CN102949732A

CN102949732A - 与人血管生成素-2特异性结合的药物融合体

Info

Publication number: CN102949732A
Application number: CN 201110404479
Authority: CN
Inventors: 于鹏展
Original assignee: Tibet Haisco Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tibet Haisco Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2013-03-06

Abstract

本发明公开了一类与人血管生成素-2特异性结合的药物融合体，还公开了该类药物融合体的制备方法及利用该药物融合体治疗老年性黄斑病变、肿瘤、炎性疾病、子宫内膜异位症的方法。

Description

与人血管生成素-2特异性结合的药物融合体

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一类与人血管生成素-2结合的特异性药物融合体及其应用。主要涉及通过基因工程手段将具有活性的、能与人血管生成素-2结合的多肽片段(X)_n通过连接链与由(X)_n镜像氨基酸序列组成的多肽片段(X’)_n连接在一起，在连接链处有聚合物、脂肪酸和糖修饰任一种修饰。所形成的药物融合体包含2段反向重复的多肽片段序列(X)_n与(X’)_n。本发明还涵盖了该多肽及其修饰产物在治疗伴随血管异常增生的疾病应用。

背景技术

很多疾病与血管异常生成相关，如老年性黄斑病变、肿瘤及炎性疾病等。目前的研究进展表明，在血管发生进程中，有很多信号系统参与，其中Tie-2受体酪氨酸激酶信号通路研究的较为充分，血管生成素是Tie-2受体的特异性配体。目前已发现4中血管生成素，分别命名为血管生成素-1、血管生成素-2、血管生成素-3及血管生成素-4。体内和体外试验研究表明，血管生成素-2在上述病理发生进程中与Tie-2受体结合，有益于血管可塑性状态，在这些病理进程中血管生成素-2的表达被显著上调。相反，正常组织的血管生成素-2表达十分有限。因此通过阻断血管生成素-2与Tie-2受体结合是治疗肿瘤、老年性黄斑病变及炎症的有效方法。

研究发现一类小肽可显著抑制血管生成素的活性（CN 200910159451.9，在此引入作为参考），但这类小肽分子量较小（约1000-2000道尔顿），很容易在人体内被肾清除，无法在体内发挥其有效活性。因此本发明的目的是提供一种体内长效的血管生成素-2特异性结合药物融合体。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了下述构型的化合物：

其中：

X是能结合人血管生成素-2（Angiopoietin ligand-2, Ang-2）的多肽片段；

Y是连接链；

X’是X的镜像多肽片段；

Z是聚合物、脂肪酸或糖类中的一种；

a、b不存在，或是独立的、包括1-20个氨基酸残基的多肽片段；

n=1-8。

本发明的目的是提供一种高活性、高半衰期、低免疫原性的多价（2段镜像序列(X)_n与(X’)_n都具有阻断血管生成素-2与Tie-2受体结合的生物学活性）药物融合体。

本发明的另一个目的是提供上述药物融合体在制备炎性疾病、肿瘤、老年性黄斑病变及子宫内膜异位症药物中的应用。

本发明是通过下列技术措施实现的：

具有下式的药物融合体：

其中：

Y是连接链；

X’是X的镜像多肽片段；

Z是聚合物、脂肪酸或糖类中的一种；

n=1-8。

药物融合体的结构特征在于：所述药物融合体中包含2段反向重复的多肽序列（互为镜像的(X)_n与(X’)_n），所述的2段重复序列(X)_n与(X’)_n通过连接链Y连接在一起；在连接链的部位有聚合物、脂肪酸或糖其中任一种修饰。X与Y间和 X’与Y间不存在或有1-20个氨基酸残基间隔。

