MX2007012548A - Formas variantes de urato oxidasa y uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a proteinas modificadas geneticamente con actividad uricolitica. Mas especificamente, la invencion se refiere a proteinas que comprenden urato oxidasas truncadas y a metodos para producirlas, inclusive proteinas conjugadas a PEG que comprenden urato oxidasas truncadas.

Description

FORMAS VARIANTES DE URATO OXIDASA Y USO DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas modificadas genéticamente con actividad uricolítica. Más específicamente, la invención se refiere a proteínas que comprenden urato oxidasas truncadas y a métodos para producirlas .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los términos urato oxidasa y uricasa se utilizan de manera intercambiable en este documento. Las urato oxidasas (uricasas; E.C. 1.7.3.3) son enzimas las cuales catalizan la oxidación del ácido úrico a un producto más soluble, alantoína, un metabolito de purina que es excretado más fácilmente. Los humanos no producen la uricasa activa enzimáticamente, como resultado de varias mutaciones en el gen para la uricasa adquirido durante la evolución de los primates superiores. Wu, X y colaboradores , (1992) J Mol Evol 34:78-84, incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad. Como consecuencia, en los individuos susceptibles, las concentraciones excesivas de ácido úrico en la sangre (hiperuricemia) pueden conducir a la artritis dolorosa (gota) , depósitos de urato desfigurantes (toba) e insuficiencia renal. En algunos individuos afectados, los fármacos disponibles tales como alopurinol (un inhibidor de la síntesis de ácido úrico) producen efectos adversos limitantes del tratamiento o no alivian adecuadamente estas condiciones. Hande, KR y colaboradores, (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG (1990) Bailliere ' s Clin Rheumatol 4:177-192, cada uno incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad. Las inyecciones de uricasa pueden disminuir la hiperuricemia e hiperuricosuria, al menos transitoriamente. Puesto que la uricasa es una proteína extraña en los humanos, aún la primera inyección de la proteína no modificada de Aspergillus flavus ha inducido reacciones anafilácticas en algún porcentaje de pacientes tratados (Pui, C-H y colaboradores, (1997) Leukemia 11:1813-1816, incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad) y las respuestas inmunológicas limitan su utilidad para el tratamiento crónico o intermitente. Donadío, D y colaboradores (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M y colaboradores, (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, cada uno incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad. La presente invención se refiere a proteínas de uricasa recombinantes, mutantes que tienen truncamientos y estabilidad estructural mejorada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas de uricasa recombinantes novedosas.

