KR101288027B1 - 양이온 계면활성제를 이용한 단백질 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 단백질 및 오염 단백질을 포함하는 혼합물을 오염 단백질이 선택적으로 침전되도록 하는 효과적인 양의 양이온 계면활성제와 접촉시키는 단계 및 상기 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하여, 표적 단백질 및 오염 단백질을 포함하는 혼합물로부터 상기 표적 단백질을 정제시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 정제된 단백질이 또한 제공된다.

Description

양이온 계면활성제를 이용한 단백질 정제 방법 {PURIFICATION OF PROTEINS WITH CATIONIC SURFACTANT}
발명의 분야
본 발명은 계면활성제를 이용한 단백질 정제 분야에 관한 것이다.
배경
생물학적 거대분자, 특히 단백질의 생성은 종종 물리적 및 물리화학적 특성에 기초한 순도 향상 단계를 포함한다. 이러한 방법의 단계에서 조우되는 난점은 비제한적인 예로서, 가용성 및 불용성 분자의 분리를 가능케 하는 조건을 결정하는 것, 처리 단계 후의 요망되는 분자의 비교적 낮은 회수, 상기 방법의 과정에서의 생물학적 활성의 손실, 및 pH와 같은 상기 방법 단계 조건에 대한 단백질의 민감성을 포함한다.
생물학적 거대분자의 처리에서 계면활성제가 이용되어 왔다. 양이온 계면활성제는 인정된 계면활성제 서브클래스로, 이는 양친매성 암모늄 화합물을 포함한다. 양친매성 암모늄 화합물은 화학식 QN+의 사차 암모늄 화합물 및 화학식 RNH3 +의 파리핀 사슬 일차 암모늄 화합물을 포함한다. 두 유형의 양친매성 암모늄 화합물은 긴 지방족 사슬, 바람직하게는 6개 이상의 탄소 원소를 지니는 장쇄 암모늄 계면활성제를 포함한다 [Scott (1960) Methods Biochem. Anal. 8:145-197, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨]. 장쇄 사차 암모늄 계면활성제는 흥미로운 생물학적 거대분자로 공지되어 있다. 장쇄 사차 암모늄 화합물은 질소에 하나 이상의 치환기를 지니고, 이는 6 내지 20개의 탄소 원자를 지닌 선형 알킬 사슬로 구성된다. 이러한 부류의 가장 널리 공지된 대표화합물은 벤즈알코늄염 (클로라이드 및 브로마이드), 헥사데실피리디늄 클로라이드 디퀄리늄 (dequalinium) 아세테이트, 세틸디메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 및 헥사데실피리디늄 클로라이드 (CPCl), 및 벤제토늄 클로라이드이다. 사차 암모늄 계면활성제는 염, 예를들어 세틸 피리디늄염, 예를들어 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC), 스테아르아미드-메틸피리디늄염, 라우릴 피리디늄염, 세틸 퀴놀리늄염, 라우릴 아미노프로피온산 메틸 에스테르염, 라우릴 아미노 프로피온산 금속염, 라우릴 디메틸 베타인 스테아릴 디메틸 베타인, 라우릴 디히드록시에틸 베타인 및 벤제토늄염을 포함한다. 알킬 피리디늄염은 스테아릴-트리메틸 암모늄염, 알킬-디메틸벤질-암모늄 클로라이드, 및 디클로로-벤질디메틸-알킬암모늄 클로라이드를 포함한다.
생물학적 거대분자를 정제시키기 위한 양이온 계면활성제의 공지된 용도는 1) 단백질 응집체를 포함하는 응집체의 용해; 2) 크로마토그래피 컬럼에 결합된 생물학적 거대분자의 용리; 및 3) 히알루론산 (HA), 핵산, 및 헤파린 (및 다음이온 (polyanion)과 함께 침전되는 분자)과 같은 다음이온의 침전을 포함한다.
양이온 계면활성제가 단백질 응집체를 용해시키기 위해 사용되어 왔다. 오타 및 베르티니 (Otta and Bertini; (1975) Acta Physiol. Latinoam. 25:451-457, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨)는 활성 요산분해효소가 사차 암모늄 계면활성제인 히아민 (Hyamine) 2389를 이용하여 설치류의 간 퍼옥시좀으로부터 용해될 수 있음을 입증하였다. 암모늄 계면활성제 농도의 증가는 요산분해효소 (효소적 활성에 기초함) 및 전체 단백질 둘 모두의 용해를 증가시켜, 전체 단백질 양에 대한 요산분해효소 단백질의 상대량에 증가가 없다는 것이 밝혀졌다. 즉, 전체 단백질에 대한 요산분해효소 단백질의 선택적 용해는 존재하지 않고, 상기 요산분해효소 단백질은 양이온 계면활성제를 이용한 용해 후에 전체 단백질에서 보다 높은 백분율을 구성하지 않는다. 따라서, 상기 방법에서, 명백하게 전체 단백질 함량에 대한 요산분해효소 순도는 사차 암모늄 계면활성제 용해의 결과로서 향상되지 않는다.
또 다른 연구에서, 트러스코 (Truscoe; (1967) Enzymologia 33:1 19-32, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨)는 소의 신장 분말로부터의 뇨산염 산화효소 (요산분해효소)를 추출하는 일단의 양이온, 음이온, 및 중성 세제의 추출 효능에 대해 연구하였다. 중성 및 음이온 세제는 가용성 뇨산염 산화효소 활성을 향상시키는 것으로 밝혀진 반면, 양이온 세제, 예를들어 사차 암모늄염은 농도가 증가할수록 전체 효소 활성이 감소하는 것으로 밝혀졌다. 상기 연구자들은 양이온 세제가 소의 신장 뇨산염 산화효소를 정제시키는데 유용하지 않은 것으로 결론내렸다.
대장균 (E. coli) 봉입체 또는 세포로부터의 재조합 단백질, 돼지 성장 호르몬, 메티오닐-돼지 성장 호르몬, 감염성 점액낭병 바이러스 단백질, B-갈락토시다아제 융합 단백질의 용해는 양이온 계면활성제를 이용한 미국 특허 제4,797,474호, 미국 특허 제4,992,531호, 미국 특허 제4,966,963호, 및 미국 특허 제5,008,377호에 기재되어 있으며, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 알칼리 조건하에서의 용해는 세틸트리메틸암모늄 클로라이드, 혼합된 n-알킬 디메틸 벤질암모늄 클로라이드, CPC, N,N-디메틸-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페녹시]에톡시]에틸]벤젠메탄암모늄 클로라이드, 테트라데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 도데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하는 사차 암모늄 화합물을 이용하여 달성된다. 상기 간행물은 각각의 용해 방법 후, 용액이 원심분리되고, 각각의 경우에서 펠렛이 관찰되지 않거나 거의 관찰되지 않았다고 기재하고 있다. 이러한 관찰은 대부분 또는 모든 단백질이 표적 단백질의 용해에 대한 선택성과 관계없이 용해되는 것을 암시한다. 회수된 단백질의 순도는 나타내지 않았다. 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제5,929,231호에는 전분을 포함하는 과립 및 응집체의 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC) 분해가 기재되어 있다. 따라서, 종래 분야는 특정한 생물학적 거대분자의 일반적이고 비특이적인 용해를 위한 양이온 계면활성제의 용도에 관한 것이다. 이러한 종래 분야의 방법에는 양이온 계면활성제를 이용하여 전체 단백질에 대한 요망되는 표적 단백질의 순도를 증가시키는 것이 기술되어 있지 않다.
양이온 계면활성제는 또한 양이온 교환 수지 또는 알루미늄 함유 애쥬번트에 흡착된 생물학적 거대분자를 용리시키기 위해 사용되어 왔다 (Antonopoulos, et al. (1961) Biochim, Biophys. Acta 54:213-226; Embery (1976) J. Biol. Buccale 4:229-236; and Rinella, et al. (1998) J. Colloid Interface Sci. 197:48-56, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨). 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제4,169,764호에는 매우 다양한 양이온 계면활성제 용액을 이용한 카르복시메틸 셀룰로오스 컬럼으로부터의 우로키나아제의 용리가 기재되어 있다. 상기 저자는 하나의 알킬기가 20개 이하의 탄소 원자의 고급 알킬기이고, 나머지가 6개 이하의 탄소 원자의 저급 알킬기인 사치환된 (tetra substituted) 암모늄염을 이용하는 것을 선호한다고 언급하고 있다. 이러한 양이온 계면활성제의 용도는 고형 매트릭스에 부착으로부터 생물학적 거대분자를 분리하는 것을 가능케 한다.
