ES2965372T3 - Variantes de L-asparaginasa de cobaya truncada y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Se describen variantes de L-asparaginasas de cobaya que están truncadas y humanizadas como proteínas de fusión que contienen la L-asparaginasa y el uso de las L-asparaginasas en el tratamiento de cánceres tales como leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide aguda. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de L-asparaginasa de cobaya truncada y métodos de uso

Antecedentes

Ciertos cánceres, tales como la leucemia linfoblástica aguda (ALL), dependen de la eliminación de Asn de la sangre, un factor atribuido más comúnmente a la falta/baja expresión de asparagina sintetasa en tales cánceres. Por consiguiente, las L-asparaginasas se han identificado como componentes críticos en el tratamiento de estos cánceres. Todas las L-asparaginasas comercialmente disponibles tienen actividades duales. La predominante, la actividad de L-asparaginasa, hidroliza el aminoácido L-asparagina (Asn) en ácido L-aspártico (Asp) y amoniaco. La actividad secundaria es una actividad de L-glutaminasa, que hidroliza L-glutamina (Gln) a ácido L-glutámico (Glu) y amoniaco. Para las enzimas aprobadas por la FDA, p. ej., ELSPAR® (enzima obtenida deEscherichia coli)y ERWINAZE® (enzima obtenida deErwinia chrysanthemi),la actividad de L-glutaminasa varía de 2 a 10% de la actividad de L-asparaginasa primaria. Aunque se acepta la importancia de la actividad de L-asparaginasa de estos fármacos, hay informes contradictorios en cuanto a la importancia de la actividad de L-glutaminasa en la destrucción de células leucémicas. Además, la actividad de L-glutaminasa se ha asociado con gran parte de la toxicidad clínica de las L-asparaginasas. De hecho, los efectos secundarios tóxicos del tratamiento con L-asparaginasa limitan gravemente el uso de este fármaco anticanceroso.

Otra desventaja para el uso de enzimas bacterianas como productos terapéuticos es su inmunogenicidad, que puede suponer una amenaza directa para el paciente debido a reacciones de hipersensibilidad, hasta choque anafiláctico. Además, los anticuerpos generados pueden inactivar y eliminar el fármaco enzimático, reduciendo así o incluso eliminando su eficacia. Se han desarrollado métodos para reducir estos efectos secundarios graves, tales como la conjugación de la enzima deE. colicon polietilenglicol (PEGilación) o la desinmunización por mutación de los restos 115, 118, 120, 123, 215, 219, 307 y 312 de la enzima de E.colide tipo natural (publicación internacional WO 2012/075173 A2). Sin embargo, se necesitan preparaciones de L-asparaginasa alternativas con inmunogenicidad reducida y actividad de L-glutaminasa reducida.

Se ha purificado y ha caracterizado una L-asparaginasa de cobaya a partir de suero de cobaya (Zhang, et al. (1995)Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol.112(4):607-12). La enzima de cobaya, anotada como H0W0T5_CAVPO, presenta actividad antitumoral, tiene un valor de Km bajo para la asparagina y carece de actividad de L-glutaminasa (Schalk, et al. (2014)J. Biol. Chem.289:33175-33186). Véanse también los documentos EP 0726313 B1 y US 6,537,547.

Otros enfoques para tratar el cáncer usando L-asparaginasa han incluido la administración conjunta de la L-asparaginasa con un agonista del ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) o agonista del receptor de TRAIL, p. ej., tres dominios de TRAIL solubles y un dominio funcional adicional tal como un fragmento de anticuerpo. Véanse los documentos US 2015/0337027; US 2009/0131317 y WO 2012/170640. A este respecto, se ha mostrado que la L-asparaginasa supera la resistencia tanto a la apoptosis intrínseca inducida por el inhibidor de Bcl-2/Bcl-xL, ABT263, como a la apoptosis extrínseca mediada por TRAIL en células de glioma que son resistentes al tratamiento único con L-asparaginasa (Karpel-Massler, et al. (2016)Oncotarget7(23):33512-28).

El documento EP0811687 A2 describe polipéptidos que se originan en mamíferos, que tienen actividad de L-asparaginasa. Los polipéptidos se preparan aplicando técnicas de ADN recombinante a los ADN que codifican los polipéptidos y ejercen efectos satisfactorios en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades causadas por células tumorales dependientes de L-asparagina, y no causan efectos secundarios graves sustanciales incluso cuando se administran a seres humanos en dosis relativamente altas.