Las proteínas contempladas de la invención serán truncadas y tendrán aminoácidos mutados con relación a las proteínas de uricasa de origen natural. La invención expuesta proporciona una uricasa recombinante mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8. También se proporciona una uricasa recombinante mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un medio para metabolizar el ácido úrico que comprende una proteína de uricasa recombinante novedosa que tiene actividad uricolítica. La actividad uricolítica se utiliza en este documento para referirse a la conversión enzimática de ácido úrico a alantoína. En una modalidad, la uricasa comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 8 hasta la posición 287 de la SEQ ID NO. 7 o la SEQ ID NO. 12. También se proporcionan uricasas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8 o la SEQ ID NO. 13. En una modalidad, la uricasa comprende un aminoácido amino-terminal, en donde el aminoácido amino-terminal es alanina, glicina, prolina, serina o treonina. En una modalidad particular, el aminoácido amino-terminal es metionina. También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que comprende una secuencia de ácido nucleico la cual codifica una uricasa de la invención. En las modalidades particulares, el ácido nucleico que codifica la uricasa está unido de manera operativa a un promotor heterólogo, por ejemplo, el promotor osmB . También se proporcionan vectores de ácido nucleico que comprenden el ácido nucleido que codifica la uricasa, células hospedantes que comprenden estos vectores y métodos para producir una uricasa que comprenden los pasos que consisten en cultivar esta célula hospedante bajo condiciones tales que la secuencia de ácido nucleico es expresada por la célula hospedante y aislar la uricasa expresada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra la estructura del plásmido pOUR-P-?N-ks-1. Los números junto a los sitios de restricción indican la posición de nucleótidos, con relación al sitio Haell, designada como 1. Los sitios de restricción los cuales se pierden durante la clonación están marcados entre paréntesis. La Figura 2 representa las secuencias de ADN y los aminoácidos deducidos de Cerdo-KS-?N uricasa (SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO . 7, respectivamente) . La numeración de los aminoácidos en la Figura 2 es relativa a la secuencia de uricasa de cerdo completa. Después del residuo de metionina iniciador, una treonina reemplaza el ácido aspártico 7 de la secuencia de uricasa de cerdo. Se indican los sitios de restricción que se utilizan para los diversos pasos de subclonación. La secuencia no traducida 3' se muestra en letras minúsculas. El codón de detención de traducción es indicado por un asterisco. La Figura 3 muestra un alineamiento relativo de las secuencias de aminoácidos deducidas de las diversas secuencias de uricasa de cerdo recombinante (SEQ ID NO. 11), PBC-?NC (SEQ ID NO. 12) y Cerdo-KS-?N (SEQ ID NO. 7). Los asteriscos indican las posiciones en las cuales hay diferencias en aminoácidos en la secuencia Cerdo-KS-?N en comparación con la secuencia de uricasa de cerdo publicada; los círculos indican las posiciones en las cuales hay diferencias en aminoácidos en la secuencia Cerdo-KS-?N en comparación con la secuencia PBC-?N. Las líneas punteadas indican la supresión de aminoácidos. La Figura 4 representa la SDS-PAGE de uricasa de cerdo y las variantes de uricasa sumamente purificadas que se producen de acuerdo con los Ejemplos 1 - 3. La fecha de producción (mes/año) y el número de carril relevante para cada muestra se indica en el código posterior. El eje Y está etiquetado con los pesos de los marcadores de peso molecular y la parte superior de la figura está etiquetada con los números de carril. Los carriles son como sigue: Carril 1 - Marcadores de peso molecular; Carril 2 - KS-?N de cerdo (7/98) ; Carril 3 - Cerdo (9/98) ; Carril 4 - KS de Cerdo (6/99) ; Carril 5 - KS de Cerdo (6/99) ; Carril 6 -Cerdo-?N (6/99) ; Carril 7 - KS-?N de Cerdo (7/99) ; Carril 8 - KS-?N de Cerdo (8/99) . La Figura 5 representa los perfiles farmacocinéticos de la uricasa Cerdo-KS-?N (9x10 kD) conjugada con PEG en ratas después de inyecciones IM (intramusculares) , SC (subcutáneas) e IV (intravenosas) , determinados por medio de la supervisión de la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de la uricasa en muestras de plasma, las cuales se recolectan en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico . Los valores de actividad (mAU = unidades de mili-absorbancia) representan la proporción de reacción enzimática por 1 µl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación con relación a una inyección IV) de uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva de la gráfica. La Figura 6 representa los perfiles farmacocinéticos de la uricasa Cerdo-KS-?N (9x10 kD) conjugada con PEG en conejos después de inyecciones IM (intramusculares) , SC (subcutáneas) e IV (intravenosas) , determinados por medio de la supervisión de la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de la uricasa en muestras de plasma, las cuales se recolectan en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mAU unidades de mili-absorbancia) representan la proporción de reacción enzimática por 1 µl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación con relación a una inyección IV) de uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva de la gráfica. La Figura 7 representa los perfiles farmacocinéticos de la uricasa Cerdo-KS-?N (9x10 kD) conjugada con PEG en perros después de inyecciones IM (intramusculares) , SC (subcutáneas) e IV (intravenosas) , determinados por medio de la supervisión de la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de la uricasa en muestras de plasma, las cuales se recolectan en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mAU unidades de mili-absorbancia) representan la proporción de reacción enzimática por 1 µl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación con relación a una inyección IV) de uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva de la gráfica. La Figura 8 representa los perfiles farmacocinéticos de la uricasa Cerdo-KS-?N (9x10 kD) conjugada con PEG en cerdos después de inyecciones IM (intramusculares) , SC (subcutáneas) e IV (intravenosas) , determinados por medio de la supervisión de la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de la uricasa en muestras de plasma, las cuales se recolectan en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mAU = unidades de mili-absorbancia) representan la proporción de reacción enzimática por 1 µl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación con relación a una inyección IV) de uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva de la gráfica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los estudios previos enseñan que cuando se logra una reducción significativa en la inmunogenicidad y/o antigenicidad de la uricasa por medio de la conjugación con PEG, está asociada invariablemente con una pérdida sustancial de actividad uricolítica. La seguridad, conveniencia y rentabilidad de los productos biofarmacéuticos son impactadas de manera adversa por las disminuciones en sus potencias y la necesidad resultante de incrementar la dosis administrada. De esta manera, existe la necesidad de un medio alternativo, seguro y efectivo para disminuir los niveles elevados de ácido úrico en fluidos corporales, inclusive la sangre. La presente invención proporciona una uricasa recombinante mutante que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 12 o SEQ ID NO. 13. La uricasa, como se utiliza en este documento, incluye subunidades individuales, así como también el tetrámero, a menos que se indique de otra manera. En una modalidad particular, la uricasa tiene una metionina amino-terminal. Esta metionina puede retirarse por medio de la modificación posterior a la traducción. En las modalidades particulares, la metionina amino-terminal es retirada después de que se produce la uricasa. En una modalidad particular, la metionina es retirada por medio de la aminopeptidasa bacteriana endógena. El penúltimo aminoácido puede ser uno que permita la remoción de la metionina N-terminal por medio de la metionina aminopeptidasa bacteriana (MAP) . Los aminoácidos que permiten la remoción más completa de la metionina N-terminal son alanina, glicina, prolina, serina y treonina. En una modalidad particular, la uricasa comprende dos aminoácidos amino-terminales, en donde los dos aminoácidos amino-terminales son una metionina seguida por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de alanina, glicina, prolina, serina y treonina. La invención expuesta proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa. La invención expuesta proporciona un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad particular, la uricasa se aisla. En una modalidad particular, la uricasa se purifica. En modalidades particulares, la uricasa se aisla y se purifica. La invención expuesta proporciona una célula hospedante que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa. La invención expuesta proporciona un método para producir la secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa, que comprende la modificación por medio de técnicas de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una uricasa. Una persona experta en el campo aprecia que una secuencia de ácido nucleico deseada se prepara por medio de la PCR por vía de cebadores de oligonucleótidos sintéticos, los cuales son complementarios para regiones del ADN objetivo (uno para cada cadena) que es amplificado. Los cebadores se agregan al ADN objetivo (que no necesita estar puro) , en presencia de un exceso de desoxinucleótidos y polimerasa Taq, una ADN polimerasa termoestable. En una serie (típicamente 30) de ciclos de temperatura, el ADN objetivo es desnaturalizado repetidamente (alrededor de 90 °C) , hibridado a los cebadores (típicamente a 50-60°C) y una cadena hija extendida desde los cebadores (72°C) . Como las cadenas hijas actúan por sí mismas como moldes para ciclos subsecuentes, los fragmentos de ADN que se aparean con ambos cebadores se amplifican exponencialmente, de preferencia que linealmente. La invención expuesta proporciona un método para producir una uricasa recombinante mutante que comprende transfectar una célula hospedante con el vector, en donde la célula hospedante expresa la uricasa, aislar la uricasa recombinante mutante de la célula' hospedante, aislar la uricasa recombinante, mutante, purificada utilizando, por ejemplo, técnicas cromatográficas y purificar la uricasa recombinante mutante. Por ejemplo, la uricasa puede producirse de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO 00/08196 y la Solicitud Norteamericana No. 60/095,489, incorporada en este documento a manera de referencia en sus totalidades. En una modalidad preferida, la célula hospedante se trata para causar la expresión de la uricasa recombinante mutante. Una persona experta en el campo está consciente que la transfección de células con un vector se realiza usualmente utilizando ADN precipitado con iones de calcio, aunque se puede utilizar una variedad de métodos diferentes (por ejemplo electroporación) . La uricasa puede aislarse y/o purificarse por medio de cualquier método conocido para aquellas personas de experiencia en el campo. Los polipéptidos expresados de esta invención se aislan generalmente en una forma sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos se aislan a una pureza de al menos 80% en peso, más preferiblemente a una pureza de al menos 95% en peso y mucho más preferiblemente a una pureza de al menos 99% en peso. En general, esta purificación puede lograrse utilizando, por ejemplo, las técnicas estándar de fraccionamiento con sulfato de amonio, electroforesis de SDS-PAGE y cromatografía de afinidad. La uricasa se aisla preferiblemente utilizando un surfactante catiónico, por ejemplo, cloruro de cetil-piridinio (CPC) de acuerdo con el método descrito en la solicitud de patente norteamericana copendiente que se presentó el 11 de Abril de 2005 que tiene el no. de solicitud 60/670,520 y el número de registro de apoderado 103864.146644, titulada Purification Of Proteins With Cationic Surfactant, incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad. En una modalidad de la invención, el vector está bajo control de un promotor sensible a la presión osmótica. Un promotor es una región de ADN a la cual se une la ARN polimerasa antes de iniciar la transcripción del ADN en ARN. Un promotor sensible a la presión osmótica inicia la transcripción como resultado de una presión osmótica incrementada percibida por la célula. La uricasa de la invención incluye una uricasa que es conjugada con un polímero, por ejemplo, una uricasa conjugada con polietilenglicol, es decir, uricasa conjugada con PEG. En una modalidad de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la uricasa. En una modalidad, la composición es una solución de uricasa. En una modalidad preferida, la solución es estéril y adecuada para la inyección. En una modalidad, esta composición comprende uricasa como una solución en solución salina amortiguada con fosfato. En una modalidad, la composición se proporciona en un frasquito, que tiene opcionalmente un tapón de caucho para inyección. En modalidades particulares, la composición comprende uricasa en solución a una concentración de 2 a 16 miligramos de uricasa por mililitro de solución, de 4 a 12 miligramos por mililitro o de 6 a 10 miligramos por mililitro. En una modalidad preferida, la composición comprende uricasa en una concentración de 8 miligramos por mililitro. Preferiblemente, la masa de uricasa se mide con respecto a la masa de proteína. Los regímenes de administración efectivos de las composiciones de la invención pueden ser determinados por una persona de experiencia en el campo. Los indicadores adecuados para valorar la efectividad de un régimen dado son conocidos para aquellas personas de experiencia en el campo. Los ejemplos de estos indicadores incluyen la normalización o disminución de los niveles de ácido úrico en el plasma (PÚA) y la disminución o mantenimiento de PÚA a 6.8 mg/dL o menos, preferiblemente 6 mg/dL o menos. En una modalidad preferida, el sujeto que es tratado con la composición de la invención tiene un PÚA de 6 mg/ml o menos durante al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% del período de tratamiento total. Por ejemplo, para un período de tratamiento de 24 semanas, el sujeto tiene preferiblemente un PÚA de 6 mg/ml o menos durante al menos 80% del período de tratamiento de 24 semanas, es decir, durante al menos un tiempo igual a la cantidad de tiempo en 134.4 días (24 semanas x 7 días/semana x 0.8 = 134.4 días) . En modalidades particulares, se administran de 0.5 a 24 mg de uricasa en solución una vez cada 2 a 4 semanas. La uricasa puede administrarse de cualquier manera apropiada que sea conocida para una persona de experiencia en el campo, por ejemplo, por la ruta intravenosa, intramuscular o subcutánea. Preferiblemente, cuando la administración es intravenosa, se administran de 0.5 mg a 12 mg de uricasa. Preferiblemente, cuando la administración es subcutánea, se administran de 4 a 24 mg de uricasa. En una modalidad preferida, la uricasa se administra por medio de una infusión intravenosa durante un período de 30 a 240 minutos. En una modalidad, se administran 8 mg de uricasa una vez cada dos semanas. En modalidades particulares, la infusión puede realizarse utilizando de 100 a 500 mL de solución salina. En una modalidad preferida, se administran 8 mg de uricasa en solución durante un período de 120 minutos una vez cada 2 semanas o una vez cada 4 semanas; preferiblemente la uricasa se disuelve en 250 mL de solución salina para infusión. En las modalidades particulares, las administraciones de uricasa toman lugar durante un período de tratamiento de 3 meses, 6 meses, 8 meses o 12 meses. En otras modalidades, el período de tratamiento es de 12 semanas, 24 semanas, 36 semanas o 48 semanas. En una modalidad particular, el período de tratamiento es durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo 2 años o más largo, durante hasta toda la vida del sujeto que es tratado. Además, se pueden utilizar múltiples períodos de tratamiento intercalados con tiempos sin tratamiento, por ejemplo 6 meses de tratamiento seguidos por 3 meses sin tratamiento, seguidos por 6 meses adicionales de tratamiento, etcétera. En ciertas modalidades, los compuestos anti-inflamatorios pueden administrarse profilácticamente para eliminar o reducir la ocurrencia de reacciones de infusión debido a la administración de uricasa. En una modalidad, se administra de esta manera al menos un corticpsteroide, al menos una antihistamina, al menos un NSAID o combinaciones de los mismos. Los corticosteroides útiles incluyen betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona. Los NSAIDs útiles incluyen ibuprofeno, indometacina, naproxeno, aspirina, acetominofeno, celecoxib y valdecoxib. Las antihistaminas útiles incluyen azatadina, bromfeniramina, cetirizina, clorfeniramina, clemastina, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, dimenhidrinato, difenhidramina, doxilamina, fexofenadina, hidroxizina, loratadina y fenindamina. En una modalidad preferida, la antihistamina es fexofenadina, el NSAID es acetaminofeno y el corticosteroide es hidrocortisona y/o prednisona. Preferiblemente, una combinación de los tres (no necesariamente de manera concomitante) se administra antes de la infusión de la solución de uricasa. En una modalidad preferida, el NSAID y la antihistamina se administran por la ruta oral de 1 a 4 horas antes de la infusión de uricasa. Una dosis adecuada de fexofenadina incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 180 mg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 50 a aproximadamente 120 mg, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 mg, aproximadamente 60 mg, preferiblemente 60 mg. Una dosis adecuada de acetaminofeno incluye de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 mg, de aproximadamente 700 a aproximadamente 1200 mg, de aproximadamente 800 a aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1000 mg, preferiblemente 1000 mg. Una dosis adecuada de hidrocortisona incluye de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 200 mg, preferiblemente 200 mg. En una modalidad, la antihistamina no es difenhidramina. En otra modalidad, el NSAID no es acetaminofeno. En una modalidad preferida, 60 mg de fexofenadina se administran por la ruta oral la noche antes de la infusión de uricasa; 60 mg de fexofenadina y 1000 mg de acetaminofeno se administran por la ruta oral la siguiente mañana y finalmente, 200 mg de hidrocortisona se administran precisamente antes de la infusión de la solución de uricasa. En una modalidad, la prednisona se administra el día, preferiblemente en la noche, antes de la administración de uricasa. Una dosificación apropiada de prednisona incluye de 5 a 50 mg, preferiblemente 20 mg. En ciertas modalidades, estos tratamientos profilácticos para eliminar o reducir la ocurrencia de reacciones de infusión se utilizan para sujetos que reciben o que están apunto de recibir uricasa, inclusive uricasa conjugada con PEG y uricasa no conjugada con PEG. En modalidades particulares, estos tratamientos profilácticos se utilizan para sujetos que reciben o están a punto de recibir péptidos terapéuticos diferentes de uricasa, en donde los otros péptidos terapéuticos están conjugados con PEG o no están conjugados con PEG. En una modalidad de la invención, la composición farmacéutica comprende una uricasa conjugada con un polímero y la uricasa modificada retiene la actividad uricolítica. En una modalidad preferida, la uricasa es una uricasa conjugada con PEG. En una modalidad de la invención, la composición farmacéutica comprende una uricasa que ha sido modificada por medio de la conjugación con un polímero y la uricasa modificada retiene la actividad uricolítica. En una modalidad particular, los conjugados de polímero-uricasa se preparan como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO 01/59078 y la Solicitud Norteamericana No. 09/501730, incorporadas en este documento a manera de referencia en su totalidad. En una modalidad de la invención, el polímero se selecciona del grupo que comprende polietilenglicol, dextrano, polipropilenglicol, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y alcohol polivinílico. En una modalidad preferida, el polímero es polietilenglicol y la uricasa es una uricasa conjugada con PEG. En modalidades de la invención, la composición comprende 2-12 moléculas de polímero en cada subunidad de uricasa, preferiblemente de 3 a 10 moléculas de polímero por subunidad de uricasa. En una modalidad de la invención, cada molécula de polímero tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y aproximadamente 100 kD. En otra modalidad de la invención, cada molécula de polímero tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y aproximadamente 50 kD. En una modalidad preferida de la invención, cada molécula de polímero tiene un peso molecular entre aproximadamente 5 kD y aproximadamente 20 kD, entre aproximadamente 8 kD y aproximadamente 15 kD, entre aproximadamente 10 kD y 12 kD, preferiblemente alrededor de 10 kD. En una modalidad preferida, cada molécula de polímero tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kD o aproximadamente 20 kD. En una modalidad especialmente preferida de la invención, cada molécula de polímero tiene un peso molecular de 10 kD. En una modalidad de la invención, la composición es adecuada para la administración repetida de la composición. La invención expuesta proporciona un medio para metabolizar el ácido úrico utilizando la uricasa. La invención expuesta proporciona el uso de una composición de uricasa para reducir los niveles de ácido úrico en un fluido biológico. En una modalidad de la invención, la composición de uricasa se utiliza para reducir el ácido úrico en un fluido biológico que comprende sangre. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico novedosas que codifican la uricasa de la invención. Las manipulaciones que dan por resultado su producción son bien conocidas para la persona de experiencia en el campo. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de uricasa pueden modificarse por medio de cualquiera de numerosas estrategias conocidas en el campo (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) . La secuencia puede escindirse en sitios apropiados con endonucleasa (s) de restricción, seguido por la modificación enzimática adicional si se desea, aislarse y ligarse in vitro. En la producción del gen que codifica una uricasa, se debe tener cuidado de asegurar que el gen modificado permanezca dentro del marco de lectura de traducción apropiado, ininterrumpido por señales de detención de traducción. La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de uricasa puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector el cual contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica la proteína insertada. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores hospedantes para expresar la secuencia que codifica la proteína. Éstos incluyen pero no están limitados a los sistemas de células de mamífero infectadas con un virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etcétera); sistemas de células de insecto infectadas con un virus (por ejemplo, baculovirus) ; microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura o bacterias transformadas con ADN bacteriófago, ADN plásmido o ADN cósmido. Los elementos de expresión de estos vectores pueden variar en sus resistencias y especificidades. Dependiendo del sistema de vectores hospedantes utilizado, se puede utilizar cualquiera de una variedad de elementos de transcripción y traducción adecuados. Cualquiera de los métodos conocidos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector se puede utilizar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste de señales de control de transcripción/traducción apropiadas y las secuencias que codifican la proteína. Estos métodos pueden incluir las técnicas sintéticas y de ADN recombinante in vitro y recombinaciones in vivo (recombinación genética) . La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de uricasa puede ser regulada por una segunda secuencia de ácido nucleico de manera que la proteína de uricasa es expresada en un hospedante transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de uricasa puede ser controlada por cualquier elemento promotor/mej orador conocido en el campo. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión de uricasa incluyen, pero no están limitados a, la región promotora proximal SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-310) , el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus Rous sarcoma (Yamamoto y colaboradores, 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci.

