomocí 20mM Tris-HCl pH 8, 0,8M síranu amonného. CPB se eluovala 0,4M síranem amonným, zahustila, diafiltrovala proti lOOmM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8 a skladovala při -20 °C.
U výše popsaného čisticího postupu se 42 litrů hostitelských buněk E. coli 4300, obsahujících plazmidovou pXProCPB při O.D.íó0 = 36. zpracovalo výše popsaným způsobem a poskytlo 1,25 g enzymaticky aktivní CPB se specifickou aktivitou 637 u/mg. Celkový výtěžek činil 60 %.
Specifická aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B, měřené za identických experimentálních podmínek, byl 298 u/mg.
Příklad 7
Charakteristika enzymaticky aktivní CPB
CPB, připravená způsoby, popsanými v příkladech 5 a 6, má biologické a enzymatické vlastnosti srovnatelné s prasečí karboxypeptidázou B. Extinkční koeficient rekombinantní CPB, vypočtený na základě jejího složení aminokyselin, je ε1%280 = 19,7. Extinkční koeficient komerční prasečí karboxypeptidázy B je ε1%28ο = 21,4 (Barrett a McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando Florida).
Rekombinantní CPB má specifickou aktivitu 637 u/mg (Hippuryl-L-Arg substrát) a obsahuje 1 mol zinku na 1 ml enzymu, stanoveno atomovou absorpcí.
Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence poskytla Ala-Ser-Gly-His-Ser, jak bylo možné očekávat na základě analýzy aminokyselinové sekvence zralé krysí karboxypeptidázy B (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845).
Optimální pH pro rekombinantní CPB aktivitu se určila za použití 25mM následujících pufrů: NaOAc, pH č až 6; Bis-Tris, pH 6 až 7,5; Tris-HCl, pH 7,5 až 9; a glycinu, pH 9 až 12. CPB specifická aktivita se měřila způsobem, popsaným v příkladu 3. Optimální enzymatická aktivita CPB byla dosažena při pH 8. Inkubace CPB při 55 °C způsobila 50% ztrátu aktivity a úplní inaktivaci se dosáhlo při 65 °C.
-15CZ 292541 B6
Kinetická analýza rekombinantní CPB se prováděla za použití Hippuryl-L-arg substrátu (obr. 4).
Inhibice CPB aktivity při koncentracích substrátu vyšších než 0,5mM.
Další studie ukázaly, že rekombinantní CPB byla inhibována katalytickým produktem argininu, který' je konkurenčním inhibitorem karboxypeptidázy B. Odpovídající Lineweaver-Burkova křivka ukázala pro Km hodnotu 0,38mM.
Rekombinantní CPB byla rovněž inhibována 1,10-fenantrolinem, silným divalentním iontovým chelátorem. což demonstruje důležitost Zn iontů pro enzymatickou aktivitu CPB. V přítomnosti lmM 1,10-fenantrolinu byla pozorována 50% ztráta aktivity 1 mg/ml rekombinantní CPB.
Příklad 8
Konverze proinzulinu na inzulín pomocí CPB
Mini-proinzulin, který popisuje EP 347781 Bl, lze převést na inzulín zpracováním za použití trypsinu a rekombinantní CPB, připravenou způsobem popsaným v příkladech 5 a 6.
Trypsin štěpí proinzulin specificky v místě mezi argininovým zbytkem a A řetězcem. CPB následně specificky hydrolyzuje argininový zbytek z C-konce B řetězce.
Komerční lidský inzulín (Boehringer-Mannheim) lze použít jako standard, pokud jde o miniproinzulin štěpený trypsinem a komerční prasečí karboxypeptidázou B a mini-proinzulin, štěpený samotným trypsinem.
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1.