역으로, 양이온 계면활성제를 이용한 나일론으로 구성된 것과 같은 필터의 함침은 다당류 또는 핵산의 고정을 가능케 한다 (Maccari and Volpi (2002) Electrophoresis 23:3270-3277; Benitz, et al. (1990) United States Patent No. 4,945,086; Macfarlane (1991) United States Patent No. 5,010,183, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨). 이러한 현상은 명백하게 다음이온의 침전을 가능케 하는 양이온 계면활성제-다음이온 상호작용으로 인한 것이다.
화학식 QN+의 사차 암모늄 화합물 및 화학식 RNH3 +의 파라핀 사슬 일차 암모늄 화합물을 포함하는 양친매성 암모늄 화합물은 규정된 조건하에서 다음이온을 침전시킬 수 있다는 것이 널리 확립되어 있다 (참조: Scott (1955) Biochim. Biophys. Acta 18:428-429; Scott (1960) Methods Biochem. Anal. 8:145-197; Laurent, et al., (1960) Biochim. Biophys. Acta 42:476-485; Scott (1961) Biochem. J. 81:418-424; Pearce and Mathieson (1967) Can. J. Biochemistry 45:1565-1576; Lee (1973) Fukushima J. Med. Sci, 19:33-39; Balazs, (1979) United States Patent No. 4,141,973; Takemoto, et al., (1982) United States Patent No. 4,312,979; Rosenberg (1981) United States Patent No. 4,301,153; Takemoto, et al., (1984) United States Patent No. 4,425,431; d'Hinterland, et al., (1984) United States Patent No. 4,460,575; Kozma, et al. (2000) Mol. Cell. Biochem. 203:103-112, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨). 이러한 침전은 높은 다음이온 전하 밀도 및 높은 분자량을 지니는 침전되는 종에 좌우된다 (Saito (1955) Kolloid-Z 143:66, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨). 염의 존재는 양이온 계면활성제에 의해 유도된 다음이온의 침전을 방해하거나 전환시킬 수 있다.
또한, 다음이온은 알칼리 pH 조건하에서 단백질 오염물을 함유하는 용액으로부터 차별적으로 침전될 수 있다. 상기 경우에, 다음이온에 화학적으로 결합하지 않는 단백질은 용액에 잔류하는 반면, 다음이온 및 다음이온에 결합한 기타 분자는 침전될 것이다. 예를들어, 다당류 및 핵산과 같은 다음이온의 침전은 다음이온과 상호작용하는 프로테오글리칸 및 단백질과 같은 분자의 공동침전에 의해 달성된다 (Blumberg and Ogston (1958) Biochem. J. 68:183-188; Matsumura, et al., (1963) Biochim. Biophys. Acta 69: 574-576; Serafini-Fracassini, et al. (1967) Biochem. J. 105:569-575; Smith, et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:11046-11051; Fuks and Vlodavsky (1994) United States Patent No.5,362,641; Hascall and Heinegard (1974) J. Biol. Chem. 249:4232-4241, 4242-4249, and 4250-4256; Heinegard and Hascall (1974) Arch. Biochem. Biophys. 165: 427-441; Moreno, et al. (1988) United States Patent No. 4,753,796; Lee, et al. (1992) J. Cell Biol. 116: 545-557; Varelas, et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 321: 21-30, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨).
단백질의 등전점 (또는 pI)은 단백질이 동등한 수의 양성 및 음성 전하를 지니는 pH이다. 단백질의 등전점에 가까운 (특히 이의 아래) pH 값을 지니는 용액 조건하에서, 단백질은 헤파린과 같은 강한 산성 다음이온과 함께 안정한 염을 형성할 수 있다. 상기 다음이온의 침전을 촉진시키는 조건하에서, 다음이온과 복합된 단백질이 또한 침전된다 (LB Jaques (1943) Biochem. J. 37:189-195; AS Jones (1953) Biochim. Biophys. Acta 10:607-612; JE Scott (1955) Chem and Ind 168-169; United States Patent No. 3,931,399 (Bohn, et al., 1976) and United States Patent No. 4,297,344 (Schwinn, et al, 1981), 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨).
미국 특허 제4,421,650호, 미국 특허 제5,633,227호, 및 스미드 등의 문헌[Smith, et al.; (1984) J. Biol. Chem. 259:11046-11051, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨]에는 양이온 계면활성제 및 암모늄 설페이트 (다음이온-양이온 계면활성제 복합체의 해리를 가능케 함)를 이용한 순차적 처리 및 이후의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 분리에 의한 다음이온의 정제가 기술되어 있다. 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 유럽 특허 공개 EP055188호에는 지질다당류로부터의 RTX 독소의 양이온 계면활성제에 의해 가능한 분리가 기술되어 있다. 그러나, 내독소 활성 분석에 의해 정량되는 지질다당류의 양에서 질량 균형은 존재하지 않는다. 강한 상호작용 양이온 화합물에 의한 내독소 활성의 중성화가 입증되어 있다 (Cooper JF (1990) J Parenter Sci Technol 44:13-5, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨). 따라서, EP055188호에서, 증가하는 양의 양이온 계면활성제를 이용한 처리 후의 침전물에서의 내독소 활성의 결핍은 계면활성제-지질다당류 복합체 형성에 의한 활성의 중성화로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 언급된 방법은 매개 다음이온, 고형 지지체, 또는 양이온 계면활성제를 이용하여 가용성 단백질의 정제를 가능케 하는 양이온 계면활성제에 의해 선택적 가용성을 지닌 단백질을 포함하는 응집체를 필요로 한다. 그러므로, 종래 분야는 단백질을 표적 단백질이 아닌 단백질, 즉 오염 단백질을 선택적으로 침전시키기에 효과적인 양의 양이온 계면활성제와 접촉 (특히, 이러한 접촉은 매개 다음이온, 고형 지지체, 또는 단백질의 집합체의 부재하에서 수행됨)시킴으로써 표적 단백질을 정제시키는 방법을 제공하지 않는다. 종종, 당업자는 가용성 단백질의 혼합물과 조우하게 되는데, 당업자는 요망되는 단백질을 정제시키기 위한 간단하고 효과적인 수단을 지니지 않는다. 본원에 기술된 단백질을 정제시키기 위한 신규한 방법은 표적 단백질이 아닌 단백질을 선택적으로 침전시키기 위한 양이온 계면활성제를 이용함으로써 표적 단백질의 효율적인 정제를 가능케 한다. 바람직하게는, 이러한 오염 단백질의 침전은 직접적이고, 이는 다음이온, 고형 지지체, 또는 오염 단백질 및 기타 분자를 포함하는 응집체의 존재에 좌우되지 않는다.
발명의 개요
본 발명은 표적 단백질 및 오염 단백질을 포함하는 혼합물을 상기 오염 단백질이 선택적으로 침전되기에 유효한 양의 양이온 계면활성제에 노출시키는 단계 및 상기 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하여, 상기 혼합물로부터 표적 단백질을 정제시키는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 요산분해효소 활성 및 순도에 대한 CPC 농도의 효과를 도시한다.
용해된 대장균 봉입체로부터의 포유동물 요산분해효소의 단백질 농도 (A) 및 효소 활성 (B)은 지정된 CPC 처리 및 원심분리 후에 측정된다. 각각의 분리물의 특정 활성 (C)을 활성/단백질 농도의 값의 비로 계산하였다.
도 2는 0.075% CPC의 처리 후의 봉입체로부터 제조된 미정제 포유동물 요산분해효소의 크기배제 HPLC 크로마토그래피 분석을 도시한다.
CPC를 처리하지 않은 용해된 대장균 봉입체 (A), 및 CPC (0.075%) 침전 및 여과 후의 상층액 (B)의 크기배제 HPLC 프로파일이 분석된다. 각각의 피크 영역 및 전체 영역의 백분율은 인접한 표에 요약되어 있다.
