CZ43098A3 - Konjugáty obsahující mutovanou formu enzymu karboxypeptidázy B, způsob jejich přípravy a jejich použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití mutantních forem lidské karboxypetidázy B spolu s patřičnými neaktivními prekurzory léčiv v systémech léčby využívajících specificky cíleného enzymu, jehož substrátem je neaktivní prekurzor účinné látky (ADEPT - antibody directed enzyme prodrug therapy).

Dosavadní stav techniky

Lékařský výzkum již dlouhou dobu řeší problém nasměrování léčiv tak, aby byla schopna selektivně .zabíjet rakovinné buňky v těle pacienta. ADEPT je jedním z přístupů, jak tento problém překonat. ADEPT .využívá protilátku konjugovanou. s enzymem selektivně namířenou proti ‘ nádoru. Tento konjugát je podáván do organismu pacienta (obvykle intravenózně) a umožňuje lokalizaci v místech výskytu nádoru a poté je zcela odstraněn z hlavního tělního oběhu.

Následně je podán pacientovi neaktivní prekurzor účinné látky (prodrug), který je enzymem, lokalizovaným v blízkosti nádoru přeměněn na cytotoxickou účinnou látku, která zabíjí rakovinné buňky. Protože jedna molekula enzymu může katalyzovat vytvoření mnoha molekul cytotoxické látky, výsledný efekt se násobí. Navíc i nádorové buňky, které nenesou antigenní determinanty rozpoznávané použitou protilátkou (nádory většinou vykazují mikroheterogenitu) jsou rovněž usmrceny enzymaticky amplifikovanou tvorbou cytotoxicky aktivní -látky. Ze stavu techniky je znám systém využívající jako enzymatickou komponentu prokaryotický enzym karboxypeptidázu G2 (CPG2) (viz WO 88/07378).

-2Dalším problémem vyskytujícím se v těchto známých systémech je skutečnost, že opakované podávání konjugátu (protilátka - enzym) vede k indukci imunitní odpovědi hostitele, která má za následek snížení účinnosti léčby.

Část konjugátu tvořená protilátkou monoklonální protilátka, která může použitím známých technik, tak, aby

je	obvykle	myší
být	. humanizována
se	snížila	její

imunogenita. Redukce imunogenity enzymové složky se ukázala být problematičtější. To je způsobeno tím, že enzymová složka přítomná v kojugátu nesmí být přítomna v přirozené formě v lidském krevním oběhu, nehod by jinak došlo k předčasné přeměně neaktivního prekurzoru účinné látky v cytotoxicky účinnou látku a cytotoxické působení by tudíž nebylo namířené selektivně proti nádorům.

Tyto problémy byly částečně řešeny v Mezinárodní patentové přihlášce WO 95/13095 (Welcome Foundation). V tomto patentu je navržen systém ADEPT využívající k aktivaci neaktivního prekurzoru léčiva mutantní formy savčích enzymů. Tyto neaktivní prekurzory účinné látky, přitom nejsou aktivovány odpovídajícími nativními enzymy.. Popsány však byly jen systémy ADEPT, které využívají mutantní formy karboxypeptidázy A.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje konjugát, který je v podstatě neimunogenní pro lidský organismus a zahrnuje část schopnou cílově specifické vazby na antigen nesený nádorovou buňkou. Cílově specifická část je spojena s mutantní formou karboxypeptidázy B (CPB), která je schopná přeměnit neaktivní prekurzor účinné látky na protinádorové léčivo, zatímco neaktivní prekurzor léčiva není prokazatelně přeměňován na protinádorové léčivo přirozeným lidským nemutovaným enzymem.

-3Ve výhodném uspořádání vynálezu je částí odpovídající za nasměrování léčiva protilátka.

Ve. zvláště výhodném provedení vynálezu je protilátka ve formě F(ab')₂ fragmentu.

Ve výhodném provedení je enzym zmutován tak, aby jeho aktivní centrum vykazov^ao. změnu polarity, takže může přeměňovat pouze prekurzor s komplementární polaritou.

Ve výhodném provedení vynálezu je enzym jednou z následujících mutantních forem lidských pankreatických karboxypeptidáz B:

lidská pankreatická karboxypeptidáza B mající aminokyselinu Asp 253 nahrazenou jednou z následujících aminokyselin Arg, Asn, Gin nebo Lys popřípadě v kombinaci s další jednou nebo více substitucemi aminokyselin, vybranými z:

přirozená aminokyselina Gin 54 substituovaná za Arg, Lys nebo Asn;

přirozená aminokyselina Asp 145 substituovaná za., jednu z těchto aminokyselin Val, Leu, Ile nebo Ala;

přirozená aminokyselina Ile 201 substituovaná za jednu z následujících aminokyselin Ser nebo Thr;

přirozená aminokyselina Ser 205 substituovaná za jednu z následujících aminokyselin Asn, Gin, His, Lys nebo Arg;

přirozená aminokyselina Ile 245 substituovaná za jednu z následujících aminokyselin Ser, Thr, Ala, Val, Leu, Asn, Gin, Lys, Arg nebo His;

přirozená aminokyselina Ala 248 substituovaná za jednu z následujících aminokyselin Asn, Gin, Lys, Arg, His, Ser nebo Thr;

přirozená aminokyselina Gly 251 substituovaná za jednu z následujících aminokyselin Thr, Asn, Ser, Gin, His, Lys, Arg, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Ala nebo norleucin;

a přirozená aminokyselina Cys 288 substituovaná za jednu z následujících aminokyselin Ser Thr, Ala, Val, Leu nebo Ile.

Ve výhodném provedení vynálezu je mutantní forma enzymu odvozena od následujících lidských pankreatických CPB:

lidská pankreatická karboxypeptidáza B mající přirozenou aminokyselinu Asp 253 zaměněnou buď Arg nebo Lys a přirozená aminokyselina Gly 251 je zaměněná buď za Thr, Asn, Ser, Gin, Lys nebo Val, dále v kombinaci s další jednou nebo více substituovanými

aminokyselinami	vybranými z následujících:
přirozená	aminokyselina	Gin	54 je	substituovaná Arg,
přirozená	aminokyselina	Asp	145	je	substituovaná	za-
Ala,
přirozená	aminokyselina	Ile	201	je	substituovaná	za
Ser,
přirozená	aminokyselina	Ser	205	je	substituovaná	za
Asn,
přirozená	aminokyselina	Ile	245	je	substituovaná	za
j ednu z	následuj ících	aminokyselin	: Ser, Ala nebo
His,
přirozená	aminokyselina	Ala	248	je	substituovaná	za
j ednu z	následuj ících	aminokyselin,	His, Ser, nebo
Asn a
přirozená	aminokyselina	Cys	288	je	substituovaná	za

jednu z následujících aminokyselin, buď Ser nebo Ala.

Výhodně lze použít jako enzym i následující mutantní formy lidské pankreatické CPB:

lidskou pankreatickou karboxypeptidázu B mající přirozenou aminokyselinu Asp 253 nahrazenou Arg nebo Lys a přirozenou aminokyselinu Gly 251 nahrazenou za Thr, Asn nebo Ser v libovolné kombinaci s jednou nebo více následujícími aminokyselinovými substitucemi:

přirozená aminokyselina Gin 54 nahrazená Arg přirozená aminokyselina Asp 145 nahrazená Ala přirozená aminokyselina Ile 201 nahrazená Ser, přirozená aminokyselina Ser 205 nahrazená Asn, přirozená aminokyselina Ile 245 nahrazená Ala přirozená aminokyselina Ala 248 nahrazená jednou z' následujících aminokyselin, buď Ser nebo Asn a přirozená aminokyselina Cys 288 nahrazená Ser.

Zvláště výhodně se jako enzym používají následující, pankreatické lidské mutantní formy CPB:

D253K; D253R; [G251N, D253K); [G251T, D2S3K]; [G251S,

D253K] ; [G251T, D253R]; [A248S, G251T, D253K]; [A248N,

G251N, D2S3K] ; [A248S, G251N, D253K] ; nebo [S2O5N, G251N,

D253K].

Vynález dále popisuje systém skládající se ze dvou částí, navržený pro užití v hostitelském organismu, kde komponenty obsahuj í:

(i) první složku, která je odpovědná za nasměrování, obsahuje určitou oblast, která je schopna vázat antigen, který nesou nádorové buňky a tato cílová část je spojena s enzymem CPB, který je schopen přeměnit neúčinný prekurzor léčiva na protinádorové léčivo, • ·

-6(ii) druhou složku, kterou je neaktivní prekurzor účinné látky, který je možné působením příslušných výše zmíněných enzymů přeměnit na protinádorové léčivo, podle vynálezu přičemž:

enzymem je mutantní forma enzymu CPB první složka v podstatě nevyvolává imunitní odpověď v hostitelském organismu a neaktivní prekurzor není v organizmu hostitele významně přeměňován v protinádorovou účinnou látku pomocí přirozených nemutovaných forem hostitelských enzymů.

Výše zmíněnou větou prekurzor' není významně přeměňován na protinádorovou účinou látku pomocí přirozených forem hostitelských enzymů míníme skutečnost, že prekurzor nevyvolává problémy s necílenou toxicitou při. podání hostiteli.

Termínem v podstatě neimunogenní rozumíme skutečnost, že první složka (konjugát) může být podávána hostiteli více než jedenkrát, aniž by vyvolala silnou imunitní odpověď, která by mohla být patrná u lidského organismu například při použití myší protilátky spojené s bakteriálním enzymem.

Ve výhodném provedení vynálezu enzymu založená druhu jako je

Nicméně mutovaná je mutovaná forma na mutaci enzymu ze stejného živočišného hostitel, pro kterého je systém určen, forma enzymu muže být odvozena od enzymu získaného z organizmů jiných druhu, a to za předpokladu, že struktura daného enzymu je mezi těmito druhy dostatečně konzervativní, tak aby nedocházelo k problémům s imunitou.

• φφφ φφφ • · « 4 · ····** · * · · · * φφφ Φ·Φ· ΦΦ ΦΦΦΦ ··

-7Ve výhodném provedení vynálezu je částí odpovědnou za nasměrování protilátka, zvláště pak fragment protilátky, jako je například fragment F(ab')₂. Vazba protilátky k enzymu při syntéze konjugátu může být zprostředkována známými metodami, jako je užití heterobifunkčních činidel sloužících jako zesilovače nebo prostřednictvím fúzí genu či dalšími vhodnými metodami. Protilátka může pocházet ze stejného hostitele (to znamená užití myších protilátek v myších) nebo protilátky mohou být přeměněny takovým způsobem, aby nebyly rozpoznávány jako cizorodé ve vybraném hostiteli (to znamená užití chimérických myších protilátek, protilátek s vloženými myšími CDR úseky v lidském organizmu). Ve výhodném provedení vynálezu je první složkou konjugát, který je popsán výše.

V preklinickýčh studiích prováděných na opicích a u lidských pacientů bylo prokázáno podstatné snížení' imunogenity protilátek hlodavců, které byly upraveny buď připojením variabilních domén protilátek hlodavců ke konstantním doménám lidských protilátek (chimérické protilátky) nebo zabudováním vazebných míst pro antigen (CDR) z protilátek hlodavců do lidských protilátek (přenos CDR úseků - CDR grafting). Dokonce i protilátky s vloženými CDR úseky obsahují v úseku základní struktury odvozeném od lidské protilátky velké množství (> 50) aminokyselin pocházejících ze sekvence protilátky hlodavce. I přes tuto skutečnost, byla u opic a pacientů zjištěna snížená imunogenita těchto protilátek. To je důkazem, že mutace omezeného počtu aminokyselin v katalytickém místě enzymu hostitele bude mít patrně za následek vytvoření enzymu s minimální imunogenitou a zcela jistě s imunogenitou nižší, než jakou by měl enzym z jiného než hostitelského organizmu. Čtenář se laskavě odkazuje na následující práce:

A. Mountain a J. R. Adair, Biotechnology and- Genetic Eňgineering Reviews 12, strana 1 až 142, 1992; G. Winter a

W. J. Harris, Trends in Pharmacological Sciences, 14, strana 139 až 143, 1993 ; I. I. Singer a další, J. Immunol, 152, strana 2844 až 57, 1993; J. Hakimi a další, J. Immunol, 147, 11352 až 59,1991 a J. D. Isacs a další', The Lancet, 342, strana 748 až 752, 1992.

Jako domény konstantních oblastí mohou být použity například domény lidského imunoglobulinu IgA, IgE, IgG nebo IgM. Použití lidského imunoglobulinu IgG2 a 3 (zvláště IgG2) je zvláště výhodné, ale mohou být použity i izotypy IgG 1 a 4. Také mohou být použity samotné lidské protilátky jako takové, místo protilátek, které jsou produkovány v geneticky manipulovaných myších za účelem produkce lidských protilátek. (Fishwald a další, Nátuře Biotechnology (1996), 14, strana 845 až 851).

V enzymu hostitele je provedena mutace ža účelem dosažení změny ve způsobu interakce mezi aktivním centrem enzymu a neaktivním prekurzorem účinné látky, ve srovnání s interakcí nativního enzymu hostitele.

Ve výhodném provedení vynálezu je mutací taková změna polarity v aktivním místě enzymu, že tato mutantní forma enzymu může přeměňovat neaktivní prekurzor účinné látky s komplementární polaritou, neaktivní prekurzor není v podstatě přeměňován nemutovanou formou hostitelského enzymu. Ve výhodném provedení vynálezu rozpoznává přirozeně se vyskytující enzym hostitele svůj přirozený substrát prostřednictvím interakce iontových párů a tato interakce má systému tvořeném mutovaným enzymem a jeho komplementárním neaktivním prekurzorem obrácenou polaritu. V této specifikaci termín aktivní místo zahrnuje aminokyselinové zbytky zapojené jakýmkoli způsobem do rozpoznání substrátu a /nebo zapojené jakýmkoli způsobem do katalytické funkce.

-9Bodové mutace budou popisovány následujícím způsobem: přirozená aminokyselina (používá se jednopísmenkový nomenklaturní kód), pozice, nová aminokyselina. Například D253K znamená, že na pozici 253 maturované aktivní HCPB je aspartát D nahrazen lysinem K. Násobné mutace v jednom enzymu budou označeny uzavřením mezi hranaté závorky s individuálními mutacemi oddělenými čárkami.

Pod pojem CPB se rozumí:

(i) maturované, pro a prepro formy enzymu s a bez peptidových značek jako je například c-myc, (ii) každá karboxypeptidáza, která je specifická pro peptidové substráty mající Lys nebo Arg na C konci a je sekvenčně identická (výhodně alespoň 60% identita, výhodněji alespoň 70% identita, ještě výhodněji alespoň 80% identita a zvláště výhodně alespoň 90% identita) s matečnou aktivní pankreatickou HCPB v každém z klíčových substrátových vazných míst 187 až 206 a 238 až 268, (iii) výhodně lidské pankreatické a plasmatické CPB enzymy (preferuje se pankreatický enzym uvedený výše), není-li jinak uvedeno nebo zřejmo z kontextu.

Uvažovány jsou také přirozeně se vyskytující alelické varianty CPB enzymů. Alelická varianta je alternativní forma sekvence, která může být substituována, může se v ní vyskytovat delece Či adice v jedné nebo více pozicích, které ale významně nezměnily funkci CPB.

K určení stupně identity mezi karboxypeptidázou a maturovanou aktivní pankreatickou HPCB v jejích klíčových substrátových vazebných místech se používá následující způsob srovnání sekvencí. Jestliže se aminokyselinové zbytky 109 až 415 v Sekvenci id. č.: 39 přečíslují jako 1 až 307, a srovnají s dalšími karboxypeptidázami pomocí

-10metody Clustal s indexem PAM 250 k vážení zbytku tak, jak je popsáno v uživatelském manuálu LASERGENE biocomputing Software pro MACINTOSH, Manuál pro LASERGENE (2. Vydání, 1994, vydáno DNASTAR lne., 1223 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715, USA), pak se v podstatě navzájem srovnají klíčové zbytky vázající zinek (v pozici H66, E69 a H194) , klíčové karboxy koncové zbytky vázající substrát (v pozici R124, N141,· R142 a Y246) a katalytické zbytky (v pozici R124, Y246 a E268).

Předpokládá se, že klíčovým zbytkem rozpoznávajícím substrát je D253, přičemž kapsa pro vazbu substrátu leží mezi β-strukturou (skládaný .list) jádra enzymu (zbytky 187 až 206) a helixem povrchové .smyčky aktivního místa (zbytky 238 až 268) . Zbytky 263 až 268 (uvnitř sekvence 238 až 268)· jsou β-vlákno, přesto že jsou rovněž částí jádra enzymu (core) se strukturou skládaného listu.

Mutantní formy CPB dle vynálezu jsou mutanty všech výše zmíněných CPB enzymů mající navrhované vlastnosti, vyžadované ve vynálezu. Upřednostňovány jsou zvláště tyto mutované formy pankreatických HCPB: D253K, D253R a zvláště.· [G251N, D253R] , avšak jsou uvažovány i odpovídající mutace v dalších CPB enzymech. Klíčové pozice pro mutace jsou uvedeny v následující tabulce.

Mutace vhodné pro změnu specifity HCPB

Původní zbytek	Příklad		Výhodná	Zvláště výhodná
	substituce	substituce	substituce
Gin 54 (Q54)	Arg, Lys,	Asn,	Arg	Arg
Aspl45 (D154)	Val, Leu, Ala	Ile,	Ala	Ala
Ile201 (1201)	Ser, Thr		Ser	Ser
Ser205 (S205)	Asn, Gin, Lys, Arg	His,	Asn	Asn

· « ♦ f · ♦ • · *4

-11Puvodní zbytek Příklad Výhodná Zvláště výhodná substituce substituce substituce

Ile245	(1245)	Ser, Thr, Val,	Ser,	Ala, His	Ala
Leu, Ala, Gin, His, Arg	Asn, Lys,
Ala248	(A243)	Asn,	Gin,	Lys,	His,	Ser,	Asn	Ser, Asn
		Arg,	His,	Ser,
		Thr
Gln251	(G251)	Thr,	Asn,	Ser,	Thr,	Asn,	Ser,	Thr, Asn, Ser
		Gin,	His,	Lys,	Gin,	Lys,	Val
		Arg,	Val,	Ile,
		Leu,	Mat,	Phe,
		Ala,	norelucin
Asp253	(A253)	Arg,	Gin,	Asn,	Lys,	Arg		Lys pro prekurzory s	G1
		Lys						Arg pro prekurzory s	As
Cys288	(C288)	Ser,	Thr,	Ala,	Ser,	Ala		Ser
		Val,	Leu,	Ile

Poznámky:

1. Výhodné kombinace mutací na výše uvedených pozicích vždy zahrnují i záměnu na pozici 253. Zvláště výhodné kombinace mutací mají záměnu jak na pozici 2 53 tak i na pozici 251. Předpokládá se, že mutace na pozici 253, popřípadě v kombinaci se substitucí na pozici 251 hrají' klíčovou roli pro změnu specifity HCPB.

2. Zvláště výhodnými kombinacemi mutací jsou [G251N,

D253K] a [G251T, D253K]. Další zvláště výhodnou mutací je [G251S,D253K] .

Mutované formy CPB dle vynálezu mohou také obsahovat další konzervativní mutace (inzerce, substituce a /nebo delece), které výrazně nemění vlastnosti klíčových mutací. Pro účely tohoto dokumentu platí, že konzervativní substituce aminokyselin je substituce, jejíž pravděpodobnost výskytu v přírodě je větší desetkrát než pravděpodobnost substituce vyskytující se náhodně (jak je definováno ve výpočetních metodách popsaných Dayhoffem a

-12dalšími v Atlase proteinových sekvencí a struktury, 1971, strana 95 až 96 a obrázcích 9 a 10) a je vyjádřeno v následující tabulce.

Konzervativní substituce

Původní zbytek	Příklad substituce i	Výhodná substituce
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gin; asn	lys
Asn (N)	gin,· his; lys; arg	gin
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gin (Q)	asn	asn
Glu (Ξ)	asp	asp
Gly (G)	pro	pro
His (H)	asn; gin; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe;norleucin	leu
Leu (L)	norleucin; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg,- gin,- asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala	leu
Pro (P)	gly	giy
Ser (Ξ)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr,· ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucin	leu

Reference o CPB enzymech zahrnují následné citace:

Folk JE v knize Enzymes Svazek III, Academie Press (1971), strana 57; Coll M a další (1991) EMBO Journal 12, strana 1

21933 až 21838; Yamamoto K a další (1992) J. Biol. Chem.

267, strana 2575 až 2581; US Patent 5364934 (Genentech) a Mezinárodní patentová přihláška WO 95/14096 (Eli Lilly) .

Ve výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, který lze použít jako metodu pro • «

-13kontrolu růstu nádorových buněk v hostitelském organismu. Zmíněný postup představuje dvousložkový systém, který se skládá z podání účinného množství první složky do hostitelského organismu, po ní následuje latentní perioda umožňující odstranění první složky z oběhu a podání účinného množství druhé složky, jak je popsáno výše. Výhodně jsou komponenty podávány pacientům intravenozně.

V dalším výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, který zahrnuje farmaceutickou kompozici obsahující účinné množství první složky lokalizující nádor a farmaceuticky přijatelný nosič a rozpouštědlo. Výhodně lze tuto kompozici použít pro intravenózní aplikaci. Ve zvláště výhodném uspořádání je první složka dodávána jako suchá pevná látka, která se před použitím rozpustí pomocí vhodného rozpouštědla.

V dalším výhodném uspořádání předkládaného vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, jež je tvořen farmaceutickou komponentu obsahující účinné množství druhé složky, která má ' protinádorovou aktivitu, farmaceuticky přijatelným nosičem a rozpouštědlem. Výhodně lze tuto kompozici použít pro intravenózní podávání. Ve zvláště výhodném uspořádání je druhá složka dodávána jako· suchá pevná látka, která se· rekonstituuje před podáváním pomocí vhodného rozpouštědla.

E. coli kmene MSD 1646 obsahující plazmid pCG330 (také známý jako pICI1698) byla uložena 23. listopadu 1994 u Národní sbírky průmyslových a mořských bakterií, (National Collection of Industrial and Marině Bacteria, NCIMB), 23 St.Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom AB2 IRY v souladu s Budapešťskou smlouvou, referenční číslo je NCIMB 40694. NCIMB 40694 je další stránkou předkládaného vynálezu.

* ·· ·· ·· 4444 • 44 4 4 44 4 4 444 • 4 4 4 4 4 4«4 * ·· 4 4 4 44444 *· 44#444

4 4«··· 44 444 4 4444

Protilátka A5B7 byla uložena ve formě hybridomu produkujícího tuto protilátku pod referenčním číslem 93071411 v souladu s Budapešťskou smlouvou 14. července 1993 v ECACC, v PHLS Centru pro aplikovanou mikrobiologii a výzkum (Centre for Applied Microbiology and Research) , Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. Výhodněji je používána humanizovaná protilátka A5B7 ve formě fragmentů F(ab) j.

Protilátka 806.077 byla uložena v souladu s Budapešťskou smlouvou ve formě hybridomu produkujícího tuto protilátku pod referenčním číslem 96022936 dne 29.února 1996 v ECACC,v PHLS Centru pro aplikovanou mikrobiologii a výzkum, Pórton Down,· Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. Protilátka 806.077 je alternativní anti-CEA protilátka k A5B7, která je vhodná pro použití v předkládaném vynálezu.

Vynález dále popisuje metodu přípravy první složky (konjugátu) pomocí spojení:

cílově specifické skupiny schopné vázat antigen prezentovaný nádorovou buňkou a enzymu schopného přeměňovat neaktivní prekurzor v protinádorové léčivo, kde enzymem je mutovaná forma hostitelského enzymu CPB. Spojení těchto dvou částí může být realizováno pomocí chemických nebo molekulárně biologických technik.

Vynález dále popisuje přípravu první složky výše· popsaného systému předkládaného vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu je popsána polynukleotidová sekvence schopná kódovat první složku (konjugát) systému uvedeného výše.

V dalším výhodném provedení vynálezu je popsán vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci schopnou kódovat první složku systému popsaného výše.

-15♦* ·· ·φ «··· • · · · » · ·· · • · · · · ·· β ♦ ♦ · · · · ··· · · * · · · * · « ·♦· ·· «··< ·♦ ··

V jiném výhodném provedení vynálezu je systémem popsaným výše myšlen takový systém, který je tvořen buňkou obsahující vektor nebo polynukleotidovou sekvenci schopnou kódovat první složku systému popsaného výše.

V dalším výhodném provedení vynálezu je popsána mutovaná forma enzymu CPB mající požadované vlastnosti dle předkládaného vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu je popsána polynukleotidová sekvence schopná kódovat mutantní formu enzymu CPB.' Předkládaný vynález se dále vztahuje na polynukleotidy, které hybridizují s polynukleotidy kódujícími mutantní formy enzymů CPB, jestliže existuje alespoň 70% identita mezi jejich sekvencemi. Vynález dále popisuje a vztahuje se zvláště k polynukleotidům, které hybridizují za přísně definovaných podmínek s nukleotidy popsanými výše.

Jak zde uvedeno, termín přísné podmínky (stringent conditions) znamená, že hybridizace, může nastat jen v případě bude-li 95% a výhodněji 97% identita mezi sekvencemi.

V dalším výhodném provedení vynálezu je vektorem popsaným výše takový vektor, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci schopnou kódovat mutantní formu enzymu CPB dle předkládaného vynálezu. Polynukleotidová sekvence může být zahrnuta do různých expresivních vehiklú, zvláště pak vektorů nebo plazmidů vhodných pro expresi polypeptidů. Takovéto vektory zahrnují chromozomální, nechromozomální a syntetické DNA sekvence, například deriváty: SW42, bakteriálních plazmidů, fágové DNA, kvasinkových plazmidů, vektorů odvozených z kombinací plazmidové a fágové DNA, virové DNA jako jsou virus kravských neštovic, adenoviry, ptačí pox virus a virus nepravé vztekliny. Může být však použit každý další plazmid

• «· 9«	• 9	4«	• 4
					4
•	• *	• ·	4 4	4 4
•	• 4 ·	♦ 4	• 449	•	4
4	4 ·	• 4	4	4	4
		4444	44	• 4

nebo vektor, tak dlouho, dokud se bude replikovat a bude životaschopný v hostitelském organismu. Uvažovaná příslušná sekvence DNA může být vložena do vektoru různými postupy.

Obecně lze vložit DNA sekvenci do určitého vhodného restrikčního místa (míst) postupem známým z odborné literatury. Tyto a další postupy jsou odborníkům v daném oboru známy. DNA sekvence v expresivním vektoru se operativně připojí k sekvenci (sekvencím) promotoru. Jako reprezentativní příklad takovýchto promotorů mohou být uvedeny: LTR nebo SV4 0 promotor, E. coli lac nebo trp, promotor P, sub. L z fága lambda a další promotory, které jsou vhodné pro kontrolu exprese genů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách nebo jejich virech. Expresivní vektor také obsahuje vazebné místo pro ribozóm pro iniciaci translace a transkripční terminátor. Vektor může také zahrnovat sekvenci pro amplifikovanou expresi.

Ve výhodném uspořádání vynálezu expresivní vektory obsahují gen pro fenotypovou selekci transformovaných hostitelských buněk jako je gen pro dihydrofolatreduktázu nebo gen rezistence k neomycinu pro eukarytické buněčné kultury nebo jako je tetracyklinová nebo ampicillinová rezistence v E coli. Vektor obsahující vhodnou sekvenci DNA, jak je uvedeno výše, jakož i vhodný promotor či kontrolní sekvence, může transformovat daného hostitele tak, aby exprimoval protein. Jako vhodní hostitelé jsou uváděni například: bakteriální buňky, jako je E. coli, Streptomyces, Salmonella Typhimurium, buňky hub, jako jsou kvasinky, hmyzí buňky jako je Drosophila a Sf9, živočišné buňky jako jsou NSO, CHO, COS nebo buňky Bowesova melanomu, rostlinné buňky a tak dále. Výběr vhodného hostitele záleží na posouzení zde uvedených možností Odborníkem.

V ještě výhodnějším provedení daného vynálezu, předkládaný vynález zahrnuje rekombinantní konstrukty obsahující jednu nebo více sekvencí, které byly podrobně

-179 9· Ι· 9« *999 • 9 9 9 9 99¹ · 9 9 99 ♦ · ·· 9 9 999

999» 099Í999 ·· 99«999 »»♦<··· 99 9999 ··99 popsány výše. Konstrukty obsahují vektor, jako je plazmid nebo virový vektor, do kterého je zabudovaná sekvence dle vynálezu, buď v předem stanovené nebo opačné orientaci.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu konstrukt dále zahrnuje regulační sekvenci, včetně například promotoru, který je operabilně připojen k sekvenci.

Odborníci znají velké množství vhodných vektorů a promotorů, které jsou komerčně dostupné. Jsou to například následující vektory:

Bakteriální vektory: pQE72, pqE-9,(Qiagen), pbs, pDlO, phagescript, psiR.174, pBluescript, SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR542, pRIT5 (Pharmacia).

Eukaryotické: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).

Nicméně lze použít všechny plazmidy nebo vektory pokud se replikují a jsou životaschopné v hostitelském organizmu. Oblasti promotoru mohou být vybrány z různých požadovaných genů užitím CAT vektorů (chloramfenikoltransferáza) nebo dalších vektorů se selektivními markéry. Dva vhodné vektory jsou ΡΚΚ232-Θ a PCM7. Zvláště lze jmenovat bakteriální promotory jako jsou láci, lacZ, T3, gpt, lambda P. sub. L a trp. Eukaryontí promotory zahrnují CMV immediate early, HSV thymidinkinázu, časný a pozdní SV42, LTRs z retrovirů a myší metalothionein -I. Výběr- vhodných vektorů a promotorů záleží na odbornících.

V dalším výhodném provedení se předkládaný vynález popisuje hostitelské buňky obsahující výše popsaný konstrukt. Hostitelská buňka může, být vyšší eukaryontní buňka, jako je buňka savčí, nebo nižší eukaryontní buňka, jako je kvasničná buňka, nebo hostitelskou buňkou může být prokaryontní buňka, jako je bakteriální buňka. Zavedení

*	··	et	4·	• 4		*4
• ·.	·. · 4	•	• 4	4 4	4	•
•	• 4	•	4	4 4		44
•	• · 4	4	4	4 44·	4	4
»	4 «	•	4	•	•	4
		4«	»41«	4 4		44

konstruktu do buňky hostitele může být ovlivněno například transfekcí fosforečnanu vápenatého, transfekcí zprostředkovanou DEAE-Dextraném, Či lipofekcí (kationtová, lipidy zprostředkovaná dodávka polynukleotidů. (Felgner a další, v Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1993) 5, strana 67 až 75] nebo elektroporací (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Zkušený čtenář, odborník, je schopen vybrat vhodnou metodu pro daného hostitele. Konstrukty v hostitelských buňkách se běžně používají k přípravě genového produktu kódovaného rekombinantní sekvencí.

Jiným způsobem mohou vynálezu dále připraveny syntetizátoru. Maturované proteiny mohou být vhodného promotoru exprimovány. v savčích kvasinkách, bakteriích nebo dalších buňkách být polypeptidy synteticky pomocí popsané ve peptidového kontroly buňkách, produkci za těchto proteinů mohou být využity i bezbuněčné translační systémy, které užívají RNA odvozené z DNA konstruktů popsaných v tomto vynálezu. Vhodné metody klonování a expresivní vektory pro použití v prokaryotních a eukaryotních hostitelských buňkách jsou popsány Sambrookem a dalšími, v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989).

Transkripce DNA kódující polypeptidy dle předkládaného vynálezu ve vyšších eukaryotech se zvýší zavedením sekvence zesilovače transkripce (enhanceru) do vektoru. Zesilovače transkripce jsou elementy DNA působící v poloze cis, velikosti obvykle od deseti do tří set bp, které působením na promotor zvýší jeho transkripci. Příklady zahrnují zesilovač transkripce SV40 na straně pozdních genů od replikačního počátku (bp 100 až 272} , zesilovač časného promotoru cytomegaloviru, zesilovač transkripce polyomaviru na straně pozdních genů od replikačního počátku.

t·	··	··		t·
• ·	9	•	• ·	• «	«		•
•	•	•	9	♦ ·		99
*	• ·	•	♦ ·	··«	•		•
•	•	•	«	•	•		•
			····	··		99

Obecně lze říci, že rekombinantní expresivní vektory budou obsahovat počátky replikace a selektivní markéry, které umožní transformaci hostitelské buňky, například gen resistence k ampicilinu z E. Coli a gen TRPÍ z S. cerevisiae a promotor odvozený z vysoce exprimovaného genu vhdný pro rychlou transkripci downstream strukturní sekvence.

Takovéto promotory mohou být odvozeny z operónů kódujících glykolytické enzymy jako je 3-fosfoglycerátkináza (PGK), alfa faktor, kyselá fosfatáza nebo heat shock proteiny a další.

Heterologní strukturální sekvence je spojena ve vhodné fázi s iniciačními a terminačními sekvencemi translace, výhodně je vedoucí sekvence schopná přímé sekrece translačních proteinů do periplasmatického prostoru nebo extracelulárního media. Heterologní sekvence může také kódovat fúzní protein, který obsahuje N-koncový identifikační peptid přinášející požadované vlastnosti, jako jsou například stabilizace nebo zjednodušení purifikace exprimovaných rekombinantních produktů.

Používané expresivní vektory pro bakterie jsou konstruovány pomocí inzerce strukturální DNA sekvence kódující požadovaný protein dohromady s vhodnými iniciačními a terminačními translačními signály ve vhodné operační čtecí fázi s funkčním promotorem. Vektor obsahuje jeden nebo více fenotypových selektivních markérů a počátek replikace k zabezpečení udržení vektoru a jeli to vhodné, k provádění amplifikace v hostiteli, vhodnými prokarvontními hostiteli pro transformaci jsou E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy rodu Pseudomonas, Streptomyces a Stafylokokus, avšak i ostatní hostitelé mohou být předmětem výběru. Jako reprezentativní, ale nikoli jediný příklad, užívanné expresivní vektory pro bakterie mohou obsahovat selektivní markér a bakteriální

	—	- ř
4	4	»	4 4	• 4 44
»	4 4	•	• *	4 4 4 4 4 4
•	4	4	4 ·	• 4 4
4 4 4	• «4 4	4 4	4 4 4 4	4 4 4 4

počátek replikace odvozený z komerčně dostupných plazmidú, které nesou genetické elementy z velmi dobře známých klonovacích vektorů pBR322 (ATCC 37017), pAT153 a pBluescript. Mezi takovéto komerční vektory patří například pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) a GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wi USA). Tyto pBR322 backbone sekce jsou kombinovány s vhodným promotorem a strukturální sekvencí, která má být exprimována. Následuje transformace vhodných hostitelských kmenů a růst hostitelských kmenů do vhodné buněčné density, kdy selektivní promotor je indukován vhodnými prostředky (teplotním posunem nebo chemickou indukcí) a buňky jsou pěstovány po další časové období.

Typický postup pro sklizeň buněk zahrnuje jejich centrifugaci a uvolnění cytoplazmy buněk pomocí fyzikálních nebo chemických prostředků. Vzniklý hrubý extrakt se dále purifikuje.

Cytoplazma mikrobiálních buněk, ve kterých dochází k expresi proteinu, může být uvolněna pomocí mnoha vhodných metod, jako jsou střídající se cykly mražení a tání, působením ultrazvuku, mechanickým poškozením nebo použitím buňky lyžujících činidel. Všechny tyto metody jsou dobře známy odborníkům v daném oboru.

Pro expresi rekombinantních proteinů se používají také různé savčí buňky. Do savčích expresivních systémů patří například COS-7 linie opičích ledvinových fibroblastů, popsaná Gluzmanem v Cell, 23: 175(1981) a další buněčné linie, které jsou schopné exprimovat kompatibilní vektor, například NSO, C127, 3T3, CHO, HeLA a BRK buněčné linie. Savčí expresivní vektory obsahují počátek replikace, vhodný promotor a zesilovač transkripce, je-li to nutné i vazebné místo pro ribozomy, polyadenilační místo, donorová a akceptorová místa pro sestřih, transkripční terminační sekvence a 5hraniční nepřepisované

-21• · · · · · ·· • · · · · v · * 4 * • · · · · · · • •4 «· ·«·« ·· ·· sekvence. Pro vytvoření požadovaných nepřepisovaných genetických elementů lze využít DNA sekvence odvozené od sestřihu SV40 a polyadenylační místa. Produkty exprese jsou získávány a purifikovány z rekombinatních buněčných kultur pomocí metod, jako je srážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselou extrakcí, aniotovou a kationtovou výměnnou chromatografií, chromatografií na íosfocelulóze, hydrofobní chromatografií, afinitní chroamtografií na hydroxylapatitu a lektinovou chromatografií.

V průběhu purifikace se doporučuje používat nízké koncentrace vápenatých iontů (přibližně 0,15 až 5 mM) . (Price a další, J. Biol. Chem., 244, strana 917 (1969). Je-li nutné získat kompletní konfiguraci maturovaného proteinu, lze protein i následně upravit. Pro konečné dočištění proteinu se používá vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC).

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou přirozeně purifikované produkty, nebo produkty chemické syntézy, či jsou připraveny pomocí rekombinantních technik z prokaryontních nebo eukaryontních hostitelů (například bakterií, kvasinek, vyšších rostlin, hmyzu a savčích buněčných kultur) . V závislosti na tom, jaký se zvolí pro rekombinantní produkční proces hostitelský organismus, polypeptidy podle vynálezu mohou být glykosylovány savčími či jinými eukaryontními cukry, nebo zůstávají neglykosylovány.

Polypeptidy podle vynálezu mohou také obsahovat na počátku sekvence methioninový aminokyselinový zbytek.

Jako další systémy exprese jsou uvažovány také například transgenní savčí buňky, které nejsou lidského původu, ve kterých je gen, který nás zajímá, ve výhodném uspořádání vystřižen z vektoru a dále výhodně spojen se savčím promotorem tak, aby protein byl přímo exprimován do

4	4· 44	• 4	44	<4	•
•	4 4	4 4	4 4	44
•	* 4 4	• 4	• ·♦·	4	4
4	4 4	4 4	•	4
		• 4 4 4	«4	♦ 4

mléka samice živočicha. Uvažovaný gen je zaveden do pronukleu savčí zygoty (obvykle mikroinjekcí do jednoho ze dvou jader, obvykle do samčího jádra nacházejícího se v pronukleu) a potom je implantován do náhradní matky. Část potomstva náhradní matky nese a exprimuje vložený gen, který se integroval· do chromozomu. Obvykle je integrovaný gen předáván potomstvu metodami konvenčního šlechtění, což dovoluje růst chovu. Ve výhodném uspořádání je požadovaný protein získáván přímo z mléka samic transgenních zvířat. Čtenář se laskavě odkazuje na následující publikace:

Simons a další. (1988), Bio/Technology 6: strana 179 až 183,- Wright a další. (1991) Bio/Technology 9: strana 830 až 834; US 4,873,191 US 5,322,775. Manipulace s myšími embryi je popsána v

Hogan a další, Manipulating the Mouše Embryo; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1986.

Pro tyto účely se také se uvažuje využití technologie transgenních rostlin, jak je popsáno v následujících publikacích: Swain W. F. (1991) TIBTECH 9: strana 107 až 109; Ha J. K. C. a další (1994) Eur. J. Immunology 24: strana 131 až 138; Hiatt A. a další (1992) FEBS Letters 307; strana 71 až 75; Hein Η. B. a další (1991) Biotechnology Progress 7: strana 455 až 461; Duering K. (1990) Plant Molecular Biology 15: strana 281 až 294.

Je-li potřeba, hostitelské geny mohou být inaktivovány nebo modifikovány užitím standardních postupů, tak jak je nastíněno dále a popsáno například v knize Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press 1993. Cílový gen, nebo jeho část, jsou ve výhodném provedení vynálezu nakloňovány do vektoru, dovnitř kterého je vložen selekční markér (jako je Neo) čímž dojde k narušení funkce tohoto genu. Vektor se linearizuje a potom se jím transformují (obvykle elektroporací) embryonální kmenové buňky (ES) ·· ·· ·· ♦· ··

-23• «· · · · · * • » « * · · · · · ♦ · * · · · · • Μ »1 ···· ·· ·· (například odvozené od myšího kmene 129/Ola) V části těchto buněk nastane homologní rekombinace. Kmenové buňky nesoucí gen s narušenou funkcí jsou pomnoženy a injikovány do blastocysty (která je například z myšího kmene C57BL/6J) a implantovány do náhradních matek k dalšímu vývoji. Chiméričtí potomci mohou být identifikováni pomocí barevné změny pokožky.

Chiméričtí jedinci jsou dále kříženi tak, aby bylo jistá přítomnost EC buněk v zárodečné linii, a to křížením s myší nesoucí genetický markér, který umožní rozlišit, gamety odvozené od ES buněk a gamety odvozené od hostitelské blastocysty. Polovina gamet vzniklých z EC buněk nese genovou modifikaci.

Potomstvo se testuje (například pomocí Southernova¹ blotu) tak, aby byly identifikováni ti jedinci, ve kterých se vyskytuje modifikovaný . gen (kolem 50% potomstva). Takto vybrané potomstvo je heterozygotní a proto může křížením s z

dalším heterozygotními jedinci vzniknout homozygotní potomek (kolem 25% potomstva). Transgenní zvířata, nesoucí, knock-outováný gen, mohou být křížena s transgenními zvířaty získanými pomocí známých technik, jako je mikroinjekce DNA do pronukleů, fúze sféroplastů (viz Jakobovits a další. (1993) Nátuře 362: strana 255 až 258) nebo lipidy zprostředkovanou transfekcí ES buněk (Lamb a další. (1993) Nátuře Genetics 5, strana 22 až 29). Výsledkem jsou transgenní zvířata s knock-outovaným endogenním genem, který je nahrazen cizorodým genem.

EC buňky nesoucí cíleně roztržený gen mohou být dále modifikovány transformací pomocí sekvencí cílových genů, které zahrnují specifickou (změnu) alteraci a s výhodou se klonují do vektoru a vektor je před vlastní transformací linearizován. Následující homologní rekombinací je pozměněný gen začleněn do genomu. Tyto

-24embrionální kmenové buňky mohou být následně využity pro tvorbu transgenních zvířat, jak je popsáno výše.

V kontextu termín hostitelská buňka zahrnuje každou prokaryontní nebo eukaryontní buňku vhodnou pro expresi proteinů. Jsou to například bakterie, kvasinky, embrionální kmenové buňky a další buňky vhodné pro transgenní technologii.

Jestliže to kontext dovoluje, zahrnujeme pod termín hostitelská buňka také transgenní rostlinné nebo savčí buňky, které nejsou lidského původu, vyvinuté z transformovaných savčích zygot, jiného než lidského původu, oocytů, blastocyst, embryogenních kmenových buněk, rostlinných buněk a dalších buněk vhodných pro transgenní technologii.

V dalším výhodném provedení vynálezu je připravenabuňka obsahující vektor nebo polynukleotidovou sekvenci schopnou kodovat mutantní formu CPB enzymu dle předkládaného vynálezu.

V dalším výhodném provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující maturovanou formu lidské pankreartické karboxypeptidázy B definovaná v Sekvenci id. č. . 3 9 od pozice 109 směřující kupředu nebo mutanta téže sekvence, která má v pozici 243 zakódovaný cysteinový zbytek. Tento cysteinový zbytek v pozici 243 v klonované sekvenci nebyl nikdy uveden v dalších publikovaných sekvencích pro lidskou pankreatickou karboxypeptidázu B.

Jak zdůrazňují Yamamoto a další, v Journal of Biological Chemistry, 267, strana 2575 až 2581, 1992, když porovnávali výše uvedenou sekvenci s ostatními aminokyselinovými sekvencemi savčí pankreatické karboxypeptidázy B, tak v sekvenci, která následuje po

-25pozici označené číslem 244 je mezera (viz diskuse v Referenčním příkladu 6).

Zvláště výhodně se užívá nukleotidová sekvence v izolované formě, přičemž se dá se říci, že je přinejmenším částečně purifikovaná z jakékoliv přirozeně se vyskytující její formy.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou mutantní formy enzymu mutantami CPB.

Podle vynálezu je popsaná metoda přípravy lidské pankreatické karboxypeptidázy B nebo její mutantní formy, ve které jsou zakódovány cysteinové zbytky v pozici 243. Metoda popisuje expresi nukleotidové sekvence maturované formy lidské pankreatické karboxypeptidázy B v hostitelskébuňce, která je definovaná v Sek. id. č.: 39 z pozice 109 směřující kupředu nebo její mutantní formu, ve které je zakódován cysteinový zbytek v pozici 243.

Další výhodné provedení vynálezu popisuje neaktivní, prekurzor účinné látky popsaný vzorcem 1, kde:

W představuje jednoduchou vazbu nebo skupinu CH₃

R¹ nebo R² nezávisle představují Cl, Br, I nebo -OSO₂Me

R² a R⁴ nezávisle reprezentují H, C_x.₃ alkyl, alkyloxylovou skupinu, F nebo Cl

C_x.₄ alkyl nebo R^s a R^s nezávisle reprezentují H nebo C_x_₄ alkyl nebo

R² a R⁶ společně mohou reprezentovat -CH=CH-CH=CH- za vzniku bicyklického systému obsahujícího laž'3 heteroatomy, které lze vybrat z O, N a S

X j e vybráno z:

-26-CHR⁷ CHR^a- kde R⁷ a R³ jsou vybrány z H a C₂_₄ alkylu volitelně substituovaných fenylem, přičemž pak alespoň R⁷ nebo R³ je H.

- NHCHR⁹- kde R⁹ je vybráno z H; postranních řetězců běžných aminokyselin včetně například postranních řetězců Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr & Val; (CHz)n CONHR¹⁰, kde n=l-3 a R¹⁰ je vybráno z Cx_₆ alkylů, cyklopentylu, cyclohexylu a fenylu a každý dříve zmíněný R^L0 je volitelně substituován. halogenem, C_x.₄ alkylem nebo C₁₌₄ alkoxylem;

-NH-N(R¹²)- kde R¹² je vybrán z H a C_x,₄ alkylu;

Y reprezentuje NH nebo 0

Z je vybráno z

- (CH₂) _n-C0₂ H (n = 1- 4)

-CH₂OCH₂CO₂H

-CH₂-CH=CH-CO₂H

- (CH₂)_n tetrazol-5 yl (n = 1- 4)

-(CH₂)_n CONHSOjR¹¹ (n = 1- 4) kde R¹¹ je vybráno z

C^₄ alkylu

- (CH₂)_nSO₂NH₂ (n = 1-4) a soli sloučenin podle uvedeného vzorce.

