CN102949731A - 与glp-2受体特异性结合的药物融合体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类结合GLP-2R短肽的药物融合体，还公开了该类药物融合体的制备方法及利用该药物融合体治疗炎性肠道疾病、克罗恩病及短肠综合症的方法。

Description

与GLP-2受体特异性结合的药物融合体

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一类与GLP-2受体结合的特异性药物融合体及其应用。主要涉及通过基因工程手段将具有活性的、能与GLP-2受体有效结合的多肽片段(X)_n通过连接链与由(X)_n镜像氨基酸序列组成的多肽片段(X’)_n连接在一起，在连接链处有聚合物、脂肪酸和糖修饰任一种修饰。所形成的药物融合体包含2段反向重复的多肽片段序列(X)_n与(X’)_n。本发明还涵盖了该多肽及其修饰产物在治疗炎性肠道疾病、克罗恩病及短肠综合症中的应用。

背景技术

肠胃道是消化、吸收营养的主要场所，当机体的肠胃道遭到破坏时，肠胃道对营养物质的消化和吸收能力下降。很多生长因子如表皮生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子-1都参与肠上皮生长的调控，能再生、修复损伤的肠粘膜。但缺乏特异性，常常伴随机体的不良反应。近年来研究发现，类胰高糖素肽-2（Glucagon-like peptide-2,GLP-2）通过与其受体（胰高糖素样肽-2受体，Glucagon-like peptide-2 receptor, GLP-2R）结合，可有效减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复，抑制其凋亡。该药增加了这些细胞的数量，后者可增加小肠吸收、减少腹泻。因此补充足够的GLP-2成为炎性肠道疾病、克罗恩病及短肠综合症治疗的关键（Estall et al., Current Pharmaceutical Designs, 2006, V12:1731-1750.）。

目前基于该机理开发的用于糖尿病治疗的多肽主要基于内源性GLP-2（胰高糖素样肽-2）改造的多肽-替度鲁肽（Teduglutide）。为降低二肽基肽酶对上述多肽的酶切，该肽将GLP-2的N端第二位的丙氨酸突变为甘氨酸。但这类多肽分子量比较小，因此应用于临床时患者治疗的依从性不佳。为延长该类小肽的半衰期，一般通用的做法是将该类活性多肽进行聚合物的化学修饰、微球包埋或蛋白融合（包括Fc融合和人血白蛋白融合）。

但上述的几种常规解决手段存在下述潜在问题：（1）PEG修饰的长效化制剂，其聚合物直接修饰在GLP-2或其类似物的尾部。由于聚合物和GLP-2或其类似物相比，其分子体积较大，存在的空间位阻效应会影响GLP-2与其受体（GLP-2R）的有效结合，造成体内生物学活性显著下降；（2）Fc融合多肽后其半衰期的延长并不如所预期的那样显著（US Pat. No. 6,756,480，引入这里作为参考）；（3）其它形式如人血白蛋白融合或微球包埋在患者体内有引发免疫原性降低治疗效果的风险。

尽管替度鲁肽已经在美国处于注册的状态，但患者在需要每天用药一次，患者的依从性不佳。目前未有长效的、高活性的GLP-2受体激动剂。因此，在炎性肠道疾病及相关领域中，存在进一步改良GLP-2受体激动剂的极大的、迫切的需要，以在临床上发挥更佳的治疗效果。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了下述构型的化合物：

                                                                  

其中：

X是能结合胰高糖素样肽-2受体（Glucagon-like peptide-2 receptor, GLP-2R）的多肽片段；

Y是连接链；

X’是X的镜像多肽片段；

Z是聚合物、脂肪酸或糖类中的一种；

a、b不存在，或是独立的、包括1-20个氨基酸残基的多肽片段；

n=1-8。

本发明的目的是提供一种高活性、高半衰期、低免疫原性的多价（2段镜像序列(X)_n与(X’)_n都具有如GLP-2相似的生物学活性）药物融合体。

本发明的另一个目的是提供上述药物融合体在制备炎性肠道疾病、克罗恩病及短肠综合症药物中的应用。

本发明是通过下列技术措施实现的：

具有下式的药物融合体：

 其中：

X是能结合胰高糖素样肽-2受体（Glucagon-like peptide-2 receptor, GLP-2R）的多肽片段；

Y是连接链；

X’是X的镜像多肽片段；

Z是聚合物、脂肪酸或糖类中的一种；

a、 b不存在，或是独立的、包括1-20个氨基酸残基的多肽片段；

n=1-8。

药物融合体的结构特征在于：所述药物融合体中包含2段反向重复的多肽序列（互为镜像的(X)_n与(X’)_n），所述的2段重复序列(X)_n与(X’)_n通过连接链Y连接在一起；在连接链的部位有聚合物、脂肪酸或糖其中任一种修饰。X与Y间和 X’与Y间不存在或有1-20个氨基酸残基间隔。

