CN106554948B - 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用 - Google Patents

突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变型尿酸酶、PEG修饰的突变型尿酸酶及其应用,具体地,本发明公开了一种突变型尿酸酶,所述突变型尿酸酶具有重组引入的半胱氨酸残基,并且所述的半胱氨酸残基位于尿酸酶的非活性区域,并且在突变型尿酸酶中偶联一个或多个PEG,得到的PEG化的突变型尿酸酶具有延长半衰期、产物均一化、酶活性稳定的特点,因此,具有广泛的应用前景。

Description

突变型尿酸酶、PEG修饰的突变型尿酸酶及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域,具体地,涉及一种突变型尿酸酶、PEG修饰的突变型尿酸酶及其应用。
背景技术
尿酸氧化酶(EC 1.7.3.3)也称尿酸酶,它能专一性催化尿酸氧化分解成尿囊素。由于尿酸酶编码基因的突变,人体内不能合成有活性的尿酸氧化酶。随着人们生活水平的不断提高,高蛋白饮食的摄入过量,导致血尿酸水平升高进而引发高尿酸血症,最终发展成痛风。近年来,慢性高尿酸血症/痛风的发病率不断升高,据不完全统计已经达到了总人口的10%以上。此外,高尿酸血症也是肿瘤病人面临的严重化疗副作用之一,因此尿酸酶制剂不仅可用于痛风的治疗,同时也是肿瘤化疗病人必不可少的辅助治疗药物,其应用非常广泛。
目前临床使用广泛的治疗痛风的药物大多为消炎镇痛药和促进尿酸排泄药,具有极大的副作用。尿酸酶作为尿酸的天然分解酶,将尿酸分解为尿囊素而排出体外,其副作用远远低于痛风的传统用药。目前国际上已经上市的尿酸酶类药物极少,国内目前没有任何自主研发的尿酸酶类药物上市。
近年来,为了解决蛋白类药物在体内半衰期短,免疫源性高等缺点,PEG修饰蛋白药物的方法得到了长足发展,而“氨基修饰”是最普遍最常用的PEG修饰方法,主要针对赖氨酸Lys-ε-氨基和N-端α-氨基,Pegloticase就采用了此种PEG修饰方法。但是尿酸酶是一个同源四聚体,每个亚基含有多达31个Lys,而每次PEG修饰只能随机非定点的修饰其中一部分Lys,这使得修饰产物十分不均一,不稳定。
与氨基修饰相比,巯基在蛋白的组成中含量很低,位置确定,因而可针对那些对活性影响不大、呈游离状态的巯基,进行定点修饰。
因此,本领域迫切需要开发一种新的PEG修饰方式——“尿酸酶PEG巯基修饰”方式,该修饰方式具有稳定且产物均一的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的PEG修饰方式——“尿酸酶PEG巯基修饰”方式,该修饰方式具有稳定且产物均一的特点。
本发明第一方面提供了一种突变型尿酸酶,所述突变型尿酸酶具有重组引入的半胱氨酸残基,并且所述的半胱氨酸残基位于尿酸酶的非活性区域。
在另一优选例中,所述的突变型尿酸酶具有野生型尿酸酶(SEQ ID NO.:1)的至少70%(≥70%)的酶活性。
在另一优选例中,所述的非活性区域为尿酸酶的选自下组的区域:
(a)尿酸酶的第103±3位、第148±3位、第177±3位、第202±3位、第228±3位、第291±3位;
(b)尿酸酶的N端之前;
(c)尿酸酶的C端之后;
(d)上述(a)、(b)和(c)的任意组合;
其中,所述的氨基酸位置基于SEQ ID NO.:1所示的尿酸酶序列。
在另一优选例中,所述的重组引入的半胱氨酸残基的数量为1-4个,较佳地为1-3个,更佳地为1-2个,最佳地为1个。
在另一优选例中,所述的重组引入的半胱氨酸残基的引入方式包括:替换(置换)、插入(位于非末端时)和/或添加(位于N端或C端时)。
在另一优选例中,所述的非活性区域为尿酸酶的选自下组的区域:尿酸酶的第103±1位、第148±1位、第177±1位、第202±1位、第228±1位、第291±1位;更佳地,为尿酸酶的第103位、第148位、第177位、第202位、第228位、第291位。
在另一优选例中,所述的重组引入的半胱氨酸残基的引入方式为替换(或置换)。
在另一优选例中,被替换的原氨基酸选自下组:K、N、Q、G、或其组合。
在另一优选例中,被替换的原氨基酸选自下组:第103位赖氨酸、第148位天冬酰胺、第177位谷氨酰胺、第202位甘氨酸、第228位赖氨酸、第291位赖氨酸、或其组合。