Vynález popisuje následující sloučeniny a jejich farmaceuticky přijatelné soli:

a) N-(4-{4- [bis- (2-chlorethyl) -amino) -3-methyl

-fenoxy} -benzoyl) -L-alanin;

«· to · · · to* ·ν • · · to · to to to to • · * · toto·· • «· to · · · · to · · to · · · · to to ·«· ·· ♦··· «· ··

b) N-[N-(4-{4- [bis- (2-chlorethyl) -amino]

-3-methyl-fenoxy} -benzoyl) -L-alanin] -L-glutamovou kyselinu

c) N-(4-{4- [bis- (2-chlorethyl)-amino] -fenoxy}

-benzoyl) -L-alanin; nebo

d) N-[N-(4-{4- [bis-(2-chlorethyl) -amino)-fenoxy} -benzoyl) -L-alanin]-L-glutamovou kyselinu.

Sloučeniny b) a d) jsou výhodně užívány dle vynálezu jako neaktivní prekurzory účinné látky (druhé složky v systému ADEPT). Sloučeniny a) a c) jsou odpovídající léčiva.

V dalším výhodném uspořádání předkládaného vynálezu je uváděna sloučenina podle Vzorce 1 nebo prekurzor b) nebo

d) popsaný výše nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl pro užití ve formě léku.

V dalším výhodném uspořádání vynálezu se sloučenina mající Vzorec 1 nebo prekurzory b) a d) popsané výše a jejich farmaceuticky využitelné sole využívají k přípravě léků pro léčbu rakoviny (v kombinaci s první složkou uvedenou ve vynálezu).

V této specifikaci jsou obecným termínem alkyl míněny jak nevětvené alkylové skupiny tak alkylové skupiny s rozvětveným řetězcem. Nicméně při jmenování konkrétních alkylových skupin, jako například propyl, je specificky míněn pouze alkyl s nerozvětveným řetězcem a výrazem izopropyl se rozumí pouze alkyl s rozvětveným řetězcem. Podobná konvence platí i pro další obecné pojmy. Je nutné si uvědomit, že pokud se jisté sloučeniny popsané Vzorcem 1 vyskytují v opticky aktivních nebo racemických formách v důsledku přítomnosti asymetrických uhlíkových atomů, vynález ve své podstatě zahrnuje všechny takové opticky aktivní nebo racemické formy, které mají tu vlastnost, že jsou substrátem pro mutantní CPB enzymy podle vynálezu. Avšak ve sloučeninách podle Vzorce 1, které mají na uhlíkovém atomu připojeny skupiny Y, Z a COOH, jestliže je přítomna odpovídající volná aminokyselina, potom atom uhlíku má výhodném uspořádání ve volné aminokyselině konfiguraci L.

Syntéza opticky aktivních forem může být provedena standardními technikami užívanými v organické chemii, které jsou všeobecně známé odborníkům v daném oboru, například syntézou vycházející z opticky aktivních výchozích materiálů nebo rezolucí racemických forem. Podobně vlastnosti substrátů pro mutantní formy CPB mohou být ohodnoceny standardními laboratorními technikami.

Z farmaceutického hlediska vhodná sůl základní sloučeniny podle . Vzorce 1 je například, sůl přidané kyseliny, ač organické či anorganické, např. kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, sírové, fosforečné, trifluoroctové, citrónové nebo maleinové.

Dále farmaceuticky vhodnou solí může být kyselá sloučenina podle Vzorce 1 ve formě soli alkalických kovů, například sodné nebo draselné soli, či soli kovů alkalických zemin, jako jsou například soli vápníku či hořčíku, amonné soli nebo soli založené na organické bázi, které vsak vytvářejí fyziologicky přijatelné kationty. Jsou to například soli . s methylaminem, dimethylaminem, trimethylaminem, piperidinem, morfolinem nebo tris-(2-hydroxyethyl) aminem.

Sloučeniny uvedené v tomto vynálezu mohou být využívány ve formě tablet, kapslí nebo tinktur pro orální podání, čípků pro rektální administraci, sterilních roztoků nebo suspenzí pro parenterální nebo intramuskulární podávání. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být podávány v případě potřeby pacientům (zvířatům či lidem),

9 U	·· 99	99	*·
						9
9	• 9	• 9'	9	4	9 9
9	* · ·	9 9 9	« 9	•	9	•
9	• ·	9 9		•	9	•
		· 999«	9		9 9

je-li nutná tato léčba v dávkách, které zaručí optimální farmaceutický účinek. Jednotlivá dávka se bude lišit u jednotlivých pacientů v závislosti na charakteru a vážnosti onemocnění, váze pacientů, speciální dietě daného pacienta, dalších užívaných lécích a dalších faktorech, které posoudí zkušený odborník. Obecně užívaná dávka se bude pohybovat v rozmezí 1 až 1000 mg na pacienta a den, a která může být podána jednorázově či v několika dávkách.

Vhodnější rozsah dávkování se bude pohybovat mezi 2,5 až 250 mg na pacienta a den, v ještě výhodnějším uspořádání v rozmezí 2,5 až 75 mg na pacienta a den.

Je-li třeba, aby bylo umožněno podávání léku ve více denních dávkách, mohou se zmíněná terapeutická množství přirozeně rozdělit do více jednotlivých dávek. Jak bylo zmíněno výše, velikost dávky je různá u jednotlivých pacientů a závisí na charakteru a závažnosti onemocnění, váze pacienta, stravovacím režimu a dalších faktorech.

Jak je. zmíněno níže, tyto kombinace mohou být obvykle formulovány do formy farmaceutických kompozic.

Přibližně 1 až 100 mg sloučeniny nebo směsi sloučenin popsaných Vzorcem 1 nebo její fyziologicky přijatelné soli je smícháno s fyziologicky přijatelným vehikulem, nosičem, excipientem, pojivém, konzervačním prostředkem, stabilizátorem, příchutí atd. Tak je vytvořena forma dávkování léku, kterou vyžaduje přijatá farmaceutická praxe. V těchto kompozicích nebo přípravcích je množství aktivní látky takové, že je. umožněno podání vhodné dávky aktivní látky v naznačeném rozmezí.

Příkladem adjuvans, která mohou být inkorporována do tablet, kapslí a podobně jsou: pojivo jako například tragant, arabská guma, kukuřičný škrob nebo želatina;

excipient jako například mikrokrystalická celulóza;

rozvolňovadlo jako například kukuřičný škrob,

-30předželatinizovaný škrob, kyselina alginová a podobně; lubrikant jako například stearát hořečnatý; sladidlo jako například sacharóza, laktóza nebo sacharin; příchutí jako například pepermint, libavková silice (wintergreen oil) nebo třešňová silice. Jestliže se léky podávají ve formě kapslí, tyto kapsle mohou obsahovat, mimo látek zmíněných výše, nějaký kapalný nosič jako například olej. Jako obal mohou být použity nej různější jiné materiály a tyto materiály mohou být použity i k jiné modifikaci fyzické formy, ve které je lék podáván. Tablety mohou být například obaleny šelakem, cukrem nebo oběma současně. Sirup nebo léčivý nápoj mohou obsahovat aktivní sloučeninu, sacharózu jako sladidlo, methyl nebo propyl parabeny (estery kyseliny p-hydroxybenzoové) jako konzervační činidla, barviva a příchutě jako například višňovou nebo pomerančovou příchuť..

Sterilní kompozice určené k podávání ve formě injekcí mohou být formulovány podle konvenční farmaceutické praxe tak, že se aktivní látka rozpustí nebo rozsuspenduje v nějakém vehikulu, jako například ve vodě pro podávání ve formě injekcí, v nějakém přirozeně se vyskytujícím rostlinném oleji jako například sezamovém oleji, kokosovém oleji, arašídovém oleji, bavlníkovém oleji atd. nebo v nějakém syntetickém mastném vehikulu jako například v ethylesteru kyseliny olejové a podobně. Je-li to žádoucí, mohou být rovněž začleněny pufry, konzervační přípravky, antioxidanty a podobně.

Sloučenina podle vynálezu mající -Vzorec 1, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, mohou být připraveny jakýmkoli známým procesem, kterým se připravují strukturně příbuzné sloučeniny. Vynález rovněž popisuje tyto postupy, které jsou dále ilustrovány v následujících ukázkových příkladech, v nichž různé skupiny mají výše popsaný význam, není-li uvedeno jinak.

• 4 44 *4

-31• · ·4 • · 4 4 ♦9 • 4 ·4

III 44··«·

Příklady provedení vynálezu

1. Sloučeniny, ve kterých W = přímá vazba

Takové sloučeniny mohou být připraveny postupem popsaným na Obrázku 9. Tyto neaktivní prekurzory účinné látky jsou štěpeny prostřednictvím mutantní CPB. Výsledkem tohoto štěpení je uvolnění meziproduktu, který je dále degradován za vzniku odpovídajícího fenol-mustard (typická IC_5O=1 μΜ) .

Sloučeniny odvozené od bis(2-chlorethyl)]aminu budou dále v textu označovány výrazem mustard.

Mezi činidla použitelná pro kroky a až d patří:

(a) DCCI, HOBT nebo ve vodě rozpustný karbodiimid (EDCI) nebo izobutylester kyseliny chlormravenčí/ triethylamin;

(b) TFA (jestliže P_x = t-butyl a P2 je benzyl) nebo. H₂/Pd/C (jestliže P_x je benzyl a P2 = t-butyl) ;

(c) EDCI, DMAP, CHC1₃, (d) H₂/Pd/C jestliže je jako chránící skupina použit P₂ = benzyl nebo TFA, jestliže je jako chránící skupina použit t-butyl.

Sloučenina 2 na Obrázku 9

i) Jestliže Y = NH₂ a P₂ je chránící skupina jako například benzyl, a jestliže Z je například -(CH₂)_n-CO₂H (η = 1 až 4) , pak jestliže n = 1, je použit dibenzylester kyseliny L-asparagové; jestliže n = 2, je použit dibenzylester kyseliny L-glutamové

* ··		*4	·*
•	•	•	• ·	• 9	• *
•	•	• ·	• · ·	*· ·	•	4
	•	•	• ·	• • ·	• • 4	«

a; jestliže n = 3, je použit dibenzylester kyseliny L-aminoadipové.

ii) Když Z je -(CH₂) _n-tetrazol: v případě, že například n = 2, je k vytvoření požadovaného meziproduktu (ze známého methylesteru) chráněného dibenzylovou skupinou použit sled reakcí znázorněný na Obrázku 10. Mezi činidla použitelná pro kroky a až e patří:

(a) Cs₂CO₃, PhCH₂Br, DMF;

(b) 10% Pd/C, Hj, BOC-O-BOC;

(c) NaOH, MeOH, H₂O;

(d) Cs₂CO₃, PhCH₂Br, DMF; izomery jsou odděleny;

(e) HC1, ether, CH₂C1₂ iii) Jestliže Z je - (CH₂) _nCONHSO₂R^xl, pak, když například n = 2 a R¹¹ = Me, je chráněný meziprodukt vytvořen z N-BOC-cc-benzylesteru kyseliny glutamové, jak je popsáno na Obrázku 11. Mezi činidla použitelná pro kroky a až e patří:

(a) MeSO₂NH₂ , DCCI, DMAP;

(b) HC1, EtOAc.

iv) Jestliže Z = -(CH₂)_nSO₂NH₂ pak, když například n = 2, je použit benzylester kyseliny L-2-amino-4sulfamylbutanové, připravený z kyseliny L-2-amino-4sulfamylbutanově (Aldrich Chemical Company).

v) Sloučeniny, kde Y označuje OH jsou připraveny s využitím zavedených postupů nebo například za použití sloučenin, jakými je například kyselina L-jablečná použitá namísto odpovídající kyseliny L-glutamové.

1 ··	·♦	««	*·
• ·				9 9	• ·	•	4
«	• *		•	9	• ·		99
•	• · ·		•	9 ·	«·>		9
«	• ·		•	•	•		9
		t·			«·		«»

Sloučenina 3 na Obrázku 9

i) Jestliže X = -CH₂CH₂-, pak může být meziprodukt připraven reakcí sloučeniny znázorněné jako Sloučenina 2 na Obrázku 9 a anhydridu kyseliny jantarové. Výsledkem této reakce je vznik monoesteru kyseliny jantarové, kde PÍ = H. Jinou možností je použít k navázání na výše zmíněný meziprodukt namísto anhydridu kyseliny jantarové její monoestery.

ii) Jestliže X = -NHCH(R⁹)- , pak neaktivní prekurzor účinné látky je štěpen mutantní CPB za vzniku sloučeniny popsané Vzorcem 5, která je sama o sobě cytotoxická. Jestliže například R⁹ = (CHZ) zCONH-nC4H9 a R¹=R²=C1, R³=R⁴=R⁵=R^s=H pak konstanta cytotoxicity této sloučeniny měřená u LoVo buněk je ICSQ = 20 μΜ,

Při přípravě sloučenin kde X = NHCH(R⁹) je použita metodologie konvenční syntézy peptidu ilustrovaná na Obrázku 12. Meziprodukt je následně vystaven působení kyseliny (například HCl/ether) za vzniku volného aminu. Připojení k fenol-mustard sloučenině je provedeno postupem znázorněným na Obrázku 13. Mezi činidla použitelná při kroku a patří·:

1. para-nitrofenylester kyseliny chlormravenčí, triethylamin, chloroform

2. triethylamin, CH₂C1_Z nebo;

1. COCl_z/chinolin, CH_ZC1_Z

2. triethylamin, CH_ZC1_Z

Sloučeniny, kde W = CH_Z a X = -NH-NH(R¹²)Tyto sloučeniny mohou být syntetizovány postupem popsaným na Obrázku 14.

* · ·	A*	»»	• A	♦ A
·· A »	A A	A A	A	A	A
• A	A ·	A	A A	A <
• A	·' A A	• A	·♦·	A A
• A	A A	A	A	A	•
< A A A A A A	• A	ΑΑΑ»	tA	A*

Mezi vhodná reakční činidla pro kroky a až b patří:

(a) BOC-N (R¹²)-NH₂, EDAC, CH₂C1₂ ; TFA, HCl/ETOAc (b) 1. pyridin, CH₂C1₂

2. triethylamin, CH₂C1₂

Chránící skupiny jsou z výsledného produktu následně odstraněny pomocí standardních metod.

Jestliže je požadována farmaceuticky přijatelná sůl sloučeniny popsané Vzorcem I, tato může být získána, například, reakcí uvedené sloučeniny s vhodnou kyselinou nebo zásadou za použití obvyklých postupů. Jestliže je požadována opticky aktivní forma sloučeniny popsané Vzorcem I, tato může být získána provedením jednoho z výše zmíněných postupů za použití opticky aktivního výchozího materiálu nebo rozdělením racemických forem zmíněné sloučeniny pomocíkonvenčních postupů.

Dalším využití mutantních CPB podle vynálezu je:

i) Karboxypetidázy mohou být použity k postupnému odštěpování C-koncových aminokyselin proteinů a následná analýza uvolněných aminokyselinových zbytků může být použita ke zjištění aminokyselinové sekvence

C-konců proteinů

Enzymology, 1967,

Press). Použití (R. P, Ambler, svazek XI, 436 mutantní CPB v : Methods v až 445, Academie specifické pro aminokyselinové zbytky kyseliny asparagové a glutamové přítomné na

C-konci proteinů umožňuje širší využití těchto enzymů tím, že rozšiřuje rozsah a zárověň usnadňuje analýzu C-konce proteinů využívající štěpení pomocí karboxypeptidázy.

ii) Mutantní enzymy mohou být použity jako značky (markéry) při různých imunostanoveních. Produkt • ·♦ 9» «4 ···· ♦ · · · · · 4 4 · « 4* • .· 4 4 4 4 ··· • · · 4 » 4 4 * 4 4 ·4 •9 444999 ······· 44 4444 49 tt

-35získaný Štěpením substrátu (neaktivního prekurzoru účinné látky) může být detekován pomocí libovolné vhodné techniky, například HPLC. Metody imunostanovení, pří kterých jsou jako značky využívány enzymy jsou popsány v A Practical Guide to ELISA, autor D.H. Kemeny, Pergamon Press 1991.

Vynález bude dále popsán v následujících Příkladech, které nejsou míněny jako omezení použití vynálezu (s odkazem na Referenční příklady), kde:

(i) odpařování bylo prováděno vakuově na rotační odparce a další zpracování bylo prováděno po odstranění pevných zbytků filtrací;

(ií) všechny operace byly prováděny za pokojové teploty, tj . v teplotním rozmezí 1Θ až 25°C a v atmosféře inertního plynu jako například argonu;

(iii) kolonová chromatografie ( flash postup - kolonová chromatografie, při níž je eluční činidlo aplikováno na kolonu pod určitým tlakem) a střednětlaká kapalinová chromatografie (medium pressure liquid chromatography - MPLC) byly prováděny na silikagelu Kiesegel firmy Měrek (položka 9385) nebo silikagelu s obrácenou fází Lichroprep RP-18 (položka 9303} získané od firmy E. Měrek, Darmstadt, Německo (iv) výtěžky jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nejsou nezbytně výtěžky maximálně dosažitelné;

(v) koncové produkty, popsané Vzorcem I poskytují uspokojivé výsledky při mikroanalýze a jejich struktury byly potvrzeny pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a hmotové spektroskopie; není-li uvedeno jinak, ke stanovení spektrálních dat pomocí NMR byly použity roztoky koncových produktů popsaných Vzorcem I v CDC1₃,„ a chemický posun byl měřen na

-35ΦΦ *· φφ φφ ·· • φφφφ φφφφ φφφ ♦ φ · φφ φ ·♦ φ · · φφφ · · • φ · φ φ φ

Φ·· ·· Φφφφ φΦ ΦΦ stupnici delta; byly použity následující zkratky: s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet;

(vi) meziprodukty nebyly dokonale charakterizovány a jejich čistota byla stanovována pomocí chromatografie na tenké vrstvě, infračervené spektroskopie (IR) a NMR spektroskopie;

(vii) uvedené teploty tání jsou nekorigované a byly stanoveny za použití automatického bodotávku Mettler SP62 nebo bodotávku s olejovou lázní; teploty tání koncových produktů popsaných Vzorcem I byly stanoveny po krystalizaci těchto sloučenin z běžných organických rozpouštědel, jakými jsou například ethanol, methanol, aceton, ether nebo hexan, použitých buď v čistém stavu nebo ve směsi a;

(viii) všechny teploty jsou udávány ve °C.

Použité zkratky

Ac	acetyl
ADEPT	antibody directed enzyme prodrug therapy
BOC	terč-butoxykarbonyl
CPB	karboxypeptidáza B
DCCI	1,3.-dicyklohexylkarbodiimid
DMAP	4-dimethylaminopyridin
DMF	N, N-dimethylformamid
DMSO	dimethylsulfoxid
Et	ethyl
EDCI	1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-karbodiimid
HCPB	lidská karboxypeptidáza B

HOBT 1-hydroxybenzotriazol

-37·« 99 ·9 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · ·· a · a a a a ··< · a a · a · · a a *·· i* 9999 9· 99

PCR polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

TFA trifluoroctová kyselina

THF tetrahydrofuran

Stručný ooois obrázků:

Obrázek 1 ilustruje postup klonování lidské pankreatické HCPB.

Obrázek 2 ilustruje postup při sekvenování lidské pankreatické CPB. Všech 6 sekvenovaných klonů mělo totožné sekvencea všechny obsahovaly: (A) aspartát v rozpoznávacím místě prosubstrát; (B) vložený kodón TGC, který mění polypetidovou sekvenci z ..GSS G.. na: ..GSSCG..

Obrázek 3 znázorňuje vektor pICI1266.

Obrázek 4 ilustruje klonování genu do expresívního vektoru pICI1266.

Obrázek 5 ilustruje cytotoxicitu neaktivního prekurzoru. účinné látky a odpovídající účinné látky. Na svislé ose je vyneseno % přežívajících buněk, na vodorovné ose je koncentrace použité látky v μΜ. Křivka A platí pro vlastní účinou sloučeninu fenol-mustard zatímco křivka B je pro neaktivní prekurzor účinné látky na bázi kyseliny glutamové.

Obrázek 6 je seznamem položek růstového média.

Obrázky 7 až 14 ilustrují postupy chemické syntézy.

Obrázek 15 ukazuje cytotoxicitu samotného (bez přítomnosti enzymu) neaktivního prekurzoru účinné látky z Příkladu 21 a cytotoxicitu odpovídající účinné látky z Příkladu 22 (samotné) v nádorových buňkách LoVo. Na svislé ose je vyneseno % přežívajících buněk, na

-3844 · ♦ 4 4 4 # « « ··

9 9 ♦·♦ • 9 99 9 4 · 44 · 4·

9 9 9 9 9 99

9·4 ·4«4 ·» «44« *·♦ vodorovné ose je koncentrace použité látky v μΜ. Křivka A platí pro účinou látku zatímco křivka B je pro neaktivní prekurzor účinné látky .

Obrázek 16 ukazuje cytotoxicitu neaktivního prekurzoru účinné látky z Příkladu 21 za přítomnosti mutantního enzymu D253K HCPB v nádorových buňkách LoVo. Číslované řady reprezentují: 1 = slepý vzorek (žádné buňky); 2 až 4 účinná látka z Příkladu 22 v koncentracích 50, 100 & 200uM ; 5 až 8 = neaktivní prekurzor účinné látky z Příkladu 21 za přítomnosti 1,47, 2,4, 5,9 a 11,75 pg/ml D253K HCPB; 9 = neaktivní prekurzor účinné látky z Příkladu 21 v koncentraci 500 μΜ; a 10 = kontrolní vzorek (pouze buňky). Každá číslovaná řada obsahuje 2 sloupce (s intervalem spolehlivosti), přičemž každý sloupec reprezentuje data z 6 jamek na plotně.

Obrázek 17 ilustruje chemickou syntézu.

Referenční příklad 1 Syntéza kyseliny Hippuryl-L-glutamové (viz. Obrázek 8)

V atmosféře vodíku byly po dobu 1,5 hodin míchány dibenzyl ester kyseliny Hippuryl-L-glutamové (Sloučenina 3) (2,06g,

4,2 x 10‘³ mol) a 30% Pd/uhlík (50% vlhkost) (0,77g) v THF. Směs byla přefiltrována přes křemelinu (Celíte™) a získaný filtrát byl odpařen dosucha. Rozetření s diethyletherem poskytlo požadovaný koncový produkt ve formě bílé krystalické látky o hmotnosti l,02g (78%). Teplota tání 169 °C až 171 °C. 20D = -2,5°.

NMR	DMSO	d6	12,3,	2H	(široký)	; 8,7, 1H	(t) ;	8,2,	1H (t) ;
7,9,	2H (	m) ;	7,5,	3H l	(m); 4,3,	1H (m) ; 3,	9, 2H	(m) ;	2,3, 2H
(t) ;	1,9,	2H	(m)

«· ·♦ *» • · · · · · • · * ·· • · ··· * · « « · • •«t »· ··

•		··
	t ·	• »
•	•	•	9
	• ·	»	9
«	•	•	O
		99

Výchozí materiál pro přípravu Sloučeniny 3 byl připraven následovně.

K roztoku kyseliny hippurové (0,90 g, 5xl0'³ mol) a dibenzylesteru kyseliny L-glutamové (2,50 g, 5xl0'³ mol) v DHF (35ml) byl přidánl-hydroxybenzotriazol (0,73g, 5,5xl0'³ mol), triethylamin (l,4ml, 9,7xl0'³ mol) a

1-(3-dimethyl-aminopropyl)-3-ethylkarbodiimid ve formě soli s HC1 (l,05g, 5,5xl0'³ mol) . Směs byla přes noc míchána při pokojové teplotě, nalita do vody (400ml) a dvakrát extrahována pomocí octanu ethylnatého (lOOml). Spojené extrakty byly promyty nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 2N HC1 a vodou. Organická fáze byla vysušena pomocí MgSO₄ a odpařena. Tímto postupem byl požadovaný výchozí materiál získán ve formě žlutého oleje.. 2,06 g (84%) .

NMR DMSO d6 8,7, IH (t) ; 8,4, IH (d) ; 7,9, 2H (m) ; 7,5, 3H (m) ; 7,35, 10H (m) ; 5,'15,. 2H (s) ,- 5,05, 2H (s.) ; 4,4, IH (m) ; 3,9, 2H (t) ; 2,0, 4H (m) .

Referenční příklad 2: Syntéza kyseliny Hippuryl-L-Asparagové

V atmosféře vodíku byly po dobu 3 hodin míchány dibenzyl ester kyseliny Hippuryl-L-asparagové (1,28 g, 2,7 x 10’³ molů) a 30% Pd/uhlík (50% vlhkost) (0,51 g) v THF. Směs byla přefiltrována přes Celíte™ a získaný filtrát byl odpařen dosucha. Rozetření s diethyletherem poskytlo požadovaný koncový produkt ve formě ne zcela bílé krystalické látky o hmotnosti 0,62g (78%). Teplota tání 200 °C až 202 °C. 20D = + 7,9°.

NMR DMSO d6 12,5, 2H (Široký); 8,7, IH (t) ;. 8,2, IH (d) ;

7,7 , 2H (m) ; 7,5, 3Ή (m) ; 4,6, IH (m) ; 3,9, 2H (d) ; 2,7, 2H (m)

Výchozí materiál byl připraven následovně.

K roztoku kyseliny hippurové (0,90 g, 5 x 10'³ mol) a dibenzylesteru kyseliny L-asparagové (2,50 g, 5 x 10'³ mol) v DHF (35ml) byl přidánl-hydroxybenzotriazol (2,31 g, 5 x 10³' mol), triethylamin (l,4ml, 9,7 x 10'³ mol) a

1-(3-dimethyl-aminopropyl)-3-ethylkarbodiimid ve formě soli s HC1 (l,05g, 5,5 x 10'³ mol) . Směs byla po dobu 4 hodin míchána při pokojové teplotě, nalita do vody (450ml) a dvakrát extrahována pomocí octanu ethylnatého (lOOml). Spojené extrakty byly promyty nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 2N HC1 a vodou. Organická fáze byla vysušena pomocí MgSO₄ a odpařena. Tímto postupem byl požadovaný výchozí materiál získán ve formě žlutého oleje. 1,90 g (80%).

NMR DMSO d6 8,7, IH, (t) ; .8,45, IH, (d) ; 7,9, 2H (m) ; 7,5, 3H (m) ; 7,3, 10H (m) ; 5,15, 2H (s) ; 5,05, 2H (s) ; 4,8, IH ^J(m); 3,9, 2H (m); 2,9, 2H (m)

Referenční příklad 3: Enzymatická aktivita rekombinantní HCPB měřená na substrátu Hipp-Arg.

Za použití spektrofotometrického stanovení byla u purifikované lidské CPB, získané postupem popsaným v Referenčním příkladu 12, stanovena její schopnost přeměny hippuryl-L-argininu (Hipp-Arg; Sigma) na volnou kyselinu hippurovou. Hodnoty Km a kcat pro nativní HCPB byly stanovovány měřením počátečních rychlostí přeměny Hipp-Arg na ' volnou kyselinu hippurovou v rozmezí koncentrací Hipp-Arg (0,75 až 0,125 mM ) a při koncentraci CPB odpovídající 1 gg/ml. Měření byla prováděna při 37°C v pufru 0,25 mM Tris-HCl,. pH 7,5 za použití kyvet o šířce 1 cm, v celkovém objemu 1,0 ml. Měření byla prováděna při vlnové délce 254 nm na spektrofotometru Perkin Elmer Lambda

-41«4

2. Hodnoty Km a Vmax byly vypočítány za použití softwearového programu ENZFITTER (Biosoft, Perkin Elmer). Hodnota kcat byla vypočítána z hodnoty Vmax vydělením příslušné hodnoty koncentrací enzymu v reakční směsi.

Výsledky pro lidskou CPB měřenou na substrátu Hipp-Arg byly:

Km = 0,18 mM kcat = 65 s'¹

Získané výsledky ukazují, že rekombinatní HCPB je enzymaticky aktivní a může štěpit amidovou vazbu přítomnou v Hipp-Arg a tím uvolnit kyselinu hippurovou.

Referenční příklad 4: Syntéza arginin-mustard neaktivního prekurzoru účinné látky (viz. Obrázek 7)

Kyselina (2S), 2-(3-(4- [bis-(2- chlorethyl) -amino)

-fenoxykarbonyl} -propionyl -amino) -5-guanidin- pentanová (Sloučenina 5c, Obrázek 7)

Roztok benzylesteru kyseliny (2S), 2-(3-(4-[bis(2-chlorethyl)-amino)-fenoxykarbonyl}-propionyl-amino)-5-(2 -nitro)-guanidin-pentanové (Sloučenina 4c, Obrázek 7) (275 mg; 0,44 mmol) ve směsi octan ethylnatý/MeOH (1/1: V/V) (8 ml) obsahující 10% Pd/C (200 mg) byl v Paarově aparatuře hydrogenován při tlaku 0,551 MPa (80 psi) po dobu 6 hodin. Po zfiltrování byla organická vrstva odpařena.

Získaný olej byl rekrystalizován za použití směsi CH₂Cl,/diethvlether a výsledkem této rekrystalizace byl vznik požadované Sloučeniny 5 ve formě bílé pevné látky (180 mg), výtěžek 84%.

¹HNMR (CD₃OD) : 1,55 až 1,7 (m, 3H) ; 1,8 až 1,9 (m, 1H) ; 2,6 až 2,7 (m, 2H) ; 2,75 až 2,85 (m, 1H); 2,9 až 2,95 (m, 1H);

3,1 až 3,2 (m, 2H); 3,6 až 3,7 (m, 4H) ; 3,7 až 3,8 (m, 4H);

4,3 (dd, IH); 6,75 (dd, 2H) ; 6,95 (dd, 2H).

MS (ESI): 512 až 514 (MNa) +

Analýza (C_2ĎH₂₉N₅O₄C₁₂ 1,5 H₂0)

Vypočteno: %C: 47,91; H.: 6,43; N: 13,97

Naměřeno: %C: 47,7; H: 6,21; N: 14,26 materiál (Sloučenina 4c)

K roztoku benzylesteru byl kyseliny (Sloučenina ml) byl (120 mg; 2 připraven (2S),

2c) (654 přidán mmo1) a

CHC1₃ (10 (Sloučenina 1) ' triethylamin (202 mg; 2 mmol) . Po 2 pokojové teplotě bylo rozpouštědlo výchozí následovně.

2-amino-5-(2-nitro)-guanidin-pentanové mg; 1 mmol) v dihydro-furan-2,5-dion .

následně pak po kapkách hodinovém míchání při odpařeno a surový zbytek byl rozpuštěn ve vodě. .Pomocí 2N HC1 bylo pH upraveno na hodnotu 2,5. Vodná vrstva extrahována octanem ethylnatým. Organická vrstva vysušena (MgSOJ a rozpouštědlo tohoto postupu byl benzylester kyseliny propionylamino) (Sloučenina 3c) .

diethyletherem a promyta solankou, odpařeno. Výsledkem (2S),2-(3-karboxyguanidin-pentanové byla rozetřena s činil 280 mg (68 %) byla byla bylo

-5(2-nitro)Získaná pevná látka zfiltrována. Výtěžek ^NMR (CD₃OD) : 1,52 až 1,68 (m, 2H) ; 1,7 až 1,8 (m, IH) ;

1,85 až 1,95 (m, IH); 2,45 až 2,7 (m, 4H); 3,15 až 3,3 (m,

2H); 4,5 (m, IH); 5,15 (dd, 2H); 7,25 až 7,4 (m, 5H)

MS (ESI): 432 (MNa)+

K roztoku Sloučeniny 3c (204 mg; 0,5 mmol) v CHC1₃ (5 ml) byl přidán 4- (bis (2-chlorethyl)amino]-fenol (Sloučenina

6) (135 mg; 0,5 mmol), EDCI (19 mg; 0,5 mmol) a následně pak DMAP (18 mg; 0,75 mmol). Po míchání po dobu 6h při pokojové teplotě bylo rozpouštědlo odpařeno. Zbylá část

-43• · * 4444« * · 4 4 4 · 4444· i * 4 4 44

44 *44444 Μ byla rozdělena mezi octan ethylňatý a vodu a vodná fáze byla pomocí 2N HC1 okyselena na hodnotu pH = 3. Po extrakci octanem ethylnatým byla organická fáze promyta solankou, vysušena (MgSOj a rozpouštědlo bylo odpařeno. Takto získaný zbytek byl purifikován flash chromatografií, při které byla jako eluant použita směs CH₂Cl₂/MeOH (95/5: V/V) . Výsledkem tohoto postupu byl požadovaný výchozí materiál 4c získaný ve formě bílé pěny (281 mg). Výtěžek: 90 %.

4c: ^NMR (CDjOD) : 1,55 až 1,7 (m, . 2H) ; 1,7 až 1,8 (m, 1H) ; 1,85 až 1,95 (m, 1H); 2,55 až 2,75 (m, 2H); 2,8 až 2,9 (m, 2Ή) ; 3,15 až 3,25 (m, 2H) ; 3,6 až 3,7 (m, 4H) ; 3,7 až 3,8 (m, 4H); 4,5 (dd, 1H); 5,15 (dd, 2H); 6,7 (d, 2H); 6,95 (d, 2H) ; 7,32. (m, 5H)

MS (ESI) : 647 až. 649 (MNa) +

Referenční příklad 5: Syntéza mono-(4-[N, N-bis(2-chlorethyl) amino]-fenyl} esteru kyseliny jantarové (označované též jako meziprodukt)

K suspenzi anhydridu kyseliny jantarové (225 mg, 2,25 mmol) v CHC1₃ (10 ml) byl za stálého míchání přidán 4-[Ν,Ν-bis(2-chlorethyl)-amino]fenol (Sloučenina 6, Obrázek 7; 203 mg, 0,75 mmol) a dále pak triethylamin (75 mg, 0,75 mmol) . Směs byla míchána přes noc a poté bylo rozpouštědlo odpařeno. Surový zbytek byl rozpuštěn ve směsi EtOAC/Et₂O/H₂O a za stálého míchání bylo pH upraveno na hodnotu 3. Organická vrstva byla promyta vodou, solankou, vysušena pomocí (MgSOj a rozpouštědlo bylo odpařeno. Vzniklý olej byl krystalizován ze směsi Et₂O/hexan a bílá pávná látka byla odfiltrována a vysušena ve vakuu, čímž byl získán požadovaný koncový (210 mg; výtěžek 83¾). Teplota tání 98 až 100°C.

9« 9 · 99 99 ··

-44• · · · «*· · · · · 9 ·· 9 ··

9*9 9 '9*

949 ·· 9999 ♦♦··

MS (ESI): 356 až 358 (MNa)+

NMR (CDClj) : 2,8 (dd, 2H) ; 2,9 (dd,2H); 3,65 (dd, 4H) ;

3,75 (dd, 4H); 6,65 (d, 2H); 7,0 (d, 2H)

Analýza (C14H17C12O4N; 0,2 H2O) ,
Vypočteno: %C:	49,78; H:	5,19; N:	4,15
Naměřeno: %C:	49,9; H:	5,3; N:	4,2

Referenční příklad 6: Klonování lidské pankreatické karboxypeptidázy B (HCPB)

Standardní techniky molekulární biologie jako například štěpení restrrkčními enzymy, ligace, kinázové reakce, defosforylace, polymerázová řetězová reakce (PCR), transformace baktérií, gelová elektroforéza, příprava pufrú a klonování, purifikace a izolace DNA, byly prováděny postupy popsanými v Maniatis a další, (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual; druhé vydání: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, nebo podle postupů doporučených výrobci jednotlivých produktů. Ve většině případů byly enzymy zakoupeny od New England BioLabs, nicméně mohou být rovněž použity výrobky od jiných dodavatelů či ekvivaletní postupy. Oligonukleotidy byly syntetizovány za použití syntetizéru DNA Biosystems 380A a jako materiál pro syntézu byly použity 2-kyanoethyl-N,N'diizopropyl- fosforamiditové nukleosidy s bází chráněnou 5' dimethoxytritylem. Chráněné nukleosidy byly navázány (přibližně 0,2 /xmol) na nosič tvořený skleněným materiálem o definované velikosti pórů a toto navázání a vlastní syntéza probíhala v souladu s postupem doporučeným firmou Applied Biosystems lne.

-45Kódující sekvence lidské pankreatické karboxypeptidázy B byla získána z cDNA knihovny z lidského pankreasu zaklonované do vektoru XgtlO (Clontech, Human pankreas 5' STRETCH cDNA, HL1163a) za použití technologie PCR, a zaklonována do plazmidu pBluescript II KS+ (Stratagene).

Při obvyklém postupu byl alikvot z cDNA knihovny (5 μΐ, titr 10^apfu/ml (pfu-plaque forming unit)) smíchán se dvěma oligonukleotidovými primery BPT1 a BPB1 (SEK. ID. Č: 28 a SEK. ID. Č: 29) o koncentracích 100 pmol, dNTP o výsledných koncentracích 200uM, reakčním pufrem pro polymerázu Taq a 2,5 jednotkami polymerázy Taq v celkovém objemu 100 μΐ. Před přidáním polymerázy Taq byla tato směs po dobu 10 minut zahřívána na teplotu 94 °C a reakce PCR byla provedena ve 30 cyklech: 94°C po dobu 1,5 minuty, 50°C po dobu 2 minut a. 72°C po dobu 2 minut, po kterých na konci reakce následovala jediná inkubace při 72°C po dobu 9,9 minuty.

Oba oligonukleotidové primery byly navrženy tak, aby pomocí PCR umožnily vytvoření genu ohraničeného na 5' konci kódujícího vlákna sekvencí komplementární ,k BPT1 (SEK. ID. Č. : 28), nacházející se v místě odpovídajícímu sekvenci přítomné mezi sekvencí kódující začátek pre-proteinu a sekvencí kódující začátek pro-proteinu, a' na 3' konci kódujícího vlákna ohraničeného sekvencí komplementární k BPB1 (SEK. ID. Č. : 29). Oligonukleotidy BPT1 a BPB1 byly rovněž navrženy tak, aby do produktu PCR reakce zavedly jedinečná restrikční místa Sací (BPT1) a Xhol (BPB1).

Alikvot produktu připraveného pomocí PCR byl elektroforézou na agarózovém gelu analyzován za účelem zjištění přítomnosti DNA o správné velikosti (přibližně 1250 párů baží ) a bylo zjištěno, Že obsahuje převážně proužek odpovídající velikosti. Zbylý produkt přítomný v reakční směsi byl purifikován a oddělen od přebytku činidel

-46za použití mikrokoncentračního sloupce Centricon 100 (Amicon) a následné izolace DNA precipitací směsí ethanol/octan sodný, centrifugací, vysušením ve vakuu a rozsuspendováním v destilované vodě. Izolovaná DNA byla rozštěpena restrikčními enzymy Sací a Xhol, a z agarožového gelu (po elektroforéze) byl proužek o správné velikosti (přibližně 1250 párů baží) purifikován a izolován vyříznutím z gelu a následným využitím činidla s komerčním názvem GLASSMILK (Geneclean, Stratec Scientific, nebo jiný obdobný produkt).

Dvouvláknová DNA vektoru pBluescript II KS+ (Stratagene) byla rozštěpena restrikčním enzymem Sací a získaný produkt byl působením telecí intestinální alkalické fosfatázy defosforylován. Touto def osforylací byly z:· vektoru odstraněny 5' fosfátové skupiny a tím vlastně snížena intenzita zpětné ligace samotného vektoru a počet., negativních kolonií (bez inzertu) vyrostlých po transformaci. Získaná DNA byla za použití činidla s komerčním názvem GLASSMILK zbavena kontaminujících látek ’ z. reakční směsi a poté štěpena restrikčním enzymem Xhol. DNA. o správné velikosti (přibližně 2850 párů baží) byla purifikována a izolována vyříznutím z agarožového gelu (po elektroforéze) a následným využitím činidla s komerčním názvem GLASSMILK (Geneclean, Stratec Scientific, nebo jiný obdobný produkt).

U alikvotů obou restrikčně rozštěpených a purifikovaných vzorků DNA byla pomocí elektroforézy na agarózovém gelu stanovena jejich čistota a srovnáním se standardy o známé koncentraci odhadnuta jejich koncentrace. S využitím těchto odhadů byla, za účelem zaklonování genu pro HCPB do vektoru, připravena ligační směs obsahující ligázu T4 DNA, 1 mM ATP, ligační pufr. a DNA s molárním poměrem vektor:inzert 1:2,5 (1 pBluescript II KS+ : 2,5 HCPB PCR produkt) o výsledné koncentrací 2,5 ng/μΐ.

•
•	• · · ·	• *	« 9
	9 9 · 9 9 9	• · 9	• «
	9 9 9 9		• ♦
		V ·	Λ 9

Po ligaci byla, směs DNA z ligační reakce použita k transformaci buněk E. coli kmene DH5a (Gibco-BRL, superkompetentní buňky). Alikvoty těchto transformovaných buněk byly vysety na plotny s L-agarem (živné médium) obsahujícím jako selekční markér ampicilin v koncentraci 100 ^g/ml, a tyto plotny byly inkubovány přes noc při 37°C. Kolonie obsahující plazmid spolu s požadovaným inzertem byly identifikovány pomocí hybridizačních technik.

Přibližně 200 kolonií bylo sebráno a v duplikátech vyseto na sterilní nitrocelulóžové filtry (Schleicher a Schull) umístěné na plotnách s L-agarem (živné médium) obsahujícím jako selekční markér ampicilin v koncentraci 100 gg/ml, a inkubovány přes noc při 37°C. Jeden duplikát je uskladněn při 4°C a slouží jako zdroj živých buněk pro případnou produkci kolonií, a druhý, filtr je vystaven působení denaturačnícha fixačních činidel za účelem fixace. DNA z jednotlivých kolonií na tento nitrocelulózový filtr.

Tento nitrocelulózový umístěn na filtrační následujícím pořadí:

filtr je odstraněn z agarové plotny a papíry

Whatman napuštěné roztoky v

1.	10% SDS po dobu 2 minut
2 .	0,5M NaOH, 1,5M NaCl po dobu 7 minut
3 .	0,5M NaOH, 1,5H NaCl po dobu 4 minut
4 .	0,5M NaOH, 1,5M NaCl po dobu 2 minut

Tris pH 7,4, 1,5M NaCl po

5.

0,5H dobu 2 minut

6. 2xSSC (standardní fyziologický roztok pufrovaný citrátovým pufrem) po dobu 2 minut

Následně je tento filtr umístěn na filtrační papíry Whatman napuštěné lOxSSC a denaturovaná DNA je k nitrocelulóze navázána působením ultrafialového záření (crosslinker UV Spectrolinker XL-1500).

•		• to	to to	*
to	to	to	•	«	• ·
•	•	to *		to	• ··· to
*	•	to	•	to	to to
			• to	··· »	to ·

Filtry jsou poté vysušeny na vzduchu při pokojové teplotě a následně jsou za mírného třepání prehybridizovány po dobu 1 hodiny při 60°C v roztoku 6xSSC (například za použití hybridizátoru Techne HB-1D). Prehybridizace zablokuje na filtrech místa nespecificky vážící DNA.

Za účelem určení, které kolonie obsahují požadované inzerty DNA, je DNA navázaná na nitrocelulózový filtr hybridizována s radioaktivně značenou sondou HCPB ³²P-DNA připravenou pomocí PCR z pankreatické knihovny cDNA (viz. výše) . Přibližně 50 ng DNA bylo za použití DNA polymerázy T7 označeno pomocí 50 μΟί ³²P-dCTP (~3000Ci/mmol) ; reakce probíhala 15 minut při 37°C v celkovém objemu 50 μΐ (Pharmacia kit T7 Quickprime). Za účelem denaturace dvoj vláknové DNA je poté radioaktivně označená sonda inkubována po dobu 2 minut při 95° C a následně okamžitě, přenesena do 10 ml SxSSC o teplotě 60°C a tímto roztokem jenahrazen roztokpoužitý při prehybridizacifiltrů. Inkubace pokračuje za mírného třepání při 60°C další 3 hodiny. Po uplynutí této doby je hybridizační roztok odstraněn a‘ filtry jsou dvakrát (po 15 minutách) promyty roztokem 2xSSC: o teplotě 60°C. Následně byly filtry vysušeny na savém papíře, překryty fólií (Saran™ nebo podobnou) a exponovány přes noc při pokojové teplotě na rentgenový film (například Kodak Xomat-AR5™) . Po vyvolání tohoto filmu byly jako pozitivní kolonie (obsahující požadovaný inzert) identifikovány ty kolonie, které na rentgenovém filmu poskytly nej silnější signál (nej tmavější tečky). V této sérii experimentů bylo hybridizačně pozitivních přibližně 15 % kolonií. Z tohoto- počtu bylo k dalšímu testování vybráno 12 kolonií. Tyto kolonie byly sebrány s prvního duplikátu filtračního papíru, přeneseny a udržovány na plotnách s L-agarem (růstové médium) obsahujícím ampicilin v koncentraci 100 ^g/ml a rozrosteny v živném mediu obsahujícím ampicilin v koncentraci 100 ^g/ml.

« 9 • ♦ * j · ·*

9 9 · · « ·♦·*« • 9 9 9 99 9

999 9999 *'· ·*·«<»

-49Za účelem zjištění, jestli vybrané klony obsahují inzerty požadované velikosti, byly s využitím primerů BPT1 a BPB1 (SEK. ID. Č. : 28 a SEK. ID. Č. : 29) provedeny PCR reakce, při kterých byla rovněž použita dvojice vnitřní primer BPT2 (SEK. ID. Č. : 30) a primer BPB1. Primer BPT2' je navržen tak, aby byl komplementární k sekvenci kódujícího vlákna kódující konec pro-sekvence nacházející se. před počátkem sekvence kódující maturovaný protein, a aby do sekvence zaváděl restrikční místo Xbal.

Pro screening prováděný pomocí PCR byly vybrané pozitivní kolonie sebrány, rozsuspendovány v 200 μΐ destilované vody a po dobu 10 minut zahřívány v mikrozkumavkách (Eppendorf) na teplotu 100°C. Buněčné suspenze byly následně po dobu 10 minut centrifugovány v mikrocentrifuze za účelem odstranění buněčných částí a 1 μ.1 supernatantu byl použit jako templátová DNA pro screening prováděný pomocí PCR. Při obvyklém provedení byl 1 μΐ supernatantu smíchán s 20 pmoly oligonukleotidových primerů BPT1 a BPB1 nebo BPT2 a BPBT, dNTP o výsledných, koncentracích 200 μΜ, reakčním pufrem pro polymerázu Taq a 0,5 jednotkami polymerázy Taq v celkovém objemu 2 0 μΐ. PCR reakce byla prováděna v 25 cyklech: 1,5 minut při 94°C, 2 minuty při 50°C a 2 minuty při 72°C. Reakce byla ukončena inkubací po dobu 9,9 minut při 72°C.