药物融合体中n优选为2。

药物融合体中n再优选为1。

药物融合体中连接链Y包含一个可发生化学修饰的氨基酸位点。

药物融合体中X选自：

（a）在SEQ ID No:1、No:2给出的序列；

（b）（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被丝氨酸替换；

（c）（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被甘氨酸替换；

（d）（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被丙氨酸替换。

药物融合体中连接链Y长度为3-20个氨基酸，所述连接链包括但不限于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。

制备的药物融合体中X片段的N端和X’片段的C端为组氨酸。

所述的可发生化学修饰的氨基酸位点为半胱氨酸。

所述的化学修饰制备药物融合体，包括但不限于脂肪酸修饰、聚乙二醇修饰、包含聚乙二醇乙氧基重复结构的嵌段共聚物修饰、糖修饰任一种。

所述的修饰，是通过Z末端的化学反应基团和连接链Y上游离的半胱氨酸反应进行修饰，制备药物融合体。

所述修饰制备的药物融合体中Z为脂肪酸，所述脂肪酸的碳链长度为5-30个。

所述修饰制备的药物融合体中Z为聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

所述修饰制备的药物融合体中Z为包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物，所述的包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

所述的药物融合体，聚乙二醇包括线性的聚乙二醇和分枝型聚乙二醇。

所述的药物融合体的X片段，选自GLP-2（1-33）或其类似物。

一种编码上述任一种多肽的核苷酸序列。

一种包含所述药物融合体表达载体的宿主细胞。

所述的表达药物融合体的宿主细胞为真核细胞。

所述的表达药物融合体的宿主细胞为原核细胞。

所述的药物融合体在治疗炎性肠道疾病的应用。

所述的药物融合体在治疗克罗恩（Chron’s）疾病的应用。

所述的药物融合体在治疗短肠综合症的应用。

本发明中所用术语“类似物”意思是与GLP-2相比，其中一个或多个氨基酸残基已经由其它氨基酸残基替换和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从肽删除和/或其中一个或多个氨基酸残基已经插入至肽。在此举例加以详细说明：

人内源性GLP-2的氨基酸序列为：

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD

将GLP-2N端第二位的丙氨酸（A）突变为甘氨酸（G），形成下述GLP-2类似物（即替度鲁肽）的序列：

HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。

将GLP-2 的C端第四位的赖氨酸（K）删除，形成下述GLP-2类似物的序列：

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。

本发明中所用术语“反向重复序列”、 “镜像片段”意思是指X’的序列与在镜子中看到的X的序列一致，具有“反向重复”和像左手和右手的特征。在此举例加以详细说明：

 X的序列为：

HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD 

X的镜像片段或反向重复序列或手性序列X’的序列为：

DTIKTQILWNIFDRAALNDLITNMEDSFSGDGH

 以下提供本药物融合体的主要制备步骤：

1、(X)_n-a-Y-b-(X’)_n多肽的克隆及菌株构建：

PCR扩增编码(X)_n-a-Y-b-(X’)_n多肽的DNA序列，经过Nde I和EcoR I双酶切，与具有T7启动子的表达载体（经过Nde I和EcoR I双酶切）进行酶连，然后将酶连产物加入100ul感受态细胞中，冰上30min孵育，经过90sec热击，加入300ul SOC 37°C摇床培养90min，4000rpm×5min，弃300ul上清，用枪吹悬菌，涂布在含抗生素的琼脂平板上，37°C下培养过夜。培养后挑多个单克隆，分别加入到５ml培育液中37°C摇床过夜培养。保存菌种，提取质粒，分别酶切，电泳观察，选择正确克隆测序，测序正确的即为目标克隆。

2、(X)_n-a-Y-b-(X’)_n的表达：

将含编码X-a-Y-b-X’多肽的质粒的菌种涂布在琼脂平板上挑取一株单克隆，接种到已灭菌的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L）37℃下过夜培养表达蛋白。

3、

的制备：

    将表达的目的蛋白通过适当的层析方法进行纯化，得到纯度高于99%的目标蛋白。然后将(X)_n-a-Y-b-(X’)_n调整到适宜浓度、适宜pH下，用末端活化的聚合物、脂肪酸或糖进行修饰。修饰的混合物通过一系列本技术领域人员所熟知的色谱方法进行纯化。