도 3은 CPC 처리된 요산분해효소의 SDS-PAGE (15% 젤) 분석을 도시한다.
요산분해효소 함유 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된다. 다양한 과정의 단계로부터의 샘플이 하기와 같이 분취되었다: 레인 1 - 용해된 IB; 레인 2 - CPC 처리 후의 상층액; 레인 3 - CPC 처리 후의 펠렛.
도 4는 0.02% CPC 처리 후의 미정제 scFv 항체의 크기배제 HPLC 분석을 도시한다.
재폴딩 및 CPC (0.02%) 침전 및 여과 후의 참고 표준 BTG-271 scFv 항체 (A), 용해된 봉입체 (B), 및 상층액 (C)의 크기배제 HPLC 프로파일이 분석된다. 각각의 피크 영역 및 전체 영역의 백분율은 인접한 표에 요약되어 있다.
도 5는 CPC 처리된 scFv 항체의 SDS-PAGE (15% 젤) 분석을 도시한다.
다양한 과정의 단계로부터의 scFv 항체 함유 샘플 및 표준은 하기 순서이다: 레인 1 - 분자량 표준; 레인 2 - 용해된 IB; 레인 3 - 재폴딩된 단백질; 레인 4 - CPC 펠렛; 레인 5 - CPC 처리 후의 상층액.
도 6은 CPC 처리 전 및 후의 인터페론 베타의 HPLC 젤 여과 크로마토그래피를 도시한다.
A. CPC 처리 전
B. CPC 처리 후
0.1 mg/ml 인터페론 베타의 200㎕ 용액이 컬럼에 로딩되었다.
발명의 상세한 설명
단백질은 양성 및 음성 전하 둘 모두를 지니는 양성(兩性)전해질이다. 단백질과 상호작용하는 용액 및 하전된 분자의 pH는 이러한 단백질의 순하전 (net charge)에 영향을 준다. 단백질 사이의 강한 상호작용은 단백질의 순하전이 중성 (등전점)인 경우에 발생한다. 용액의 pH가 단백질의 등전점 아래인 경우, 단백질은 순 양성 전하를 지니고, 기타 단백질을 포함하는 양이온 분자 사이에 정전기적 반발이 존재할 수 있다.
본 발명의 목적은 표적 단백질 및 오염 단백질의 용해된 혼합물을 유효량의 양이온 계면활성제와 접촉시키고 상기 표적 단백질을 회수하는 것을 포함하여, 표적 단백질 및 오염 단백질의 혼합물을 포함하는 용액으로부터 용해된 표적 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 양이온 계면활성제는 양성 전하를 지니는 표면 활성 분자이다. 일반적으로, 이들 화합물은 또한 비극성 지방족기를 지닌다. 바람직하게는, 표적 단백질은 7을 초과하는 등전점을 지닌다. 한 특정 구체예에서, 용액의 pH는 표적 단백질의 등전점과 대략 동일하다. 한 바람직한 구체예에서, 용액의 pH는 표적 단백질의 등전점 미만이다. 한 특정 구체예에서, 용액의 pH가 표적 단백질의 등전점을 초과하는 경우, 용액의 pH는 표적 단백질의 등전점의 1-2 pH 단위 이내이다. 한 특정 구체예에서, 용액의 pH가 표적 단백질의 등전점을 초과하는 경우, 용액의 pH는 표적 단백질의 등전점의 1 pH 단위 이내이다.
한 특정 구체예에서, 오염 단백질 (단백질들)은 선택적으로 침전됨으로써, 표적 단백질인 용액에 잔류하는 단백질의 비율이 증가한다. 예를들어, 표적 단백질이 용액 내의 전체 단백질의 20%인, 표적 단백질 및 오염 단백질의 용액으로부터 출발하여, 당업자는 표적 단백질이 용액 내에 잔류하는 전체 단백질의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상인 용액이 달성되도록 하는 상기 방법을 이용하여 표적 단백질을 정제할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "선택적 침전"은 단백질 또는 단백질 그룹이 또 다른 단백질 또는 단백질 그룹보다 많은 범위로 침전되는 것을 의미한다. 예를들어, 단백질 및 오염 단백질의 혼합물의 경우에서, 오염 단백질은 20% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면 20% 미만의 표적 단백질이 침전되는 경우에 표적 단백질에 비해 선택적으로 침전된다. 바람직하게는, 높은 퍼센트의 오염 단백질은 침전되는 반면, 낮은 퍼센트의 표적 단백질이 침전된다. 바람직한 구체예에서, 30% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 30% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 40% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 40% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 50% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 50% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 60% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 60% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 70% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 70% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 80% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 80% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 90% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 90% 미만의 표적 단백질이 침전되고; 95% 이상의 오염 단백질이 침전되는 반면, 95% 미만의 표적 단백질이 침전된다. 바람직하게는, 작은 백분율의 표적 단백질이 침전된다. 예를들어, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 표적 단백질이 침전된다.
한 특정 구체예에서, 본 발명의 정제 방법을 수행하기 전의 용액 내의 단백질의 전체량 (표적 단백질 + 오염 단백질)은 0.1 내지 10 mg/ml이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 정제 방법을 수행하기 전의 용액 내의 단백질의 전체량은 0.1 내지 3 mg/ml, 0.3 내지 2 mg/ml, 0.5 내지 2 mg/ml, 0.5 내지 1 mg/ml, 1 내지 2 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml이다.
특정 구체예에서, 오염 단백질의 선택적 침전은 직접적이고, 다음이온의 존재에 좌우되지 않거나, 실질적으로 좌우되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 오염 단백질의 선택적 침전은 직접적이고, 고형 지지체의 존재에 좌우되지 않거나, 실질적으로 좌우되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 오염 단백질의 선택적 침전은 오염 단백질과 기타 분자 사이의 응집체의 존재에 좌우되지 않거나, 실질적으로 좌우되지 않는다. 오염 단백질의 선택적 침전은 예를들어 성분 (예를들어, 다음이온, 고형 지지체, 또는 오염 단백질과 기타 분자의 응집체)의 제거가 오염 단백질의 선택적 침전에 각각 영향을 주지 않거나 실질적으로 영향을 주지 않는 경우, 상기 성분에 좌우되지 않거나 실질적으로 좌우되지 않는다. 성분의 제거의 비실질적 영향의 예는 오염 단백질이 성분이 존재하는 경우 및 성분이 존재하지 않는 두 경우 모두에 선택적으로 침전되는 것이다. 하나의 추가예는 성분이 존재하는 경우 및 성분이 존재하지 않는 경우에 동일한 정도로 선택적으로 침전되는 것이다. 바람직하게는, 동일하거나 실질적으로 동일한 양의 오염 단백질은 성분의 존재하에서와 같이 상기 성분의 부재 또는 실질적 부재하에서 침전된다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 다음이온의 부재하 또는 실질적인 양의 다음이온의 부재하에서 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 고형 지지체의 부재하 또는 실질적인 고형 지지체의 부재하에서 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 오염 단백질과 기타 분자 사이의 응집체의 부재하, 또는 오염 단백질과 기타 분자 사이의 실질적인 양의 응집체의 부재하에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 방법은 다음이온; 고형 지지체; 및 오염 단백질과 기타 분자 사이의 응집체로 구성된 그룹 중의 두개 또는 세개의 일원의 부재하에서 또는 이들의 실질적인 양의 부재하에서 수행된다.
일단 본 발명의 방법이 제공되면, 특정 표적 단백질의 정제의 효율을 향상시키는 것이 달성되는 과정 하에서, 사용되는 특정 계면활성제 및 조건, 예를들어 pH, 온도, 염도, 양이온 계면활성제 농도, 전체 단백질 농도를 선택하는 것은 당업자에게 통상적인 일이다. 예를들어, 다양한 pH 값 및 계면활성제 농도에서 수행된 정제가 최적 정제 조건을 확립하기 위해 비교될 수 있다. 이러한 방법의 예는 하기의 실시예 구획에 제공된다. 한 특정 구체예에서, 용액의 pH는 회수되는 표적 단백질의 양을 실질적으로 감소시키지 않으면서 가능한 한 높게 선택된다.
본 발명의 하나의 추가 목적은 양이온 계면활성제에 의해 영향을 받는 바와 같은 용해도의 기초하여 표적 단백질의 효과적인 정제를 가능케 하는 조건을 결정하는 방법을 제공하는 것이다.