Pomocí elektroforézy na agarózovém gelu byly produkty reakce PCR analyzovány za účelem detekce přítomnosti DNA o správné velikosti (přibližně 1250 párů bází při použití primerů BPT1 a BPB1, přibližně 900 páru bází při použití primerů BPT2 a BPB1, viz. Obrázek 1). Deset z dvanácti klonů poskytlo při PCR produkty DNA o správné velikosti. Šet z těchto deseti klonů bylo použito k přípravě plazmidové DNA (za použití kitů Qiagen Maxi, ze 100 ml kultury pěstované přes noc při 37°C v živném bujónu obsahujícím ampicilin o koncentraci 100 /xg/ml) . Tyto

plazmidové DNA byly následně v oblasti obsahující inzert, který je produktem reakce PCR, sekvenovány za použití sekvenačního kitu pro sekvenování DNA USB Sequenase, který využívá DNA polymerázu T7. Každý klon byl sekvenován za použití osmi různých nukleotidových prímerů, označovaných jako 676, 336, 337, 679, 677, 1280, 1279 a 1281 (SEK, ID.

Č.: 30 až 37) . Umístění sekvenačních primerů v sekvenci

HCPB je zobrazeno na Obrázku 2, Primery 336, 1279, 676,

1280, 677 a 1281 jsou přímé primery a primery 337 a 679 jsou reverzní primery.

Bylo zjištěno, že pět ze šesti testovaných klonů má mezi restrikčními místy Sací a Xhol (včetně těchto míst) identickou sekvenci (SEK. ID. Č.: 38) sestávající z 1263 párů baží. Tato sekvence byla použita v dalších., experimentech. Translace této sekvence DNA do polypeptidu je znázorněna jako SEK. ID. Č. : 39. Počátkem maturovaného proteinu je aminokyselinový zbytek 109. Aminokyselinový zbytek číslo 14 označuje počátek předpokládaného pro-enzymu. V klonované DNA vytvořené pomocí PCR se nachází.' pouze část vedoucí sekvence pre-enzymu (pre-sekvence) . Ve. zmíněné polypeptidové sekvenci je v pozici 361 . přítomen aminokyselinový zbytek-kyseliny asparagové, který, jestliže je celá sekvence srovnán se sekvencemi jiných savčích karboxypeptidáz A a B, naznačuje, že se jedná o karboxypeptidázu se specifitou typu B (viz. aminokyseliny Číslované 255 v publikaci Catasus L, a další, Biochem. J., 287, 299 až 303, 1992, a diskuze) . Nicméně cysteinový zbytek v pozici 243 přítomný v klonované sekvenci není pozorován v žádné jiné publikované sekvenci lidské pankreatické karboxypeptidázy B, jak je zdůrazněno v publikaci Yamamoto a další, Journal of Biological Chemistry, svazek 267, 2575 až 2581, 1992, kde autorka ukazuje za pozicí označenou 244 v sekvenci mezeru, jestliže je tato sekvence srovnána še sekvencemi jiných savčích pankreatických karboxypeptidáz B. Na Obrázku 2 jsou rovněž φ φ

-519 9 · 9 9 9

9 9 9 · 9 99 9 9

9 9 9 * • · 4» * φφ · ΦΦ znázorněna přibližná místa výskytu aminokyselinových zbytků kyseliny asparagové přítomných v rozpoznávacím místě enzymu a cysteinový zbytek přítomný maturovaného enzymu (pozice 243 v pozici v SEK. ID.

135 v řetězci Č,: 39) .

Jeden z klonů byl 23.

National Collection of listopadu

Industrial and

1994 uložen v

Marině Bacteria

Limited (23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 jé označen NCIMB 40694. Plazmid z tohoto klonu je znám pod označením pICI1698.

1RY, Skotsko) a

Referenční příklad 7: Exprese maturované HCPB-(His) _s-c-Myc v E. coli

Aby bylo možné dosáhnout exprese maturované HCPB v E. coli, byl maturovaný gen z pICI1698 přenesen do plazmidového vektoru, který umožňuje řídit expresi proteinových produktů do periplazmatického prostoru bakterií. Tento vektor pro sekreci, známý jako pICI266, umístěný v hostitelské, bakteriální buňce MSD522 použitelné k řízené expresi, byl.. 11. října 1993 uložen v National Collection of Industrial and Marině Bacteria Limited (23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Skotsko) a je označen NCIMB 40589. Plazmidová mapa plazmidu pICI266 je znázorněna na Obrázku 3. Plazmid nese tetracyklinovou rezistenci a indukci (TetA a operátor AraB a promotorovou sekvenci AraB pro vloženého genu a gen AraC sloužící k řízení Promotorové sekvence je

PelB, která periplazmatického prostoru, nachází několik jediněčných místem' následuje Sekvence DNA geny pro TeTR), expresi exprese. vedoucí sekvencí sekvence za ní do genu se míst a za tímto klonování následována překládanou řídí sekreci peptidové V místě pro restrikčním sekvence terminátoru

T4.

transkripce fága charakteristiky pro klonování genu

Obrázku. 4 .

v této oblasti a jsou zobrazeny na

•	• «	·*	• *	• ·	9 9
*	• ♦	•		9 9	« ·
«	« · ·	•	• ·	99 9	•	•
•	• *	a	a	9
		U	«·««	99	«

Za účelem zaklonování maturované sekvence HCPB do vektoru pICI266 bylo rozhodnuto vytvořit pomocí PCR DNA kódující HCPB a provést určité změny v použitých kodonech v místě počátku maturovaného genu tak, aby byly zavedeny kodony upřednostňované v E. coli. K enzymu byla rovněž za účelem snadnější detekce a purifikace exprimovaného konstruktu přidána na C-konec peptidová kotva, označovaná jako (His) ₅-c-myc. Tato kotva se skládá ze šesti histidinu, peptidového linkeru ' o délce tří aminokyselin (EPE) a peptidové sekvence (EQKLISEEDL) z genu c-myc, který je rozpoznáván protilátkou 9E10 (jak je publikována v Evan a další, Mol. Cell. Biol., svazek 5, 129 až 136, 1985, a dostupnou od Cambridge Research Biochemicals nebo jiných dodavatelů antibiotik).

C-konec je ukončen asparaginem. Šest histidinových zbytků by mělo umožnit purifikaci exprimovaného proteinu na koloně s navázaným přechodným . kovem (například agaróza Ni-NTA od firmy Qiagen) . PCR primery byly rovněž- použity k zavedení jedinečných restrikčních míst 5¹ (FspI) a 3’ (EcoRI) do genu, aby bylo usnadněno zaklonování produktuPCR do expresívního vektoru. Sekvence těchto dvou primerů, označovaných jako FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1, jsou znázorněny jako SEK. ID. Č.: 40 a 41.

Za účelem vytvoření modifikovaného genu pro zaklonování do pICI266 byla provedena reakce PCR za použití 100· pmolů primerů FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1 za přítomnosti přibližně 5ng DNA pICI1698, dNTP o výsledných koncentracích 200 μΜ, reakčního pufru pro polymerázu Taq a 2,5 jednotek polymerázy Taq v celkovém objemu 100 μΐ. Před přidáním polymerázy Taq byla směs zahřívána po dobu 10 minut na 94°C a reakce PCR byla prováděna ve 30 cyklech: 1,5 minut při 94°C, 2 minuty při 50°C a 2 minuty při 72°C. Reakce byla ukončena inkubací po dobu 9,9 minut při 72°C. Alikvot produktu připraveného pomocí PCR byl elektroforézou na

agarózovém gelu analyzován za účelem zjištění přítomnosti DNA o správné velikosti (přibližně 1000 párů baží ) a bylo zjištěno, že obsahuje převážně proužek odpovídající velikosti. Zbylý produkt přítomný v reakční směsi byl purifikován a oddělen od přebytku činidel za použití mikrokoncentračního sloupce Centricon 100 (Amicon) a následné izolace DNA precipitací směsí ethanol/octan sodný, centrifugací, vysušením ve vakuu a rozsuspendováním v destilované vodě. Izolovaná DNA byla rozštěpena restrikčními enzymy FspI a EcoRI, a z agarózového gelu (po elektroforéze) byl proužek o správné velikosti (přibližně 1000 párů baží) purifikován a izolován vyříznutím z gelu a následným využitím činidla s komerčním názvem GLASSMILK (Geneclean, Stratec Scientific, nebo jiný obdobný produkt).

Dvojvláknová DNA pICI266, připravená za použití standardních technik firmy Qiagen nebo enzymem Kpní. Toto aby bylo zajištěno enzym inaktivován následným vytvořené odštěpeny výrobcem přítomnosti dNTP při zastavena inaktivací Vzniklá (kity pro izolaci plazmidové DNA od. podobně), štěpení dokonalé inkubací ochlazením na štěpením pomocí za použití (New England byla rozštěpena restrikčním bylo provedeno velmi rozštěpení plazmidu.

°C po dobu

Přesahy na byly při ledu.

pečlivě, Poté byl minut a;

koncích minut.

pomocí vzorek, kolony který

3' enzymaticky

T4 postupem popsaným reakce probíhala za Reakce byla následně

KpnI polymerázy . BioLabs) . Tato °C po dobu 15 minut.

enzymu inkubací při 70°C po dobu 15 DNA byla očištěna od zbytků reakční směsi glass-milk. Po přečištění byl odebrán malý byl testován na agarové elektroforéze, aby

DNA mohl být vyhodnocen výtěžek reakce. Zbytek DNA byl naštěpen restrikčním enzymem EcoRI. . Opět bylo třeba velmi dbát na to, aby došlo k úplnému restrikčnímu štěpení. Izolace, vyříznutí a purifikace DNA požadované velikosti (přibližně 5600 párů baží) byla provedena pomocí elektroforézy v

-54AÁ AA ♦·♦ ♦ • · A A · »· • · *A AA

A A · * A A A ·

A A ·' A A · ♦· • AB···< »· AAAA AA ·· agarózovém gelu a systému glass-milk (Geneclean, Stratec Scientific, nebo jiného podobného produktu).

Pomocí elektroforézy v agarózovém gelu byla kontrolována čistota DNA v alikvotech obou restrikčně štěpených a purifikovaných vzorků a srovnáním se známými standardy odhadnuta její koncentrace. Na základě těchto odhadů byly připraveny ligační směsi ke klonování HCPB genu do vektoru. Molární poměr vektoru a inzertu byl 1:2,5 (1 pICI2 66 na 2,5 HCPB PCR produktů) . Konečná koncentrace DNA byla 2,5ng/^l, ligace byla prováděna v přítomnosti T4 DNA ligasy, lmM ATP a enzymového pufru, za použití podmínek vhodných pro ligaci tupých konců DNA (FspI do místa KpnI zarovnaného T4 DNA polymerázou).

Po ligační reakci byla směs DNA použita k. transformaci DH5cc kmene E.coli (Gibco-BRL, kompetentní buňky s maximálním výtěžkem) . Alikvoty buněk byly vysety na živná média s L-agarem, která obsahovala /ig/ml tetracyclinu jako selekčního činidla pro plazmidový vektor, a inkubovány přes noc při teplotě 37°C. Kolonie obsahující plazmidy s· požadovanými inzerty byly identifikovány pomocí’ hybridizace.

Bylo odebráno přibližně 350 kolonií a vyseto na dvojité sterilní nitrocelulózové filtry (Schleicher a Schull). Tyto filtry byly ještě předtím navlhčeny na plotnách s L-agarem obsahujícím 10 gg/ml tetracyklinu jako selekčního činidla pro vektor. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37°C. Jeden z filtrů byl uschován při teplotě 4°C jakožto zdroj živých buněk pro tvorbu kolonií, zatímco druhý filtr byl denaturován a DNA z jednotlivých kolonií fixována na nitrocelulózový filtr. Nitrocelulózový filtr byl vyjmut z agarové plotny a postupně inkubován na filtračních papírech Whatman™ nasycených:

1. 10% SDS, 2 minuty

2 .	0,5M NaOH,	1,5M NaCl,	7	minut
3 -	0,5M NaOH,	1,5M NaCl,	4	minuty
4 .	0,5M NaOH,	1,5M NaCl,	2	minuty

5. 0,5M Tris pH 7,4, 1,5M NaCl, 2 minuty

6. 2xSSC, 2 minuty

Membrána byla poté umístěna na filtrační papír Whatman™ nasycený lOxSSC a denaturovaná DNA se kovalentně navázala na nitro-celulózu pomocí ultrafialového záření (pomocí UV pece XL-1500 Spectrolinker). Filtry pak byly sušeny za pokojové teploty a po sušení pre-hybridizovány za mírného míchání v roztoku 6xSSC po dobu jedné hodiny v 60°C (například v hybridizéru Techne HB-1D). Prehybridizací byla zablokována volná nespecifická vazebná místa pro DNA na filtrech.

Kolonie obsahující požadovaný DNA inzert . byly identifikovány pomocí hybridizace se sondou DNA značenou radionuklidem ³²P. Tato sonda byla připravena z PCR produktů, genu HCPB z pankreatické cDNA knihovny (viz výše) . Přibližně 50ng DNA bylo označeno 50μ0ί ³²P-dCTP (~3000Ci/mmol) pomocí T7 DNA polymerázy v celkovém objemu 50 μΐ (souprava Pharmacia T7 Quickprime). Reakce probíhala 15 minut při teplotě 37°C. Značená sonda se poté na 2 minuty zahřála na teplotu 95°C, čímž došlo k denaturaci dvouvláknové DNA. Poté okamžitě přidala k 10 ml 6xSSC o teplotě 60°C a tento roztok byl zaměněn za pre-hybridizační roztok na membránách. . Nitrocelulózové filtry byly za mírného míchání inkubovány v hybridizačním roztoku po dobu 3 hodin při teplotě 60°C. Po této době byl hybridizační roztok odsát pryč a filtry byly dvakrát promyty v 2xSSC (pokaždé 15 minut). Filtry se pak osušily pomocí filtračního papíru a zabalily do potravinářské fólie (Saran wrap nebo podobné). Hybridizace byla vizualizována pomocí

-569 Ι· 4**4 ·*99

444 *44*4**4 * 9 9 9 9 9 999

9 9 9 0 * · *4*44

4* « 4 ·*4*

999999 99 9999 9999 vhodného rentgenového filmu (na příklad Kodak Xomat-AR5). Film byl exponován přes noc za pokojové teploty. Kolonie obsahující požadovaný inzert byly ty, které dávaly na filmu nej tmavší skvrny. V tomto případě přibližně 50 % kolonií vykazovalo pozitivní signál. Z nich bylo vybráno 12 kolonií pro další vyhledávání. Tyto kolonie byly odebrány ze záložního filtru, vysety a dále udržovány na plotnách s L-agarem, který obsahoval 10 gg/ml. tetracyklinu. Pro další pokusy byly tyto kolonie pěstovány v L-buj.ónu s přídavkem tetracyklinu o stejné koncentraci.

Pomocí PCR pak bylo zkontrolováno, zda vybrané izoláty obsahují inzert o správné velikosti. Při této kontrole byly použity primery FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1, (Sekvence . id. č. 40 a 41), a rovněž interní primery BPB2 (Sekvence id. č. 33) a FSPT1. Primer BPB2 byl navržen tak, aby hybridizoval v úseku genu pro maturovaný protein za vzniku přibližně 430 bp dlouhého fragmentu.

Vybrané kolonie byly odebrány z kultivačních médií, resuspendovány v 200 μΐ destilované vody a vařeny 10 minut při teplotě 100°C v uzavřené zkumavce.. Poté byla suspenze centrifugována 10 minut v mikrocentrifuze, čímž byly odstraněny zbytky buněk.. 1 μΐ supernatantu byl použit jako templát pro PCR vyhledávání. 1 μΐ supernatantu se podle obvyklého postupu smísil s 20 pmol oligonukleotidových primerů FSPT1 a 6HIS9E10R1BS1, nebo FSPT1 a BPB 2, dále s takovým množstvím dNTPs, aby jejich výsledná koncentrace byla 200μΜ, s reakčním pufrem pro Taq polymerázu a s 0,5 U Taq polymerázy. Celkový objem reakční směsi byl 20 μΐ. PCR probíhala v 25 cyklech, z nichž každý zahrnoval 1,5 minutovou inkubaci při 94°C, 2 minutovou při 50°C a 2 minutovou při 72°C. Po těchto 25 cyklech byla reakční směs ještě zahřáta na 72°C na 9,9 minuty.

Elektroforézou na agarózovém gelu byly v PCR produktech vyhledány proužky DNA o správné velikosti • ·

-57(přibližně 1000 bp pro primery FSPT1 a 6HIS9E10R1BS1 a přibližně 430 bp pro primery FSPT1 a BPB 2, viz obrázek 18) . Všech dvanáct klonů, poskytlo PCR produkty o správné velikosti. Šest z těchto klonů bylo použito pro přípravu plazmidové DNA. Plazmidová DNA byla vyizolována pomocí soupravy Quiagen Maxi ze lOOml kultury, pěstované přes noc při teplotě 37°C v L-bujónu s přídavkem 10/zg/ml tetracyklinu. Plazmidová DNA byla poté sekvenována v oblasti PČR produktu pomocí sekvenační soupravy USB Sequenase, která obsahuje DNA polymerázu bakteriofága T7. Alternativně byly fragmenty DNA sekvenovány automatickým sekvenátorem (za použití vybavení ABI) . Každý z klonů byl sekvenován pomocí několika různých primerú. Tři z těchto primerů (1504, 1590 a 1731) byly použity ke kontrole míst, kde došlo během klonování ke spojení mezi expresivním. vektorem a vloženým genem (Sekvence id. č. 42, 43 a 44).

Tyto primery rovněž poskytly informace o počátku a konci vloženého inzertu. Další primery (679, 677, 1802 a 1280,

Sekvence id. č. 33, 34, 45 a 35) byly použity k ověření zbytku sekvence vloženého genu. Uvedený plazmid obsahující modifikovaný gen pro maturovaný HCBP protein byl označen j áko pICI1712.

Ověřená sekvence klonovaného genu, s vyznačenou translací aminokyselin od počátku sekvence PelB až k peptidové značce (His) ₆-c-myc, je znázorněna v Sekvenci id. č. 46, přičemž číslování DNA začíná v místě prvního kodónu PelB a číslování peptidu začíná první aminokyselinou maturovaného HCBP proteinu.

Kontrolované exprese modifikovaného HCPB bylo dosaženo transformací kompetentích kmenů E.coli plazmidem pICI1712 v přítomnosti chloridu vápenatého. Mezi terrtito kmeny byly i takové, které nebyly schopny využívat jako jediný zdroj uhlíku arabinózu. Tyto kmeny měly chromozómovou deleci v místě operonu Ara. Výhodným kmenem

-58·* »· ·# ·· *· • ···· 9 · · · * · · » · · · · • · · · * ·> ··· · · • · · · · · · 999 ·* ·♦»· ·· *· byl kmen MSD213 (kmen MC 1000 podle Casadabana a dalších, Journal Molecular Biology, 138, 179 až 208, 1980), který má genotyp F-Ara A(Ara-Leu) ALacX74 GalV GalK StrR. Jiný výhodný kmen MSD525 (nebo kmen MC1061) má genotyp AraD139 A(Ara Leu)7697 Δ Lac74 GalU HsdR RpsL. Kmeny E.coli vhodné pro kontrolovanou expresi genů z promotoru AraB v plazmidu pICI266 s podobným genotypem mohou být získány z Genové banky E.coli, Biologické oddělení Yalesské univerzity, CT, USA. Selekce transformantů probíhala na L-agarovém živném médiu s obsahem 10 ^g/ml tetracyklinu při teplotě 37°C přes noc. Jednotlivé kolonie byly odebrány z ploten a přečárkovány a udržovány na stejném médiu. Vlastní kultivace pak probíhala v živném médiu s L-bujónem, které obsahovalo 10 Mg/ml tetracyklinu.

Všechny expresivní kmeny transformované plazmidem pICI1712 byly testovány na expresi klonovaného genu pro HCPB stejným způsobem.

1. Jednotlivé kolonie byly použity k zaočkování do 10 ml živného média s L-bujónem, které obsahovalo 10 Mg/ml tetracyklinu. Za stálého třepání byly kultury v 25 ml; kultivační nádobě Universal inkubovány přes noc při teplotě 37°C.

2. 75 ml živného média s L-bujónem, které obsahovalo 10

Mg/ml tetracyklinu, bylo předehřáto na 37°C v 250ml kónické baňce. Poté do něj bylo zaočkováno 0,75 ml přes noc pěstované kultury (tj 1 % z celkového objemu). Inkubace probíhala za stálého třepání při teplotě 37°C. Růst bakterií byl sledován pomocí absorbance při vlnové délce 540nm. Indukci exprese klonovaného proteinu bylo třeba provést během exponenciálního růstu kultury, to znamená při hodnotách O.D.₅₄₀ v rozmezí 0,4 a 0,6. Těchto hodnot kultury většinou dosáhly po 90 až 150 minutách po zaočkování.

3. Jakmile buňky dosáhly požadované optické density, byla kultura během třicetiminutového stání za pokojové teploty ochlazena na přibližně 30°C. Poté byla do média přidána arabinóza (1 % z celkové hmotnosti) a inkubace pokračovala za stálého třepání při teplotě 30°C po dobu 4 až 6 hodin.

4. Po inkubaci se změřila optická hustota a buňky byly zcentrifugovány. Měření optické hustoty sloužilo k výpočtu objemu vzorkového pufru pro proteinovou elektroforézu na akrylamidovém gelu (Laemmli), jež byl nutný k resuspendování buněčné pelety. Pro O.D. nižší než 1 bylo použito 10 μΐ pufru na každých 0,1 O.D., pro O.D. vyšší než 1 bylo použito 15 μΐ na každých 0,1 O.D. Vzorkový pufr podle Laemmliho obsahuje 0,125M Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 2% β-merkaptoethanol, 10% glycerol a 0,1 % Bromfenolovou modř.

5. Vzorky byly resuspendovány a denaturovány 10 minutovým povařením při 100°C a poté zcentrifugovány, čímž se oddělily viskózní buněčné zbytky od' supernatantu. Vzorky (supernatant o objemu 20 μΐ) byly naneseny na 17% SDS akrylamidové gely a elektroforeticky byly separovány proteiny. Většinou se stejné vzorky nanesly na dva gely, takže, jeden bylo možné .použít k detekci všech proteinů barvením Coomassie modří nebo podobným barvivém a druhý k detekci specifických produktů pomocí Western blotové analýzy.

K Western blotové analýze byly proteiny pomocí polosuchého blotovacího zařízení (Bio-rad nebo.podobného) z elektroforetického gelu převedeny na nylonovou membránu (například Problot™, Applied Biosystems). Před a během přenosu se membrána stále udržovala vlhká. Po přenosu proteinů se membrána blokovala 5% roztokem odtučněného • 99 9» ·· 99·· • · · 4 · 9 9 · 9 9 9· · · 9·»«·« • 9 ♦ · 9 9 9 ··♦ 99 • 9 9 9 99 9*

9999999 99 *9·· 9999 mléka (Marvel nebo podobného) ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Blokování probíhalo v pokojové teplotě za stálého jemného míchání 5 hodin. Po blokování byla membrána v pokojové teplotě 3 krát 5 minut za stálého jemného míchání promývána. K promývání bylo použito PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20. Promyté membrány pak byly inkubovány s myší primární mónoklonální protilátkou 9E10 proti c-myc peptidů (viz výše) ve vhodném zředění (typicky 1:10.000 pro ascity nebo 1:40 pro supernatanty z hybridomů) v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 2 0 a 0,5 % nízkotučného mléka.' Inkubace s protilátkou probíhala za stálého jemného míchání přes noc v pokojové teplotě. Poté byla membrána v pokojové teplotě 3 krát 5 minut za stálého jemného míchání promyta v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20. Promyté membrány byly inkubovány. se sekundární anti-myší (obyčejně kozí) protilátkou ve vhodném zředění (typicky 1:10.000) v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20 a 0,5 % nízkotučného mléka. Sekundární protilátka byla, značená křenovou peroxidázou (například A4416, Sigma). Inkubace s protilátkou probíhala za stálého jemného míchání alespoň 3 hodiny za pokojové teploty. Poté byla opět membrána za pokojové teploty a za' stálého jemného míchání 3 krát alespoň 10 minut promyta v PBS s obsahem 0,05 % Tweenu 20. Po promytí byla membrána dále zpracována technikou Amersham ECL pro detekci Western blotů a výsledek byl zobrazen pomocí filmu Amersham Hyperfilm ECL. První expozice byla zpravidla 30 sekund a další se upravily tak, aby na výsledném obrázku byly jasně patrné proužky exprimovaných proteinů. Obecně může být rovněž' použit jiný podobný systém se srovnatelnou citlivostí pro detekci'proteinů na membránách.

Dobrá exprese klonovaného značeného HCPB v plazmidu pICI266 (pICI1712) byla barvením gelů Coomassie modří prokázána v kmenech E.coli MSD213 a MSD525. Tyto kmeny vykazovaly nový proteinový proužek o velikosti přibližně 35 kDa vzhledem ke kmeni se samotným vektorem (pICI266).

9 ··	• 9	• 9	99	··
9· 9 9	•	•	9 ·	* *	«	•
·		9	9	* ·	99
• · ♦	•	9	9	9 ·*·	* ·
e ·	9	9	9	«	9	9
····»·»	9«		99*9	«*	*9

Proužek o shodné velikosti dával rovněž silný signál ve Western blotu,kde byla detekována peptidová značka c-myc.

Referenční příklad 8: Exprese genu pro maturovaný protein HCPB v E. coli

Způsob klonování a exprese genu pro maturovaný HCPB protein v E.coli byl velmi podobný způsobu popsanému v Referenčním příkladu 7. Opět byl použit plazmid pICI266 jako klonovací vektor, nicméně v tomto případě byl jako výchozí maťerál pro PCR amplifikaci genu pro maturovaný HCPB protein použit plazmid pICI1712, obsahující značený gen v expresivním vektoru. Dva oligonukleotidy označené 2264 a 2265 (Sekvence, id. č ; 48 a 49) byly použity v PCR reakci místo primerů FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1. Reakční podmínky byly podobné jako v Referenčním příkladu 7, pouze s tím·, rozdílem, že byla použita DNA z plazmidu pICI1712. místo pICI169S. První oligonukleotidový primer 2264 byl navržen tak, aby hybridizoval s plazmidem pICI1712 a zároveň aby obsahoval restrikční místo pro enzym Ncol ve vedoucí sekvenci PelB a aby dále pokračoval směrem k počátku vloženého genu pro maturovaný HCPB protein (t.j. DNA báze 36 až 66 včetně; Sekvence id. č.: 46). Druhý primer, označený 2265, byl navržen tak, aby hybridizoval s koncem genu pro maturovaný HCPB protein před začátkem sekvence pro značku (His)₆-c-myc (byl komplementární k DNA bažím 965 až 987 včetně; viz Sekvence id. č.: 46) a zároveň zavedl na konec genu kodóny pro terminaci translace (koplementární k TAA TAA) a restrikční místo pro enzym EcoRI (GAATTC). Tento oligonukleotid hybridizoval v PCR tak, že umožnil prodlužování nukleotidového řetězce ve směru a umožnil tak izolovat sekvenci genu pro maturovaný protein HCPB.

V alikvotu PCR produktu byla pomocí elektroforézy v agarózovém gelu ověřena přítomnost DNA požadované velikosti

-62• 4 · 4 4 4 4 4 · · 4 · * 44 · • · 4 · · · ··· ♦·

4 4 4 4 44

444 44 4444 «44« (přibližně 970 bp) . Zbytek PCR produktu byl zbaven kontaminantů z reakční směsi a přečištěn podobně jako v Referenčním příkladu 7. Izolovaná DNA byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI. DNA požadované velikosti (přibližně 940 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v Referenčnímu příkladu 7.

Dvouvláknová DNA z plazmidu ,pICI266, připravená podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7, byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI. Velká pozornost byla věnována tomu, aby štěpení bylo úplné. DNA požadované velikosti (přibližně 5600 bp) byla purifikována podobným způsobem jako v Referenčnímu příkladu 7.

Pomocí elektroforézy v agarÓzovém gelu byla testována čistota obou restrikčně štěpených a purifikovaných vzorků DNA a odhadnuta jejich koncentrace porovnáním se známými standardy. Tento odhad byl použit při přípravě ligační· směsi pro klonování genu HCPB do plazmidu pICI266, podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Po ligační reakci byla směs DNA použita k transformaci DH5a kmene E.coli. Jednotlivé kolonie byly sebrány párátkem a otestovány hybridižací, podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Šest z těchto klonů bylo vybráno pro přípravu plazmidové DNA. Tyto klony byly sekvenovány v oblasti PCR produktu podobným způsobem jako v Referenčnímu příkladu 7. Klony byly sekvenovány pomocí šesti různých oligonukleotidových primerů označených 1504, 1802, 679, 1280, 677 a 1731 (Sekvence id. č.: 42, 45, 33, 35, 34 a 44). Z výsledků sekvenace byl vybrán klon obsahující plazmid s požadovaným genem pro maturovaný protein HCPB. Tento klon byl označen pICI1736.

Potvrzená sekvence klonovaného genu s vyznačenou sekvencí aminokyselin začínající, sekvencí PelB až po

ΦΦ · · ·* φφ φφ

-63φ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φ · φ Φφφφ ·

Φ · Φ Φ Φ Φ Φ • ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ sekvenci restrikčního místa pro EcoRI je popsána v Sekvenci id. č.: 50, přičemž číslování DNA začíná v místě prvního kodónu PelB a aminokyselinová sekvence je číslována od počátku maturovaného proteinu HCPB.

Kontrolované exprese genu pro maturovaný protein HCPB, bylo dosaženo transformací kompetentích kmenů E.coli plazmidem pICI1736 v přítomnosti chloridu vápenatého podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. Exprese klonovaného genu pro HCPB byla ve všech transformovaných expresivních kmenech pICI1736 testována způsobem podobným Referenčnímu příkladu 7. V tomto případě však nemohla být použita myší monoklonální protilátka se specifitou k c-myc, protože maturovaný protein HCPB nemá na C-konci peptidovou značku. Proto byla jako primární protilátka použita králičíprotilátka proti hovězí karboxypeptidáze A (Biogenesis), která křížově reaguje s purifikovanou lidskou pankreatickou karboxypeptidázou B. Jako sekundární protilátka byla použita kozí anti-králičí IgG značená křenovou peroxidázou (Sigma A9169 nebo podobná).

Exprese klonovaného genu pro maturovaný protein HCPB; v plazmidu pICI266 (pICI1736) byla v kmenech E.coli MSD213 a MSDS2S prokázána barvením gelů Coomassie modří. V těchto gelech byl, ve srovnání s klony se samotným vektorem pICI266, patrný nový proteinový proužek o velikosti přibližně 34 kDa. Proužek o shodné velikosti dával rovněž silný signál ve Western blotu, kde byla detekována hovězí karboxypeptidáza A.

Referenční příklad 9: Exprese genu pro maturovaný HCPB protein v buňkách COS

Gen kódující preHCPB byl vytvořen pomocí PCR z plazmidu pICI1698 (viz Referenční příklad 1) . Reakční směs pro PCR

-64• ·4 44 ·· 4»··

4 4 · · * · · 4 444

4 44 4 4 4· 4

4 4* * 4 4 44*4·

444444

444MM 44 4444 «444 obsahovala jako templát plazmid pICI1689 (10/xg) a 100 pmol každého z prímerů Sekvence id. č.: 1 a 2 ve 100 μΐ pufru obsahujícím lOmM Tris-HCl (pH 8,3), 50mM KC1, l,5mM MgCl₂, 0,125mM každého z nukleotidtrifosfátú a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus). Reakční směs byla převrstvena minerálním olejem (100 μΐ). PCR reakce probíhala v 25 cyklech, přičemž jeden cyklus zahrnoval inkubaci v 94°C po dobu 1 minuty, v 53°C též po dobu 1 minuty a v 72°C po dobu 2,5 minut. Na závěr byla celá reakční směs ještě 10 minut inkubována při 72°C. PCR produkt o velikosti 985bp byl izolován elektroforézou v 1 % agarózovém gelu (agaróza typu I, Sigma A-6013), proužek vyříznut a DNA přečištěna pomocí soupravy Geneclean (Geneclean II kit, Stratech Scientific Ltd. nebo Bio 101 lne.). Souprava Geneclean kit obsahuje 1) 6M iodid sodný, 2) koncentrovaný roztok chloridu sodného, Tris a EDTA pro přípravu promývacích roztoků chlorid sodný/ethanol/voda, 3) Giassmilk™' - 1,5 ml lahvička obsahující 1,25 ml suspenze speciální silikátové matrice ve vodě.

Tato technika purifikace DNA je založena na způsobu Vogelsteiria a Gillespie, publikovaném v Proceedings National Academy Sciences USA (1979) Vol 76, 615. Případně může být použit libovolný jiný způsob popsaný v Molecular Cloning - a laboratory manual, Second edition, Sambrook, Fritsch a Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).. Zde je stručný popis techniky Geneclean: K jednomu dílu agaru vyříznutému z gelu se přidají tři díly roztoku iodidu sodného ze soupravy. Agaróza se roztaví zahříváním směsi po dobu 10 minut' na 55°C. Pak se přidá silikátová matrice Giassmilk (5-10/zl) . Směs se dobře promíchá a nechá se 10 minut stát za pokojové teploty. Matrice giassmilk se stočí a 3 krát promyje 500 /xl promývacího pufru NEW WASH ze soupravy. Promývací pufr se odtraní a matrice Giassmilk se nechá oschnout, na vzduchu. DNA se uvolní inkubací vysušené matrice Giassmilk s 5 až 10 μΐ vody při teplotě 55°C po • ·· ·· U 4499

4 ·4·* 4 499 • 4 9 4 49494 · 4 4 9 4 9 ♦ ·* 99

4 4 9944 *f 9944 94 4999 9199 dobu 5 až 10 minut. Centrifugací se získá vodný supernatant s obsahem eluované DNA. Tento eluční krok se může opakovat a supernatanty se mohou spojit.

Po purifikaci byl gen preHCPB 1 hodinu štěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII při teplotě 37°C v ΙΟΟμΙ reakční směsi, která obsahovala lOOmM Tris-HCl (pH 7,5), lOmM MgCl₂, 50mM NaCl, 0,025% Triton X-100 a 25U každého z enzymů HindlII a EcoRI (New England Biolabs) . Štěpený fragment byl přečištěn elektroforézou v agarózovém gelu.a.na matrici GeneClean tak, jak bylo popsáno výše pro neštěpený fragment, a poté byl klonován do plazmidu pBluescript (Stratagene Cloning Systems).

DNA z plazmidu pBluescript KS+ (5^g) byla kompletně naštěpena restrikčními enzymy EcoRI a HindlII (25 U každého) ve 100 μΐ reakční směsi tak, jak bylo popsáno výše. K naštěpenému plazmidu byla přidána telecí střevní alkalická fosfatáza (1 μΐ, New England Biolabs, 10 U/μΙ) čímž se odstranily 5' 'fosfátové konce. Reakční směs byla inkubována při teplotě 37°C dalších 30 minut. Fosfatáza byla inaktivována 10 · minutovým zahřátím na 70°C. Plazmid. naštěperiý restrikčními enzymy EcoRI-HindlII byl purifikován z agarózového gel tak, jak bylo popsáno výše. 50 ng genu pro preHCPB naštěpeného restrikčními enzymy EcoRI-HindlII bylo ligováno s výše uvedeným plazmidem v 20 μΐ reakční směsi obsahující 30mM Tris-HCl (pH7,8), lOmM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 Mg/ml BSA a 400 U T4 DNA ligázy (New England Biolabs, lne). Reakce probíhala 4 hodiny při teplotě 25°C. Vzorky reakční směsi o objemu 1 μΐ byly použity k transformaci 20 μΐ kompetentních buněk Ξ. coli kmene DH5a (kompetentní buňky s maximální účinností transformace, Life Technologies Ltd.) za použití protokolu dodaného výrobcem. Transformované buňky byly vysety na plotny s L-agarem obohaceným 100 jig/ml ampicilinu. Klony potencinálně produkující preHCPB byly identifikovány pomocí

* ··	·* ··	··	99
						•
	• *	• ·	•	•
9	9 ·	t · ·	• ·	•	•	♦
	• ·	• · «· ««·«	« ·	♦	9 99	•

PCR. Každý z klonů byl použit pro PCR tak, jak bylo popsáno výše pro přípravu genu preHCPB s výjimkou toho, že směs s buňkami byla inkubována 5 minut při teplotě 94 °C (horký start) ještě před vlastními 25 cykly PCR a místo primerů podle Sekvence id. č.:3 a 4 byly použity primery podle Sekvence id. č.: 1 a 2. Z reakční směsi byl odebrán vzorek (10 μΐ) a analyzován elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Klony obsahující gen pro preHCPB byly identifikovány díky přítomnosti . 1.2kb velkého PCR produktu. Klony dávající jasný 1.2 kb dlouhý signál byly použity pro přípravu plazmidové DNA ve velkém měřítku. Sekvence inzertu byly ověřeny sekvenční analýzou. Výsledný plazmid obsahující gen preHCPB v plazmidu pBluescript byl pojmenován pMF15.

GS-System™ (Celltech Biologics) byl použit pro. přípravu vektorů schopných exprese genu pro HCPB v eukaryotických buňkách (viz WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 a WO 89/10404). Tato technika zahrnuje klonování genu preHCPB do HindlII-EcoRI oblasti vektoru pEE12. Tento vektor je podobný vektoru pSV2.GS popsanému Bebbingtonem a dalšími (1992), Bio/Technology 10, 169 až 175, přičemž u nej byla cílenou mutagenezí odstraněna některá cílová místa, přítomná v původním vektoru pSV2.GS. Tím bylo dosaženo toho, že místa v polylinkeru jsou unikátní. Expresivní vektor byl zkostruován tak, že byly plazmidy pEE12 a pMF15 štěpeny restrikčními enzymy EcoRI a HindlII tak, jak bylo popsáno výše. Příslušný vektor (z plazmidu pEE12), respektive inzert (z plazmidu pMF15) z každého štěpení byl izolován z 1% agarózového gelu. Obě DNA byly spojeny ligací a použity pro transformaci DHSa kompetentních buněk. Transformované buňky byly přeneseny na plotny s L-agarem s přídavkem 100 /xg/ml ampicilinu. Pomocí PCR byly kolonie otestovány tak, jak bylo popsáno výše. Jako primer byla použita Sekvence id. č.: 5, která hybridizuje s oblastí v CMV promotoru a Sekvence id. č: 6, která hybridizuje s oblastí v genu pro HCPB. Klony * · 9 9 9 ♦99 * * · 9 b 9 9 «·· ·» to · šito· 9 to to • 99 ···· ·· ··«·«9 99

-67produkující l,365kb dlouhý PCR produkt byly použity pro přípravu plazmidové DNA ve velkém měřítku. Sekvence inzertu byla potvrzena sekvenováním. Plazmid obsahující sekvenci preHCPB v původním plazmidu pEE12 byl pojmenován pMF48.

Jiný eukaryotický expresivní plazmid pEE12 obsahující prepro sekvence genu preproHCPB byl připraven výše popsaným způsobem. V počáteční PCR byly použity primery podle Sekvence id. č.: 7 a 8. Tato reakce slouží k izolaci sekvence prepro z plazmidu pMF18 (viz Referenční příklad 11). V tomto případe byla PCR zahájena horkým startem, t.j. inkubací směsi bez Taq DNA polymerázy po dobu 5 minut při teplotě. 94 °C. Poté byly přidány 2,5 U Taq DNA polymerázy a PCR pokračovala 25 cykly tak, jak bylo popsáno výše. 360 bp dlouhý fragment byl nakloňován do plazmidu pBluescript za vzniku plazmidu pMF66 a následně do plazmidu pEE12 (testováno pomocí PCR s primery podle Sekvencí id. č. 7 a

8) za vzniku plazmidu pMF67.

Pro expresi preHCPB a preproHCPB v eukaryotických buňkách byly vektory obsahující tyto geny kotransfekovány do COS-7 buněk. COS buňky jsou buňky z buněčných linií z ledvin kočkodana zeleného (Afričan green monkey) CV-1, transformované virem SV40 s defektním pořátkem replikace. Tyto buňky jsou v hojné míře využívány pro krátkodobou přechodnou expresi různých proteinů. Mají totiž schopnost replikovat cirkulární plazmid obsahující počátek replikace viru SV4O a dosáhnout přitom vysokého počtu kopií plazmidu. Existují dvě hlavní dostupné linie: COS-1 a COS-7. Zaklady metodologie transfekce buněk COS jsou popsány v práci Bebbingtona v Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, strana 141. Pro expresi genů HCPB byly plazmidové vektory pMF48 a pMF67 (4 μg každého) použity k transfekci COS-7 buněk (2xl0⁵) na šesti jamkové kultivační plotně v 2 ml média DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) s přídavkem 10% tepelně inaktivovaného fetálního telecího

-68séra (FCS) způsobem známým jako lipofekce - transport polynukleotidů zprostředkovaný kationickými lipidy - [viz Felgner a další, Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1993) 5, strana 67 až 73) . Buňky byly 20 hodin inkubovány při teplotě 37°C v CO₂ inkubátoru. Směs plazmidové DNA v 200 μΐ bezsérového media OPTI-MEM (Reduced Sérum Medium: GibcoBRL kat. č. 31935) se opatrně smíchala s 12 μΐ,činidla LIPOFECTIN (GibcoBRL kat. č. 18292-011) . Poté následovala 15 minutová inkubace ' za pokojové teploty. Pak byly buňky promyty 2 ml bezsérového média OPT1-MEM. Nakonec bylo ke směsi DNA/LIPOFECTIN přidáno 600μ1 bezsérového media (OPTI-MÉM) a výsledná směs byla navrstvena na buňky, které se 6 hodin inkubují při teplotě 37°C v CO₂ inkubátoru. Médium obsahující DNA bylo nahrazeno- normálním médiem DMEM obsahujícím 10% FCS a buňky byly inkubovány po> dobu 72 hodin tak, jak bylo popsáno výše. 250 μΐ. supernatantů z buněčných kultur bylo testováno na HCPB: aktivitu proti proti Hipp-Arg (5 hodinový test) tak, jak bylo popsáno v Referenčním příkladu 3. Supernatanty buněk. COS, které byly transformovány pouze činidlem LIPOFECTIN' bez plazmidové DNA, hydrolyzovaly 1.2 % substrátu, zatímco': supernatanty buněk COS, které byly transformovány směsí plazmidů hydrolyzovaly trans f ikované exprimuj ících % i hydrolyzovaly ošetřené pouze pouze

Hipp-Arg činidlem preHCPB substrátu plazmidem stejnou LIPOFECTIN.

a prepro Hipp-Arg. COS obsahuj ícím měrou jako sekvenci buňky, preHCPB COS buňky

Činidlo LIPOFECTIN je 1:1 (w/w) lipozómový přípravek obsahující kationický lipid N-[l-(2, 3dioleyloxy)-propyl]-n.n.n-trimethylamonium chlorid (DOTMA) a dioleoyl fosfatidylethanolamin (DOPE) v membránově filtrované vodě. Tento přípravek spontánně váže DNA za vzniku komplexu lipid-DNA, viz Felgner a další v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1987), 84, 7431.

-69• · · · ♦ « • · « s« ··

Referenční příklad 10: Exprese proteinu proHCPB v E. coli

Způsob klonování a exprese pro-HCPB v E.coli byl velmi podobný způsobu popsanému v Referenčním příkladu 7. Opět byl jako klonovací vektor použit plazmid pTCI266, jako výchozí materiál pro PCR amplifikaci genu pro-HCPB byl použit plazmid pICI1698 (tak, jak bylo popsáno v Referenčním příkladu 6}. Místo primerů FSPTS! a 6HIS9E1OR1BS1 byly použity primery označené jako 2310 a 2265 (Sekvence id. č. : 528 a 49). PCR reakce probíhala za podobných podmínek jako v Referenčním příkladu 7.

První oligonukleotid 2312 byl navržen jako primer hybridizující s plazmidem pICI1698 a přidávající cílové místo pro restrikční enzym Ncol od vedoucí sekvence PelB (báze 51 až 66 včetně v Sekvenci id. č. : 46) po začátek vloženého genu pro-HCPB (báze 40 až 57 včetně v Sekvenci id. č.: 38). Oligonukleotid 2265, určený pro druhé vlákno· byl navržen jako primer hybridizující na konec genu pro maturovaný HCPB, před začátek sekvence značky (His) ₆-c-myc (je komplementární k bažím 965 až 987 včetně v Sekvenci id.. č.: 46). Tento primer posloužil zavedení kodónů pro ukončení translace (je komplementární k TAA TAA) na konec genu a následného cílové místo pro restrikční enzym EcoRI (GAATTC) a vyplňující báze. Tento oligonukleotid slouží jako primer pro PCR syntézu DNA ve směru zpět do genu. Tato PCR umožňuje izolovat sekvenci pro-genu.

Alikvot PCR produktu byl analyzován elektroforézou na agarózovém gelu a byla hledána DNA o velikosti 1240 párů baží. Bylo prokázáno že produkt obsahuje převážně pás DNA o správné velikosti. Zbytek produktu z reakční směsi byl přečištěn podobným způsobem' jako Referenčním příkladu 7. Izolovaná DNA byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI a pás o správné velikosti 1210 páru baží byl opět přečištěn podobným způsobem jako Referenčním příkladu 7.

♦	i»·	4· 44	• 4	4* 4
•	• ·	♦	♦	4	•	♦	4 ·
•	• 4 ·	♦	4	• ··	•	4
*	« 4	♦		4	•	4
		• ·	444 4	• 4			♦ 4

Dvouvláknová DNA plazmidu pICI266, připravená podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7, byla restrikčně štěpena enzymy Ncol a EcoRI, přičemž reakce byla prováděna tak, aby bylo zajištěno kompletní štěpení. DNA o správné velikosti 5600 párů baží byla přečištěn podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

Byla stanovena čistota a koncentrace alikvotů obou nastěpených a přečištěných vzorků DNA pomocí srovnání se známými standardy na agarózové elektroforéze. Z těchto odhadů se vycházelo při přípravě ligační směsi pro klonování genu pro-HCPB do vektoru pICI266. Reakční směs byla připravena podobným způsobem jako Referenčním příkladu

7.

