ES2909664T3 - Composición farmacéutica que comprende arginina desiminasa de unión a albúmina para el tratamiento dirigido del cáncer - Google Patents

Composición farmacéutica que comprende arginina desiminasa de unión a albúmina para el tratamiento dirigido del cáncer Download PDF

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Abstract

Proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, comprendiendo la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID nº 40 y 41. **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica que comprende arginina desiminasa de unión a albúmina para el tratamiento dirigido del cáncer
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional de patente US número de serie 61/773.214, presentada el 6 de marzo de 2013 y la solicitud no provisional de patente US número de serie 14/197.236, presentada el 5 de marzo de 2014, publicada como el documento US 2014255377 (A1).
Campo técnico
La presente divulgación describe una proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina (AAD) que ha sido modificada genéticamente para crear un material que presenta una actividad elevada y una semivida in vivo prolongada. La presente divulgación describe además diseños para la ingeniería de ADN y proteínas destinados a crear diferentes proteínas de fusión de AAD. Las proteínas de fusión de AAD pueden aislarse y purificarse a partir de una fracción soluble y una fracción insoluble (cuerpos de inclusión) de las proteínas en bruto. La presente divulgación se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen arginina desiminasa de unión a albúmina para el tratamiento dirigido del cáncer (“cancer targeting treatment”) y que curan enfermedades dependientes de arginina en seres humanos y en otros animales.
Antecedentes de la invención
La incidencia del cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer hepático, melanoma y cáncer cervical en la población mundial está creciendo. Se requieren urgentemente tratamientos eficaces para dichas enfermedades. En muchos tipos de cáncer, entre ellos leucemia, melanoma, cáncer pancreático, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer cervical y cáncer hepático, las células de cáncer son auxotróficas para la arginina, ya que carecen de expresión de argininosuccinato sintetasa (ASS), convirtiendo a estos cánceres en excelentes dianas para la terapia de agotamiento de la arginina.
La arginina es un aminoácido semiesencial para seres humanos y otros mamíferos. Puede sintetizarse a partir de citrulina mediante un procedimiento en dos etapas mediante los enzimas del ciclo de la urea argininosuccinato sintasa (ASS) y argininosuccinato liasa (ASL). La arginina puede ser metabolizada en ornitina por el enzima arginasa, y la ornitina puede ser convertida en citrulina por la ornitina carbamoiltransferasa (OTC) en las mitocondrias. La citrulina puede utilizarse para sintetizar arginina nuevamente. Las células normales habitualmente no requieren un suministro exógeno de arginina para el crecimiento debido a la abundante actividad catalítica de ASS y ASL. En contraste, muchos tipos de cánceres no expresan ASS y, por lo tanto, son auxotróficos para la arginina. Su crecimiento es dependiente de la arginina obtenida exclusivamente de la circulación de la sangre. Por lo tanto, dirigirse (“targeting”) a la arginina circulante mediante el uso de enzimas degradantes de arginina es una estrategia viable de inhibición del crecimiento de tumores negativos para ASS [Feun et al., Curr. Pharm. Des.
14:1049-1057 (2008); Kuo et al., Oncotarget. 1:246-251 (2010)]
La arginina puede ser degradada por la arginasa, la arginina descarboxilasa y la arginina desiminasa (ADI). De entre ellas, la arginina desiminasa (ADI) apraentemente presenta la afinidad más alta para la arginina (un valor bajo de Km). La ADI convierte la arginina en citrulina y amoníaco, los metabolitos del ciclo de la urea. Por desgracia, sólo puede observarse ADI en procariotas, por ejemplo, Mycoplasma sp. Existen algunos problemas asociados al aislamiento y purificación de ADI a partir de los procariotas. La ADI aislada a partir de Pseudomonas pudita no consigue mostrar eficacia in vivo debido a su baja actividad enzimática a pH neutro. La ADI producida a partir de Escherichia coli es enzimáticamente inactiva y en consecuencia requiere un procedimiento de múltiples desnaturalizaciones y renaturalizaciones, lo que eleva el consiguiente coste de producción.
Debido a que la ADI nativa se observa en microorganismos, es antigénica y resulta rápidamente lavada de la circulación en el paciente. La forma nativa de la ADI es inmunógena tras la inyección en la circulación humana con una semivida corta (~4 horas) e induce anticuerpos neutralizadores [Ensor et al., Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Izzo et al., J. Clin. Oncol. 22:1815-1822 (2004)]. Estas desventajas pueden remediarse mediante pegilación. De entre las diversas formas de ADI pegilada, se encontrado que la ADI unida a PEG (peso molecular de 20,000) mediante succinato de succinimidilo (ADI-PEG 20) es una formulación eficaz. Sin embargo, la actividad de ADI tras la pegilación se reduce mucho, del orden de 50% [Ensor et al., Cancer Res. 62:5443-5450 (2002)]. Los intentos anteriores de crear ADI pegilada resultaron en materiales que no eran homogéneos (debido a la unión aleatoria de PEG a residuos de Lys en la superficie de las proteínas) y que además resultaban difíciles de caracterizar y de someter a control de calidad durante el procedimiento de fabricación. Además, PEG es muy caro, por lo que incrementa mucho el coste de producción. Tras la inyección intravenosa de ADI pegilada in vivo, se observa la fuga o desprendimiento de PEG libre y la ADI (sin PEG) puede inducir el problema de la inmunogenicidad. Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones mejoradas de tratamiento de cáncer, en particular, composiciones mejoradas de tratamiento de cáncer que presenten una actividad y semivida in vivo incrementadas.
El documento CN1634995 da a conocer una proteína fusionada (HSA-ADI) de albúmina de suero humano (HSA) y arginina desacilasa de micoplasma, un procedimiento para la preparación de la misma y la utilización de la misma en la preparación de medicina para el tratamiento de un tumor, tal como hepatoma.
La patente EP1987636 da a conocer una proteína antitumoral acoplada con un reactivo modificador específico en un sitio específico para superar las deficiencias inherentes de la proteína antitumoral, tal como una elevada antigenicidad y una semivida corta, y para superar las deficiencias resultantes de un método de modificación no específica, tal como sitios modificados inconsistentes, reconstituidos no homogéneos, actividad significativamente reducida y calidad difícil de controlar de los productos, y para finalmente ponerla a disposición para el tratamiento de tumores y la producción de medicamentos antitumorales.