在另一优选例中,所述的重组引入的半胱氨酸残基位于N端。
在另一优选例中,所述的重组引入的半胱氨酸残基位于C端。
在另一优选例中,所述的重组引入的半胱氨酸残基选自下组:K103C、N148C、G202C、K228C、K291C、或其组合。
在另一优选例中,所述的“非活性区域”指尿酸酶的活性没有实质性影响的区域,即所述非活性区域发生突变后,所形成的突变型尿酸酶仍保留了至少70%(如70-200%,较佳地80-150%,更佳地90-140%)野生型尿酸酶的活性。
在另一方面,本发明还提供了上述突变型尿酸酶的衍生多肽,这些衍生多肽在上述突变型尿酸酶基础上,还可具有一个或几个氨基酸残基(优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基)的取代、缺失或添加,并且所述衍生多肽尿酸酶活性。
在另一优选例中,所述突变型尿酸酶的活性保留率≥70%,较佳地为80-200%,更佳地为100-150%。
在另一优选例中,所述突变型尿酸酶的酶平均比活≥10U/mg,较佳地为12-30U/mg,更佳地为15-25U/mg。
在另一优选例中,所述突变型尿酸酶为SEQ ID NO.:1所示的尿酸酶经突变后形成的。
在另一优选例中,在SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列中重组引入的半胱氨酸残基选自下组:K103C、N148C、G202C、K228C、K291C、或其组合。
本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸,所述序列编码本发明第一方面所述的突变型尿酸酶。
在另一优选例中,所述多核苷酸编码的突变型尿酸酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.:1所示,并且还含有选自下组的重组引入的半胱氨酸残基:K103C、N148C、G202C、K228C、K291C、或其组合。
在另一优选例中,所述的多核苷酸在突变型尿酸酶的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件:信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。
在另一优选例中,所述的多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示的突变型尿酸酶。
在另一优选例中,所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述的多核苷酸选自下组:DNA序列、和RNA序列。
本发明第三方面提供了一种载体,它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞,它含有本发明第三方面所述的载体或在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述突变型尿酸酶的方法,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养本发明第四方面所述的宿主细胞,从而表达出本发明第一方面所述的突变型尿酸酶;和
分离所述突变型尿酸酶。
本发明第六方面提供了一种PEG化的突变型尿酸酶,所述的突变型尿酸酶为本发明第一方面所述的突变型尿酸酶,并且所述的PEG化的位点为所述的重组引入的半胱氨酸残基位置。
在另一优选例中,所述的PEG化的突变型尿酸酶中,PEG为定点化修饰的。
在另一优选例中,所述的定点化修饰指重组引入的半胱氨酸残基位点,优选地选自下组:K103C、N148C、G202C、K228C、K291C、或其组合。
在另一优选例中,所述的PEG化的突变型尿酸酶中,PEG化的位点的数量为1-4个,较佳地为1-3个,更佳地为1-2个。
在另一优选例中,所述的PEG化是通过与马来酰亚胺型PEG分子进行反应而形成的。
在另一优选例中,所述的马来酰亚胺型PEG分子的分子量为10-40KDa,较佳地为15-30KDa。
在另一优选例中,所述突变型尿酸酶包括单体、或四聚体形式。
在另一优选例中,所述的PEG化的突变型尿酸酶(单体)的分子量为45,000-80,000Da,较佳地50,000-70,000Da。