Po ligační reakci byla směs DNA použita pro transformaci E. coli kmene DH5a,. Transformované kolonie byly odebírány z kultivačních ploten a testovány hybridizací podobným způsobem jako Referenčním příkladu 7.

Čtyři pozitivně hybridizující izoláty byly pomocí PCR testovány na přítomnost inzertů o správné velikosti. Byly k·' tomu použity primery 2310 a 2265, (Sekvence id. č.: 52 a 49) , a dále byla provedena PCR s párem vnitřních primerů 1279 (Sekvence id. č.: 36) a 679 (Sekvence id. č.: 33), podobně jako Referenčním příkladu 7. PCR produkty byly analyzovány elektroforézou na agarózovém gelu a byla hledána- DNA o velikosti 1200 párů baží pro primery 2310 a 2265 a 580 párů baží pro primery 1279 a 679. Všechny klony obsahovaly PCR produkty o správné velikosti.

Ze všech čtyř klonů byla poté vyizolována plazmidová DNA, která byla osekvenována v oblasti PCR produktu. Sekvenování bylo provedeno podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.Klony byly sekvenovány za použití šesti oligonukleotidových primerů označených jako 1504, 1802, 679,1281, 1590 a 1592 (Sekvence id. č.: 42, 45, 33,

-7137, 53 a 54) . Podle výsledků sekvenace byl vybrán klon obsahující plazmid s požadovaným genem pro-HCPB. Tento klon byl označen pICI1738.

Potvrzená sekvence klonovaného genu pro-HCPB v plazmidu pICI1738,spolu s vyznačenou aminokyselinovou sekvencí, od počátku sekvence PelB až po restrikční místo EcoRI je znázorněna na Sekvenci id. č.: 55 přičemž číslování DNA začíná od prvního kodónu PelB a číslování peptidu začíná od maturovaného HCPB.

Pro řízenou exprese proteinu pro-HCPB byly plazmidem pICI1738 za přítomnosti chloridu vápenatého transformovány kompetentní E. coli expresivního kmene podobně jako v Referenčním příkladu 7. Všechny expresivní kmeny transformované plazmidem pICI1738 byly ošetřeny podobnějako Referenčním příkladu 7 přičemž byla testována expreseklonovaného genu HCPB. V tomto případě však nelze pro Western blotovou analýzu použít moklonální protilátku 9E10 specifickou pro peptidovou značku c-myc, vzhledem k tomu, že protein pro-HCPB žádnou C-terminální značku neobsahuje. Proto tedy byla jako primární použita králičí protilátka-, proti hovězí karboxypeptidáze A (Biogenesis). Tato protilátka je schopna křížově reagovat s purifkovanou lidskou pankreatickou karboxypeptidázou B, jak bylo již dříve prokázáno. Jako sekundární byla použita kozí protilátka proti králičím IgG značená křenovou peroxidázou a (Sigma A0545 nebo podobná).

Exprese klonovaného- proteinu pro-HCPB v plazmidu pICI266 (pICI.1738) v bakteriích E. coli byla demonstrována na gelech barvených Coomassie modří vykazujících dodatečný proteinový proužek o velikosti přibližné 42.000 Daltonů ve srovnání s klony obsahujícími pouze vektor (p!CI266), a klony produkujícími značený HCPB (viz Referenční příklad

7). Proužek o stejné velikosti poskytoval pozitivní signál

e ·♦		·	··
•	• «		• *	t ·	··
	♦ · «		• · ·	«*·	• »
•	« ·		• ·	•	• ·
		•	mh	* «	4«

ve Westernové analýze při použití protilátky proti hovězí karboxypeptidáze A.

Referenční příklad 11: Exprese proteinu proHCPB buňkami COS

Gen pro protein preproHCPB byl připraven pomocí PCR, viz Referenční příklad 9, za použití plazmidu pICI16B9 jakožto templátu a oligonukleotidů Sekvence id. č.: 1 a 7, přičemž velikost vzniklého produktu byla 1270bp. Gen byl naštěpen enzymu EcoRI a HindiII a nakloňován nejdříve do plazmidu pBluescript ΚΞ+ (za vzniku plazmidu pMF18) a potom do plazmidu pEE12 v DHScc (za vniku plazmidu pMF49), viz Referenční příklad 9. Plazmid pMF49 byl transfekcí přenesen do buněk COS-7 pomocí činidla LIPOFECTIN, viz Referenční' příklad 9. Buněčné supernatanty (250 μΐ) byly testovány na aktivitu HCPB za použití Hipp-Arg jako substrátu (5 hodinová zkouška), viz Referenční příklad 3. Reakční směs byla nejprve 1 hodinu aktivována trypsinem (700 μ9/τη1) v, pufru obsahujícím 50mM Tris-HCl (pH7,6), 150mM NaCl při teplotě 4°C. Za těchto podmínek došlo k úplné hydrolýze. substrátu Hipp-Arg, zatímco trypsinem aktivovaný supernatant z COS buňek ošetřených samotným činidlem LIPOFECTIN (bez plazmidové DNA) byl schopen hydrolyzovat pouze 30 % substrátu Hipp-Arg.

Referenční příklad 12: Purifikace nativní formy proteinu HCPB

Byly navženy dva způsoby počáteční purifikace nativního a různých mutantních forem enzymu. Výhodná cesta je popsána jako první. Buněčná pasta z rekombinantních bakterií E. coli obsahující rekombinantní enzymy byla vyjmuta z mrazáku, kde byla uskladněna při teplotě -70°C, a byla ponechána roztát. Buněčná pasta byla poté zvážena v

-73·· gramech a resuspendována v přídavku pufru A (200mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan hydrochlorid (Tris-HCl), 20% sacharóza, pH 8.0), který se rovnal počáteční váze buněčné hmoty. Buněčná suspenze byla 20 minut inkubována při pokojové teplotě za příležitostného mírného míchání a poté byl přidán stejný díl destilované vody a směs byla důkladně promíchána. Buněčná suspenze byla znovu 20 minut inkubována při pokojové teplotě za příležitostného mírného míchání. Surový, osmoticky uvolněný obsah buněk byl pročištěn centrifugací při 98000xg po dobu 90 minut při teplotě 4°C. Po centrifugací byl supernatanť dekantací oddělen od pelety nerozpustné frakce.

K supernatantu byla přidána deoxyribonukleáza 1 tak, aby její výsledná koncentrace činila 0,1 mg/ml. Směs byla.· poté inkubována za pokojové teploty a stálého třepání dokud nebyla snížena viskozita natolik, aby mohl být vzorek nanesen na afinitní kolonu s CNBr-Sepharosou aktivovanou inhibitorem karboxypeptidázy. Afinitní kolona byla připravena podle instrukcí dodaných s CNBr aktivovanou Sepharosou 4B (Pharmacia) a s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz (c-0279,Sigma). pH supernatantu bylo upraveno na 8,0 a poté byl zaveden na afinitní kolonu, předvrstvenou pufrem obsahujícím lOmM Tris-HCl, 500mM chlorid sodný, pH 8,0.Po nanesení supernatantu byla kolona promývána, dokud se absorbance protékajícího nenavrátila zpět na základní úroveň předtím, než byl navázaný materiál vymyt z kolony pomocí elučního pufru (lOOmM uhličitan sodný, 500mM chlorid sodný, pH 11, 4). Eluované frakce byly zamraženy při -20°C zatímco frakce obsahující rekombinantní karboxypeptidázu byly testovány pomocí Western blotu za použití protilátky proti c-myc značce (9E10), následované konjugátem anti-myší protilátky s křenovou peroxidázou (a-9044, Sigma). Tento konjugát dává barevnou reakci po inkubaci s 4-chloro-naftol a peroxidem vodíku.

-Ί4~ « ·· ·· «· ·· ·♦ • · ♦ · · · · ♦ « ·♦ · • · * · 9' 9 999 « · ♦ ♦ · · · ·· 9 99

9 9 9 9 9 99

9999999 99 9999 9999

Frakce obsahující rekombinantní karboxypeptidázu B byly spojeny, zakoncentrovány a jejich pH bylo nastaveno na 7,5. Poté byly velmi rychle zamraženy a uskladněny při -20°C. Dále lze v případě potřeby provést další purifikaci spojených vzorků, využívající známé způsoby jako jsou iontoměniocová a gelová permeační chromatografie.

Druhá purifikační cesta zahrnuje totální lýzu buňek E. coli jak protiklad k periplazmatickému šoku, použitému ve výhodném provedení purifikace.

Buněčná pasta z rekombinantních E. coli obsahující rekombinantní enzym byla resuspendována v lytickém pufru (50mM Tris-HCl, 15% sacharóza, pH 8,0) . Poté byl přidán lyzozym do výsledné koncentrace 1 mg/ml a současně byl přidán i dodecylsulfát litný (LDS) (80 μΐ 25% roztoku na 25 ml suspenze). Suspenze byla 30 minut inkubována na ledu za příležitostného třepání, pak byla přidána deoxyribonukleáza 1 do výsledné koncentrace 1 mg/ml a znovu byla suspenze 30 minut inkubována na ledu za příležitostného třepání. Suspenze byla poté rozdělena na 200 ml díly a sonikací 10 x 30 vteřin byly zcela rozbity buňky. Mezi jednotlivýmy sonikačními impulsy byly 30 vteřinové intervaly. Sonikavané suspenze byly po dobu 90 minut centrifugovány při 98,000x g a teplotě 4°C. Poté byl supernatant dekantací oddělen od pelety nerozpustné frakce. pH supernatantu bylo upraveno na 8,0 a byl nanesen na afinitní kolonu, předvrstvenou pufrem obsahujícím lOmM Tris-HCl, 500mM chlorid sodný, pH 8,0.Po nanesení supernatantu byla kolona promývána dokud se absorbance protékajícího elučního činidla nenavrátila zpět na základní úroveň, která byla předtím, než byl navázaný materiál vymyt z kolony pomocí elučního pufru (lOOmM uhličitan sodný, SOOmM chlorid sodný, pH 11, 4). Eluovaně frakce byly zamraženy při -20°C a frakce obsahující rekombinantní karboxypeptidázu byly stanoveny pomocí Western blotu za použití protilátky proti c-myc značce

-789 Φφ Η ·* ΦΦ ··

4* · * · Φ Φ · · · Φ ♦ * Φ ΦΦ · · Φ . ΦΦ φ ΦΦΦΦ · Φ *·· Φ ·

ΦΦ Φ Φ Φ · Φ ·

Φ·ΦΦΦ·Φ ΦΦ ·Φ·Φ ·Φ ΦΦ (9Ε10), následované konjugátem anti-myší protilátky s křenovou peroxidázou (a-9044, Sigma). Tento konjugát dává barevnou reakci po inkubaci s 4-chloro-naftol a peroxidem vodíku.

Frakce obsahující rekombinantní karboxypeptidáza B byly spojeny, zakoncentrovány a jejich pH bylo nastaveno na hodnotu 7,5. Pak byl vzorek velmi rychle zamražen a uskladněn při teplotě -20°C. Je možné popřípadě provést další purifikaci spojených frakcí za využití známých způsobu jako jsou iontomeničová a gelová permeační chromatografie. Vzorky spojených frakcí z obou purifikačních postupů byly analyzovány pomocí denaturační elektroforézy na polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a blotingu na nitrocelulózovou membránu, přičemž jednotlivé·, proteiny byly vizualizovány pomocí Coomassie modři. Byly identifikovány proteinové pásy o správné molekulové hmotnosti odpovídající rekombinantním karboxypeptidázám B. Tyto pásy byly sekvenovány pomocí automatizovaného protein/peptidového sekvenátoru používajícího Edmanovy degradace. Sekvence vzorků se shodovaly s jednotlivými, purifikovanými rekombinantními karboxypeptidázami B.

Referenční příklad 13: Exprese fúzního proteinu myší A5B7

F(ab')₂-HCPB buňkami COS

Protilátkou se zvláštní specifitou k antigenům· asociovaným s nádory je myší moklonální protilátka ASB7.Protilátka ASB7 se váže na lidský karcinoembryonický antigen (CEA) a je zvláště vhodná pro naměrování účinné látky na kolorektální karcinom. Protilátka ASB7 je dodávána firmou DAKO Ltd., 16

Manor Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP13 5RE, Anglie, Spojené Království. Fragmenty této protilátky mohou být připraveny z celé protilátky typu IgG pomocí obvyklých prostředků, například F(ab'}₂ fragmenty lze

9 ··	*9	99	99	99
H · 9	9	9	• '9	9 ·	• 9
• ♦	9	9	. ·'	• 9	• 9
♦ · ·	•	9	9	9 99«	9	9
9 *	• 9	♦	•	9	9
···♦···	9·	9999	9 9	99

připravit způsobem popsaným Marianim, M. a dalšími (1991), Molecular Immunology 28,strana 69 až 77.obvykle by měl být konjugát protilátky (nebo jejího fragmentu) s enzymem alespoň divalentní, to znamená, že by měl být schopný vázat alespoň dva antigeny asociované s nádory (které mohou být totožné nebo rozdílné). Molekuly protilátek mohou být humanizovány pomocí známých způsobů jako například zabudováním vazebných míst pro antigen z jiných protilátek (CDR grafting) viz EP239400 nebo přenosem celé variabilní oblasti na lidskou konstancí, viz US 4816567.Humanizované protilátky mohou být vhodné pro redukci nežádoucích imunogenních účinků protilátky (nebo jejího fragmentu). Humanizované verze protilátky A5B7 jsou popsány v PCT W092/01059.

Hybridom produkující moklonální protilátku A5B7 byla uložen u Evropské sbírky zvířecích buněčných kultur,. Centrum PHLS pro aplikovanou mikrobiologii a výzkum, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG,, Spojené království, 14. července 1993 a bylo mu přiděleno přístupové číslo 93071411. Protilátku A5B7 lze získat z uloženého hybridomů pomocí standardních technik známých ze stavu techniky, viz například Fenge C, Fraune E. & Schuegerl K. v publikaci Production of Biologicals from Animal. Cells in Culture (Spier RE, Griffiths JR & Heignier B, editoři) Butterworth-Heinemann, 1991, strana 262 až 265 a Anderson BL & Gruenberg HL v publikaci Commercial Production of Monoclonal Antibodies (Seaver S, editor), Marcel Dekker, 1987, strana 175 až 195. Buňky mohou vyžadovat občasné překlonování za limitního ředění, což umožní udržení dobré úrovně produkce protilátky.

Tento příklad popisuje přípravu cDNA z hybridomů A5B7, izolaci specifických fragmentů Fd a lehkého řetězce pomocí PCR, stanovení kompletní DNA sekvence těchto fragmentů, následující přípravu fúzního genu Fd-HCPB

*	4«		*4	4 4	44	M	4
•	4	4		4 4	4 4	44
4	4	• 4		4 4·	444	4	4
4	0	4		4 4	4	4	•
			4»	• 444	44	44

-ΊΊ ko-expresivního vektoru schopného produkce jak lehkého řetězce tak i fúzníhó protein Fd-HCPB v eukaryotických

buňkách, expresi F(ab')2-HCPB buňkami COS transfekce se sekvencí prepro HCPB.	pomocí	společné
a) Příprava mRNA z hybridómatických buněk
Existuje několik způsobů izolace	polyA+	mRNA z
eukaryotických buňek (viz Sambrook J.,	Fritsch	E. F. ,

Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, druhé vydání, 1989,Kapitola 8,strana 3, dále citováno jako Maniatis). Jedním z takových způsobů je kit firmy Pharmacia, který je založen na lýza relativně malého počtu buněk (IQ⁷ nebo méně), po které následuje navázání polyA+ konců mRNA na oligo dT kolonu. Nepotřebné buněčné složky jsou odstraněny promytím pufrem s nízkou koncentrací solí a poté je za zvýšené teploty eluována mRNA pufrem s vysokým obsahem soli.

Potřebná mRNA byla připravena z 10⁷ hybridómatických buňek A5B7 za použití kitu Quickprep mRNA (Pharmacia Biotechnology Ltd.). Koncentrace mRNA byla odhadnuta z ultrafialového spektra (300 až 220 nm) pořízeného pomocí spektrofotometru Uvikon 930 (Kontron Instruments) přičemž byl použit extinkční koeficient 40 ^g/ml při vlnové délce 260nm. Vyizolovaná mRNA byla uskladněna ve formě 2,5 ug alikvotů vysrážených v ethanolu.

b) syntéza cDNA

Způsob použitý při syntéze cDNA byl založen technice Gublera a Hofmana, která zahrnuje reverzní transkripci mRNA pomocí primeru, po které následuje štěpení pomocí RNAázy H. Vzniklá jenošroubovice komplementární DNA slouží jako matrice pro syntézu druhého vlákna pomocí DNA polymerázy I.

•	99 99	• 9	«9	9»
	• ♦ *	9 9 *	• ·	9	•
•	• 9	• ·	9 *	* 9
•	* 9 9	• ·	• 999	9	9
•	• ·	• «	*	• ·
		99*9	9*	9*

Jiné vhodné způsoby syntézy cDNA jsou shrnuty v laboratorním manuále od Maniatise (kapitola 8).

Vzorky obsahující 5 pg mRNA byly hybridizovány s oligo dT (směs 12-ti až 18-ti merů, Pharmacia Biotechnology Ltd., 0,5 pg} v 10 μΐ roztoku obsahujícím 2,5U inhibitoru RNAázy z placenty (Life Technologiés Ltd.). NA objem 10 μg byl vzorek doplněn vodou bez obsahu RNA-ázy a poté byl inkubován při 70 °C a poté prudce ochlazen na ledu. Syntéza prvního vlákna cDNA byla provedena po přídavku 4 μΐ 5x H-RT pufru (250mM Tris, pH 8,3, 200mM KC1, 30mM MgCl₂ a 0,5mg/ml BSA) , 2 μΐ 1M DTT (dithiothreitolu) , 1 μΐ dNTP mixu (dATP, dCTP, dGTP a dTTP po 20mM) , 4 μΐ reverzní tranškriptázy Superscript (Life Technologies Ltd.). Rekační směs byla 1 hodinu inkubována při 42°C. Při syntéze druhého vlákna bylok reakční směsi přidáno 1, 5 μ! směsi dNTP (viz výše), 92,5 μΐ vody bez obsahu RNA-ázy, 30 μΐ 5x reakčního pufru (125mM Tris, pH7,5, 500mM KC1, 25mM MgCl₂, 50mM (NH₄)₂S0₄ a 5 mg/ml β-NAD) , 1 μΐ T4 DNA ligázy (10 U, Life Technologies Ltd.), 4 μΐ DNA polymerázy I (40 U, Life Technologies Ltd.) a 1 μΐ RNA-ázy H (2,7 U, Life Technologies Ltd.) a inkubace pokračovala další 2 hodiny při teplotě 16°C. Aby bylo zaručeno, že vzniklá cDNA má tupé konce, byla reakční směs na závěr ještě 5 minut inkubována za teploty 16°C s přídavkem 2 μΐ T4 DNA polymeráza (10 U, Life Technologies Ltd.). Enzymatická aktivita byla zastavena 10 minutovým zahříváním při 70°C.

c) izolace fragmentů genů pro protilátku pomocí PCR

Izolace fragmentů řetězců Fd a L protilátky A5B7 byla provedena za použití cDNA jako matrice. Fd fragment byl ukončen hned po pantové sekvenci (po C-koncovém threoninu), dále je tento konec uváděn jako proteolytický typ Fd..

• ·*	99	9·	99		99
99 9 ·	• 9	9 9	« 9	9	9
9 ·	• 9	9	9 9		9 9
9 ♦ ♦'	9 ♦	9	9 9*9	9	9
• 9	9 *	9	9	9	9
··· ···♦	• 9	···♦	»·		»·

Jako templát je možno použít materiál získaný při syntéze prvního vlákna cDNA nebo z reakce pro dokončení druhého vlákna. Tento materiál lze použít jak v neředěné formě po dokončení reakce nebo v ředění rozředění (až 1:100) v redestilované vodě. Pro syntézu fragmentů řetězců Fd a L byly použity oligonukleotidy podle Sekvencí id. Č. 13 až 19. Oligonukleotid pro 5'-koncovou oblast fragmentů (Sekvence id. č. ·. 13 pro Fd fragment a Sekvence id. č.: 14 pro L řetězec) obsahoval cílové místo pro restrikční enzym (HindiII v případě fragmentu Fd a místo pro EcoRI v případě L řetězce) , konvenční Kozákovu sekvenci (GCCGCCACC) určenou pro zesílení iniciace translace a část přirozené myší signá-l-n-í—-sekvence-—ClTgonuk±eotřd~pro^3^H“koncovou~^bTasť pro fragment proteolytického typu Fd (Sekvence id. č.: 15) byl komplementární s 3 ' koncem pantové oblasti protilátky a. obsahoval mutace pro zavedení dvojitého kodónu pro terminaci translace (TAG a TAA) bezprostředně za pantovou sekvencí a dále obsahoval cílové místo pro restrikční enzym EcoRI za touto sekvencí. 3'-koncová oblast L řetězce byla určená pomocí oligonukleotidu (Sekvence id. č. ; 16) , který je komplementární ke konci kódující oblast. Tento' oligonukleotid zavedl dodatečný terminační kodón (TAA) a restrikční místo EcoRI. Dále byly k reakci přidány páry částečně se překrývajících a komplementárních oligonukleotidů pro každý fragment (Sekvence id. č.: 17 a 18 pro fragment Fd a Sekvence id. č. : 19 a 65 pro L řetězec), které zavádějí do obou vláken vznikající DNA tiché mutace, které odstraňují cílová místa pro enzym BamHI z CH1 Fd fragmentu a regionu VL řetězce L, aniž by přitom došlo ke změně aminokyselinové sekvence. Jak 5'-koncový tak i 3'-koncový oligonukleotid byl použit s vhodným mutagenním oligonukleotidem, tak aby vznikly dva zmutované fragmenty každého řetězce protilátky. Po purifikaci byly oba fragmenty ekvimolárně smíchány a použity jako matrice pro druhou PCR reakci za použití odpovídajících oligonukleotidů

9	99	9·	• 9	*9	9 ·	9
9	• ·	9	•	9 9	99
•	• · 9	9	9 9	99	•	9
0	O 9	9 9	9	9	•
		99	···♦	• 9	• 9

pro 5'- a 3'-koncovou oblast. Produkty těchto reakcí byly úplné fragmenty Fd a L řetězce bez vnitřních míst pro enzym BamHI.

Pokud není uvedeno jinak bylo přidáváno 5 μΐ cDNA na 100 μΐ reakční směsi obsahující lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KC1, 0,1% gelatin, 1, 5mM MgCl₂, 1,25 mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 1 . μΜ . každého z odpovídajících oligonukleotidů a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus).

Každá reakce'byla překryta 100 μΐ minerálního oleje a

1,5 minuty inkubována při teplotě 94°C, 1 minutu při 50 'ne'bo5-5·⁰ C~ a~~ 2—mi nu t y ~ p ři—- teplo t-ě-A^-°S^—Ten-to·—ey-k-lu-s—by-l .................

opakován 25-krát. Na závěr byla reakce ještě zakončena inkubací 10 minut při 72°C. Byly rovněž provedeny kontrolní reakce bez templátu DNA.

Z každé PCR reakce byl odebrán 5 μΐ vzorek a ten byl analyzován na 0,8% agarózovém gelu (Sigma), .který byl vzápětí obarven v 1 Mg/ml roztoku ethidium bromidu (BDH Laboratory Supplies) a DNA byla zviditelněna na na UV transiluminátoru. Pásy o správné velikosti byly patrné ve všech PCR reakcích s obsahem cDNA protilátky A5B7, což dokazuje úspěšnou amplifikaci’ fragmentů Fd a L řetězce. Nepřítomnost Den pás v řízených reakcích. Nepřítomnost DNA v kontrolních reakcích naopak indikuje, že použitá činidla neobsahovala kontaminující DNA.

Všechny PCR produkty byly Čištěny pomocí filtračního mikro-koncentrátoru Centricon 100 (Amicon Ltd.). Každá reakce byla převedena do koncentrátoru a její objem byl zvětšen na 2ml přídavkem redestilované vody. Jednotka byla potom 5 minut centrifugována při 500xG na stolní centrifuze Sorval RT6000B s rotorem H1000B. Průtočná frakce byla odstraněna pro a průtoku vyřadil. Zadržená frakce byla opět zředěna na 2ml a jednotka byla znovu-centrifugována.

• 99	99	99	9 9	• 9
• 9	• 9	9	•	• 9	9 9	• 9
9	•	9	9	9	9 »	99
9	• *>	9	9	9 9	9 9«	• 9
9	9	9	•	9	9	9 ·
			9 9	9999	9 9	99

Tento postup byl ještě jednou opakován (celkově třikrát). Smyslem těchto centrifugací je odstranění přebytku oligonukleotidú a složek pufru z amplifikované DNA. Takto přečištěné DNA byly potom použity přímo v následujících PCR reakcích. Páry fragmentů byly smíšeny v ekvimolárním poměru a alikvoty této směsi byly použity v druhé PCR reakci s příslušnými 5' a 3' oligonukleotidu.

d) Klonování fragmentů vytvořených pomocí PCR do plazmidu pBluescript

Produkty druhé PCR reakce obsahovaly pásy o velikosti přibližně 775 bp a 730 bp, což odpovídá úplnému Fd respek-t-i-ve~L·—řefe-ězc-i-v—-Ty-to—prod-u-k-fe-y—byiy—ta-ké—přeč-iš-těnypomocí mikrokoncentrátorů Centricon 10 viz výše. Jednotlivé DNA byly poté precipitovány v 1,5 ml roztoku obsahujícího 50 μΐ 3NI octanu sodného doplněného destilovanou vodou do 500 μΐ a 1 ml absolutního ethanolu. Roztok byl alespoň 10 minut inkubován na ledu před 10 minutovou centrifugací při ll,600xG (MSE MicroCentaur). Supernatant byl odstraněn a peleta byla promyta v 1 ml 70% ethanol (v/v v destilované vodě) centrifugací trvající dalších 5 minut. Supernatant byl opět odstraněn a DNA peleta byla vysušena ve vákuu. Jednotlivé DNA pelety byly resuspendovány v destilované vodě. PCR produkt obsahující Fd fragment byl potom naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII v 200 μΐ reakční směsi obsahující 20mM Tris-acetát, pH 7,9, lOmM octan hořečnatý, 50mM octan draselný, lmM dithiothreitol (DTT) a 25 U od každého z enzymů HindlII a EcoRI (Promega Corp.). Produkt obsahující DNA pro L řetězec byl naštěpen restrikčním enzymem EcoRI v 30 μΐ reakční směsi obsahující 90mM Tris-HCl, pH7,5, lOmM chlorid hořečnatý, 50mM chlorid sodný a 10 U enzymu EcoRI. Štěpení probíhalo po dobu 1 hodinu při teplotě 37°C.

Naštěpené fragmenty DNA byly poté přečištěny pomocí elektroforézy na 0,75% SeaPlaque GTG agarózovém gelu (FMC

-82• ·· ·· ·· 9*99 * · ' · 9 9 9 9 ··9

9«9 99999

9 9, « 9 9 99999*

9 9 9«99 ·· 99 99 99 9999 999*

BioProducts Ltd.) a poté izolovány vyříznutím odpovídajících pásů z gelu. Vyříznuté kousky gelu byly rozpuštěny zahřátím na 65°C na 2 minuty, zředěny do výsledného objemu 450 μΐ destilovanou vodou a poté bylo přidáno 5 0 μΐ 3M octanu sodného. Tento roztok byl extrahován stejným dílem kapalného fenolu, vyrovnán pufrem Tris pH 7,6 (Fisons) a poté byla centrifugací 2' minuty při ll,600xG (ΜΞΕ MicroCentaur) oddělena vodná a fenolická fáze. Vodná fáze byla poté extrahována směsí fenol: chloroform (50:50 v/v) a znovu chloroformem ještě před precipitací ethanolem, viz výše. Jednotlivé purifikované pelety byly resuspendovány v 10 μί destilované vody a 1 μΐ vzorky byly a.n.a.l.yz.o_yány pomo.c.í___elektroforézy— na— 0-,-8%— - agarózovém gelu. Z výsledků elektroforézy byla odhanuta kvalita a koncentrace DNA ve vzorcích.

Plazmid pBluescript (Stratagene Cloning Systems) byl použit pro počáteční klonování cDNA pro Fd a L řetězce. Tento phagemidový vektor má jedinečná klonovací místa pro enzymy EcoRI a Hindlll, gen pro rezistenci k ampicilinu a replikační počátky jak ColEI tak i fl pro izolaci jak jednovláknové tak i dvouvláknové DNA. 5 gg pBluescript KSDNA bylo úplně naštěpeno 30 U enzymu EcoRI (Promega Corp.) v 100 μΐ reakční směsi obsahující 90mM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM MgCl₂, 50mM NaCl nebo enzymy EcoRI a Hindlll v 100 μΐ reakční směsi obsahující 20mM Tris-acetát, pH 7,9, lOmM octan horečnatý, 50mM octan draselný, lmM dithiothreitol (DTT), a 25 U obou z enzymů EcoRI a Hindlll (Promega Corp.) Štěpící reakce byla inkubována při teplotě 37°C po dobu 1 hodiny. K plazmidu naštěpenému enzymem EcoRI byly přidány 2 μΐ střevní telecí alkalické fosfatázy (2 U, Boehringer Mannheim) na odstranění 5'koncových fosfátových skupin a inkubace při 37°C pokračovala dalších 30 minut. Fosfatázová aktivita byla Odstraněna 10 minutovým zahřátím na 70°C.

• AW	»·	«»		• A
AA · A	•	•	A ·	A A	A	A
• ·	• ·	•	A A	A A
• ·	* A	A	• A	A A	A	•
* ·	v ·	A	A	9	A
·«A ·«««	A A	AAAA	AA	• A

Plazmid naštěpený enzymy EcoRI-HindlII byl přečištěn od zbytků SeaPlaque GTG agarózy tak, jak je popsáno výše.

až 50ng naštěpeného produktu PCR obsahujícího DNA pro Fd nebo L řetězce bylo ligováno s 50ng EcoRI-HindiI respektive EcoRI/CIP štěpeným plazmidem pBluescript v 10 μΐ roztoku obsahujícího 30mM Tris-HCl, pH7,8, lOmM MgCl₂, lOmM DTT, lmM ATP a 1,5 U T4 DNA ligázy (Promega Corporation) . Reakce probíhala při teplotě 16 °C po dobu 2,5 hodiny. 1 μΐ alikvoty jednotlivých reakcí byly použity pro transformaci 20 μΐ kompetentních buněk E. coli DH5a (Life Technologies Ltd.).. Při transformaci byl použit protokol dodávaný s buňkami.

Transformované buňky byly vysety na plotny s L-agarem s přídavkem 100 μ9/ιη1 ampicilinu, lmM IPTG a 0,2% X-gal a inkubovány přes noc při teplotě 37°C. Byly vybrány klony obsahující klonovaný inzert, jejichž kolonie se v popsaném mediu barvily bíle, na rozdíl od kolonií obsahujících rodičovský plazmid, které se barvily modře.

e) Sekvenční analýza cDNA klonů

Klony potenciálně obsahující Fd a L řetězce cDNA identifikované pomocí barevné selekce byly převedeny z agarových -ploten a použity pro velkoobjemovou izolaci plazmidové DNA. Jednotlivé klony byly použity k naočkování 200 ml L-bujónu s přídavkem 100 μ9^1 ampicilinu v 500ml kónických kádinkách. Kultury byly inkubovány za stálého třepání při teplotě 37°C přes noc. Poté byly buňky z jednotlivých kultur zpeletovány 10 minutovou centrifugací při 5000xG centrifuze v Sorvall RCSC a rotoru GS3 při teplotě 4°C. Buněčná peleta z jednotlivých kultur byla resuspendována v 20ml pufr TE a znovu 10 minut centrifugována při 2000xG v centrifuze Sorvall RCSC a

« ··		··
*· · ·	•	•	• ·	•	•	•	•
* ·	•	•	•	•	•
• ·	• ·	•	• ·	···	•	•
• · 9··	• ··	•	• ····	• ··	9 ««	•

rotoru SS-34 v kývete typu oak-ridge při teplotě 4°C. Jednotlivé promyté buněčné pelety byly resuspendovány ve 3 ml ledové 25¾ sacharózy, 50mM Tris, pH 8,2 a ponechány na ledu. Pak byl přidán čerstvý roztok lyzozymu (1, Oml o koncentraci lOmg/ml), obsah kyvety byl promíchán kutálením a inkubace na ledu pokračovala dalších 5 minut. Poté byl přidán roztok ethylen-diamin-tetracetátu sodného (EDTA, 1,0 ml při koncentraci 0,5 mM, pH 8,5) a obsah byl opatrně promíchán. Na závěr bylo přidáno 5,0 ml roztoku vychlazeného Tritonu-X (0,1% Triton X-100, 62,5mM EDTA, 50mM Tris, pH8,0) a obsah byl opět opatrně promíchán. Další inkubace na ledu pokračovala po dobu 10 minut. Zbytky buněk byly__potom zpe 1 e továny__3,0__.minut.o.vo.u—cent r-if-ugací——p-ř-i39.000xG v centrifuze Sorvall RCSC a rotoru SS-34 při teplotě 4°C. Supernatant obsahující plazmidovou DNA byl přidán k 16 g chloridu česného (Boehringer Mannheim) a 150 μΐ roztoku ethidium bromidu (lOmg/ml) -a objem byl doplněn na 18,5ml přídavkem TE pufru. Tento roztok byl převeden do

18,5_ml polypropylénových centrifugačních kyvet se zatavitelným koncem (Crimp top, Sorvall Instruments). Kyvety byly zataveny a centrifugovány při 180.000xG po dobu 16 hodin v titanovém vertikálním rotoru Sorvall TVB6SB v centrifuze 0TD65B při teplotě 18°C.

Po centrifugaci byla plazmidová DNA viditelná jako· ostrý oranžový pás v hustotním gradientu CsCl/EtBR, který se vytvořil během centrifugace. Plazmidová DNA byla odebrána z gradientu za použití injekční stříkačky, kterou byla propíchnuta stěna kyvety. Vzorek odebraný z gradientu byl 3- až 4-krát naředěn TE pufrem a DNA precipitována přídavkem stejného objemu isopropylalkoholu a inkubací na ledu po dobu 10 minut. Vysrážená DNA byla zpeletována centrifugací při 17,000xG v centrifuze Sorvall RCSC a rotoru SS-34 při teplotě 4°C. Supernatant byl odstraněn a peleta promyta 70% ethanolem (v/v) a opětovně 5 minut centrifugována. Peleta byla poté vysušena ve vákuu,

-85• ·· ·· ♦· ·· ·· • · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · « · · 4 ♦ ♦ · · · ·· · · · ··· • ·· ·«·· ·· ·♦♦· ·· ·· resuspendována v 1, 5ml TE pufru s přídavkem 200 μΐ 3M roztoku octanu sodného a extrahována stejným dílem fenolu. Fáze byly odděleny centrifugací při 17,000xG po dobu 2 minut.

Vodná fáze byla znovu extrahována ve stejném objemu chloroformu a DNA byla poté vysrážena přídavkem stejného objemu ethanolu vychlazeného na -20°C. Srážení probíhalo na ledu po dobu 10 minut. Přečištěná DNA byla zpeletována (viz výše), promyta v 5ml 70% ethanolu a vysušena ve vakuu. Vysušená pleta byla resuspendován v 500 μΐ redestilované vody a koncentrace DNA ve vzorku byla stanovena změřením spektra ředěného vzorku od 300nm do 220nm na UV-spektrofotometru za použití extinkčního koeficientu 50 μg/ml/0D260.Pro purifikaci plazmidové DNA je rovněž dostupný velký počet komerčních souprav (např. Qiagen, Hybaid).

Tato purifikovaná plazmidové DNA byla potom použita pro sekvenční analýzu. Dvouvláknovou DNA lze použít pro sekvenování Sangerovou metodou terminace řetězce pomocí dideoxynukleotidů (Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1977, strana 5463) za použití komerční soupravu jako je například kit Sequenase dodávaný firmou United States Biochemical Company a použitý podle protokolu výrobce.

Pro sekvenční analýzu byly použity alikvoty o velikosti 2 až 4 μ^ plazmidové DNA obsahující cDNA pro Fd a L řetězce. Jednotlivé alikvoty byly zpočátku denaturovány 10 minutovou inkubací za pokojové teploty s 0,2M NaOH, 0,2mM EDTA v konečném objemu 100 μΐ. Ďenaturovaná DNA byla potom precipitována přídavkem 10 μΐ 3M octanu sodného (pH 5,0) a 275 μΐ ethanolu a inkubací na ledu po dobu 10 minut. Vysrážená DNA byla resuspendována tak, jako plazmidové DNA výše. Ďenaturovaná DNA byla potom použity jako matrice pro sekvenaci spolu s 5pmoly jednotlivých vhodných primerů v 10 μΐ Sequenázovém reakčním pufru (40mM Tris, pH 7,5, 25mM

-86MgCl₂, 50mM NaCl) s přídavkem 10% dimethyl-sulfoxidu (DMSO). Reakce byla započata 2 minutovou inkubací při 65°C, po které následovalo postupné ochlazování pod 3 0°C. Sekvenační reakce byla provedena podle protokolu výrobce s 10% DMSO jak při značení tak v terminační reakční směsi.

Sekvenační reakce byly analyzovány autoradiograficky po elektroforéze s vysokým rozlišením na 6% polyakrylamidovém denaturujícím gelu s 8M močovinou (Sanger a Coulson, 1978,FEBS- lett, 87, strana 107). Kompletní sekvence cDNA klonovaných řetězců Fd a L je uvedena níže (Sekvence id. č.: 20 pro proteolytický typ Fd řetězce Sekvence id. č.: 22 pro L řetězec). Plazmid obsahující proteolytický typ Fd byl pojmenován pAFl a plazmid obsahující L řetězec pak pAF3. Přítomnost tiché mutace, odstraňující BamHI místo byla' v jednotlivých fragmentech rovněž potvrzena. Z DNA sekvence lze soudit, že protilátka je izotypu IgGxK, což vyplývá ze srovnání s publikovanými DNA sekvencemi konstantních oblastí (viz Kabat, E. A., Wu, T. T., Bilofsky, H., Reid-Hilner, H., Perry, H., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Sekvence imunologicky zajímavých proteinů), 4. vydání, Public Health Service N. I. H., Washington DC).

f) Příprava DNA sekvence pro fúzní protein Fd-HCBP

Gen kódující C-terminální oblast sekvence Fd od cílového místa Ncol v Sekvenci id. č.: 20 (pozice 497) byl pomocí PCR spojen se sekvencí pro HCPB. Přitom byla do fúzního genu vložena sekvence DNA kódující 8 aminokyselin dlouhý linker (VPEVSSVF; Sekvence id. č.: 67). Plazmid pAFl byl použit jako matrice pro PCR reakci s teplým startem (viz Referenční příklad 9) s oligonukleotidy podle Sekvence id. Č.: 9 a 10 za vzniku 338bp dlouhého produktu. Podobně byl plazmid pICI1698 použit jako matrice pro PCR reakci s

9

-87oligonukleotidy podle Sekvence id. č. ·. 11 a 1 za vzniku

998bp dlouhého produktu. Oba produkty byly izolovány elektroforézou na agarózovém gelu a přečištěny soupravou Geneclean, viz Referenční příklad 9. Po přečištění bylo 0,2 ng obou produktu v celkovém objemu 50 μΐ použito v druhé PCR reakci s teplým startem. Tato reakce sestával z 10 cyklů po 1 minutě při 94°C, 4 minutách při 63°C a 2 minutách při 94°C. K DNA fragmentům bylo přidáno lOOpM každého z hraničních oligonukleotidů (Sekvence id. č. : 9 a 1) v 50 μΐ pufru s přídavkem 2,5 U Amplitaq. Reakční směs byla nejprve 3 minuty zahřívána při 94 °C a poté bylo provedeno 25 cyklů: 1,5 minuty při 94°C, 2 minuty při 55°C a 2 min při 72°C. Po dokonče n í _2.5„_mcy.klů_^by la__r e ak c é -...... ...

uzavřena 10 minutovou inkubací při 72^aC. Produktem reakce byl pás o velikosti 1336bp, který byl vyizolován dříve uvedeným postupem, a potom nastěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a nakloňován do. plazmidu pBluescript v buňkách DH5cc (klony byly testovány pomocí PCR s oligonukleotidy podle Sekvencí id. č: 3 a 4) za vzniku plazmidu pMF35. Kompletní sekvence fúzního proteinu Fd-HCPB byla připravena, tak, že 10 μg každého z plazmidů pAFl a pMF35 bylo naštěpeno restrikčními enzymy Ncol a EcoRI (2 hodinová inkubace) ve 100 μΐ.pufru obsahujícího 50 mM octan draselný, 20mM Tris-acetát (pH 7,9), lOmM MgCl₂, lmM DTT, 40 U enzymu EcoRI a 20 U Ncol. 3,4 kb dlouhý fragment plazmidu pAFl byl izolován a inkubován s telecí střevní alkalickou fosfatázou (viz Referenční příklad 9) a ligován do přečištěného 1, 2 kb dlouhého fragmentu plazmidu pMF35.

Výsledný vektor byl nakloňován do buněk DH5cc, které byly testovány na přítomnost správného. 1.922 bp dlouhého inzertu pomocí PCR s oligonukleotidy podle Sekvencí id. Č.: 3 a 4. Výsledný plazmid byl pojmenován pMF39. EcoRI-HindlII fragment plazmidu pMF39 byl nakloňován do plazmidu pEE6 (jde o plazmid odvozený od pEES.hCMV - Stephens a Cockett (1989), Nucleic Acids Research 17', strana 7112, ve kterém v v

-88je cílové místo HindlII proti směru exprese od hCMV promotoru převedeno na cílové místo BglII) a vložen do buněk DH5a, které byly testovány na přítomnost správného, přibližně 2.200bp dlouhého inzertu pomocí PCR s oligonukleotidy podle Sekvencí id. č. ·. 5 a 6.Výsledný plazmid byl pojmenován pMF43.

Plazmidy pAF3 (viz bod e) a pEE12 [tento vektor je podobný plazmidu pSV2.GS popsaném Bebbingtonem a dalšími, (1992) Bio/Technology 12, strana 169 až 175, přičemž je řada původních cílových míst pro restrikční enzymy z plazmidu pSV2.GS odstraněna pomocí cílené mutageneze, takže cílová místa v oblasti polylinkeru jsou jedinečná]. Vhodné 'fragmenty vektorů a inzertů ž jednotlivých štěpení byly poté vyizolovány z SeaPlaque GTG agarózy, spojeny ligací a použity pro transformaci kompetentních buněk DH5a, viz výše. Transformované buňky byly vysety na plotny s L-agarem s přídavkem 100 μ9/πι1 ampicilinu. Vyhledání transformovaných kolonií bylo provedeno pomocí PCR. Kolonie byly přeneseny do 200 μΐ destilované vody a pečlivě zamíchány na vořtexu. Suspendované buňky byly potom 1 minutu zahřívány při 100°C a 2 minuty centrifugovány při 11.600xG. Supernatant byl použit pro PCR reakci. V v každé z PCR reakcí byl použit oligonukleotid, který hybridizuje se sekvencí v CMV promotoru (Sekvence id. č.: 5) a oligonukleotid komplementární s 3'koncovou oblastí lehkého řetězce (Sekvence id. č.: 16). Pouze klony, které obsahují gen pro fragment protilátky vložený ve správné orientaci po směru exprese od CMV promotoru dají vzniknout specifickým PCR produktům o velikosti přibližně 2.0 kb. Výsledný plazmid byl pojmenován pAF6. Při přípravě vektoru pro společnou expresi bylo 10 μg plazmidu pMF43 naštěpeno 20 U enzymu BglII a 40 U Sáli ve 100 μΐ pufru obsahujícího lOmM Tris-HCl (pH 7,9), 150mM NaCl, lOmM MgCl₂, lmM DTT a BSA (100 μ9/τη1) . 4348bp dlouhý fragment byl izolován elektroforézou na agarózovém gelu a přečištěn soupravou

-89• · · 9 · · 4 4

4 4 4 4 4 444 · 4 * * * 4 4 4 4

444 44 4444 4» 44

Geneclean, viz výše. Podobně byl naštěpen i plazmid pAF6 40· U enzymu BamHI a 40 U Sáli a výsledný 7,8 kb dlouhý fragment vektoru byl vyizolována a ligován s BglII-SalI fragmentem plazmidu pMF43 a nakloňován do buněk DH5a. Kolonie byly testovány pomocí PCR s dvěma sadami oligonukleotidů (podle Sekvencí id. č.: 14 a 12 a podle

Sekvencí id. č.: 13 a 6) . Klony dávající PCR produkty dlouhé 360 bp respektive 1, 3kbp byly blíže určeny sekvenováním DNA. Klon obsahující správnou sekvenci byl pojmenován pMF53. Tento plazmid je určen pro společnou expresi lehkého řetězce/Fd-HCPB v buňkách DH5a.

g) exprese fúzního proteinu. myší protilátky A5B7 F(ab')₂-HCPB buňkami COS

Byl zopakován postup popsaný v Referenčním příkladu 9 popisující kotransfekci buněk COS-7 plazmidem kódujícím prepro-sekvenci (pMF67) s tím, že plazmid pMF48 byl nahrazen plazmidem pMF53. Supernatanty COS buněk byly testovány na aktivitu HCPB, viz Příklad 3 a 9. Supernatanty COS buněk ošetřených činidlem LIPOFECTIN, ale bez přídavku plazmidové DNA, byly schopny hyrolyzovat 1,2% substrátu, zatímco supernatanty COS buněk transfikované směsí plazmidů exprimujících lehký řetězec/Fd-HCPB a prepro sekvenci byly schopny hyrolyzovat 34% substrátu Hipp-Arg. COS buňky transfikované pouze plazmidem pMF53 hyrolyzují substrát Hipp-Arg stejnou měrou jako COS buňky ošetřené pouze činidlem LIPOFECTIN. Pomocí Western-blotu (viz bod h) byly identifikovány proteiny o velikosti přibližně 80kDa a 160kDa, které odpovídají fúzním peroteinúm Fab’-HCPB respektive F (ab¹) ₂-(HCPB)₂. V testu CEA-ELISA (viz body i) a j) níže) byly pro detekci látek schopných vazby na antigen CEA použity buněčné supernatanty (viz výše) podle protokolu uvedeném v bodu j) .