NI et al., "Arginine deiminase, a potential anti-tumor drug", CANCER LETTERS, NEW YORK, NY, EE.UU. (20080107), vol. 261, n° 1, ISSN 0304-3835, páginas 1 a 11, resumen los resultados de la expresión recombinante, análisis estructural, modificación con PEG (polietilenglicol), actividades anticancerosas in vivo y estudios clínicos de la arginina desiminasa (ADI) y, en particular, comentan la expresión heterogénea de la ADI, la evolución dirigida para la mejora de las propiedades enzimáticas y la fusión con HSA para conseguir una actividad in vivo incrementada.
El documento EP2295560 se refiere a arginina desiminasas modificadas que muestran una actividad incrementada a un pH más alto, en comparación con una arginina desiminasa no modificada, así como usos de dichos enzimas para el tratamiento de cáncer y neovascularización inducida por tumor no deseada en un cáncer.
ROLAND E KONTERMANN ED - JIN YONG-SU et al., "Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 22, n° 6, ISSN 0958-1669, (2011), páginas 868 a 876, proporcionan una vista general exhaustiva de las estrategias de prolongación de la semivida, entre ellas las destinadas a incrementar el volumen hidrodinámico de un fármaco proteico, aunque asimismo las que implementan procedimientos de reciclado mediados por el receptor neonatal de Fc.
Sumario de la presente divulgación
En la presente divulgación, las proteínas de fusión de arginina desiminasa (AAD) de unión a albúmina presentan una actividad y semivida en plasma incrementadas con el fin de reducir eficientemente la cantidad de arginina en las células de cáncer. Puede observarse ADI nativa en los microorganismos y es antigénica y resulta rápidamente lavada de la circulación en el paciente. La presente divulgación construye diferentes proteínas de fusión de AAD con una o dos proteínas de unión a albúmina para mantener una actividad elevada con una semivida in vivo más larga (por lo menos 5 días de agotamiento de la arginina después de una inyección). En la presente divulgación, la proteína de unión a albúmina en el producto de proteína de fusión de AAD aparentemente no influye sobre su actividad enzimática específica, sino que por el contrario aparentemente incrementa la semivida en circulación. Las actividades específicas de la ADI de tipo salvaje y la proteína de fusión de AAD en la presente divulgación son de 8.4 y 9.2 U/mg (a pH fisiológico 7.4), respectivamente.
En su sentido más amplio, la presente divulgación proporciona una proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina que comprende una primera parte que comprende uno o dos componentes seleccionados de un dominio de unión a albúmina, un péptido de unión a albúmina o una o más proteínas de unión a albúmina fusionadas con una segunda parte que comprende arginina desiminasa para formar la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, de manera que la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina conserva la actividad de la arginina desiminasa y asimismo es capaz de unirse a la albúmina sérica.
La presente divulgación se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen proteína de fusión de arginina desiminasa (AAD) de unión a albúmina para el tratamiento dirigido del cáncer en seres humanos y otros animales. El primer aspecto de la presente divulgación es construir la proteína de fusión de AAD modificada con elevada actividad contra las células de cáncer. El segundo aspecto de la presente divulgación es purificar la proteína de fusión de AAD con alta pureza a partir de fracciones tanto solubles como insolubles de las proteínas en bruto. El tercer aspecto de la presente divulgación es prolongar la semivida de la proteína de fusión de AAD ya que puede unirse a la albúmina muy bien en la circulación. El cuarto aspecto de la presente divulgación es proporcionar un método de utilización de la composición farmacéutica que contiene AAD de la presente divulgación para el tratamiento de cáncer mediante la administración de dicha composición en un sujeto que lo necesita que sufre de diversos tumores, cánceres o enfermedades asociadas a tumores o cánceres u otras enfermedades dependientes de arginina.
La proteína de fusión de AAD de la presente divulgación asimismo se modifica para evitar la disociación en proteína de unión a albúmina y ADI de manera que deviene más estable y presenta una semivida en circulación más prolongada. La ADI se fusiona con un dominio/péptido/proteína de unión a albúmina en un producto de fusión de AAD para prolongar la semivida en plasma y reducir la inmunogenicidad del producto de fusión. El dominio de unión a albúmina (DAB) es un péptido que se une a la albúmina en la sangre. Existen diferentes variantes de DAB que muestran afinidades diferentes o mejoradas para la albúmina de suero humano (HSA). Pueden construir diferentes variantes de DAB y pueden fusionarse con la ADI. Al contrario que la ADI natural, esta propiedad de semivida más prolongada facilita el agotamiento de la arginina eficientemente en las células cancerosas, células madre de cáncer y/o células progenitoras de cáncer.
La composición farmacéutica que contiene proteína de fusión de AAD puede utilizarse para la inyección intravenosa (i.v.) (para la administración de acción rápida de la medicación) y la inyección intramuscular (i.m.) (para la administración de acción bastante rápida y de duración prolongada de la medicación). La aplicación de proteína de fusión de AAD en la presente divulgación puede utilizarse en el tratamiento de diversos cánceres, tales como cáncer pancreático, leucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer hepático, cáncer nasofaríngeo, cáncer esofágico y cáncer cerebral. La presente divulgación se refiere a proteínas de fusión de AAD, a dichas proteínas de fusión de AAD para la utilización en métodos de tratamiento de cáncer, para la utilización en método de tratamiento y/o inhibición de la metástasis de tejido canceroso, y para la utilización en métodos de curación de enfermedades dependientes de la arginina.
Las proteínas de fusión de AAD de la presente divulgación asimismo resultan útiles en métodos que incluyen la utilización de una combinación de diferentes fármacos quimioterápicos y/o radioterapia con proteína de fusión de AAD de la presente divulgación, proporcionando un efecto sinérgico sobre el tratamiento de cáncer.
Sumario de la invención
En una primera forma de realización, la presente invención se refiere a una proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, en la que dicha proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 40 y n° 41.
En una segunda forma de realización, la presente invención se refiere a un método para preparar la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina de la primera forma de realización que comprende construir un gen de fusión codificante de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, insertar el gen de fusión en un vector, insertar el vector en un organismo hospedador y expresar una proteína que incluye la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina de la primera forma de realización.
En una tercera forma de realización, la presente invención se refiere a un método de preparación de la proteína de fusión de desiminasa de unión a albúmina de la primera forma de realización mediante ligadura de proteínas mediada por inteína entre el dominio de unión a albúmina, el péptido de unión a albúmina o la proteína o proteínas de unión a albúmina y la segunda parte que comprende arginina desiminasa.