在另一优选例中,所述的PEG化的突变型尿酸酶(四聚体)的分子量为160,000-240,000Da,较佳地180,000-200,000Da。
在另一优选例中,所述的PEG化的突变型尿酸酶中,所述重组引入的半胱氨酸残基位点的PEG化比例为50-100%(摩尔),较佳地为60-90%(摩尔)。
在另一优选例中,所述PEG通过化学键(如共价键)偶联到所述的重组引入的半胱氨酸残基。
在另一优选例中,所述PEG化的突变型尿酸酶的半衰期≥72小时,较佳地为80-120小时,更佳地为90-110小时。
在另一优选例中,所述PEG化的突变型尿酸酶的酶比活≥10U/mg,较佳地为15U/mg。
在另一优选例中,所述PEG化的突变型尿酸酶具有以下一个或多个特征:
(i)在pH6-10具有酶活性(较佳地所述pH下的酶活性为最高酶活性的至少50%);
(ii)在5℃-45℃具有酶活性(较佳地所述温度下的酶活性为最高酶活性的至少30%)。
本发明第七方面提供了一种药物组合物,包括:
本发明第六方面所述的PEG化的突变型尿酸酶;和
药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中,所示的药物组合物为注射剂、冻干制剂。
本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的突变型尿酸酶、本发明第六方面所述的PEG化的突变型尿酸酶和本发明第七方面所述的药物组合物的用途,其特征在于,用于制备治疗痛风和/或降低尿酸水平的药物。
本发明第九方面提供了一种制备本发明第六方面所述的PEG化的突变型尿酸酶的方法,包括步骤:
(i)提供本发明第一方面所述的突变型尿酸酶;
(ii)对步骤(i)的突变型尿酸酶进行PEG化处理,从而形成本发明第六方面所述的PEG化的突变型尿酸酶。
在另一优选例中,在步骤(ii)中,所述的PEG化处理包括用带有马来酰亚胺活性基团的聚乙二醇(mPEG-Ala-MAL)进行PEG化反应。
在另一优选例中,在步骤(ii)中,所述的PEG化处理在20-30℃进行。
在另一优选例中,在步骤(ii)中,所述的PEG化处理进行0.5-3小时。
在另一优选例中,在步骤(ii)之后,还包括对形成的所述的PEG化的突变型尿酸酶进行分离和/或纯化。
本发明第十方面提供了一种非治疗性的降低哺乳动物体液或组织中尿酸水平的方法,包括步骤:给施用对象施用本发明第六方面所述的PEG化的突变型尿酸酶;和
检测所述施用对象的体液或组织中的尿酸水平。
在另一优选例中,所述施用对象包括非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述施用对象包括啮齿动物,包括大鼠、小鼠。
在另一优选例中,所述施用方式包括静脉注射、腹腔注射、皮下注射。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了野生型尿酸酶三维立体模拟结构中定点突变点的位置示意图。其中,图1A为侧面观;图1B为顶面观。
图2显示了载体质粒pET3d和目的片段突变体PBC经NcoI和BamHI双酶切电泳结果图。其中,PBC表示本发明所述的野生型尿酸酶。
图3a显示了突变点位于序列中的多个突变株的PCR鉴定图。其中,1,2:K103C;3,4:N148C;5,6:Q177C;7,8:G202C;9,10:K228C;M:Marker(分子量标准);11:阴性对照(NC);12,13:G274C;14,15:K291C。
图3b显示了突变点位于序列末端的2个突变株的PCR鉴定图。其中,1-3:N-ter-C;4-6:C-ter-C;M:Marker(分子量标准)。
图4a显示了突变点位于序列中的7个突变株经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。其中,M:Marker(分子量标准);1:野生型PBC沉淀;2:K103C上清;3:K103C沉淀;4:N148C上清;5:N148C沉淀;6:Q177C上清;7:Q177C沉淀;8:G202C上清;9:G202C沉淀;10:K228C上清;11:K228C沉淀;12:G274C上清;13:G274C沉淀;14:K291C上清;15:K291C沉淀。其中,表达的尿酸酶蛋白(单体)的分子量为约35Kda。