양이온 계면활성제의 유효량은 오염 단백질의 선택적 침전을 야기시키는 계면활성제의 양이다. 특정 구체예에서, 계면활성제의 유효량은 오염 단백질의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 침전시킨다.
본 발명의 한 구체예에서, 양이온 계면활성제는 0.001% 내지 5.0%의 농도로 첨가되고, 바람직하게는 양이온 계면활성제는 0.01% 내지 0.5%의 농도로 첨가되고, 더욱 바람직하게는 양이온 계면활성제는 0.03% 내지 0.2%의 농도로 첨가된다. 특정 구체예에서, 양이온 계면활성제는 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.075%, 0.01% 내지 0.05% 또는 0.01% 내지 0.03%의 농도로 첨가된다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 언급된 방법은 양이온 계면활성제가 양친매성 암모늄 화합물인 경우에 달성된다.
한 바람직한 구체예에서, 용해된 표적 단백질은 오염 단백질이 선택적으로 침전된 후 추가 과정에 적용된다. 이러한 추가 과정은 추가 정제 단계, 활성 또는 농도에 대한 분석, 투석, 크로마토그래피 (예를들어, HPLC, 크기배제 크로마토그래피), 전기영동, 투석 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 양친매성 암모늄 화합물은 QN+ 또는 RNH3 +의 화학식을 지니는 양이온 또는 비극성 성분 둘 모두를 지니는 화합물을 포함한다. Q는 질소가 사차 암모늄 (서로 결합되거나 결합될 수 없는 네개의 유기기에 공유적으로 결된 것임)인 것을 나타낸다. 유기기가 서로 결합되는 경우, 이들은 고리 구조를 형성하는 성분 사이의 결합의 전자 배열에 따라 고리 지방족 또는 방향족 화합물을 형성할 수 있다. 선택된 양친매성 암모늄 화합물이 화학식 RNH3 +를 지니는 경우, 상기 화합물은 R이 지방족기인 일차 아민이다. 지방족기는 열린사슬 유기기이다.
본 발명의 한 구체예에서, 선택된 양친매성 암모늄 화합물은 할라이드와 함께 염을 형성할 수 있다. 일반적으로, 할라이드염은 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드 이온을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 한 구체예에서, 양친매성 암모늄 화합물은 6 내지 20개의 탄소 원자를 지니는 하나 이상의 지방족 사슬을 지니고, 바람직하게는 양친매성 암모늄 화합물은 8 내지 18개의 탄소 원자를 지니는 하나 이상의 지방족 사슬을 지닌다.
본 발명의 한 구체예에서, 선택된 양친매성 암모늄 화합물은 세틸 피리디늄염, 스테아르아미드-메틸피리디늄염, 라우릴 피리디늄염, 세틸 퀴놀리늄염, 라우릴 아미노프로피온산 메틸 에스테르염, 라우릴 아미노 프로피온산 금속염, 라우릴 디메틸 베타인, 스테아릴 디메틸 베타인, 라우릴 디히드록시에틸 베타인 및 벤제토늄염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
사용될 수 있는 양친매성 암모늄 화합물은 헥사데시피리디늄 클로라이드 데퀄리늄 아세테이트, 헥사데실피리디늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드, 혼합된 n-알킬 디메틸 벤질암모늄 클로라이드, 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC), N,N-디메틸-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페녹시]에톡스]에틸]벤젠메탄암모늄 클로라이드, 알킬-디메틸벤질-암모늄 클로라이드, 및 디클로로-벤질디메틸-알킬암모늄 클로라이드, 테트라데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 도데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드, 라우릴 디메틸 베타인 스테아릴 디메틸 베타인, 및 라우릴 디히드록에틸 베타인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 양친매성 암모늄 화합물은 세틸피리디늄염, 예를들어 세틸피리디늄 클로라이드이다.
본 발명의 한 구체예에서, 요망되는 단백질을 함유하는 혼합물은 세포 성분, 예를들어 미생물, 예를들어 대장균과 같은 세균으로부터 유래된 세포 성분을 추가로 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 세포 성분은 하나 이상의 단백질이다.
본 발명의 한 구체예에서, 표적 단백질은 재조합 단백질, 예를들어 효소일 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 항체, 요산분해효소, 인터페론-베타, 거머리 X 인자 억제제, 산 데옥시리보누클레아제 Ⅱ, 엘라스타아제, 리소자임, 파파인, 퍼옥시다아제, 췌장 리보누클레아제, 트립시노겐, 트립신, 시토크롬 c, 에라부톡신, 스태필로코쿠스 아우레우스 장독소 C1, 및 모노아민 옥시다아제 A, 및 알칼리 조건하에서 양성으로 하전되는 기타 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 표적 단백질은 항체, 수용체, 효소, 운반 단백질, 호르몬, 또는 이들의 조합물, 또는 예를들어 이차 단백질 또는 화학 물질 또는 독소에 컨쥬게이팅된 컨쥬게이트일 수 있다.
항체는 비제한적인 예로 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 이특이적 (bispecific) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 및 상기중 임의의 것의 에피토프 결합 단편을 포함하나, 단 정제 조건에서 상기 항체는 양성으로 하전된다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 세포주의 연속 배양에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술이 사용될 수 있다. 이들은 콜러 및 밀스타인의 문헌[Kohler and Milstein, (1975, Nature 256, 495.-497; and U.S. Pat. No. 4,376,110)]의 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030), 및 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이러한 항체는 클로닝하여 개별적 중쇄 및 경쇄를 재조합적으로 발현시키는 것을 기초로 하여 이용될 수 있다. 상개 두개의 사슬은 별개의 발현 및 정제 후에 동일한 세포 또는 조합된 시험관 내에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 요망되는 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩하는 핵산 (예를들어, 플라스미드 벡터 상의 핵산) 또는 요망되는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 분자를 엔코딩하는 핵산은 중합체 단백질의 발현을 위해 별개의 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 항체 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 분자를 발현하는 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 대안적으로, 중쇄 또는 이의 가변 영역을 포함하는 분자 또는 이의 CDR은 임의로 상보적 경쇄 또는 경쇄 가변 영역의 존재 없이 발현되고 사용될 수 있다. 기타 구체예에서, 이러한 항체 및 단백질은 예를들어 C-말단 아미드화 또는 N-말단 아세틸화에 의해 N 또는 C 말단 변형될 수 있다.
키메라 항체는 다양한 부분이 다양한 동물종, 예를들어 뮤린 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 지니는 것으로부터 유래되는 분자이다 (참조: Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; and Boss et al., U.S. Pat. No. 5,816,397.). 키메라 항체를 생성하기 위한 기술은 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱시키는 것을 포함한다 (참조: Morrison, et at., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-6855; Neuberger, et al., 1984, Nature 312, 604-608; Takeda, et al., 1985, Nature 314, 452-454).
인간화된 항체는 비인간종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 지니는 비인간종으로부터의 항체분자이다. 인간화된 항체의 생성을 위한 기술은 예를들어 미국 특허 제5,585,089호 (Queen) 및 미국 특허 제5,225,539호 (Winter)에 기술되어 있다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 정확히 정의되어 있다 (참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983)).
단일 사슬 항체는 아미노산 브릿지를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하여 단일 사슬 폴리펩티드를 발생시킴으로써 형성된다. 단일 사슬 항체를 생성하기 위한 기술은 예를들어 미국 특허 제4,946,778호; 문헌[Bird, 1988, Science 242, 423-426]; 문헌[Huston, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883]; 및 문헌[Ward, et al., 1989, Nature 334, 544-546)]에 기술되어 있다.
이특이적 항체는 두개 유형의 표적, 예를들어 (1) 특정 에피토프 및 (2) "트리거(trigger)" 분자, 예를들어 골수세포 상의 Fc 수용체를 인지하는 유전학적으로 고안된 항체이다. 이러한 이특이적 항체는 화학적 컨쥬게이션, 하이브리도마, 또는 재조합 분자 생물학적 기술에 의해 제조될 수 있다.
항체 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화 브릿지를 감소시킴으로써 생성될 수 있는 F(ab') 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, Fab 발현 라이브러리는 요망되는 특이성을 지닌 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능케 하도록 제작될 수 있다 (Huse, et al., 1989, Science 246, 1275-1281).