En una cuarta forma de realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento de un cáncer en un paciente, en el que dicha composición comprende una cantidad clínicamente eficaz de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina de la primera forma de realización en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 (comparativa) representa el enfoque de diseño para la construcción de diferentes proteínas de fusión de AAD con uno o dos dominios/péptidos/proteínas de unión a albúmina en estructura tridimensional. Puede fusionarse uno o dos dominios/péptidos/proteínas de unión a albúmina a la ADI para formar la proteína de fusión de AAD. La posición del dominio/péptido/proteína de unión a albúmina se encuentra lejos del sitio activo de la ADI. El dominio/péptido/proteína de unión a albúmina puede fusionarse con el extremo N y/o el extremo C de la ADI. La estructura en dicha figura se basa en la estructura de la ADI de Mycoplasma arginini (Protein Data Bank: 1LXY). (A) ADI nativa, (B) proteína de fusión de AAD con dos ABD o ABd 1, (C) proteína de fusión de AAD con un ABD o ABD1 en el extremo N, (D) proteína de fusión de AAD con un ABD o ABD1 en el extremo C.
La figura 2 (comparativa) representa la alineación de secuencias para la ADI en algunas especies bacterianas, incluyendo Mycoplasma arginini (SEC ID n° 23), Lactococcus lactis (SEC ID n° 24), Bacillus cereus (SEC ID n° 25) y Bacillus licheniformis (SEC ID n° 26).
La figura 3 representa los diseños y secuencias de aminoácidos para diferentes proteínas de fusión de AAD originadas a partir de Mycoplasma arginini (en el que A, B, C y D son comparativos y E, según la invención) y proteína de fusión de a A d originada a partir de Bacillus cereus (F, según la invención).
La figura 4 (comparativa) representa la creación de proteína de fusión de AAD en las dos formas de realización (A) y (B) mediante la utilización de proteínas de fusión de inteína y ligadura de proteínas expresadas (CBD, dominio de unión a quitina) bajo los esquemas siguientes: (C) fusión de extremo C-terminal, (D) fusión de extremo N-terminal y (E) ligadura de proteínas mediada por inteína.
La figura 5 representa el mapa plasmídico del vector de expresión construido para producir la proteína de fusión de AAD.
La figura 6 representa (A) el mapa génico, (B) la secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 44) y (C) la secuencia de aminoácidos (SEC ID n° 40) de His-ABD-PoliN-ADI (ADI: la ADI de Mycoplasma arginini)
La figura 7 representa (A) el mapa génico, (B) la secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 45) y (C) la secuencia de aminoácidos (SEC ID n° 41) de His-ABD-PoliN-bcADI (bcADI, la ADI de Bacillus cereus)
La figura 8 representa la expresión y purificación de la proteína de fusión de AAD: (A) AAD es -90% soluble al expresarse a 20°C (carriles 2 y 3) y -90% insoluble (cuerpos de inclusión) al expresarse a 37°C (carriles 4 y 5), (B) la proteína de fusión de AAD purificada en electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE): carril 1, proteína de fusión de AAD purificada (52.8 kDa); carril 2: marcador de peso molecular.
La figura 9 ilustra que la proteína de fusión de AAD agota la arginina eficientemente e inhibe el crecimiento de diversos tipos de estirpes celulares de cáncer humano en estudios de cultivo tisular in vitro, incluyendo el melanoma humano (A375), el carcinoma de colon humano (HCT116) y el cáncer pancreático humano (Pancl).
La figura 10 representa los resultados de unión a albúmina de la proteína de fusión de AAD: (A) gel de poliacrilamida nativo no desnaturalizante (al 12%) que muestra el incremento en la cantidad de complejo HSA+AAD al incrementarse la cantidad añadida de proteína de fusión de AAD (la secuencia de aminoácidos se representa en la SEC ID n° 36, figura 3A). Las proporciones molares de albúmina de suero humano (HSA): AAD en los carriles 3 a 6 son de 1:1, 1:2, 1:5 y 1:15, respectivamente. Los carriles 1 y 2 representan HSA y AAD en 6 y 30 pmoles, respectivamente; (B) En otro experimento basado en proteína de fusión de AAD (SEC ID n° 40, figura 3E), una proporción albúmina: AAD de 1:8 resulta suficiente para ligar toda la albúmina presente (carril 5).
La figura 11 es un gráfico que representa la respuesta a dosis de la proteína de fusión de AAD sobre los niveles plasmáticos de arginina en ratones. Una dosis de 100 |jg de AAD resulta suficiente para agotar la arginina plasmática durante como mínimo 5 días.
Definiciones
La expresión "célula madre de cáncer" se refiere a la célula biológicamente diferente dentro del clon neoplásico que es capaz de iniciar y sostener el crecimiento tumoral in vivo (es decir, la célula iniciadora de cáncer).
Descripción detallada de la invención
La arginina es un aminoácido semiesencial para seres humanos y otros mamíferos. Puede sintetizarse a partir de citrulina mediante un procedimiento en dos etapas catalizado por los enzimas del ciclo de la urea argininosuccinato sintasa (ASS) y argininosuccinato liasa (ASL). La arginina puede ser metabolizada en ornitina por el enzima arginasa, y la ornitina puede ser convertida en citrulina por la ornitina carbamoiltransferasa (OTC) en las mitocondrias. La citrulina puede utilizarse para sintetizar arginina nuevamente. Las células normales habitualmente no requieren un suministro exógeno de arginina para crecer debido a la abundante actividad catalítica de ASS y ASL. En contraste, muchos tipos de cánceres no expresan ASS y, por lo tanto, son auxotróficos para la arginina. Su crecimiento es exclusivamente dependiente de la arginina en la circulación. Por lo tanto, dirigirse a la arginina circulante mediante el uso de enzimas degradantes de arginina es una estrategia viable de inhibición del crecimiento de tumores negativos para ASS.
La arginina puede ser degradada por la arginina desiminasa (ADI). La ADI convierte la arginina en citrulina y amoníaco, los metabolitos del ciclo de la urea. Desafortunadamente, sólo puede observarse ADI en procariotas, por ejemplo, Mycoplasma sp. Existen muchos problemas asociados al aislamiento y purificación de arginina desiminasa a partir de los procariotas. La ADI aislada a partir de Pseudomonas pudita no consigue mostrar eficacia in vivo debido a su baja actividad enzimática a pH neutro. La ADI producida a partir de Escherichia coli es enzimáticamente inactiva y en consecuencia requiere un procedimiento de múltiples desnaturalizaciones y renaturalizaciones, lo que eleva el consiguiente coste de producción. La semivida en plasma de la forma nativa de ADI es corta (~4 horas) tras la inyección en la circulación humana [Ensor et al., Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Izzo et al., J. Clin. Oncol. 22:1815-1822 (2004)]. Estas desventajas pueden remediarse parcialmente mediante pegilación. De entre las diversas formas de ADI pegilada, se encontrado que la ADI unida a PEG (peso molecular de 20,000) mediante succinato de succinimidilo (ADI-PEG 20) es una formulación eficaz. Sin embargo, la actividad de ADI tras la pegilación se reduce en gran medida (en -50%) [Ensor et al., Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Wang et al., Bioconjug. Chem. 17:1447-1459 (2006)]. Además, el conector de succinado de succinimidilo PEG puede hidrolizarse fácilmente y desprenderse de la proteína, causando problemas inmunógenos tras un corto periodo de uso en el cuerpo. Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones mejoradas de tratamiento del cáncer, particularmente composiciones mejoradas de tratamiento del cáncer con actividad incrementada.