• φ · · · · I» · φ

Φ * * V Φ φφφφ φ φφ φ φφφφ φ φφ φ φ « φφφφ» • φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφ

h) Analýza metodou Western blot

Analýza metodou Western blot byla provedena níže popsaným způsobem:

Alikvoty (20 μΐ) z každého vzorku supernatantu byly smíchány se stejným množstvím vzorkového pufru (62,5 mM Tris, pH 6,8,1¾ SDS, 10% sacharóza a 0,05% bromfenolová modř) s nebo bez redukčního činidla. Před vlastní elektroforézou na gradientu akryamidového gelu s gradientem 8 až 18% (gel Excel, produkt Pharmacia Biotechnology Products) prováděnou podle návodu poskytovaného výrobcem na přístroji Multiphor II (LKB Produkter AB) byly vzorky inkubovány po dobu 10 minut při 65 °C. Po elektroforéze_by,l-V.·.-....... — za použití přístroje Novablot (Produkter AB) postupem popsaným výrobcem přeneseny separované proteiny na membránu Hybond C-Super (Amersham International). Po přeblotování byla membrána vysušena na vzduchu.

Přítomnost fragmentů protilátky byla detekována pomocí protilátky konjugované s peroxidázou namířené proti myšímu F(ab')2 (ICN Biomedicals, produkt číslo 67-430-1). Přítomnost fragmentů myší protilátky A5B7 byla vizualizována pomocí detekčního systému ECL (Amersham International) postupem podle výrobce.

i) Analýza metodou ELISA

Standardní postupy pro ELISA stanovení jsou popsány v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology editoři Burdon, R. H. a van Kippenberg, P. H., svazek 15, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Tijssen, P., 1985, Elsevier Science Publishers B. V.. Jiným zdrojem informací je například Antibodies - A Laboratory Manual Harlow, E. a Lané, D. P., 1988, publikovaný v Cold Spring Harbor Laboratory.

j) stanovení anti-CEA protilátek metodou ELISA

1. Připraví se potahovací pufr (1 kapsle pufru uhličitan-hydrogenuhličitan - Sigma C-3041 - ve 100 ml redestilované vody).

2. Na každou použitou 96-ti jamkovou destičku se přidá k ml potahovacího pufru 5 μΐ zásobního roztoku CEA (1 mg/ml, Dako).

3. Do každé jamky na mikrotitrační destičce Nunc Maxisorp se napipetuje 100 μΐ zředěného CEA 50 ng/jamka/100 μΐ.

4. Destičky se inkubují při 4°C přes noc (nebo_2__ho.dinv........... ....

při pokojové teplotě).

5. Destičky se promyjí celkem čtyřikrát po dobu 5 minut roztokem PBS + 0,01% azidem sodným (PBSA).

6. Destičky se blokují (po vyklepání promývacího roztoku) pomocí 200 μΐ 1% BSA (Sigma A-7888) v PBSA obsahujícím 0,05% Tween 20 na jednu jamku. Inkubujese dvě hodiny při pokojové teplotě.

7. Destičky se promyjí celkem čtyřikrát po dobu 5 minut roztokem PBSA obsahujícím 0,05% Tween 20.

8. Nanesou se vzorky (supenatanty z buněčné kultury) a vhodné standardy (proteolytickým štěpením připravené F(ab')₂ ve dvojnásobných ředěních). Vzorky se naředí růstovým médiem (nebo PBS) . Jako prázdné vzorky lze použít PBSA + 1% BSA a rozpouštědlo.

9. Destičky se inkubují 3 hodiny při pokojové teplotě.

10. Poté se destičky promyjí celkem šestkrát po dobu 5 minut roztokem PBSA + 0,5% Tween 20.

11. Připraví se roztok sekundární protilátky (namířená proti myším IgG F(ab')₂, kozí protilátka konjugovaná • e • 4 4 « * · 4·· • 4 ♦ · · 4 4 · · · 44

44** φ 4 •44 44*4 44 4444 4444

-92s peroxidázou - ICN 67-430-1 - o objemu 20 μΐ ve 40 ml PBSA + 1% BSA + 0,5% Tween 20) a do každé jamky přidejte 100 μΐ.

12. Destičky se inkubují 1 hodinu při pokojové teplotě.

13. Poté se destičky promyjí celkem šestkrát po dobu 5 minut roztokem PBSA + 0,5% Tween 20.

14. Připraví se vyvíjecí roztok rozpuštěním jedné kapsle pufru Fosforečnan-Citrát-Peroxoboritan (Sigma P-4922) ve 100 ml redestilované vody. Do 100 ml pufru se přidá 30 mg o-fenyldiamin dihydrochloridu (OPD, SigmaP-8287). Do každé jamky se nanese 150 μΐ.

15. Inkubuje se 15 minut při pokojové teplotě ve tmě.

16. Reakce se zastaví přídavkem 50 μΐ 2 M kyseliny sírové: do každé jamky.

17. Na čtečce destiček se odečte OD při 490 nm.

Příklad 1: Klonování a exprese mutantního proteinu D253K

HCPB-(His)_s-c-Myc v.buňkách E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu D253K-HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsáném v Referenčním příkladu 7. Opět byl použit plazmid pICI266 jako klonovací vektor a jako výchozí materiál pro PCR amplifikaci genu pro pro-HCPB byl použit plazmid pICI1698 (viz Referenční příklad 6) . V tomto případě však byl cílenou mutagenezí během PCR amplifikace genu zaměněn kodón na aminokyselinové pozici 253 v maturovaném genu z kodónu pro kyselinu asparagovou(D) na kodón pro lyzin(K) (GAC na ΑΆΑ) . Mutantní protein byl pojmenován D2 53K. Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. V první reakci byly použity primery

• 44	44	• 4	• 4	4 φ
						•
•	4	4	4 ·	4 4	• 4
4	•	4 4	4 4 4	• 4 4	4	•
4	•	4	4 4	*	4	4
		4 4	··«·	44	44

FSPTS1 (Sekvence id. č.: 40) a 1398 (Sekvence id. č.: 57). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 41) a 1397 (Sekvence id. č.: 58). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1698.Primery 1398 a 1397 (Sekvence id. č. : 57 a 58) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly okolo aminokyseliny 253 a zavedly do sekvence. DNA změnu kodónu GAC na AAA a aby daly vzniknout komplementárním sekvencím na koncích obou PCR produktů. Další dva primery, FSPTS1 a 6HIS9EIOR1BS1 (Sekvence id. Č.: 40 a 41) jsou popsány v Referenčním příkladu 7. Alikvoty z obou PCR reakcí byl analyzovány na přítomnost DNA o správné velikosti (okolo 750 a 250 bp) elektroforézou na agarózovém ge-l-u-v—E-lektorforéza posToužiTa i pro odhad koncentrace produktů. Reakční směs obsahovala převážně DNA o právné; velikosti. Poté byla připravena další PCR reakce za použití, přibližně 4 ng každého z PCR produktů první reakce. Kromě tepmlátové DNA byly k reakční směsi přidány dNTP do výsledné koncentrace 200 μΜ, reakční pufr pro Taq polymerázu, 2U Taq polymerázy a celkový objem reakční směsi, činil 80 μΐ. Směs byla zahřáta na 94 °C po dobu 10 minut, před přídavkem Taq polymerázy. Vlastní PCR probíhala v 10 cyklech sestávajících z 1 minutové inkubace při 94°C a 4 minutové inkubace při 63°C. Po dokončení těchto cyklů byla reakční směs doplněna na 120 μΐ pomocí přídavku 120 pmolů obou koncových primerů FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 40 a 41), další směsi dNTP (přibližně dalších 100 μΜ) , reakčního pufru pro Taq polymerázu a 4U Taq polymerázy. Směs byla inkubována při 94°C po dobu 10 minut a pak byla teprve přidána další Taq polymeráza. Vlastní PCR probíhala v 30 cyklech sestávajících z 1,5 minutové inkubace při 94°C, 2 minutové inkubace při 50°C a 2 minutové inkubace při 72°C. Na závěr byla ještě směs zahřívána 9,9 minuty při 72°C.

Alikvot PCR produktu byl analyzován na obsah DNA o správné velikosti (přibližně 1000 bp) elektroforézou na

-94agarózovém gelu a bylo přitom prokázáno že obsahuje převážně DNA o správné velikosti. Zbytek PCR produktu z reakční směsi byl přečištěn podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. Izolovaná DNA byla restrikčně štěpena enzymy Fspl a EcoRI a proužek DNA o správné velikosti (přibližně. 1000 párů baží) byl přečištěn v podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7,

Dvouvláknová DNA plazmidů pICI266, připravená podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7, byla restrikčně štěpena enzymem. KpnI a konce byly zarovnány T4

DNA polymerázou. Reakční podmínky byly stanoveny tak, aby zajistily kompletní rozštěpení. Purifikovaná DNA byla potom nastěpena restrikčním enzymem EcoRI. DNA o správné velikosti (přibližně 5600 páru baží byla purifikována způsobem podobným jako v Referenčním příkladu 7.

Alikvoty obou naštěpených a přečištěných vzorků DNA byly ještě jednou použity pro elektroforézu na agarozovém gelu přičemž byla překontrolována jejich čistota a. odhadnuta jejich koncentraci srovnáním se známými, standardy. Z těchto výsledků byla připravena ligační směs pro klonování genu pro HCPB do plazmidů pICI266 způsobem podobným jako v Referenčním příkladu 7.

Po ligační reakci byla směs DNA použita pro transformaci bakterií E. coli kmene DH5a, z kultivačnívh ploten byly vybrány jednotlivé kolonie a ty byly testovány hybridizací opět podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

Bylo vybráno šest pozitivně hybridizujících klonů, které byly překontrolovány pomocí PCR na přítomnost inzertu o správné velikosti. Při této PCR byly použity primery FSP1TS1 a 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 40 a 41). Rovněž byla testována schopnost vnitřních primerů FSPTS1 (Sekvence id. č.: 40) a 679 (Sekvence id. č.: 33) vytvářet specifické • · i

-95produkty, tak jak bylo popsáno v Referenčním příkladu 7. Při PCR by měly vzniknout DNA fragmenty o velikosti přibližně 1000 párů baží s primerů FSPTS1 a 6HIS9E10R1BS1 a přibližně 430 párů baží z primerů FSPTS1 a 679. Elektroforézou na agarózovém gelu bylo prokázáno, že všech šest klonů obsahuje správné DNA inzerty.

Všech šest klonů bylo poté napěstováno ve větším měřítku a byla vyizolována jejich plazmidová DNA. Dva z klonů byly v oblasti PCR produktu sekvenovány podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. Klony byly sekvenovány za použití osmi různých oligonukleotidových primerů označených jako 1281, 677,. 1504, 679, 1802, 159_2_____—

1280 a 1731 (Sekvence id. č.: 37, 34, 42, 33, 45, 43, 35 a 44). Podle, výsledků sekvenování byl vybrán klon obsahující plazmid s požadovanou sekvencí genu D253K-HCPB a ten byl označen jako pICI1713.

Potvrzená sekvence klonovaného genu pro fúžní mutantní protein D253K-HCPB v plazmidu pICI1713 s vyznačením translace aminokyselin, od počátku sekvence PelB' až po cílové místo pro restrikční enzym EcoRI je znázorněna na Sekvence id. č. : 59, přičemž číslování DNA začíná 1 v prvním kodónu PelB a číslování peptidu začíná 1 v maturovaném proteinu HCPB.

S cílem dosáhnout kontrolované exprese D253K-HCPB byla plazmidová DNA pICI1713 transformovaná do expresivních kmenů E. coli vhodných pro transformaci chloridem vápenatým, podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. K testování exprese klonovaného genu pro fúzní mutantní protein D253K-HCPB byly všechny expresivní kmeny transformované plazmidem pICI1713 zpracovány podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. V tomto případě byla ve Westernové analýze použita monoklonální protilátka 9E10 specifická pro C-myc značenou část peptidu, nebof

-96- .

•	4·	• · ··	• ·	• ·	4
•	• 4	4	•	• 4	44
•	• · ·	*	* 4	V · 4	•	•
*	• 4	•	•	4	•	4
		• 9	• 4*4	4·	• ·

D253K-HCPB má C-terminalní (His)6-c-myc značku podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Exprese klonovaného značeného fúzního mutantního proteinu D253K-HCPB v plazmidu pICI266 (pICI1713) v E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný velký obsah proteinů o velikosti přibližně 35,000 Daltonů na rozdíl od klonů obsahujících pouze vektor (pICI266) Či klonů produkujících- značený HCPB (viz Referenční příklad 7). Proteiny stejné velikosti byly detekovány i pomocí Western analýzy, která detekovala c-myc peptidovou značku.

Příklad 2: Klonování a exprese fúzního ’ mutovaného proteinu D253R HCPB-(His)_s-c-Myc v bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese D253R-HCPB v E. coli je velmi podobný tomu, který je popsaný v Referenčním příkladu 8. Plazmid pICI2 6 6 byl opět použit jako klonovací vektor a: výchozím materiálem pro PCR amplifikaci genu pro-HCPB byl plazmid pICI1712 (viz Referenční příklad 7). V tomto případě však byl během PCR amplifikace cílenou mutagenezí změněn kodón pro aminokyselinu v pozici 253 v genu pro maturovaný enzym z kodónu pro kyselinu asparagovou(D) na kodón pro arginin(R) (GAC na CGC), změna D253R. Byly připraveny dvě PCR směsi. Způsob jejich přípravy byl podobný tomu, jenž je popsán v Referenčních příkladech 7 a

8.Primery v první reakci byly 2264 (podle Sekvence id. č.: 48) a 2058 (podle Sekvence id. č.: 61). Primery v druhé reakci byly 6HIS9E1OR1BS1 (podle Sekvence id. č.: 41) a

2054 (podle Sekvence id. č.: 62). Výchozí DNA v obou reakcích byla DNA plazmidu pICI1712.

4 44	• 1 44	*4	44
						4
•	4	4 4 4	*	4	*4
4	4	4 4 4 4 *	4 4	4	4	4
•	4	4 4 4 ·· *444	«4	♦	4 • 4	4

Primery 2058 a 2054 (Podle Sekvence id. č.: 61 a 62) byly konstruovány tak, aby hybridizovaly kolem kodónu pro aminokyselinu v pozici 253 a zavedly v sekvenci DNA změnu kodónu GAC na CGC a vytvořily komplementární sekvence na koncích obou PCR. produktů. Druhé dva primery, 2264 a 6HIS9E1OR1BS1 (Podle Sekvence id. č.: 48 a 41), jsou popsané v Referenčních příkladech 7 a 8.Pomocí elektroforézy v agarózovém gelu byly analyzovány alikvoty z těchto dvou PCR reakcí, byla detekována DNA správné velikosti (přibližně 750 a 250 bp) a odhadnuta její koncentrace. Vzorky obsahovaly převážně DNA správné velikosti. Pro další PCR reakci'bylo použito přibližně 4ng z”ka7ž~deKo ž prvních PCR produktů. Reakce probíhaly v přítomnosti dNTP, jejichž konečná· koncentrace byla 200μΜ’,„ Taq polymerázového reákčního pufru a 2U Taq polymerázy v konečném objemu 8 0 μΐ. Před přidáním Taq enzymu byla směs po dobu 10 minut zahřívána při teplotě 94^QC, PCR inkubace pak probíhala v deseti cyklech - při 94°C po dobu 1 minuty a při 63°C po dobu 4 minut. Na závěr těchto cyklů bylareakční směs doplněna do 120 μΐ přidáním 120pmolů každého z·, primerů, 2264 a 6HIS9E1OR1BS1 (podle Sekvence id. č.: 48 a 41), další směsi dNTP (přibližně ΙΟΟμΜ), Taq polymerázového reakčního pufru a 4'U Taq polymerázy. Před přidáním Taq enzymu byla směs po dobu 10 minut zahřívána při teplotě. 94°C, PCR inkubace pak probíhala v třiceti cyklech - při 94°C po dobu 1,5 minuty, při 50°C po dobu 2 minut a při 72°C po dobu 2 minut. Na konci reakce pak byla provedena jednorázová inkubace při 72°C po dobu 9,9 minut.

Pomocí elektroforézy v agarózovém gelu byl analyzován alikvot z PCR produktu a byla detekována DNA správné velikosti (přibližně 1000 bp) . Vzorky obsahovaly převážně DNA správné velikosti. Zbytek produktu z reakční směsi byl purifikován obdobným způsobem jako v Referenčním příkladu

7. Izolovaná DNA byla štěpena restrikčními enzymy Ncol a • 9 · 4 ·♦ VB *4 · · 4 ·· B ·

B 4 9 # 9 B · 4 4 B

4 · 4»44

494 4« ··«· 4»44

EcoRI a pásy obsahující DNA o správné velikosti (přibližně lOOObp) byly purifikovány podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

Dvouvláknová DNA plazmidu pICI266 připravená podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7, byla štěpena restrikčními enzymy Ncol a EcoRI s důrazem na to, aby bylo zajištěno kompletní rozštěpení. DNA správné velikosti (přibližně 5600 bp) byla purifikována obdobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

Byla zkontrolována čistota alikvotů obou restrikčne štěpených a purifikovaných vzorků DNA a jajich koncentrace odhadnut .a^pomocí—elek-t-ro-í.©-ré-z-y—v—-aga-rovém~geůu~~a~srovnáni se známými standardy. Na základě těchto odhadů byly podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7 připraveny ligační směsi pro klonování genu HCPB do plazmidu pICI266.

Po ligační reakci byla směs DNA použita k transformaci E. coli kmene DH5a, kolonie byly odebrány a testovány hybridizací podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

Tři klony pak byly použity k přípravě plazmidové DNA a byly sekvenovány v oblasti PCR produktu podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. Klony byly sekvenovány pomocí devíti samostatných oligonukleotidových primerů označených 1281, 677, 1504, 679, 1802, 1592, 1282, 1731 a 1592 (Podle Sekvence id. č.: 55, 52, 62, 51, 63, 61, 53, 62a 70) . Na základě výsledků sekvenování byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu pro fúzní mutantní protein D253R-HCPB. Tento plazmid byl pojmenován pICI1746.

Ověřená sekvence klonovaného genu pro fúzní mutantní protein D253R-HCPB v plazmidu pICI1746, s vyznačenou translací aminokyselin od počátku sekvence PelB k restrikčnímu místu EcoRI je označena jako Sekvence id. č.:

to ··	a·	• to	··	·«
to· to 4	v ·	4 ·	• ·	to	•
• 4	• ·	•	• ·		·«
• 4	• 4 4	• 4	• 4 ·	•
• 4	• 4	«	•	«	•
*44 ·♦*·	• 4	to···	··		··

s číslováním DNA, které začíná od 1 na prvním kodónu PelB a číslováním peptidu., které začíná od 1 v genu pro maturovaný protein HCPB.

S cílem dosáhnout kontrolované exprese D253R-HCPB byla pICI1746 plazmidové DNA transformována do kompetentních expresivních kmenů E. coli, Transformace byla provedena podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.K testování exprese klonovaného genu pro fuzní mutantní protein D253R-HCPB byly všechny expresivní · kmeny transformované plazmidem pICI1746 zpracovány podobnými způsobem jako v Referenčním příkladu 7. Opět byla ve Western blotu použita monoklonální protilátka 9E10 specifická pro peptidovou značku C-myc, nebof fúzní protein D253R-HCPB má C-terminalní (His)6-c-myc značku podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Exprese klonovaného značeného proteinu D253R-HCPB z plazmidu pICI266 (pIC11746) v bakteriích E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný velký obsah proteinu o velikosti přibližně 35,000 Daltonů na rozdíl od klonů obsahujících pouze samotný vektor (pICI266) či klonů produkujících značený HCPB (Referenční příklad 15) . Protein stejné velikosti byl detekován i pomocí Western blotu, který detekoval c-myc peptidovou značku. Purifikace byla provedena obdobným způsobem jako v Příkladu 3.

Příklad 3: Purifikace mutantních proteinů D253K HCPB- (His) _e-c-Myc z kultury E. coli

Nejprve bude popsán 20 litrový fermentační proces pro produkci analogu karboxypeptidázy B D253K v buněčné kultuře E. coli. E. coli K12 kmene MSD1924 byly transformovány plazmidem pZenl713 (pICI 1713: viz příklad 1 výše) a i » A A A A A AA • A A A A A A AAA A

A · AAA A A

AAAAAAA ♦ · AA·· A· ··

-100výsledný kmen MSD2230 (MSD1924 pZen 1713) byl uskladněn v mrazicí směsi s glycerolem při teplotě -80°C.

Buňky kmene MSD 2230 byly rozetřeny na agarové plotny obsahující 10 ^g/ml L-tetracyklinu tak, aby mohly být druhého dne odebrány jednotlivé kolonie. Bakterie byly pěstovány při inkubační teplotě 37°C. Šest jednotlivých kolonií kmene MSD2230 byly odebráno ž kultivační plotny s tetracyklinem a resuspendováno v 10 ml vývaru s 10 gg/ml L-tetracyklinu. 100μ1 této kultury bylo okamžitě naočkováno šest 250 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 75 ml živného bujónu s 10 μg/ml L-tetracyklinu. Po inkubaci trvající 15 až 16 hodin na třepačce při 300 otáčkách v -ná-nu-bě-—byů.-y—obsahy—všech^ban^k^-shromážděny a pouzí ty k naočkování 15 litrového fermentoru obsahujícího médium podle obrázku 6 (U30D, B. Braun, Melsungen, SRN).

Vlastní fermentace probíhala při teplotě 37°C za pH 6,7.pH bylo auomaticky kontrolováno přídavkem 6M hydroxidu sodného nebo 2M kyseliny sírové. Tlak rozpuštěného kyslíku byl nastaven na- hodnotu 50% nasycení vzduchem a byl udržován regulací otáček míchadla mezi 200 až 1000 min'¹. Průtok vzduchu fermentorem byl udržován na hodnotě 20 standardních litrů v minutě což odpovídá 1,3 násobku obsahu nádoby za minutu automatickým regulátorem průtoku vzduchu firmy Tylan.

4,5 hodiny po naočkování začaly být bakterie ve fermentoru živeny přídavkem kvasničného extraktu (225 g. I'¹) přičemž rychlost přidávání činila 190 až 210 ml. h'¹. Tato výživa byla do fermentoru přidávána po 28,5 hodin. 1,5 hodiny začátky přidávání extraktu bylo sníženo nastavení inkubační teploty fermentoru na 25°C. Když bylo této teploty asi po hodině dosaženo, začala indukce exprese analogu karboxypeptidázy D253K jednorázovým přídavkem 50% arabinózy do výsledné koncentrace 0,5% ve fermentační nádobě. Jednu až dvě hodiny po této indukci až · do konce • · · 9 · ·· • 9 · ··· < · 9 9 9 · ··

9 * ♦* ·· «··· ·· ··

-101fermentace byla do fermentoru přidávána směs glycerolu (714 g. I'¹) a síranu amonného (143 g. I'¹) rychlostí 45 až 55 ml za hodinu. Kultura byla sklizena asi 75 hodin po inokulaci a jendolitrové alikvoty kultury byly převedeny do centrifugačních kyvet o objemu 11,

Vyčerpané médium bylo odděleno od bakteriálních buněk centrifugací v centrifuze Sorvall RC-3B při 7,000 x G za teploty 4°C. Centrifugace probíhala 30 minut. Centrifugací bakteriální kultury za těchto podmínek lze typicky získat zhruba 20 g sušiny na litr média.

Buněčná hmota byla purifikována ' následujícím j:pú.sobem,.„B.uněoná_hmo-ta—obsa-huj-í-GÍ—rekombinantni— coTi~s rekombinantním enzymem, D253K HCPB byla vyjmuta z mrazáku, kde byla skladována při teplotě -70°C a nechala se rozmrazit. Navážením byla stanovena hmotnost buněk na 309 gramů. Buňky byly poté resuspendovány přídavkem pufru A (obsahuje 200mM Tris (hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid (Tris-HCl), 20% sacharózu, pH 8,0) za vzniku

320 ml konečné buněčné suspenze. Suspenze byla poté inkubována 20 minut za pokojové teploty za občasného jemného míchání. Poté byl za pokojové teploty přidán stejný objem destilované vody a důkladně promíchán se suspenzí. Buněčná suspenze se pak opět 20 minut inkubuje za pokojové teploty a občasného jemného míchání.

Osmoticky narušené buňky se poté zcentrifugují při 98000 x g (90 minut) a při teplotě 4°C. Po skončení centrifugace byl supernatant dekantací oddělen od peletovaných nerozpustných zbytků buněk. Objem čirého supernatantu činil 240 ml. 24 mg deoxyribonukleázy 1 se rozpustí v 5 ml destilované vody, přidá se' k supernatantu a reakční směs se 30 minut inkubuje za pokojové teploty a za stálého třepání tak, aby viskozita směsi poklesla natolik, že může být nanesena na sepharózóvou afinitní kolonu s inihibitorem karboxypeptidázy (CNBr aktivovaná sepharóza).

-102Kolona se aktivovanou inhibitorem

CNBr připraví podle instrukcí dodaných s Sepharózou™ 4B od firmy Pharmacia karboxypeptidázy z bramborových (c-0279,Sigma). Suprenatant byl naředěn 1: 1 pufrem mM Tris-HCl, 500mM chlorid sodný, pH 8,0). pH supernatantu bylo upraveno na pH 8,0 a poté byl nanesen na kolonu předvrstvenou pufrem B o teplotě 4°C. Pak byla kolona přes noc promývána elučním pufrem (lOOmM uhličitan sodný, SOOmM chlorid sodný, pH 11,4) o teplotě 4°C a při průtoku elučního pufru 0,5 ml/min· dokud absorbance průchozího pufru nepoklesla zpět na hodnotu před neňesením vzorku. Eluované lml frakce byly zmraženy na -20°C a poté byly pomocí We.s.ter n_b 1 ot u—s—m-y-š-í—monok-lon-á-in-í—p r o ťiftá ťkou”9E I0~přo Ci~ c-myc identifikovány ty, které obsahují rekombinantní. karboxypeptidázu. Jako konjugátu bylo použito koňské-anti-myší protilátky s křenovou peroxidázou (a-9044, Sigma), který poskytuje barevnou reakci po přídavku

4-chloro-naftolu a peroxidu vodíku. Frakce 11 až 44 obsahující rekombinantní karboxypeptidázu B byly spojeny, jejich pH nastaveno na 7,5 a poté zakoncentrovány pomocí, centrifugační kolonky Millipore Ultrafree™ 20 (s prahem' propustnosti 10 kDa). Poté byly rychle zamraženy na -20°C a za této teploty skladovány. Purifikací bylo získáno 4,7 mg mutované karboxypeptidázy D253K o 80% čistotě v objemu 0,95 ml.

/ íť • · * ♦ · · · · · ♦ · • 4 «· · · 4 · · · ·♦ • 4 ··· · ♦·

44« 444« 4· 4444 ··*·

-103Příklad 4: Syntéza neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od aspartát fenol mustard sloučeniny (sloučenina 5a, obrázek 7) (2S) ,

2-(3-(4-[bis-(2-chlorethyl) -amino)fenoxykarbonyl}-propionyl-amino)-jantarová kyselina

K sytéze jsou použity podobné způsoby jako v Referenčním příkladu 4. Dibenzyl ester' (2S), 2-(3- (4- [bis(2-chlorethyl)- amino) -fenoxykarbonyl)-propionylamino) jantarové kyseliny (sloučenina 4a) se 2 hodiny hydrogenuje při tlaku 0,551 MPa (80 psi) za vzniku požadovaného konečného produktu, sloučeniny 5a. Výtěžek činí 86 %.

Vlastnosti sloučeniny 5a: ¹HNMR (CD3OD) : 2,65 až 2,75 (t, (m, 4H); 3,8 až 3,85 2H) ,- 7,0 až 7,1 (m,

2H) ; 2,8 až 2,9 (m, 4H); 3,7 až 3,75 (m, 4H) ; 4,75 (t, 1H) ; 6,7 až 6,8 (m,

2H) .

MS (ESI): 471 až 473 (MNa)+

Anal. :	(C18H22N2O7C12 1,4 H20)
Vypočteno:	%C: 45,56 H: 5,27	N
Nalezeno:	%C: 4S. 79 H: 5,60-	N

5.90

5.91

Výchozí materiál t. j. sloučenina 4a se připraví následujícím způsobem.

Dibenzyl ester (2S), 2-amino-jantarové kyseliny (sloučenina 2a) se nechá reagovat za vzniku dibenzyl esteru (2S), 2-(3karboxypropionyl- amino)-jantarové kyseliny (sloučeniny 3a) po rekrystalizaci z diethyl etheru/hexanu. Výtěžek činí 80%

Sloučenina 3a: 1HNMR (CDC1₃) : 2,42 až 2,66 (m, 2H) : 2,6 až 2,75 (m, 2H) ; 2,85 (dd, 2H) ; 3,1 (dd, 1H) ; 4,9 (dd, 1H) ; 5,05 (dd, 2H) ; 5,15 (s, 2H) ; 6,7 (d, 1 H) ; 7,25 až 7,5 (m, 10H) .

-104-

MS (ESI):	436 [MNa] +
Anal.:	(C33H23N07 O.	4H;	ř0) ;
Vypočteno:	: %C: 62,82	H:	5,70	N: 3,33
Nalezeno:	%C: 63,2	H:	5,75	N: 2,9

Reakcí sloučeniny 3a vznikl požadovaný výchozí sloučenina 4a s výtěžkem 78 %, míchána za pokojové purifikována mžikovou diethyl etheru/hexanu činidla.

materiál teploty (flash) (70/30

La 3 hodiny

4a. byla za použití > elučního

Sloučenina 4a; 1HNMR (CDC1J ; 2,55 až 2,65 (m, 2H) ; 2,8 až 2,9 (m, 2H); 2,9 (dd, IH); 3,1 (dd, IH); 3,6 (dd, 4H); 3,7 (dd, 4H) ; 4,9. (dd, IH) ; 5,05 (dd, 2H) ; 5,15 (s, 2H) ; 6,58 (d, IH); 6,65 (d, 2H); 6,95 (d, 2H); 7,25 až 7,4 (m, 10H).

MS (ESI): 651 až 653 (MNa)+

Příklad 5: Syntéza neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od glutamát fenol-mustard (sloučenina 5b; obrázek 27) (2S), 2-(3-(4-[bis-(2-chlornethyl)-amino)- fenoxykarbonyl}

-propionyl -amino-pentandiová kyselina

K syntéze byly použity analogické způsoby jako v Referenčním příkladu 4. Dibenzyl ester (2S), 2-(3- (4-(bis(2-chlorethyl)- amino)- fenoxykarbonyl}propionylamino)-pentandiové kyseliny (sloučenina 4b) se 3 hodiny hydrogenuje za tlaku 0,4134 MPa (60 psi) přičemž vzniká požadovaný konečný produkt sloučenina 5b s výtěžkem 93 %.

-105Sloučenina 5b: 1HNMR (CD₃0D) : 1,9 až 2,0 (m, IH) ; 2,1 až

2,2 (m, IH); 2,35 až 2,45 (m, 2H); 2,55 až 2,7 (m, 2H); 2,8 až 2,9 (m, 2H) ; 3,65 až 3,7 (m, 4H) ; 3,72 až 3,8 (m, 4H) ;

4,4 až 4,5 (m, 1 H); 6,75 (d, 2H); 6,95 (d, 2H).

MS (ESI): 485 až 487 (MNa)+

Výchozí materiál, t. j. sloučenina 4b, se připraví následujícím způsobem.

Dibenzyl ester (2S), 2-amino-pentandiové kyseliny (sloučenina 2b) se nechala reagovat za vzniku dibenzyl esteru (2S), 2-(3- karboxypropionylamino)-pentandiové kyseliny (sloučeniny 3b) s kvantitativním výtěžkem.

Sloučenina 3b: 1 HNMR (CDCIJ : 2,0 až 2,1 (m, IH) ; 2 2 až

2.3 (m, IH) ; 2,3 až 2,5 (m, 4H) ; 2,6 až 2,7 (m, 2H) ; 4,65 (dd, 1 H); 5,05 (s, 2H); 5,15 (s, 2H); 6,5 (d, 1 H); 7,3 až

7.4 (m, 10 H) .

MS (ESI): 450 [MNa]+

Reakcí sloučeniny 3b vzniká požadovaný výchozí materiál sloučenina 4b s 82% výtěžkem.

Sloučenina 4b: 1HNMR (CDCIJ : 1,95 až 2,05 (m, IH) ; 2,2 až

2,3. (m, IH) ; 2,3 až 2,5 (m, 2H) ; 2,6 (dt, 2H) ; 2,8 až 3,0 (m, 2H) ; 3,6 (dd, 4H) ; 3,7 (dd, 4H) ; 4,7 (dd, IH) ; 5,1 (s, 2H) ; 5,2 (s, 2H) ; 6,3 (d, 1 H) ; 6,6 (d, 2H) ; 6,95 (d, 2H) ;

7,3 až 7,4 (m, 10 H) .

MS (ESI): 665 až 667 (MNa)+

-106··

Příklad 6: Stanovení aktivity mutované lidské CPB a nativní lidské CPB proti analogům neaktivních prekurzorů účinné látky Hipp-Asp a Hipp-Glu.

Purifikované mutantní lidské karboxypeptidázy B (CPB, D253K a D253R: viz příklady 1 až 3) a nativní lidské CPB připravené podle Referenčního příkladu 12, byly testovány na svoji schopnost konverze hippuryl-L-asparagové kyseliny (Hipp-Asp, viz Referenční příklad 2) , hippuryl-L-glutamové kyseliny (Hipp-Glu, viz Referenční příklad 1) nebo hippuryl-L-argininu (Sigma Chemical Company - Kat. č. H6625) na hippurovou kyselinu. Schopnost konverze byla testována pomocí HPLC.

250 μΐ reakční směsi obsahovalo 4 ^g lidské CPB (nativní nebo mutantní) a 0,5 mM Hipp-Asp nebo Hipp-Glu v 0,025 M Tris-HCl, pH 7,5. Vzorky byly 5 hodin inkubovány při teplotě 37°C. Reakce byla ukončena přídavkem 250 μΐ 80 % methanolu, 20 % destilované vody, 0,2 % trifluorooctové kyseliny. Množství vzniklé kyseliny hippurové bylo stanoveno pomocí HPLC.

HPLC analýza byla provedena pomocí HPLC systémuHewlett Packard 1090 Series 11 (s diodovým polem). Vzorky po 50 μΐ byly nastříknuty na kolonu Hichrom Hi-RPB (25 cm) a rozděleny pomocí mobilní fáze sestávající z 40% methanolu, 60% destilované vody a 0,1 % trifluorooctové kyseliny při průtokové rychlosti 1 ml/min. Množství produktu (hippurové kyseliny) vzniklé enzymatickou reakcí bylo stanoveno podle kalibračních křivek získaných ze známých množství kyseliny hippurové (Sigma-H6375). Výsledky jsou vyjádřeny jako procento konverze substrátu na produkt za 5 hodin při teplotě 37°C a s 4 ^g enzymu, viz tabulka 1.

-107-

*		4 4	44	4 4	• 4
• 4 a	4 · 4	• 4 • 4	4 4 4	4 4 • 4	9 4 4 4
• 9	«44 4 4 · ·	• 4 4 • 444	4 4 4 4 4 4	• 4 9 9 44

Tabulka 1; Konverze substrátů Hipp-Asp a Hipp-Glu mutantní a nativní lidskou karboxypeptidázou B (CPB)

Hipp-Asp Hipp-Glu Hipp-Arg % převedené na kyselinu hippurovo

nativní CPB	0	0	100
mutantní CPB D253K	78	91	<2
mutantní CPBD253R	72	52	3

Z uvedených dat vyplývá, že vložení lysinového nebo argininového zbytku na pozici 253 v lidské_CP.B_místo^zby-t-k-ukyseliny asparagové v nativním enzymu mění substrátovou specifitu enzymu tak, že je schopen konverze Hipp-Asp nebo Hipp-Glu. Naproti tomu nativní enzym není schopen konvertovat žádnou z těchto sloučenin na kyselinu hippurovou, ale konvertuje Hipp-Arg na hippurovou kyselinu. Nejvyšší aktivitu vykazoval mutant D253K se substrátem Hipp-Glu.

Příklad 7; Stanovení Km a kcat mutantních enzymů HCPB se substráty Hipp-Asp a Hipp-Glu

Purifikované mutatní proteiny HCPB D253K [Q54R, D145A,

D253KJHCPB, [G251N, D253K1HCPB a [G251T, D253K]HCPB byly připraveny tak, jak bylo popsáno v Příkladu 3, v Referenčním příkladu 12, Příkladu 12, 27 respektive 28.

Tyto zmutované enzymy byly testovány na svoji schopnost konverze Hipp-Asp (viz Referenční příklad 2) a/nebo Hipp-Glu (viz. Referenční příklad 1) a byly určeny hodnoty jejich Km a kcat platné pro tyto substráty. Hipp-Glu a Hipp-Asp byly naředěny v rozsahu 0,25 až 8,0 mM respektive • ·

-1080,25 až 5,0 mM v 0,025 M Tris-HCl pufru o pH 7,5. V případe potřeby bylo pH vzorku nastaveno na pH 7,5 pomocí 1M NaOH.

Pak byly k těmto vzorkům přidány mutované enzymy 4 gg/ml HCPB D253K pro substrát Hipp-Asp a 0,5 Mg/ml pro Hipp-Glu, 1,5 /ig/ml enzymu (Q54R, D145A, D253KJHCPB pro substrát Hipp-Glu, 0,14 ^g/ml enzymu [G251N, D253K]HCPB pro substrát Hipp-Glu a 0,02 ^g/ml enzymu [G251T, D253K] HCPB pro substrát Hipp-Glu, do celkového objemu 500 μΐ. Vzorky byly poté 5 hodin inkubovány při teplotě 37°C. Reakce byly ukončeny přídavkem 500 μΐ 80% methanolu s 0,2% triflorooctovou kyselinou. Množství hippurové kyseliny vzniklé reakcí bylo kvantifikováno pomocí HPLC, viz Příklad 6··.

Hodnoty konstant Km a Vmax byly spočítány za použití programu ENZFITTER™ (Biosoft, Perkin Elmer). Konstanta kcat byla spočítána z konstanty Vmax vydělením koncentrací enzymu v reakční směsi (molekulová hmotnost HCPB je 34 kDa). Výsledky viz tabulky 2a a 2b.

Tabulka 2a: Hodnoty Km a kcat pro konverzi Hipp-Asp a

Hipp-Glu mutantní HCPB D253K

	Km(mM)	kcat (s'1)	kcat/Km (rriMCsŇ
Hipp-Asp	2,7	2,26	2,1
Hipp-Glu.	5,3	3,8	2,7
Tabulka 2b:	Hodnoty	Km a kcat pro	konverzi Hipp-Glu

mutantními HCPB

Mutant	Km(mM)	kcat (s'1)	kcat/Km (mM-1. s*1)
(Q54R,	D145A,	10,6	15	1,4
D253K]
[G251N,	D253K]	2,3	24	10
[G251T,	D253K]	1,1	75	68

-109Údaje potvrzují, že nahrazením zbytku kyseliny asparagové lysinovým zbytkem na pozici 253 v lidské CPB vedou ke vzniku enzymu, schopného konvertovat jak Hipp-Asp tak i Hipp-Glu na hippurovou kyselina s rozumnou enzymovou kinetikou. Poměr konstant kcat/Km je přibližně 7-krát vyšší se substrátem Hipp-Glu než se Hipp-Asp.

Vložení dalších mutací zvyšuje aktivitu mutantní D253K HCPB na substrátu Hipp-Glu až stonásobně.

Příklad 8: Stanovení aktivity mutované HCPB a nativní

HCPB proti neaktivnímu prekurzoru účinné látky odvozenému od kyseliny glutamové

Purifikovaná HCPB D253K a nativní lidská karboxypeptidáza B připravená podle Příkladu 3 respektive Referenčního příkladu 12 byly testovány na svoji schopnost enzymaticky odštěpit kyselinu glutamovou od neaktivního prekurzoru účinné látky založeného na kyselině glutamové (viz Příklad

5) . Štěpením se uvolňuje meziprodukt (viz Referenční příklad 5), který se sám, neenzymaticky rozkládá za uvolnění aktivní fenol-mustard účinné látky. Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od kyseliny glutamové na tento meziprodukt byla měřena pomocí HPLC.

Neaktivní prekurzor účinné látky byl naředěn v rozsahu 0,25 až 5,0 mM v pufru 0,025 M Tris-HCl o pH 7,5. V případě potřeby bylo pH vzorku upraveno na 7,5 přídavkem 1M NaOH. Mutantní HCPB D253K nebo nativní HCPB byly přidány do výsledné koncentrace 0,25 mg/ml. Vzorky byly ještě před přídavkem enzymu předehřátý na teplotu 37°C. Celkový reakční objem činil 250 μΐ. Vzorky byly 4 minuty inkubovány při teplotě 37°C. Reakce byla ukončena přídavkem 250 μΐ ·· ·Φ >9 ΦΦ «φ φ · Φ Φ Φ * Φ

Φ φ · Φ Φ Φ ··

Φ ΦΦ Φ Φ Φ Φ 4 Φ Φ

Φ Φ « φ Φ Φ

ΦΙΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ 4Φ

-11098,8% MeCN, 0,2% TFA a vzorky dány na led. Množství vzniklého meziproduktu bylo stanoveno pomocí HPLC.

HPLC byla provedena tak, jak bylo popsáno v Příkladu 6 kromě toho, že jako mobilní fáze bylo použito směsi MeCN/destilovaná voda (55 ku 45 objemově) s přídavkem 0,1 % TFA. Tento eluční roztok umožní separaci neaktivního prekurzoru účinné látky (retenční čas 4,9 minuty) a meziproduktu (retenční čas 8,4 minuty). Množství vzniklého meziproduktu bylo stanoveno pomocí kalibračních křivek získaných ze známých množství meziproduktu.

Množství vzniklého meziproduktu vzniklého z 5,0 mM a 0,2 mM roztoku neaktivního—prekur-zo-ru—ú-č-i-n-n-é—:1-á-t-k-v— č-i-nnosti~ nativní a mutované formy HCPB (D253K] v opakovaných vzorcích ukazuje tabulka 3.

Tabulka 3: Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky na meziprodukt činností nativní a mutované formy HCPB [D253K]

	Koncentrace	intermediátu
Koncentrace neaktivního	Nativní HCPB	Mutantní HCPB
prekurzoru účinné látky (mM)
5,0	0,0	0,023; 0,022
0,25	0,0	0,005; 0,005

Hodnoty Km, Vmax a kcat pro lidský mutovaný enzym (D253K] a příslušný neaktivní prekurzor účinné látky se spočítá z množství meziproduktu vzniklého z. různých koncetrací substrátu (0,25 až 3,0 mM) pomocí programu ENZFITTER™ viz Příklad 7.Výsledky pro mutantní formu HCPB D253K-.

Km = 1,25 mM

Vmax = 1,17 x 10‘⁴mM. sec'¹ kcat = 0,016 sec’¹

4'

-111-

44 4»	• 4 ··	44
4 4 4	4 4	4	4
• 4 4	• 4 4	4«
4 4 4 4	4 44 ·	4	4
4 4 4	4 ·	4	•
	444« ··	44

Údaje potvrzují, že nahrazením zbytku kyseliny asparagové lysinovým zbytkem na pozici 253 v lidské CPB vedou ke změně substrátové specifity za vzniku enzymu, schopného konvertovat neaktivní prekurzor účinné látky odvozený od kyseliny glutamové na samovolně se rozkládající meziprodukt. Naproti tomu nativní forma enzymu není schopna této konverze. Vzehledem k tomu, že neaktivní prekurzor účinné látky má relativně nízkou cytotoxicitu (viz Příklad

9) a meziprodukt se neenzymaticky rozkládá za uvolnění volné fenol-mustard účinné látky, která zabíjí tumorové buňky, (viz Příklad 9), ukazují výsledky, že mutace v aktivním místě CPB může dát vzniknout mutantní formě -l-ids-kého—enzymuT^krerá je schopná~~konverze relativně málo cytotoxického prekurzoru účinné látky na účinnou cytotoxickou látku schopnou usmrtit tumorové buňky.

Příklad 9: Cytotoxicita neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od kyseliny glutamové a účinné látky fenol-mustard v lidských buňkách LoVo z kolorektálního nádoru.

Různá cytotoxicita neaktivního prekurzoru účinné látky odvozeného od kyseliny glutamové (Příklad 5) a odpovídající účinné látky fenol mustard (Obrázek 7, Sloučenina 6) pro nádorové buňky byla dokázána následujícím způsobem.

Nádorové buňky LoVo z kolorektálního tumoru byly 1 hodinu inkubovány s prekurzorem účinné látky nebo s účinnou látkou o různých konečných koncentracích v rozmezí 5 x 10‘⁴ až 5 x 10'^a M v 96-jamkových mikrotitračních deskách (2,500 buněk na jamku) při teplotě 37°C. Poté byly buňky promyty a další 3 dny inkubovány při teplotě 37°C. Poté byly jamky promytím zbaveny mrtvých buněk a do jamek byla přidána TCA. Množství buněčných proteinů adherujících ke· stěnám jamky bylo stanoveno pomocí barvivá SRB tak, jak bylo popsáno v

-112publikaci P. Skehan a další J. Nati. Cancer Inst. 82, strana 1107 (1990). Účinost jednotlivých sloučenin byla vyjádřena koncentrací nutnou k inhibici buněčného růstu o 50% (IC₅₀) .

Z pokusu s Lo Vo buňkami ošetřenými přímo účinnou látkou fenol-mustard vyplynula IC₅₀ této účinné látky přibližně 1 μΜ. Naproti tomu neaktivní prekurzor účinné látky založený na glutamové kyselině byl mnohem méně cytotoxický (TC_S0 byla přibližně 50μΜ) , viz obrázek 5. Z toho vyplývá, že neaktivní prekurzor účinné látky s glutamovou kyselinou je přibližně 50-krát méně cytotoxický pro nádorové buňky než vlastní účinná látka fenol-mustard.

Když se přidá 100 μg mutantní HCPB D253K připravené podle Příkladu 3 do testovacích jamek obsahujících neaktivní prekurzor účinné látky s glutamovou kyselinou, lze pozorovat cytotoxicitu srovnatelnou s aktivní účinnou látkou. To dokazuje konverzi neaktivního prekurzoru účinné látky mutovaným enzymem za vzniku mnohem silnější látky účinné. Přitom přídavek 100 gg nativní lidské CPB do každé jamky nijak významně cytotoxicitu neaktivního prekurzoru účinné látky nezvýší. Tyto pokusy dokazují schopnost zmutované lidské karboxypeptidázy B D253K selektivně konvertovat poměrně neaktivní prekurzor účinné látky na silnou, cytotoxický účinnou látku schopnou usmrtit nádorové buňky.