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádný (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 1:
gcgcatatgc atgcttccga ggagcacttt GATGGC 36
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 285 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina
-16CZ 292541 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) LOKALITA: 1..285 (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
CAT His 1 | GCT TCC GAG GAG | CAC TTT GAT GGC AAC | CGG GTG TAC CGT | GTC Val 15 | AGT Ser | 48 | |||||||||
Ala Ser | Glu | Glu 5 | HÍS | Phe | Asp Gly Asn 10 | Arg Val | Tyr Arg | ||||||||
GTA | CAT GGT | GAA | GAT | CAC | GTC | AAC | TTA | ATT | CAG | GAG | CTA | GCC | AAC | ACC | 96 |
val | His Gly | Glu | Asp | His | Val | Asn | Leu | Ile | Gin | Glu | Leu | Ala | Asn | Thr | |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
AAA | GAG ATT | GAT | TTC | TGG. | AAA | CCA | GAT | TCT | GCT | ACA | CAA | GTG | AAG | CCT | 144 |
Lys | Glu Ile | Asp | Phe | Trp | Lys | Pro | Asp | Ser | Ala | Thr | Gin | Val | Lys | Pro | |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
CTC | ACT ACA | GTT | GAC | TTT | CAT | GTT | AAA | GCA | GAA | GAT | GTT | GCT | GAT | GTG | 192 |
Leu | Thr Tnr | Val | Asp | Phe | His | Val | Lys | Ala | Glu | Asd | Val | Ala | Asp | Val | |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
GAG | AAC TTT | CTG | GAG | GAG | AAT | GAA | GTT | CAC | TAT | GAG | GTA | CTG | ATA | AGC | 240 |
Glu | Asn Phe | Leu | Glu | Glu | Asn | Glu | Val | His | Tyr | Glu | Val | Leu | Ile | Ser | |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
AAC | GiG AGA | AAT | GCT | CTG | GAA | TCC | CAG | TTT | GAT | AGC | CAC | ACC | CGT | 285 | |
Asn | Val Arg | Asn | Ala | Leu | Glu | Ser | Gin | Phe Asp | Ser | His | Thr | Arg | |||
B5 | 90 | 95 |
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 95 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 3:
His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg val Tyr Arg Val Ser 15 10 15
Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gin Glu Leu Ala Asn Thr 20 * 25 30
-17CZ 292541 B6
Lys | Glu | Ile 35 | Asp | Phe | Trp | Lys | Pro 40 | Asp | Ser | Ala | Thr | Gin 45 | Val | Lys | Pro |
Leu | Thr | Thr | Val | Asp | Phe | His | Val | Lys | Ala | Glu | Asp | Val | Ala | Asp | Val |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Asn | Phe | Leu | Glu | Glu | Asn | Glu | Val | His | Tyr | Glu | Val | Leu | Ile | Ser |
85 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Asn | Val | Arg | Asn | Ala | Leu | Glu | Ser | Gin | Phe | Asp | Ser | His | Thr | Arg |
90 95
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukieová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 4:
GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 927 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) LOKALITA: 1..927 (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
-18CZ 292541 B6
GCA Ala | AGT Ser | GGA Gly | CAC AGC | TAC ACC Tyr Thr | AAG Lys | TAC AAC AAC Tyr Asn Asn 105 | TGG Trp | GAA ACC- ATT C-AC- | 4 6 | ||||||
His | Ser 100 | Glu | Thr ile 110 | Glu | |||||||||||
GCG | TGG | ATT | CAA | CAA | GTT | GCC | ACT | GAT | AAT | CCA | GAC | CTT | GTC ACT | CAG | 95 |
Ala | Trp | Ile | Gin | Gin | Val | Ala | Thr | Asp | Asn | Pro | Asp | Leu | Val Thr | Gin | |
115 | 12*0 | 125 | |||||||||||||
AGC | GTC | ATT | GGA | ACC | ACA | TTT | GAA | GGA | CGT | AAC | ATG | TAT | GTC CTC | AAG | 144 |
Ser | Val | Ile | Gly | Thr | Tnr | Phe | Glu | Gly | Arg | Asn | Met | Tyr | Val Leu | Lys | |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
