CZ292541B6 - Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy - Google Patents

Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ292541B6
CZ292541B6 CZ19972258A CZ225897A CZ292541B6 CZ 292541 B6 CZ292541 B6 CZ 292541B6 CZ 19972258 A CZ19972258 A CZ 19972258A CZ 225897 A CZ225897 A CZ 225897A CZ 292541 B6 CZ292541 B6 CZ 292541B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
procarboxypeptidase
carboxypeptidase
cpb
procpb
enzymatically active
Prior art date
Application number
CZ19972258A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ225897A3 (cs
Inventor
Jacob Hartman
Netta Fulga
Simona Mendelovitch
Marian Gorecki
Original Assignee
Savient Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Savient Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Savient Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ225897A3 publication Critical patent/CZ225897A3/cs
Publication of CZ292541B6 publication Critical patent/CZ292541B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B, při kterém se rekombinantní hostitelská buňka obsahující DNA kódující prokarboxypeptidázu B zpracuje tak, že DNA řídí expresi prokarboxypeptidázy B; takto exprimovaná prokarboxypeptidáza B se solubilizuje; pH hodnota solubilizované prokarboxypeptidázy B se nastaví na hodnotu 8 až 11, při které se prokarboxypeptidáza B sbalí; načež se sbalená prokarboxypeptidáza B podrobí enzymatickému štěpení, při kterém se vytvoří enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B; a tato enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se čistí. Rovněž se týká purifikované enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B prosté všech dalších látek savčího původu.ŕ

Description

Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy
Oblast techniky
Vynález se týká přípravy enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidázy B.
Dosavadní stav techniky
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidáza B [Peptidyl-L-lysin(L-arginin)hydrolyza EC 3.4.17.2] je pankreatickou exopeptidázou obsahující zinek, která z peptidů specificky odštěpuje C-koncovou Arg, Lys nebo Om (Barrett a McDonald (175), Mammilian proteases, aGlossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida.; Coli a kol. (1991), The Embo J. 10. l.až 9).
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidáza B je produktem prekurzorového proteinu, preprokarboxypeptidázy B, obsahujícího N-koncový fragment 108 aminokyselin, který obsahuje signální sekvenci (13 aminokyselin) a aktivační peptid (95 aminokyselin). Preprokarboxypeptidáza B je enzymaticky inaktivní.
Během transportu preprokarboxypeptidázy B do endoplazmatického retikula se odštěpí signální peptid, v důsledku čehož se enzymaticky inaktivní preprokarboxypeptidáza B vyloučí z buňky. Enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se následně vytvoří odštěpením aktivačního peptidu trypsinem (Aviles a kol. (1985), Biochem. And Bioph. Res. Comm, 130: 97 až 103.
Karboxypeotidáza B dospělé krysy obsahuje 307 aminokyselin (Clauser a kol. (1988). J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845) a má zdánlivou průměrnou molekulovou hmotnost 35 kD. Karboxypeptidáza B rovněž obsahuje 7 cysteinových zbytků, z nichž 6 je spárováno přes S-S vazby.
Karboxypeptidáza B má jak široké komerční uplatnění, tak uplatnění při výzkumech. Používá se například při výrobě inzulínu a dalších biologicky účinných polypeptidů a při proteinové sekvenční analýze.
Komerčně dostupná karboxypeptidáza B izolovaná ze slinivky prasete je velmi drahá a není zcela zbavena dalších proteáz.
Byla zveřejněna parciální aminokyselinová sekvence prasečí prekurzorové preprokarboxypeptidázy B a kompletní aminokyselinová sekvence hovězí karboxypeptidázy B (Burgos a kol. (1991), Biochemistry 30: 4082-4089; resp. Titáni a kol. (1975), P.N.A.S. 72: 1666-1670). Rovněž již byla publikována kompletní nukleová sekvence krysího genu a lidská cDNA (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17745).
Yomamoto a kol. ((1991), J. Bio. Chem. 267: 2575-2581) popsal rekombinantní expresi enzymaticky inaktivní lidské preprokarboxypeptidázy B, postrádající prvních 11 aminokyselin aktivačního peptidu.
Rovněž byla zaznamenána rekombinantní exprese enzymaticky inaktivního β-galaktosidázopreprokarboxypeptidázového B fúzního proteinu, jehož preprokarboxypeptidáza postrádá prvních jedenáct aminokyselin aktivovaného peptidu.
Evropská patentová přihláška EP 588 118 A2 popisuje z kosti odvozený karboxypeptidáze podobný protein, označený jako OSF-5. Dá se usuzovat, že OSF-5 působí jako adhezívní
-1 CZ 292541 B6 molekula nebo růstový faktor a že může být použit jako účinná látka pro ošetření metabolických onemocnění kostí. Tato přihláška však neuvádí žádnou skutečnou funkci nebo aktivaci OSR—5 a ani nepopisuje produkci přirozeně se vyskytujícího nebo rekombinantně biologicky aktivovaného protienu.
Cílem vynálezu je tedy poskytnout způsob přípravy rekombinantní vysoce čisté enzymaticky aktivní a levné karboxypeptidázy B. Tato příprava enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B nebyla dosud popsána a proto lze zde uvedený způsob přípravy považovat za nový.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu přípravy enzymaticky aktivní karboxypeptidázy B, při kterém se rekombinantní hostitelská buňka obsahující DNA kódující prokarboxypeptidázu B zpracuje tak, že DNA řídi expresi prokarboxypeptidázy B; takto exprimovaná prokarboxypeptidáza B se solubilizuje; pH hodnota solubilizované prokarboxypeptidázy B se nastaví na hodnotu 8 až 11, při které se prokarboxypeptidáza B sbalí; načež se sbalená prokarboxypeptidáza B podrobí enzymatickému štěpeni, při kterém se vytvoří enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B; a tato enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se čistí.
Předmětem vynálezu je rovněž samotná purifíkovaná enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B prostá všech dalších látek savčího původu.
Stručný popis obrázků
Restrikční mapy plazmidů znázorněné na obrázcích 2 a 3 neidentifikují všechna restrikční místa přítomná na plazmidech. Nicméně ta biologicky významná restrikční místa, která jsou nezbytná pro úplné pochopení vynálezu jsou znázorněna.
Obr. 1 znázorňuje aminokyselinu a odpovídající cDNA nukleotidovou sekvenci pankreatické krysí preprokarboxypeptidázy B.
Tento obrázek tedy ukazuje cDNA nukleotidovou sekvenci a odpovídající aminokyselinovou sekvenci panteatické krysí preprokarboxypeptidázy B, zahrnující nukleotidovou sekvenci zralé karboxypeptidázy B a aktivační peptidovou nukleotidovou sekvenci. DNA sekvence se liší od DNA sekvence publikované Clauserem a kol. ((1988), J.Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845) čtyřmi nukleotidy, z nichž mají dva mají za následek změnu aminokyseliny: Lys14 -> Asn a Arg142 -> Asp.
DNA Nukleotidové sekvence tří primerů, používaných během klonování, (příklad 1) jsou rovněž znázorněny (velkými písmeny): preprokarboxypeptidázový B 5’-konečný primer, zralý karboxypeptidázový B 5'-koncový primer a karboxypeptidázový B 3'-koncový primer.
Očíslování aminokyselin se provedlo v souladu s homologií karboxypeptidázy A odvozené z hovězí slinivky (Bradshaw a kol. (1969), P.N.A.S. 63: 1389-1394; Gardell a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17828-17836), přičemž první aminokyselina (Ala) zralé krysí karboxypeptidázy B má číslo 4. Hvězdička (*) označuje další aminokyselinu (Leu), kterou má krysí karboxypeptidáza B navíc oproti karboxypeptidáze A.
Obr. 2 znázorňuje konstrukci plazmidového pCPGB a plazmidového pCPB-C.
Plazmidový pABN se digeroval Βα/nHI a Nco. Fragment tvořený 2500 bp se izoloval a ligoval do BamH a Nco\ 940 bp cDNA fragmentu karboxypeptidázy B (získaného způsobem popsaným
-2CZ 292541 B6 v příkladu 1). Nově získaný plazmid byl označen jako pCPB a použil se pro transformaci E. coli
4300.
Plazmid pCPB se digeroval BamHl a Ndel za účelem izolace většího fragmentu. Za účelem izolovat větší fragment se plazmid pCPB digeroval rovněž Asel a Scal.
Smísením dvou velkých fragmentů s 5'-koncovým fosforylovaným oligonukleotidem připraveným pro místně specifickou mutagenezi (příklad 1) a s polymerázoligázovým pufrem (5x pufr: 32,5 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM MgCl2, 5 mM 2-merkaptoethanol, 0,5M NaCl) (Morinaga a kol. (1984), Bio-Technology July: 636-639) se vytvořil heteroduplex. Denaturace DNA řetězců se dosáhlo vařením směsi, načež postupné ochlazení směsi DNA opět denaturovalo. Reakční produkty se použily pro transformaci E. coli 1645 elektroporací. Transformanty se screenovaly růstem LB agaru, který obsahoval ampicilin, a in šitu diferenciální hybridizací kolonií s 5'-koncovým fosforylovaným oligonukleotidem připraveným pro mutagenezi.