药物融合体中n优选为4。

药物融合体中n优选为3。

药物融合体中n优选为2。

药物融合体中n优选为1。

药物融合体中连接链Y包含一个可发生化学修饰的氨基酸位点。

药物融合体中X选自：

（a）在SEQ ID No:1给出的序列；

（b）（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被丝氨酸替换；

（c）（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被甘氨酸替换；

（d）（a）的氨基酸序列中，具有在一个或多个位置的氨基酸被丙氨酸替换；

（e）氨基酸组成中有>80%与（a）的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

药物融合体中连接链Y长度为3-20个氨基酸，所述连接链包括但不限于SEQ NO：2给出的氨基酸序列。

所述的可发生化学修饰的氨基酸位点为赖氨酸。

所述的化学修饰制备药物融合体，包括但不限于脂肪酸修饰、聚乙二醇修饰、包含聚乙二醇乙氧基重复结构的嵌段共聚物修饰、糖修饰任一种。

所述的修饰，是通过Z末端的化学反应基团和连接链Y上游离的半胱氨酸反应进行修饰，制备药物融合体。

所述修饰制备的药物融合体中Z为脂肪酸，所述脂肪酸的碳链长度为5-30个。

所述修饰制备的药物融合体中Z为聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

所述修饰制备的药物融合体中Z为包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物，所述的包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

所述的药物融合体，聚乙二醇包括线性的聚乙二醇和分枝型聚乙二醇。

一种编码上述任一种多肽的核苷酸序列。

一种包含所述药物融合体表达载体的宿主细胞。

所述的表达药物融合体的宿主细胞为真核细胞。

所述的表达药物融合体的宿主细胞为原核细胞。

所述的药物融合体在治疗老年性黄斑病变、肿瘤、炎性疾病、子宫内膜异位症中的应用。

本发明中所用术语“类似物”意思是与X相比，其中一个或多个氨基酸残基已经由其它氨基酸残基替换和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从肽删除和/或其中一个或多个氨基酸残基已经插入至肽。在此举例加以详细说明：

X的氨基酸序列为：

QEECEWDPWTCEHM

将X的C端增加一个谷氨酸（E），形成下述X类似物的序列：

QEECEWDPWTCEHME。

将X 的N端第三位的谷氨酸（E）替换为组氨酸（H），形成下述X类似物的序列：

QEHCEWDPWTCEHM。

本发明中所用术语“反向重复序列”、 “镜像片段”意思是指X’的序列与在镜子中看到的X的序列一致，具有“反向重复”和像左手和右手的特征。在此举例加以详细说明：

X的序列为：

QEECEWDPWTCEHM

X的镜像片段或反向重复序列或手性序列X’的序列为：

MHECTWPDWECEEQ

以下提供本药物融合体的主要制备步骤：

1 、(X)_n-a-Y-b-(X’)_n多肽的克隆及菌株构建：

PCR扩增编码(X)_n-a-Y-b-(X’)_n多肽的DNA序列，经过Nde I和EcoR I双酶切，与具有T7启动子的表达载体（经过Nde I和EcoR I双酶切）进行酶连，然后将酶连产物加入100ul感受态细胞中，冰上30min孵育，经过90sec热击，加入300ul SOC 37°C摇床培养90min，4000rpm×5min，弃300ul上清，用枪吹悬菌，涂布在含抗生素的琼脂平板上，37°C下培养过夜。培养后挑多个单克隆，分别加入到５ml培育液中37°C摇床过夜培养。保存菌种，提取质粒，分别酶切，电泳观察，选择正确克隆测序，测序正确的即为目标克隆。

2 、(X)_n-a-Y-b-(X’)_n的表达：

将含编码X-a-Y-b-X’多肽的质粒的菌种涂布在琼脂平板上挑取一株单克隆，接种到已灭菌的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L）37℃下过夜培养表达蛋白。

3、

的制备：

将表达的目的蛋白通过适当的层析方法进行纯化，得到纯度高于99%的目标蛋白。然后将(X)_n-a-Y-b-(X’)_n调整到适宜浓度、适宜pH下，用末端活化的聚合物、脂肪酸或糖进行修饰。修饰的混合物通过一系列本技术领域人员所熟知的色谱方法进行纯化。

4、

的活性测定：

依据药物融合体刺激Tie2的磷酸化程度实验评价该药物融合体的活性。稳定表达Tie2受体的HEK 293细胞由CRO公司代为制备。用400 ng/ml 药物融合体刺激HEK 293细胞30分钟，然后加入抗人-Tie2的山羊多抗（购自R&D公司），利用Western-Blot法检测蛋白的磷酸化程度。