Příklad 10: Příprava fúzního proteinu: humanizovaný fragment A5B7 F(ab')2-D253K HCPB

Opakuje se postup popsaný v Referenčním příkladu 13, ale místo sekvencí pro myší lehký řetězec A5B7 a Fd se použijí sekvence pro humanizovaný fragment A5B7 a místo sekvence pro HCPB se použije sekvence pro HCPB D253K. 8 aminokyselin

-113dlouhý peptidový linker popisovaný v Referečním pčíkladu 13 f) se nahradí ekvivalentní lidskou sekvencí, APPVAGPS (Sekvence id. č.: 66). Fúzní protein je poté exprimován buňkami COS po kotransfekci sekvencí pro prepro-HCPB tak, jak bylo popsáno v Referenčním příkladu 13.

Výsledný produkt byl purifikován buď průchodem supernatantu obsahujícího fúzní protein přes imobilizovaný protein A a elucí vázaného fúzního proteinu pufrem s vysokým pH nebo průchodem supernatantu obsahujícího fúzní protein přes imobilizovaný inhibitor karboxypeptidázy a dalším pokračováním purifikace rekombinantní karboxypeptidázy podle Příkladu 3. Oba způsoby mohou 'zahrnovat daLši purífíkaci fúzního proteinu Buď gelovou permeační chromatografií, chromatografií na iontoměniči nebo hydrofóbní chromatografií nebo jejich kombinací.

Dále se opakuje postup popsaný v Referenčním příkladu 13, ale myší sekvence Fd a lehký řetězec podle Sekvencí id. č.: 20 a 22 jsou nahrazeny humanizovanými sekvencemi podle Sekvencí id. č.: 24 respektive 26. Sekvence pro nativní. HCPB z Referenčního příkladu 13 je nahrazena sekvencí pro¹ karboxypeptidázu D253K (viz příklad 1, ale bez (His)_s-c-Myc značky). Templát pro PCR z Referenčního příkladu 13 (pICI1698) je nahrazen plazmidem pICI1713 (viz příklad 1).

Humanizované sekvence podle Sekvencí id. č.: 28 a 29 mohou být připraveny mnoha způsoby, včetně způsobů popsaných v publikacích Edwards (1987) Am. Biotech. Lab. 5, strana 38 až -44. Jayaraman a další (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, strana 4084 až 4088, Foguet a Lubben (1992) Biotechniques 13, strana 674 až 675 a Pierce (1994) Biotechniques 16, strana 708.

-114Příklad 11: Příprava mutačního enzymu D253K HCPB fermentací v třepané nádobě

E. coli kmene MSD 213 se transformují plazmidem pICI 1713 (viz Příklad 1) a výsledný kmen MSD 213 pZen 1713 se uskladní v glycerolu za teploty -80°C. Alikvot buněk kmene MSD 213 pZen 1713 se rozetře na agarové plotny s L- tetracyklinem tak, aby se druhého dne po inkubaci při teplotě 37°C mohly odebrat jednotlivé kolonie. Jediná kolonie MSD 213 pZen 1713 byla odebrána z této plotny a použita k naočkování 250ml Erlenmeyerovy baňky obsahující 75ml vývaru s L-tetracyklinem. Po inkubaci trvající 16h při teplotě. 37°C na třepačce byl použit obsah baňky pro naočkování devíti 21 Erlenmeyerových baněk obsahujících 600ml vývaru s L-tetracyklinem do OD_5SQ=0,1. Tyto baňky se poté na třepačce inkubují při teplotě 2 0°C dokud OD₅₅₀ nedosáhne hodnoty 0,5. V tomto okamžiku se indukuje produkce heterologního proteinu přídavkem L-arabinózy do kultivačního média do výsledné koncentrace 0,01% w/v a v inkubaci se pokračuje při teplotě 20°C tak, jak bylo popsáno výše po dalších 4 2 hodin. Vyčerpané médium se' oddělí od bakteriálních buněk centrifugací na centrifuze Sorvall RC-3B (7000 x G, 4°C, 30 minut) a buněčná hmota se uskladní pří -70°C.

Příklad 12: Klonování a exprese mutantního proteinu [G251N, D253R] HCPB-(His)_s-c-Myc v buňkách E.

coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [G251N, D253RJHCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [G251N, D253RJHCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl- místo plazmidu pICI1712 použit již jednou

-115mutovaný gen D253K HCBP z plazmidu pICI1764 (viz Příklad 2) . V tomto případě byla cílenou mutagenezí změněna sekvence genu z kodónu na pozici 251 kódujícího aminokyselinu glycin (G) na kodón kódující asparagin (N) (z GGC na AAC). Tato mutace je označována jako G251N.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a 1038 (Sekvence id. č.: 68 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. Č.: 41) a 1043 (Sekvence id. č.: 69 místo Sekvence id. č.: 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1764. '

Primery 1038 a 1043 (Sekvence id. č.: 68 a 69) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly okolo aminokyseliny 251 a: zavedly do sekvence DNA změnu kodónu GGC na AAC a aby daly vzniknout komplementárním sekvencím na koncích obou PCR produktů.

Potvrzená sekvence klonovaného genu pro fúzní.' mutantní protein [G251N, D253R]HCPB v plazmidu pMC12.5.4 s vyznačením translace aminokyselin, od počátku sekvence PelB až po cílové místo pro restrikční enzym EcoRI je podobná Sekvenci id. č.: 63, kde číslování DNA začíná 1 v prvním kodónu PelB a číslování peptidu začíná 1 v maturovaném proteinu HCPB z jedinou výjimkou, kterou je záměna aminokyseliny 251 na asparagin (Asn) a rovněž změna odpovídajícího kodónu na AAC.

S cílem dosáhnout kontrolované exprese [G251N, D253R1HCPB byla DNA plazmidu pMC12.5.4 transformována do expresivních E. coli kmene SD213, obdobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. K testování exprese klonovaného genu pro fúzní mutantní protein [G251N, D253R]HCPB byly všechny expresivní kmeny transformované plazmidem pMC12.5.4 zpracovány podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

9»

-116* ·· «

9· •9

9* 99 9· ·· * « * 9 9999 * « · · · ·· * « 9 9 9*999 • · * · · · *9 ··*« «4*9

V tomto případě byla ve Westernové analýze použita monoklonálni protilátka 9E10 specifická pro C-myc značenou část peptidu, nebof protein [G251N, D253R] HCPB má C-terminalní (His)₆-c-myc značku podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Exprese klonovaného značeného fúzního mutantního proteinu [G251N, D253R]HCPB v plazmidu pICI266 (pMC12.5.4) v E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný velký obsah proteinu o velikosti přibližně 35,000 Daltonů na rozdíl od klonů obsahujících pouze vektor (pICI266) či klonů produkujících značený HCPB Jviz Referenční příklad 7) . Proteiny stejné velikosti byly detekovány i pomocí Western blotu, který detekoval c-myc peptidovou značku.

Příklad 13.- Klonování a exprese mutantního proteinu [G251N, D253K] HCPB-(His) ₅-c-Myc v buňkách E..

coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [G251N, D253K] HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [G251N, D253KJHCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již jednou mutovaný gen D253K HCBP z plazmidu pICI1713 (viz Příklad 1). V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu na pozici 251 z kodónu kódujícího aminokyselinu glycin (G) na kodón kódující asparagin (N) (z GGC na AAC). Tato mutace je označována jako G251N.

Podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8 byly připraveny dvě reakční směsi pro PCR. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a 2261

-117(Sekvence id. č. : 70 místo Sekvence id. č.: 61) . V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 41) a 2260 (Sekvence id. č.: 71 místo Sekvence id. č.: 62).

V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1713.

Primery 2261 a 2260 (Sekvence id. č.: 70 a 71) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly okolo aminokyseliny 251 a zavedly do sekvence DNA změnu kodónu GGC na AAC a aby daly vzniknout komplementárním sekvencím na koncích obou PCR produktů.

Potvrzená sekvence klonovaného genu pro fúzní mut-a-n tn-í~—pr ot e-i-n— [ G-2-5-1-N-7— D-2-5-3-K-]-H GP-B—v—p-l-a-z m-i-du—pMG 4-3—1— svyznačením translace aminokyselin, od počátku sekvence PelB až po cílové místo pro restrikční enzym EcoRI je podobná Sekvenci id. č.: 59,kde číslování DNA začíná 1 v prvním¹ kodónu PelB a číslování peptidu začíná 1 v maturovaném proteinu HCPB z jedinou výjimkou, kterou je záměna aminokyseliny 251 na asparagin (Asn) a rovněž změna, odpovídajícího kodónu na AAC.

S cílem dosáhnout kontrolované exprese [G251N, D253KJHCPB byla DNA plazmidu pMC43.1 transformována do expresivního kmene E. coli MSD213, obdobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. K testování exprese klonovaného genu pro fúzní mutantní protein [G251N, D253K]HCPB byly všechny expresivní kmeny transformované plazmidem pMC43.1 zpracovány podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7.

V tomto případě byla ve Westernové analýze použita monoklonální protilátka 9E10 specifická pro C-myc značenou část peptidu, nebof protein [G251N, D253K] HCPB má

C-terminalní (His)_s-c-myc značku podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Exprese klonovaného značeného fúzního mutantního proteinu [G251N, D253K1HCPB v plazmidu pICI266 (pMC43.1) v

-118··

E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný velký obsah proteinu o velikosti přibližně 35,000 Daltonú na rozdíl od klonů obsahujících pouze vektor (pICI266) či klonů produkujících značený HCPB (viz Referenční příklad 7) . Proteiny stejné velikosti byly detekovány i pomocí Western blotu, který detekoval c-myc peptidovou značku.

Příklad 14: Klonování a exprese mutantního proteinu [G251T, D253K]HCPB-(His)_s-c-Myc v buňkách E.

.co 1 i . ______________________

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [G251T, D253K] HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu, popsáném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [G251T, D253KJHCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již jednou;, mutovaný gen D253K HCBP z plazmidu pICI1713 (viz Přiklaď 1) . V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna·, sekvence genu na .pozici 251 z kodónu kódujícího aminokyselinu glycin (G) na kodón kódující threonin(T) (z GGC na ACT). Tato mutace je označována jako G251T. Podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8 byly připraveny dvě reakční směsi pro PCR. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č..· 48) a 1038 (Sekvence id. č.; 68 místo Sekvence id. č.: -61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 41) a 2659 (Sekvence id. č.: 72 místo Sekvence id. č.: 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1713.

Primery 1038 a 2659 (Sekvence id. č.: 68 a 72) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly okolo aminokyseliny 251 a zavedly do sekvence DNA změnu kodónu GGC na ACT a aby daly

-119-

• ·· 99	9 *	99	• 9
•	9 9	9 9	9	9	9 9
•	• · ·	9 9 9	99	•	9	9
•	• 9	9 9 99 9 *	9«	9	• 99	•

vzniknout komplementárním sekvencím na koncích obou PCR produktů.

Potvrzená sekvence klonovaného genu pro fúzní mutantní protein [G251T, D253KJHCPB v plazmidu pMC46.4.1 s vyznačením translace aminokyselin, od počátku sekvence PelB až po cílové místo pro restrikční enzym EcoRI je velmi podobná Sekvenci id. č.: 59,kde číslování DNA začíná 1 v prvním kodónu PelB a číslování peptidů začíná 1 v maturovaném proteinu HCPB z jedinou výjimkou, kterou je záměna aminokyseliny 251 na asparagin (Asn) a rovněž změna odpovídajícího kodónu na ACT.

——S—c-í-l-em—dos-á-hnou-t——kon-t-ro-lov-a-né-—-e-xprese—[-0-2-5-1-14D253K1HCPB byla DNA plazmidu pMC46.4.1 transformována do exp resívního^-Kmene^-El όοΚΓΈεϋΖΙ^·; 0'b‘ďo'bným^-způ'so’b’em^—j'a’ko^—v’ Referenčním . příkladu 7. K testování exprese klonovaného genu pro fúzní mutantní protein [G251T, D253KJHCPB byly všechny expresivní kmeny transformované plazmidem pMC46.4.1 zpracovány podobným způsobem jako v Referenčním příkladu 7. V tomto případě byla ve Westernové analýze použita monoklonální protilátka 9E10 specifická pro C-myc značenou, část peptidů, neboť protein [G251T, D253K] HCPB má

C-terminalní (His)_s-c-myc značku podobně jako v Referenčním příkladu 7.

Exprese klonovaného značeného fúzního mutantního proteinu [G251T, D253K]HCPB v plazmidu pICI266 (pMC46.4.1) v E. coli byla prokázána pomocí gelů obarvených v Coomassie blue, z nichž byl patrný velký obsah proteinu o velikosti přibližně 35,000 Daltonů na rozdíl od klonů obsahujících pouze vektor (pICI266) či klonů produkujících značený HCPB (viz Referenční příklad 7) . Proteiny stejné velikosti byly detekovány i pomocí Western blotu, který detekoval c-myc peptidovou značku.

·· ·· ·· * ·· · • · · · · • · ·· ·4· ··♦ ···

-120Příklad 15: Klonování a exprese mutantního proteinu [G251N, D253K, T266G]HCPB-(His)₆-c-Mycv buňkách E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [G251N, D253K, T266G] HCPB v bakteriích E. coli byl opět velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Způsobem popsaným v Příkladu 2 byl připraven gen pro mutantní formu proteinu [G251N, D253K, T266G]HCPB pouze s tím rozdílem, že jako templát .pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICIL712 použit již podvakráte mutovaný gen [G251N, D253K]HCBP z plazmidu pMC43.1 (viz Příklad 13). V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu na pozici 266 z kodónu kódujícího aminokyselinu threonin (T) '__________na kodón kódující glycin (T) (z ACC na GGC) . Tato mutace je:

označována jako T266G. Podobným způsobem jako v

Referenčních příkladech 7 a 8 byly připraveny dvě reakční, směsi pro PCR. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a 1045 (Sekvence id. č.: 73 místo

Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery

6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 41) a 55 (Sekvence id. č.;.

místo Sekvence id. č.: 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pMC43.1.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [G251N, D253K, T266G]HCPB.

Tento klon byl nazván pMC47.1.

Příklad 16: Exprese dalších mutantních proteinů HCPB v buňkách E. coli

Podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8 a v

Příkladech 12, 13, 14 a 15 byla připravena celá řada

II 49 ·· 44 99

-1214 4 44 4 4 ···

4*4 4 4 4 ·4 · 44

44«444

4444 49 449« 94·· mutantních forem HCPB. V jednotlivých případech byly výše uvedenými způsoby navrženy oligonukleotidy zavádějící specifické změny do sekvence genu. V něj kterých případech byly po sekvenování mutovaného genu identifikovány dodatečné mutace, které byly pravděpodobně zavedeny v průběhu PCR amplifikace. Byly identifikovány mutantní formy s enzymatickou aktivitou k analogům substrátu (viz Příklad 18 níže), příklady jsou uvedeny v Tabulce 4 níže. Enzymatická aktivita je vztažena ke známé aktivitě enzymu z plazmidu pICI1713 (D253K HCPB) nebo z plazmidu pICI1746 (D253R HCPB) v bakteriích E.coli kmene MSD213 po uvolnění cytoplazmatických proteinů osmotickým šokem. Tento materiál •je~dáie—uváděn—j-ako—buněčný-—lyz-át~— způsobený—osmo tickým šokem nebo jen buněčný lyzát a byl připraven následujícím způsobem.

1. Jediná kolonie byla použita pro naočkování 75 ml L-bujón živného média obsahujícího 10 Mg/ml tetracyklinu a arabinózu, tak aby její výsledná koncentrace činila 0,01 %

(w/v). Kultivační nádoba	byla inkubována	při	20°C	za.
stálého třepání při (250	ot.min'1) po dobu	přibližně	60.
hodin.
2. Buňky byly poté sklizeny	centrifugací při 4	°C.
3. Buněčná peleta byla	resuspendována v	3 00	Ml	20%

L-sacharózy (w/v) obsahující lmM EDTA v 200mM Tris-HCl, pH7,5 a 15 minut inkubována za pokojové teploty.

4. Buněčný lyzát byl vytvořen přídavkem 450 μ1 destilované vody a další 15 minutovou inkubací za pokojové teploty.

5. Buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací a supernatant byl testován na svoji enzymatickou aktivitu. Test enzymatické aktivity byl proveden co nejdříve po přípravě buněčného lyžátu, který byl před testem inkubován při 4°C.

44 44 44 44 44 «44 4 4 44 4 4 44 4

444 44··4

4 44 4 4 4 4 4 4 4 4

4« 44« 444

-122-

Tabulka 4: aktivita vzhledem k D253K HCPB nebo D253R HCPB v surovém buněčném lyzátu z bakterií E.coli

Mutace	Hipp-Glu	Hipp-Asp	Hipp-Arg
[Q54R,D145A,D253K]	a	a
[I245S, D253K]	a	a
[I245A, D253K]	a	a
[I245H, D253K]	a	NAD
[A248H,D253K]	a	NAD
C288S			c
C288A			d
[G251K, D253R]	a	NAD
[I201S, D253K1	NAD	b .
[G251Q,D253K]	a	NAD
[G251S, D253K]	e	a
[G251V, D253K]	a	NAD
[A248N,G251S,D253K]	a	a
[A248S,G251S,D253K]	a	NAD
[1201T,D253R]	b	b

Legenda k tabulce :

a = aktivita ekvivalentní D253K HCPB b = aktivita ekvivalentní D253R HCPB

c - aktivita dosahující Referenční příklad 7 a 8)	75	%	maturovaného	HCPB	(viz
d = aktivita dosahující	25	%	maturovaného	HCPB	(viz

Referenční příklad 7 a 8) e = >10-násobná aktivita D253K HCPB

NAD žádná aktivita nebyla detekována

-123Příklad 17: Stanovení aktivity mutovaných lidských CPB proti analogům neaktivních prekurzoru účinné látky Hipp-Glu, Hipp-Asp a Hipp-Glu.

Tento příklad popisuje testování mutantních forem popsaných v Příkladu 6.

Purifikované mutantní formy lidské karboxypeptidázy B (D253K; [G251K,D253R]; [G251N,D253R]; [I201S,D253K];

[G251N,D253K] ; [Q54R,D145A,D253K] ; [G251T,D253K] ;

[G251S,D253K]; [Α24ΘΝ,G251N,D253K]; [A248S,G251N,D253K] a [S205N,G251N,D253K] - popsané v Příkladech 3, 12, 13, 16,

28, 3 0,31, 32 a 33) byly testovány na svou schopnost konverze hippuryl-L-glutamové kyseliny (Hipp-Glu Referenční příklad 1) , hippuryl-L-asparagové kyseliny ,_(Hipp-rAsp - Referenční příklad_2.)___a__h.ip.puryl^Lj^arginin.u. ..

(Sigma Chemical Company - kat. č. H6625) na kyselinu, hippurovou. Schopnost konverze byla testována pomocí HPLC.

500 μΐ reakční směsi obsahovalo 0,01 až 12,5 μ$ lidské mutantní CPB (v závislosti na typu mutace) a 0,5mM'. Hipp-Asp nebo Hipp-Glu nebo Hipp-Arg v 0,025M Tris-HCl, pH' 7,5. Vzorky byly 30 minut inkubovány při teplotě 37°C.. Reakce byla ukončena přídavkem 500 μΐ 40% methanolu a 60% destilované vody, 0,2% trifluorooctové kyseliny. Množství vzniklé kyseliny hippurové bylo stanoveno pomocí HPLC, obdobně jako v Příkladu 6 s tím rozdílem, že jako mobilní fáze bylo použito 20% methanolu, 80% 50mM fosfátového pufru, pH 6,5. Kyselina hippurová byla detekována absorbancí při 230 nm. Výsledky jsou vyjádřeny v Tabulce 5 jako procento konverze substrátu na produkt za 30 minut při teplotě 37°C.

«· ·· ·· ·· ··

-124-

• 9 *	•	• ·	• ·
• A * «	♦ «		• ·
V · ·	•	A	• ·
	• »··	··	♦ ♦

Tabulka 5: konverze Hipp-Glu, mutantních forem lidské CPB	Hipp-Asp nebo Hipp-Arg pomocí
Mutant	Koncentrace	Hipp-Glu	Hipp-Asp	Hipp-Arg
	^g/ml)		% konverze
D253K	25	79	22	0
	2,5	14,6	2,9	0
[G251K,D253R]	25	5,5	0,2	0
	2,5	3,2	0,2	0
[G251N,D253R]	25	57	9,4	0
	2,5	8,8	1,4	0
[I201S,D253K]	25	27,8	33,1	0
	2,5	4,6	5,8	0
[G251N, D253K]	25	100	8,3	1,8
~[G2 5 IR7D1’4’5A7~D2 53ΚΓ~	2,5	62,4	1,9	0,4
25	90	'30	0
	2,5	26	5,2	0
ΓβΟβίτ D°53K1	2^	10n	14	.ς 9
	0,02	8,2	0	0
(G251S,D253K]	25	100	2,8	0,8
	0,25	14,5	0	0
[A248N, G251N, D253K]	25	100	2,5	•1,4
	0,25	25,3	0,6	0
[A248S,G251N,D253K]	25	86	1,3	0
	0,5	10,7	0	0
[S205N,G251N,D253K]	25	85	0,48	0,2
	0,5	7,9	0	0

Z dat vyplývá, že všech 11 mutantu je schopno štěpit substráty Hipp-Asp a Hipp-Glu zatímco jejich aktivita vzhledem k substrátu Hipp-Arg, který je vhodný pro nativní enzym (Příklad 6), je minimální nebo žádná. Nejvyšší aktivitu vykazovaly mutanti [G251T,D253K] se substrátem Hipp-Glu a [I201S,D253K] se substrátem Hipp-Asp.

Příklad 18: Stanovení aktivity mutantní lidské [G251T,D253K]HCPB a dalších HCPB mutantu

Aktivita mutantní lidské [G251T,D253K]HCPB byla měřena za stejných podmínek a uspořádání jako v Příkladu 17 pouze s

-125-

9 ti	99	9«	9 9	• 9
• 99 ·	9 9	• 9	9 9 9	9
9 9	9 9	9	• 9	9 9
9 4 9.	9 «	9	9 9 99 9	9
• 9	9 9	9	9 9	9
···»9*9	99	9 999	99	99

tím rozdílem, že místo purifikovaného enzymu bylo použito 50 μΐ buněčného lyzátu způsobeného osmotickým šokem a to buď v neředěné formě nebo po naředění 1:10 či 1:100. Vzorky byly 24 hodin inkubovány při teplotě 3 7°C. Pro srovnání byla prováděna paralelní reakce s D253K HCPB v redukovaném objemu 250 μΐ s obsahem 125 μΐ neředěného buněčného lyzátu D253K. Rovněž při testování dalších HCPB mutantů byl reakční objem 250 μΐ, ze kterých 125 μΐ činil právě neředěný nebo 1:50 ředěný buněčný lyzát obsahující testovaný enzym. Vzorky buněčných lyzátu byly připraveny podle Příklad 16. Množství kyseliny hippurové vzniklé během 24 hodin bylo · stanoveno pomocí HPLC, obdobně jako v . Pří k la du„ 1.7_.—_Vý s.le dky.....j. s o.u—uvede n^—v_T abu lce—6— a_g.s o u.

vyjádřeny jako procento konverze substrátu na produkt za 24 hod-i-n—p-ř-i—t e pio t-ě—3-7-°CH— ------—----------— ——------Tabulka 6: Konverze Hipp-Glu, Hipp-Asp a Hipp-Arg pomocí

mutantní lidské [G251T,D253K] HCPB	HCPB a dalších	mutantních
Mutant	Koncentrace buněčného	Hipp-Glu Hipp-Asp	Hipp-Arg
	lyzátu		% konver:	ze
D253K	50,0	7,4	2,0	0
[G251T,D253K]	10	100	2,6	0,8
	1	93	0	0,1
	0,1	60	-	-
[G251N, D253K,T266G]	50	0,95	3,4	-
[G251S,D253K]	50	93,8	1,6	-
	1	5	-
[A248N,G251T,D253K]	50	95	1	-
	1	53,5	-
[A248S,G251T,D253K]	50	91,3	0,5	-
	1	20	-
[G251T,D253R]	50	65,4	14,6	-
[A248N,G251N,D253K]	50	63,9	0	-
[A248S,G251N,D253K]	50	46,1	1	-
[S205N,G251N,D253K]	50	14,1	0

·« 44 44 44 • 4 * Λ · · ·

4 4 4 4*

4 4 44*4 4 • ·4 * 4 4 • 4 ···· ·· ·»

-126-

Z dat	vyplývá,	že mutantní	forma	[G251T,D253K]	HCPB
je nejméně	50-krát	aktivnější	v konverzi Hipp-Glu	na
kyselinu hippurovou	než mutant	D253K.	Dále je mutant
[G251T,D253K]	HCPB	přibližně	900-krát	aktivněj ší	při
konverzi substrátu Hipp-Glu než při konverzi Hipp-Arg,	což
je substrát	vhodný	pro nativní	formu	enzymu HCPB,	viz
Příklad 6.

Příklad 19: Cytotoxicita neaktivního prekurzoru účinné látky podle Příkladu 21 a odpovídající účinné látky v nádorových buňkách LoVo

-Různá—cy to toxřc i ta—ne ak tú vnfho—p r ekur zořu—úč inné—Látky podle Příkladu 21 a odpovídající účinné látky podle' Příkladu 22 pro lidské kolorektální. nádorové buňky LoVo byla dokázána způsobem popsaným v Příkladu 9.

Nádorové buňky LoVo z kolorektálního tumoru byly inkubovány s prekurzorem účinné· látky nebo s účinnou látkou' přičemž byla ve třech nezávislých experimentech stanovena·. IC50 neaktivního prekurzoru. účinné látky 905μΜ zatímco IC50 účinné látky činila 84μΜ. Reprezentativní studie je znázorněna na Obrázku 15. Neaktivní prekurzor účinné látky je tedy pro kolorektální nádorové buňky LoVo 10-krát méně cytotoxický než vlastní účinná látka, což plně opodstatňuje její využití spolu s vhodnou mutantní HCPB podle vynálezu.

V případech, kdy byla k jamkám s LoVo buňkami přidána mutantní D253K HCPB, připravená podle Příkladu 3 a neaktivní prekurzor účinné látky podle Příkladu 21, bylo možno naměřit zvýšenou cytotoxicitu.

Po přídavku mezi 2,4 a 11,75 μ9/τη1 mutantní D253K HCPB k neaktivnímu prekurzoru účinné látky (500μΜ) byla naměřena toxicita srovnatelná s 200μΜ koncentrací aktivní

-127-

•	44	«4	44	• 4	4«
♦ * '	• ·	•	•	· 4	• 4	•	•
•	4	4	4	•	• ·	4 4
•	•	• *		4 4	• 4 ·	•	•
•	•	•	•	•	•	4	•
		4·		4444	4 4	4 4

účinné látky podle Příkladu 22 (Obrázek 16) . Tato studie dále demonstrovala potenciál mutantních lidských karboxypeptidáz B pro selektivní konverzi relativně netoxického neaktivního prekurzoru účinné látky na silnou, cytotoxicky účinnou látku, schopnou zabíjet nádorové buňky.

Příklad 20: Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky podle Příkladu 24 pomocí mutantního enzymu D253K HCPB a dalších mutantú

Schopnost purifikované mutantní formy enzymu D253K HCPB Xv.iz_ P ř.í k 1 ad_ 3-)__ konver. z-t o vat—ne a-kt-i-v-n-í—p-r eku-r-zer—úči-nnélátky podle Příkladu 24 na účinnou látku podle Příkladu 25 -by-l-a— de mons-t-r o vána— násTe du j-fc tm^-z působě rrn------------500 μΐ reakční směsi obsahující 7,5 μς D253K HCPB, 0,5mM neaktivní prekurzor účinné látky v 0,025M pufru Tris-HCl, pH 7,5 bylo 5 minut inkubováno při teplotě 37°C. Reakce byla zastavena přídavkem 500 μΐ MeCN a 0,2% trifluorooctové kyseliny. Množství vzniklé účinné látky bylo poté kvantitativně určeno pomocí HPLC.

Vlastní HPLC separace byla provedena, podle Příkladu 6 s tim rozdílem, že jako pohyblivé fáze bylo použito 70% MeCN, 30 % destilované vody a 0,1% kyseliny trifluorooctové. Tato mobilní fáze je vhodná pro optimální separaci neaktivního prekurzoru účinné látky (retenční čas

3,8 minuty) a účinné látky (retenční čas 4,9 minuty). Sloučeniny byly detekovány při vlnové délce 260nm. Množství vzniklé účinné látky bylo kvantitativně stanoveno z kalibrační křivky sestrojené pomocí známých množství účinné látky.

μρ/ml mutantní D253K HCPB bylo při teplotě 37°C během 5 minut schopno hydrolyzovat 70% neaktivního

-128-

* ··	·«	··	4*
• 9 * 4	a a	• 9	* ·	• *
• *	* ·	«	• ·	··
• 9	• » 9	•	• ···	* ♦
9 ·	a ·	a	•	• ·
*9· *··*	··	····		··

prekurzoru účinné látky na vlastní účinnou látku (koncentrace účinné látky na konci reakce byla 0,352mM).

Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky na účinnou látku pomocí . dalších mutantních forem HCPB za stejných podmínek jsou uvedeny v Tabulce 7. Množství použitých enzymů [Q54R,D145A,D253K]HCPB a [G251T,D253K]HCPB v reakční směsi bylo redukováno na 0,75 μg.

Tabulka 7: Konverze neaktivního prekurzoru účinné látky podle Příkladu 24 pomocí mutantních forem HCPB

Mutant Koncentrace hydrolýza neaktivního ; (pg/ml) prekurzoru úcinné~íátky (%

D253K 15 70,4

D253R	15	18,3
[G251K,D253R]	15	16,2
[G251N,D253R]	15	66,7
[I201S,D253K]	15	72,6
[G251N,D253K]	15	75,9
[Q54R,D145A,D253K]	1,5	26,0
[G251T, D253K]	1,5	36,0

Z dat vyplývá, že mutantní formy HCPB jsou schopny konvertovat neaktivní prekurzor účinné látky na vlastní účinnou látku, což je další důkaz, že aktivitu, kteřou tyto enzymy vykazují proti modelovým substrátům Hipp-Glu a Hipp-Asp je možno interpolovat i na prekurzory účinných látek odvozené od bis(2-chlorethyl)]aminu (mustard).

• · •

-129Příklad 21: Příprava N-[N-(4-(4-[bis -(2-chlorethyl)amino] -3-methyl-fenoxy] -benzoyl)-L-alanin] -L-glutamové kyseliny (reakční schéma viz

Obrázek 17)

K roztoku 130 mg dibenzyl esteru N-(N-(4-{4[bis- (2-chloroethyl)-amino] -3-methyl-fenoxy]

-benzoyl)-L-alanine-L-glutamové kyseliny (sloučenina 8) v 5 ml ethylacetátu bylo přidáno 30% katalyzátoru Pd/C (50% vlhkost; 25 mg) . Směs byla 1 hodinu důkladně promíchávána pod vodíkovou atmosférou. Katalyzátor byl odstraněn filtrací přes CELÍTE a filtrát byl do sucha odpařen za vzniku titulní sloučeniny (sloučenina 11) va formě oleje, výtěžek Činil 88 mg (88% výtěžnost).

._NMR_DMS.O.d_s_7_,_9_až_6.,.6_(.m.,.—7.H.)_;—4-,-8-5-(-m---1-H-)-,4-,-6-(-m-,—1-H-)-;ť

3,4 (m, 8H) ; 2,25 (s, 3H) ; 2,4 až 1,9 (m, 4H) ; 1,45 (d,

3H) ;

MS ESI, 566 [Μ -H]

Výchozí materiál, sloučenina 8, byla připravena následujícím způsobem.

13,8 g (0,1 molu) kyseliny 4-hydroxybenzoové bylo rozpuštěno v methanolu a k tomuto roztoku bylo přidáno 10,8 g (0,2 molu) methoxidu sodného. Roztok byl poté do sucha odpařen. K výsledné pevné látce bylo přidáno 500 ml DMF a poté 10,2 ml (0,1 molu) 4- fluoro- 2- methyl- 1nitrobenzenu (dodává Aldrich pod názvem

5-fluoro-2-nitro-toluen). Tato směs byla 2 hodiny zahřívána na teplotu 125°C, poté byla zchlazena a nalita do 3 1 vody, okyselena na pH 2 přídavkem 2M HC1 a dvakrát extrahována ethylacetátem. Spojené organické fáze byly promyty vodou, vysušeny a odpařeny do sucha . Výsledná pevná látka byla rozetřena v éteru za vzniku 4-(3-methyl- 4- nitro-fenoxy)-

-130-

•	4« ··	*9	•
•	9 9	9 9	•	9
•	• 9 9	• 9 9	9 9	9 9
9	• *	♦ 9		9 9
		• ·· 4	• 4

benzoové kyselina (sloučenina 1) ve formě bílé pevné látky. Výtěžek činil 6,1 g (22%, teplota tání = 187 až 190°C).

K roztoku 34 g isobutylenu ve 100 ml dichloromethanu bylo přidáno 5 g sloučeniny 1 za teploty 5°C a poté 0,5 ml koncentrované kyseliny sírové. Směs byla, za pokojové teploty 2 dny míchána a poté nalita do 200 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Vodná fáze byla extrahovaná dichloromethanem a spojené organické extrakty byly vysušeny a odpařeny za vzniku oleje. Olej chromatograficky čištěn pomocí 5% ethylacetátu v hexanu za vzniku 2,5 g tert-butyl esteru 4- (3- methyl- 4nitro-fenoxy)- benzoové kyseliny (sloučenina 2). Výtěžek činil 42%; teplota tání produktu = 81 až 83°C).

' K roztoku 2τΐ’5 g^J (5 mMj sÍOtrčenŤny 2 ve ^3’5 ml· ethylacetátu bylo přidáno 400 mg 30% katalyzátoru Pd/C (za 50% vlhkosti) . Směs byla 2 hodiny důkladně promíchávána pod vodíkovou atmosférou. Katalyzátor byl' odstraněn filtrací přes CELÍTE a filtrát byl odpařen za vzniku 1,9 g terc-butyl esteru 4-(4-amino-3-methyl-fenoxy)-benzoové kyseliny (sloučenina 3) ve formě pevné látky. Výtěžek činil 99 %. Teplota tání sloučeniny byla 84 až 86°C.

K roztoku 2 g sloučeniny 3 ve 30 ml směsi kyselina octová/voda 1:1 bylo přidáno 5 g ethylenoxidu . Směs byla dva dny inkubována v klidu za pokojové teploty a poté btyla nalita do 200 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a dvakrát extrahována ethylacetátem. Spojené organické extrakty byly promyty vodou, vysušeny a odpařeny za vzniku 2,5 g (99% výtěžek) terc-butyl esteru 4- [4[bis(2- hydroxyethyl)- amino]- 3- methyl- fenoxy)- benzoové kyseliny (sloučenina 4) ve formě oleje.

NMR CDClj8,0 (d, 2H) ; 7,3 až 6,9 (m, 7H) ; 3,6 (t, 4H) ; 3,2 (t, 4H); 2,3 (s, 3H); 1,5 (s, 9H).

β ·

-131• * ··

Κ roztoku 2,5 g sloučeniny 4 v 90 ml směsi acetonitril/tetrachlormathan 1:1 bylo přidáno 1,7 g imidazolu a 6,6 g trifenylfosfenu. Směs byla 3 hodiny důkladně promíchávána a poté byla do sucha odpařena. Zbytek byl rozdělen mezi 1M roztok kyseliny citrónové a ethylacetát. Organická fáze byla promyta vodou, vysušena a do sucha odpařena. Zbytek byl chromatograficky přečištěn v systému hexan/ethylacetát (9:1) za vzniku 1,2 g (44% výtěžek) terc-butyl esteru 4-{4-[bis(2 -chlorethyl)- amino] -3-methyl-fenoxy)-benzoové kyseliny (sloučenina 5) ve formě oleje.

,NMR_CP.C.1.₃—7-,.9.5-(-ČL,—2 7-,-2-až—6-,-9-(m-,—7H)-,·—3-,-4—(.m-,—8H-)_; .

2,3 (s, 3H); 1,6 (s, 9H).

R^žeoJc^šloučěrriňy 5 v 5 ml^-“ďicfiloromethanu a TO ml“ ' ^— kyseliny trifluorooctové byl 2 hodiny míchán za pokojové teploty. Směs byla odpařena, do sucha a dvakrát extrahována ethylacetátem za vzniku 1,0 g (73% výtěžek) 4-(4-[bis (2-chlorethyl) -amino) -3-methyl-fenoxy) -benzoové kyseliny (sloučeniny 6) ve formě pevného trifluoroacetátu s teplotou tání 91 až 93°C.

K roztoku 250 mg (0,5 mM) dibenzyl esteru N-Boc-L-alanin-L-glutamové kyseliny (Beilharz a další, 1983, 36, strana 751 až 758) (sloučenina 7) ve 2 ml dichloromethanu byly přidány 4 ml kyseliny trifluorooctové. Roztok se nechal 1 hodinu stát za pokojové teploty a poté byl do sucha odpařen. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt s nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen a odpařen za vzniku oleje (sloučenina 7 s odstraněnou skupinou BOC) . Tento olej ve 2 ml DMF byl přidán k 255 mg sloučeniny 6 ve 3 ml DMF. K této směsi bylo přidáno 70 mg hydroxybenzotriazolu, 115 mg hydrochloridu 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (DECI) a 0,18 ml triethylaminu. Směs byla 1 hodinu míchána za pokojové teploty a pak nalita do 100 ml nasyceného roztoku

-132-

• 4 4		• 4	4 4	44			44
♦ 4 ·	4	•	4 4	•	4	•		•
• 4	•	4	4	•	4		• 4
• 4	• 4	4 4	•	4 4 ·	•	4		4
• 4	4	4		4	4		4
P4 · 4 · 4 4		44	»44·	44			44

hydrogenuhličitanu sodného a 100 ml ethylacetátu. Organická fáze byla oddělena, promyta vodou a poté 0,5M kyselinou citrónovou, vysušena a odpařena do sucha. Zbytek byl chromatograficky rozdělen v systému ethylacetát/hexan 1:1 za vzniku 150 mg (40%) požadovaného výchozího materiálu ve formě oleje.

NMR CDC1₃ 7,8 (d, 2H); 7,4 až 6,7 (m, 7H); 5,2 (s, 2H); 5,0 (S, 2H); 4,7 (m, 2H); 3,4 (m, 8H); 2,3 (s, 3H); 2,45 až 2,0 (m, 4H); 1,4 (d, 3H).

Příklad 22: Příprava N- (4- {4- [bis- (2- chlorethyl)amino]- 3- methyl- fenoxy}- benzoyl)- Lalaninu (reakční schéma viz Obrázek 17)

400 mg terc-butyl esteru N- (4- {4- [bis- (2- chlorethyl)amino]- 3- methyl- fenoxy}- benzoyl)- L- alaninu ( sloučenina 9) bylo rozpuštěno ve 4 ml dichloromethanu a pak bylo přidáno 8 nechal 1 hodinu ml kyseliny trifluorooctové. Roztok stát za se.

sucha odpařen, ethylácetátem za sloučeniny (sloučenina 10) je úč innou účinné látky podle

Odparek vzniku teploty a poté byl do a dvakrát extrahován (52% výtěžek) titulní pokoj ové byl

0,43 g ve formě oleje., Tato sloučenina látkou odpovídající neaktivnímu prekurzoru Příkladu 21.

NMR DMSOd_s 8,5 (d,

3.,55 (t, 4H) ; 3,35

7H) ; 4,4 (m, 1H) ;

1,4 (d, 3H),

MS (M+H)*, 439

Výchozí materiál, sloučenina 9, byla připravena následujícím způsobem.

• ♦ ♦ ·· *»

-133Κ 586 mg (1 mmol) směsi 4- [4- (bis(2- chlorethyl)- amino]-

3- methyl- fenoxy)- benzoové kyseliny (sloučenina 6 podle

Příkladu 21) ve 2 ml dimethylformamidu bylo přidáno 135 mg hydroxybenzotriazolu, 230 mg hydrochloridu 1aminopropyl)-3hydrochloridu Ltriethylaminu. Směs byla míchána teplot a poté nalita do 60 hydrogenuhličitanu sodného, ethylacetátem a spojené extrakty roztokem kyseliny citrónové, vysušeny a do sucha odpařeny. Zbytek byl chromatograficky rozdělen v systému ethylkarbodiimidu, alanin-terc-butyl poté esteru ml dvakrát hodiny nasyceného za dimethyl181 mg

0,54 ml pokojové roztoku extrahována byly promyty vodou, 1M

-hex-any-ethyLaeetát~-—4-:i-—z-a-—vzniku-—0—4-—g^—(-8i%--—v-ý-běž-nost-)· požadovaného výchozího materiálu ve formě oleje.

NMR CDC13 7,8 (d, 2H); 7,3 až 6,7 (m, 7H); 4,6 (m, IH); 3,4 (m, 8H); 2,3 (s, 3H); 1,5 (d, 3H); 1,5 (s, 9H).

Příklad 23: Protinádorová aktivita neaktivních prekurzorů. účinné látky a konjugátu humanizované protilátky s mutantním fúzním proteinem HCPB v myších s heteroštěpem

Protinádorová účinnost vhodného neaktivního prekurzoru účinné látky a konjugátu humanizované protilátky s mutantním fúzním proteinem HCPB (viz Příklad 10) může být demonstrována pomocí následujícího modelu.

Kolorektální nádorové buňky LoVo (lxlO⁷, ECACC č. 87060101) byly subkutánně injikovány myším, které byly zbaveny brzlíku. Když nádory dosáhly velikosti 4 až 5 mm v průměru, byl myším intravenózně podán konjugát v dávkách, jejichž velikost se pohybovala mezi 10 a 100 mg/kg. Když se injikovaný konjugát dostal k nádorům a Zároveň uplynula

-134dostatečně dlouhá doba k tomu, aby byly ostatní tkáně a krevní řečiště očištěny od zbytkového konjugátu (1 až 4 byl myším bud intravenózně nebo intraperitoneálně podán neaktivní prekurzor účinné látky v dávce, jejíž velikost se pohybovala v rozsahu od 100 do lOOOmg/kg.

Neaktivní prekurzor účinné látky byl podán buď v jedné dávce nebo v několika následujících dávkách. Ve srovnání s kontrolními, neléčenými nádory či nádory léčenými stejnou dávkou bud samotného konjugátu nebo samotného neaktivního prekurzorů účinné látky vedly kombinace konjugátu a neaktivního prekurzorů účinné látky k podstatně pomalejšímu růstu nádorů. Tyto studie demonstrují, že konjugát humanizované—protil-á-tky— s—mu-fcan-fe-n-í-m—fůz-n-í-m—p-r-ote-i-nem—HCPB— v kombinaci s vhodným neaktivním prekurzorem účinné látky vyka-zuj-e-výraznou-protinádOrovou^-aktivitu.

Příklad 24: Příprava N- [N- (4- {4- [bis- (2- chlorethyl)amino]- fenoxy}- benzoyl)- L- alanin}- Lglutamové kyseliny

Titulní sloučenina byla připravena analogickým způsobem jako v Příkladu 21 s tím rozdílem, že místo 4- (4nitro-fenoxy)- benzoové kyseliny (Ravick a další (1933), JACS, 55, strana 1289 až 1290) byla použita 4-(3- methyl-4nitro-fenoxy)- benzoová kyselina (sloučenina 1 v Příkladu 21) .

NMR DMSOd₆, 8,4 (d, IH) ; 8,3 (d, IH) ; 7,8 (d, IH) ; 7,05 až

6,75 (m, 6H);4,5 (m, IH); 4,25 (m, IH); 3,7 (s, 8H); 2,4 až

1,6 (m, 4H); 1,4 (d, 3H).

MS ESP, 551[M-H]'

4

-135- • ·· 44 4444 **· · 4 ♦ · 4 4 4«· • · 4 4 44444 • · 4 > « 4444444 *· · · 4 4 4· ♦ •«4444 «4 4444 444«

Příklad 25: Příprava N- (4- {4- [bis- (2- chlorethyl)amino)- fenoxy}- benzoyl)- L- alaninu

Titulní sloučenina je účinnou látkou odpovídající neaktivnímu prekurzoru účinné látky podle Příkladu 24. Tato sloučenina byla připravená podobným způsobem jako v Příkladu 22 s tím rozdílem, že místo 4- {4- [bis(2chlorethyl)- amino]- fenoxy)- benzoové kyselina (intermediát v Příkladu 24) byla použita 4- (4- [bis(2chlorethyl)- amino]- 3- methyl- fenoxy)- benzoová kyselina.

NMR CDC1₃, 7,75 (d, 2H) ; 7,0 až 6,4 (m, 6H) ; 4,6 (m, 1H);

3,6 až 3,4 (m, 8H); 1,6 (d, 2H).

-MS-E-S-P—42-3-[Μ-Ή-] ~

Příklad 26: Purifikace mutantního fúzního enzymu D253R HCPB-(His)_s-cMyc z bakterií E. coli

Byl zopakován postup popsaný v Příkladu 11 s tím, že místo plazmidu pICI1713 byl použit plazmid pICI1746 (viz Příklad 2) . Místo devíti 11 Erlenmeyerových baněk používaných v Příkladu 11 bylo použito dvanáct 21 s obsahem 600ml živného media s L-tetracyklinem.

Buněčná hmota rekombinantních E.coli byla vyjmuta z mrazáku, kde byla uskladněna při -70°C a ponechána roztát. Poté byla tato hmota zvážena (82,4 g) a resuspendován v přídavku pufru (200mM Tris-HCl, pH 8,0, 20% sacharóza). Po resuspendován! činil celkový objem 130ml. Buněčná suspenze byla 20 minut inkubována za pokojové teploty s občasným mírným mícháním a poté byl přidán a důkladně smísen stejný objem destilované vody. Buněčná suspenze pak byla znovu 20 minut inkubována za pokojové teploty za občasného mírného míchání.

Výsledný surový osmoticky uvolněný obsah buněk byl zbaven hrubých zbytků buněk centrifugací při 98.000xG po • ··. ·* ·· »· ·· ··· · · ·· · 4 « * * * 44» 4 4 4 44 * · 4 4 * 4 φ ·φ 4 4 · * · 44* * φ Š ♦♦••444 φφ 4«Φ· φ* φ*

-136dobu 90 minut a při 4°C. Po centrirfugaci byl supernatant dekantací oddělen od zpeletované nerozpustné frakce. Supernatant byl naředěn 1:1 pufrem lOmM Tris-HCl, 500mM chlorid sodný, pH 8,0 (pufr B), a výsledné pH bylo nastaveno pH 8.0 při celkovém objemu SOOml. Takto upravený roztok bakteriálních proteinů byl nanesen na afinitní kolonu s inhibitorem karboxypeptidázy a nechal se protékat přes noc při průtokové rychlosti 0,5 ml/min.