본 발명의 한 구체예에서, 단백질은 요산분해효소이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 요산분해효소는 포유동물 요산분해효소이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포유동물 요산분해효소는 변이체 포유동물 요산분해효소이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포유동물 요산분해효소는 돼지 요산분해효소이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 변이체 돼지 요산분해효소는 PKSΔN 요산분해효소로 명명된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 단백질은 항체이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 단일 사슬 항체이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 단백질은 인터페론이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 인터페론은 인터페론 베타이다. 한 특정 구체예에서, 인터페론은 인터페론 베타 1b이다. 문헌[Nagola, S. et al., Nature, 284:316 (1980); Goeddel, D. V. et al., Nature, 287:411 (1980); Yelverton, E. et al., Nuc. Acid Res., 9:731 (1981); Streuli, M. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (U.S.), 78:2848 (1981); European Pat. Application No. 28033, published May 6, 1981; 321134, published July 15, 1981; 34307 published Aug. 26, 1981; and Belgian Patent No. 837379, issued July 1, 1981]에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 베타-인터페론을 생성하는 다양한 방법이 기술되어 있다. 세균 생성된 IFN을 회수하고 정제하는 방법은 문헌[U.S. Pat. Nos. 4,450,103; 4,315,852; 4,343,735; and 4,343,736; and Derynck et al., Nature (1980) 287:193-197 and Scandella and Kornberg, Biochemistry, 10:4447 (1971)]에 기술되어 있다.
한 특정 구체예에서, 표적 단백질은 거머리 Xa 인자 이다. 거머리 Xa 인자는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를들어 미국 특허 제6,211,341호 및 국제 공개 번호 W094/23735호에 기술된 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 접촉은 약 1분 내지 약 48시간, 더욱 바람직하게는 약 10분 내지 약 24시간, 약 30분 내지 약 12시간, 약 30분 내지 약 8시간, 약 30분 내지 약 6시간, 약 30분 내지 약 4시간, 약 30분 내지 약 2시간, 약 30분 내지 약 1시간, 또는 약 1시간 내지 약 2시간 동안 수행된다.
본 발명의 한 구체예에서, 접촉은 약 4℃ 내지 약 36℃; 더욱 바람직하게는 약 4℃ 내지 약 26℃의 온도에서 수행된다.
본 발명은 또한 알칼리 조건하에서 7을 초과하는 등전점을 지니는 단백질을 정제시키기 위한 단일 작용제로서 양이온 계면활성제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 세틸피리디늄 클로라이드를 혼합물에 첨가함으로써 혼합물로부터 알칼리 조건하에서 정제된 요산분해효소를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 요산분해효소는 DNA를 발현시키기 위해 세균 세포를 처리하고, 요산분해효소를 생성시키고, 요산분해효소를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 요산분해효소를 엔코딩하는 DNA를 포함하는 세균 세포로부터 수득된다.
본 발명의 한 구체예에서, 요산분해효소는 세균 세포 내의 침전물로부터 회수된다.
본 발명은 또한 요산분해효소-중합체 컨쥬게이트의 제조에 사용하기 위한 저제된 요산분해효소를 제공한다.
본 발명은 또한 단백질이 양성으로 하전되거나 양성 전하의 영역을 지니는 조건하에서 단백질을 함유하는 혼합물을 유효량의 양이온 계면활성제와 접촉시키고, 단백질을 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득가능한, 7을 초과하는 등전점을 지니는 정제된 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 7을 초과하는 등전점을 지니는 단백질을 정제시키기 위한 세틸피리디늄염의 용도를 제공한다.
pH와 관련하여, 표적 단백질이 양성으로 하전되는 조건하에서 혼합물이 유효량의 양이온 계면활성제와 접촉되는 구체예에서, pH는 표적 단백질의 특성에 따라 다양할 것이다. 그러나, pH는 바람직하게는 약 pH7 내지 pH11이고; 바람직한 범위는 pH7 내지 pH10, pH7 내지 pH9, pH8 내지 pH11, pH8 내지 pH10 또는 pH8 내지 pH9이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 기술되나, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하고자 하는 바가 아니며 이렇게 간주되어선 안된다.
실시예 1. 재조합 포유동물 요산분해효소의 정제를 위한 CPC의 용도
1.1. 백그라운드
약학적 등급의 요산분해효소는 본질적으로 비-요산분해효소 단백질을 포함하지 않아야 한다. 대장균에서 생성된 포유동물 요산분해효소 (8.67의 등전점)는 추가의 정제를 위해 용이하게 단리될 수 있는 봉입체 (IB)로 언급되는 소기관과 유사한 침전물을 세포내에 축적시킨다. IB가 스크램블링된/잘못 폴딩된 발현 단백질을 함유하다는 고전적 시각과는 대조적으로, 이들 IB-유사 성분은 침전된 형태로 정확하게 폴딩된 요산분해효소를 함유한다. 요산분해효소 IB-유사 성분의 알칼리 pH, 예를들어 pH 9-11로의 노출은 침전된 단백질을 재용해시킨다. 용해된 IB-유사 성분 내의 요산분해효소 함량은 약 40-60%였고, 균일한 요산분해효소 제조물을 수득하기 위해 광범위한 정제를 필요로 하였다. 본원에서, 본 발명자들은 다양한 방법에 의해 측정될 수 있는, CPC를 이용한 요산분해효소 및 기타 단백질의 정제를 입증하였다. 예를들어, 포유동물 요산분해효소 순도는 특정 활성, 하기의 전기영동 및 SDS-PAGE 젤의 염색에서 나타나는 밴드의 수, 및 크기 배제 HPLC 후의 크로마토그램에서 나타나는 피크의 수 및 크기를 결정함으로써 측정될 수 있다.
1.2. 재료 및 방법
1.2.1. 50 mM NaHCO 3 완충용액 (pH 10.3)
상기 완충용액을 NaHCO3를 50 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 제조하였다. pH를 10.2 내지 10.4로 조정하였다. 시작 pH에 따라, 0.1 M HCl 또는 1N NaOH를 사용할 수 있다.
1.2.2. 10% CPC 용액
CPC를 증류수에 10 gr/100ml의 최종 농도로 용해시킴으로써 10% CPC를 제조하였다.
1.2.3. 재조합 돼지 요산분해효소 발현
재조합 포유동물 요산분해효소 (요산염 옥시다아제)를 듀크대의 국제 공개 번호 W0 00/08196호 및 미국 특허 가출원 제60/095,489호 (이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이 대장균 K-12 균주 W3110 F-에서 발현시켰다.
1.2.4. 요산분해효소-생성 세균의 배양 및 수거
세균을 카세인 가수분해물, 효모 추출물, 염, 글루코오스, 및 암모니아를 함유하는 성장 배지에서 37℃에서 배양하였다.
배양후, 요산분해효소가 축적된 세균을 원심분리에 의해 수거하고, 잔류 배지를 제거하기 위해 물로 세척하였다.
1.2.5. 세포 분해 및 회수
수거된 세포 펠렛을 50 mM의 트리스 완충용액 (pH 8.0) 및 10 mM의 EDTA에 현탁시켜, 건조 세포 중량 (DCW)의 약 20배의 최종 부피를 생성시켰다. 2000-3000 유닛/ml의 농도로 리소자임을 혼합과 함께 현탁된 펠렛에 첨가하였고, 4-8℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션시켰다.
세포 용해물을 고전단 혼합으로 처리한 후, 음파처리하였다. 현탁액을 동일한 부피의 탈이온수로 희석시키고, 원심분리시켰다. 요산분해효소 봉입체를 함유하는 펠렛을 탈이온수 (w/w)로 희석시키고, 불순물을 추가로 제거하기 위해 원심분리시켰다. 이러한 마지막 세척 단계로부터 수득된 펠렛을 추가의 과정을 위해 비축하였고, 상층액은 폐기하였다.
1.2.6. 용해
봉입체 (IB) 펠렛을 50 mM NaHCO3 완충용액 (pH 10.3±0.1)에 현탁시켰다. 현탁액을 약 0.5 내지 2시간 동안 25±2℃의 온도에서 인큐베이션시켜, IB 유래 요산분해효소를 용해시켰다.