El documento JP H1057080 A describe un polipéptido de mamífero que tiene actividad de L-asparaginasa. El polipéptido es útil para tratar y prevenir enfermedades, p. ej., tumores malignos tales como leucemia y linfoma causados por células tumorales dependientes de L-asparagina, etc. El polipéptido se obtiene preparando una biblioteca de ADNc a partir de un ARN con poli(A) añadido, purificado de un hígado de cobaya como material por el método convencional, cribando la biblioteca con una sonda sintetizada químicamente basada en la secuencia de aminoácidos parcial de L-asparaginasa, insertando el gen de L-asparaginasa obtenido en un vector y expresando posteriormente el gen en células hospedantes.

Compendio de la invención

Esta invención proporciona una variante de L-asparaginasa de cobaya (GpA) truncada en el extremo C-terminal que comparte al menos un 85% de identidad de secuencia con los restos 1 a 359 de la SEQ ID NO: 1,

en donde la al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 es H10R, Q23R, K25E, K48E, Q52R, Q54R, P57S, D58E, H59D, A60T, A62V, D91A, D92E, K98Q, E101K, Q108H, S121F, G122A, H134Q, R147H, K193R, C198A, C198S, C198V, D217E, N233S, H236Q, S250A, Q288E, R301Q, E344D, L360P, T362S, A363V, D364E, L365E, H366R, Q367R o S368P, o una combinación de las mismas;

y/o

en donde la al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 comprende:

(a) un resto cisteína en la posición 49, 52, 225, 257, 281 o 340, o una combinación de los mismos; o

(b) un resto lisina en la posición 7, 53, 54, 57, 58, 98, 106, 233, 250, 257, 281, 311 o 340, o una combinación de los mismos;

Y en donde el truncamiento C-terminal está en una posición entre 359 y 396 de la SEQ ID NO: 1.

Idealmente, la variante tiene una actividad catalítica igual o mayor que GpA de tipo natural. Opcionalmente, la variante de GpA truncada puede incluir además un marcador de histidina, un marcador SUMO, un dominio de unión a albúmina, tres dominios solubles en tándem de TRAIL (p. ej., restos 115-281 de TRAIL humano), o una combinación de los mismos.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico, vectores de expresión, células hospedantes y composiciones farmacéuticas que contienen la variante de GpA truncada o proteínas de fusión, como son variantes de GpA truncadas o proteínas de fusión para usar en métodos de tratamiento de cáncer, en donde los métodos comprenden administrar a un sujeto que necesite tratamiento una cantidad efectiva de la variante de GpA truncada o proteínas de fusión, opcionalmente en combinación con una forma estable de TRAIL. Métodos de tratamiento que no forman parte de la invención

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una representación esquemática de los clones obtenidos a partir del procedimiento de barajado de ADN e intercambio de dominio C-terminal. Las secuencias de hASNasa1 son los recuadros blancos, gpASNasa1 son los recuadros sombreados. Los clones aislados de la selección (n.° 63, 64, 65 y SA) o generados por intercambio C-terminal (63-hC, 64-hC, 65-hC y SA-hC) son un barajado entre las secuencias de hASNasa1 (recuadros blancos) y gpASNasa1 (recuadros sombreados).

Las Fig. 2A y 2B muestran un alineamiento de secuencias de aminoácidos de hASNasa1 (hASN), gpASNasa1 (GpA), y clones humanizados seleccionados. Los restos subrayados son restos derivados de GpA.

Descripción detallada de la invención

La L-asparaginasa es un fármaco de quimioterapia usado para tratar la leucemia linfoblástica aguda (ALL). El principal prerrequisito para la eficacia clínica de las L-asparaginasas es la Km micromolar para la asparagina para permitir el agotamiento completo de este aminoácido en la sangre. Dado que las L-asparaginasas aprobadas actualmente son de origen bacteriano, la inmunogenicidad es un reto que se mitigaría mediante una enzima humana. Sin embargo, todas las L-asparaginasas humanas tienen Km milimolares para la asparagina. Se ha identificado una L-asparaginasa de cobaya de Km baja (gpASNasa1), que comparte ~70% de identidad de aminoácidos con la L-asparaginasa 1 humana (hASNasa1). Al igual que la enzima humana, la gpASNasa1 contiene dos dominios; un dominio N-terminal de ~360 restos donde reside la actividad de L-asparaginasa, y un dominio C-terminal de ~200 restos de función desconocida. Para mejorar la semivida, se buscaron versiones más cortas pero estables de GpA. Por consiguiente, la GpA se truncó en el extremo C-terminal para identificar el fragmento más corto de GpA que retenía la actividad. Este análisis indicó que el dominio catalítico N-terminal de 359 restos de aminoácidos podría expresarse con un marcador SUMO y retener la actividad de tipo natural. Sin embargo, tras la eliminación del marcador SUMO, la proteína se volvió inestable. La extensión del truncado al resto 369 proporcionó una enzima tanto estable como activa.