图4b显示了突变点位于序列末端的2个突变株经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。其中,M:Marker(分子量标准);1:野生型PBC沉淀;2,4,6:N-ter-C上清;3,5,7:N-ter-C沉淀;8,10,12:C-ter-C上清;9,11,13:C-ter-C沉淀。其中,表达的尿酸酶蛋白(单体)的分子量为约35Kda。
图5a显示了突变点位于序列中的多个重组尿酸酶蛋白和野生型尿酸酶蛋白经PEG修饰后SDS-PAGE鉴定结果图。其中,M:Marker(分子量标准);1:mPEG-K103C;2:mPEG-N148C;3:mPEG-Q177C;4:mPEG-G202C;5:mPEG-G274C;6:mPEG-K291C;7:mPEG-K228C;8:mPEG-PBC(野生型尿酸酶蛋白)。
图5b显示了突变点位于序列末端的2个重组尿酸酶蛋白和野生型尿酸酶蛋白经PEG修饰后SDS-PAGE鉴定结果图。其中,M:Marker(分子量标准);1:mPEG-C-ter-C;2:mPEG-N-ter-C;3:mPEG-PBC(野生型尿酸酶蛋白)。
图6显示了PEG修饰的重组尿酸酶PEG-K103C与未修饰的K103C pH稳定性比较结果。
图7显示了PEG修饰的重组尿酸酶PEG-K103C与未修饰的K103C热稳定性的比较结果。
图8显示了PEG修饰的重组蛋白PEG-K103C与未修饰的K103C单次给药后小鼠血清酶活性-时间曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外的发现,虽然野生型尿酸酶具有多个半胱氨酸位点,但是却无法有效地被PEG化,如果在重组的尿酸酶的特定位置(如非活性区域、N端和/或C端)人工引入半胱氨酸,所形成的尿酸酶突变体能够保留尿酸酶70%以上的活性(甚至对活性有提高),并且对上述尿酸酶突变体进行PEG定点化修饰,得到的PEG化的尿酸酶突变体具有半衰期更长、产物均一化、酶活性更稳定等特点。在此基础上,本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“突变型尿酸酶”、“突变体尿酸酶”、“尿酸酶突变体”可互换使用,都指本发明第一方面中所述的重组引入了半胱氨酸残基且保留尿酸酶活性的突变蛋白。半胱氨酸的重组引入为定点引入,具体地,在尿酸酶的N端、C端、或者尿酸酶的非活性区域定点引入半胱氨酸。引入半胱氨酸后的尿酸酶(即突变型尿酸酶)仍保留了至少70%(如70-200%,较佳地80-150%,更佳地90-140%)野生型尿酸酶的活性。
本发明还提供了上述突变型尿酸酶的衍生多肽,这些衍生多肽在上述突变型尿酸酶基础上,还可具有一个或几个氨基酸残基(优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基)的取代、缺失或添加,并且所述衍生多肽尿酸酶活性。
如本文所用,所述“PEG”指聚乙二醇,具体地,指环氧乙烷缩聚物和水的混合物,由通式H(OCH2CH2)nOH表示,其中,n≥4。通常,PEG分子的分子量≥5KDa,较佳地为10-40KDa,更佳地为15-30KDa。
起始尿酸酶
在本发明中,用作起始尿酸酶的尿酸酶没有特别限制,可以是任何来源的尿酸酶,代表性的例子包括(但并不限于):哺乳动物的尿酸酶、重组的尿酸酶。此外,起始尿酸酶的尿酸酶可以是野生型的尿酸酶,也可以是含有突变的突变型尿酸酶。
一种优选的起始尿酸酶是包含两种或多种哺乳动物氨基酸序列的嵌合蛋白,如包含猪尿酸酶和狒狒尿酸酶的区段的重组尿酸酶。
在另一优选例中,所述起始尿酸酶的N端来源于猪尿酸酶,其C端来源于狒狒尿酸酶。更佳地,起始尿酸酶的N端来源于猪尿酸酶的225个氨基酸,其C端来源于狒狒尿酸酶的79个氨基酸。
一种典型的起始尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
PEG化的突变型尿酸酶
突变型尿酸酶可使用本领域已知方法通过化学键共价结合PEG。通常,PEG可通过连接基团与突变型尿酸酶结合,其中连接基团可以选自下组:琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、或其组合。另外,突变型尿酸酶还可以通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联(即没有连接基团)。