1.2.7. CPC 처리
10% CPC 용액을 강하게 혼합시키면서 균질화된 IB (pH 10.3)에 분취량으로 첨가하여 요망되는 CPC 농도를 수득하였다. 샘플을 침전 플레이크 (flake)가 형성되는 동안 상기 나타낸 바와 같이 1 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 펠렛과 상층액을 분리시키고, 펠렛을 본래 부피로 50 mM NaHCO3 완충용액 (pH 10.3)을 이용하여 현탁시켰다. 각각의 분획의 효소 활성을 결정하고, 분획을 농축시키고, 투석시켜 잔류하는 CPC를 제거하였다.
1.2.8. 단백질 분석
처리된 IB 샘플 및 처리되지 않은 IB 샘플의 분취량의 단백질 함량을 변형된 브래드포드 (Bradford) 방법 (Macart and Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101)을 이용하여 결정하였다.
1.2.9. 요산분해효소 분석
1.2.9.1. 효소 활성
요산분해효소의 활성을 UV 방법에 의해 측정하였다 (Fridovich, I. (1965) The competitive inhibition of uricase by oxonate and by related derivatives of s-triazines. J Biol Chem, 240, 2491-2494; 1mg/ml BSA의 첨가에 의해 변형됨). 요산의 알란토인으로의 산화로부터 발생된 292 nm에서의 흡광도의 감소를 측정함으로써 이중 샘플에서 효소 반응을 결정하였다. 하나의 활성 단위는 특정 조건하에서 25℃에서 분당 요산 1μmole을 산화시키는데 필요한 요산분해효소의 양으로 정의된다. 요산분해효소 효능을 단백질 mg당 활성 단위 (U/mg)로 나타내었다.
1 cm의 경로 길이에서 292 nm에서의 1 mM 요산의 흡광계수는 12.2였다. 따라서, 반응 혼합물 ml당 1 μmole의 요산의 산화는 12.2 mA292의 흡광도의 감소를 야기시켰다. 시간에 대한 흡광도 변화 (분당 ΔA292)를 곡선의 선형 부분으로부터 유도하였다. 이후, 요산분해효소 활성은 하기와 같이 계산된다:
Figure 112007077802948-pct00001
상기 식에서,
DF = 희석 인자
VRM = 반응 혼합물의 전체 부피 (㎕)
VS = 반응 혼합물에서 사용된 희석된 샘플의 부피 (㎕)임.
1.2.9.2. 수퍼덱스 (Superdex) 200을 이용한 HPLC 분석
천연 요산분해효소 뿐만 아니라 가능한 오염물질의 양 및 상대 백분율을 수퍼덱스 200 컬럼을 이용하는 HPLC에 의해 수득된 희석 프로파일에 따라 정량하였다. 요산분해효소 용액의 이중 샘플을 컬럼에 주입하였다. 각각의 피크 영역 및 전체 영역의 백분율을 자동적으로 계산하고, 인접한 표에 요약하였다.
1.2.10. SDS-PAGE 분석
레인당 ~20 g의 단백질을 함유하는 샘플 내의 단백질을 15% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 생성된 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue)로 염색시켰다.
1.3. 결과
상층액에서 회수된 요산분해효소 활성에 대한 CPC (0.005-0.075%) 처리 (1-24시간 동안)의 효과, 및 이의 순도를 표 1 및 도 1에 나타내었다. CPC 처리 (pH 10.3) 전에, 단백질 농도는 1.95 mg/ml이었고, 특정 효소 활성은 3.4 - 4.67 U/mg이었다. 도 1B에 나타낸 결과는 각각의 인큐베이션 기간에서, CPC 농도가 증가함에 따라 상층액의 단백질 농도가 감소하는 것을 나타낸다. 0.04% 미만의 CPC에서, 단백질 농도에 대해 상대적으로 경미한 효과가 관찰되었다. 0.04% 내지 0.075%의 농도의 CPC는 단백질 농도를 본래 농도의 약 50%로 감소시켰다.
전체 단백질 농도에 대한 CPC의 효과와는 대조적으로, 전체 가용성 요산분해효소 활성은 CPC 농도 및 인큐베이션 시간의 증가에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다 (도 1A). 각각의 인큐베이션 기간 내에서, 특정 효소 활성 (도 1C)은 CPC 농도의 함수로 0.04% 내지 0.075%의 범위 내로 지속적으로 증가하였다. 이러한 증가는 비-요산분해효소 단백질의 특이적 제거의 결과이다. 최종 정제된 효소의 특이적 효소 활성은 약 9 U/mg이므로, 대부분의 오염 단백질은 CPC 침전에 의해 제거되었다. 또한, 수행된 HPLC 및 SDS-PAGE 분석은 이러한 결론을 뒷받침한다.
표 1. 요산분해효소 특이적 활성 및 순도에 대한 CPC 노출의 영향
Figure 112007077802948-pct00002
1.4. 요산분해효소 순도의 CPC 향상의 확증
섹션 1.3에서와 같이 요산분해효소 함유 IB를 분리시키고, 용해시켰다. 가용성 물질의 샘플을 CPC 처리 전 및 CPC-침전된 단백질의 침윤 후에 분석하였다.
1.4.1. 0.075% CPC 처리 후의 비-요산분해효소 단백질의 HPLC 분석
용해된 IB의 HPLC 분석은 요산분해효소 관련 피크 (유지 시간 (RT) ~25.5분)가 미정제 IB 샘플의 단백질의 약 46%를 포함함을 나타내었다 (도 2A). CPC 처리후, 요산분해효소 관련 피크는 단백질의 약 92%로 증가하였고 (도 2B), RT 15 내지 22분 사이로 산출된 오염물의 유의한 감소를 수반하였다 (도 2A). 요산분해효소 피크 영역은 도 2A의 영역의 약 70%였다. 따라서, 이러한 결과는 요산분해효소 순도의 배가가 CPC 처리 후의 비-요산분해효소 단백질의 제거로부터 발생한 것임을 나타낸다.
1.4.2. 효소 활성에 대한 0.075% CPC의 효과
결과 (표 2에 나타냄)는 요산분해효소 활성의 질량 균형이 처리 과정 동안 유지됨을 나타낸다. CPC 노출은 용액 내의 전체 단백질의 60%를 침전시킨 것으로 밝혀졌다. 효소 활성의 85% 이상이 용액에서 유지되었고, 따라서 외래 단백질의 제거는 생성된 상층액의 특정 활성을 110% 이상으로 증가시켰다. 대부분의 정제 과정과 같이, 요망되는 활성의 일부가 펠렛에 잔류하였다. 이러한 경우, 본래 활성의 단지 17.6%가 펠렛에 잔류하였고 (분석 목적을 위해 50 mM 중탄산나트륨 (7 mSi, pH 10.3)을 이용하여 추출하였음), 이는 전체량의 비교적 적은 분획이다.
표 2. 요산분해효소 활성에 대한 CPC 처리의 효과
Figure 112007077802948-pct00003
1.4.3. 0.075% CPC로 처리 후의 SDS-PAGE 분석
동일한 양의 단백질을 함유하는, CPC에 대한 노출 전의 미정제 요산분해효소의 샘플, 및 가용성 및 불용성 물질의 분리 후, CPC 처리 후, 분획의 원심분리 후, 및 원심분리 후에 수득된 펠렛의 재구성 후의 분획들을 SDS-PAGE 방법으로 분석하였다. 결과 (도 3 참조)는 CPC 처리 전에 오염 단백질의 존재를 나타내었다. CPC 처리후, 펠렛은 대부분의 오염 단백질을 함유한 반면, 상층액은 단일한 주요 단백질 밴드를 발생시키는 요산분해효소를 함유하였다.
실시예 2. 단일 사슬 (scFv) 항체의 정제에 대한 CPC의 효과
2.1. 재료 및 방법
2.1.1. 완충용액
2.1.1.1. 봉입체 용해 완충용액
용해 완충용액은 6M 우레아, 50 mM 트리스, 1 mM EDTA, 및 0.1M 시스테인을 함유하였다. 완충용액의 pH를 8.5로 적정하였다.
2.1.1.2. 폴딩 완충용액
폴딩 완충용액은 1M 우레아, 0.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 0.1M 시스테인을 함유하였다. 완충용액의 pH를 10.0으로 적정하였다.