Z pozitivních kolonií se extrahoval plazmid DNA. pro restrikční enzymové analýze a DNA nukleotidovém sekvencování se zvolil klon obsahující mutantní Spěl místo. Nově získaný plazmid, který se označil jako pCPB-C, kódoval karboxypeptidázu B s mutací z cysteinu na serin na aminokyselině 290. Plazmid pCPB-C se použil pro tranformaci E. coli 4300.
Obr. 3 znázorňuje konstrukci plazmidu pProCPB a plazmidu pXProCPB
Preprokarboxypeptidázová B cDNA, získaná způsobem popsaným v příkladu 1, se odštěpila pomocí Ndel a Clal, čímž se izoloval 470 bp dlouhý fragment, který kódoval aktivační peptid a část karboxypeptidázy B.
Odštěpením plazmidu pCPB-C pomocí BamHl a Clal se izoloval 760 bp dlouhý fragment, který kódoval zbytek karboxypeptidázy B, zahrnující Cys290 -> Ser mutaci.
Odštěpením plazmidu pAB pomoci NdeHl a BamH\ se izoloval 2500 bp fragment, který kódoval všechny prvky nezbytné pro expresi v bakterii (viz příklad 1).
Tři výše uvedené fragmenty se ligovaly a nově získaný plazmid se označil jako pProCPB-C.
Plazmid pROCPB-C a pCPB se odštěpily pomocí Stul a Xhól. Z plazmidu pProCPB-C se izolovat 3700 bp fragment, kódující všechny prvky, nezbytné pro expresi v bakterii (příklad 1), celý aktivační peptid a část karboxypeptidázy B.
Z plazmidu pCPB se izoloval 440 bp fragment kódující zbytek karboxypeptidázy B.
Tyto dva fragmenty se ligovaly a nově vytvořený plazmid se označil jako pXProCPB.
Obr. 4 znázorňuje srovnání aktivity rekombinantní karboxypeptidázy B a přirozeně se vyskytující karboxypeptidázy B.
Aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B (Sigma) a rekombinantní karboxypeptidázy B, připravené způsobem popsaným v příkladu 5, se stanovila Folkovou metodou (Folk) (1970), Methods in Enzymology 19. 504-508) za použití Hippuryl-L-Arg substrátu. Vo katalytické reakce se měřilo za použití koncentrací substrátu, v rozmezí od 0,025 mM do 1,0 mM:
Aby se splnily požadavky budapešťské mezinárodní dohody o ukládání mikroorganizmů pro účely patentového řízení, byl plazmid pXProCPB 4. srpna 1994 uložen v bakterii E. coli. v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod ATTC depozitním číslem 69673. Výraz „CPB“, jak je zde použit, znamená polypeptid vyrobený
-3CZ 292541 Β6 rekombinantními DNA metodami nebo jinými slovy polypeptid, který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako libovolná přirozené se vyskytující savčí karboxypeptidáza B. Výraz „CPB“ tedy zahrnuje polypeptidy, které se liší jednou nebo více aminokyselinami, výhodně ne více než přibližně 10 aminokyselinami, od přirozeně se vyskytujících karboxypeptidáz B.
Výraz „ProCPB“, jak je zde použit, znamená polypeptid připravený rekombinantními DNA metodami nebo polypeptid, který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako libovolná přirozeně se vyskytující savčí prokarboxypeptidáza B. Výraz „ProCPB“ tedy zahrnuje polypeptidy, které se liší jednou nebo více aminokyselinami, výhodně ne více než přibližně 10 aminokyselinami, od přirozeně se vyskytujících prokarboxypeptidáz B.
Odborníci v daném oboru mohou snadno určit, které aminokyselinové zbytky lze přidat, vynechat nebo substituovat (včetně toho, jakými aminokyselinami lze tyto substituce realizovat) za použití dobře známých metod, zahrnujících například konvenční metody pro navrhování a přípravu DNA sekvencí kódujících bakteriální expresi polypeptidů, modifikaci cDNA a genomových sekvencí technikami místně směrované mutageneze, konstrukci rekombinantních proteinů a expresních vektorů, bakteriální expresi polypeptidů a měření biochemické aktivity polypeptidů za použití běžných biochemických testů.
Výraz „enzymaticky aktivní“ CPB, jak je zde použit, znamená CPB, která vykazuje biologickou aktivitu přirozeně se vyskytující savčí karboxypeptidázy B. Pro účely této definice „biologická aktivita“ přirozeně se vyskytující karboxypeptidázy B znamená schopnost karboxypeptidázy B z peptidu specificky odstraňovat C-koncový arginin, lysin nebo omithin.
V podstatě stejná aminokyselinová sekvence je zde definována jako sekvence zahrnující substituce a/nebo delece a/nebo adice aminokyselin v aminokyselinové sekvenci, které mohou zahrnovat až deset aminokyselinových zbytků homologových nebo ekvivalentních skupin a které jsou popsány například Lehningerem, Biochemistiy, 2. vydání, Worth Pub., N. Y. (1975), kapitola 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL tisk oxfordské univerzity, Anglie (1989); a Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure sv. 5, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), kapitola 9. Tyto substituce jsou odborníkům v daném oboru známy.
U výhodného provedení může DNA, kódující ProCPB nebo CPB, pocházet z člověka, krysy, skotu nebo prasete. Tuto DNA lze získat reverzní transkripcí, reakcí polymerázového řetězce (PCR), syntetickými nebo semisyntetickými prostředky nebo více než jednou z těchto metod, případně dalších, v daném oboru známých, metod.
DNA kódující ProCPB nebo CPB polypeptid lze mutovat způsoby známými v daném oboru, viz například Bauer a kol. (1985), Gene 37: 73-81. Mutovaná sekvence může být zavedena do vhodných expresních vektorů, které, jak je zde popsáno, jsou zavedeny do buněk, které se následně ošetří tak, aby mutovaná dna řídila expresi polypeptidů.
Odborníkům v daném oboru bude zřejmé, že plazmid, uložený v souvislosti s touto přihláškou, lze snadno upravit známými technikami (například místně směrovanou mutagenezí nebo vložením vazebných činidel) tak, aby kódoval expresi polypeptidů. Tyto techniky jsou popsány například v publikaci autorů Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Příkladem vektorů, které lze použít pro exprimaci nukleové kyseliny, kódující CPB nebo ProCPB, jsou viry, jakými jsou bakteriální viry, například bakteriofágy (například fág lambda), kosmidy, plazmidy a další vektory. cDNA, kódující ProCPB nebo CPB, se vloží do vhodných vektorů způsoby známými v oboru. Například použitím konvenční restrikce endonukleázovým enzymových míst mohou být inzerty a vektor DNA odštěpeny tak, že dojde k vytvoření vzájemně
-4CZ 292541 B6 komplementárních konců, jejichž bazické páry se následně společně ligují DNA ligázou. Alternativně lze syntetická vazebná činidla, nesoucí bazické sekvence, které jsou komplementární k restrikčnímu místu ve vektorové DNA, ligovat na inzertní DNA, která se následně digeruje restrikčním enzymem. Další prostředky jsou rovněž dostupné.
Vektory podle vynálezu, které obsahují sekvenci, kódující ProCPB nebo CPB, lze upravit pro expresi v celé řadě prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk, např. bakteriích, kvasinkách, houbách, insekticidních buňkách nebo dalších savčích buňkách, například CHO, kuřecího embrya, fibroblastu, ledvin nebo dalších známých buněčných linií.
Tyto vektory dále obsahují regulační prvky, které jsou nezbytné pro expresi klonovaného genu v hostitelské buňce v určité poloze vzhledem k nukleové kyselině, kódující v odezvě na tuto expresi ProCPB nebo CPB.
Regulační prvky, potřebné pro expresi, zahrnující sekvence promotoru a operátoru a ribozomové vazebné místo. Vektor bakteriální exprese může například zahrnovat promotor-operátorovou sekvenci, jakou je například XPLOL, nebo deo promotory. Pro iniciaci translace lze použít XCn nebo deo ribozomová vazebná místa. Tyto vektory lze získat komerčně nebo sestavit z popsaných sekvencí způsoby, známými v daném oboru. Související patent US 4 831 120, udělený 16. května 20 1989 a patent US 5 143 836, podaný 1. září 1992, popisují například způsoby, které se týkají XPL promotoru, a evropská patentová přihláška EP 303 972, publikovaná 22. února 1989, popisuje způsoby, týkající se deo promotoru. Rovněž mohou být přítomny další vhodné prvky, například represory a zesilovače transkripce. Odborníci v daném oboru jsou seznámeni s tím, jakým způsobem regulační prvky vhodné pro různé expresní systémy použít.