Kolona byla připravená podle instrukcí výrobce na základě CNBr-aktivované Sepharózy 4B (aktivovaný 4% agarózový gel vhodný pro imobilizaci ligandů obsahujících primární aminy; Pharmacia kat. č. 17-0430-01) a inhibitoru karboxypeptidázy bramborových hlíz (c-0279, Sigma). Pro purifikaci karboxypeptidázy v tomto měřítku bylo použito 15 ml matrice umístěné v koloně Pharmacia XK 15. Pro přípravu tohoto množství afinitního nosiče bylo použito 5g' suché matrice a 80mg inhibitoru karboxypeptidázy. Afinitní nosič byl připraven následujícím způsobem:

g lyofilizované matrice bylo suspendováno v lmM HC1. Po nabobtnání byl gel promyt na skleněné fritě jedním, litrem lmM HC1, která byla přidávána po částech. 80 mg inhibitoru karboxypeptidázy bylo rozpuštěno v 25ml 0,lM roztoku hydrogenuhličitanu sodného (pH 8,3) s obsahem 0,5M NaCl (konjugační pufr). Roztok inhibitoru byl poté v dělící nálevce smísen s gelem. Směs byl 1 hodinu za pokojové teploty nebo 18 hodin ve 4°C velmi důkladně promíchávána otáčením nálevky hlavou dolů a naopak. Poté byl přebytek ligandu vymyt alespoň pětinásobkem konjugačního pufru. Aktivovaný gel byl poté převeden do pufru 0,lM Tris-HCl (pH 8,0) a ponechán 2 hodiny stát za pokojové teploty. Pak byl gel promyt nejprve alespoň pětinásobkem 0,lM acetátového pufru (pH 4,0) s obsahem 0,5M NaCl a poté alespoň pětinásobkem pufru 0,lM Tris-HCl (pH 8,0) s obsahem 0,5M NaCl.

-137-

J	• 4	44 44	4«	44
					•
4	• 4	4 *	4 4	4 4
4	» 4 4	4 · 4	4 4 4	4	♦
•	• 4	• 4	4	4	♦
		•4 4444	4*	• 4

Kolona byla předvrstvena pufrem B vychlazeným na 4°C. Po nanesení supernatantu byla kolona promývána, dokud se absorbance protékajícího elučního Činidla nevrátila k hodnotám před elucí navázaného materiálu. Eluční pufr sestával ze lOOmM uhličitanu sodného, 500mM chloridu sodného, pH 11,4. Eluční činidlo bylo- vychlazeno na 4°C a byly odebírány lml frakce. Poté co. byly odebrány malé vzorky pro stanovení obsahu rekombinantní karboxypeptidázy B byly eluované frakce zamraženy na -20°C.

Stanovení obsahu rekombinantní karboxypeptidázy B bylo prováděno pomocí Western blotu s protilátkou 9E10 proti c-myc proteinové značce, která byla detekována konjugátem anti-myší protilátky s křenovou peroxidáza (a-9044, Sigma). Po expozici s 4-chlo.ronaf.t.o.l.em.-a_peroxidem. vodíku dochází k barevné reakci. Některé polyakrylamidové gely byly rovněž nespecificky obarveny stříbrem. Frakce 20 až 66 obsahovaly rekombinantní karboxypeptidázu B. Zředěný supernatant, který vytekl z kolony během počátečního nanášení byl opětovně nanesen na kolonu. Eluční podmínky a analýza odebraných frakcí byly totožné s první elucí. Frakce 25 až 60 obsahovaly rekombinantní karboxypeptidázu B. Tyto frakce byly spojeny s frakcemi z první eluce a jejich pH bylo nastaveno na hodnotu pH 7,5. Frakce byly zakoncentrovány centrifugačních koncentrátorů Millipore Ultrafree -20 (s prahem propustnosti 10,000 Da) a poté byly rychle zamraženy a uskladněny v -80°C. Touto purifikací bylo získáno 550 μΐ 87% mutantní D253R HCPB o koncentraci

3,5 mg/ml.

··· ·· ·· t ···· **···*·« ? · v · · · 4·♦ • 4 4 4 4 4 4 4444 *9 · 4 · · *9 ·*♦···· 99 ···» «44·

-138Příklad 27: Purifikace mutantní formy enzymu [G251N, D253K] HCPB-His₆-cMyc z bakterií E. coli

Byl zopakován postup popsaný v Příkladu 26 s tím, že plazmid pICI1746 byl nahrazen plazmidem pMC43.1 (viz Příklad 13) . 94 g buněčné hmoty bylo resuspendován ve 110 ml pufru A. Objem osmoticky uvolněného obsah buněk po naředění pufrem B činil 500 ml. Osmotickým šokem rozbité buňky byly poté naneseny na kolonu s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz. V první eluci byly odebírány frakce 10 až 27. Při druhé eluci byly odebrány frakce 10 až 39. Purifikace poskytla 900 μΐ 95% mutantní formy fúzního proteinu [G251N,D253K]HCPB o koncentraci 1,24mg/ml.

Příklad 28: Purifikace mutantní formy enzymu [G251T,D253K] HCPB-His_Ě-cMyc z bakterií E. coli

Byl zopakován postup popsaný v Příkladu 26 s tím, že plazmid pICI1746 byl nahrazen plazmidem pMC46.4.1 (viz Příklad 14) . 4.6 g buněčné hmoty bylo resuspendován ve 65ml pufru A. Objem osmoticky uvolněného obsah buněk po naředění pufrem B činil 260 ml. Osmotickým šokem rozbité buňky byly poté naneseny na kolonu s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz. V první eluci byly odebírány frakce 8 až 28. Při druhé eluci byly odebrány frakce 41 až 79. Purifikace poskytla 500 μΐ 95% mutantní formy fúzního proteinu [G251T,Ď253K]HCPB o koncentraci l,24mg/ml.

-139-

9'9	··	« 9	99	99
• ♦ ·		9	• 9	9	9	9
9 *		9	9	9	9	• «9
• 9 ·		9	9	9 9 9	9	•
9 9		9	9		•	•
	• 9		9999	• ·		9 9

Příklad 29: Farmaceutické kompozice

Následující příklady ilustrují reprezentativní farmaceutické dávkovači formy vynálezu tak, jak mohou být použity pro terapeutické účely v humánní medicíně.

Roztoky vhodné pro aplikaci ve formě injekce

i) sterilní vodný roztok vhodný pro aplikaci ve formě injekce, obsahující na 1 ml roztoku;

Konjugát protilátka-enzym podle

Příkladu 10,

................... ' 1,0 mg trihydrát octanu sodného 6,8mg chlorid sodný 7,2mg

Tween 20 0,05mg

Typická dávka konjugátu je 30 mg, po kterých za 3 dny následuje neaktivní prekurzor účinné látky.

ii) pro výrobu finální dávkovači formy neaktivního prekurzoru účinné látky je třeba připravit následující: skleněné ampulky (3 x 20ml) obsahující 600 mg neaktivního prekurzoru účinné látky podle Příkladu 21; 3 ampulky obsahující 11 ml 2,15% (w/v) hydrogenuhličitanu sodného;

jehly (3xl8G); hydrofóbní filtry pro odvzdušnení ampulí a 3 jednorázové sterilní filtrů s póry 0,22 μη pro vodné roztoky.. Všechen materiál musí být uskladněn při 2 až 8°C.

Všechny následující operace jsou ve výhodném provedení vynálezu vykonávány za sterilních podmínek. Nejprve se jedna ampulka s neaktivním prekurzorem účinné látky odvzdušní jehlou a hydrofóbním filtrem. Odvzdušnění nelze provádět dříve naŽ hodinu před dávkováním. Poté se přímo přes zátku stříkačkou a jehlou přidá 10 ml sterilního 2,15% · 9 · V • 9 9 ί» · 9 4 4 > 4 4 · • 9 *9 9 » 4 ·4

9 4 9 4' 4 · 4·9 4' ♦ • 4 9 · 4 · 94 ···*··♦ «4 ···· «·4«

-140(w/v) roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Ampule se jemně zatřepe za vzniku čirého roztoku obsahujícího zhruba 50 mg/ml volné báze. Při třepání se nechá větrací otvor stále volný je vír jemně získat jasný roztok. Požadovaná dávka se poté přes sterilní filtr nasaje do sterilní stříkačky. Místo filtru se poté na stříkačku nasadí zapouzdřená sterilní jehla a celá stříkačka se před vlastní administrací uchová v chladu. Jednotlivé ampule s prekurzorem účinné látky se připraví pro administraci totožným způsobem v jednohodinových intervalech tak, aby se například mohly aplikovat tři dávky ve třech hodinách.

.P.říklad 30: Klonování a exprese mutantního proteinu [G251S,D253K] HCPB-(His)_fi-c-Myc v bakteriích E.

coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [G251S, D253K] HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsáném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [G251S,D253K]HCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již jednou mutovaný gen D253K HCBP z plazmidu pICI1713 (viz Příklad 1). V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 251 kódujícího aminokyselinu glycin (G) na kodón kódující serin (S) (z GGC na TCT). Tato mutace je označována jako G251S.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a 1038 (Sekvence id. č..· 68 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 42) a 54 (Sekvence id. č.: 75 místo Sekvence id.

-141-

• ♦♦	• 4	«9	*·	··
• ·	•	to to	• ·	• 4
• 4 4	•	• 9	• · ··	• 4
» *			•	• 4
·» · 9 * ·*	♦ ·	·♦··	• 4	• 4

č.: 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1713.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [G251S,D253K] HCPB. Tento klon byl nazván pMC49.2.

Při purifikaci rekombinantního mutantního enzymu [G251S,D253K] HCPB byl zopakován postup popsaný v Příkladu 26 s tím, že plazmid pICI1746 byl nahrazen plazmidem pMC49.2 77 g buněčné hmoty bylo resuspendováno ve 100 ml pufru A. Objem osmotičky uvolněrrého”obsah^buněk—po—naředěn-ípufrem B činil 395 ml. Osmotickým sokem rozbité buňky byly poté naneseny na kolonu s inhibitorem kařboxypepťrUďážy ž: bramborových hlíz. V první eluci byly odebírány frakce 11.. až 40. Při druhé eluci byly odebrány frakce 12 až 33. Purifikace poskytla 500 μΐ mutantni formy fúzního proteinu [G251S, D253K]HCPB o koncentraci 1,7 mg/ml a čistotě 86 %.

Příklad 31: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [A248N,G251N,D253K] HCPB-(His) _s-c-Myc v bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese · mutantního proteinu [A248N,G251N,D253K]HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [A248N,G251N,D253K]HCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již dvakrát mutovaný gen [G251N,D253K] HCBP z plazmidu pMC43.1 (viz Příklad 13). V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 248 kódujícího aminokyselinu alanin (A) na kodón kódující i

-142Φ· 9« ·· ·· · '· · · · · 9 9 9 9 · 9 * * · ··♦

9 9 * 9 0 99 • 4 · · 9 99

9999 99 ··««φ· ·» asparagin(N) (z GCT na AAC) . Tato mutace je označována jako A248N.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.t 48) a 1024 (Sekvence id. Č.; 76 místo Sekvence id. č.t 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.t 42) a 1028 (Sekvence id. č.; 7S místo Sekvence id. č. : 62) . V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidů pMC43.1.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a -ident-i-f-i-k-ací—by-l-y— obdobné—j.ako_v_Příkladu 14 . Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid š'^_požadovahOU serkvencí^-genu—[-A-2-4-8-NtG-2-5-1-N—D-2-53-K-]-HCPB—Tento:—.___________ klon byl nazván pMC50.2.

Při purifikaci rekombinantního mutantního enzymu [A248N,G251N,D253K]HCPB byl zopakován postup popsaný v Příkladu 26 s tím, že plazmid pICI1746 byl nahrazen, plazmidem pMC50.2. 83 g buněčné hmoty bylo resuspendováno ve 100 ml pufru A. Objem osmoticky uvolněného obsah buněk' po naředění pufrem B činil 560 ml. Osmotickým šokem rozbité buňky byly poté naneseny na kolonu s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz. V první eluci byly odebírány frakce 23 až 40, Při druhé eluci byly odebrány frakce 18 až 40. Purifikace poskytla 1000 μΐ mutantní formy fúzního proteinu (A248N,G251N,D253K]HCPB o koncentraci 1,0 .

mg/ml a čistotě 90 %.

• Φ· ·· *4 ΦΦ v* • Φ · · ι ·* φ * φ · Φ φ * Φ Φ Φ φ > φφ

Φ · * Φ · · φ ΦΦΦ φ ·

Φφ Φ ♦ · φφφ

-143Příklad 32: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [A248S,G251N,D253K] HCPB-(His) _É-c-Myc v bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [Α248Ξ,G251N,D253K]HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [A248S,G251N,D253K]HCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již dvakrát mutovaný gen [G251N,D253K] HCBP z plazmidu pMC43.1 (viz Příklad 13). V tomto případě byla cí.1 enou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 248 kódujícího aminokyselinu alanin (A) na kodón kódující -----------se-r-iil·— (-S-)—(-z—GCT— na_T.T.C)___Ta.t.o_mutace je označována jako.

A248S.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a

1024 (Sekvence id. č.: 76 místo Sekvence id. č.: 61) . V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence, id. č.: 42) a 1030 (Sekvence id. č.: 78 místo Sekvence id. č.: 62) . V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pMC43.1.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [A248S·, G251N, D253K] HCPB. Tento klon byl nazván pMC51.2.

Při purifikaci rekombinantního mutantního enzymu [A248S,G251N,D253K]HCPB byl zopakován postup popsaný v Příkladu 26 s tím, že plazmid pICI1746 byl nahrazen plazmidem pMC51.2. 71,5 g buněčné hmoty bylo resuspendováno ve 100 ml pufru A. Objem osmoticky uvolněného obsah buněk po naředění pufrem B činil 520 ml. Osmotickým šokem rozbité

-144-

• ··	4»	4«	44	4«
·· · ’4	» ·	• 4	4 4 4	4
• 4	• ·	4	• ·	44
• * ·	• 4	4	• 444 4	4
• 4	• 4	•	♦ 4	4
99 · »» 4 4	• 4	4 »44	• 4	4 4

buňky byly poté naneseny na kolonu. s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz. V první eluci byly odebírány frakce 10 až 40. Při druhé eluci byly odebrány frakce 10 až 32. Purifikace poskytla 1500 μΐ mutantní formy fúzního proteinu [A248S,G251N,D253R]HCPB o koncentraci 0,8 mg/ml a čistotě 80,5 %.

Příklad 33: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [S205N, G251N, D253K] HCPB-(His) _s-c-Myc v bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního prďťeTnu· [S205N,G251N,D253K]HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro' mutantní formu [S205N, G251N,D253K] HCPB byl připravenzpůsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již dvakrát mutovaný gen [G251N,D253K] HCBF z plazmidu pMC43.1 (viz Příklad 13). V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici. 205 kódujícího aminokyselinu serin (S) na kodón kódující asparagin (N) (z TCA na AAC) . Tato mutace je označována jako S205N.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a

1010 (Sekvence id. č.: 79 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č. : 42) a 1016 (Sekvence id. č.: 80 místo Sekvence id. č.: 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pMC43.1.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě

·. »4 ·· ·· 4· ·♦ »·· '» 4 4 4 · 4 4 ♦ * · 4 · · · 4 ·· ♦ 4 · 4 4 » 44· 4 4

4 4 4 ·. 4 4 4

4'4 · »*·» 44 »··» 44 4»

-145výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [S205N,G251N,D253K]HCPB. Tento klon byl nazván pMC52.1.

Při purifikaci rekombinantního mutantního enzymu [S205N,G251N,D253K]HCPB byl zopakován postup popsaný v Příkladu 26 s tím, že plazmid pICI1746 byl nahrazen plazmidem pMC52.1. 77 g buněčné hmoty bylo resuspendováno ve 100 ml pufru A, Objem osmoticky uvolněného obsah buněk po naředění pufrem B činil 420 ml. Osmotickým šokem rozbité buňky byly poté naneseny na kolonu s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz. V první eluci byly odebírány frakce 10 až 40. Při druhé eluci byly odebrány frakce 12 až 29. Purifikace poskytla 650 μΐ mutantní formy -f úzn-ího—p robe i nu [.S.2.0.5 N.,_G.2.5.1 N.D253K1HCPB o koncentraci 0,8,______ mg/ml a čistotě 85 %.

Příklad 34: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [G251T,D253R] HCPB-(His)_Ě-c-Myc v’ bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [G251T,D253R]HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsáném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [G251T,D253R]HCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2. s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již jednou mutovaný gen D253R HCBP z plazmidu pICI1746 (viz Příklad 2) . V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 251 kódujícího aminokyselinu glycin (G) na kodón kódující threonin (T) (z GGC na ACT). Tato mutace je označována jako G251T.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první

-146-

•	·*	99	99	99	99
• 9'		9 9	9 9	9 9	9	9
«	9	9	9	9	9 9		99
♦'1	• 9	9	9'	*	• ·«♦	9	9
9-	9	• 9'	9	9'	9	9
·«>	*99*	99	*999	99		99

reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a

1038 (Sekvence id. č.= 68 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 42) a 794 (Sekvence id. č.: 81 místo Sekvence id. č.i 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1746 .

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako, v Příkladu 14. .Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [G251T,D253R]HCPB. Tento klon byl nazván pMC55-2.

Příklad 35: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [I201T,D253R] HCPB-(His)_e-c-Myc v bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu [I201T,D253R]HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní.' formu [I201T,D253R]HCPB byl připraven způsobem popsaným v Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již jednou mutovaný gen D253R HCBP z plazmidu pICI1746 (viz Příklad 2) . V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 201 kódujícího aminokyselinu izoleucin (I) na kodón kódující threonin (T) (z ATC na ACT). Tato mutace je označována jako I201T.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č. : 48) a

1003 (Sekvence id. č.: 82 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 42) a 795 (Sekvence id. Č.: 83 místo Sekvence id.

-147-

• 99	»9	• 9	9*	*9
9 9 9 ·	9 «	·. 9	9 9	9	9
• *	9 9	9	9 9	• 9
• ♦ 9	9 9	9	• 999	9	9
• 9	9 9	9'	9	•	9
• 9* 9999	• 9	··>·	9·	• 9

č. : 62) . V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pICI1746.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [I201T,D253R]HCPB. Tento klon byl nazván pMC57.2.

Příklad 36: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [A248N,G251T,D253K] HCPB-(His) _s-c-Myc —————— v ba ]< ceri” í c“ h~ ET~c ο“Γ i ' '

.._____ Způsob____kl.o.nováηí____a__exprese mutantního , proteinu:

[A248N,G251T,D253K]HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [A248N,G251T,D253K]HCPB byl připraven způsobem popsaným v· Příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již dvakrát mutovaný gen [G251T,D253K] HCBP z plazmidu pMC46.4 (viz Příklad 14). V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 248 kódujícího aminokyselinu alanin (A) na kodón kódující asparagin(N) (z GCT na AAC). Tato mutace je označována jako A248N.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č. : 48) a 1024 (Sekvence id. č.: 76 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 42) a 1028 (Sekvence id. č.: 75 místo Sekvence id. č.: 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pMC46.4.

• 44 44 4444 ·4 • 4 · · 4 44 4 4 444 · 4 4 4. 4 4 44 4 · 4 4 4 4,4 4 444 4· • · · ·’ · · ·» ··· ···· ·· ····». ··

-148Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě výsledku sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid s požadovanou sekvencí genu [A248N,G251T,D253K]HCPB. Tento klon byl nazván pMC59.3.

Příklad 37: Klonování a exprese rekombinantního mutantního proteinu [A248S,G251T,D253K] HCPB-(His)_s-c-Myc v bakteriích E. coli

Způsob klonování a exprese mutantního proteinu. (A248S,G251T,D253K] HCPB v bakteriích E. coli byl velmi podobný způsobu popsaném v Referenčním příkladu 8. Gen pro mutantní formu [A248S,G251T,D253K]HCPB byl připraven způsobem popsaným v příkladu 2 s tím rozdílem, že jako templát pro PCR cílenou mutagenezi byl místo plazmidu pICI1712 použit již dvakrát mutovaný gen [G251T,D253K] HCBP z plazmidu pMC46.4 (viz Příklad 14) . V tomto případě byla cílenou mutagenezi změněna sekvence genu z kodónu na pozici 248 kódujícího aminokyselinu alanin (A) na kodón kódující serin (S) (z GCT na TTC) . Tato mutace je označována jako A248S.

Dvě reakční směsi pro PCR byly připraveny podobným způsobem jako v Referenčních příkladech 7 a 8. V první reakci byly použity primery 2264 (Sekvence id. č.: 48) a 1024 (Sekvence id. č.: 76 místo Sekvence id. č.: 61). V druhé reakci byly použity primery 6HIS9E10R1BS1 (Sekvence id. č.: 42) á 1030 (Sekvence id. č.: 78 místo Sekvence id. č. : 62). V obou reakcích bylo jako výchozí DNA použito plazmidu pMC46.4.

Metodologie při provádění PCR, klonování, expresi a identifikaci byly obdobné jako v Příkladu 14. Na základě výsledků sekvenace byl vybrán klon, který obsahoval plazmid • · · · 9' 9 9 9 • 9 · · 9 9 9 99* · 9 • * 9 9 9/ 9 9'Γ 9 *·99φ»9 «« **·* 99 *9

-149s požadovanou sekvencí genu [A248S,G251T,D253K]HCPB. Tento klon byl nazván pMC60.3.

Příklad 38; Příprava fúzního proteinu: humanizovaný fragment protilátky A5B7 F'(ab¹) ₂-[G251, D253K] HCPB

Opakuje se postup popsaný v Příkladu 10, ale místo sekvence pro D253K se použije sekvence pro [G251, D253K] HCPB . Sekvence pro rekombinantní mutantní protein [G251,D253K] HCPB je popsána v Příkladu 14.

Příklad 39: Purifikace a stanovení enzymatické aktivity, rekombinantního fúzního proteinu [A248S',G251T, D253K] HCPB- (His) _s-c-myc

Byl opakován postup popsaný v Příkladu 3 s tím rozdílem, že plazmid MSD 2230 byl nahrazen plazmidem MSD 2812 (MSD 1924 pZEN1921). Plazmid pZEN1921 je také označován jako pMC60.3. Příprava plazmidu pMC60.3 je popsána v Příkladu 37. Dva vzorky buněčné hmoty byly zpracovány odděleně. První vzorek obsahoval 593 g buněčné hmoty zatímco druhý vzorek 558 g. Buněčná hmota byla suspendována v 750 ml respektive 710 ml pufru A. Objem osmoticky uvolněného obsahu buněk činil po naředění pufrem B 3 1 pro každý ze vzorků. Tento osmotický lyzát byl postupně nanášen na dvě afinitní kolony s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz.. Při první purifikaci byly z obou kolon spojeny frakce 18 až 80 (kolona 1) a 30 až 63 (kolona 2). Při druhé purifikaci byly spojeny frakce 21 až 73 (kolona 1) a 23 až 68 (kolona 2) . Spojené frakce po purifikaci poskytly 4,4 ml roztoku [A248S,G251T,D253K]HCPB o- koncentraci 2„6 mg/ml při 83% čistotě.

• »* ·· ·· ·· ·· ·♦· · ♦ ·· · · ·· * • ··· · * · «« * ···· ·····« ·· ♦ · · ·· ······♦ ·· ···· «« *

-150Enzymatická aktivita proti substrátu Hipp-Glu,

Hipp-Asp a Hipp-Arg byla určena podle postupu uvedeného v Příkladu 17.

Koncentrace Hipp-Glu Hipp-Asp Hipp-Arg (^g/ml) (% konverze) “ — sTšθ

0,25 14,5 00

Konstanty Km a kcat k substrátu Hipp-Glu byly stanoveny způsobem popsaným v Příkladu 7.

Km (mM)1,1 kcat (s'¹)19 kca.t./-Km—(.mM—.-sil)—l-T-,-3-------------------------—------------------------------------Příklad 40:. Purifikace a stanovení enzymatické aktivity rekombinantního fúzního proteinu [G251T, D253R] HCPB-(His) _fi-c-myc

Byl opakován postup popsaný v Příkladu 3 s tím rozdílem, že plazmid MSD 2230 byl nahrazen plazmidem MSD 2803 (MSD 1924 pZEN1907) . Plazmid pZEN1907 je také označován jako pMC55.2 a jeho příprava je popsána v Příkladu 37. Dva vzorky buněčné hmoty byly zpracovány odděleně. První vzorek sestával z 660 g buněčné hmoty zatímco druhý vzorek 484 g. Buněčná hmota byla suspendována v 300 ml respektive 700 ml pufru A. Objem osmoticky uvolněného obsahu buněk činil po naředění pufrem B 1,61 1 respektive 1,41 pro druhý vzorek. Tento osmotický lyzát byl postupně nanášen na dvě afinitní kolony s inhibitorem karboxypeptidázy z bramborových hlíz. Při první purifikaci byly z obou kolon spojeny frakce 20 až 70 (kolona 1) a 20 až. 65 (kolona 2.) . Při druhé byla odebrána z obou kolon pouze jediná frakce odpovídající elučnímu píku

-151• ♦· ·» »* ♦· ·· • 44 4 4 4* · > 4· • · * 4 4 4·>

• 4 4 4 4 4 4 4444« «4 4 4 4 4 ·4

444444 »4 ·««« «444 zaznamenanému grafickým vyhodnocovacím zařízením. Spojené frakce po purifikaci poskytly 1,4 ml roztoku [G251T,D253R]HCPB o koncentraci 3,6 mg/ml při 50% čistotě.

Enzymatická aktivita proti substrátu Hipp-Glu, Hipp-Asp a Hipp-Arg byla určena postupem uvedeným v Příkladu 17.

Koncentrace (Mg/ml) '	Hipp-Glu	Hipp-Asp Hipp-Arg (% konverze)
25	96	29 0
1	16,2	1,2 0

Konstanty Km a kcat k substrátu Hipp-Glu a Hipp-Asp byly stanoveny způsobem popsaným v Příkladu 7.

	Hipp-Glu	Hipp-Asp
Km (mM)	1,6	1,7
kcat (s'1)	7,8	0,7
kcat/Km (mM-1, s’1)	4,9	0,4

·· ·· 4» ·* 44 ·· 4 4 · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4. 4 44 · · · 4 » »·· 4 4 • 4 4 · 4 4 4 «444 ·· 4··4 4 4

-152Seznam sekvencí:

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č:1

CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG C

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 108 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č:2

CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCAGTC TTGGTTCTGG

TGACTGTGGC CCTGGCATCT eo

GCTGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC AACAAGTGGG AAACGATA

109

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA:16 párů basí
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	j iná nukleová	kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č	: 3
AACAGCRATG	ACCATG			16

INFORMACE O SEKVENCI ID. C. 4:

-153-

4 4·	44	«4	• 4	4«
♦ · to · ·	to	• ·	• ·	4	4
• ··	•	«	• ·	• 4
4 4 ♦ ·	4	4	4 toto·	4	to
to· ·	4	•	4	*	4
4·· 4 4 4 4	··	*···	• 4	44

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID . Č : 4

GTAAAACGAC GGCCAGT

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:30 párů baží (Bj~~TY'P~:—nukleová— kyse-l-i-na ..........

(C) POČET VLÁKEN: jedno _______________(D) TOPOLOGIE: lineární_______ (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID . Č : 5

TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTTGGC 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 6

CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAG 23

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

-154-

• ··		··		··	99	44
·· · 4	•		4	• ·	• ·	4	4
• 4	•		•	4	• 9	«4
• *	• *		•	4	• 99·	9	4
• 4	•		•	•	9	9	4
·♦··		44		4444	99	44

(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 7

CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCACTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 8

CTCATAACTG AATTCTTATT AACGAACCCG GCTATCAAA 39

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 9

GGATCTGCTG CCCAAGCTTA CTCCATGGTG ACCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina- (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č; 10

CTTCTCATAA CTGTGŤCCTG TTGCGAACAC GCTGCTCACC TCGGGCACTG TACATATGCA

-155AGGCTTACAA CCACAATCCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 párů baží (B) TYP; nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE;, lineární (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi)

POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID . Č : 11

GGTTGTAAGC

CTTGCATATG TACAGTGCCC GAGGTGAGCA GCGTGTTCGC AACAGGACAC

AGTTATGAGA AGTACAAC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 12

CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCCTCC 27

INFORMACE O SEKVENCI ID.Č. 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 13

ATATAAAGCT TGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT 50

INFORMACE O SEKVENCI ID. C. 14:

-156·· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) (xi)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 14

ATCGAATTCG CCGCCACCAT GGATTTTCAA GTGCAGATTT TCAGCTTC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 páru baží

-......... T-V-P-:—mik-l-eová^kysel.ina , (C) POČET VLÁKEN: jedno _____________ (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č:	: 15
TGAGAATTCT	TACTATGTAC ATATGCAAGG	CTTACAACCA CAATC		45
INFORMACE 0 SEKVENCI ID.	Č. 16 :
(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 35 páru baží
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	j iná nukleová	kyselina

(xi)

POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 16

GCGCCGAATT CTTATTAACA CTCATTCCTG TTGAA

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární • ·

-157- (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 17

GACCTGGAAC TCTGGATCTC TGTCCAGCGG 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 18

AGGTGTGCAC ACCGCTGGAC AGAGATCCAG 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 19

TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 777 párů baží (8) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

-158- (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:16 až 765 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 20

AAGCTTGCCG CCACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA ACA 51

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr

5 10 .

CTT TTA AAT GGT ATC Leu Leu Asn Gly Ile 15 GGC TTG GTA CAG CCT Gly Leu Val Gin Pro 30

CAG TGT GAG GTG AAG

CTG GTG GAG TCT GGA GGA

99 147

Gin Cys Glu Val 20 GGG GGT TCT CTG Gly Gly Ser Leu 35

Lys AGA Arg

Leu Val Glu 25 CTC TCC TGT Leu Ser Cys

Ser Gly Gly GCA ACT TCT Ala Thr Ser

40

~CGC' Arg

GGG TTC Gly Phe 45

ACC TTC ACT Thr Phe Thr

GAT Asp 50

TAC Tyr

TAC Tyr

ATG Met

AAC Asn

TGG GTC Trp Val 55

~CAG~CCT'

-CCA Pro 60

—1-95-

Gin

Pro

GGA

AAG

GCA

CTT

GAG

TGG

TTG

GGT

TTT

ATT

GGA

AAC

AAA

GCT

AAT

GGT

. 243

Gly

Lys

Ala

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

Gly

65

70

75

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

AGT-

GCA

TCT

GTG

AAG

GGT

CGG

TTC

ACC

ATC

TCC

291

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

80

85

90

AGA

GAC

AAA

TCC

CAA

AGC

ATC

CTC

TAT

CTT

CAA

ATG

AAC

ACC

CTG

AGA

339

Arg

Asp

Lys

Ser

Glzi

Ser

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Arg

95

100

105

GCT

GAG

GAC

AGT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGT

ACA

AGA

GAT

AGG

GGG

CTA

CGG

387

Ala

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly

Leu

Arg

110

115

120

TTC

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

ACA

GTC

TCC

TCA

435

Phe

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

125

130

135

140

GCC

AAA

ACG

ACA

CCC

CCA

TCT

GTC

TAT

CCA

CTG

GCC

CCT

GGA

TCT

GCT

483

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

145

150

155

GCC

CAA

ACT

AAC

TCC

ATG

GTG

ACC

CTG

GGA

TGC

CTG

GTC

AAG

GGC

TAT

S31

Ala

Gin

Thr

Asn

Ser

Met

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Tyr

160

165

170

TTC

CCT

GAG

CCA

GTG

ACA

GTG

ACC

TGG

AAC

TCT

GGA

TCT

CTG

TCC

AGC

579

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

175

180

185

GGT

GTG

CAC

ACC

TTC

CCA

GCT

GTC

CTG

CAG

TCT

GAC

CTC

TAC

ACT

CTG

627

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu

190

195

200

-159AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG

Ser Ser Ser Val Thr Val pro Ser Ser Thr Trp 205 210215

CCC AGC GAG ACC GTC

Pro Ser Glu Thr Val

220

675

ACC TGC AAC GTT GCC CAC

Thr Cys Asn Val Ala His

225

CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

230235

723

ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

240245

TAGTAAGAAT TC

CCT TGC ATA TGT ACA

Pro Cys Ile Cys Thr

250

765

777

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 21:

(T)~CHAR’A’KTERTSTIKA SEKVENCE : .............

(A) DÉLKA: 250 aminokyselin _____________{B) _TYP·. aminokyselina ____________ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 21

Met Lys 1

Leu Trp

Leu Asn Trp Ile Phe Leu

Val

Thr Leu

Leu

Asn Gly 15

5

10

Ile

Gin

Cys

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly Gly Gly

Leu

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn·

Lys

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

Θ5

90

95

Gin

Ser

Ile

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Ser

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly. Leu

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

130

135

140

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn

145

150

15S

160

Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

-160-

Val

Thr

Val

Thr 180

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser 185

Leu

Ser

Ser

Gly

Val 190

His

Thr

Phe

Pro

Ala 195

Val

Leu

Gin

Ser

Asp 200

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser 205

Ser

Ser

Val

Thr

Val 210

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp 215

Pro

Ser

Glu

Thr

Val 220

Thr

Cys

Asn

Val

Ala 225

His

Pro

Ala

Ser

Ser 230

Thr

Lys

Val

Asp

Lys 235

Lys

Ile

Val

Pro

Arg 240

Asp

Cys

Gly Cys

Lys

Pro

Cys

Ile

Cys

Thr

245 250

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 22:

_tY)~_CH-_A-_R-_KK-_TER-_I-_STI-_K-_A^_s-_E-_KV-_EN._e-_E-_r - ....................

(A) DÉLKA: 732 páru baží ____(B) TYP: nukleová kyselina _______________ ÍC) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A)

JM

ÉNO/

KLÍČ: C

DS

(B)

UM

rsTĚ

NÍ :

16

až 7

’20

(

xi)

PO

PIS

SE

KVENCE;

; SEKVE

INCE

ID

. Č :

22

GAATTCGCCG CCACC ATG GAT ΤΓΤ CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA

51

Mel

L Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu

1

5

10

ATC

AGT

GCT

TCA

GTC

ATA

ATG

TCC

AGA

GGA

CAA

ACT

GTT

CTC

TCC

CAG

99

Ile

Ser

Ala

Ser

Val

Ile

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Ser

Gin

15

20

25

TCT

CCA

GCA

ATC

CTG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

147

Ser

Pro

Ala

Ile

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

30

35

40

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

ACT

TAC

ATT

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

195

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

Ile

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

45

50

55

60

CCA

GGT

TCC

TCC

ccc

AAA

TCC

TGG

ATT

TAT

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

243

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

65

70

75

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

291

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

80

05

90

-161-

9

TCT CTC ACA Ser Leu Thr

ATC Ile

AGC AGA GTG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC

339

Ser

Arg Val

Glu 100

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala 105

Thr Tyr

Tyr

95

TGC

CAA

CAT

TGG

AGT

AGT

AAA

CCA

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

387

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

110

115

120

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

TCC

ATC

TTC

CCA

435

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

Pro

125

130

135

140

CCA

TCC

AGT

GAG

CAG

TTA

ACA

TCT

GGA

GGT

GCC

TCA

GTC

GTG

TGC

TTC

483

Pro

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

145

150

155

TTG

AAC

AAC

TTC

TAC

CCC

AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

GAT

531

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

160

165

170

GGC

AGT

GAA

CGA

CAA

AAT

GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG

GAC

Gly

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp Gin Asp

175

180

185

AGC

AAA

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

ATG

AGC

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG

ACC

AAG

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

190

195

200

GAC

GAG

TAT

GAA

CGA

CAT

AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

AAG

Asp

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

205

210

215

220

ACA

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC.

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

AAT

GAG

TGT

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

225

230

235

579

527

675

720

TAATAAGAAT TC

732

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 23 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA: 235 aminokyselin (B) . TYP: aminokyselina
(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(i i)	TYP MOLEKULY:	protein
(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 23

Met

Asp

Phe

Gin

val

Gin

Ile

Phe

Ser

Phe

Leu

Leu

Ile

Ser

Ala

Ser

1

5

10

15

Val

Ile

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Ser

Gin

Ser

Pro

Ala

Ile

20

25

30

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

35

40

45

-162-

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

Ile

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

50

55

60

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

€5

70

75

80

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

His

Trp

100

105

110

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

115

120

125

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

Ser

Glu

Arg

-1-55 .......... ...........1-7 O.............. -1-7-5-

-Gin-	-Asn-G-ly-Val-	-Leu-	-Asn-	-Ser-Trp-Thr-Asp-G-l-n-Asp-	-Ser-Lys-Asp-Ser-
		180				185	190
Thr	Tyr Ser	Met	Ser	Ser	Thr	Leu Thr Leu Thr Lys	Asp Glu Tyr Glu
	195.					200	205
Arg	His Asn	Ser	Tyr	Thr	Cys	Glu Ala Thr His Lys	Thr Ser Thr Ser
	210				215	220
Pro	Ile Val	Lys	Ser	Phe	Asn	Arg Asn Glu Cys
225				230		235
INFORMACE	O	SEKVENCI	ID. Č. 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 777 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:16 až 765 (xi

POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 24

AAGCTTGCCG CCACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA ACA51

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr 1510

CTT TTA AAT GGT ATC CAG TGT GAG GTG CAG CTG CTG GAG

Leu Leu Asn Gly Ile Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu Glu

2025

TCT GGA GGA Ser Gly Gly • ·

-163-

GGA CTG

GTG CAQ CCT..GGA

GGA TCT CTG AGA CTG TCT TGT GCA

ACA Thr

TCT Ser

147

Gly

Leu 30

Val Gin

Pro

Gly

Gly 35

Ser

Leu Arg

Leu Ser 40

Cys

Ala

GGA

TTC

ACC

TTC

ACA

GAC

TAC

TAC

ATG

AAT

TGG

GTG

AGA

CAG

GCA

CCT

195

Gly

Phe

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

45

50

55

60

GGA

AAG

GGA

CTC

GAG

TGG

CTG

GGC

TTC

ATC

GGA

AAT

AAG

GCA

AAT

GGA

243

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

Gly

65

70

75

TAC

ACA

ACA

GAG

TAC

TCT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGA

AGA

TTC

ACA

ATT

TCC

291

Tyr

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

ao

85

90

AGA

GAC

AAG

AGC

AAG

TCC

ACA

CTG

TAC

CTG

CAG

ATG

AAT

ACA

CTG

CAG

339

Arg

Asp

Lys

Ser

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Gin

95

100

105

-GCS-GAG’-GAC-TCT-GCA-ATT'TAC-TAC-TG'F-ACA-AGA”GftCAGA--GGACTG-AGA——38T

Ala Glu Asp Ser Ala. Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg

110 115 120

TTC Phe 125

TAC TTC

GAC TAC

TGG Trp 130

GGA Gly

CAG GGA ACA CTG GTG ACA GTG

TCT Ser

TCT Ser 140

435

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Gin Gly

Thr

Leu 135

Val

Thr

Val

GCT

AGC

ACC

AAG

GGA

CCA

TCG

GTC

TTC

CCC

CTG

GCC

CCC

TGC

TCC

AGG

4S3

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

cys

Ser

Arg

145

150

155

AGC

ACC

TCC

GAG

AGC

ACA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

TAT

531

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

160

165

170

TTC

CCC

GAA

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCT

CTG

ACC

AGC

579

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

175

180

185

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

CTC

TAC

TCC

627

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

190

195

200

CTC

AGC

AGC

GTC

GTG

ACG

GTG

CCC

TCC

AGC

AAC

TTC

GGC

ACC

CAG

ACC

675

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

205

210

215

220

TAC

ACC

TGC

AAC

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

GAC

AAG

723

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

225

230

235

ACA

GTT

GAG

CGC

AAA

TGT

TGT

GTC

GAG

TGC

CCA

CCG

TGC

CCG

765

Thr

Val

Glu

Arg

Lys

Cys

Cys

Val

Glu

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

240

245

250

ŤAATAGGAAT TC

777

-164·♦

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) (B) (D)	DÉLKA: 250 aminokyselin TYP: aminokyselina
TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	protein
(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 4

Met

Lys

Leu

Trp

Leu

Asn

Trp

Ile

Phe

Leu

Val

Thr

Leu Leu

Asn

Gly

1

5

10

is

Ile

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Leu

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly Leu

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

'Cys Ala

Thr-

Ser’

-Gly-Pher

-Thr-

-Phe-

40 45

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Vál^-Arg^_Gln^—Ala^-Pro-Gly-Lys-G-ly-Leu—--——·—·------------

50

55

60

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

Ile

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Thr

Glu

ss

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

85

90

95

Lys

Ser

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Ser

100

105

110

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly

Leu

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

130

135

140

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

145

1S0

155

160

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

165

170

175

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

180

185·

190

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

195

200

205

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

210

215

220

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

Val

Glu

Arg

225

230

235

240

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 *«

-165-

A	• A
A A	A A
A	A
A	A
•	*

·»

A · · ·

A « · ♦ · · · • A A

AA AAAA

A A A A

A A AA

A A A A φ A

A A A

A A A A

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 26:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 732 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY; jiná nukleová	kyselina
(ix)	CHARAKTERISTICKÉ RYSY: (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:16 až 720
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č:	26

—na-aTTrnrrn-PPAeg-A-TG-GAT—TT-T—CAA-GTG—CAG_AT.T_TTC AGC TTC CTG CTA 51

Met Asp Phe Gin Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu 15 10

ATC Ile

AGT Ser

GCT Ala 15

TCA Ser

GTC ATA

ATG TCC AGA GGA CAG ACT

GTA Val 25

CTC Leu

ACT' Thr

CAG Gin

99

Val

Ile

Met Ser 20

Arg

Gly

Gin

Thr

AGT

CCA

AGT

AGT

CTC

AGT

GTA

AGT

GTA

GGT

GAT

AGG

GTA

ACT

ATG

ACT

147

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Met

Thr

30

35

40

TGT

AGG

GCC

AGT

AGT

AGT

GTA

ACT

TAT

ATC

CAT

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

195

Cys

Arg

Ala

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

Ile

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

45

50

55

60

CCA

GGT

CTC

GCC

CCA

AAA

AGT

TGG

ATC

TAT

GCC

ACT

AGT

AAC

CTC

GCC

243

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

65

70

75

AGT GGT

GTA Val

CCA TCT AGA TTC

AGT Ser

GGT AGC GGT

AGT GGT ACT GAT

TAT Tyr

291

Ser

Gly

Pro 80

Ser

Arg

Phe

Gly Ser B5

.Gly

Ser

Gly Thr 90

Asp

ACT

CTC

ACT

ATC

AGT

AGT

CTC

CAG

CCA

GAA

GAT

ATC

GCC

ACT

TAC

TAT

339

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

95

100

105

TGC

CAG

CAT

TGG

AGT

AGT

AAA

CCA

CCA

ACT

TTC

GGT

CAG

GGT

ACT

AAA

387

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

110

115

120

GTA

GAA

GTA

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

435

Val'

Glu

Val

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro_

Ser

Val.

Phe

Ile

Phe

Pro

125

130

135

140

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

483

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

14S

150

155

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAG

GTG

GAT

531

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

160 165 170 • ·

-166-

AAC Asn

GCC CTC CAA TCG

GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG

CAG Gin

GAC Asp

579

Ala Leu 175

Gin Ser

Gly Asn

Ser 180

Gin

Glu

Ser

Val

Thr 185

Glu

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

627

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

190

195

200

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

675

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

205

210

215

220

GGC

CTG

AGT

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

720

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

TAATAGGAAT TC

732

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 27:

~Cf)~~CHARAKTER'rST_rKA”S-EKV_ENC-E-:—-—- - .........- (A) DÉLKA: 230 aminokyselin _____________(B.)_.T.YP: aminokyselina ______________ ÍD) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 27

Met

Asp

Phe

Gin

Val

Gin

Ile

Phe

Ser

Phe

Leu

Leu

Ile

Ser

Ala

Ser

1

5

10

15

Val

Ile

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

20

2S

30

Leu

Ser

Val

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Ser

Val

Thr

Tyr

Ile

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

50

55

60

Pro

Lys

Ser

Trp

Ile

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

65

70

75

80

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

85

90

95

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

His

Trp

100

105

110

Ser

Ser

Lys

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Val

Lys

115

120

125

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165 170 175

-167-

··	• 9
•	♦ to 9
•	to

Ser

Gly

Asn

Ser 1.80

Gin

Glu

Ser

Val

Thr 1.8 5

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys 190

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser 195

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu 200

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala 205

Asp

Tyr

Glu

Lys

His 210

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys 21S

Glu

val

Thr

His

Gin 220

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro 22S

Val

Thr

Lys

Ser

Phe 230

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys 235

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (3) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN; jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

----('i-i-)—T-Y-P—MOL-E-K-U-L-Y-:—j-i-n-á—nukleo-v-á_k-y.s.e.l.i.na____.

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 28

GTTGGAGCTC TTGGTTCTGG 20

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č.- 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN; jedno

ÍD) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 29

CAAGGCCTCG AGCTTTCTCA AC 22

INFORMACE O SEKVENCI ID, Č. 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

	-168-	• ·· ·· ’· - _ ««·· ♦ · » * · í * • · · · · · · « « « · » ······ ·· ·»· · · «* «4·· ···· ··
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č	4
GTTTGATTCT	AGAGTTCGTG C			21
INFORMACE 0 SEKVENCI ID	. Č. 31:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 22	párů baží
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	j iná nukleová	kyselina

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 31

TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno <D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 32

GAAACAGCTA TGACCATGAT TACG

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

-169- (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 33

GGACCTGCTG CAGAGTCTG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (iij TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 35 •GCCTGT CTC- AATAT-TGATG-G.