2.1.2. 세균에서의 scFv 항체의 발현
ScFv 항체 (pI 8.9)를 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 PCT 공개 번호 WO 02/059264호에 기술된 바와 같이, 카르복실 말단에 시스테인-리신-알라닌-리신을 지니는 scFv를 엔코딩하는 벡터로 형질전환된 대장균에서 발현시켰다.
2.1.3. scFv 항체 생성 세균의 배양 및 수거
scFv 함유 세균 세포를 유도 전에 4시간 동안 최종 농도 0.5%의 L-아르기닌이 보충된 최소 배지 (pH 7.2)에서 배양시켰다. scFv의 발현을 배지 내의 글루코오스 양을 제한함으로써 유도하였다. scFv 함유 세균 세포를 초여과에 의해 배양물로부터 수거하였다.
2.1.4. 세포 분해 및 봉입체의 회수
수거된 세포 펠렛을 50 mM 트리스 완충용액 (pH 8.0) 및 10 mM EDTA에 현탁시켜, 건조 세포 중량 (DCW)의 약 20배의 최종 부피를 생성시켰다. 2000 내지 3000 유닛/ml의 농도의 리소자임을 혼합과 함께 현탁된 펠렛에 첨가한 후, 4℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션시켰다.
이후, 세포 용해물을 고전단 혼합을 처리한 후, 음파처리하였다. scFv 항체 함유 봉입체를 10,000 x g에서의 원심분리에 의해 회수하였다. 펠렛을 탈이온수 (w/w)로 약 16배로 희석시키고, 불순물을 추가로 제거하기 위해 원심분리시켰다. 이러한 최종 세척 단계로부터 수득된 펠렛을 추가 과정을 위해 비축하였다.
2.1.5. 용해 및 재폴딩
IB-풍부 펠렛을 봉입체 용해 완충용액 (상기 참조)에 현탁시키고, 실온에서 5시간 동안 인큐베이션시키고, 아르기닌/산화된 글루타티온에 기초한 용액 중에서 시험관내에서 재폴딩시켰다. 재폴딩 후, 단백질을 투석시키고, 우레아/인산염 함유 완충용액에 대해 접선 유동 여과 (tangential flow filtration)에 의해 농축시켰다.
2.1.6. CPC 처리
10% CPC 용액을 0.02%의 최종 농도로 scFv 재폴딩 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1-2시간 인큐베이션시킨 후, 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 상층액은 scFv 항체를 함유하였다.
2.2. 결과
2.2.1. 회수가능한 scFv 항체에 대한 CPC 농도의 효과
scFv 항체 순도 및 회수에 대한 CPC (pH 7.5 또는 10)의 효과를 표 3에 나타내었다. CPC 처리 전에, IB 단백질의 최초량은 73 mg이었고, 수퍼덱스 75 상에서의 HPLC 분석에 의해 결정된 바에 따라 15.87 mg의 scFv 항체를 함유하였다. scFv 항체 함유 피크의 유지 시간 (RT)은 약 20.6분이었다. 상기 결과는 전체 단백질의 회수가 일반적으로 CPC 농도가 증가함에 따라 감소하고, scFv 항체의 회수가 CPC 농도가 0.03% 미만인 경우 80%를 초과하여 유지되는 것을 나타낸다. 오염 단백질의 보다 효과적인 제거는 pH 10에 비해 pH 7.5에서 달성되었다. 따라서, scFv 항체 정제는 0.01 내지 0.03% CPC의 처리에 의해 달성되었다.
표 3. scFv 항체 회수 및 순도에 대한 CPC 처리의 효과
Figure 112007077802948-pct00004
2.3. scFv 항체 순도의 CPC 향상의 확증
2.3.1. CPC 처리 후의 scFv 회수의 HPLC 분석
재폴딩된 단백질의 HPLC 분석은 scFv 항체 관련 피크 (유지 시간 (RT) ~20.6분)가 전체 단백질의 약 22.7%의 단백질을 포함하는 것을 나타낸다 (도 4B). 도 4C의 크로마토그램은 0.02% CPC 처리 후, 상층액의 scFv 관련 피크가 3.3배가 정제된 주입된 전체 단백질의 약 75.9%를 포함하는 것을 나타낸다. 따라서, CPC 처리는 scFv 항체 용액으로부터 단백질 불순물을 제거하였다.
2.3.2. CPC 처리 후의 scFv 회수에 대한 SDS-PAGE 분석
결과 (도 5)는 CPC 처리 전에, 샘플이 유의한 양의 다수의 단백질을 함유하는 것을 나타낸다. 유사하게, CPC 처리후, 펠렛은 다수의 단백질을 함유하였다. 대조적으로, CPC 처리 후의 상층액은 scFv 항체의 밴드인 하나의 주요한 단백질 밴드를 함유하였다.
실시예 3. 재조합 인터페론-베타의 정제에 대한 CPC의 효과
공지된 방법에 의해 대장균에서 인터페론 베타 (IFN-베타, pI 8.5-8.9)를 발현시켰다. 문헌[Nagola, S. et al., Nature, 284:316 (1980); Goeddel, D. V. et al., Nature, 287:411 (1980); Yelverton, E. et al., Nuc. Acid Res., 9:731 (1981); Streuli, M. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (U.S.), 78:2848 (1981); European Pat. Application No. 28033, published May 6, 1981; 321134, published July 15, 1981; 34307 published Aug. 26, 1981; and Belgian Patent No. 837379, issued July 1, 1981]에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 베타-인터페론을 생성하는 다양한 방법이 기술되어 있다. 세균에서 생성된 IFN을 회수하고 정제하기 위한 방법은 문헌[U.S. Pat. Nos. 4,450,103; 4,315,852; 4,343,735; and 4,343,736; and Derynck et al., Nature (1980) 287:193-197 and Scandella and Kornberg, Biochemistry, 10:4447 (1971)]에 기술되어 있다. IFN-베타를 함유하는 봉입체를 분리키고, 용해시켰다.
생성된 용액에 CPC를 처리하였다. 도 6에 나타낸 결과는 CPC 처리 후에 존재하는 오염 단백질의 수준의 현저한 감소를 나타낸다. IFN-베타의 실제량 (피크 아래 영역)은 CPC 처리 후에 감지할 수 있을 정도로 변화하지 않았다.
표 4에 CPC 처리의 효과를 요약하였다. 전체 단백질 (브래드포드)이 40% 감소하였고, UV 흡수는 약 40% 감소하였으나, IFN-베타의 양은 변화하지 않았다.
표 4
Figure 112007077802948-pct00005
a Vydac C4 컬럼으로 정량화
b SEC 프로파일은 여러 피크를 함유하였음. 13분으로 산출된 피크 (R.T. 13분)는 CPC 처리후 감소하였고, 이는 고분자량 단백질 및 이의 변이체가 산출되는 영역에 해당함.
실시예 4. Xa 인자 억제제의 정제에 대한 CPC의 효과
거머리 Xa 인자 억제제를 정제시키기 위해 CPC를 사용하였다. 거머리 Xa 인자 억제제 (FXaⅠ, pI 8.4-9.1)는 미국 특허 제6,211,341호 및 국제 특허 출원 번호 W094/23735에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다. FXaI 함유 봉입체 (IB)의 분리 후, FXaI을 실시예 1에 기술된 바와 실질적으로 동일하게 IB로부터 정제시켰다. IB 펠렛의 용해후, 제조물을 10% CPC 용액과 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 혼합물을 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 펠렛 및 상층액을 분리시켰다. 펠렛을 50 mM NaHCO3 완충용액을 이용하여 본래의 부피로 현탁시켰다. 펠렛 및 상층액을 별개로 농축시키고, 투석시켜, 잔류하는 CPC를 제거하였다. 단백질 함량 및 활성을 분석하였고, FXaI이 상층액에서 주로 존재하는 성분이고 펠렛에는 실질적으로 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다. 상기 결과는 CPC 처리가 회수되는 FXaI의 회수 및 정제의 효율을 향상시키는 것을 나타낸다.