Expresní plazmidy podle vynálezu obsahují vhodné regulační prvky, které se nacházejí uvnitř plazmidu v takové poloze vhledem kDNA, kódující ProCPB nebo CPB polypeptid, ve které způsobí expresi ProCPB nebo CPB polypeptidu ve vhodné hostitelské buňce. Těmito regulačními prvky jsou promotory a operátory, např. deo PiP2 a XPL, a ribozomová vazebná místa, například 30 deo a Cn, a rovněž represory a zesilovače transkripce.
U výhodných provedení vynálezu jsou regulační prvky umístěny v blízkosti DNA kódující ProCPVB nebo CPB, a to před touto DNA.
Plazmidy podle vynálezu rovněž obsahují ATG iniciační kodon. DNA kódující ProCPB nebo CPB je ve fázi s ATG iniciační kodonem.
Plazmidy podle vynálezu rovněž zahrnují DNA sekvenci, obsahující počátek replikace z bakteriálního plazmidu, schopného autonomní replikace v hostitelské buňce. Vhodné počátky replika40 ce lze získat z celé řady zdrojů, například z plazmidu pBR322 (ATCC depozitní číslo 37017).
Plazmidy podle vynálezu rovněž zahrnují DNA sekvenci, která obsahuje gen související s volitelným nebo identifikovatelným fenotypovým znakem, který se projeví, jakmile je plazmid přítomen v hostitelské buňce, jako drogově rezistentní gen, například rezistencí proti ampicilinu, 45 chloramfenicolu nebo tetracyclinu.
Výhodnými bakteriálními hostitelskými buňkami jsou E. coli buňky. Příkladem vhodné E. coli buňky je kmen 4300, ale jako hostitelské buňky pro plazmidy je možné použít i další kmeny E coli a další bakterie.
Bakteriemi použitými jako hostitelské buňky mohou být libovolné bakteriální kmeny včetně auxotrofních (například A1645), prototrofních (například A4255) a lytických kmenů; F+ a F~ kmenů; kmenů obsahujících Cl857 represorovou sekvenci Xprofágu (například A1645 aA4255) a kmenů, postrádajících deo represory a/nebo deo gen (viz evropská patentová
-5CZ 292541 B6 přihláška EP 0 303 972, publikovaná 22. února 1989). Bakteriální kmen E. coli 4300 byl uložen pod ATCC depozitním číslem 69363.
Všechny výše popsané E. coli hostitelské bakteriální kmeny mohou být „ošetřeny“ uvedenými plazmidy, které jsou v nich obsaženy způsoby známými v daném oboru, například ethidiumbromidovou metodou, popsanou R.P. Novickem v Bacteriol, Review 33, 210 (1969).
Vynález poskytuje způsob přípravy enzymaticky aktivní CPB, který zahrnuje ošetření rekombinantní buňky' obsahující DNA, kódující ProCPB, které způsobí, že DNA směruje expresi ProCPB; izolaci takto exprimované ProCPB z buňky; ošetření izolované ProCPB za podmínek umožňujících sbalování ProCPB, vystavení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení za vzniku enzymaticky aktivní CPB a čištění enzymaticky aktivní CPB.
U výhodného provedení zahrnuje izolaci ProCPB z rekombinantní buňky porušení buněčné stěny rekombinantní buňky nebo jejího fragmentu, které vede ke vzniku lyzátu, izolaci intracelulámí sraženiny z lyzátu odstřeďováním a rozpuštění intracelulámí sraženiny ve vhodném pufru. U dalšího provedení zahrnuje ošetření izolovaného ProCPB inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 h až 24 h při pH přibližně 9 až 9,5.
U ještě dalšího provedení zahrnuje ošetření izolovaného ProCPB inkubaci ProCPB při pokojové teplotě po dobu přibližně 20 h až 24 h při pH přibližně 9 až 9,5 v přítomnosti ZnCU, zoxidovaného glutathionu (GSSG) a redukovaného glutathionu (GSH). Dá se předpokládat, že toto podrobení sbalené ProCPB enzymatickému štěpení bude zahrnovat nastavení pH na přibližně 8,5 a přibližně 60min štěpení ProCPB trypsinem při 37 °C.
Dále se dá předpokládat, že čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografii.
Pro tyto účely lze zvolit libovolnou iontoměničovou chromatografíckou metodu. Výhodná je slabá iontoměničová kolona, například DEAE Sepharose. Slabé iontoměničové sloupce mají zpravidla jako funkční skupinu terciární amin (diethylaminoethyl), ale rovněž lze použít kvartérní aminoethyl nebo kvartémí amin.
Jako matrici lze použít matrici na bázi anorganických sloučenin, syntetických pryskyřic, polysacharidů nebo organických polymerů. Vhodnými matricemi jsou matrice na bázi agarózy, celulózy, triskrylu, dextranu, skleněných kuliček, oxiran-akrylových kuliček, akrylamidu, kopolymerů agarózy a polyakrylamidu nebo hydrofilního vinylového polymeru.
Rovněž se dá předpokládat, že čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografii a hydrofobní chromatografii.
Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že lze použít libovolný hydrofobní sloupec. Výhodným sloupcem je fenylsefarózový sloupec. Funkční skupinou může být fenyl, benzyl, oktyl nebo butyl. Matricí může být libovolná výše diskutovaná matrice.
U dalšího výhodného provedení čištění enzymaticky aktivní CPB zahrnuje iontoměničovou chromatografii, hydrofobní chromatografii a diafiltraci.
U zvláště výhodného provedení je ProCPB extrahována plazmidem pXProCPB, uloženým pro ATCC depozitním číslem 69673.
Vynález dále poskytuje enzymaticky aktivní CPB, prostou ostatních látek savčího původu.
-6CZ 292541 B6
Příklady provedení vynálezu
Níže uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky. Příklady nezahrnují detailní popisy konvenčních metod, používaných pro konstrukci vektorů, vložení genů kódujících polypeptidy do těchto vektorů nebo zavádění výsledných plazmidů do hostitelských buněk. Příklady rovněž nezahrnují podrobní popis konvenčních metod, používaných pro testování polypeptidů, připravených těmito hostitelskými vektorovými systémy. Tyto metody jsou odborníkům v daném oboru dobře známy a jsou popsány v celé řadě publikací, které jsou v předložené přihlášce zmíněny formou odkazů.
Příklad 1
Klonování krysí karboxypeptidázové B cDNA pomocí PCR
I. DNA amplifíkace
Ze slinivky Sprague-Dawleyových krys se extrahovala kompletní RNA. Z této kompletní RNA se izolovala 40 pg póly A' mRNA (pomocí sloupce oligo dT-Celulóze). Takto získaný alikvotní podíl (10 pg) polyA+ mRNA se použil jako matrice při reverzní transkripční reakci, prováděné v přítomnosti 3'-koncového primeru syntetické karboxypeptidázy B (5) (obrázek 1).
Po ukončení syntézy jednořetězcové komplementární DNA (ss-cDNA), se mRNA vysrážela ethanolem. Alikvotní ss-cDNA se následně podrobila PCR amplifikaci:
Pro amplifikaci DNA kódující CPB (940 bp) se použily syntetický primer, odpovídající 3'-konci karboxypeptidázy B, a syntetický primer, odpovídající 5'-konci zralé karboxypeptidázy B (obrázek 1).
Pro amplifikaci DNA kódující ProCPB (1230 bp) se použily syntetický primer, odpovídající 3'-konci karboxypeptidázy B, a syntetický primer, odpovídající 5'-konci prokarboxypeptidázy B (obr. 1).
PCR amplifikační podmínky byly následující:
1. Příměrový 3 '-konec 2 Pg
2. Primerový 5'-konec 2 pg
3. ss-cDNA 5 pl
4. Pufr:
dNTP's 0,2 mM
Tris-HCL 50 mM
KC1 20 mM
MgCl2 8 mM
5. Tag Polymeráza I 5 jednotek
Celkový objem: 100 pl
6. Minerální olej (proti odpařování) 50 pl
7. 1 cyklus χ [Γ při 92 °C; 2' při 40 °C: ; a 4' při 72 °C]
8. 35 cyklů χ [Γ při 92 °C; 2' při 53 °C; a 3' při 72 °C]
9. 1 cyklus χ [Γ při 92 °C; 2'při 53 °C; a 15' při 72 °CJ.