La ADI aislada a partir de P. pudita no consiguió mostrar eficacia in vivo debido a que presentaba poca actividad enzimática a pH neutro y resultaba rápidamente lavada de la circulación en los animales experimentales. La ADI derivada de Mycoplasma arginini se describe en, por ejemplo, Takaku et al, Int. J. Cancer, 51:244-249 (1992) y en la patente US n° 5.474.928. Sin embargo, un problema asociado a la utilización terapéutica de dicha proteína heteróloga es su antigenicidad. La modificación química de la ADI de Mycoplasma arginina, mediante un grupo de enlace de cloruro cianúrico, con polietilenglicol (PEG) ha sido descrita por Takaku et al., Jpn. J. Cancer Res., 84:1195-1200 (1993). Sin embargo, la proteína modificada era tóxica al ser metabolizada debido a la liberación del cianuro a partir del grupo de enlace de cloruro cianúrico. En contraste, incluso para ADI-PEG20, el conector de PEG puede ser fácilmente hidrolizado y desprenderse de la proteína, causando problemas inmunógenos tras un corto periodo de uso en el cuerpo. Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones que degraden aminoácidos no esenciales y que no presenten los problemas asociados a la técnica anterior.
En muchos tipos de cáncer, entre ellos el melanoma, cáncer pancreático, cáncer de colon, leucemia, cáncer de mama, cáncer prostático, carcinoma de células renales y cáncer hepático, las células de cáncer son auxotróficas para la arginina ya que carecen de expresión de argininosuccinato sintetasa (ASS), convirtiéndolas en excelentes dianas para la terapia de agotamiento de arginina. En la presente invención, las proteínas de fusión de arginina desiminasa (AAD) de unión a albúmina presentan una actividad elevada con semividas prolongadas para un agotamiento eficientes de la arginina en las células de cáncer.
El tamaño del monómero para la ADI es del orden de 45 kDa y existe en forma de dímero (del orden de 90 kDa) [Das et al., Structure. 12:657-667 (2004)]. Se representa un diseño para la construcción de una proteína de fusión de AAD, según la presente divulgación, en la figura 1 (comparativa). Se fusionan uno o dos dominios/péptidos/proteínas de unión a albúmina con o sin conectores, SEC ID n° 46 a n° 49, a ADI para formar la proteína de fusión de AAD. Cabe señalar que la selección de una o más dominios/péptidos/proteínas de unión a albúmina particulares puede llevarse a cabo dependiendo del tipo de tejido de cáncer que va a ser la diana, el tamaño y semivida deseados de la proteína de fusión resultante, y de si se selecciona un dominio o una proteína completa. Además, el material de unión a albúmina seleccionado puede ser igual o diferente. Es decir, puede fusionarse una proteína y un péptido, dos proteínas, dos dominios, un dominio y una proteína, etc., con la condición de que la molécula resultante conserve la actividad de la ADI y asimismo sea capaz de unirse a la albúmina sérica sin que ninguna parte de la proteína de fusión resulte interferida por otra parte de la proteína de fusión. La posición del dominio/péptido/proteína de unión a albúmina se encuentra lejos del sitio activo. El dominio/péptido/proteína de unión a albúmina puede fusionarse con el extremo N y/o el extremo C de la ADI. Existen diferentes variantes de DAB que muestran afinidades diferentes o mejoradas para la albúmina de suero humano (HSA). Pueden construir diferentes variantes de DAB y pueden fusionarse con la ADI. Algunos microorganismos datos de ADI (por ejemplo, Pseudomonas sp) no pueden ser utilizados debido a su potencial patogenicidad y pirogenicidad. Según la presente divulgación, la fuente de ADI puede ser, aunque sin limitación de diferentes microorganismos, por ejemplo, Mycoplasma (por ejemplo, Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritidis, Mycoplasma hominis), Lactococcus (por ejemplo, Lactococcus lactis), Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa), Steptococcus (por ejemplo Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumonia, Streptococcus pneumoniae), Escherichia, Mycobacterium (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis) y Bacillus (por ejemplo, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus). Resulta preferente que la ADI se clone a partir de Mycoplasma arginini, Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, o cualquier combinación de los mismos. Según la presente invención, la ADI se clona a partir de Mycoplasma arginine o Bacillus cereus. Sus secuencias de aminoácidos con SEC ID (SEC ID n° 23 a n° 25) y la alineación de secuencias para algunas de las secuencias de aminoácidos en la figura 2 (comparativa) se dan a conocer en la presente memoria y asimismo en la literatura [Das et al., Structure. 12:657-667 (2004); Wang et al., Bioconjug. Chem. 17:1447-1459 (2006); Ni et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 90:193-201 (2011)].
El diseño y secuencia de aminoácidos de (A) proteína ADI nativa de Mycoplasma arginini (SEC ID n° 23), (B) diferentes proteínas de fusión de AAD originadas a partir de ADI de Mycoplasma arginini (SEC ID n° 36 a n° 40) y (C) diferentes proteínas de fusión de AAD originadas a partir de ADI de Bacillus cereus (SEC ID n° 41) se representan en la figura 3. Se han construido con éxito diferentes proteínas de fusión de AAD, de entre las que las proteínas de fusión de AAD originadas a partir de ADI de Mycoplasma arginini (SEC ID n° 40) y proteína de fusión de AAD originadas a partir de ADI de Bacillus cereus (SEC ID n° 41) son proteínas de fusión según la primera forma de realización de la presente invención. Se ha insertado un conector entre la proteína de unión a albúmina y la ADI en la proteína de fusión de AAD en dichas formas de realización.