ATT | GGT | AAA | ACT | AGA | CCG | AAT | AAG | CCT | GCC | ATC | TTC | ATC | GAT TGT | GGT | 192 |
Ile | Gly | Lys | Thr | Arg | Pro | Asn | Lys | Pro | Ala | Ile | Phe | Ile | Asp Cys | Gly | |
145 | 150 | 155 | |||||||||||||
TTC | CAT | GCA | AGA | GAG | TGG | ATT | TCT | CCT | GCA | TTC | TGT | CAG | TGG TTT | GTG | 240 |
Phe | His | Ala | Arg | Glu | Trp | Ile | Ser | Pro | Ala | Phe | Cys | Gin | Trp Phe | Val | |
160 | 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
AGA | GAG | GCT | GTC | CGT | ACC | TAT | AAT | CAA | GAG | ATC | CAC | ATG | AAA CAG | CTT | 288 |
Arg | G1U | Ala | Val | Arg | Thr | Tyr | Asn | Gin | Glu | Ile | His | Met | Lvs Gin | Leu | |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
CTA | GAT | GAA | CTG | GAT | TTC | TAT | GTT | CTG | CCT | GTG | GTC | AAC | ATT GAT | GGC | 336 |
Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | Tyr | Val | Leu | Pro | Val | Val | Asn | Ile Asp | Gly | |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
TAT | GTC | TAC | ACC | TGG | ACT | AAG | GAC | AGA | . ATG | TGG | AGA | , AAA | , ACC CGC | TCT | 384 |
Tyr | Val | Tyr | Thr | Trp | Thr | Lys | Asp | Arg | Met | Trp | Arg | Lys | Thr Arg | Ser |
210 215 220
ACT Thr | ATG GCT | GGA Gly | AGT Ser | TCC TGC TTG GGT GTA GAC | CCC AAC AGG | AAT TTT | |||||||||
Met 225 | Ala | Ser | Cys 230 | Leu Gly Val | ASp | Pro 235 | Asn | Arg | Asn | Phe | |||||
AAT | GCT | GGC | TGG | TGT | GAA | GTG | GGA | GCT | TCT | CGG | AGT | CCC | TGC | TCT | GAA |
Asn | Ala | Gly | Trp | Cys | G1U | Val | Gly | Ala | Ser | Arg | Ser | Pro | Cys | Ser | Glu |
240 | 245 | 250 | 255 |
- 19CZ 292541 B6
ACT TAC TGT GGA CCA GCC CCA GAG TCT | GAA AAA GAG ACA | AAG GCC | CTG Leu | 528 | ||||||
Tnr Tyr Cys | Gly Pro Ala Pro Glu 260 | Ser | Glu 265 | Lys | Glu Thr | Lys | Ala 270 | |||
GCA GAT TTC | ATC CGC AAC AAC CTC | TCC | ACC | ATC | AAG | GCC | TAC | CTG | ACC | 576 |
Ala Asp Phe | Ile Arg Asn Asn Leu | Ser | Thr | Ile | Lys | Ala | Tyr | Leu | Thr | |
275 | 200 | 205 | ||||||||
ATC CAC TCA | TAC TCA CAG ATG ATG | CTC | TAC | CCT | TAC | TCC | TAT | GAC | TAC | 624 |
Ile His Ser | Tyr Ser Gin Met Met | Leu | Tyr | Pro | Tyr | Ser | Tyr | Asp | Tyr | |
290 | 295 | 300 | ||||||||
AAA CTG CCT | GAG AAC TAT GAG GAA. | TTG | AAT | GCC | CTG. | GTG | AAA | GGT | GCG | 672 |
Lys Leu Pro | Glu Asn Tyr Glu Glu | Leu | Asn | Ala | Leu | Val | Lys | Gly | Ala | |
305 | 310 | 315 | ||||||||
GCA AAG GAG | CTT GCC ACT CTG CAT | GGC | ACC | AAG | TAC | ACA | TAT | GGC | CCA | 720 |
Ala Lys Glu | Leu Ala Thr Leu His | Gly | Thr | Lys | Tyr | Thr | Tyr | Gly | Pro | |
320 | 325 | 330 | 335 | |||||||
GGA GCT ACA | ACA ATC TAT CCT GCT | GCT | GGG | GGA | TCT | GAC | GAC | TGG | TCT | 768 |
Gly Ala Thr | Thr Ile Tyr Pro Ala | Ala | Gly | Gly | Ser | Asp | Asp | Trp | Ser | |
340 | 345 | 3 50. | ||||||||
TAT GAT CAG | GGA ATC AAA TAT TCC | TTT | ACC | TTT | GAA. | CTC | CGG | GAT | ACA | 816 |
Tyr Asp Gin | Gly Ile Lys Tyr Ser | Phe | Thr | Pne | Glu | Leu | Arg | Asp | Thr | |
355 | 3 60 | 365 | ||||||||
GGC TTC TTT | GGC TTT CTC CTT CCT | GAG | TCT | CAG | ATC | CGC | CAG | ACC | TGT | 864 |
Gly Phe Phe | Gly Phe Leu Leu Pro | Glu | Ser | Gin | Ile | Arg | Gin | Thr | Cys | |
370 | 375 | 380 | ||||||||
GAG GAG ACA | > ATG CTT GCA GTC AAG | TAC | ATT | GCC | AAT | TAT | GTC | CGA | GAA | 912 |
Glu Glu Thr | Met Leu Ala Val Lys | Tyr | Ile | Ala | Asn | Tyr | Val | Arg | Glu | |
385 | 390 | 395 |
CAT CTA TAT TAG TGA
His Leu Tyr * ♦
400
927