Para disminuir la inmunogenicidad de la variante de GpA truncada, se adoptaron dos enfoques diferentes para humanizar la enzima: barajado de ADN y mutación basada en estructura de restos de superficie. La humanización de GpA produjo variantes que comparten aproximadamente 80% de identidad de secuencia con hASNasa1, actividad de GpA de tipo natural, un valor de Km bajo para asparagina, y sin actividad de L-glutaminasa detectable. Tras la introducción de restos cisteína o lisina y la conjugación con PEG, las variantes de GpA truncadas se mantenían, y en algunos casos, mostraron un aumento en su actividad de L-asparaginasa. Además, modificaciones tales como la adición N- o C-terminal de un marcador de histidina, marcador SUMO, y/o dominio de unión a albúmina pueden aumentar el tiempo en la circulaciónin vivoy la fusión de la variante de GpA truncada con tres dominios solubles en tándem de TRAIL puede facilitar la muerte celular tanto al proporcionar las señales necesarias para la cascada apoptótica intrínseca (L-asparaginasa) como al inducir la cascada apoptótica extrínseca (TRAIL).

Por consiguiente, esta invención proporciona variantes de GpA truncadas para su uso en el tratamiento de cánceres tales como linfomas y leucemias, que dependen de la presencia de un suministro externo de Asn. La seguridad mejorada de las L-asparaginasas presentes proporcionará beneficio a las poblaciones de pacientes actuales (p. ej., aquellos con ALL pediátrica), y uso extendido en otras poblaciones de pacientes (p. ej., ALL adulta, a Ml , y otros cánceres).

Como se conoce en la técnica, las L-asparaginasas (L-asparagina aminohidrolasa, E.C. 3.5.1.1) son amidasas que hidrolizan el enlace amida en la Asn a Asp y amoniaco (Kumar y Verma (2012)Asian J. Biochem. Pharma Res.3:197-205). La L-asparaginasa de cobaya de tipo natural(Cavia porcellus),denominada en el presente documento "gpASNasa1" o "GpA", es una proteína de 565 restos de aminoácidos disponible con el número de acceso de Uniprot H0W0T5_CAVPO y SEQ ID NO: 1. La GpA presenta actividad antitumoral, tiene un valor K<m>bajo para la asparagina y carece de actividad de L-glutaminasa. Sin embargo, la GpA de tipo natural solo comparte aproximadamente 70% de identidad de secuencia con la hASNasa1. Por consiguiente, esta invención proporciona una GpA truncada, que se humaniza para disminuir la inmunogenicidad. En particular, esta invención proporciona una variante de GpA truncada que comparte al menos 85% de identidad de secuencia con los restos 1 a 359 de la SEQ ID NO: 1.

Una "variante de GpA" se refiere a una forma no natural de GpA que presenta actividad de L-asparaginasa, tiene una K<m>baja para la Asn, y carece de actividad de L-glutaminasa. En comparación, una GpA "de tipo natural" se refiere a la forma típica de la L-asparaginasa cuando se aísla de una fuente de origen natural. Un tipo natural es aquel que se observa con mayor frecuencia en una población natural y, por lo tanto, se designa arbitrariamente como la forma normal o tipo natural. La GpA de tipo natural tiene una velocidad de reacción (k<cat>) de aproximadamente 39 s<_1>y K<m>para la Asn de 58 pM (Schalk, et al. (2014)J. Biol. Chem.289:33175-33186). Una variante de GpA truncada de esta invención típicamente presenta una k<cat>de al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de la enzima GpA de tipo natural y presenta una K<m>para la Asn de menos de 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 80 pM o 60 pM.

Como mínimo, una variante de GpA está truncada. "GpA truncada" se refiere a una GpA en donde se han eliminado todos o una parte de los aproximadamente 206 restos de aminoácidos C-terminales. En ciertas realizaciones, una proteína GpA truncada retiene el dominio catalítico de 359 restos de aminoácidos N-terminales. Idealmente, la GpA de longitud completa (SEQ ID NO: 1) está truncada en el extremo C-terminal en una posición entre el resto 359 y 396. En particular, la GpA de longitud completa (SEQ ID NO: 1) está truncada en el extremo C-terminal en la posición 359, 367, 369, 374, 384, 392 o 396. En ciertas realizaciones, una variante de GpA truncada está truncada en el extremo C-terminal en la posición 369. Las variantes de GpA truncadas de ejemplo se proporcionan en las SEQ ID NO: 3 (GpA359), SEQ ID NO: 4 (GpA367), SEQ ID NO: 5 (GpA369), SEQ ID NO: 6 (GpA374), SEQ ID NO: 7 (GpA384), SEQ ID NO: 8 (GpA392) y SEQ ID NO: 9 (GpA396). En algunas realizaciones, una variante de GpA truncada en el extremo C-terminal comprende o consiste en la SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, una variante de GpA truncada en el extremo C-terminal comprende o consiste en la SEQ ID NO: 5.