Por otra parte, según la presente divulgación, asimismo se ha creado una nueva proteína de fusión de AAD mediante la utilización de proteínas de fusión de inteína y ligadura de las proteínas expresadas (figura 4, comparativa). La nueva proteína de fusión de AAD puede formarse (1) mediante reacción de la ADN que presenta un residuo de cisteína N-terminal con un tioéster reactivo en el extremo C de ABD, o (2) mediante reacción de ABD que presenta un residuo de cisteína N-terminal con un tioéster reactivo en el extremo C de la ADI, de manera que ADI y ABD se unen mediante un enlace covalente. En la figura 4E, la ADI con residuo de cisteína N-terminal reacciona con el tioéster reactivo en el extremo C de ABD. La etiqueta tioéster en el extremo C de ABD y una acisteína en el extremo N de la ADI resultan necesarios para facilitar la ligadura de la proteína. Dichos productos se producen utilizando un vector pTWIN1 (New England Biolabs) siguiendo el manual del fabricante. En particular, el gen codificante de la proteína de fusión ABD-inteína-CBD se sintetiza y se clona en el vector bajo el control del promotor de T7 para la expresión en E. coli (figura 4C). La proteína de fusión ABD-inteína-CBD producida se une a la quitina en una columna. La secuencia de aminoácidos de ABD-inteína-CBD (SEC ID n° 42) se representa en la figura 4A. Tras la escisión inducible con tiol y la elución a partir de la columna, se obtiene la ABD con tioéster reactivo en su extremo C (figura 4C). Por otra parte, el gen codificante de la proteína de fusión CBD-inteína-ADI se sintetiza y se clona en el vector bajo el control del promotor de T7 para la expresión en E. coli (figura 4D). La proteína de fusión CBD-inteína-ADI producida se une a la quitina en una columna. La secuencia de aminoácidos de CBD-inteína-ADI (SEC ID n° 43) se representa en la figura 4B. Tras la escisión a pH 7 y 25°C, y la elución a partir de la columna, se obtiene la ADI con a-cisteína en su extremo N (figura 4D). Finalmente, la proteína de fusión de AAD, según la presente divulgación, se produce mediante la reacción de ligadura de proteínas, tal como se representa en la figura 4E.
Resulta importante, según la invención, que las proteínas de fusión de AAD puedan producirse y purificarse de una manera conveniente. Por ejemplo, una proteína de fusión de AAD se expresa y purifica con éxito a partir de E. coli tanto en la fracción soluble como en la fracción insoluble, y se representa este resultado en la figura 8. Además, la figura 8 representa la proteína de fusión de AAD purificada, analizada mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE). Se determina que el tamaño de la proteína de fusión de AAD purificada es de 52.8 kDa.
La composición farmacéutica de la cuarta forma de realización de la presente invención contiene proteína de fusión de AAD de alta actividad para agotar la arginina en las células tumorales para el tratamiento de cáncer. La actividad específica de la proteína de fusión de AAD purificada se ha encontrado que es similar a la de la ADI de tipo salvaje. IC50 es la concentración de inhibición semimáxima, es decir, representa la concentración de proteína de fusión de AAD que resulta necesaria para la inhibición al 50% de una estirpe de células de cáncer. La IC50 es una medida de la eficacia de un fármaco. La C50 de la proteína de fusión de AAD (la secuencia de aminoácidos se representa en la SEC ID n° 40, figura 3E) para diferentes estirpes celulares de cáncer (melanoma humano, A375 y SK-meI-28; carcinoma de colon humano, HCT116; cáncer pancreático humano, PancI, cáncer hepático humano, Sk-hep1; cáncer cervical humano, C33-A) se representa en la tabla 1. La eficacia in vitro de la proteína de fusión de a A d sobre diferentes estirpes celulares de cáncer se representa en la figura 9. Ilustra que la proteína de fusión de AAD puede eliminar muchos tipos de cáncer, entre ellos el melanoma humano, el carcinoma de colon humano y las estirpes celulares de cáncer pancreático.
Tabla 1
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Para el estudio de unión a albúmina, los presentes inventores demostraron con éxito que la proteína de fusión de AAD manipulada puede unirse a la albúmina de suero humano (HSA). La figura 10 representa que la proteína de fusión de AAD (la secuencia de aminoácidos se representa en la SEC ID n° 40, figura 3E) se une a HSA fácilmente. En una proporción molar de 1:5 o 1:15, se produce la formación del complejo HSA-AAD según el constructo de la figura 1 utilizando el diseño de la molécula de conector. Se espera que la semivida en circulación de la proteína de fusión de AAD en sangre se incremente gracias a la formación del complejo no covalente HSA-AAD. Por lo tanto, se ha creado con éxito una versión de larga duración de la proteína de fusión de AAD.
Ningún producto comercial muestra una elevada eficacia en comparación con la composición farmacéutica que contiene proteína de fusión de AAD preparada en la presente invención. Para el uso en el tratamiento del cáncer, la composición farmacéutica que contiene proteína de fusión de AAD de la presente invención sirve como agente anticanceroso para agotar la arginina en los tejidos tumorales. La proteína de fusión de AAD es un buen candidato para la utilización en combinación con otros agentes de direccionamiento molecular o citotóxicos.
Ejemplos
Los ejemplos a continuación se proporcionan mediante la descripción de formas de realización específicas de la presente invención sin pretender limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.
Varios de los ejemplos, a continuación, se refieren a métodos de preparación de una proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina. Pueden utilizarse diversas técnicas, entre ellas la clonación y la ligadura de proteínas mediada por inteína. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "clonación" se utiliza ampliamente y comprende construir un gen de fusión codificante de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, insertar el gen de fusión en un vector, insertar el vector en un organismo hospedador y expresar una proteína que incluye una proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina. Pueden llevarse a cabo numerosas variantes de dicha técnica y todavía se encuentran comprendidas dentro de la clonación contemplada por la presente invención.
Ejemplo 1
Construcción del gen codificante de dominio/péptido/proteína de unión a albúmina (ABD)
El gen codificante de ABD se construyó mediante dos rondas de PCR. En la primera ronda, la mezcla de reacción de PCR (volumen total: 25 j l ) contenía los materiales siguientes:
1 x tampón para PCR iProof (Bio-Rad)
mezcla de dNTP 50 jM
0.5 unidades de ADN polimerasa iProof (Bio-Rad)
10 nM de cada uno de los oligos siguientes:
cebador directo ABD-F1 (SEC ID n° 01):
5' -CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3'
cebador inverso ABD-R2 (SEC ID n° 02):
5' -TAGTCACTTACTCCATATTTGTCAAGTTCTCTGTTAGCTAAGACTTTAGC-3'
cebador directo ABD-F3 (SEC ID n° 03):
5'-GAACTTGACAAATATGGAGTAAGTGACTATTACAAGAACCTAATCAACAA-3'
cebador inverso ABD-R4 (SEC ID n° 04):
5'-TACACCTTCAACAGTTTTGGCATTGTTGATTAGGTTCTTGTAATAGTCAC-3'
cebador directo ABD-F5 (SEC ID n° 05):
5'-GCCAAAACTGTTGAAGGTGTAAAAGCACTGATAGATGAAATTTTAGCTGC-3'
cebador inverso ABD-R6 (SEC ID n° 06):
5'-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3'
Se utilizó el programa de PCR siguiente:
98°C, 30 s; 20 ciclos de {98°C, 10 s; 50°C, 20 s; 72°C, 20 s}.