E.U.A. 78:144-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster y colaboradores, 1982, Nature 296:39-42); los vectores de expresión procarióticos tal como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Kamaroff y colaboradores, 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 75:3727-3731), el promotor tac (DeBoer y colaboradores, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 80:21-25) y el promotor osmB . En las modalidades particulares, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa unida de manera operativa a un promotor heterólogo. Una vez que se prepara y se aisla una molécula de ADN recombinante particular que comprende una secuencia de ácido nucleico codificadora, se pueden utilizar varios métodos conocidos en el campo para propagarla. Una vez que se estabiliza el sistema hospedante adecuado y las condiciones de crecimiento, los vectores de expresión recombinante pueden propagarse y prepararse en cantidad. Como se explicara previamente, los vectores de expresión que se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insecto tales como vaculovirus ; vectores de levadura; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN plásmido y cósmido, por nombrar solo algunos pocos. Además, se puede seleccionar una cepa de células hospedantes la cual modula la expresión de las secuencias insertadas o modifica y procesa el producto génico en la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede ser elevada en presencia de ciertos inductores; de esta manera, se puede controlar la expresión de la proteína de uricasa diseñada genéticamente. Además, las diferentes células hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación en la traducción y posterior a la traducción (por ejemplo, glicosilación, escisión) de proteínas. Las líneas celulares apropiadas o sistemas hospedantes pueden seleccionarse para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína foránea expresada. Diferentes sistemas de expresión de vectores/hospedantes pueden efectuar las reacciones de procesamiento tales como las escisiones proteolíticas a diferentes grados. En las modalidades particulares de la invención, la expresión de uricasa en E. coli se realiza preferiblemente utilizando vectores los cuales comprenden el promotor osmB.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Construcción de Gen y Plásmido de Expresión para la Expresión de Uricasa La uricasa porcina recombinante (urato oxidasa) , Cerdo-KS-?N (proteína de uricasa de cerdo truncada en la terminación amino que reemplaza los aminoácidos 291 y 301 por lisina y serina, respectivamente) se expresó en la cepa K-12 de E. coli W3110 F- . Se construyó una serie de plásmidos que culminaban en pOUR-P-?N-ks-1 , el cual con la transformación de las células hospedantes de E. coli fue capaz de dirigir la expresión eficiente de uricasa.