De acuerdo con otros aspectos de esta invención, una variante de GpA está truncada e incluye al menos una sustitución o modificación de aminoácidos (p. ej., PEGilación) que aumenta la estabilidad, aumenta la identidad de secuencia con la hASNasa1, y/o aumenta el tiempo en la circulaciónin vivode la GpA en comparación con una enzima de GpA de tipo natural. Como se demuestra en el presente documento, los restos de aminoácidos localizados en la superficie de la GpA se mutaron para humanizar la GpA y opcionalmente para proporcionar un sitio adecuado para PEGilación. Además, la fusión de GpA con marcadores de proteína o TRAIL trimérico proporciona estabilidad y/o actividad de destrucción de células tumorales mejorada.

Por consiguiente, una variante de GpA tiene al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la GpA de tipo natural (SEQ ID NO: 1). En realizaciones particulares, el resto de aminoácido que se sustituye es un resto de superficie. La expresión "resto de superficie" se refiere a un resto localizado en una superficie de una proteína. Por el contrario, un resto enterrado es un resto que no se localiza en la superficie de una proteína. Un resto de superficie normalmente incluye una cadena lateral hidrofílica. Operacionalmente, un resto de superficie puede identificarse computacionalmente a partir de un modelo estructural de una proteína como un resto que entra en contacto con una esfera de hidratación por encima de la superficie de la estructura molecular. Un resto de superficie también puede identificarse experimentalmente por medio del uso de estudios de intercambio de deuterio, o accesibilidad a varios reactivos de marcado tales como, p. ej., agentes alquilantes hidrófilos. Como se indica en el presente documento, la GpA369 truncada comparte aproximadamente 72% de identidad de secuencia con los 371 restos de aminoácidos N-terminales de hASNasa1. Idealmente, la al menos una sustitución de aminoácido de GpA genera una variante de GpA con identidad de secuencia de aminoácidos mayor con hASNasa1 en comparación con la GpA de tipo natural. Por consiguiente, esta invención proporciona la humanización de GpA. De acuerdo con este aspecto de la invención, la variante de GpA truncada comparte al menos 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la GpA truncada de tipo natural.

La humanización de GpA truncada se logra reemplazando uno o más restos de superficie de la GpA de tipo natural por los restos de superficie correspondientes de la hASNasal. En particular, la humanización de la GpA truncada se logra reemplazando el resto de GpA de tipo natural H10, Q23, K25, K48, Q52, Q54, D91,<d>92, K98, E101, Q108, S121, G122, H134, R147, K193, D217, N233, H236, S250, Q288, R301, E344, L360, T362, A363, L365, H366, Q367 o S368 o cualquier combinación de los mismos, por el resto de superficie correspondiente de la hASNasa1. Específicamente, la humanización de la GpA truncada se logra haciendo una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: H10R, Q23R, K25<e>, K48E, Q52R, Q54R, D91A, D92E, K98Q, E101K, Q108H, S121F, G122A, H134Q, R147H, K193R, D217E, N233S, H236Q, S250A, Q288E, R301Q, E344D, L360P, T362S, A363V, L365E, H366R, Q367R y/o S368P en la GpA de tipo natural. Las variantes de GpA truncadas y humanizadas de ejemplo se proporcionan en la SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 86.

Se ha demostrado que la PEGilación de L-asparaginasas aumenta el tiempo en circulaciónin vivo.El término "PEGilado" o "PEGilación" se refiere a la conjugación de una L-asparaginasa con polietilenglicol (PEG). "PEG" o "polietilenglicol" se refiere a cualquier poli(etilenglicol) o poli(óxido de etileno) soluble en agua. La expresión PEG comprende así la estructura (CH<2>CH<2>O)<n>, en la que n es un número entero de 2 a aproximadamente 1000. Un PEG comúnmente utilizado es el PEG protegido terminalmente, en donde un extremo de los extremos del PEG está protegido terminalmente con un grupo relativamente inactivo tal como alcoxi, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo que puede modificarse adicionalmente mediante restos enlazadores. En una realización, el grupo de protección es metoxi y el PEG protegido terminalmente correspondiente se indica mPEG. Por lo tanto, mPEG es CH<3>O(CH<2>CH<2>O)<n>, en donde n es un número entero de 2 a aproximadamente 1000. En otra realización, el grupo de protección es hidroxilo y el PEG protegido terminalmente correspondiente es hidroxiPEG. "PEG" seguido de un número (que no es un subíndice) indica un resto de PEG con el peso molecular aproximado igual al número multiplicado por 1000. Por lo tanto, "PEG40" o "PEG40K" es un resto de PEG que tiene un peso molecular aproximado de 40 kDa. Ejemplos de métodos que se pueden usar para determinar el peso molecular de PEG incluyen, sin limitación, espectrometría de masas, tal como, por ejemplo, TOF-MS. El PEG puede ser proporcionado, por ejemplo, por NOF Corporation, Tokio, Japón; Creative p EG-works, Winston Salem, NC; y Nanocs, Boston, MA.