 4、

的活性测定：

     雌性CD小鼠，随机分为4组（n=7）,每组动物每天分别皮下给药替度鲁肽（50 微克）、HSK-B-04、HSK-B-05（20 微克），和生理盐水，连续给药10天。给药结束后，将小鼠处死，收集小肠部分，冷PBS洗，用玻璃片刮下粘液，称重分析。药物融合体组（HSK-B-04与HSK-B-05）动物粘液重量显著高于替度鲁肽和生理盐水组。

 5、

在小鼠体内半衰期的测定：

    SD大鼠静脉注射上述药物融合体，分别于0.5,1,2,4,8,12,24,,48,72小时的不同时间点采样，用碘示踪法测定血中药物融合体的浓度，根据药物浓度-时间关系做药-时曲线分析。结果显示：药物融合体组与替度鲁肽组比，其药物半衰期显著延长。

本发明的有益效果：

该方法主要的优点：（1）与PEG直接修饰的结合GLP-2受体的短肽相比，依据本发明所制备的药物融合体，聚合物修饰在柔性连接链上。保证了结合GLP-2受体短肽与GLP-2受体结合的自由度，最大程度降低了聚合物带来的空间位阻效应，提升了药物聚合体中短肽与GLP-2受体结合的能力。另一方面，该药物聚合体与PEG直接修饰的结合GLP-2受体的短肽相比，具有双价功能，及该分子含有2个与GLP-2受体结合的短肽域，提升了药物融合体中短肽与GLP-2受体结合的几率（见图2）。（2）对于FC融合的结合GLP-2受体的短肽，由于所述短肽的C端通过分子生物学技术直接与FC铰链的DKTHT序列融合形成双价的分子。当细胞表面GLP-2受体分布间距较大时，很难发挥其双价的性能。与其相比，本发明所述的药物融合体其柔性连接链Y的长达变化在3-20个氨基酸残基之间，其可有效与细胞表面分布间距较大的GLP-2受体结合，有效发挥其双价性能。（3）与人血白蛋白融合或微球包埋的结合GLP-2受体短肽相比，由于聚乙二醇的修饰，可显著降低药物融合体在体内引发免疫反应的几率，提升其在临床上给患者带来的收益。

附图说明

图1药物融合体HSK-B-04的非还原性SDS-PAGE图谱。

图2 药物融合体HSK-B-05的非还原性SDS-PAGE图谱。

图3药物融合体HSK-B-04、HSK-B-05和替度鲁肽的生理活性比较。

图4 药物融合体HSK-B-04、HSK-B-05和替度鲁肽在SD大鼠体内的半衰期比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。在此，我们证明了本发明中制备的结合GLP-2受体的药物融合体较单独的多肽X： (1)、具有更高的生物学活性；（2）、具有更长的血浆半衰期。

 实施例1

该实施例描述了制备X片段序列为：HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (SEQ ID NO:1)，

X’片段序列为：

DTIKTQILWNIFDRAALNDLITNMEDSFSGDGH (SEQ ID NO:5)

Y为GGGCGGG（SEQ ID NO:3）

Z为分子量为20000道尔顿，末端为马来酸亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇

a和b不存在，即氨基酸残基数量为0

n=1

的药物融合体的制备方法，该融合体在本发明中被命名为HSK-B-04。

 HSK-B-04质粒克隆

克隆表达下述蛋白序列的质粒：

HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDGGGCGGGDTIKTQILWNIFDRAALNDLITNMEDSFSGDGH (SEQ ID NO:6)

 引物5’ CATGCCATGGCC CAT ATG AAA TAC -3’ (SEQ ID NO:7)

      5’ CCGAATTCTCATTAGTGACCGTC -3’ (SEQ ID NO:8)

编码上述蛋白序列的DNA序列如下:

CATGCCATGGCC CAT ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC CAC GGT GAC GGT TCT TTC TCT GAC GAA ATG AAC ACC ATC CTG GAC AAC CTG GCT GCT CGT GAC TTC ATC AAC TGG CTG ATC CAG ACC  AAA ATC ACC GAC GGT  GGT GGT TGC GGT GGT GGT GAC ACC ATC AAA ACC CAG ATC CTG TGG AAC ATC TTC GAC CGT GCT GCT CTG AAC GAC CTG ATC ACC AAC ATG GAA GAC TCT TTC TCT GGT GAC GGT CAC ta atgaGAATTC GG (SEQ ID NO:9)