-20CZ 292541 B6
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 309 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
Ala | Ser | Gly | His | Ser | Tyr | Thr | Lys | Tyr | Asn | Asn Trp | Glu | Thr | Ile | Glu |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Ala | Trp | Ile | Gin | Gin | Val | Ala | Thr | Asp | Asn | Pro Asp | Leu | Val | Thr | Gin |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Ser | Val | Ile | Gly | Thr | Thr | Phe | Glu | Gly | Arg | Asr. Met | Tyr | Val | Leu | Lys |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Ile | Gly | Lys | Thr | Arg | Pro | A.sn | Lys | Pro | Ala | Ile Phe | Ile | Asp | Cys | Gly |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Phe | His | Ala | Arg | Glu | Trn | Ile | Ser | Pro | Ala | Phe Cys | Gin | Trp | Phe | Val |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
Arg | Glu | Ala | Val | Arg | Thr | Tyr | Asn | Gin | Glu | Ile His | Met | Lys | Gin | Leu |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||
Leu | Asp | Glu | Leu | Asp | Phe | Tyr | Val | Leu | Pro | Val Val | Asn | Ile | Asp | Gly |
100 | 105 | 110 |
Tyr | Val | Tyr 115 | Thr | Trp | Thr | Lys | Asp 120 | Arg | Met | Trp | Arg | Lys 125 | Thr | Arg | Ser |
Thr | Met | Ala | Gly | Ser | Ser | Cys | Leu | Gly | Val | Asp | Pro | Asn | Arg | Asn | Phe |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Asn | Ala | Gly | Trp | Cys | Glu | Val | Gly | Ala | Ser | Arg | Ser | Pro | Cys | Ser | Glu |
145 | 150 | 155 | 160 |
-21 CZ 292541 B6
Tnr Tvr | Cys | Gly Pro Ala 165 | Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr 170 | Lys | ATs. Leu 175 | ||||||||
Alb Asp | Phe | 11e Arg | Asn | Asn | Leu | Ser | Thr | Ile | Lys | Ala | Tyr | Leu | Thr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||
Ile His | Ser | Tyr Ser | Gin | Met | Met | Leu | Tyr | Pro | Tyr | Ser | Tyr | Asp | Tyr |
195 | 200 | 205 | |||||||||||
Lvs Leu | Pro | Glu Asn | Tyr | Glu | Glu | Leu | Asn | Ala | Leu | val | Lys | Gly | Ala |
210 | 215 | 220 | |||||||||||
Ala Lys | Glu | Leu Ala | Thr | Leu | His | Gly | Thr | Lys | Tyr | Thr | Tyr | Gly | Pro |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||
Gly Ala | Thr | Thr Ile | Tyr | Pro | Ala | Ala | Gly | Gly | Ser | Asp | Asp | Tru | Ser |
245 | 250 | 25*5 | |||||||||||
Tyr Asp | Gin | Gly Ile | Lys | Tyr | Ser | Phe | Thr | Phe | Glu | Leu | Arg | Asp | Thr |
2 60 | 265 | 270 | |||||||||||
Gly Phe | Phe | Gly Phe | Leu | Leu | Pro | Glu | Ser | Gin | Ile | Arg | Gin | Thr | Cys |
275 | 280 | 285 | |||||||||||
Glu Glu | Thr | Met Leu | Ala | Val | Lys | Tyr | Ile | Ala | Asn | Tyr | Val | Arg | Glu |
290 | 295 | 300 |
His Leu Tyr *
3C5
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
CGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT
-22CZ 292541 B6
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 8:
ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy enzymaticky aktivní savčí pankreatické karboxypeptidázy B, která má aminokyselinovou sekvenci a enzymatickou aktivitu přirozeně se vyskytující savčí pankreatické karboxypeptidázyB,vyznačený tím , že:(a) se rekombinantní hostitelská buňka obsahující DNA kódující prokarboxypeptidázu B zpracuje tak, že DNA řídí expresi prokarboxypeptidázy B;(b) takto exprimovaná prokarboxypeptidáza B se solubilizuje;(c) pH hodnota solubilizované prokarboxypeptidázy B se nastaví na hodnotu 8 až 11, při které se prokarboxypeptidáza B sbalí;(d) sbalená prokarboxypeptidáza B se podrobí enzymatickému štěpení, při kterém se vytvoří enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B; a (e) tato enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se čistí:
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se prokarboxypeptidáza B v kroku (b) solubilizuje tak, že:(a) se poruší buněčná stěna hostitelské buňky za vzniku lyzátu;(b) z lyzátu se odstřeďováním izoluje intracelulámí sraženina; a (c) intracelulámí sraženina se solubilizuje ve vhodném pufru.
- 3. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se prokarboxypeptidáza B v provozním kroku (c) 20 h až 24 h inkubuje při teplotě místnosti.-23CZ 292541 B6
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že se inkubace provádí v přítomnosti ZnCU, zoxidovaného glutathionu a zredukovaného glutathionu.
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se enzymatické štěpení v provozním kroku (d) provádí tak, že se (i) pH hodnota nastaví na 8,5; a (ii) prokarboxypeptidáza B 60 min štěpí trypsinem.
- 6. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se purifíkace v kroku (e) provádí pomocí iontoměničové chromatografie.
- 7. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se purifíkace v kroku (e) provádí pomocí iontoměničové chromatografie a hydrofobní chromatografie.
- 8. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se purifíkace v kroku (e) provádí pomocí iontoměničové chromatografie, hydrofobní chromatografie a diafiltrace.
- 9. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se prokarboxypeptidáza B exprimuje pomocí plazmidu pXprokarboxypeptidázy B, uloženého pod depozitním číslem ATCC 69673.
- 10. Purifikovaná enzymaticky účinná karboxypeptidáza B prostá všech dalších látek savčího původu.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37823395A | 1995-01-25 | 1995-01-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ225897A3 CZ225897A3 (cs) | 1998-10-14 |
CZ292541B6 true CZ292541B6 (cs) | 2003-10-15 |
Family
ID=23492292
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ19972258A CZ292541B6 (cs) | 1995-01-25 | 1996-01-25 | Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5948668A (cs) |
EP (1) | EP0871718B1 (cs) |
JP (1) | JP4250716B2 (cs) |
KR (1) | KR100566136B1 (cs) |
CN (1) | CN1144874C (cs) |
AT (1) | ATE358717T1 (cs) |
AU (1) | AU698889B2 (cs) |
BR (1) | BR9606795A (cs) |
CA (1) | CA2210242C (cs) |
CZ (1) | CZ292541B6 (cs) |
DE (1) | DE69637011T2 (cs) |
DK (1) | DK0871718T3 (cs) |
ES (1) | ES2284167T3 (cs) |
HK (1) | HK1014986A1 (cs) |
HU (1) | HU225673B1 (cs) |
IL (1) | IL116696A (cs) |
MX (1) | MX9705279A (cs) |
NZ (1) | NZ302874A (cs) |
PL (1) | PL183228B1 (cs) |
PT (1) | PT871718E (cs) |
WO (1) | WO1996023064A1 (cs) |
ZA (1) | ZA96515B (cs) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR19990036383A (ko) | 1995-08-16 | 1999-05-25 | 크로우 캐씨 엘 | 화학적 화합물 |
CN1896231B (zh) | 1998-08-06 | 2012-09-05 | 山景药品公司 | 分离四聚体尿酸氧化酶的方法 |
US20040117863A1 (en) * | 1998-09-18 | 2004-06-17 | Edge Michael D. | Transgenically produced fusion proteins |
DE19915938A1 (de) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Aventis Pharma Gmbh | Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung |
JP2003509040A (ja) * | 1999-09-17 | 2003-03-11 | ジェンジム トランスジェニックス コーポレイション | 遺伝子導入により産生された融合タンパク質 |
EP1632575B1 (en) * | 1999-09-29 | 2009-01-28 | Lexicon Pharmaceuticals, Inc. | Human carboxypeptidases and polynucleotides encoding the same |
JP2003512027A (ja) | 1999-09-29 | 2003-04-02 | レキシコン・ジェネティクス・インコーポレーテッド | 新規ヒトカルボキシペプチダーゼおよびそれをコードするポリヌクレオチド |
AU2001229253A1 (en) * | 2000-01-12 | 2001-07-24 | Eli Lilly And Company | Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity |
DE602004025192D1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung |
EP1538203B1 (en) * | 2003-12-05 | 2010-01-20 | Roche Diagnostics GmbH | Recombinantly expressed carboxypeptidase B and purification thereof |
PL1794294T3 (pl) * | 2004-09-27 | 2011-12-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Rekombinowana karboksypeptydaza b |
US8148123B2 (en) | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
US9534013B2 (en) | 2006-04-12 | 2017-01-03 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Purification of proteins with cationic surfactant |
CA2604399A1 (en) | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Variant forms of urate oxidase and use thereof |
US20080159976A1 (en) * | 2005-04-11 | 2008-07-03 | Jacob Hartman | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
BRPI0612942A2 (pt) | 2005-04-11 | 2012-10-09 | Savient Pharmaceuticals Inc | forma variante de oxidase de urato e uso do mesmo |
EP1883425A1 (en) * | 2005-05-23 | 2008-02-06 | Universite De Geneve | Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant |
CN101058805B (zh) * | 2007-03-21 | 2011-09-07 | 北京贯虹科技有限公司 | 突变羧肽酶原b及突变羧肽酶b的生产方法 |
US8993714B2 (en) * | 2007-10-26 | 2015-03-31 | Imiplex Llc | Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof |
US9102526B2 (en) | 2008-08-12 | 2015-08-11 | Imiplex Llc | Node polypeptides for nanostructure assembly |
WO2010132363A1 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Imiplex Llc | Method of protein nanostructure fabrication |
EP3482768A1 (en) | 2009-06-25 | 2019-05-15 | Horizon Pharma Rheumatology LLC | Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy |
CN101967467B (zh) * | 2009-07-28 | 2012-11-14 | 上海雅心生物技术有限公司 | 一种高稳定性的重组羧肽酶b的生产及应用 |
US11918624B2 (en) * | 2020-06-10 | 2024-03-05 | Kelsius Laboratories LLC | Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK124483B (da) * | 1967-12-04 | 1972-10-23 | Bayer Ag | Fremgangsmåde til rensning af carboxypeptidase B. |
US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
HU190129B (en) * | 1983-07-11 | 1986-08-28 | Reanal Finomvegyszergyar,Hu | Process for the isolation of carboxypeptidase b enzyme from mammal pancreas |
US5206161A (en) * | 1991-02-01 | 1993-04-27 | Genentech, Inc. | Human plasma carboxypeptidase B |
FR2692907B1 (fr) * | 1992-06-25 | 1995-06-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation. |
JP3472587B2 (ja) * | 1992-08-28 | 2003-12-02 | アベンティス ファーマ株式会社 | 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法 |
JPH09505998A (ja) * | 1993-11-16 | 1997-06-17 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | ブタ膵臓カルボキシペプチダーゼbをコードするdna配列 |
-
1996
- 1996-01-08 IL IL11669696A patent/IL116696A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-01-23 ZA ZA96515A patent/ZA96515B/xx unknown
- 1996-01-25 WO PCT/US1996/000995 patent/WO1996023064A1/en active IP Right Grant
- 1996-01-25 HU HU9800091A patent/HU225673B1/hu unknown
- 1996-01-25 AT AT96905218T patent/ATE358717T1/de active
- 1996-01-25 CA CA2210242A patent/CA2210242C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 KR KR1019970705046A patent/KR100566136B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-25 PL PL96321499A patent/PL183228B1/pl unknown
- 1996-01-25 DK DK96905218T patent/DK0871718T3/da active
- 1996-01-25 CZ CZ19972258A patent/CZ292541B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-25 JP JP52300096A patent/JP4250716B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 ES ES96905218T patent/ES2284167T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 NZ NZ302874A patent/NZ302874A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-01-25 AU AU49034/96A patent/AU698889B2/en not_active Expired