Aislamiento y Subclonación de ADNc de Uricasa de Hígado de Cerdo y Babuino Los ADNcs de uricasa se prepararon a partir de hígados de cerdo y babuino por medio del aislamiento y la subclonación del ARN relevante. El ARN celular total se extrajo de los hígados de cerdo y babuino (Erlich, H. A. (1989) . PCR Technology; Principies and Application for DNA Amplification; Sambrook, J. y colaboradores (1989) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición; Ausubel, F. M. y colaboradores (1998) . Current protocols in molecular Biology) , luego se transcribieron de manera inversa utilizando el Equipo de Síntesis de ADNc First-StrandMR (Pharmacia Biotech) . La amplificación mediante la PCR se realizó utilizando la ADN polimerasa Taq (Gibco BRL, Life Technologies) . Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos utilizados para la amplificación mediante la PCR de urato oxidasas (uricasa) de cerdo y babuino se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Cebadores para la Amplificación mediante la PCR del ADNc de Uricasa Uricasa de hígado de cerdo: efector 5'gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3' (SEQ ID NO. 1 ) antisentido 5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3' (SEQ ID NO. 2) Uricasa de hígado de babuino (D3H): efector 5'gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3' (SEQ ID NO. 3) anti-sentido 5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3' (SEQ ID NO. 4) Las secuencias de enzimas de restricción, introducidas en los extremos de los cebadores y mostradas en letras minúsculas en la Tabla 1, fueron EcoRI y Ncol efectores (cerdo y babuino) y Ncol, HindIII y Xbal antisentido (cerdo) , Xbal y Ncol (babuino) . En el cebador efector de babuino, el tercer codón GAC (ácido aspártico) que está presente en el uricasa de babuino se reemplazó por CAC (histidina) , el codón que está presente en esta posición en la secuencia de codificación del pseudogen de urato oxidasa humana. La construcción de uricasa de babuino recombinante generada utilizando estos cebadores se denomina Uricasa de Babuino D3H.

El producto de la PCR de uricasa de cerdo se digirió con EcoRI y HindIII y se clonó en pUC18 para crear la Uricasa pUC18 -Cerdo. El producto de la PCR de Uricasa de Babuino D3H se clonó directamente en el vector pCRIIMR, utilizando TA CloningMR (Invitrogen, Carlsbad, CA) , creando la Uricasa de Babuino pCRIIMR-D3H. Los ADNcs ligados se utilizaron para transformar la cepa de E. coli XLl-BlueMR (Stratagene, La Jolla, CA) . Se preparó el ADN plásmido que contenía el ADNc de uricasa clonada y los clones que poseían las secuencias de codificación de ADN de uricasa publicadas (excepto por la sustitución de D3H en la uricasa de babuino, mostrada en la Tabla 1) se seleccionaron y se aislaron. En el clon de Uricasa de Babuino pCRIIMR-D3H seleccionado, las secuencias pCRIIMR estuvieron junto al codón de detención de uricasa, resultante de la supresión de las secuencias introducidas por medio de la PCR. Como consecuencia, los sitios de restricción Xbal y Ncol de la región no traducida 3' se eliminaron, permitiendo de esta manera la clonación direccional utilizando Ncol en el extremo 5' del producto de la PCR y BamHl el cual se deriva del vector pCRIIMR.

Subclonación de ADNc de Uricasa en Vectores de Expresión pET Subclonación de Uricasa de Babuino El ADNc de babuino D3H que contenía la secuencia de codificación de uricasa de longitud completa se introdujo en el vector de expresión pET-3d (Novagen, Madison, Wl) . La Uricasa de Babuino pCRIIMR-D3H se digirió con Ncol y BamHl y se aisló un fragmento de 960 pb. El plásmido de expresión pET-3d se digirió con Ncol y BamHl y se aisló un fragmento de 4600 pb . Los dos fragmentos se ligaron para crear pET-3d-D3H-Babuino .

Subclonación de Uricasa Quimera de Cerdo-Babuino La uricasa quimera de cerdo-babuino (PBC) se construyó a fin de lograr la expresión, la estabilidad y la actividad más altas del gen recombinante. La PBC se construyó al aislar el fragmento de Ncol-Apal de 4936 pb del clon pET-3d-D3H-Babuino y ligar el fragmento aislado con el fragmento de Ncol-Apal de 624 pb aislado de la Uricasa pUC18-Cerdo, dando por resultado la formación de pET-3d-PBC. El ADNc de la uricasa PBC consiste en los codones de uricasa de cerdo 1-225 unidos dentro del marco a los codones 226-304 de la uricasa de babuino.

Subclonación de la Uricasa Cerdo-KS La uricasa Cerdo-KS se construyó a fin de agregar un residuo de lisina, el cual puede proporcionar un sitio de conjugación con PEG adicional. KS se refiere al inserto de aminoácido de lisina en la uricasa de cerdo, en la posición 291, en lugar de arginina (R291K) . Además, la treonina en la posición 301 se reemplazó por serina (T301S) . El plásmido de la uricasa CerdoKS se construyó al aislar el fragmento de Ncol-Ndel de 4696 pb de pET-3d-D3H-Babuino y entonces se ligó con el fragmento de Ncol-Ndel de 864 pb aislado de la uricasa pUC18 -Cerdo, dando por resultado la formación de pET-3d-CerdoKS . La secuencia de la uricasa CerdoKS resultante consiste en los codones de uricasa de cerdo 1-288 unidos dentro del marco a los codones 289-304 de la uricasa de babuino.

Subclonación de la Secuencia de Uricasa Bajo Regulación del Promotor osmB El gen de uricasa se subclonó en un vector de expresión que contenía el promotor osmB (siguiendo la enseñanza de la Patente Norteamericana No. 5,795,776, incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad) . Este vector hizo posible la inducción de la expresión de proteínas en respuesta a una presión osmótica alta o envejecimiento de cultivo. El plásmido de expresión pMFOA-18 contuvo el promotor osmB, una secuencia de sitio de enlace al ribosoma (rbs) y una secuencia terminadora de transcripción (ter) . Confiere resistencia a la ampicilina (AmpR) y expresa la acetilcolina esterasa humana recombinante (AChE) .

Subclonación de la Uricasa D3H-Babuino El plásmido pMFOA-18 se digirió con Ncol y BamHl y el fragmento grande se aisló. La construcción pET-3d-D3H- Babuino se digirió con Ncol y BamHl y se aisló el fragmento de 960 pb, el cual incluía el gen de Uricasa D3H-Babuino.

Estos dos fragmentos se ligaron para crear pMFOU18. El plásmido de expresión pMFXT133 contenía el promotor osmB, una rbs (operon deo de E. coli ) , ter (TrypA de E. coli ) , el polipéptido inhibidor del factor Xa recombinante (Fxal) y confirió el gen de resistencia a tetraciclina (TetR) . El gen de uricasa de babuino se insertó en este plásmido a fin de intercambiar los genes de resistencia a antibióticos. El plásmido pMFOUld se digirió con Ncol, se rellenó, luego se digirió con Xhol y se aisló un fragmento de 1030 pb. El plásmido pMFXT133 se digirió con Ndel, se rellenó, luego se digirió con Xhol y se aisló el fragmento grande. Los dos fragmentos se ligaron para crear el vector de expresión de uricasa de babuino, pURBA16.

Subclonación de la Uricasa Quimera de Cerdo y Babuino El plásmido pURBA16 se digirió con Apal y AlwNI y se aisló el fragmento de 2320 pb. El plásmido pMFXT133 se digirió con Ndel, se rellenó, luego se digirió con AlwNI y se aisló el fragmento de 620 pb. La construcción pET-3d-PBC se digirió con Xbal, se rellenó, luego se digirió con Apal y se aisló el fragmento de 710 pb. Los tres fragmentos se ligaron para crear pUR-PB, un plásmido que expresaba la urícasa PBC bajo control del promotor osmB y una rbs así como también la rbs T7 , la cual se derivó del vector pET-3d. La rbs T7 se escindió en un paso adicional. El pUR-PB se digirió con Ncol, se rellenó, luego se digirió con AlwNI y se aisló el fragmento de 3000 pb. El plásmido pMFXT133 se digirió con Ndel, se rellenó y luego se digirió con AlwNI y se asiló el fragmento de 620 pb. Los dos fragmentos se ligaron para formar pDUR-PB, el cual expresa la PBC bajo control del promotor osmB.