Produkty PCR amplifíkace se analyzovaly na 1% agarózovém gelu. Neamplifikované kontrolní vzorky a velikostní markéry byly rovněž přítomny. Bylo možné pozorovat dva distinktní pásy přibližně 940 bp a 1230 bp. 940 bp pás reprezentoval CPB nukleotidovou sekvenci a 1230 bp pás
-7CZ 292541 B6 reprezentoval ProCPG nukleotidovou sekvenci, který zahrnoval aktivační peptidovou nukleotidovou sekvenci.
Po ukončení PCR amplifikace se DNA vyčistila z reakční směsi chloroformovou a fenolovou extrakcí a vysrážením octanem amonným a izopropanolem.
II. Plazmid pCPB
Plazmid pCPB (obr. 2) se konstruoval digerací CPB cDNA pomocí BamH\ a Ncol. Po následné genové purifikaci se fragment subklonoval do BamHl a Ncol fragmentu plazmidu pABN o délce 2500 bp, který kódoval následující prvky, nezbytné pro expresi v bakterii:
(i) XPL promotor, umožňující genovou expresi zE. coli buněk indukcí, tj. posunem teploty z 30 °C na teplotu 42 °C, která inaktivuje teplotně senzitivní represor cl857;
(ii) deo ribozomové vazebné místo (rbs);
(iii) trp transkripční terminátor (8);
(iv) ampicilinově rezistentní gen z plazmidu pBR322; a (v) pBR322 počátek replikace.
III. Plazmidová pCPB-C
Přirozeně se vyskytující karboxypeptidázová B aminokyselinová sekvence obsahuje 7 cysteinových zbytků, z nichž šest je napárována na S-S vazby a jeden z nich (Cys290) je volným cysteinovým zbytkem (Barrett a McDonald (1985), Mammlian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida). Dá se předpokládat, že tento volný cysteinový zbytek může v průběhu sbalování rekombinantní CPB tvořit nežádoucí intermolekulámí nebo intramolekulámí S-S vazby. Cys290 se nenachází ani v katalytickém místě, ani v substrátovém vazebném místě karboxypeptidázy B a zdánlivě není potřebný pro enzymatickou aktivitu tohoto enzymu (Barrett a McDonald (1985), Mammilian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando, Florida.; Coli a kol. (1991), The Embo J., 10.1 až 9,). Proto bylo rozhodnuto, že se vyrobí CPB, ve které bude tento cystein nahrazen serinem a takto připravená CPB se označila jako CPB-C.
Připravil se 5'-koncový fosforylovaný oligonukleotid, obsahující 2-nukleotidové substituce:
Thr Cys
... .ACC TGT.... původní sekvence v karboxypeptidáze B
Thr Ser
5' ATCC CGC CAG ACT AGT GAG GAG ACA ATG 3' mutantní sekvence
Spěl
Tento oligonukleotid se použil při substituci nukleotidové sekvence, kódující Cys290 nukleotidovou sekvencí, kódující serin v plazmidové pCPB místně specifickou mutagenezí, která je znázorněna na obrázku 2 (Morinaga a kol. (1984), Bio-Technology July: 636-639). Nově získaný plazmid se označil jako pCPB-C.
-8CZ 292541 B6
IV. Plazmid pProCPB-C
Sestrojila se plazmidem značená pProCPB-C, nesoucí ProCPB-C nukleotidovou sekvenci 5 (obsahující Cys290 -> Ser mutaci] (viz obrázek 3), která se použila pro transformaci do hostitelských buněk E. coli 4300.
V. Plazmidová pXProCPB
Sestrojil se plazmid označený jako pXProCPB, obsahující ProCPB nukleotidovou sekvenci (obrázek 3), který se použil pro transformaci do hostitelských buněk E. coli 4300. Tento plazmid se uložil 4. srpna 1994 do sbírky ATCC pod ATCC depozitním číslem 69673.
Z plazmidů pCPB, pCPB-C, pXProCPB a pProCPB-C se připravila plazmidová DNA. K ověření 15 přítomnosti správných sekvencí se použila restrikční enzymová analýza plazmidové DNA a nukleové sekvencování.
Příklad 2
Fermentace, růstové podmínky a purifikace ProCPB a CPB
I. Zásobní kultury
Zásobní kultura E. coli 4300, ve které je přítomen plazmid pXProCPB, se nechala růst na LB médiu doplněném ampicillinem (100 pg/ml).
II. Inokulum
Inokulum se propagovalo ve 100 ml LB média, doplněného ampicillinem (100 pg/ml), při 30 °C, dokud buněčná koncentrace nedosáhla O.D.660 2,0.
Produkční médium (LB médium + ampicillin (100 pg/ml)) se naočkovalo, inkubovalo při 30 °C, provzdušnilo, míchalo a udržovalo při pH 7,2 přidáním amoniaku. Do kultury se během růstu 35 přidalo dvacet gramů glukózy. Po dosažení buněčné koncentrace O.D.660 12, se teplota zvýšila na teplotu 42 °C, která umožnila expresi ProCPB. Po 2 h buněčná koncentrace dosáhla O.D.66o 22 až 29 a bakterie se sklidily.
III. Čištění
ProCPB se exprimovala plazmidem pXProCPB, shromážděným v intracelulámí sraženině, která se izolovala následujícím postupem: 40 g (hmotnost za vlhka) koláče se suspendovalo ve 450 ml pufru, obsahujícího 1 mM PMSF (Sigma), 50 mM Tris-HCl, pH 8, lOmM EDTA a 2h ošetřovalo lysozymem (Sigma) do konečné koncentrace 50 pg/ml při 37 °C.
Do směsi, která se následně sonifikovala, se přidával Triton X-100 (Měrek) do konečné koncentrace 2 % a míchal 2 h při pokojové teplotě. Surová intracelulámí sraženina se peletovala odstřeďováním (frekvence otáčení 14 000 min'1,30 min, 4 °C) a promyla vodou.
Intracelulámí sraženina obsahující pro CPB se rozpustila v pufru B, obsahujícím 25 mM NaCl, 8M močoviny, 10 mM DTT, 20mM Bis-Tris pH 7. Roztok se chromatografoval na DEAESepharozovém rychloproudém sloupci, uvedeném do rovnovážného stavu v pufru B a protein se eluoval přibližně lOOmM NaCl v pufru B a ProCPB se vysrážela pomocí (NH^SOt při 40% nasycení při 0 °C.
-9CZ 292541 B6
Později se ukázalo, že enzymaticky aktivní CPB by se dal získat pouze přes produkci prekurzorového proteinu. Nejprve se podobným způsobem jako výše popsaná ProCPB připravily polypeptidy CPB a CPB-C. Stejně tak byla podobným způsobem připravená ProCPB. Použitými plazmidy byly pCPB, pCPB-C, resp. pProCPB-C (viz příklad 1). Růstové podmínky hostitelských buněk E. coli, které obsahovaly tyto plazmidy, a čištění polypeptidů byly v podstatě popsány výše v souvislosti s izolováním ProCPB z pufru, který se použil pro rozpuštění intracelulámí sraženiny, obsahující rekombinantní CPB nebo CPB-C, a který obsahoval 20mM ethanolaminu pH 9, lOmM DTT a 8M močoviny.
Je třeba poznamenat, že v tomto případě nebyly připravené a vyčištěné polypeptidy enzymaticky aktivní. Balení polypeptidů, které poskytuje enzymaticky účinné proteiny, je popsáno v příkladu 3.
Příklad 3
Balení a aktivace ProPCB-C
Způsobem popsaným v příkladu 2 se připravily polypeptidy CPB a CPB-C, které, jak se ukázalo, nebyly enzymaticky aktivní, běžné metody (popsané níže), které se použily pro balení polypeptidů, neposkytly enzymaticky aktivní protein.
Tento problém, spočívající v neschopnosti získat enzymaticky aktivní protein, vyřešilo vyvinutí alternativní metody, která zahrnuje expresi a balení prekurzorového proteinu po ošetření, odstraňujícím aktivní peptidovou část sbaleného prekurzorového proteinu.
Součástí tohoto alternativního postupu jsou následující kroky:
ProCPB-C připravená způsobem popsaným v příkladu 2, se rozpustila v koncentraci lOmg/ml v 8M močovině, 5mM HC1 a naředila na 1 mg/ml ve lOOmM glycinu, 0,2mM ZnCl2 při pH 9, 10 a 11. Tyto roztoky tvořily balicí roztoky.
Sbalení se dosáhlo 17h inkubací výše popsaných balicích roztoků při pokojové teplotě. V tomto stadiu neměla sbalená ProCPB-C ještě žádnou enzymatickou aktivitu (viz tabulka I).
Hodnota pH roztoku, obsahujícího sbalenou ProCPB-C, se následně nastavila přidáním HC1 přibližně na 8,5 a ošetřovala 30 min při 37 °C trypsinem (1:200 hmotn./hmotn.), v důsledku čehož došlo k odstranění aktivačního peptidu. Reakce se ukončila přidáním PMSF do konečné koncentrace 0,1 mM.