En una realización, el resto de PEG puede unirse por sustitución nucleofílica (acilación) en grupos alfa-amino N-terminales o en resto(s) lisina en las posiciones gamma, p. ej., con ésteres activados por OSu. En otra realización, el resto de PEG puede unirse por alquilación reductora en grupos amino presentes en la proteína GpA usando reactivos de PEG-aldehído y un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio. En otra realización, el resto de PEG puede unirse a la cadena lateral de un resto cisteína no emparejado en una reacción de adición de Michael usando, por ejemplo, reactivos de maleimida de PEG. Otros métodos de PEGilación incluyen, pero no se limitan a, PEGilación puente, PEGilación de transglutaminasa, glicoPEGilación, PEGilación usando ingeniería genética, PEGilación de enlazadores liberables. Para una revisión de los métodos de PEGilación, véase Pasut y Veronese (2012)J. Contr. Rel.161:461-472; y Roberts, et al. (2012)Adv. Drug Deliv. Rev.64:116-127. En una realización, los restos de PEG se unen a la(s) cadena(s) lateral(es) de resto(s) de lisina o cisteína.

"Enlazador" se refiere a un resto químico que conecta un grupo -HN- de la proteína GpA con el grupo -O- de un resto de PEG. En una realización preferida, el enlazador no tiene ninguna influencia adversa en la actividad de GpA. El enlazador es típicamente un derivado de un ácido carboxílico, en donde la funcionalidad de ácido carboxílico se usa para la unión a la proteína GpA a través de un enlace amida. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, un resto de ácido acético con el motivo de enlace: CH<2>CO, un resto de ácido propiónico con el motivo de enlace: CH<2>CH<2>CO o CHCH<3>CO, un resto de ácido butírico con el motivo de enlace: CH<2>CH<2>CH<2>CO o CH<2>CHCH<3>CO, un grupo CO, derivados de N-(aminocarbonil)succinimida (tales como, por ejemplo, N-(N-propilpropanamida)succinimida, N-(N-propilhexanamida)succinimida y N-(N-etilpropanamida)succinimida), ácido pentanoico ((CH<2>)<5>CO), ácido a-metilbutanoico (CH<2>CH<2>CH(CH<3>)CO), ácido succínico (CO(CH<2>)<2>CO), ácido glutárico (CO(CH<2>)<3>CO), derivados de succinamida (tales como, por ejemplo, (CH2)2NHc O(CH2)2c O), derivados de glutaramida (tales como, por ejemplo, (CH<2>)<3>NHCO(CH<2>)<3>CO y (CH<2>)<2>NHCO(CH<2>)<3>CO). Las moléculas de PEG de ejemplo de uso en esta descripción incluyen, pero no se limitan a, carbonato de metoxi-PEG-succinimidilo (mPEG-SC), éster de succinimidilo de carboximetil-mPEG (mPEG-SCM) y éster de succinimidilo de mPEG-succinamida (mPEG-SAS).

Los métodos de PEGilación que se pueden usar para PEGilar una L-asparaginasa de la descripción se proporcionan, por ejemplo, en los documentos US 4,179,337, US 5,766,897, US 2002/0065397 y US 2009/0054590. Idealmente, se produce una variante de GpA PEGilada haciendo reaccionar PEG con una variante de GpA truncada en una relación de PEG:GpA de aproximadamente 20:1 a 100:1, o más particularmente de 20:1 a 50:1, o lo más particularmente 20:1, dependiendo del tamaño de PEG. En algunos aspectos, la variante de GpA tiene al menos un resto de cisteína, el PEG es un PEG-maleimida, la reacción se lleva a cabo en ausencia de glicina o ácido aspártico, y el producto de reacción se trata con betamercaptoetanol. En otros aspectos, la variante de GpA tiene al menos un resto de lisina, el PEG es mPEG-SC, mPEG-SCM o mPEG-SAS, y la reacción se lleva a cabo en ausencia de DTT y glicerol.