Construcción de pOUR-PB-?NC Se introdujeron varios cambios en el ADNc de la uricasa, los cuales dieron por resultado un incremento sustancial en la estabilidad de la enzima recombinante. Se construyó el plásmido pOUR-PBC-?NC, en el cual se retiró tanto el péptido de maduración de seis residuos N-terminal como el tri-péptido en la terminación C, el cual funciona in vivo como una señal de fijación como objetivo peroxisomal. Esto se llevó a cabo al utilizar la secuencia de PBC en el plásmido pDUR-PB y los cebadores de oligonucleótidos específicos listados en la Tabla 2, utilizando la amplificación mediante la PCR.

Tabla 2. Cebadores para la Amplificación mediante la PCR de la Uricasa PBC-?NC Uricasa PBC-?NC: Efector 5'gcgcatATGACTTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAG 3' (SEQ ID NO.5) Antisentido 5'ccgtctagaTTAAGACAACTTCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGTATGG3' (SEQ ID NO.6) Las secuencias de enzimas de restricción introducidas en los extremos de los cebadores se muestran en letras negritas y las regiones no codificantes se muestran en letras minúsculas en la Tabla 2. El Ndel es efector y el Xbal es antisentido. El cebador antisentido también se utilizó para eliminar un sitio de restricción Ndel interno al introducir una mutación puntual (subrayada) la cual no afectó la secuencia de aminoácidos y, de esta manera, facilitó la subclonación por medio del uso de Ndel. El fragmento de 900 pares de bases generados por la amplificación mediante la PCR de pDUR-PB se escindió con Ndel y Xbal y se aisló. El fragmento obtenido entonces se insertó en un plásmido de expresión de deo pDBAST-RAT-N, el cual alberga el promotor deo-PlP2 y una rbs derivada de E. coli y expresa constitutivamente el precursor de insulina recombinante humano. El plásmido se digirió con Ndel y Xbal y el fragmento de 4035 pb se aisló y se ligó al producto de la PCR PBC-uricasa. La construcción resultante, pDUR-PB-?NC, se utilizó para transformar el K-12 Sf733 de E. coli (F - cytR strA) que expresaba un alto nivel de uricasa truncada activa. La secuencia de PBC-?NC doblemente truncada también se expresó bajo control del promotor osmB. El plásmido pDUR-PB-?NC se digirió con AlwNI - Ndel y se aisló el fragmento de 3459 pb. El plásmido pMFXT133, descrito anteriormente, se digirió con Ndel - AlwNI y se aisló el fragmento de 660 pb. Los fragmentos entonces se ligaron para crear pOUR-PB-?NC, el cual se introdujo en la cepa K-12 de E.- coli W3110 F" y expresó un alto nivel de uricasa truncada activa.

Construcción del Plásmido de Expresión de Uricasa pOUR-P-?N-ks-1 Este plásmido se construyó a fin de mejorar la actividad y estabilidad de la enzima recombinante. La uricasa Cerdo-KS-?N se truncó en la terminación N únicamente (?N) , donde se retiró el péptido de maduración N-terminal de seis residuos y contuvo las mutaciones S46T, R291K y T301S. En la posición 46, hubo un residuo de treonina en lugar de serina debido a una mutación conservadora que ocurrió durante la amplificación mediante la PCR y la clonación. En la posición 291, la lisina reemplazó a la arginina y en la posición 301 la serina se insertó en lugar de la treonina. Ambas se derivaron de la secuencia de uricasa de babuino. Las modificaciones de R291K y T301S se designaron KS y se describen anteriormente. El residuo de lisina suplementario proporcionó un sitio de conjugación con PEG potencial, adicional . Para la construcción pOUR-P-?N-ks-1 (Figura 1) , el plásmido pOUR-PB-?NC se digirió con Apal - Xbal y se aisló el fragmento de 3873 pb. El plásmido pET-3d-PKS (construcción mostrada en la Figura 4) se digirió con Apal - Spel y se aisló el fragmento de 270 pb. La escisión de Spel dejó una extensión 5 ' CTAG que se ligó eficientemente a los fragmentos de ADN generados por Xbal. Los dos fragmentos se ligaron para crear pOUR-P-?N-ks-1. Después de la ligadura, los sitios de reconocimiento Spel y Xbal se perdieron (su sitio se muestra entre paréntesis en la Figura 9) . La construcción pOUR-P-?N-ks-1 se introdujo en la cepa K-12 de E. coli W3110 FJ prototrófica, ATCC #27325. La uricasa Cerdo-KS-?N resultante, expresada bajo control del promotor osmB, produjo altos niveles de enzima recombinante que tenía actividad y estabilidad superiores. La Figura 1 ilustra la estructura del plásmido pOUR-P-?N-ks-1. Los números junto a los sitios de restricción indican la posición de nucleótidos, con relación al sitio Haell, designada como 1; los sitios de restricción que se perdieron durante la clonación están marcados entre paréntesis. El plásmido pOUR-P-?N-ks-1, que codifica la uricasa Cerdo-KS-?N tiene una longitud de 4143 pares de bases (pb) y comprendió los siguientes elementos: 1. Un fragmento de ADN, 113 pb de largo, que abarcaba desde el número de nucleótido 1 hasta el sitio Ndel (en la posición 113), el cual incluye el promotor osmB y el sitio de enlace al ribosoma (rbs) . 2. Un fragmento de ADN, 932 pb de largo, que abarcaba desde Ndel (en la posición 113) hasta la unión Spel/Xbal (en la posición 1045), el cual incluye: 900 pb de la región codificante Cerdo-KS-?N (secuencia de ácido nucleico de la proteína de uricasa de cerdo truncada en la terminal amino en la cual los aminoácidos 291 y 301 son reemplazados por lisina y serina, respectivamente) y la secuencia flanqueadora de 32 pb derivada de • pCRIIMR, del sitio de clonación de TA corriente arriba del sitio de restricción Spel/Xbal. 3. Una secuencia de sitios de clonación múltiples de 25 pb (MCS) de la unión Spel/Xbal (en la posición 1045) hasta HindIII (en la posición 1070) . 4. Un oligonucleótido sintético de 40 pb que contenía el terminador de transcripción TrpA (ter) con los extremos HindIII (en la posición 1070) y AatlI (en la posición 1110) . 5. Un fragmento de ADN, 1519 pb de largo, que abarcaba desde los sitios AatlI (en la posición 1110) hasta Mscl/Scal (en la posición 2629) en pBR322 que incluye el gen de resistencia a tetraciclina (TetR) . 6. Un fragmento de ADN, 1514 pb de largo, que abarcaba desde los sitio Seal (en la posición 2629) hasta Haell (en la posición 4143) en pBR322 que incluye el origen de la replicación de ADN. La Figura 2 muestra el ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de la uricasa Cerdo-KS-?N. En esta figura, la numeración de los aminoácidos es de acuerdo con la secuencia de uricasa de cerdo completa. Después del residuo de metionina iniciador, se insertó una treonina en lugar del ácido aspártico de la secuencia de uricasa de cerdo. Este residuo de treonina hizo posible la remoción de metionina por la aminopeptidasa bacteriana. El espacio en la secuencia de aminoácidos ilustra el péptido de maduración N-terminal suprimido. Se indican los sitios de restricción que se utilizaron para los diversos pasos de subclonación de las diferentes secuencias de uricasa (Apal, Ndel, BamHl, EcoRI y Spel) . La secuencia no traducida 3', mostrada en letras minúsculas, se derivó de la secuencia pCRIIMR. El codón de detención de traducción es indicado por un asterisco. La Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las diversas secuencias de uricasa recombinante. La línea superior representa la uricasa de cerdo, la cual incluyó la secuencia de aminoácidos completa. La segunda línea es la secuencia de la uricasa quimera de cerdo-babuino doblemente truncada (PBC-?NC) . La tercera línea muestra la secuencia de la uricasa Cerdo-KS-?N, que solo está truncada en la terminación N y contenía las mutaciones S46T y los cambios de aminoácidos R291K y T301S, ambos que reflejan el origen de babuino de la terminación carboxi de la secuencia de codificación de uricasa. Los asteriscos indican las posiciones en las cuales existen diferencias en los aminoácidos en la uricasa Cerdo-KS-?N en comparación con la secuencia de uricasa de cerdo publicada; los círculos indican las posiciones en las cuales existen diferencias en los aminoácidos en la uricasa Cerdo-KS-?N en comparación con la PBC-?N, la quimera de cerdo-babuino; y las líneas punteadas indican la supresión de aminoácidos. El ADNc para la uricasa nativa de babuino, cerdo y conejo con la mutación Y97H y la quimera de cerdo/babuino (PBC) se construyó para la clonación en E. coli . Se construyeron clones que expresaban altos niveles de variantes de uricasa y se seleccionaron de tal manera que todos fueran W3110 F" E. coli y la expresión es regulada por osmB. Se aislaron los ADNs plásmidos, se verificaron por medio de la secuenciación de ADN y el análisis de enzimas de restricción y se cultivaron las células. La construcción de las uricasas truncadas, inclusive Cerdo-?N y Cerdo-KS-?N se realizó por medio de la ligadura cruzada entre PBC-?NC y Cerdo-KS, después de la escisión con las endonucleasas de restricción Apal y Xbal y Apal más Spel, respectivamente. Es razonable que estos mutantes truncados retuvieran la actividad, puesto que los seis residuos N-terminales, el "péptido de maduración" (1-2) y el tri -péptido C-terminal, "señal de fijación como objetivo peroxisomal" (3-5) no tienen funciones que afecten significativamente la actividad enzimática y es posible que estas secuencias pudieran ser inmunógenas. Se seleccionaron los clones que expresaban niveles muy altos de las variantes de uricasa.