Enzymatická aktivita takto získané sbalené CPB-C se určila (tabulka I) Folkovou metodou (Folk (1970), methods in Enzymology 19: 504-508): Jedna jednotka aktivity (u) je definována jako množství enzymu, které katalyzuje hydrolýzu 1 pmol Hippuryl-L-Arg substrátu za 1 min při 25 °C a které způsobuje 0,12 zvýšení absorbance při 254 nm a 1 cm délky dráhy. Specifická aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B (Sigma) je 230 u/mg.
-10CZ 292541 B6
Tabulka I. Specifická aktivita proCPB-C (a z ní odvozené CPB-C) za různých podmínek
Reakce Specifická aktivita (u/mg)
1. Samotný substrát 0,0
2. Balení při pH 9, trypsinové ošetření, není přítomná žádná ProCPB-C 0,0
3. Balení při pH 9, trypsinové ošetření 4,3
4. Pouze balení při pH 9 0,0
5. Balení při pH 10, trypsinové ošetření 1,7
6. Balení při pH 11, trypsinové ošetření 0,3
7. Komerční prasečí CPB 230
Tabulka I naznačuje, že sbalení ProCPB-C a ošetření sbalené ProCPB-C trypsinem za použití výše popsaných předem stanovených podmínek poskytlo enzymaticky aktivovanou CPB-C.
Tabulka I dále ukazuje, že v případě, že je pH hodnota v balicí směsi rovna 9, je specifická aktivita CPB-C vyšší než v případě, kdy je pH v balicí směsi rovna 10 nebo 11.
Příklad 4
Zlepšené balicí podmínky
Cílem následujících experimentů bylo stanovit optimální balicí a aktivační podmínky. Předpokládalo se, že čím vyšší bude specifická aktivita CPB-C, získané trypsinovým odštěpením sbalené ProCPB-C, tím optimálnější budou balicí podmínky ProCPB-C. Pro níže uvedené experimenty se jako kontrolní materiál použily „samotný substrát“ a „komerční prasečí karboxypeptidáza“.
Výsledky (které byly popsány v příkladu 3) se zlepšily, pokud se balení provádělo za použití 0,05 až 0,01 mg/ml ProCPB pro pH 9,5.
I. Vliv teploty na balení PriCPB-C
Sbalení ProCPB-C se dosáhlo inkubací 0,05 mg/ml polypeptidů ve 100 mM glycinu, pH 9,5 po dobu 90 h při teplotách, pohybujících se v teplotním rozmezí 10 °C až 37 °C. Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:200 hmotn./hmotn.) a specifická aktivita takto získaní CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3. Nej vyšší specifická aktivita se získala v případě, kdy se balení ProCPB-C provádělo při teplotách 20 °C až 30 °C.
II. Vliv zoxidovaného a zredukovaného glutathionu na balení ProCPB-C
Sbalení ProCPB-C se dosáhlo inkubací 0,05 nm/ml polypeptidů ve 100 mM glycinového pufru pH 9,5, 0,01mM ZnCL při 25 °C v přítomnosti zoxidovaného a/nebo zredukovaného glytathionu 35 (GSSG/GSH) nebo kyseliny askorbové (tabulka II). Následně se inkubované roztoky ošetřovaly 1 h trypsinem (1:200 hmotn./hmotn.) při 37 °C a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila (jak popisuje příklad 3) po 18 h a po 45 h.
-11 CZ 292541 B6
Tabulka II: Specifická aktivita CPB-C jako funkce přítomnosti oxidačního/redukčního činidla v balicím roztoku
Oxidační/redukční činidlo přidané do Specifická aktivita (u/mg)
balicího roztoku
18 h 45 h
0,1 mMGSSG 2,18 16,39
0,lmMGSSG, lmM GSH 16,37 26,90
16,5 μΜ kyseliny askorbové 4,06 9,24
Kontrolní (bez přidání ox./red. činidel) 1,19 5,39
* Kyselina askorbová se přidala v koncentraci 2,5 mol do 1 mol SH skupiny.
Tabulka II ukazuje, že kombinované přidání GSSG a GSH způsobí prudké zvýšení specifické aktivity CPB-C a pravděpodobně tedy i balicí účinnosti ProCPB-C. GSSH samotný rovněž zvyšuje balicí účinnost ProCPB-C a rovněž tak kyselina askorbová, i když nižší měrou.
U další řady experimentů se zjistilo, že optimálního sbalení Pro CPB-C se dosáhne přidáním 0,1 mM GSSG a 0,5mM GSH do balicího roztoku.
III. Aktivace sbalené ProCPB-C trypsinem
Zjistilo se, že nejaktivnější CPB-C se získala odštěpením ProCPB-C trypsinem, které odstranilo aktivační peptid, pokud se inkubovaný balicí roztok 1 h ošetřoval trypsinem 1:50 hmotn./hmotn. při teplotě 37 °C.
IV. Vliv pH na balení ProCPB-C
Vliv pH na balení ProCPB-C se určil v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek.
Balení ProCPB-C se provádělo 24 h při koncentraci 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinu, 0,02mM ZnCl2, 0,5 mM redukovaného glytathionu (GSH), 0,1 mM zoxidovaného glytathionu (GSSG) při 25 °C a při různých hodnotách pH (hodnoty pH se pohybovaly v rozmezí od 8,75 do 10,00). Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem (1:50 hmotn./hmotn.; rozpustily v 1 mM HC1, lOmM CaCl2) a specifická aktivita takto získané CPb-C se měřila způsobem popsaným v příkla30 du3.
Nej vyšší specifická aktivita byla zjištěna v případě, kdy se balení PriCPB-C provádělo za pH hodnoty 9,25.
V. Vliv ZnCl2 na balení ProCPB-C f φ
Účinek ZnCl2 koncentrace v balicím roztoku na balení ProCPB-C se stanovil v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek. Při koncentraci ZnCl2 2 až 20x vyšší než určená koncentrace CPB-C (mol./mol.), se dosáhlo nejvyšší specifické aktivity připravené CPB-C.
Pokud se balení provádělo v nepřítomnosti dalšího ZnCl2 a do balicí směsi se přidala EDTA, která chelátovala veškeré zbytkové divalentní ionty, potom se specifická aktivita CPB-C snížila na nulu.
VI. Vliv proteinové koncentrace na balení ProCPB-C
Balení ProCPB-C se provádělo 24 h za optimálních podmínek (které byla uvedeny výše) při koncentracích naznačených v tabulce II. Po digeraci trypsinem se aktivita CPB-C měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
-12CZ 292541 B6
Tabulka III: Specifická aktivita CPB-C jako funkce proteinové koncentrace v balicím roztoku.
Proteinová koncentrace (mg/ml) Specifická aktivita (u/mg)
0,05 35,1
0,10 31,8
0,20 20,3
Tabulka III ukazuje, že nejvyšší specifická aktivita připravené CPB-C se získá při proteinové koncentraci 0,05 mg/ml.
VII. Doba balení jako funkce specifické aktivity CPB-C
Optimální doba balení se určila v řadě reakcí prováděných za již optimalizovaných podmínek.
Balení ProCPB-C se provádělo při koncentraci 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinu, pH 9,25, 0,1 mM GSSG, 0,5mM GSH a 0,01 mM ZnCl2. Vzorky sbalené ProCPB-C se ošetřily trypsinem 15 (1:50 hmotn./hmotn.) a specifická aktivita takto získané CPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3 v různých časových okamžicích (mezi 0 h až 40 h) od iniciace balení.
Nejvyšší aktivita CPB-C se naměřila v příkladě, kdy se sbalení ProCPB-C odštěpila pomocí trypsinu po 20 h, měřeno od počátku balení. Balení trvající déle než 20 min již hodnotu speci20 fícké aktivity neovlivnilo.
Příklad 5
Balení a aktivita různých CPB proteinů
CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C připravené a čištěné způsobem popsaným v příkladu 2, se balily 24 h 0,1 mg/ml ve 100 mM glycinového pufru, pH 9,25, 0,0lmM ZnCl2, 0,5mM GSSH při pokojové teplotě, tj. za použití optimálních podmínek určených v příkladu 4.