5、在小鼠体内半衰期的测定：

SD大鼠静脉注射上述药物融合体，分别于0.5,1,2,4,8,12,24,,48,72小时的不同时间点采样，用碘示踪法测定血中药物融合体的浓度，根据药物浓度-时间关系做药-时曲线分析。结果显示：药物融合体组其药物半衰期为3天。

本发明的有益效果：

该方法主要的优点：（1）该药物聚合体具有双价功能，该分子含有2个与血管紧张素-2结合的短肽域，提升了药物融合体中短肽与血管紧张素-2结合的几率。（2）对于专利描述的FC的C端融合的结合血管紧张素-2的短肽，由于所述短肽的C端通过分子生物学技术直接与FC的C端融合形成四价的分子AMG386（Neal et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2010, V12:487-495，在这里引入作为参考）。当细胞表面Tie-2受体分布间距较大时，很难发挥其双价的性能。与其相比，本发明所述的药物融合体其柔性连接链Y的长达变化在3-20个氨基酸残基之间，其可有效与细胞表面分布间距较大的Tie-2受体结合，有效发挥其双价性能，提升其在临床上给患者带来的收益。

附图说明

图1 药物融合体HSK-B-06的非还原性SDS-PAGE图谱。

图2 药物融合体HSK-B-06的体外活性比较。

图3 药物融合体HSK-B-06在SD大鼠体内的半衰期测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。在此，我们证明了本发明中制备的结合Tie-2受体的药物融合体较单独的多肽X：(1)、具有相似的体外生物学活性；（2）、具有更长的血浆半衰期。

实施例1

该实施例描述了制备X片段序列为：

QEECEWDPWTCEHM (SEQ ID NO:1)，

X’片段序列为：

MHECTWPDWECEEQ (SEQ ID NO:3)

Y为GGGKGGG（SEQ ID NO:2）

Z为分子量为20000道尔顿，末端为马来酸亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇

a和b不存在，即氨基酸残基数量为0

n=2

的药物融合体的制备方法，该融合体在本发明中被命名为HSK-B-06。

HSK-B-06质粒克隆

克隆表达下述蛋白序列的质粒：

QEECEWDPWTCEHMQEECEWDPWTCEHMGGGKGGGMHECTWPDWECEEQ MHECTWPDWECEEQ (SEQ ID NO:4)

引物5’ CATGCCATGGCC CAT ATG AAA TAC -3’ (SEQ ID NO:5)

5’- CCGAATTCTCATTACTGTTCTTCGC -3’ (SEQ ID NO:6)

编码上述蛋白序列的DNA序列如下：

CATGCCATGGCC CAT ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC CAG GAA GAA TGC GAA TGG GAC CCG TGG ACC TGC GAA CAC ATG CAG GAA GAA TGC GAA TGG GAC CCG TGG ACC TGC GAA CAC ATG GGT GGT GGT AAA GGT GGT GGT ATG CAC GAA TGC ACC TGG CCG GAC TGG GAA TGC GAA GAA CAG ATG CAC GAA TGC ACC TGG CCG GAC TGG GAA TGC GAA GAA CAG ta atgaGAATTC GG (SEQ ID NO:7)

合成上述DNA序列及引物序列,并将序列均克隆至pet-25b载体的Nde I和EcoR I位点之间即可由此获得具有适当插入片段的质粒。

表达和纯化

将含编码HSK-B-06质粒的菌种涂布在琼脂平板上，37°C下培养过夜，挑取一株单克隆，接种到已灭菌的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L）37℃下培养过夜。将此种子液转接入5L的Braun发酵罐中(含有3500mlLB培养基，氨苄青霉素浓度100 μg/ml）。在37℃下培养，通过氨水和20%磷酸控制培养基的pH在7.0。当培养物的OD达到10时，加入IPTG进行诱导。当OD达到30左右，停止培养，4000rpm下收集菌体。