실시예 5. CPC에 의한 카르복시펩티다아제 B (CPB)의 정제
CPB를 발현하는 클론으로부터 수득된 동일량의 봉입체를 8M 우레아 (pH 9.5; 대조군 및 시험)에 용해시켰다. CPB의 생성은 국제 공개 번호 WO96/23064호 및 미국 특허 번호 제5,948,668호에 기재되어 있다. 시험 샘플을 CPC 0.11%로 처리하고, 재폴딩 전에 여과에 의해 정제하였다. 상기 용액을 재폴딩 완충용액에 1:8로 희석시킴으로써 대조군 및 시험 샘플의 재폴딩을 수행하였다. 주위 온도에서 밤새 엔도프테이나아제로 처리한 후, 동등량의 대조군 및 시험 샘플을 DEAE 세파로오스 컬럼에 로딩시켰다. 컬럼을 세척한 후, 활성 효소를 20 mM 트리스 완충용액 (pH 8) 중의 60 mM 염화나트륨으로 희석시켰다.
표 5
Figure 112007077802948-pct00006
(*) 브래드포드 방법으로 단백질 측정을 수행함.
(**) 재폴딩 전에 단백질은 비활성이었음.
표 5에 제시된 결과는 CPC 처리된 물질에서의 전체 OD가 49.5% 감소하고, 전체 단백질 함량이 44.5% 감소하였음을 나타낸다. 흥미롭게도, CPC 처리된 샘플에서 회수된 전체 단백질 활성은 79% 증가하였는데, 이는 CPC가 활성 효소의 생성을 부분적으로 억제하는 성분을 제거하였음을 의미한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 이들의 전체 내용이 참조로서 포함된다고 특별하고 개별적으로 기재되어 있는 경우에 모든 목적을 위해 이들의 천체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명의 다수의 변형 및 변화가 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있으며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기술된 특정 구체예는 단지 예시의 방법으로 제공되며, 본 발명은 본원에 첨부된 청구의 범위가 권리를 부여하는 동일한 전체 범위에 따라 상기 청구항에 의해서만 제한된다.

Claims (48)

  1. a. 용해된 표적 단백질, 용해된 오염 단백질 및 염기성 완충용액의 혼합물을 포함하는 용액을 얻는 단계로서 상기 표적 단백질은 염기성 pH 하에서 양성 전하를 가지고 7을 초과하는 등전점을 가지고 상기 오염 단백질은 다음이온 전하를 가지는 단계;
    b. 용해된 표적 단백질, 용해된 오염 단백질 및 염기성 완충용액의 혼합물을 포함하는 용액을 양이온 계면활성제와 접촉시키는 단계로서 상기 양이온 계면활성제는 오염 단백질을 선택적으로 침전시킬 수 있는 양의 양친매성 암모늄 화합물인 단계; 및
    c. 상기 용해된 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 양친매성 암모늄 화합물이 화학식 QN+의 사차 암모늄 화합물; 화학식 RNH3 +의 파라핀 사슬 일차 암모늄 화합물; 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 양친매성 암모늄 화합물이 세틸 피리디늄염, 스테아르아미드-메틸피리디늄염, 라우릴 피리디늄염, 세틸 퀴놀리늄염, 라우릴 아미노프로피온산 메틸 에스테르염, 라우릴 아미노 프로피온산 금속염, 라우릴 디메틸 베타인, 스테아릴 디메틸 베타인, 라우릴 디히드록시에틸 베타인 및 벤제토늄염으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 양친매성 암모늄 화합물이 헥사데실피리디늄 클로라이드, 데퀄리늄 아세테이트, 헥사데실피리디늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드, 혼합된 n-알킬 디메틸 벤질암모늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, N,N-디메틸-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시]에톡시]에틸]벤젠메탄암모늄 클로라이드, 알킬-디메틸벤질-암모늄 클로라이드, 및 디클로로-벤질디메틸-알킬암모늄 클로라이드, 테트라데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 도데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드, 라우릴 디메틸 베타인 스테아릴 디메틸 베타인, 및 라우릴 디히드록시에틸 베타인으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 양친매성 암모늄 화합물이 세틸피리디늄염임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 세틸 피리디늄염이 할라이드염임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세틸 피리디늄 할라이드염이 세틸피리디늄 클로라이드임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 양친매성 암모늄 화합물이 6 내지 20개의 탄소 원자를 지니는 하나 이상의 지방족 사슬을 지님을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 지방족 사슬이 8 내지 18개의 탄소 원자를 지님을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 용액이 세포 성분을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 세포 성분이 미생물로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 미생물이 세균임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 세균이 대장균 (E. coli)임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 세포 성분이 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 표적 단백질이 재조합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 재조합 단백질이 효소임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 표적 단백질이 항체, 요산분해효소, 인터페론-베타, X 인자 억제제, 산 데옥시리보누클레아제 Ⅱ, 엘라스타아제, 리소자임, 파파인, 퍼옥시다아제, 췌장 리보누클레아제, 트립시노겐, 트립신, 시토크롬 c, 에라부톡신, 스태필로코쿠스 아우레우스 장독소 C1, 인터페론 및 모노아민 옥시다아제 A로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 표적 단백질이 요산분해효소임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 요산분해효소가 포유동물 요산분해효소임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 포유동물 요산분해효소가 돼지 요산분해효소임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항에 있어서, 표적 단백질이 항체임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항체가 단일 사슬 항체임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 표적 단백질이 인터페론임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 인터페론이 인터페론 베타임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 양이온 계면활성제가 0.001% 내지 5.0%의 농도로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 양이온 계면활성제가 0.01% 내지 0.5%의 농도로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 양이온 계면활성제가 0.03% 내지 0.2%의 농도로 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 접촉이 5분 내지 48시간 동안 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 접촉이 10분 내지 24시간 동안 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 접촉이 4℃ 내지 36℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 접촉이 4℃ 내지 26℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 용액이 다음이온 (polyanion)을 포함하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 용액이 고형 지지체를 포함하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 용액이 오염 단백질의 응집체를 포함하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 용액이 다음이온; 고형 지지체; 및 오염 단백질의 응집체를 포함하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33항, 제34항 또는 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 계면활성제가 세틸피리디늄염임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 세틸피리디늄염이 세틸피리디늄 클로라이드임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항에 있어서, 표적 단백질이 7 이상의 등전점을 지님을 특징으로 하는 방법.
  39. 제18항에 있어서, 요산분해효소가 세균 세포로부터 유래되고, 상기 세균 세포가 요산분해효소를 엔코딩하는 DNA를 포함하여, 상기 DNA가 발현되어 요산분해효소를 생성함을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 요산분해효소가 세균 세포에 의해 생성된 봉입체로부터 회수됨을 특징으로 하는 방법.
  41. a. 용해된 표적 단백질, 용해된 오염 단백질 및 염기성 완충용액을 포함하는 용액을 얻는 단계로서 상기 표적 단백질은 염기성 pH 하에서 양성 전하를 가지고 7을 초과하는 등전점을 가지고 상기 오염 단백질은 다음이온 전하를 가지는 단계;
    b. 용해된 표적 단백질, 용해된 오염 단백질 및 염기성 완충용액을 포함하는 용액을 양이온 계면활성제와 접촉시키는 단계로서 상기 양이온 계면활성제는 오염 단백질을 선택적으로 침전시킬 수 있는 양의 양친매성 암모늄 화합물인 단계; 및
    c. 상기 용해된 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 표적 단백질을 정제하는 방법.
  42. a. 다수의 단백질의 용액을 얻는 단계로서, 상기 용액 중의 단백질은 표적 단백질, 오염 단백질 및 염기성 완충용액을 포함하고, 상기 표적 단백질은 용액 중의 전체 단백질의 제 1 중량%를 차지하고, 상기 표적 단백질은 염기성 pH 하에서 양성 전하를 가지고 7을 초과하는 등전점을 가지고 상기 오염 단백질은 다음이온 전하를 가지는 단계; 및
    b. 상기 단계 (a)의 용액을 양이온성 계면활성제와 접촉시키는 단계로, 상기 양이온성 계면활성제는 오염 단백질을 선택적으로 침전시킬 수 있는 양의 양친매성 암모늄 화합물이고, 상기 단계 (b)내의 표적 단백질은 전체 단백질의 제2 중량%를 차지하고, 이러한 제2 중량%가 상기 제 1 중량%보다 높은 방법.
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