Hodnota pH každého roztoku obsahujícího sbaleno CPB, CPB-C, ProCPB nebo ProCPB-C se nastavila pomocí HC1 na 8,5 a roztoky, obsahující ProCPB a ProCPB-C se ošetřovaly 1 h tiypsinen (1:50 hmotn./hmotn.) při teplotě 37 °C, v důsledku čehož došlo k odstranění aktivačního peptidů. Reakce se ukončila přidáním PMSF do konečné koncentrace 0,1 mM. Specifická 35 aktivita CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
Tabulka IV: Specifická aktivita CPB, CPB-C, ProCPB a ProCPB-C po sbalení a aktivita při optimálních podmínkách
Balení Specifická aktivita (u/mg)
Kontrolní1 bez trypsinového ošetření 0,00
bez proteinu 0,00
Balení - CB 0,00
-CPB-C 0,08
-ProCPB 42,90
-ProCPB-C 20,90
Kontrola „bez trypsinu“ se provedla pouze pro ProCPB-C.
-13CZ 292541 B6
Tabulka IV ukazuje, že enzymaticky účinnou CPB lze produkovat pouze z buněk, exprimujících prekurzor, který obsahuje aktivační peptid. Aktivační peptid je tedy nezbytný pro správné sbalení
CPB.
Tabulka IV rovněž naznačuje, že CPB s optimální specifickou aktivitou se získá sbalením a aktivací ProCPB (exprimované plazmidovou pXProCPB), která obsahuje tři Cys290 zbytky a nikoliv sbalením a aktivací ProCPB-C, která obsahuje Cys290 -> Ser mutaci. Cys290 je tedy zřejmě potřebná pro optimální sbalení a/nebo dosažení nejvyšší aktivity CPB.
Příklad 6
Zlepšení balení ProCPB
I. Balení proCPB ze surové intracelulámí sraženiny
Zjistilo se, že optimální balicí podmínky pro ProCPB jsou v podstatě identické s optimální balicími podmínkami pro ProCPB-C, které se určily v příkladu 4.
Zjednodušený způsob balení a aktivace ProCPB se prováděl za použití surové intracelulámí sraženiny s tím, že se vynechal počáteční purifikační krok popsaný v části III příkladu 2.
Ukázalo se, že surová intracelulámí sraženina obsahující proCPB (připravené způsobem popsaným v příkladu 2), by mohla být rozpuštěna při vysokých proteinových koncentracích (tabulka V) ve lOOmM glycinu, pH 9,5 a 8M močovině.
Balení se provádělo za optimalizovaných podmínek při pokojové teplotě 24 h. Hodnota pH se zvýšila na optimálních 9,5 (tato optimální hodnota byla stanovena již dříve). Sbalená ProCPB se odštěpila pomocí trypsinu (1:50 hmotn./hmotn.) a specifická aktivita CPB se měřila způsobem popsaným v příkladu 3.
Tabulka V: Specifická aktivita CPB jako funkce proteinové koncentrace v balicím roztoku, obsahujícím surovou intracelulámí sraženinu
Proteinová koncentrace (mg/ml) Specifická aktivita (u/mg)
0,1 10,5
0,2 10,9
0,5 11,9
1,0 12,1
2,0 11,4
Tabulka V ukazuje, že enzymaticky aktivní CPB lze získat sbalením ProCPB, získané ze surové intracelulámí sraženiny, a následnou trypsinovou digerací. Kromě toho CPB má při všech měřeních proteinových koncentracích podobné hodnoty enzymatické aktivity. To je neočekávaný výsledek, vzhledem ktomu, že specifická aktivita CPB, čištěné na DEAE Sepharose před jejím sbalením (příklad 2), s růstem proteinové koncentrace v balicí směsi klesá. Intracelulámí sraženina pravděpodobně obsahuje faktory, které napomáhají sbalení ProCPB.
-14CZ 292541 B6
II. Kalibrace CPB sbalováním ProCPB ze surové intracelulámí sraženiny (i) Příprava
Ze 42 litrů hostitelských buněk £. coli 4300, obsahujících plazmid pXProCPB a exprimujících ProCPB, se vyčistila téměř homogenní CPB. Fermentační a růstové podmínky byly v podstatě popsány v příkladu 2.
Surová intracelulámí sraženina se omyla ve vodě a rozpustila v koncentraci 20 mg/ml ve lOOmM glycinu, pH 9,5, 8M močoviny. Tato směs se naředila do koncentrace 1 mg/ml lOOmM glycinu, pH 9,5, 0,1 mM ZnCl2, 0,5mM GSH. do takto naředěné směsi se přidalo 0,1 mM GSSG a výsledný balicí roztok se inkuboval 24 h při teplotě 25 °C. Hodnota pH se následně nastavila pomocí HC1 na 8,5 a sbalená ProCPB se digerovala 1 h při 37 °C trypsinem (20 pg/ml). Trypsin se inaktivoval 0,1 mM PMSF.
(ii) Čištění
Enzymaticky aktivní CPB se aplikovala na DEAE Sepharose Fast-Flow sloupec (Pharmacia), uvedený do rovnovážného stavu 20 mM Tris-HCl, pH 8 při 20 mg na 1 ml pryskyřice. CPB se eluovala 80mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8. Do DEAE eluční frakce se přidal síran amonný (0,8M) a frakce se dále chromatografovala na Fenyl-Sepharose Fast-Flow sloupci (Pharmacia), vyváženém pomocí 20mM Tris-HCl pH 8, 0,8M síranu amonného. CPB se eluovala 0,4M síranem amonným, zahustila, diafiltrovala proti lOOmM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8 a skladovala při -20 °C.
U výše popsaného čisticího postupu se 42 litrů hostitelských buněk E. coli 4300, obsahujících plazmidovou pXProCPB při O.D.íó0 = 36. zpracovalo výše popsaným způsobem a poskytlo 1,25 g enzymaticky aktivní CPB se specifickou aktivitou 637 u/mg. Celkový výtěžek činil 60 %.
Specifická aktivita komerční prasečí karboxypeptidázy B, měřené za identických experimentálních podmínek, byl 298 u/mg.
Příklad 7
Charakteristika enzymaticky aktivní CPB
CPB, připravená způsoby, popsanými v příkladech 5 a 6, má biologické a enzymatické vlastnosti srovnatelné s prasečí karboxypeptidázou B. Extinkční koeficient rekombinantní CPB, vypočtený na základě jejího složení aminokyselin, je ε1%280 = 19,7. Extinkční koeficient komerční prasečí karboxypeptidázy B je ε1%28ο = 21,4 (Barrett a McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, sv. 2, Academie Press, Orlando Florida).
Rekombinantní CPB má specifickou aktivitu 637 u/mg (Hippuryl-L-Arg substrát) a obsahuje 1 mol zinku na 1 ml enzymu, stanoveno atomovou absorpcí.
Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence poskytla Ala-Ser-Gly-His-Ser, jak bylo možné očekávat na základě analýzy aminokyselinové sekvence zralé krysí karboxypeptidázy B (Clauser a kol. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845).
Optimální pH pro rekombinantní CPB aktivitu se určila za použití 25mM následujících pufrů: NaOAc, pH č až 6; Bis-Tris, pH 6 až 7,5; Tris-HCl, pH 7,5 až 9; a glycinu, pH 9 až 12. CPB specifická aktivita se měřila způsobem, popsaným v příkladu 3. Optimální enzymatická aktivita CPB byla dosažena při pH 8. Inkubace CPB při 55 °C způsobila 50% ztrátu aktivity a úplní inaktivaci se dosáhlo při 65 °C.
-15CZ 292541 B6
Kinetická analýza rekombinantní CPB se prováděla za použití Hippuryl-L-arg substrátu (obr. 4).
Inhibice CPB aktivity při koncentracích substrátu vyšších než 0,5mM.
Další studie ukázaly, že rekombinantní CPB byla inhibována katalytickým produktem argininu, který' je konkurenčním inhibitorem karboxypeptidázy B. Odpovídající Lineweaver-Burkova křivka ukázala pro Km hodnotu 0,38mM.
Rekombinantní CPB byla rovněž inhibována 1,10-fenantrolinem, silným divalentním iontovým chelátorem. což demonstruje důležitost Zn iontů pro enzymatickou aktivitu CPB. V přítomnosti lmM 1,10-fenantrolinu byla pozorována 50% ztráta aktivity 1 mg/ml rekombinantní CPB.
Příklad 8
Konverze proinzulinu na inzulín pomocí CPB
Mini-proinzulin, který popisuje EP 347781 Bl, lze převést na inzulín zpracováním za použití trypsinu a rekombinantní CPB, připravenou způsobem popsaným v příkladech 5 a 6.
Trypsin štěpí proinzulin specificky v místě mezi argininovým zbytkem a A řetězcem. CPB následně specificky hydrolyzuje argininový zbytek z C-konce B řetězce.
Komerční lidský inzulín (Boehringer-Mannheim) lze použít jako standard, pokud jde o miniproinzulin štěpený trypsinem a komerční prasečí karboxypeptidázou B a mini-proinzulin, štěpený samotným trypsinem.
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1.