Ejemplo 2. Transformación del Plásmido de Expresión en una Célula Hospedante Bacteriana El plásmido de expresión, pOUR-P-?N-ks-1 , se introdujo en la cepa K-12 de E. coli W3110 FJ Las células bacterianas se prepararon para el crecimiento que involucró la transformación a una fase semi- logarítmica en caldo Luria (LB, por sus siglas en inglés) , luego las células se recolectaron por medio de la centrifugación, se lavaron en agua fría y se suspendieron en glicerol al 10%, en agua, a una concentración de aproximadamente 3xl010 células por ml . Las células se almacenaron en alícuotas, a -70°C. El ADN plásmido se precipitó en etanol y se disolvió en agua. Las células bacterianas y el ADN plásmido se mezclaron y la transformación se realizó por medio del método de electroporación en alto voltaje utilizando Gene Pulser IIMR de BIO-RAD (Trevors y colaboradores (1992) . Electrotransformation of bacteria by plasmid DNA, in Guide to Electroporation and Electrofusion (D. C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders and A. E. Sowers, eds.), páginas 265-290, Academic Press Inc., San Diego, Hanahan y colaboradores (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Las células transformadas se suspendieron en medio SOC (triptona al 2%, extracto de levadura al 0.5%, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucosa 20 mM) , se incubaron a 37°C, durante 1 hora y se seleccionaron por la resistencia a la tetraciclina. Se seleccionó un clon expresador alto.

Ejemplo 3. Preparación de Uricasa Recombinante Las bacterias tales como aquellas transformadas (véase anteriormente) se cultivaron en un medio que contenía glucosa; el pH se mantuvo a 7.2+0.2, a aproximadamente 37 °C. Hacia las últimas 5-6 horas de cultivo, el medio se complementó con KCl hasta una concentración final de 0.3M. El cultivo continuó para permitir la acumulación de uricasa. La uricasa recombinante se acumuló dentro de las células bacterianas como un producto precipitado insoluble similar a los cuerpos de inclusión (IBs, por sus siglas en inglés) . La suspensión de células se lavó por medio de la centrifugación y se suspendió en amortiguador de Tris 50 mM, pH 8.0 y EDTA 10 mM y se llevó hasta un volumen final de aproximadamente 40 veces el peso en seco de las células. Los IBs que contenían uricasa recombinante se aislaron por medio de la centrifugación después de la alteración de las células bacterianas utilizando lisozima y una presión alta. El tratamiento con lisozima (2000-3000 unidades/ml) se realizó durante 16-20 horas a pH 8.0 y 7±3°C, mientras se mezclaba. La pelotilla se lavó con agua y se almacenó a -20°C hasta el uso. Los IBs enriquecidos se procesaron adicionalmente después de la suspensión en amortiguador de NaHC03 50 mM, pH 10.3±0.1. La suspensión se incubó durante toda la noche, a temperatura ambiente, para permitir la solubilización de la uricasa derivada de IB y se eliminó subsecuentemente por medio de la centrifugación. La uricasa se purificó adicionalmente por medio de varios pasos de cromatografía. Inicialmente, la cromatografía se realizó en una columna Q-Sepharose FF. La columna cargada se lavó con amortiguador de bicarbonato que contenía NaCl 150 mM y la uricasa se eluyó con amortiguador de bicarbonato, que contenía NaCl 250 mM. Luego, la resina de xantina-agarosa (Sigma) se utilizó para retirar las impurezas menores de la preparación de uricasa. El eluato de Q-Sepharose FF se diluyó con amortiguador de glicina 50 mM, pH 10.3+0.1, a una concentración de proteína de aproximadamente 0.25 mg/ml y se cargó. La columna se lavó con amortiguador de bicarbonato, pH 10.3+0.1, que contenía NaCl 100 mM y la uricasa se eluyó con el mismo amortiguador complementado con xantina 60 µM. En esta etapa, la uricasa se purificó por medio de la cromatografía en Q-Sepharose para retirar las formas agregadas. La pureza de cada preparación de uricasa es mayor que 95%, determinada por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño. Menos de 0.5% de formas agregadas se detectaron en cada preparación utilizando una columna Superdex 200. La Tabla 3 resume la purificación de la uricasa Cerdo-KS?N de IBs derivados de 25 L de caldo de fermentación.

Tabla.3 Purificación de la Uricasa Cerdo-KS?N Ejemplo 4. Características de las Uricasas Recombinantes SDS-PAGE El análisis de SDS-PAGE de las variantes de •uricasa sumamente purificadas (Figura 4) reveló un patrón preferiblemente distintivo. Las muestras se almacenaron a 4°C, en amortiguador de carbonato, pH 10.3, durante hasta varios meses. Las variantes de longitud completa, Cerdo, Cerdo-KS y PBC, muestran una acumulación de dos productos de degradación mayores que tienen pesos moleculares de aproximadamente 20 y 15kD. Esta observación sugiere que al menos una mella individual dividió la molécula de subunidad de uricasa. Un patrón de degradación diferente se detecta en los clones acortados amino-terminales y también en la uricasa de conejo, pero en una proporción más baja. La terminación amino del conejo se asemeja a aquella de los clones acortados. Se determinaron las secuencias amino-terminales de los fragmentos de uricasa generados durante la purificación y el almacenamiento.

Secuenciación de péptidos La secuenciación N-terminal de preparaciones de uricasa a granel se realizó utilizando el método de degradación de Edman. Se realizaron diez ciclos. La uricasa de cerdo recombinante (clon de longitud completa) generó una abundancia más grande de fragmentos de degradación en comparación con Cerdo-KS-?N. Los sitios deducidos de escisión que conducen a los fragmentos de degradación son los siguientes: 1) Sitio mayor en la posición 168 que tenía la secuencia: --QSG i FEGFI-- 2) Sitio menor en la posición 142 que tenía la secuencia: --IRN i GPPVI-- Las secuencias anteriores no sugieren ninguna escisión proteolítica conocida. No obstante, la escisión podría surgir de ya sea la proteólisis o alguna reacción química. Las uricasas amino- truncadas son sorprendentemente más estables que las uricasas no amino-truncadas . La PBC-?NC también tuvo una estabilidad similar a las otras moléculas ?N y menos que la PBC no amino- truncada.

Potencia La actividad de uricasa se midió por medio de un método de luz ultravioleta. La proporción de reacción enzimática se determinó al medir la disminución en la absorbancia a 292 nm resultante de la oxidación de ácido úrico a alantoína. Una unidad de actividad se define como la cantidad de uricasa requerida para oxidar un µmol de ácido úrico por minuto, a 25°C, en las condiciones especificadas. La potencia de uricasa es expresada en unidades de actividad por mg de proteína (U/mg) . El coeficiente de extinción del ácido úrico 1 mM a 292 nm es 12.2 mM"1 cm"1. Por lo tanto, la oxidación de 1 µmol de ácido úrico por ml de mezcla de reacción dio por resultado una disminución en la absorbancia de 12.2 mA292. El cambio de absorbancia con el tiempo (?A292 por minuto) se derivó de la porción lineal de la curva. La concentración de proteínas se determinó utilizando un método modificado de Bradford (Macart y Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101). La actividad específica (potencia) de uricasa se calculó al dividir la actividad en U/ml con una concentración de proteína en mg/ml. Los resultados de la actividad enzimática de las diversas uricasas recombinantes se resumen en la Tabla 4. Los resultados de preparaciones comerciales se incluyen en esta tabla como valores de referencia. Es aparente a partir de estos resultados que el truncamiento de proteínas de uricasa no tiene un efecto significativo sobre su actividad enzimática.