En la segunda ronda de PCR, la mezcla de PCR (volumen total: 50 j l ) contenía los materiales siguientes:
1 x tampón para PCR iProof (Bio-Rad),
mezcla de los dNTP 50 jM ,
1 j l de reactivo de PCR como molde de ADN de la primera ronda,
1 unidad de ADN polimerasa iProof (Bio-Rad),
200 nM de cada uno de los oligos siguientes:
cebador directo ABD-F7 (SEC ID n° 07):
5'-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3'
cebador inverso ABD-R8 (SEC ID n° 08):
5'-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3'
Se utilizó el programa de PCR siguiente:
98°C, 30 s; 35 ciclos de {98°C, 10 s; 60°C, 20 s; 72°C, 20 s}; 72°C, 5 min.
Se obtuvo un producto de PCR que contenía la secuencia de ADN de ABD (169 pb) y se purificó con un kit de extracción en gel de ADN Qiagen para fines de clonación.
Ejemplo 2A
Construcción del gen de fusión codificante de la proteína de fusión de AAD
En la primera PCR, la mezcla de PCR (volumen total: 50 j l ) contenía los materiales siguientes:
1 x tampón para PCR iProof (Bio-Rad),
mezcla de los dNTP 50 jM ,
25 ng de ADN genómico de Mycoplasma arginini,
1 unidad de ADN polimerasa iProof (Bio-Rad),
200 nM de cada uno de los oligos siguientes:
cebador directo ADINde-F (SEC ID n° 09):
5'-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3'
cebador inverso ADIhis-R (SEC ID n° 10):
5'-AGCTAAGGAATTCGCATCATGATGGTGATGGTGGTGGCTACCCCACTTAAC-3'
Se utilizó el programa de PCR siguiente:
98°C, 1 min; 35 ciclos de {98°C, 10 s; 50°C, 20 s; 72°C, 40 s}; 72°C, 5 min.
Se obtuvo un producto de PCR de 1280 pb de longitud y se purificó con el kit de extracción en gel de ADN Qiagen. Después, se llevó a cabo la segunda PCR. La mezcla de PCR (volumen total: 50 j l ) contenía los materiales siguientes:
1 x tampón para PCR iProof (Bio-Rad),
mezcla de los dNTP 50 jM ,
10 ng del producto de PCR de 1280 pb,
10 ng del producto de PCR de 169 pb,
1 unidad de ADN polimerasa iProof (Bio-Rad),
200 nM de cada uno de los oligos siguientes:
cebador directo ADINde-F (SEC ID n° 11):
5'-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3'
cebador inverso ABD-R10 (SEC ID n° 12):
5'-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3'
Se utilizó el programa de PCR siguiente:
98°C, 1 min; 35 ciclos de {98°C, 10 s; 50°C, 20 s; 72°C, 45 s}; 72°C, 5 min.
Se obtuvo un producto de PCR de 1428 pb de longitud y se purificó con el kit de extracción en gel de ADN Qiagen. A continuación, se digirió con los enzimas de restricción NdeI e HindIII y se ligó al plásmido pREST A (Invitrogen) que se había predigerido con los mismos enzimas. Seguidamente, el producto de ligadura se transformó en células de E. coli BL21 (DE3). La secuencia del gen de fusión construido se confirmó mediante secuenciación de ADN.
Ejemplo 2B
Clonación de His-ABD-PoliN-ADI
La construcción de His-ABD-PoliN-ADI (SEC ID n° 40, en la figura 3E) se llevó a cabo en dos etapas de PCR solapante; el fragmento de PCR obtenido de la última etapa se insertó en el vector pET3a entre los sitios Ndel y BamHI. El mapa génico, la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de His-ABD-PoliN-ADI se representan en la figura 6.
Cebadores implicados en la construcción de His-ABD-PoliN-ADI:
cebador directo hisABDNde-F (SEC ID n° 13):
5'-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3'
cebador inverso ABDnn-R1 (SEC ID n° 14):
5'-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3'
cebador inverso ABDn-R2 (SEC ID n° 15):
5'-AGAACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3'
cebador directo ADIn-F (SEC ID n° 16):
5'-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3'
cebador inverso ADIBam-R (SEC ID n° 17):
5'-TAGATCAATGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACGTGATAAAG-3'
En la primera ronda de PCR, se prepararon 50 pl de volumen de reacción que contenía una concentración conocida de componentes en dos tubos para PCR. En cada uno de los tubos se mezcló dNTP, tampón iProof (BIO-RAD), ADN polimerasa iProof (BIO-RAd ), cebadores y molde de ADN y se enrasó a 50 pl con ddH2O. El molde de ADN utilizado en la reacción era un vector pET3a que contenía el gen de ADI de Mycoplasma arginini con eliminación de una mutación interna del sitio NdeI sin alterar la secuencia proteica del gen ADI.
Los dos tubos de reacción contenían las mezclas de cebadores de (A) 10 pmoles de hisABDNde-F (SEC ID n° 13), 0.5 pmoles de ABDnn-R1 (SEC ID n° 14) y 10 pmoles de ABDn-R2 (SEC ID n° 15) y (B) 10 pmoles de ADIn-F (SEC ID n° 16) y 10 pmoles de ADIBam-R (s EC ID n° 17), respectivamente.
El programa de la PCR se configuró según las etapas recomendadas en el manual, con una temperatura de hibridación y extensión (tiempo) de 50°C (20 s) y de 72°C (40 s), respectivamente. Los dos productos generados mediante PCR presentaban un tamaño de 237 pb y 1278 pb. Se extrajeron los productos y se aplicaron como molde para la siguiente ronda de PCR.
En la segunda etapa solapante, se preparó la mezcla de reacción de una manera similar a la primera ronda, excepto en que el molde utilizado era la mezcla de 1 pmol del producto de PCR de 237 pb y 1 pmol del producto de PCR de 1278 pb de la primera ronda de PCR. Los cebadores utilizados se cambiaron a 10 pmoles de hisABDNde-F (SEC ID n° 13) y 10 pmoles de ADIBam-R (SEC ID n° 17).