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádný (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 1:
gcgcatatgc atgcttccga ggagcacttt GATGGC 36
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 285 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina
-16CZ 292541 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) LOKALITA: 1..285 (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
CAT His 1 GCT TCC GAG GAG CAC TTT GAT GGC AAC CGG GTG TAC CGT GTC Val 15 AGT Ser 48
Ala Ser Glu Glu 5 HÍS Phe Asp Gly Asn 10 Arg Val Tyr Arg
GTA CAT GGT GAA GAT CAC GTC AAC TTA ATT CAG GAG CTA GCC AAC ACC 96
val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gin Glu Leu Ala Asn Thr
20 25 30
AAA GAG ATT GAT TTC TGG. AAA CCA GAT TCT GCT ACA CAA GTG AAG CCT 144
Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gin Val Lys Pro
35 40 45
CTC ACT ACA GTT GAC TTT CAT GTT AAA GCA GAA GAT GTT GCT GAT GTG 192
Leu Thr Tnr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asd Val Ala Asp Val
50 55 60
GAG AAC TTT CTG GAG GAG AAT GAA GTT CAC TAT GAG GTA CTG ATA AGC 240
Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser
65 70 75 80
AAC GiG AGA AAT GCT CTG GAA TCC CAG TTT GAT AGC CAC ACC CGT 285
Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gin Phe Asp Ser His Thr Arg
B5 90 95
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 95 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 3:
His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg val Tyr Arg Val Ser 15 10 15
Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gin Glu Leu Ala Asn Thr 20 * 25 30
-17CZ 292541 B6
Lys Glu Ile 35 Asp Phe Trp Lys Pro 40 Asp Ser Ala Thr Gin 45 Val Lys Pro
Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val
50 55 60
Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser
85 70 75 80
Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gin Phe Asp Ser His Thr Arg
90 95
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukieová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 4:
GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 927 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) LOKALITA: 1..927 (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
-18CZ 292541 B6
GCA Ala AGT Ser GGA Gly CAC AGC TAC ACC Tyr Thr AAG Lys TAC AAC AAC Tyr Asn Asn 105 TGG Trp GAA ACC- ATT C-AC- 4 6
His Ser 100 Glu Thr ile 110 Glu
GCG TGG ATT CAA CAA GTT GCC ACT GAT AAT CCA GAC CTT GTC ACT CAG 95
Ala Trp Ile Gin Gin Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gin
115 12*0 125
AGC GTC ATT GGA ACC ACA TTT GAA GGA CGT AAC ATG TAT GTC CTC AAG 144
Ser Val Ile Gly Thr Tnr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys
130 135 140
ATT GGT AAA ACT AGA CCG AAT AAG CCT GCC ATC TTC ATC GAT TGT GGT 192
Ile Gly Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly
145 150 155
TTC CAT GCA AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA TTC TGT CAG TGG TTT GTG 240
Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gin Trp Phe Val
160 165 170 175
AGA GAG GCT GTC CGT ACC TAT AAT CAA GAG ATC CAC ATG AAA CAG CTT 288
Arg G1U Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gin Glu Ile His Met Lvs Gin Leu
180 185 190
CTA GAT GAA CTG GAT TTC TAT GTT CTG CCT GTG GTC AAC ATT GAT GGC 336
Leu Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly
195 200 205
TAT GTC TAC ACC TGG ACT AAG GAC AGA . ATG TGG AGA , AAA , ACC CGC TCT 384
Tyr Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser
210 215 220
ACT Thr ATG GCT GGA Gly AGT Ser TCC TGC TTG GGT GTA GAC CCC AAC AGG AAT TTT
Met 225 Ala Ser Cys 230 Leu Gly Val ASp Pro 235 Asn Arg Asn Phe
AAT GCT GGC TGG TGT GAA GTG GGA GCT TCT CGG AGT CCC TGC TCT GAA
Asn Ala Gly Trp Cys G1U Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu
240 245 250 255
- 19CZ 292541 B6
ACT TAC TGT GGA CCA GCC CCA GAG TCT GAA AAA GAG ACA AAG GCC CTG Leu 528
Tnr Tyr Cys Gly Pro Ala Pro Glu 260 Ser Glu 265 Lys Glu Thr Lys Ala 270
GCA GAT TTC ATC CGC AAC AAC CTC TCC ACC ATC AAG GCC TAC CTG ACC 576
Ala Asp Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr
275 200 205
ATC CAC TCA TAC TCA CAG ATG ATG CTC TAC CCT TAC TCC TAT GAC TAC 624
Ile His Ser Tyr Ser Gin Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
290 295 300
AAA CTG CCT GAG AAC TAT GAG GAA. TTG AAT GCC CTG. GTG AAA GGT GCG 672
Lys Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala
305 310 315
GCA AAG GAG CTT GCC ACT CTG CAT GGC ACC AAG TAC ACA TAT GGC CCA 720
Ala Lys Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro
320 325 330 335
GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG GGA TCT GAC GAC TGG TCT 768
Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser
340 345 3 50.
TAT GAT CAG GGA ATC AAA TAT TCC TTT ACC TTT GAA. CTC CGG GAT ACA 816
Tyr Asp Gin Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Pne Glu Leu Arg Asp Thr
355 3 60 365
GGC TTC TTT GGC TTT CTC CTT CCT GAG TCT CAG ATC CGC CAG ACC TGT 864
Gly Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin Ile Arg Gin Thr Cys
370 375 380
GAG GAG ACA > ATG CTT GCA GTC AAG TAC ATT GCC AAT TAT GTC CGA GAA 912
Glu Glu Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu
385 390 395
CAT CTA TAT TAG TGA
His Leu Tyr * ♦
400
927
-20CZ 292541 B6
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 309 bazických párů (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
Ala Ser Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu
1 5 10 15
Ala Trp Ile Gin Gin Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gin
20 25 30
Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asr. Met Tyr Val Leu Lys
35 40 45
Ile Gly Lys Thr Arg Pro A.sn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly
50 55 60
Phe His Ala Arg Glu Trn Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gin Trp Phe Val
65 70 75 80
Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gin Glu Ile His Met Lys Gin Leu
85 90 95
Leu Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly
100 105 110
Tyr Val Tyr 115 Thr Trp Thr Lys Asp 120 Arg Met Trp Arg Lys 125 Thr Arg Ser
Thr Met Ala Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe
130 135 140
Asn Ala Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu
145 150 155 160
-21 CZ 292541 B6
Tnr Tvr Cys Gly Pro Ala 165 Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr 170 Lys ATs. Leu 175
Alb Asp Phe 11e Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr
180 185 190
Ile His Ser Tyr Ser Gin Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr
195 200 205
Lvs Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu val Lys Gly Ala
210 215 220
Ala Lys Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro
225 230 235 240
Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Tru Ser
245 250 25*5
Tyr Asp Gin Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr
2 60 265 270
Gly Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gin Ile Arg Gin Thr Cys
275 280 285
Glu Glu Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu
290 295 300
His Leu Tyr *
3C5
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (iv) PROTISMYSLNÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
CGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT
-22CZ 292541 B6
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: žádná (xi) POPIS BIOLOGICKY VÝZNAMNÝCH MÍST SEKVENCE:
SEQ ID NO: 8:
ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy enzymaticky aktivní savčí pankreatické karboxypeptidázy B, která má aminokyselinovou sekvenci a enzymatickou aktivitu přirozeně se vyskytující savčí pankreatické karboxypeptidázyB,vyznačený tím , že:
    (a) se rekombinantní hostitelská buňka obsahující DNA kódující prokarboxypeptidázu B zpracuje tak, že DNA řídí expresi prokarboxypeptidázy B;
    (b) takto exprimovaná prokarboxypeptidáza B se solubilizuje;
    (c) pH hodnota solubilizované prokarboxypeptidázy B se nastaví na hodnotu 8 až 11, při které se prokarboxypeptidáza B sbalí;
    (d) sbalená prokarboxypeptidáza B se podrobí enzymatickému štěpení, při kterém se vytvoří enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B; a (e) tato enzymaticky aktivní karboxypeptidáza B se čistí:
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se prokarboxypeptidáza B v kroku (b) solubilizuje tak, že:
    (a) se poruší buněčná stěna hostitelské buňky za vzniku lyzátu;
    (b) z lyzátu se odstřeďováním izoluje intracelulámí sraženina; a (c) intracelulámí sraženina se solubilizuje ve vhodném pufru.
  3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se prokarboxypeptidáza B v provozním kroku (c) 20 h až 24 h inkubuje při teplotě místnosti.
    -23CZ 292541 B6
  4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že se inkubace provádí v přítomnosti ZnCU, zoxidovaného glutathionu a zredukovaného glutathionu.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se enzymatické štěpení v provozním kroku (d) provádí tak, že se (i) pH hodnota nastaví na 8,5; a (ii) prokarboxypeptidáza B 60 min štěpí trypsinem.