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C> POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 36

CCGTGTTAAA CGAGAAGATA CTG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) · TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 37

GCTACTGTGA AAGAACTTGC CTC ·· • 4 ·4 ♦ 4·

4 · ··

44 «4·44·

-170INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1263 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN': jedno (D) TOPOLOGIE:lineární (ii) TYP MOLEKULY; jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 38

GAGCTCTTGG	TTCTGGTGAC	TGTGGCCCTG	GCATCTGCTC	ATCATGGTGG	TGAGCACTTT	60
GAAGGCGAGA	AGGTGTTCCG	TGTTAACGTT	GAAGATGAAA	ATCACATTAA	CATAATCCGC	120
GAGTTGGCCA	GCACGACCCA	GATTGACTTC	TGGAAGCCAG	ATTCTGTCAC	ACAAATCAAA	180
CCTCACAGTA	CAGTTGACTT	CCGTGTTAAA	GCAGAAGATA	CTGTCACTGT	GGAGAAŤGTT	240
CTAAAGCAGA	ÁTGÁACTACA’	-ATACAAGGTA-	-CTGATAAGSA-	-ACCTGAGAAA.	JTGTGGTGGAG	300
GCTCAGTTTG	ATAGCCGGGT	TCGTGCAACA	GGACACAGTT	ATGAGAAGTA	CAACAAGTGG	360
GAAACGATAG	AGGCTTGGAC	TCAACAAGTC	GCCACTGAGA	ATCCAGCCCT	CATCTCTCGC	420
AGTGTTATCG	GAACCACATT	TGAGGGACGC	GCTATTTACC	TCCTGAAGGT	TGGCAAAGCT	480
GGACAAAATA	AGCCTGCCAT	TTTCATGGAC	TGTGGTTTCC	ATGCCAGAGA	GTGGATTTCT	54 0
CCTGCATTCT	GCCAGTGGTT	TGTAAGAGAG	GCTGTTCGTA	CCTATGGACG	TGAGATCCAA	600
GTGACAGAGC	TTCTCGACAA	GTTAGACTTT	TATGTCCTGC	CTGTGCTCAA	TATTGATGGC	660
TACATCTACA	CCTGGACCAA	GAGCCGATTT	TGGAGAAAGA	CTCGCTCCAC	CCATACTGGA	720
TCTAGCTGCA	TTGGCACAGA	CCCCAACAGA	AATTTTGATG	CTGGTTGGTG	TGAAATTGGA	780
GCCTCTCGAA	ACCCCTGTGA	TGAAACTTAC	TGTGGACCTG	CCGCAGAGTC	TGAAAAGGAA	340
ACCAAGGCCC	TGGCTGATTT	CATCCGGAAC	AAACTCTCTT	CCATCAAGGC	ATATCTGACA	900
ATCCACTCGT	ACTCCCAAAT	GATGATCTAC	CCTTACTCAT	ATGCTTACAA	ACTCGGTGAG	960
AACAATGCTG	AGTTGAATGC	CCTGGCTAAA	GCTACTGTGA	AAGAACTTGC	CTCACTGCAC	1020
GGCACCAÁGT	ACACATATGG	CCCGGGAGCT	ACAACAATCT	ATCCTGCTGC	TGGGGGCTCT	1080
GACGACTGGG	CTTATGACCA	AGGAATCAGA	TATTCCTTCA	CCTTTGAACT	TCGAGATACA	1140
GGCAGATATG	GCTTTCTCCT	TCCAGAATCC	CAGATCCGGG	CTACCTGCGA	GGAGACCTTC	1200
CTGGCAATCA	AGTATGTTGC	CAGCTACGTC	CTGGAACACC	TGTACTAGTT	GAGAAAGCTC	1260

GAG 1263 ♦ ·

-171INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 415 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 39

Glu 1

Leu Leu

Val

Leu Val Thr Val Ala Leu

Ala Ser Ala

His

His 15

Gly

5

10

Gl-y_Glu_

,His_

.Phe.

Glu

Gly Glu

Lys

Val

Phe

Arg Val

Asn

Val

Glu

Asp

20

25

30

.Glu.

.Asn.

.His.

.Il.e_

Asn

Ile

Ile

Arg

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Gin

Ile

35

40

45

Asp

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp

Ser

Val

Thr

Gin

Ile

Lys

Pro

His

Ser

Thr

50

55

60

Val

Asp

Phe

Arg

Val

Lys

Ala

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asn

Val

65

70

75

80

Leu

Lys

Gin

Asn

Glu

Leu

Gin

Tyr

Lys

Val

Leu

Ile

Ser

Asn

Leu

Arg

85

90

95

Ásn

Val

Val

Glu

Ala

Gin

Phe

Asp

Ser

Arg

Val

Arg

Ala

Thr

Gly

His

100

105

110

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

115

120

125

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

130

135

140

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

145

150

155

160

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

165

170

175

Glu

Trp

ile

Ser

Pro

Ala

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

180

185

190

Arg

Thr

Tyr

Gly Arg

Glu

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

195

200

205

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly Tyr

Ile

Tyr

Thr

210

215

220

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

225

230

235

240

-172- • *< ·· «φ «*99

9 9 9 9 9 · *« • · · · · *· « » • « · · · * · · ♦ · » • · · 9 99 9

999 9999 99 9999 9999

Ser Ser Cys Ile Gly Thr Asp

Pro

Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp

245

250

255

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

260

265

270

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

275

280

285

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

290

295

300

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

305

310

31S

320

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

325

330

335

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

340

345

350

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

355

360

355

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr Gly

370

3 75

3'80

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

385

390

395

400

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

Ala

Ser

Tyr Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

405

410

415

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č, 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 40 GCCCGGGTTTG CGCAACTGGT CACTCTTAČG AGAAG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 88 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

-173- • ** 9 · · ·9· «φ • · · 9 9 · · · ·9 9 φ • · 9 · 9 9 999 • 9 99 · 9 9 999*9

99»999

999 9999 ·· 9999 ·«99 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 41

CCGGAATTCT TATTAGTTCA GGTCCTCCTC AGAGATCAGC TTCTGCTCCT CGAACTCATG

GTGGTGATGG TGGTGGTACA GGTGTTCC

B3

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) . TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 42

TTAGCGGATC CTGCCTGACG GT

-22·

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 43

GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT 23

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 44:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) ' DÉLKA: 2 0 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 44

ACCTCTAGGG TCCCCAATTA

-174INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 45

CAAGTCGCCA CTGAGAATCC AGO 23

INFORMACE 0 SEKVENCI ID.

C. 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: _______.__(A)_DÉLKA: 1053 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) . POČET VLÁKEN: jedno (D)

TOPOLOGIE: lineární (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina ( ix)

CHARAKTERISTICKÉ RYSY: {A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 1047

CHARAKTERISTICKÉ RYSY: JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid UMÍSTĚNÍ: 67 až 1047 (A) (B)

POPIS

SEKVENCE:

SEKVENCE

ATG AAA TAC Met Lys Tyr

CTA Leu

TTG CCT ACG

GCA GCC

GCT GGA TTG TTA TTA

CTC Leu

Leu

Pro Thr

Ala -15

Ala

Ala

Gly Leu

Leu -10

Leu

-22

-20

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

-5

1

5

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

15

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA-

TTT

GAG

GGA

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

30

35

40

GCT

ΆΤΤ

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

45-

50

55

ΆΑΤ

Asn

CGC

Arg

GCC

Ala

GCT Ala

AAC

Asn

144

192

240

ATT TTC Ile Phe 60

ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG

ATT TCT CCT

GCA Ala

288

Met Asp

Cys

Gly

, Phe 65

His

Ala

Arg

Glu.Trp 70

Ile

Ser

Pro

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

ΤΤΆ

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

cys

Ile

Gly

Thr

1’25’

~13·ίλ

135

GAC

CCC

AAC

AGA AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp-

-Pro-

-Asn-

-Arg-

-Asn-

-Phe-Asp.

-Ala.

Gly T.rp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

185

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

768

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

Tyr

Thr

Tyr Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

864

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg. Asp

Ťhr

Gly Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

200

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

ttc

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile·

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

-176-

GCC AGC Ala Ser

TAC GTC CTG GAA GAC

CTG TAC CAC CAC

CAT CAC

CAC CAT GAG His His Glu

íooa

Tyr

Val

Leu

Glu His 305

Leu Tyr

His

His

His 310

His

300

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC

CTG

AAC

TAATAA

1053

Phe

G1U

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

315

320

325

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 349 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární .(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 47

Met

Lys

Tyr

Leu

Leu

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

-22

-20

-15

-10

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15

20

25

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

30

35

40

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

eo

85

90

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

1SS

160

165

170

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

130

135

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190 195 200

4

-177-

Pro

Tyť

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

-Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

200

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

295

290

295

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

__Phe_

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

315

320

325

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 4

GTTATTACTC GCTGCCCAAC CAGCCATGGC G 31

INFORMACE O -SEKVENCI ID. Č. 49:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 41 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kyselina
(xi) CTCTAGGAAT	POPIS SEKVENCE: TCTTATTAGT ACAGGTGTTC	SEKVENCE ID.Č CAGGACGTAG C	: 4	41

-178-

4 ·· 94	• 4	« ·	44
					•
9	• ·	• «	4 4	• 4
•	• 4 4	• 4 9	4*4	4	4
•	4	4	4	4	•
		444«	• 4	44

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 999 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 987 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid

................(-Bj- UMÍ-STĚN-Í- : 6-7—a Ž-9 8 -7 — . .....................

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 50

ATG Met -22

ΆΑΑ TAC

CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT

GGA TTG TTA TTA CTC

GCT Ala

48

Lys

Tyr -20

Leu Leu

Pro

Thr

Ala Ala -15

Ala

Gly

Leu Leu -10

Leu

Leu

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15·

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

30

35

40

GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

289

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

TTC

TGC

GAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly Arg

Glu

75

80

85

90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

cct

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

.Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

lis

120

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125 130 135

-179-

*	4 4 ··	44	• 4	··
•	• 4 4 4	• 4	4 4 4	•
•	4 4 4	4	• 4	• ·
	• · 4 4	4	4 4*4 4	4
9	• · «	•	4 4	•
		4 444	4«	• 4

GAC CCC AAC

AGA Arg

AAT Asn

TTT GAT GCT GGT TGG TGT

GAA ATT.GGA

GCC Ala

TCT Ser

528

Asp

Pro Asn 140

Phe

Asp Ala 145

Gly

Trp

Cys

Glu 150

Ile

Gly

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

1Θ5

ATC

AAG

GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

672

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

19S

200

CCT Pro

TAC TCA TAT

GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT

GAG TTG

AAT Asn

720

Tyr

Ser 205

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu 210

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala 215

Glu

Leu

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

760

Ala

Leu Ala Lys

Ala

Thr

Val

Lys Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

016

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly. Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

364

Gly Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg' Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

230

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

285

290

295

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

TAATAAGAAT TC

999

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

300

305

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 51:

(i.) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 329 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 51

-180• 4· ·« ·♦ ·· »·

9*4 ♦ 9 ·· · · · 4 » · 9 · 994 99

9 9 « · 9 9 4*4 **

9« 4 4 * · 4*

444 4·*« 4* *49« 4»*4

Ala

Glri -5

Pro Ala Met

Ala

Ala Thr 1

Gly His Ser Tyr 5

Glu

Lys

Tyr

Asn 10

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15

20

25

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

30

35

40

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly Arg

Glu

75

30

85

90

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

130

185

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

21S

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

280

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

28S 290 295

Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr

300305

-181-

•	♦ ·		··	··	»·		··
•	·	•	•	♦ ·	• ·	«	•
•	•	•	•	•	• ·
«	•	* ·	«	•	« · · ·
«,		«	•	v	»	*	«
			φ »	♦ · · ·	« ·

INFORMACE 0 SEKVENCI ID.	Č. 52 :
(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 34 párů baží
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č:	: 52
CCAACCAGCC	ATGGCGCATC ATGGTGGTGA	GCAC		34

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 53:

—či-)— &H-A-R-A-K-T-E-R-I-S-T-I-KA-S-EK-V-EN.CE-:_ . . . ....................

(A) DÉLKA: 23 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno '' (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

(xi) GGCTGGATTC	POPIS SEKVENCE: TCAGTGGCC-A CTT	SEKVENCE ID.Č:	53	23
INFORMACE 0 SEKVENCI ID	. Č. 54:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno ÍD) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kyselina
(xi) CGAGAAAGCC	POPIS SEKVENCE: ATATCTGCCT G	SEKVENCE ID.Č:	: 54	21

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) . DÉLKA: 1284 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (O POČET VLÁKEN: jedno

-182- (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

(ix)	CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ:	CDS iž 1272
(B)	UMÍSTĚNÍ:! č
( ix)	CHARAKTERISTICKÉ	RYSY :
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	mat_peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:352 až 1272
(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 55

ATG AAA TAC OTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala —1-1-7—-1-1-5 ......—1-1-0 ......—1-05...............................

GCC CAA CCA GCC ATG GCG CAT -Al a- Gl-n— Pr o-Ala-Me t—Al a-H-is-100 -95

CAT -His-

GGT GGT GAG -Gl-y-Gl-y-Gl-u-

CAC -His- -90

TTT -Phe-

GAA -Glu-

GGC GAG -Gly Glu

96

AAG

GTG

TTC

CGT

GTT

AAC

GTT

GAA

GAT

GAA

AAT

CAC

ATT

AAC

ATA

ATC

144

Lys

Val

Phe

Arg

Val

Asn

Val

Glu

Asp

Glu

Asn

His

Ile

Asn

Ile

Ile

-85

-80

-75

-70

CGC

GAG

TTG

GCC

AGC

ACG

ACC

CAG

ATT

GAC

TTC

TGG

AAG

CCA

GAT

TCT

192

Arg

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Gin

Ile

Asp

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp

Ser

-65

-60

-55

GTC

ACA

CAA

ATC

AAA

CCT

CAC

AGT

ACA

GTT

GAC

TTC

CGT

GTT

AAA

GCA

240

Val

Thr

Gin

Ile

Lys

Pro

His

Ser

Thr

Val

Asp

Phe

Arg

Val

Lys

Ala

-50

-45

-40

GAA

GAT

ACT

GTC

ACT

GTG

GAG

AAT

GTT

CTA

AAG

CAG

AAT

GAA

CTA

CAA

288

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Lys

Gin

Asn

Glu

Leu

Gin

-35

-30

-25

TAC

AAG

GTA

CTG

ATA

AGC

AAC

CTG

AGA

AAT

GTG

GTG

GAG

GCT

CAG

TTT

336

Tyr

Ly3

Val

Leu

Ile

Ser

Asn

Leu

Arg

Asn

Val

Val

Glu

Ala

Gin

Phe

-20

-15

-10

GAT

AGC

CGG

GTT

CGT

GCA

ACA

GGA

CAC

AGT

TAT

GAG

AAG

TAC-

AAC

AAG

384

Asp

Ser

Arg

Val

Arg

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

-5

1

5

10

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

CCA

432

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

Pro

15

20

25

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT-GAG

GGA

CGC

GCT

480

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Ala

30

35

40

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

ATT

528

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

Ile

45

50

55

-183-

• 99	• 9		9«	99	99
99 9 9	•	•	* 9	9 9	9 9
• 9	•	•	•	9 9	»9
♦ ·	• 9	9	• 9	999	9 9
• 9	9	•	9	•	9 9
• Μ MM	• 9		9999	99	• 9

TTC Phe 60

ATG Met

GAC Asp

TGT Cys

GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT

GCA Ala

TTC Phe 75

576

Gly

Phe His Ala 65

Arg

Glu Trp 70

Ile

Ser

Pro

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

ATC

624

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

Ile

80

05

90

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

GTG

672

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

Val

95

100

105

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

TGG

720

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp

110

115

120

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

GAC

768

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

Asp

125

130

135

CCC

AAC

AGA AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

CGA

016

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly Trp

Cys

Glu

Ile

Gly Ala

Ser

Arg

140

145

150

155

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

AAG

864

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

Lys

160

165

170

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

ATC

912

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

Ile

175

180

185

AAG' GCA

TAT

CTG

ACA

ATC

CAC

TCG

TAC

TCC

CAA

ATG

ATG

ATC

TAC

CCT

960

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

Pro

190

195

200

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

GCC

1000

Tyr-

Ser

Tyr

Ala

Tyr Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

205

210

215

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

AAG

1056

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

Lys

220

225

230

235

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

GGC

1104

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly Gly

240

245

250

TCT

GAC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

TTT

1152

Ser

Asp

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

Phe

255

260

265

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

CAG

1200

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly Arg

Tyr Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

Gin

270

275

280

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

GCC

1248

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

Ala

285 290 295

-184-

• ··	44	44	44	·«
• 4 4 4	«	4	• ·	• 4	•		•
• ·	4	•	4	4 4		4 4
4 ·	• 4	•	4				•
* 4	•	4	•	•	•		4
··* HH	4«		4444	4 4		44

AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC TAATAAGAAT TC

Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr

300 305

1234

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 424 aminokyselin.

(B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 56

-Met—Lys-Tyr—Leu—Leu—Pro—Thr-A-l-a-Ala-Al-a-Gl-y—Leu-Leu—Leu-Leu-Ala

-117 -115 -110 -105

A-l-a-Gl-n—Pro-A-la—Met—Al-a—H-i-s—His-Gly-Gly—Glu-His—Phe-Glu-Gl-y—Gl.u. -100 -95 . -90

Lys -85

Val

Phe Arg

Val

Asn -30

Val

Glu

Asp Glu Asn -75

His

Ile

Asn

Ile

Tle -70

Arg

Glu

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Gin

Ile

Asp

Phe

Trp

Lys

Pro

Asp

Ser

-65

-60

-55

Val

Thr

Gin

Ile

Lys

Pro

His

Ser

Thr

Val

Asp

Phe

Arg

Val

Lys

Ala

-50

-45

-40

Glu

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Lys

Gin

Asn

Glu

Leu

Gin

-35

-30

-25

Tyr

Lys

Val

Leu

Ile

Ser

Asn

Leu

Arg

Asn

Val

Val

Glu

Ala

Gin

Phe

-20

-15

-10

Asp

Ser

Arg

Val

Arg

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

Lys

-5

1

5

10

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

val

Ala

Thr

Glu

Asn

Pro

15

20

25

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

Ala

30

35

40

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

Ile

45

50

55

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

Phe

60

65

70

75

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr- Gly

Arg

Glu

Ile

80

85

90

Gin Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr Val

Leu

Pro

Val

95

100

105

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

Trp

Ί A n c

170

-185-

•	99 99	·*	99	9«
• 9	• 9	9 9	9 9	9	9
9	• · ♦	9	9 9	9«
•	**· 9	•	• *99	•	9
•	9 *·	9	9	9	*
		9999	99	99

Arg Lys Thr	Arg	Ser	Thr His 13 0	Thr Gly Ser Ser Cys 135	Ile Gly Thr	Asp
	125
Pro	Asn Arg	Asn	Phe	Asp Ala	Gly Trp Cys Glu Ile	Gly Ala Ser	Arg
14 0				145	150		155
Asn	Pro Cys	Asp	Glu	Thr Tyr	Cys Gly Pro Ala Ala	Glu Ser Glu	Lys
			160		165	170
Glu	Thr Lys	Ala	Leu	Ala Asp	Phe Ile Arg Asn Lys	Leu Ser Ser	Ile
		175			180	185
Lys	Ala Tyr	Leu	Thr	Ile His	Ser Tyr Ser Gin Met	Met Ile Tyr	Pro
	190				195	200
Tyr	Ser Tyr	Ala	Tyr	Lys Leu	Gly Glu Asn Asn Ala	Glu Leu Asn	Ala
	20S			210	215
Leu	Ala Lys	Ala	Thr	Val Lys	Glu Leu Ala Ser Leu	His Gly Thr	Lys
220				225	230		235
Tyr	Thr Tyr Gly	Pro	Gly Ala	’TFnFTHr”I TeTy rPro_	’Al’a ATa Gly Gly
			240		245	250
Ser	Asp Asp	Trp	Ala	“TyŤ^Asp“	Grn~Gly_ITe-*Arg-Tyr-	-Ser-Phe-T-hr-	-Phe-
		255			260	265
Glu	Leu Arg	Asp	Thr	Gly Arg	Tyr Gly Phe Leu Leu	Pro Glu Ser	Gin
	270				275	280
Ile	Arg Ala	Thr	Cys	Glu Glu	Thr Phe Leu Ala Ile	Lys Tyr Val	Ala
	2Θ5			29Ó	295
Ser	Tyr Val	Leu	Glu	His Leu	Tyr
300				305
INFORMACE	O	SEKVENCI	ID. Č. 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 57

GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGCC 25

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární • ·

-1Θ6-

(ii) (xi) CCTGCTGCTG	TYP MOLEKULY: POPIS SEKVENCE: GGGGCTCTAA AGACTGG	jiná nukleová kyselina
SEKVENCE ID.Č:	: 58	27
INFORMACE 0 SEKVENCI ID.	Č. 59:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA:1059 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kyselina

íix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS

CB)~UMÍSTĚNÍT~l~až~I04'7~ .......

(ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

^{1 1} (Á)~JMÉN07KL’ÍČ; mat_jpept“i“d ’ (B) UMÍSTĚNÍ: 67 až 1047 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 59

ATG Met -22

AAA TAC

CTA TTG CCT

ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA

TTA CTC

GCT Ala

48

Lys

Tyr -20

Leu

Leu Pro

Thr Ala -15

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu -10

Leu

Leu

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TTT

GAG

GGA

CGC

192

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser

Arg

Ser

Val

Ile

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu

Gly

Arg

3 0

35

40

GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT

AAG

CCT

GCC

240

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

288

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

ČGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

im

11 ς

120

φφ ·

-187-

TGG AGA AAG Trp Arg Lys 125

ACT CGC TCC ACC

CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC

ACA Thr

400

Thr Arg

Ser

Thr

His 130

Thr Gly

Ser

Ser

Cys 135

Ile

Gly

GAC

ccc

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

528

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA

AAC

CCC

TGT

GAT

GAA

ACT

TAC

TGT

GGA

CCT

GCC

GCA

GAG

TCT

GAA

576

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

”ATC~

-AAG“

GCA-

-TAT-

175 -CTG-

-ACA-

-ATC-

-CAC-

-TCG-

180 -TAC-

-TGC-

-GAA-

-ATG-

-ATG-

185 -ATC-

íhr.

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile Tyr

190

195

200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT .

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

768

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr,

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

816

Lys

iyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

AAA

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

064

Gly

Ser

Lys

Asp

Trp- Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

2S0

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr.

Val

285

290

295

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

1000

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC

CTG

AAC

TAATAAGAAT

1057

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

315

320

325

TC

1059

	-188-	* ·> ·· ·· ·· •*44 4 · · 4 toto* • té· ····· 4 · ·· · · · ·« · < • · 4 4 · to · ·· toto·· ·· »··· ·· ··
INFORMACE	0 SEKVENCI ID. Č.60:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA.- 34 9 aminokyselin. (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: protein

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 60

Met

Lys

Tyr

Leu

Leu

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

-22

-20

-15

-10

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15

20

25

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser Arg

Ser

Val

Ile Gly

Thr

Thr

Phe

Glu Gly Arg

30

35

40

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

as

90

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

. Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

1S0

Arg

Asn

Pro

Cys

Asp

Glu

Thr

Tyr

Cys

Gly

Pro

Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

180

185

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

Gly Ser Lys Asp Trp Ala Tyr Asp Gin Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr

255 260 265

-189-

• >9			44	44		44
4· · *	4		4 ·	• 4	•	e
• 4	4	4	•	4 4		• f
• e ♦		•	4	4 444	•	•
• «	4	•	4	4	•	4
4444	44		44 44	44		• 4

Phe

Glu

. Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

280

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

285

290

295

Ala

Ser.

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

315

320

325

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2S páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární

TYP- MOLEKULY :

jiná nukleová kyselina

(χΐ^ΡΌ’ΡΊ’Ξ^-SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: ’6’1

GGTCATAAG CCAGTCGCGA GAGCC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 62:

(i)	charakteristik;	ί SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 27	páru baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET VLÁKEN: jedno
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kyselina
(xi)	POPIS	SEKVENCE:	: SEKVENCE ID.Č:	: 62
CCTGCTGCTG	GGGGCTCTCG CGACTGG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1059 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 1047

-190- ·· • 9 · ♦ *· · ·*♦<

íx) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) (B)	JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid UMÍSTĚNÍ:67 až 1047
(xi) POPIS	SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 63

ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT

48

Met -22

Lys

Tyr -20

Leu

Leu Pro Thr Ala -15

Ala

Ala Gly

Leu

Leu -10

Leu

Leu

Ala

GCC

CAA

CCA

GCC

ATG

GCG

GCA

ACT

GGT

CAC

TCT

TAC

GAG

AAG

TAC

AAC

96

Ala

Gin

Pro

Ala

Met

Ala

Ala

Thr

Gly

His

Ser

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn

-5

1

5

10

AAG

TGG

GAA

ACG

ATA

GAG

GCT

TGG

ACT

CAA

CAA

GTC

GCC

ACT

GAG

AAT

144

Lys

Trp

Glu. Thr

Ile

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin

Gin

Val

Ala

Thr

Glu

Asn

15

20

25

CCA

GCC

CTC

ATC

TCT

CGC

AGT

GTT

ATC

GGA

ACC

ACA

TŤT

GAG''

GGA“

CGC

—192·

Pro

Ala

Leu

Ile

Ser Arg

Ser Val

Ile Gly

Thr

Thr

Phe

Glu Gly Arg

30

35

40

GCT

ATT

TAC

CTC

CTG

AAG

GTT

GGC

AAA

GCT

GGA

CAA

AAT’

AAG'

'CCT'

'GCC

24Ό·

Ala

Ile

Tyr

Leu

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Asn

Lys

Pro

Ala

45

50

55

ATT

TTC

ATG

GAC

TGT

GGT

TTC

CAT

GCC

AGA

GAG

TGG

ATT

TCT

CCT

GCA

288

Ile

Phe

Met

ASp

cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

TTC

TGC

CAG

TGG

TTT

GTA

AGA

GAG

GCT

GTT

CGT

ACC

TAT

GGA

CGT

GAG

336

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly

Arg

Glu

75

80

85

90

ATC

CAA

GTG

ACA

GAG

CTT

CTC

GAC

AAG

TTA

GAC

TTT

TAT

GTC

CTG

CCT

384

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

GTG

CTC

AAT

ATT

GAT

GGC

TAC

ATC

TAC

ACC

TGG

ACC

AAG

AGC

CGA

TTT

432

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

TGG

AGA

AAG

ACT

CGC

TCC

ACC

CAT

ACT

GGA

TCT

AGC

TGC

ATT

GGC

ACA

480

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

GAC

CCC

AAC

AGA

AAT

TTT

GAT

GCT

GGT

TGG

TGT

GAA

ATT

GGA

GCC

TCT

S28

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

CGA AAC CCC TGT GAT

GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA

576

Arg 155

Asn Pro

Cys Asp

Glu 160

Thr

Tyr Cys

Gly

Pro Ala Ala Glu Ser Glu

165

170

AAG

GAG

ACC

AAG

GCC

CTG

GCT

GAT

TTC

ATC

CGC

AAC

AAA

CTC

TCT

TCC

624

Lys

G1U

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175 180 185

-191-

ATC Ile

AAG GCA TAT CTG

ACA Thr

ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG

ATC Ile

TAC Tyr

672

Lys-

Ala Tyr Leu 190

Ile His Ser' 195

Tyr

Ser

Gin

Met

Met 200

CCT

TAC

TCA

TAT

GCT

TAC

AAA

CTC

GGT

GAG

AAC

AAT

GCT

GAG

TTG

AAT

720

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

GCC

CTG

GCT

AAA

GCT

ACT

GTG

AAA

GAA

CTT

GCC

TCA

CTG

CAC

GGC

ACC

76B

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

AAG

TAC

ACA

TAT

GGC

CCG

GGA

GCT

ACA

ACA

ATC

TAT

CCT

GCT

GCT

GGG

316

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

GGC

TCT

CGC

GAC

TGG

GCT

TAT

GAC

CAA

GGA

ATC

AGA

TAT

TCC

TTC

ACC

364

Gly

Ser

Arg

Asp

Trp

Ala

Tyr

Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

255

260

265

TTT

GAA

CTT

CGA

GAT

ACA

GGC

AGA

TAT

GGC

TTT

CTC

CTT

CCA

GAA

TCC

912

'Phe

Olu”

'Leu~Arg·

Asp-

-Thr-Gly-Arg-

-Tyr-Gly-

.Phe.

.Leu.

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

2S0

CAG

ATC

CGG

GCT

ACC

TGC

GAG

GAG

ACC

TTC

CTG

GCA

ATC

AAG

TAT

GTT

960

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

2S5

290

295

GCC

AGC

TAC

GTC

CTG

GAA

CAC

CTG

TAC

CAC

CAC

CAT

CAC

CAC

CAT

GAG

100S

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

TTC

GAG

GAG

CAG

AAG

CTG

ATC

TCT

GAG

GAG

GAC

CTG

AAC

TAATAAGAAT

1057

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

315

320

325

TC

1059

INFORMACE 0 SEKVENCI ID.	C. 64:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 349 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	protein
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 64

Met -22

Lys

Tyr -20

Leu

Leu

Pro

Thť

Ala -15

Ala

Ala

Gly

Leu

Leu -10

Leu

Leu

Ala

Ala

Gin -5

Pro

Ala

Met

Ala

Ala 1

Thr

Gly

His

Ser 5

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Asn 10

Lys

Trp

Glu

Thr

Ile 15

Glu

Ala

Trp

Thr

Gin 20

Gin

Val

Ala

Thr

Glu 2’5

Asn

Pro

Ala

Leu

Ile 30

Ser

Arg

Ser

Val

Ile 35

Gly

Thr

Thr

Phe

Glu 40

Gly

Arg

v · i

-192-

Ala Ile Tyr Leu

Leu Lys Val Gly 50

Lys

Ala Gly

Gin

Asn 55

Lys

Pro

Ala

45

Ile

Phe

Met

Asp

Cys

Gly

Phe

His

Ala

Arg

Glu

Trp

Ile

Ser

Pro

Ala

60

65

70

Phe

Cys

Gin

Trp

Phe

Val

Arg

Glu

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Gly Arg

Glu

75

30

Θ5

90

Ile

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Lys

Leu

Asp

Phe

Tyr

Val

Leu

Pro

95

100

105

Val

Leu

Asn

Ile

Asp

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Trp

Thr

Lys

Ser

Arg

Phe

110

115

120

Trp

Arg

Lys

Thr

Arg

Ser

Thr

His

Thr

Gly

Ser

Ser

Cys

Ile

Gly

Thr

125

130

135

Asp

Pro

Asn

Arg

Asn

Phe

Asp

Ala

Gly

Trp

Cys

Glu

Ile

Gly

Ala

Ser

140

145

150

Arg Asn

Pro

Cys Asp Glu Thr

Tyr Cys Gly Pro Ala

Ala

Glu

Ser

Glu

155

160

165

170

Lys

Glu

Thr

Lys

Ala

Leu

Ala

Asp

Phe

Ile

Arg

Asn

Lys

Leu

Ser

Ser

175

1B0

185

Ile

Lys

Ala

Tyr

Leu

Thr

Ile

His

Ser

Tyr

Ser

Gin

Met

Met

Ile

Tyr

190

195

200

Pro

Tyr

Ser

Tyr

Ala

Tyr

Lys

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Ala

Glu

Leu

Asn

205

210

215

Ala

Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Leu

Ala

Ser

Leu

His

Gly

Thr

220

225

230

Lys

Tyr

Thr

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Gly

235

240

245

250

Gly

Ser

Arg

Asp

Trp

Ala

Tyr Asp

Gin

Gly

Ile

Arg

Tyr

Ser

Phe

Thr

25S

260

265

Phe

Glu

Leu

Arg

Asp

Thr

Gly

Arg

Tyr

Gly

Phe

Leu

Leu

Pro

Glu

Ser

270

275

230

Gin

Ile

Arg

Ala

Thr

Cys

Glu

Glu

Thr

Phe

Leu

Ala

Ile

Lys

Tyr

Val

2S5

290

295

Ala

Ser

Tyr

Val

Leu

Glu

His

Leu

Tyr

His

His

His

His

His

His

Glu

300

305

310

Phe

Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Ile

Ser

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn

315 320 325

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 65:

• ·· ♦ ···

-193- (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN; jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 65

GGATTTGGGG GAGGAACCTG GCTTCTGCTG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin „ jgj—TjYP . i£a (C) POČET VLÁKEN: jedno

---------------(D)—TOPOLOGIE-:—1-i-neá-rn-í----— (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 66

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 67

Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) ' DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina

-194-

(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	j iná nukleová	kys e1ina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č:	: 68
GCAGCAGGAT	AGATTGTTGT AGC			23

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 69 CAATCTATCC TGCTGCTGGG AACTCTCGCG ' ' ~ 30

INFORMACE O SEKVENCI' ID. Č. 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 70

GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGTTCCCAG 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 71:

1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE:

(ii) TYP MOLEKULY:

(xi) POPIS SEKVENCE:

CTATCCTGCT GCTGGGAACT CTAAAGACTG lineární jiná nukleová kyselina

SEKVENCE ID.Č: 71

-195INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 72:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 30 párů baží
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 72
CAATCTATCC	TGCTGCTGGG ACTTCTAAAG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP; nukleová kyselina ——--(-G-)—P0GE-T—VLÁKEN-:—jedno------—-----------——— ------——— (D) TOPOLOGIE:, lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 73

GGAATCAGAT ATTCCTTCGG CTTTGAAC

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 4

GGAATATCTG ATTCCTTGGT C 21

INFORMACE O SEKVENCI IĎ. Č. 75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3'0 páru baží • · · · ·

-196- (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:

jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE:

SEKVENCE ID.Č: 75

CAATCTATCC TGCTGCTGGG TCTTCTAAAG

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno

(ii)	(D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY:	jiná nukleová kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 76
GATTGTTGTA	GCTCCCGGGC		20

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 77

GGAGCTACAA CAATCTATCC TAACGCTGGG 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

L • ·

-19730 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 78

GGAGCTACAA CAATCTATCC TTTCGCTGG

INFORMACE 0 SEKVENCI ID	. Č. 79:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D> TOPOLOGIE: lineární
íii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová	kys e1ina
(xi) GGGTAGATCA	POPIS SEKVENCE: TCATTTGGGA GTACG	SEKVENCE ID.Č:	: 79	25

--INFORMACE-O—SEKVENCI—ID-.,-Č—80-:--- (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 80

CCAAATGATG ATCTACCCTT ACAACTATGC 30

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 81:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 30 párů baží
	(B) TYP: nukleová kyselina
	(C) POČET VLÁKEN: jedno
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	jiná nukleová kyselina
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE ID.Č: 81
CAATCTATCC	TGCTGCTGGG ACTTCTCGCG

-198-

4·	4«	«4	• 4
• · 4 4	4 4	4 *	• «
• 4 4	4	4 4	* 4
« 4 4 4	4	4 44 ·	• 4
• «4	4	4	4
	·· 4 *	• 4	• 4

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 82

CATTTGGGAG TACGAGTGGA TTG

INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP.MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID.Č: 83

CGTACTCCCA AATGATGACT TACCC

Claims (6)

PATENTOVÉNÁROKY

1/17

Obr. 1

Sací Xba1

Xho1

BPT1 BPT2 ► ►

------------1.7—Zpúsob_pří.pr.av.y_mu.tan.tní_£o.rmy_karb.o.xyp.e.pJt.i.dá_zy_B.________ podle nároku 13 vy značující se tím, ^j---------že—zahrnuje—e-xpr-es-i—enz-ymu—v—hos-t-i-te-l-s-k-ýc-h—buňkách------podle nároku 16 a popřípadě alespoň částečnou purifikaci enzymu.

18. Farmaceutická kompozice vy značující se tím, že obsahuje první složku podle libovolného z nároků 9 až 10 a farmaceuticky použitelný nosič nebo ,· ředidlo.

19. Farmaceutická kompozice vy značující se tím, že druhou složku podle libovolného z nároků 9 nebo 11 a farmaceuticky použitelný nosič nebo ředidlo.

20. Způsob přípravy konjugátu vy značující se tím, že zahrnuje navázání cílově specifické skupiny schopné vazby na antigen asociovaný s tumory podle libovolného z nároků 1 až 3 na enzym schopný konvertovat neaktivní prekurzor účinné látky na protinádorovou účinnou látku, přičemž tímto enzymem je zmutovaná forma hostitelské karboxypeptidázy B podle libovolného z nároků 1 nebo 4 až 8.

• ·* • ·· «

-205-

21. Plazmid pCG330 uložený u Národní sbírky průmyslových a mořských bakterií (NCIMB) po přístupovým číslem NCIMB 40694.

22. Nukleotidová sekvence vy značující se tím, že odpovídá Sekvenci id.č.: 39 od pozice 109 dopředu nebo její mutantní formě kódující cysteinový zbytek na pozici 243.

23. Způsob přípravy lidské karboxypeptidázy B nebo její mutantní formy s cysteinovým zbytkem na pozici 243 vy značující se tím, že zahrnuje expresi nukleotidové sekvence odpovídající Sekvenci ______ id.č.: 39 od pozice 109 dopředu nebo její mutantní_________ formě kódující cysteinový zbytek na pozici 243 v hostitelském organismu.

24. Způsob ošetření nádorových buněk v hostitelském organismu vyznačující se tím, že zahrnuje administraci účinného množství první složky do hostelského oragismu, přičemž je této složce ponechán čas dostatečný k vymizení z krevního řečiště a dále pak administraci účinného množství druhé složky, přičemž obě složky jsou součástí systému podle libovolného z nároků 9 až 11.

i • *· »· φφ ♦ · ·· • · φ · * · · · φ · φ · • φ «φ φ φφφφ • * φφ φ φ φ φφφφ φ φφ φφφ φφφ •••φφφ φφ φφφφ φφ φφ

1. Konjugát vy značující se tím, že je pro člověka v podstatě neimunogenní a sestává z cílově specifické skupiny schopné vazby na antigen asociovaný s tumory, která je navázána na zmutovanou formu enzymu karboxypeptidázy B, schopnou konvertovat neaktivní prekurzor účinné látky na protinádorovou účinnou látku, přičemž tento neaktivní prekurzor v podstatě není, v člověku přirozeně se vyskytujícími enzymy, konvertován na protinádorovou účinnou látku.

2/17

Obr. 2

1279

--►

676

1280 • ·44· Μ • 4 · 4 · 4 44 • 44>4 • 4 4 4 44 • 4 4 44 *4« 4444 ··4*44

2._Konjugát podle nároku 1 vy značující se __ t í m , že cílově specifickou skupinou je protilátka.

3/17

Obr. 3

3. Konjugát podle nároku 2 vy značující se tím, že protilátkou je F(Ab')_z fragment protilátky.

-4—

A

1206

337

4 44 • 4·♦

1281

677

-..... - ...» konec

336 ►

maturovaný protein pBiuesciipt i’

285

B ⁶⁷⁹

4 44444

4 44 4

4 · 44

4 44«

4. Konjugát podle libovolného ž nároků 1 až 3 vy značující se tím, že enzym je zmutován tak, že došlo ke změně polarity v jeho aktivním místě, takže dokáže štěpit neaktivní prekurzor účinné látky s komplementární polaritou.

5. Konjugát podle nároku 4 vy značující se tím, že ezymem je libovolný z následujících mutantů lidské pankreatické karboxypeptidázy B: lidí^sá pankreatická karboxypeptidáza B, ve které je místo přirozeně se vyskytující aminokyseliny Asp na pozici 253 libovolná z aminokyselin Arg, Asn, Gin nebo Lys, přičemž tato substituce může být zkombinována s jednou nebo více substitucemi vybranými z:

»♦

-200- přirozeně se vyskytující aminokyselina Gin na pozici

54 je nahrazena Arg, Lys nebo Asn;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Asp na pozici

145 je nahrazena Val, Leu, Ile nebo Ala;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ile na pozici

201 je nahrazena Ser nebo Thr,· přirozeně se vyskytující aminokyselina Ser na pozici .205 je nahrazena Asn, Gin, His, Lys nebo Arg;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ile na pozici

245 je nahrazena Ser, Thr, Ala, Val, Leu, Asn, Gin,

---- —Lysy—Ηϊ-s-nebo—Arg-;·--—........ - ..................... — - _ přirozeně se vyskytující aminokyselina Ala na pozici

248 je nahrazena Asn, Gin, Lys, Arg, His, Ser nebo Thr ;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Gly na pozici 251 je nahrazena Thr, Asn, Ser, Gin, His, Lys, Arg, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Ala nebo norelucinem;

a přirozeně se vyskytující aminokyselina Cys na pozici’ 288 je nahrazena Ser, Thr, Ala, Val, Leu nebo Ile.

6. Konjugát podle nároku 4 vy značující se tím, že ezymem je libovolný z následujících mutantů lidské pankreatické karboxypeptidázy 8: lidská pankreatická karboxypeptidáza B, ve které je místo přirozeně se vyskytující aminokyseliny Asp na pozici 253 libovolná z aminokyselin Arg nebo Lys a místo přirozeně se vyskytující aminokyseliny Gly na pozici 251 je libovolná z aminokyselin Thr, Asn, Ser, Gin, Lys nebo Val, přičemž tato substituce může být zkombinována s jednou nebo více substitucemi vybranými z :

-201- *· ·· • · ·

9 · • toto * • · · «* to··· ♦ · · • 4 ·« přirozeně se vyskytující aminokyselina Gin na pozici 54 je nahrazena Arg;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Asp na pozici 145 je nahrazena Ala;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ile na pozici 201 je nahrazena Ser;.

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ser na pozici 205 je nahrazena Asn;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ile na pozici 245 je nahrazena Ser, Ala nebo His;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ala na pozici 248 je nahrazena His, Ser nebo Asn;_________________ a přirozeně se vyskytující aminokyselina Cys na pozici 288 je nahrazena Ser nebo Ala.

7. Konjugát podle nároku 4 vy značující se tím, že ezymem je libovolný z následujících mutantů lidské pankreatické karboxypeptidázy B: lidská pankreatická karboxypeptidáza B, ve které je místo přirozeně se vyskytující aminokyseliny Asp na pozici 253 libovolná z aminokyselin Arg nebo Lys a místo přirozeně se vyskytující aminokyseliny Gly na pozici 251 je libovolná z aminokyselin Thr, Asn nebo Ser, přičemž tato substituce muže být zkombinována s jednou nebo více substitucemi vybranými z:

přirozeně se vyskytující aminokyselina Gin na pozici 54 je nahrazena Arg;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Asp na pozici 145 je nahrazena Ala;

-202-

• ·· 9« « · • * • 9 4 • 4 4 • • 4 * 4 • • * 4 99 · 1«·· 44

·· ·· 94 • · · 4 * • • 4 4 • 9 • 9 99 9 • 9 4 4 9 ··♦· «9 44

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ile na pozici 201 je nahrazena Ser;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ser na pozici 205 je nahrazena Asn;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ile na pozici 245 je nahrazena Ala;

přirozeně se vyskytující aminokyselina Ala na pozici 248 je nahrazena Ser nebo Asn;

a přirozeně se vyskytující aminokyselina Cys na pozici 288 je nahrazena Ser.

_______

8 Konjuqát podle nároku 4 vy značující se tím, že ezymem je libovolný z následujících mutantů lidské pankreatické karboxypeptidázy B:

D253K; D253R; [G251N,D253K]; [G251T,D253K];

[G251S, D253K] ; [G251T,..D253R] ; [A248S, G251T, D253K] ;

[A248N,G251N,D253K]; [A248S,G251N,D253K] nebo [S2OSN, G251N, D253K] .

9. Dvousložkový systém připravený pro použití v hostitelském organismu vy značující se tím, že jednotlivé složky sestávají z:

(i) cílově specifické skupiny schopné vázat se na antigen asociovaný s tumory, která je navázána na karboxypeptidázu B schopnou konverze neaktivního prekurzoru účinné látky na protinádorovou účinnou látku a;

(ii) neaktivního prekurzoru účinné látky, který může být činností enzymu konvertován na protinádorovou účinnou látku;

přičemž: • ·

-203karboxypeptidáza je mutentní formou lidské karboxypeptidázy B;

první složka je v hostitelském organismu v podstatě neimunogenní; a neaktivní prekurzor účinné látky v podstatě není v hostitelském organismu konvertován na protinádorovou účinnou látku přirozeně se vyskytujícími enzymy.

10. Dvousložkový systém podle nároku 9 vy značující se tím, že první složkou je konjugát podle libovolného z nároků 1 až 8 a systém je — ................................—---vytvoře n—p ro~p ou z ití—v_ li d s k é m_ho s.t .i.t.e.l.i ......................

11. Dvousložkový systém podle ríbovolňeho z nároku^-9^—a~ro vy značující se tím, že druhá složka obsahuje libovolný z neaktivních prekurzorů účinné látky podle nároků 12b) nebo 12d).

12. ' Libovolná z následujících sloučenin nebo jejich farmaceuticky použitelná sůl:

a) N-(4-{4 -[bis- (2-chlorethyl) -amino) -3-methyl -fenoxy} -benzoyl) -L- alanin;

b) N-[N-{4-(4- [bis-(2-chlorethyl) -amino] -3-methyl -fenoxy} -benzoyl) -L- alanin] -L- glutamová kyselina;

c) N-(4-{4- [bis-(2-chlorethyl) -amino]-fenoxy} -benzoyl) -L- alanin; nebo

d) N-[N-(4-{4- [bis-(2-chlorethyl) -amino)-fenoxy} -benzoyl)-L-alanin] -L-glutamová kyselina.

13. Mutantní forma enzymu karboxypeptidázy B podle libovolného z nároků 4 až 8.

• 9

-204-

14. Polynukleotidová sekvence vy značující se tím, že kóduje mutantní formu karboxypeptidázy B podle nároku 13.

15. Vektor vy značující se tím, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci podle nároku 14.

16. Hostitelská buňka vy- značující se tím, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci podle nároku 14.

6/17 • · · · * · ·! · · • * · * • · · ** 9 · *·* « · ·J « · · « 9·«· · · «· Složení růstového média Složka Koncentrace v deionizované (g/1) vodě dihydrogenfosforečnan draselný 3,0 hydrogenfosforečnan sodný 6,0 chlorid sodný 0,5 hydrolyzovaný kasein 2,0 síran amonný 10,0 glycerol 35,0 kvasničný extrakt 20,0 heptahydrát síranu hořečnatého 0,5 dihydrát chloridu vápenatého 0,03 thiamin 0,008 heptahydrát síranu železnatého 0,04 kyselina citrónová 0,02 roztok stopových prvků (TES) 0,5 ml/1 hydrochlorid tetracyklinu . . 0,01 Roztok stopových prvků (TES) Složka ’ Koncentrace v deionizované (mg/10 ml) voda·. . · hexahydrát chloridu hlinitého 2,0 hexahydrát chloridu kobaltnatého. 0,8 dodekahydrát síranu draselno-chromitého .0,2 dihydrát chloridu mědi 0,2 . kyselina boritá 0,1 iodid draselný 2,0 monohydrát síranu manganu .2,0 hexahydrát síranu niklu 0,09 dihydrát molybdenanu sodného 0,4 heptahydrát síranu zinečnatého 0,4

Obr. 6