La temperatura de hibridación y extensión (tiempo) eran de 50°C (20 s) y 72°C (60 s), respectivamente. Se generó un producto de PCR de un tamaño de 1484 pb a partir de la reacción. El producto de p Cr se purificó y se digirió con NdeI y BamHI y después se ligó en el plásmido pET3a predigerido. A continuación, el producto ligado se transformó en E. coli BL21 (DE3) para la producción de proteína recombinante.
Ejemplo 2C
Clonación de His-ABD-PoliN-bcADI
La construcción de His-ABD-PoliN-bcADI (SEC ID n° 41, en la figura 3E) se llevó a cabo en dos etapas de PCR solapante; el fragmento de PCR obtenido de la última etapa se insertó en el vector pET3a entre los sitios NdeI y BamHI. El mapa génico, la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de His-ABD-PoliN-bcADI se representan en la figura 7.
Cebadores implicados en la construcción de His-ABD-PoliN-bcADI:
cebador directo hisABDNde-F2(SEC ID n° 18):
5'-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3'
cebador inverso bcABDnn-R1 (SEC ID n° 19):
5'-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3'
cebador inverso bcABDn-R2 (SEC ID n° 20):
5'-TTTACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3'
cebador directo bcADIn-F (SEC ID n° 21):
5'-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTAAACATCCGATACATGTTACTTCAGA-3'
cebador inverso bcADIBam-R (SEC ID n° 22):
5'-TAGATCAATGGATCCCTAAATATCTTTACGAACAATTGGCATAC-3'
En la primera ronda de PCR, se prepararon 50 |jl de volumen de reacción que contenía una concentración conocida de componentes en dos tubos para PCR. En cada uno de los tubos se mezcló dNTP, tampón iProof (BIO-RAD), ADN polimerasa iProof (BIO-RAD), cebadores y molde de ADN y se enrasó a 50 j l con ddH2O. El molde de ADN utilizado en la reacción era un vector pET3a que contenía el gen de ADI de Bacillus cereus con eliminación de una mutación interna del sitio NdeI sin alterar la secuencia proteica del gen ADI.
Los dos tubos de reacción contenían las mezclas de cebadores de (A) 10 pmoles de hisABDNde-F2 (SEC ID n° 18), 0.5 pmoles de bcABDnn-R1 (SEC ID n° 19) y 10 pmoles de bcABDnR2 (SEC ID n° 20) y (B) 10 pmoles de bcADIn-F (SEC ID n° 21) y 10 pmoles de bcADIBam-R (SEC ID n° 22), respectivamente. El programa de la PCR se configuró según las etapas recomendadas en el manual, con una temperatura de hibridación y extensión (tiempo) de 50°C (20 s) y de 72°C (40 s), respectivamente. Los dos productos generados mediante PCR presentaban un tamaño de 237 pb y 1250 pb. Se extrajeron los productos y se aplicaron como molde para la siguiente ronda de PCR.
En la segunda etapa solapante, se preparó la mezcla de reacción de una manera similar a la primera ronda, excepto en que el molde utilizado era la mezcla de 1 pmol del producto de PCR de 237 pb y 1 pmol del producto de PCR de 1250 pb de la primera ronda de PCR. Los cebadores utilizados se cambiaron a 10 pmoles de hisABDNde-F2 (SEC ID n° 18) y 10 pmoles de bcADIBam-R (SEC ID n° 22).
La temperatura de hibridación y extensión (tiempo) eran de 50°C (20 s) y 72°C (60 s), respectivamente. Se generó un producto de PCR de un tamaño de 1512 pb a partir de la reacción. El producto de p Cr se purificó y se digirió con NdeI y BamHI y después se ligó en el plásmido pET3a predigerido. A continuación, el producto ligado se transformó en E. coli BL21 (DE3) para la producción de proteína recombinante.
Ejemplo 3
Expresión y purificación de la proteína de fusión de AAD
Para preparar el cultivo de inóculo, se cultivó la cepa E. coli BL21(DE3) portadora del plásmido codificante de la proteína de fusión de AAD (figura 5) en 5 ml de medio 2xTY, a 30°C, 250 rpm, durante la noche. El cultivo inóculo de durante la noche (2.5 ml) se añadió a 250 ml de 2xTY, a 37°C, 250 rpm, durante 2.5 h (hasta una DO600 “ 0.6­ 0.7). Tras alcanzar la DO600, se añadió IPTG al cultivo (concentración final: 0.2 mM). Se continuó con el crecimiento durante 22 horas más a 20°C y después se recolectaron las células mediante centrifugación. Se resuspendió el sedimento celular en 25 ml de tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7.4. Las células se lisaron mediante sonicación. La parte soluble se recolectó mediante centrifugación. A continuación, la proteína de fusión (que contenía una etiqueta de His) se purificó mediante cromatografía de afinidad de níquel. La tabla 2 muestra que la temperatura de cultivo es un factor importante que afecta la solubilidad de la proteína de fusión de AAD (la secuencia de aminoácidos se representa en la SEC ID n° 40, figura 3E) obtenida a partir del hospedador de expresión.
Para aislar la fracción soluble de la proteína de fusión de AAD, el sedimento celular se resuspendió en 25 ml de tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7.4. Las células se lisaron mediante sonicación. La parte soluble se recolectó mediante centrifugación. A continuación, la proteína de fusión de AAD (que contenía una etiqueta de His) se purificó mediante cromatografía de afinidad de níquel.
Para aislar la fracción soluble de la proteína de fusión de AAD, el sedimento celular se resuspendió en 25 ml de tampón de Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, Triton X-100 al 1%. Las células se lisaron mediante sonicación. La parte insoluble (cuerpos de inclusión) se recolectó mediante centrifugación. La proteína se desplegó mediante resuspensión en 10 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, HCl de guanidina 6 M, y se agitó con vórtex hasta solubilizarse. La proteína se plegó nuevamente mediante la adición de solución de proteína no plegada gota a gota en una solución de agitación rápida de 100 ml de tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7.4. Los materiales insolubles se eliminaron mediante centrifugación. La precipitación salina de la proteína se llevó a cabo mediante la adición de polvos sólidos de sulfato amónico al sobrenadante hasta alcanzar una saturación de 70%. Se recolectó la parte insoluble mediante centrifugación y se resuspendió en 10 ml de tampón de fosfato sódico 20 mM. A continuación, la proteína de fusión de AAD (que contenía una etiqueta de HiS) se purificó mediante cromatografía de afinidad de níquel.