Tabla 4. Resumen de Parámetros Cinéticos de Uricasas Recombinantes y Nativas Notas de la Tabla 4 : (1) La concentración de proteínas se determinó por medio de la absorbancia medida a 278 nm, utilizando un coeficiente de extinción de 11.3 para una solución de uricasa 10 mg/ml (Mahler, 1963) . (2) 1 unidad de actividad de uricasa se define como la cantidad de enzima que oxida 1 µmol de ácido úrico a alantoína por minuto, a 25 °C. (3) Los valores de actividad específica se derivaron de los diagramas de Lineweaver-Burk, en una concentración de substrato equivalente a 60 µM. (4) Las Mezclas de Reacción estaban compuestas de varias combinaciones de las siguientes soluciones madre amortiguador de borato de sodio 100 mM, pH 9.2 ácido úrico 300 µM en amortiguador de borato de sodio 50 mM, pH 9.2 1 mg/ml de BSA en amortiguador de borato de sodio 50 mM, pH 9.2. (5) El valor Kca se calculó al dividir el valor Vmax (calculado a partir de los diagramas respectivos de Lineweaver-Burk) por la concentración de uricasa en la mezcla de reacción (expresada en equivalentes en mol, basados en los pesos moleculares tetraméricos de las uricasas) .

Ejemplo 5. Conjugación de Uricasa con m-PEG (Conjugación con PEG) La uricasa Cerdo-KS-?N se conjugó utilizando m-PEG-NPC (monometoxi-poli (etilenglicol) -carbonato de nitrofenilo) . Se establecieron las condiciones que daban por resultado 2 - 12 cadenas de PEG 5, 10 o 20 kD por subunidad de uricasa. El m-PEG-NPC se agregó gradualmente a la solución de proteína. Después de que se concluyó la adición de PEG, la mezcla de reacción de uricasa/m-PEG-NPC entonces se incubó a 2-8°C durante 16-18 horas, hasta que la cantidad máxima de cadenas de m-PEG no enlazadas se conjugaron a la uricasa. El número de cadenas de PEG por monómero de PEG-uricasa se determinó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño Superóse 6 (SEC) , utilizando estándares de PEG y uricasa. El número de cadenas de PEG enlazadas por subunidad se determinó por medio de la siguiente ecuación: PEG 3.42 x Cantidad de PEG en la muestra inyectada (µg) cadenas/subunidad = Cantidad de proteína en la muestra inyectada (µg) La concentración de las porciones de PEG y proteína en la muestra de PEG-uricasa se determinó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) utilizando detectores de luz ultravioleta (UV) e índice de refracción (Rl) ordenados en serie (desarrollados por Kunitani y colaboradores, 1991) . Se generaron tres curvas de calibración: una curva de proteína (absorción medida a 220 nm) ; una curva de proteína (medida por el Rl) ; y curva de PEG (medida por medio del Rl) . Entonces, las muestras de PEG-uricasa se analizaron utilizando el mismo sistema. Los valores de área máximos de UV y Rl resultantes de las muestras experimentales se utilizaron para calcular las concentraciones del PEG y la proteína con relación a las curvas de calibración. El índice de 3.42 es la relación entre el peso molecular del monómero de uricasa (34,192 Daltons) con respecto a aquel del PEG 10 kD. El PEG unido mejoró la solubilidad de la uricasa en soluciones que tenían valores de pH fisiológico. La Tabla 5 proporciona una indicación de la variabilidad entre lotes del producto de uricasa Cerdo-KS-?N conjugada con PEG. En general, existe una relación inversa entre el número de cadenas de PEG unidas y la actividad específica retenida (SA) de la enzima.

Tabla 5. Actividad Enzimática de Conjugados de la Uricasa Cerdo-KS-?N Conjugada con PEG Ejemplo 6. Conjugación con PEG de uricasa con PEG 1000 D y 100,000 D La Uricasa Cerdo-KS-?N se conjugó utilizando m-PEG-NPC 1000 D y 100,000 D como se describe en el Ejemplo 5. Se utilizaron las condiciones que daban por resultado 2 - 11 cadenas de PEG por subunidad de uricasa. Después de que se concluyó la adición de PEG, la mezcla de reacción de uricasa/m-PEG-NPC entonces se incubó a 2-8°C durante 16-18 horas, hasta que una cantidad máxima de cadenas de m-PEG no enlazadas se conjugaron a la uricasa. El número de cadenas de PEG por monómero de PEG-uricasa se determinó como se describiera anteriormente. El PEG unido mejoró la solubilidad de la uricasa en soluciones que tenían valores de pH fisiológico.

Ejemplo 7. Farmacocinética de la Uricasa Cerdo-KS-?N Conjugada con PEG Los experimentos biológicos se realizaron a fin de determinar el grado óptimo y el tamaño de conjugación con PEG necesaria para proporcionar un beneficio terapéutico. Los estudios farmacocinéticos en ratas, utilizando inyecciones i.v. de 0.4 mg (2U) por kg de peso corporal de uricasa no modificada, administradas en el día 1 y el día 8, produjeron una vida media en circulación de aproximadamente 10 minutos. Sin embargo, los estudios de la proporción de eliminación en ratas con PEG 2-llxlOkD-uricasa Cerdo-KS-?N, después de hasta 9 inyecciones semanales, indicaron que la eliminación no dependió del número de cadenas de PEG (dentro de este intervalo) y permaneció relativamente constante por todo el período del estudio (véase la Tabla 6; con una vida media de aproximadamente 30 horas) . Las diferencias de semana a semana están dentro del error experimental. Este mismo patrón es aparente después de nueve inyecciones de los conjugados de PEG 10x5kD y PEG 10x20kD-uricasa. Los resultados indicaron que sin importar el grado de conjugación con PEG de la uricasa, en este intervalo, se observaron efectos biológicos similares en el modelo de rata.

Tabla 6. Vidas Medias de las Preparaciones de la Uricasa Cerdo-KS-?N Conjugada con PEG en Ratas Notas de la Tabla 6 : Los resultados se indican en horas ± error estándar del promedio. Los números entre paréntesis indican el número de animales sometidos a prueba . Las ratas recibieron inyecciones i.v. semanalmente de 0.4 mg por kilogramo de peso corporal de la uricasa Cerdo-KS-?N modificada como se indica en la tabla. Cada grupo comprendió inicialmente 15 ratas, las cuales se sangraron alternadamente en subgrupos de 5. Varias ratas murieron durante el estudio debido a la anestesia. Las vidas medias se determinaron al medir la actividad de uricasa (ensayo colorimétrico) en muestras de plasma recolectadas en 5 minutos y 6, 24 y 48 horas después de la inyección. La Tabla 5 describe los lotes de uricasa conjugada con PEG utilizados en el estudio. Los estudios de biodisponibilidad con PEG 6x5 kD-uricasa Cerdo-KS-?N en conejos indican que, después de la primera inyección, la vida media en circulación es 98.2±1.8 horas (i.v.) y la biodisponibilidad después de inyecciones i.m. y subcutáneas (s.c.) fue 71% y 52%, respectivamente. Sin embargo, se detectaron títulos de anticuerpos anti-uricasa significativos, después de las segundas inyecciones i.m. y s.c., en todos los conejos y la eliminación se aceleró después de las inyecciones subsecuentes. Las inyecciones de ratas con el mismo conjugado dieron por resultado una vida media de 26+1.6 horas (i.v.) y la biodisponibilidad después de inyecciones i.m. y s.c. fue 33% y 22%, respectivamente. Los estudios en ratas, con PEG 9x10 kD-uricasa Cerdo-KS-?N indican que la vida media en circulación después de la primera inyección es 42.4 horas (i.v.) y la biodisponibilidad, después de inyecciones i.m. y s.c., fue 28.9% y 14.5%, respectivamente (véase la Figura 5 y la Tabla 7) . Después de la cuarta inyección, la vida media en circulación fue 32.1+2.4 horas y la biodisponibilidad, después de inyecciones i.m. y s.c. fue 26.1% y 14.9%, respectivamente . Los estudios farmacocinéticos similares, en conejos, con PEG 9x10 kD-uricasa Cerdo-KS-?N, indican que no se observó una eliminación acelerada después de la inyección de este conjugado (se administraron 4 inyecciones cada dos semanas) . En estos animales, la vida media en circulación después de la primera inyección fue 88.5 horas (i.v.) y la biodisponibilidad, después de inyecciones i.m. y s.c. fue 98.3% y 84.4%, respectivamente (véase la Figura 6 y la Tabla 7) . Después de la cuarta inyección, la vida media en circulación fue 141.1+15.4 horas y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c. fue 85% y 83%, respectivamente. Los estudios similares con PEG 9x10 kD-Cerdo-KS-?N se realizaron para valorar la biodisponibilidad en perros sabuesos (2 machos y 2 hembras en cada grupo) . La vida media en circulación de 70±11.7 horas se registró después de la primera inyección i.v. y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c. fue 69.5% y 50.4%, respectivamente (véase la Figura 7 y la Tabla 7) . Los estudios con PEG 9x10 kD-Cerdo-KS-?N se realizaron utilizando cerdos. Se utilizaron tres animales por grupo para la administración por vía de las rutas i.v., s.c. e i.m.. La vida media en circulación de 178±24 horas se registró después de la primera inyección i.v. y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c. fue 71.6% y 76.8%, respectivamente (véase la Figura 8 y la Tabla 7) .