在本发明的一个优选例中,PEG通过化学键(如共价键)与突变型尿酸酶上重组引入的半胱氨酸残基进行偶联。
在本发明的一个优选例中,PEG是定点修饰的。突变型尿酸酶可以为单体、或四聚体。该酶可以共价结合1-4个,较佳地,1-3个,更佳地1-2个PEG。这些PEG可以是线型链,也可以是分支链。
一种优选的PEG化的突变型尿酸酶(四聚体)的分子量为160,000-220,000Da。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物,它含有有效量的本发明的PEG化的突变型尿酸酶,以及药学上可接受的载体。通常,可将本发明的PEG化的突变型尿酸酶配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地,pH约为6-8。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量,如0.001-99wt%;较佳的0.01-95wt%;更佳的,0.1-90wt%。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的PEG化的突变型尿酸酶以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明PEG化的突变型尿酸酶的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:本发明PEG化的突变型尿酸酶的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对尿酸水平高的患者,通常,当本发明的PEG化的突变型尿酸酶每天以约0.5mg-100mg/kg动物体重(较佳的1mg-50mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开的剂量,或将剂量按比例地减少。
注射前,本发明的PEG化的突变型尿酸酶可与磷酸缓冲盐水溶液或任何其他本领域技术人员已知的合适溶液混合,本发明的药物组合物可如所需要作为亲液体(lyophilate)或液体制剂施用。
一种降低体液或组织中尿酸水平的方法
在另一优选例中,所述方法包括:摄取本发明的药物组合物。所述实验对象为人。
在另一优选例中,所述方法包括:摄取本发明的药物组合物。所述实验对象为动物,较佳地为鼠类,兔类。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明在尿酸酶中定点引入半胱氨酸,引入半胱氨酸后形成的突变型尿酸酶能够保留至少70%(如70-200%,较佳地80-150%,更佳地90-140%)野生型尿酸酶的活性。
(2)本发明的突变型尿酸酶的半胱氨酸残基与PEG进行偶联,得到PEG化的突变型尿酸酶,PEG修饰后的突变型尿酸酶具有延长半衰期、产物均一化、酶活性稳定的特点。
实施例1确定突变位点
本发明人经过大量分析研究,最终确定了8个突变位点(定点突变为半胱氨酸),其中,6个位点暴露于四聚体的外部,2个位点位于C端和N端(表1、图1)。
表1 不同突变位点的选择及被半胱氨酸(Cys)替换的氨基酸
实施例2构建突变菌株
2.1获取突变基因
K291C、N端和C端的突变用全序列合成方式获得,K103C,N148C,Q177C,G202C,K228C,G274C用双重PCR法获得,引物序列如下所示:
表2 不同突变序列的引物设计
2.2构建表达质粒
将pET3d质粒和目的片段进行双酶切(图2),回收后用T4连接酶进行连接,连接产物全部加入到50μL的刚解冻的DH5α感受态细胞中,轻弹混匀;冰浴30min,42℃热激90s;立即转冰浴2min后;加入500μL无菌LB培养基混匀,37℃200rpm培养1h,使菌体复苏;涂布含有相应抗性的平板上,挑选单克隆菌落,PCR鉴定转化成功的菌株。
2.3构建突变菌株
提取质粒,将上述测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,构建表达菌株(突变菌株),PCR对突变菌株进行鉴定(图3a和图3b)
实施例3突变型尿酸酶的表达及其活性的测定