Como se describe en el presente documento, una L-asparaginasa puede PEGilarse por PEGilación específica del sitio en 1 a 6 restos de cisteína o 10 a 30 de lisina introducidos en la secuencia de aminoácidos de la L-asparaginasa por sustitución de aminoácidos. Véanse los ejemplos 4 y 5. En particular, la GpA truncada, o una GpA humanizada y truncada se puede PEGilar mediante la introducción de: (a) un resto de cisteína en la posición 49, 52, 225, 257, 281 y/o 340; y/o (b) un resto de lisina en la posición 7, 53, 54, 57, 58, 98, 106, 233, 250, 257, 281,311 y/o 340. Además de la introducción de restos de cisteína o lisina en ubicaciones específicas, los restos endógenos de cisteína o lisina pueden estar mutados (es decir, sustituidos por otro resto) para distribuir más uniformemente los sitios de PEGilación a lo largo de la longitud de la proteína. A este respecto, ciertas realizaciones incluyen reemplazar el resto Cys198 por Ala, Val o Ser y/o reemplazar el resto Lys223 por Asp. En una realización, la Cys198 se reemplaza por Ala y el derivado de L-asparaginasa se PEGila en la Cys79. En otras realizaciones, la Cys198 se reemplaza por Ala y uno o más de los restos de aminoácidos en las posiciones 49, 225 y 340 se reemplazan por cisteína. Las variantes de GpA truncadas de ejemplo adecuadas para PEGilación se proporcionan en la SEQ ID NO: 51 (GpA369-C198A), SEQ ID NO: 52 (GpA369-C198S), SEQ ID NO: 53 (GpA369-C198V), SEQ ID NO: 54 (GpA369-C198A+K225C), SEQ ID NO: 55 (GpA369-C198A+K225C+E340C), SEQ ID NO: 56 (GpA369-C198A+K225C+E340C+E49C), SEQ ID NO: 57 (GpA369-C198A+K225C+E340C+E49C+Q257C), SEQ ID NO: 58 (GpA369(hum)-Grupo1+2+3-C198A), SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 86.

Para aumentar el tiempo en la circulaciónin vivode la GpA truncada, esta invención también proporciona las variantes, en particular variantes de GpA truncada, que tienen un marcador de histidina (His), un marcador de SUMO (SUMO), un dominio de unión a albúmina (ABD), o una combinación de los mismos. La variante de GpA truncada puede incluir el marcador de histidina, el marcador de SUMO y/o un dominio de unión a albúmina en su extremo C, extremo N, y/o una ubicación interna dentro de la secuencia de GpA. Idealmente, cuando se inserta un marcador de His, un marcador SUMO o ABD dentro de la secuencia de GpA (es decir, no en el extremo N o C), la inserción es en uno o más bucles flexibles de la proteína GpA. A modo de ilustración, la variante de GpA truncada puede tener la estructura de N a C-terminal de SUMO-Asparaginasa-ABD, His-SUMO-ABD-Asparaginasa, His-SUMO-Asparaginasa-ABD, His-SUMO-Asparaginasa, His-ABD-Asparaginasa, ABD-Asparaginasa, ABD-SUMO-Asparaginasa, Asparaginasa1'225-ABD-Asparaginasa226'369, Asparaginasa1 340-ABD-asparaginasa341'369 y similares. Los ácidos nucleicos que codifican His, SUMO o ABD pueden insertarse en el marco ya sea 5' o 3' de los ácidos nucleicos que codifican la variante de GpA truncada creando así una proteína de fusión.

Idealmente, la inclusión de uno o más de un marcador de histidina, un marcador SUMO, un dominio de unión a albúmina, o una combinación de los mismos puede aumentar significativamente el tiempo en la circulaciónin vivode una L-asparaginasa. Expuesto de forma alternativa, la variante tiene una t1^ más larga que la L-asparaginasa de tipo natural administrada con una dosis de proteína equivalente. Tal como se usa en el presente documento, el término "t1^ " o "semivida" se refiere al tiempo que se requeriría para que la concentración de una variante de GpA truncada o proteína de fusión de la misma disminuyera a la mitadin vitrooin vivo,por ejemplo, después de la inyección en un mamífero. Dado que la eficacia de las L-asparaginasas está relacionada con la semividain vivodel fármaco, las variantes de GpA truncadas de esta invención son particularmente útiles en el tratamiento de cánceres, tales como leucemias y linfomas.