HSK-B-06选择阳离子交换树脂进行纯化。蛋白经N端测序分析，其N端15个氨基酸序列为：QEECEWDPWTCEHMQ，与理论一致。

的修饰

将100mg纯化的HSK-B-06在室温下，按1：10摩尔比率（多肽：聚合物）加入单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯（分子量20kDa，购自Nektar），室温下反应2-4小时，反应混合物用磁力搅拌器轻柔搅拌，使反应充分进行。反应结束后加入赖氨酸至终浓度为0.5 M，继续反应1小时以终止未反应的聚乙二醇（PEG）修饰剂。反应混合物中未反应的PEG利用Superdex 200 （Prep Grad, GE Healthcare）脱除。柱子为XK16/40，介质体积约100ml，蛋白浓度为3-4 mg/ml，每次上样3ml，目标修饰产物在外水体积被洗脱，收集并用Minimate TFF（PALL Cooperation）超滤浓缩，滤膜的截留分子量为10kDa，至浓度约4mg/ml。蛋白质浓度用lowry法进行测定（Lowry O H., et al. J. Biol. Chem., 1951, V193:265-275.）。非还原电泳鉴定其纯度高于90%，见图1。

Claims

1.具有下式的与人血管生成素-2特异性结合的药物融合体：

其中：

Y是连接链；

X’是X的镜像多肽片段；

Z是聚合物、脂肪酸或糖类中的一种；

b不存在，或是独立的、包括1-20个氨基酸残基的多肽片段；

n=1-8。

2.根据权利要求1所述的药物融合体，其结构特征在于：所述药物融合体中包含2段反向重复的多肽序列（互为镜像的(X)_n与(X’)_n），所述的2段重复序列((X)_n与(X’)_n)通过连接链Y连接在一起；在连接链的部位有聚合物、脂肪酸或糖其中任一种修饰；X与Y间和X’与Y间不存在或有1-20个氨基酸残基间隔。

3.根据权利要求1和权利要求2所述，n是4。

4.根据权利要求1和权利要求2所述，n是3。

5.根据权利要求1和权利要求2所述，n是2。

6.根据权利要求1和权利要求2所述，n是1。

7.根据权利要求1-6所述，药物融合体中连接链Y包含一个可发生化学修饰的氨基酸位点。

8.根据权利要求1-6所述，药物融合体中X选自：

（a）在SEQ ID No:1给出的序列；

9.根据权利要求1-7项所述的药物融合体中，连接链Y长度为3-20个氨基酸，所述连接链包括但不限于SEQ NO：2给出的氨基酸序列。

10.根据权利要求7所述修饰，可发生化学修饰的氨基酸位点为赖氨酸。

11.任一项在前权利要求所述，药物融合体的化学修饰，包括但不限于脂肪酸修饰、聚乙二醇修饰、包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物修饰、糖修饰任一种。

12.根据权利要求11所述修饰，是通过Z末端的化学反应基团和连接链Y上游离的半胱氨酸反应进行修饰，制备药物融合体。

13.根据权利要求11所述修饰制备的药物融合体中Z为脂肪酸，所述脂肪酸的碳链长度为5-30个。

14.根据权利要求11所述修饰制备的药物融合体中Z为聚乙二醇，所述聚乙二醇的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

15.根据权利要求11所述修饰制备的药物融合体中Z为包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物，所述的包含乙氧基重复结构的嵌段共聚物的分子量范围为5000-40000道尔顿之间。

16.根据权力要求14所述的药物融合体，聚乙二醇包括线性的聚乙二醇和分枝型聚乙二醇。

17.一种编码权利要求1-10任一项的多肽的核苷酸序列。

18.一种包含权利要求17的表达载体的宿主细胞。

19.权利要求18的宿主细胞为真核细胞。

20.权利要求18的宿主细胞为原核细胞。

21.任一项在前权利要求所述的药物融合体在治疗伴随血管异常增生的疾病应用。

22.权利要求21所述的疾病，包括老年性黄斑病变、肿瘤、炎性疾病、子宫内膜异位症。