合成上述DNA序列及引物序列,并将序列均克隆至pet-25b载体的Nde I和EcoR I位点之间即可由此获得具有适当插入片段的质粒。

表达和纯化

     将含编码HSK-B-04质粒的菌种涂布在琼脂平板上，37°C下培养过夜。从平板上挑取一株单克隆，接种到已灭菌的含100ml LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L）的500ml锥形瓶中，200 rpm，37℃下培养过夜。将此100ml培养液转接入5L的Braun发酵罐中。所述发酵罐含有3500ml发酵培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素浓度100 μg/ml）。在37℃下培养，通过氨水和20%磷酸控制培养基的pH在7.0。当溶解氧急剧下降至20%左右的空气饱和度时，开始流加培养基（250 g/L葡萄糖，100 g/L酵母提取物，7g/L MgSO₄·7H₂O）,当溶解氧降至10%空气饱和度时停止补料；当溶解氧升至70%空气饱和度时再次开始补料，如此循环。当培养物的OD达到10时，加入IPTG进行诱导。当OD达到30左右，停止培养，4000rpm下收集菌体。

HSK-B-04选择阳离子交换树脂进行纯化。具体操作为：将沉淀的菌体（100g）重悬于120 mM乙酸钠盐缓冲液中（pH 5.0），菌体重/缓冲液体积约1：3（W/V）。重悬物超声破碎，条件为东芝破碎仪10号探头，功率600赫兹，工作5S间隔10S，冰水浴下破碎180次。破碎液在4℃下10000rpm离心20分钟，取上清进行下一步的层析纯化步骤。

将一个装有100ml SP Sepharose Fast Flow 介质(GE Healthcare)的XK26/40柱用纯水充分洗涤后，用120 mM 乙酸钠缓冲液（pH 5.0， Buffer A）平衡5个柱体积，然后将破碎上清（约150ml）从管路吸入进柱中，Buffer A洗至电导、紫外信号到达基线后，以80% Buffer A + 20%Buffer B （120 mM 乙酸钠+1.0 M 氯化钠）洗脱目标蛋白峰。然后用100% Buffer B再生介质。目标峰在20mM 磷酸盐（pH7.4）下透析过夜除盐。Bradford方法（Bradford M M. Anal. Biochem., 1976, V72:248-254.）测定目标蛋白质浓度，并用pH7.4的20mM 磷酸盐稀释蛋白浓度至2.0 mg/ml。蛋白经N端测序分析，其N端15个氨基酸序列为：HGDGSFSDEMNTILD，与理论一致。

的修饰

将100mg纯化的HSK-B-04在室温下，按1：5摩尔比率（多肽：聚合物）加入单甲氧基聚乙二醇马来酸亚胺酯（分子量20kDa，购自Nektar），室温下反应2-4小时，反应混合物用磁力搅拌器轻柔搅拌，使反应充分进行。反应结束后加入半胱氨酸至终浓度为0.5 M，继续反应1小时以终止未反应的聚乙二醇（PEG）修饰剂。反应混合物中未反应的PEG利用Superdex 200 （Prep Grad, GE Healthcare）脱除。柱子为XK16/40，介质体积约100ml，蛋白浓度为3-4 mg/ml，每次上样3ml，目标修饰产物在外水体积被洗脱，收集并用Minimate TFF（PALL Cooperation）超滤浓缩，滤膜的截留分子量为10kDa，至浓度约4mg/ml。蛋白质浓度用lowry法进行测定（Lowry O H., et al. J. Biol. Chem., 1951, V193:265-275.）。非还原电泳鉴定其纯度高于90%，见图1。

实施例2

该实施例描述了制备X片段序列为：

HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDKKKKKK (SEQ ID NO:2)，

X’片段序列为：

KKKKKKGRGKVLWAIFEKAAQGELYSSVDSTFTGEGH (SEQ ID NO:10)

Y为GGGSGGGCGGGSGGG（SEQ ID NO:4）

Z为分子量为30000道尔顿，末端为马来酸亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇

a和b不存在，即氨基酸残基数量为0

n=1

的药物融合体的制备方法，该融合体在本发明中被命名为HSK-B-05。

克隆

克隆表达下述蛋白序列的质粒：

HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDKKKKKKGGGSGGGCGGGSGGG KKKKKKGRGKVLWAIFEKAAQGELYSSVDSTFTGEGH （SEQ ID NO:11）