Como se usa en el presente documento, un "marcador de histidina" se refiere a un motivo de aminoácidos compuesto de al menos un resto de histidina (His) y preferiblemente al menos 6 restos de His. El marcador de histidina incluye una polihistidina de 6 (marcador de hexahistidina, marcador 6xHis o marcador His6), 7, 8, 9, 10 o hasta 20 restos de histidina.

Un "marcador SUMO" se refiere a la fusión de una proteína SUMO (modificador relacionado con ubiquitina pequeña) con una proteína de interés para mejorar la solubilidad/estabilidad de la proteína de interés. La inclusión de un marcador SUMO puede conseguirse usando sistemas de expresión conocidos tales como el sistema de expresión CHAMPION pET SUMO (Invitrogen), el sistema de clonación y expresión EXPRESSO T7 SUMO (Lucigen), o vector de clonación pET His6 SUMO TEV LIC (Addgene). Además del marcador SUMO, está contemplado que se puedan usar otras proteínas Ubl incluyendo, pero no limitadas a, Ub, Rub1, Hub1, ISG15, Ubi-L (MNSF), FAT10, Apg12, Apg8 y Urm1 (Larsen y Wang (2002)J. Proteome Res.1 (5):411-9). Véase también el documento US 7,655,413. Los marcadores SUMO de ejemplo se exponen en la SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70.

Un "dominio de unión a albúmina" o "ABD" se refiere a un polipéptido que se une a albúminain vivooin vitroy mejora la semivida en suero y la biodistribución de un agente terapéutico. La albúmina puede derivar de cualquier especie animal, por ejemplo ser humano, mono o roedor. Los dominios de unión a albúmina se describen, por ejemplo, en los documentos US 6,267,964, WO 1991/19741, WO 2005/097202, WO 2001/45746, WO 2013/043071 y US 2004/0001827. Además, el documento US 9,156,887 describe dominios de unión a albúmina no naturales, que pueden usarse en esta descripción. En algunas realizaciones, el dominio de unión a albúmina tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 73.

La actividad citotóxica mejorada de las variantes de GpA truncadas descritas en el presente documento se puede lograr conjugando o fusionando la GpA con tres dominios solubles en tándem de TRAIL o coadministrando la GpA con una forma estable de TRAIL. La proteína de fusión resultante puede proporcionar al menos una disminución de 20, 25, 30, 35 o 40 veces en el valor de IC<50>en comparación con una variante de GpA truncada que carece de los tres dominios solubles en tándem de TRAIL. Por consiguiente, una variante de GpA truncada fusionada con tres dominios solubles en tándem de TRAIL es particularmente útil en el tratamiento del cáncer, en particular, cánceres insensibles a L-asparaginasa.

Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que contiene proteínas o fragmentos de proteína (p. ej., variantes de GpA) unidos operativamente de una manera no nativa. De acuerdo con la proteína de fusión de esta invención, tres dominios solubles en tándem de TRAIL (TRAIL<trímero>) se fusionan, en el marco, con una variante de GpA truncada. Idealmente, se inserta un resto de glicina o serina entre cada repetición de TRAIL para facilitar el plegado del trímero de TRAIL (véase, p. ej., la SEQ ID NO: 87 y SEQ iD NO: 88). Opcionalmente, el trímero de TRAIL y los componentes de asparaginasa pueden separarse mediante un enlazador como se expone en la SEQ iD NO: 81, Se Q ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84. La proteína de fusión puede incluir el trímero de TRAIL fusionado con el extremo C ( GpA-TRAIL<trímero>; p. ej., SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90) o extremo N (TRAIL<trímero>-GpA; p. ej., SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92) de GpA, donde el componente GpA puede ser cualquiera de las variantes descritas anteriormente. Cuando se usa además en combinación con un marcador o modificación, la proteína de fusión puede tener la estructura de: SUMO-TRAIL<trímero>-GpA-ABD, His-SUMO-ABD-TRAIL<trímero>-GpA, His-SUMO-TRAIL<trímero>-GpA-ABD, His-SUMO-GpA-TRAIL<trímero>, His-ABD-TRAIL<trímero>-GpA, ABD-GpA-TRAIL<trímero>, ABD-SUMO-TRAIL<trímero>-GpA, y similares Además de insertarse en el extremo N o C, el péptido ABD puede injertarse en uno o más bucles flexibles de variantes de GpA. En un ejemplo, el bucle flexible abarca los restos 215 a 228. En otro ejemplo, el bucle flexible abarca los restos 337 a 342 de GpA. Véase, p. ej., SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 95. Los ácidos nucleicos que codifican TRAIL en particular TRAIL<trímero>se pueden insertar en el marco ya sea 5' o 3' de los ácidos nucleicos que codifican la L-asparaginasa, creando así la proteína de fusión.