TABLA 2
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Ejemplo 4
Ensayo de actividad enzimática y cinética enzimática de la proteína de fusión de AAD
Con el fin de determinar la actividad enzimática de la ADI de tipo salvaje y la proteína de fusión de AAD en la presente invención, se utilizó monoxima de diacetilo (DAM) -tiosemicarbazida (TSC) para la detección de citrulina. se representa la reacción a continuación:
L-arginina arq¡n¡na desiminasa (a d i) o proteina de fusión de a a d > L-citrulina amoníaco
Se llevó a cabo dicho ensayo mediante la adición de muestra a un reactivo de color, que se preparó mediante la mezcla de solución ácida de cloruro férrico y solución de DAM-TSC. Brevemente, se incubó el enzima con arginina 20 mM, fosfato sódico 10 mM, pH 7.4, durante 5 min a 37°C. La mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 5 min para revelar el color y se leyó a 540 nm (camino óptico=1 cm). Se construyó una curva patrón mediante la utilización de diversas concentraciones de citrulina. Una unidad del enzima nativo ADI es la cantidad de actividad enzimática que convierte 1 pmol de arginina en 1 pmol de citrulina por minuto a 37°C bajo las condiciones de ensayo. Las actividades especificas de la ADI de tipo salvaje y la proteina de fusión de AAD en la presente invención son de 8.4 y 9.2 u/mg (a pH fisiológico 7.4), respectivamente. Asimismo se determinaron las actividades especificas para la a D i de tipo salvaje y la proteina de fusión de AAD en un intervalo de pH diferente (pH de 5.5 a 9.5) y el pH óptimo se encontraba en 6.5. Por lo tanto, los resultados indican que la proteina de fusión de AAD agota la arginina eficientemente, ya que la fusión con proteina de unión a albúmina no afecta la actividad enzimática de la ADI.
La constante de Michaelis, Km, es la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es semimáxima y es una medida inversa de la afinidad del sustrato para el enzima. Una Km pequeña indica una afinidad elevada para el sustrato, y ello significa que la velocidad se aproximará a la velocidad de reacción máxima con mayor rapidez. Para la determinación de la cinética enzimática o el valor de Km, se mide la actividad de la ADI de tipo salvaje y de la proteina de fusión de AAD bajo diferentes concentraciones de sustrato de arginina (2000 pM, 1000 |jM, 500 pM, 250 pM, 125 pM, 62.5 pM) a pH 7.4. Los valores medidos de Km de la proteina de fusión de AAD mostrados en la figura 3E (SEC ID n° 40; la proteina ADI se orinó a partir de Mycoplasma arginini) y la proteina de fusión de AAD mostrada en la figura 3F (SEC ID n° 41; la proteina ADI se originó a partir de Bacillus cereus) eran de 0.0041 mM y 0.132 mM, respectivamente. Los resultados sugieren que la fusión con ABD no afecta a la afinidad de unión de las diferentes proteinas de fusión de AAD a la arginina.
Ejemplo 5
Ensayo de proliferación celular y eficacia in vitro de la proteina de fusión de AAD sobre estirpes celulares de cáncer
Se utilizó el medio de cultivo DMEM para cultivar las estirpes celulares de melanoma humano A375 y SK-meI-28, de cáncer pancreático humano PancI y de cáncer cervical humano C-33A. Se utilizó medio EMEM para cultivar las estirpes celulares de cáncer hepático SK-hep 1 y de cáncer cervical C-33A. Se sembraron células de cáncer (2-5 x 103) en 100 pl de medio de cultivo en los pocillos de placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. El medio de cultivo se sustituyó por medio que contenia diferentes concentraciones de proteina de fusión de AAD. Las placas se incubaron durante 3 dias adicionales a 37°C en una atmósfera de 95% de aire/5% de CO2. Se llevó a cabo un ensayo de MTT para estimar el número de células viables en el cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de enzima necesaria para conseguir una inhibición de 50% del crecimiento celular se define como IC50.
Tal como se representa en la tabla 1 y en la figura 9, los resultados indican que la proteina de fusión de AAD agota la arginina eficientemente e inhibe el crecimiento de diversos tipos de estirpes celulares de cáncer humanas en estudios de cultivo tisular in vitro. Por ejemplo, el melanoma humano, el carcinoma de colon humano, el cáncer pancreático humano, el cáncer hepático humano y el cáncer cervical humano presentan todos valores bajos de IC50 (ver la tabla 1), ya que estos tipos de cáncer resultan todos inhibidos por la proteina de fusión de AAD con facilidad. Tal como se habia predicho, la proteina de fusión de AAD inhibe todos los tipos de cáncer que son dependientes de arginina (por ejemplo, los cánceres negativos para ASS).
Ejemplo 6
Determinación in vivo de la semivida de la proteina de fusión de AAD
En el presente estudio se utilizaron ratones Balb/c (5 a 7 semanas) y se dejó que se aclimatasen durante una semana antes del experimento. Los ratones (n=3) se separaron en tres grupos y recibieron inyecciones de 0, 100,

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, comprendiendo la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEC ID n° 40 y 41.
Figure imgf000062_0001
2. Método de preparación de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 1, que comprende construir un gen de fusión que codifica la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina, insertar el gen de fusión en un vector, insertar el vector en un organismo hospedadory expresar una proteína que incluye la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 1.
3. Método de preparación de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 2, que comprende además purificar la proteína de fusión.
4. Método de preparación de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 3, en el que la purificación se lleva a cabo mediante cromatografía.
5. Método de preparación de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 3, en la que la purificación se lleva a cabo a partir de fracciones solubles de proteínas en bruto.
6. Método de preparación de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 3, en la que la purificación se lleva a cabo a partir de fracciones insolubles de proteínas en bruto.
7. Método de preparación de la proteína de fusión de desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 1 mediante ligadura de proteína mediada por inteína entre el dominio de unión a albúmina, el péptido de unión a albúmina o la(s) proteína(s) de unión a albúmina y la segunda parte que comprende arginina desiminasa.
8. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento de un cáncer en un paciente, comprendiendo dicha composición una cantidad clínicamente eficaz de la proteína de fusión de arginina desiminasa de unión a albúmina según la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 8, en la que la composición presenta un pH en un intervalo de 5.5 a 9.5.
10. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 8, en la que la composición presenta un pH de 7.4.
11. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 8, en la que la composición presenta un pH de 6.5.
12. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 8, en la que el cáncer es cáncer pancreático, melanoma, leucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer nasofaríngeo, cáncer esofágico, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer cervical o cáncer cerebral.
13. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 8, en la que el cáncer es negativo para la argininosuccinato sintetasa (a Ss ).
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