- 1996-01-25 CN CNB961923679A patent/CN1144874C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 EP EP96905218A patent/EP0871718B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 PT PT96905218T patent/PT871718E/pt unknown
- 1996-01-25 DE DE69637011T patent/DE69637011T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-25 BR BR9606795A patent/BR9606795A/pt not_active Application Discontinuation
-
1997
- 1997-01-13 US US08/782,760 patent/US5948668A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 MX MX9705279A patent/MX9705279A/es unknown
-
1998
- 1998-12-30 HK HK98119240A patent/HK1014986A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ302874A (en) | 1998-11-25 |
KR100566136B1 (ko) | 2006-11-10 |
CN1144874C (zh) | 2004-04-07 |
JPH11503002A (ja) | 1999-03-23 |
HUP9800091A3 (en) | 2004-03-29 |
EP0871718A1 (en) | 1998-10-21 |
WO1996023064A1 (en) | 1996-08-01 |
CA2210242C (en) | 2010-04-27 |
JP4250716B2 (ja) | 2009-04-08 |
KR19980701652A (ko) | 1998-06-25 |
AU698889B2 (en) | 1998-11-12 |
IL116696A0 (en) | 1996-05-14 |
US5948668A (en) | 1999-09-07 |
DE69637011D1 (de) | 2007-05-16 |
EP0871718B1 (en) | 2007-04-04 |
IL116696A (en) | 1999-08-17 |
HK1014986A1 (en) | 1999-10-08 |
HUP9800091A2 (hu) | 1998-05-28 |
DK0871718T3 (da) | 2007-07-02 |
ZA96515B (en) | 1996-08-15 |
MX9705279A (es) | 1998-06-30 |
PT871718E (pt) | 2007-06-26 |
PL183228B1 (pl) | 2002-06-28 |
DE69637011T2 (de) | 2007-12-13 |
CN1177377A (zh) | 1998-03-25 |
CA2210242A1 (en) | 1996-08-01 |
HU225673B1 (en) | 2007-06-28 |
EP0871718A4 (en) | 2000-06-07 |
AU4903496A (en) | 1996-08-14 |
PL321499A1 (en) | 1997-12-08 |
ATE358717T1 (de) | 2007-04-15 |
ES2284167T3 (es) | 2007-11-01 |
BR9606795A (pt) | 1997-12-30 |
CZ225897A3 (cs) | 1998-10-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ292541B6 (cs) | Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy | |
Verhaert et al. | Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis | |
EP0746611B1 (en) | Method for increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by (saccharomyces cerevisiae) | |
CA2218880A1 (en) | Process for preparing anti-obesity protein | |
US5948659A (en) | Recombinant fructosyl amino acid oxidase | |
HU215948B (hu) | Eljárás urát-oxidáz aktivitással rendelkező protein, azt kódoló gén, expressziós vektor és mikroorganizmusok előállítására | |
US5496719A (en) | Polypeptide from Humicola insolens possessing protein disulfide isomerase activity gene encoding the same | |
AU669735B2 (en) | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase | |
Teichmann et al. | Cloning and biochemical characterization of an anionic peroxidase from Zea mays | |
KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 b를 사용한 인슐린의 제조 | |
US6723543B1 (en) | Mutant kanamycin nucleotidyltransferases from S. aureus | |
JPH06225775A (ja) | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 | |
KR20000069395A (ko) | 트리파레독신, 발현 플라스미드, 제조방법, 용도, 시험 시스템및 의약 제제 | |
KR19990067302A (ko) | 벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도 | |
JP3257119B2 (ja) | プロティンジスルフィドイソメラーゼ活性物質およびその製造方法 | |
JPH0723787A (ja) | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 | |
TEICHMANN et al. | from zyxwvutsrqponmlkji | |
MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use | |
JPH1175853A (ja) | 銅の利用性を制御するホメオスタシスタンパク質遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160125 |