  6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se purifíkace v kroku (e) provádí pomocí iontoměničové chromatografie.
  7. 7. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se purifíkace v kroku (e) provádí pomocí iontoměničové chromatografie a hydrofobní chromatografie.
  8. 8. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se purifíkace v kroku (e) provádí pomocí iontoměničové chromatografie, hydrofobní chromatografie a diafiltrace.
  9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se prokarboxypeptidáza B exprimuje pomocí plazmidu pXprokarboxypeptidázy B, uloženého pod depozitním číslem ATCC 69673.
  10. 10. Purifikovaná enzymaticky účinná karboxypeptidáza B prostá všech dalších látek savčího původu.
CZ19972258A 1995-01-25 1996-01-25 Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy CZ292541B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37823395A 1995-01-25 1995-01-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ225897A3 CZ225897A3 (cs) 1998-10-14
CZ292541B6 true CZ292541B6 (cs) 2003-10-15

Family

ID=23492292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19972258A CZ292541B6 (cs) 1995-01-25 1996-01-25 Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5948668A (cs)
EP (1) EP0871718B1 (cs)
JP (1) JP4250716B2 (cs)
KR (1) KR100566136B1 (cs)
CN (1) CN1144874C (cs)
AT (1) ATE358717T1 (cs)
AU (1) AU698889B2 (cs)
BR (1) BR9606795A (cs)
CA (1) CA2210242C (cs)
CZ (1) CZ292541B6 (cs)
DE (1) DE69637011T2 (cs)
DK (1) DK0871718T3 (cs)
ES (1) ES2284167T3 (cs)
HU (1) HU225673B1 (cs)
IL (1) IL116696A (cs)
MX (1) MX9705279A (cs)
NZ (1) NZ302874A (cs)
PL (1) PL183228B1 (cs)
PT (1) PT871718E (cs)
WO (1) WO1996023064A1 (cs)
ZA (1) ZA96515B (cs)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ43098A3 (cs) 1995-08-16 1998-05-13 Zeneca Limited Konjugáty obsahující mutovanou formu enzymu karboxypeptidázy B, způsob jejich přípravy a jejich použití
EP1588716B1 (en) 1998-08-06 2011-02-16 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
US20040117863A1 (en) * 1998-09-18 2004-06-17 Edge Michael D. Transgenically produced fusion proteins
DE19915938A1 (de) 1999-04-09 2000-10-19 Aventis Pharma Gmbh Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung
US6441153B1 (en) 1999-09-29 2002-08-27 Lexicon Genetics Incorporated Human carboxypeptidases and polynucleotides encoding the same
CA2382725A1 (en) * 1999-09-17 2001-03-22 Genzyme Transgenics Corporation Transgenically produced fusion proteins
EP1632575B1 (en) * 1999-09-29 2009-01-28 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Human carboxypeptidases and polynucleotides encoding the same
AU2001229253A1 (en) * 2000-01-12 2001-07-24 Eli Lilly And Company Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity
ATE455849T1 (de) * 2003-12-05 2010-02-15 Hoffmann La Roche Rekombinante carboxypeptidase b und ihre aufreinigung
EP1538203B1 (en) * 2003-12-05 2010-01-20 Roche Diagnostics GmbH Recombinantly expressed carboxypeptidase B and purification thereof
WO2006035008A1 (de) * 2004-09-27 2006-04-06 Merck Biosciences Ag Rekombinante carboxypeptidase b
US20080159976A1 (en) * 2005-04-11 2008-07-03 Jacob Hartman Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
US8148123B2 (en) 2005-04-11 2012-04-03 Savient Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase
AU2006235495B2 (en) 2005-04-11 2012-04-12 Horizon Therapeutics Usa, Inc. Variant forms of urate oxidase and use thereof
SG161248A1 (en) 2005-04-11 2010-05-27 Savient Pharmaceuticals Inc A variant form of urate oxidase and use thereof
US20090081122A1 (en) * 2005-05-23 2009-03-26 Universite De Geneve Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant
KR101288027B1 (ko) 2006-04-12 2013-07-22 새비언트 파마수티컬즈 인크. 양이온 계면활성제를 이용한 단백질 정제 방법
CN101058805B (zh) * 2007-03-21 2011-09-07 北京贯虹科技有限公司 突变羧肽酶原b及突变羧肽酶b的生产方法
US8993714B2 (en) * 2007-10-26 2015-03-31 Imiplex Llc Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof
US9102526B2 (en) 2008-08-12 2015-08-11 Imiplex Llc Node polypeptides for nanostructure assembly
US9285363B2 (en) 2009-05-11 2016-03-15 Imiplex Llc Method of protein nanostructure fabrication
EP2446260B1 (en) 2009-06-25 2018-12-26 Horizon Pharma Rheumatology LLC Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy
CN101967467B (zh) * 2009-07-28 2012-11-14 上海雅心生物技术有限公司 一种高稳定性的重组羧肽酶b的生产及应用
WO2020160322A1 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Horizon Pharma Rheumatology Llc Tolerization reduces intolerance to pegloticase and prolongs the urate lowering effect (triple)
US11918624B2 (en) * 2020-06-10 2024-03-05 Kelsius Laboratories LLC Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders
US12269875B2 (en) 2023-08-03 2025-04-08 Jeff R. Peterson Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK124483B (da) * 1967-12-04 1972-10-23 Bayer Ag Fremgangsmåde til rensning af carboxypeptidase B.
US4511503A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
HU190129B (en) * 1983-07-11 1986-08-28 Reanal Finomvegyszergyar,Hu Process for the isolation of carboxypeptidase b enzyme from mammal pancreas
US5206161A (en) * 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
FR2692907B1 (fr) * 1992-06-25 1995-06-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation.
JP3472587B2 (ja) * 1992-08-28 2003-12-02 アベンティス ファーマ株式会社 骨関連カルボキシペプチダーゼ様タンパク質およびその製造法
BR9408061A (pt) * 1993-11-16 1996-12-24 Lilly Co Eli Sequência de dna codificando carboxipeptidase b pancreática de suiínos

Also Published As

Publication number Publication date
HU225673B1 (en) 2007-06-28
JPH11503002A (ja) 1999-03-23
PL321499A1 (en) 1997-12-08
CN1177377A (zh) 1998-03-25
DE69637011D1 (de) 2007-05-16
NZ302874A (en) 1998-11-25
HK1014986A1 (en) 1999-10-08
AU4903496A (en) 1996-08-14
PT871718E (pt) 2007-06-26
MX9705279A (es) 1998-06-30
DE69637011T2 (de) 2007-12-13
EP0871718A4 (en) 2000-06-07
ATE358717T1 (de) 2007-04-15
IL116696A (en) 1999-08-17
KR100566136B1 (ko) 2006-11-10
CA2210242A1 (en) 1996-08-01
US5948668A (en) 1999-09-07
CA2210242C (en) 2010-04-27
EP0871718B1 (en) 2007-04-04
BR9606795A (pt) 1997-12-30
ES2284167T3 (es) 2007-11-01
IL116696A0 (en) 1996-05-14
CN1144874C (zh) 2004-04-07
HUP9800091A2 (hu) 1998-05-28
EP0871718A1 (en) 1998-10-21
AU698889B2 (en) 1998-11-12
WO1996023064A1 (en) 1996-08-01
CZ225897A3 (cs) 1998-10-14
ZA96515B (en) 1996-08-15
PL183228B1 (pl) 2002-06-28
KR19980701652A (ko) 1998-06-25
JP4250716B2 (ja) 2009-04-08
HUP9800091A3 (en) 2004-03-29
DK0871718T3 (da) 2007-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ292541B6 (cs) Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy
Verhaert et al. Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis
EP0746611B1 (en) Method for increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by (saccharomyces cerevisiae)
CA2218880A1 (en) Process for preparing anti-obesity protein
US5948659A (en) Recombinant fructosyl amino acid oxidase
AU669735B2 (en) Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase
US5496719A (en) Polypeptide from Humicola insolens possessing protein disulfide isomerase activity gene encoding the same
Teichmann et al. Cloning and biochemical characterization of an anionic peroxidase from Zea mays
KR100714116B1 (ko) 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조
US6723543B1 (en) Mutant kanamycin nucleotidyltransferases from S. aureus
JPH06225775A (ja) 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子
KR20000069395A (ko) 트리파레독신, 발현 플라스미드, 제조방법, 용도, 시험 시스템및 의약 제제
KR19990067302A (ko) 벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도
JP3257119B2 (ja) プロティンジスルフィドイソメラーゼ活性物質およびその製造方法
HK1014986B (en) Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b
JPH0723787A (ja) 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子
TEICHMANN et al. from zyxwvutsrqponmlkji
MXPA01009979A (en) Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use
JPH1175853A (ja) 銅の利用性を制御するホメオスタシスタンパク質遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20160125