取Amp、Chl双抗板上长出的BL21(DE3)pLysS-pET3d-PBC-C于5ml的试管中活化,37℃220rpm过夜;转接至100ml摇瓶37℃220rpm摇2h,至OD600在0.6左右;加入IPTG,28℃,220rpm诱导过夜;8000rpm离心弃去上清,收集菌体;将菌体重悬于1/10体积的菌体破碎液,20kHz超5秒停5秒,破碎直至完全,离心分离,破碎上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测(图4a和图4b);取上述沉淀用等体积的PBS重悬、漂洗一次后,12000rpm离心10min取沉淀,用0.1MpH10.12CBS溶解,12000rpm离心10min取上清,为酶粗提液。
用紫外分光光度法测定尿酸酶活性,酶促反应速度通过测量由尿酸氧化成尿囊素所致290nm处吸收光的减少来测定。酶活力单位的定义为,在37℃、pH8.5下,每分钟催化1μmol尿酸分解所需要的尿酸酶量定义为1个酶活力单位。尿酸酶的功效以每毫克蛋白的活力单位来表示(U/mg)。预实验已经扫描尿酸的吸收光谱在290nm处有最大吸收峰,1mM尿酸在290nm处的消光系数为12.04mM-1cm-1。因此,1μM尿酸在反应中氧化导致吸收光度减少12.04mAu。吸收光度随尿酸浓度变化由线性部分导出。其中,酶活力的计算公式如下所示:
酶活力(U/ml)=(ODb-ODt)×Vt×df/12.04×1.0×Vs×t
(ODb:空白对照管吸光度值;ODt:检测管吸光度值;Vt:反应总体积1.28ml;df:样品加入体系前的稀释倍数;Vs:加入测试尿酸酶样品总体积0.2ml;t:反应时间5min;12.04:测试条件下底物尿酸的摩尔消光系数;1.0:比色皿光径1.0cm)
酶活力(U/mg)=(U/ml)/C
(C:酶浓度mg/ml)
活性测定方法:
(1)取两EP管分别加入1mL尿酸工作液,标记为反应管与对照管,37℃温浴5min;
(2)反应管:加入稀释后的酶液200μL 37℃反应5min;对照管:不做处理37℃反应5min;
(3)反应管:加入80μL 20%KOH终止反应;对照管:加入80μL 20%KOH终止反应后,加入稀释后的酶液200μL;
(4)与290nm处测定紫外吸收波长。
结果如表3所示。结果显示,在诱导大肠杆菌对突变型尿酸酶进行表达后,突变株K103C和K291C的活性保留和蛋白浓度都有显著优势。
表3 不同突变体重组尿酸酶蛋白的蛋白萃取浓度及活性
注:“-ter-”表示端部(terminal)。
其中,N-ter-C为在N端添加了一个Cys,而C-ter-C为在C端添加了一个Cys。
实施例4突变型尿酸酶的PEG修饰
将不同突变体的PBC配制成2mg/ml浓度,与MAL-mPEG(马来酰亚胺型PEG,分子量约20kD)摩尔比为1:2,最终反应蛋白浓度为1mg/ml,pH7,室温反应2h,电泳检测。
结果如图5a和5b所示。结果表明,未经突变的野生型尿酸酶无法被PEG化(图5a中泳道8以及图5b中的泳道3),而经定点突变后的各突变型尿酸酶可以被PEG化,其中K103C突变体的修饰效率最高。
以K103C突变体为例,PEG化后,K103C单体分子量为35Kda,一个PEG分子分子量为20Kda,由于PEG分子的水合作用,实际表观分子量会增大约1.5-2.5倍,因此PEG化后的尿酸酶单体分子量约为65-85Kda,实际实验显示在分子量约70Kda的位置有一条蛋白带,这表明此条带为PEG化的尿酸酶单体(图5a)。
以N端添加Cys的突变体为例,PEG化后,分子量约65-85Kda,图中约70Kda位置的条带即为PEG修饰的单体尿酸酶,这表明添加Cys后的酶可以被PEG修饰。(图5b)
按摩尔计,1摩尔突变型尿酸酶平均被约0.5-0.8摩尔的PEG修饰。
实施例5PEG修饰的突变株K103C(PEG-K103C)性质的测定
5.1稳定性的测定
pH稳定性:将突变型尿酸酶K103C和PEG-K103C配置成等浓度溶液,调节pH至5、6、7、8、9、10放置2h后,测定酶活性。
温度稳定性:将突变型尿酸酶K103C和PEG-K103C置于4℃、20℃、37℃、50℃、60℃放置2h后,测定酶活性。
结果如图6和图7所示。
上述结果表明,突变型尿酸酶K103C经过PEG修饰后pH耐受的范围更广,特别是在生理pH条件下的活性得到较大提升,并且热稳定性也有所提升,在40℃中温浴2h仍维持较好的活性。
5.2米氏常数的测定