引物5’- CATGCCATGGCC CAT ATG AAA TAC -3’ （SEQ ID NO:12）

5’- CCGAATTCTCATTAGTGACCTTCAC -3’ （SEQ ID NO:13）

 编码上述蛋白序列的DNA序列如下:

CATGCCATGGCC CAT ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC CAC GGT GAC GGT TCT TTC TCT GAC GAA ATG AAC ACC ATC CTG GAC AAC CTG GCT GCT CGT GAC TTC ATC AAC TGG CTG ATC CAG ACC AAA ATC ACC GAC AAA AAA AAA AAA AAA AAA GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT TGC GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT AAA AAA AAA AAA AAA AAA GGT CGT GGT AAA GTT CTG TGG GCT ATC TTC GAA AAA GCT GCT CAG GGT GAA CTG TAC TCT TCT GTT GAC TCT ACC TTC ACC GGT GAA GGT CAC   ta atgaGAATTC GG （SEQ ID NO:14）

 合成上述DNA序列及引物序列,并将序列均克隆至pet-25b载体的Nde I和EcoR I位点之间即可由此获得具有适当插入片段的质粒。

表达和纯化

制备方法同实施例1所述方法。蛋白经N端测序分析，其N端15个氨基酸序列为：HGDGSFSDEMNTILD，与理论一致。

的修饰

制备方法同实施例1所述方法。所用的修饰剂为分子量为30000道尔顿的、马来酸亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇。纯化的HSK-B-02的电泳图谱见图2。

Claims (23)

1.具有下式的与GLP-2受体特异性结合的药物融合体：

X是能结合胰高糖素样肽-2受体（Glucagon-like peptide-2 receptor, GLP-2R）的多肽片段；

Y是连接链；

X’是X的镜像多肽片段；

Z是聚合物、脂肪酸或糖类中的一种；

b不存在，或是独立的、包括1-20个氨基酸残基的多肽片段；

n=1-8。

2.根据权利要求1所述的药物融合体，其结构特征在于：所述药物融合体中包含2段反向重复的多肽序列（互为镜像的(X)_n与(X’)_n），所述的2段重复序列((X)_n与(X’)_n)通过连接链Y连接在一起；在连接链的部位有聚合物、脂肪酸或糖其中任一种修饰；X与Y间和X’与Y间不存在或有1-20个氨基酸残基间隔。

3.根据权利要求1和权力要求2所述，n是2。

4.根据权利要求1和权力要求2所述，n是1。

5.根据权利要求1-4所述，药物融合体中连接链Y包含一个可发生化学修饰的氨基酸位点。

6.根据权利要求1-4所述，药物融合体中X选自：

在SEQ ID No:1、No:2给出的序列；

（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被丝氨酸替换；

（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被甘氨酸替换；

（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被丙氨酸替换。

7.根据权利要求1-5项所述的药物融合体中，连接链Y长度为3-20个氨基酸，所述连接链包括但不限于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4给出的氨基酸序列。

8.任一项在前权利要求所述，制备的药物融合体中X片段的N端和X’片段的C端为组氨酸。

9.根据权利要求5所述修饰，可发生化学修饰的氨基酸位点为半胱氨酸。

10.任一项在前权利要求所述，药物融合体的化学修饰，包括但不限于脂肪酸修饰、聚乙二醇修饰、包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物修饰、糖修饰任一种。

11.根据权利要求10所述修饰，是通过Z末端的化学反应基团和连接链Y上游离的半胱氨酸反应进行修饰，制备药物融合体。

12.根据权利要求10所述修饰制备的药物融合体中Z为脂肪酸，所述脂肪酸的碳链长度为5-30个。

13.根据权利要求10所述修饰制备的药物融合体中Z为聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

14.根据权利要求10所述修饰制备的药物融合体中Z为包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物，所述的包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

15.根据权力要求13所述的药物融合体，聚乙二醇包括线性的聚乙二醇和分枝型聚乙二醇。

16.任一项在前权利要求所述的药物融合体的X片段，选自GLP-2（1-33）或其类似物。

17.一种编码权利要求1-9、权利要求16任一项的多肽的核苷酸序列。

18.一种包含权利要求17的表达载体的宿主细胞。

19.权利要求18的宿主细胞为真核细胞。

20.权利要求18的宿主细胞为原核细胞。

21.任一项在前权利要求所述的药物融合体在治疗炎性肠道疾病的应用。

22.任一项在前权利要求所述的药物融合体在治疗克罗恩（Chron’s）疾病的应用。

23.任一项在前权利要求所述的药物融合体在治疗短肠综合症的应用。

Images