Tabla 7. Estudios Farmacocinéticos con PEG 9x10 kD- Uricasa Cerdo-KS-?N Los estudios de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) se realizaron después de la yodación de PEG 9x10 kD-uricasa Cerdo-KS-?N por medio del método de Bolton & Hunter con 125I . El conjugado etiquetado se inyectó en 7 grupos de 4 ratas cada uno (2 machos y 2 hembras) . La distribución de la radioactividad se analizó después de 1 hora y cada 24 horas durante 7 días (excepto el día 5) . Cada grupo, a su vez, se sacrificó y los diferentes órganos se escindieron y se analizaron. El séptimo grupo se mantuvo en una jaula metabólica, de la cual se recolectó la orina y las heces. La distribución del material por todo el cuerpo del animal se evaluó al medir la radioactividad total en cada órgano y la fracción de conteos (riñon, hígado, pulmón y bazo) que estuvieron disponibles para la precipitación con TCA (es decir proteína enlazada, normalizada al tamaño del órgano) . De los órganos que se escindieron, ninguno tuvo una radioactividad específica más alta que los otros, de esta manera no se observó una acumulación significativa por ejemplo en el hígado o el riñon. 70% de la radioactividad fue excretada en el día 7.

Ejemplo 8. Resultados de Pruebas Clínicas Un estudio de grupos paralelos, multicéntrico, de rótulo abierto, aleatorizado se realizó para valorar la respuesta al urato y los perfiles farmacocinéticos y de seguridad de PEG-uricasa (PuricaseMR, Savient Pharmaceuticals) en pacientes humanos con hiperuricemia y gota grave quienes no fueron sensibles a o fueron intolerantes a la terapia convencional . La duración promedio de la enfermedad fue 14 años y 70 por ciento de la población del estudio tuvo una o más tobas. En el estudio, 41 pacientes (edad promedio de 58.1 años) se aleatorizaron a 12 semanas de tratamiento con PEG-uricasa intravenosa en uno de cuatro regímenes de dosificación: 4 mg cada dos semanas (7 pacientes) ; 8 mg cada dos semanas (8 pacientes) ; 8 mg cada cuatro semanas (13 pacientes) ; o 12 mg cada cuatro semanas (13 pacientes) . La actividad de uricasa y los niveles de urato en el plasma se midieron en intervalos definidos. Los parámetros farmacocinéticos, la concentración promedio de urato en el plasma y el porcentaje de tiempo que el urato en el plasma fue menor que o igual a 6 mg/dL se derivaron del análisis de las actividades de uricasa y niveles de urato. Los pacientes que recibieron 8 mg de PEG-uricasa cada dos semanas tuvieron la reducción más grande en PÚA con niveles inferiores a 6 mg/dL 92 por ciento del tiempo de tratamiento (urato en el plasma previo al tratamiento de 9.1 mg/dL contra urato en el plasma promedio de 1.4 mg/dL durante 12 semanas) . Los niveles de urato en el plasma más bajos sustanciales y sostenidos también se observaron en los otros grupos de dosificación de tratamiento con PEG-uricasa: PÚA inferior a 6 mg/ml 86 por ciento del tiempo de tratamiento en el grupo de 8 mg cada cuatro semanas (urato en el plasma previo al tratamiento de 9.1 mg/dL contra urato en el plasma promedio de 2.6 mg/dL durante 12 semanas) ; PÚA inferior 6 mg/ml 84 por ciento del tiempo de tratamiento en el grupo de 12 mg cada cuatro semanas (urato en el plasma previo al tratamiento de 8.5 mg/dL contra urato en el plasma promedio de 2.6 mg/dL durante 12 semanas) ; y PÚA inferior a 6 mg/ml 73 por ciento del tiempo de tratamiento en el grupo de 4 mg cada dos semanas (urato en el plasma previo al tratamiento de 7.6 mg/dL contra urato en el plasma promedio de 4.2 mg/dL durante 12 semanas) . El porcentaje de disminución máximo en el ácido úrico en el plasma desde la línea de referencia dentro de las primeras 24 horas de dosificación de PEG-uricasa fue 72% para sujetos que recibían 4 mg/2 semanas (p igual .0002); 94% para sujetos que recibieron 8 mg/2 semanas (p menor que .0001); 87% para sujetos que recibieron 8 mg/4 semanas (p menor que .0001) y 93% para sujetos que recibieron 12 mg/4 semanas (p menor que .0001) . El porcentaje de disminución del ácido úrico en el plasma desde la línea de referencia durante el período de tratamiento de 12 semanas fue 38% para sujetos que recibieron 4 mg/2 semanas (p igual .0002); 86% para sujetos que recibieron 8 mg/2 semanas (p menor que .0001); 58% para sujetos que recibieron 8 mg/4 semanas (p igual .0003) y 67% para sujetos que recibieron 12 mg/4 semanas (p menor que .0001) . Sorprendentemente, algunos sujetos que recibieron PEG-uricasa experimentaron un evento adverso relacionado con la infusión, es decir una reacción de infusión. Estas reacciones ocurrieron en 14% de las infusiones totales. Todas las referencias citadas en este documento se incorporan en el mismo a manera de referencia en su totalidad y para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación o patente o solicitud de patente individual fuera indicada de manera específica e individual para incorporarse a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Muchas modificaciones y variaciones de la presente invención se pueden hacer sin apartarse de su espíritu y alcance, como será aparente para aquellas personas expertas en el campo. Las modalidades específicas descritas en este documento se ofrecen a manera de ejemplo únicamente y la invención debe limitarse únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance completo de equivalentes a los cuales tienen derecho estas reivindicaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una uricasa aislada, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 8 hasta la posición 287 de la SEQ ID NO. 7.

2. La uricasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 8.

3. La uricasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un aminoácido amino-terminal, en donde el aminoácido amino-terminal es alanina, glicina, prolina, serina o treonina.

4. La uricasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un aminoácido amino-terminal, en donde el aminoácido amino-terminal es metionina.

5. Una uricasa aislada, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la posición 8 hasta la posición 287 de la SEQ ID NO. 12.

6. La uricasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13.

7. La uricasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque además comprende un aminoácido amino-terminal, en donde el aminoácido amino-terminal es alanina, glicina, prolina, serina o treonina.

8. La uricasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque además comprende un aminoácido amino-terminal, en donde el aminoácido amino-terminal es metionina.

9. La uricasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la uricasa es una uricasa conjugada con PEG.

10. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una uricasa seleccionada del grupo que consiste de: la uricasa de la reivindicación 1, la uricasa de la reivindicación 2, la uricasa de la reivindicación 3, la uricasa de la reivindicación 5, la uricasa de la reivindicación 6 y la uricasa de la reivindicación 7.

11. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico está unida de manera operativa a un promotor heterólogo .

12. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el promotor es el promotor osmB .

13. Un vector de ácido nucleico, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11.

14. Una célula hospedante, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 13.

15. Un método para producir una uricasa, caracterizado porque comprende los pasos que consisten en cultivar una célula hospedante de conformidad con la reivindicación 14 bajo condiciones tales que la secuencia de ácido nucleico sea expresada por la célula hospedante y aislar la uricasa expresada.