通过比较突变株K103C在PEG修饰前后的米氏常数、最大酶促反应速率和催化常数,从而评价PEG修饰对突变型尿酸酶的影响。
表4 PEG-K103C的米氏常数计算
通过软件计算分析得到以下数据:
Km=0.0108 ΔAmax=0.034 斜率=0.3184 R2=0.9713
Vmax=1.823μM/min kcat=743.78min-1
表5 重组尿酸氧化酶K103C的米氏常数计算
通过软件计算分析得到以下数据:
Km=0.0114 ΔAmax=0.040 斜率=0.2891 R2=0.9265
Vmax=2.333μM/min kcat=951.84 min-1
结果如表4、表5所示。结果表明,突变株K103C在PEG修饰后,其米氏常数变化不大,说明PEG的修饰没有遮蔽酶的活性位点,很大程度保留了酶与底物的亲和力;而酶修饰后的最大反应速率与催化常数较修饰之前略低,这可能与PEG对酶的“包裹”作用有关,这使得酶促反应更加温和,更适合体内生理环境。
5.3半衰期的测定
将30只5周龄的BABL/C雄性小鼠20g±2g随机分为3组。第1组10只,按10mg/kg给药剂量每只尾静脉注射PEG修饰的重组尿酸酶PEG-K103C,在注射后的2h、4h、8h、16h、24h、36h、48h、72h、96h、120h时间点摘除眼球采集血液离心留取上清,稀释20倍测定血浆尿酸酶活性;第2组10只按10mg/kg给药剂量每只尾静脉注射重组尿酸酶K103C,在注射后的5min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、16h、24h时间点摘除眼球采集血液离心留取上清,稀释20倍测定血浆尿酸酶活性;第3组10只作为对照组注射等体积生理盐水,在注射后的5min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、16h、24h时间点摘除眼球采集血液离心留取上清,稀释20倍测定血浆尿酸酶活性。
结果如图8所示。结果表明,突变型尿酸酶K103C在血清内的半衰期约为1h,酶活性最多只能维持24h;而PEG修饰后的酶由于PEG的“包裹”降低了其在小鼠体内的降解速度,其半衰期约为72h,最长作用时间达到96h。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种突变型尿酸酶,其特征在于,所述突变型尿酸酶具有重组引入的半胱氨酸残基,并且所述的半胱氨酸残基位于尿酸酶的非活性区域,所述的非活性区域为尿酸酶的选自下组的区域:
(a)尿酸酶的第103位、第148位、第177位、第202位、第228位或第291位的替换;或
(b)尿酸酶的N端之前的添加;或
(c)尿酸酶的C端之后的添加;
其中,所述的氨基酸位置基于SEQ ID NO.1所示的尿酸酶序列。
2.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述序列编码权利要求1所述的突变型尿酸酶。
3.一种载体,其特征在于,它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求3所述的载体或在基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种产生权利要求1所述突变型尿酸酶的方法,其特征在于,包括步骤:
在适合表达的条件下,培养权利要求4所述的宿主细胞,从而表达出权利要求1所述的突变型尿酸酶;和
分离所述突变型尿酸酶。
6.一种PEG化的突变型尿酸酶,其特征在于,所述的突变型尿酸酶为权利要求1所述的突变型尿酸酶,并且所述的PEG化的位点为所述的重组引入的半胱氨酸残基位置。
7.一种药物组合物,其特征在于,包括:
权利要求6所述的PEG化的突变型尿酸酶;和
药学上可接受的载体。
8.一种权利要求1所述的突变型尿酸酶、权利要求6所述的PEG化的突变型尿酸酶和权利要求7所述的药物组合物的用途,其特征在于,用于制备治疗痛风和/或慢性高尿酸血症的药物。
9.一种制备权利要求6所述的PEG化的突变型尿酸酶的方法,其特征在于,包括步骤:
(i)提供权利要求1所述的突变型尿酸酶;
(ii)对步骤(i)的突变型尿酸酶进行PEG化处理,从而形成权利要求6所述的PEG化的突变型尿酸酶。
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