Preferiblemente, los dominios solubles de TRAIL se derivan de un mamífero, particularmente TRAIL humano que incluye variantes alélicas y/o derivados de los mismos. Los dominios solubles incluyen la porción extracelular de TRAIL que incluye el dominio de unión al receptor sin dominios localizados en la membrana. Al igual que otras proteínas de la superfamilia de TNF, TRAIL se ancla a la membrana a través de una porción N-terminal de 15-30 aminoácidos, la llamada región de tallo. La región de tallo contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular. Sin embargo, la región de tallo no es parte del dominio de unión al receptor (RBD). Por consiguiente, se prefiere que los dominios de TRAIL solubles incluyan el dominio de unión al receptor del TRAIL que carece de cualquier aminoácido de la región del tallo (véase el documento US 2015/0337027).

El dominio de TRAIL soluble puede derivarse de TRAIL humano. Preferiblemente, los dominios de TRAIL solubles se derivan de TRAIL humano, particularmente empezando a partir de los restos de aminoácidos 115 122, e incluyen los restos de aminoácidos 115-281, 120-281, 121-281 o 122-281 de TRAIL humano. En ciertas realizaciones, cada uno de los dominios solubles del TRAIL<trímero>está compuesto por los restos 115-281 de TRAIL humano. Los restos 115-281 de TRAIL humano se exponen en la presente memoria en la SEQ ID NO: 80. Para facilitar el correcto plegado, se puede insertar un resto de glicina o serina entre cada repetición de TRAIL. Véase, p. ej., SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88.

Están contemplados todos los derivados y variantes de los dominios de TRAIL de unión al receptor de muerte y se pueden hacer alterando sus secuencias de aminoácidos por sustituciones, adiciones y/o deleciones/truncamientos o introduciendo modificaciones químicas que dan como resultado polipéptidos funcionalmente equivalentes. Un experto en la técnica comprenderá que ciertos aminoácidos en una secuencia de cualquier polipéptido pueden sustituirse por otros aminoácidos sin afectar adversamente a la actividad de los polipéptidos.

Los dominios de TRAIL descritos en el presente documento incluyen sustituciones de uno o más de los aminoácidos en las secuencias descritas. Un experto en la técnica podrá determinar usando técnicas bien conocidas variantes de secuencia adecuadas de los péptidos expuestos en el presente documento. En ciertas realizaciones, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad, dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En otras realizaciones, el experto en la técnica puede identificar restos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En realizaciones adicionales, incluso los restos de aminoácidos importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden estar sujetos a sustituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir la actividad biológica de las mismas o sin afectar adversamente a la estructura peptídica.

Los tres dominios solubles de TRAIL están preferiblemente unidos entre sí a través de un grupo de unión peptídico compuesto por uno a ocho restos de aminoácidos. Del mismo modo, es preferible que TRAIL<trímero>se una a la L-asparaginasa a través de un grupo de unión peptídico compuesto por uno a veinte restos de aminoácidos. La expresión "grupo de unión peptídico" o "enlazador" pretende referirse a un resto peptídico que actúa como un puente molecular para unir operativamente dos moléculas diferentes entre sí. Deseablemente, los enlazadores de esta descripción están compuestos de glicina o serina, o una combinación de las mismas. En realizaciones particulares, cada uno de los dominios solubles de TRAIL<trímero>están preferiblemente unidos entre sí por un solo resto de glicina o uno solo de serina. Un TRAIL<trímero>de ejemplo incluye un solo resto de serina entre los tres dominios de TRAIL solubles (SEQ ID NO: 88). Con respecto al grupo de unión peptídico localizado entre el TRAIL<trímero>y la L-asparaginasa, es deseable que este enlazador sea un enlazador flexible. El enlazador flexible preferiblemente tiene una longitud de uno a 20 restos de aminoácidos, particularmente una longitud de 6, 9, 12, 15 o 18 restos de aminoácidos. El enlazador flexible es preferiblemente un enlazador de glicina/serina, es decir, un enlazador peptídico compuesto principalmente de los aminoácidos glicina y serina. En una realización particular, el enlazador entre el TRAIL<trímero>y la L-asparaginasa es un enlazador (GGGS)<n>(SEQ ID NO: 81), en donde n es de 1 a 4, o una permutación del mismo que incluye, p. ej., GGGS(GGGGS)<n>(SEQ ID NO: 82), en el presente documento n es de 1 a 4. En ciertas realizaciones, el enlazador entre el TRAIL<trímero>y la L-asparaginasa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 83. En otras realizaciones, el enlazador entre el TRAIL<trímero>y la L-asparaginasa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84. Un ejemplo de una proteína de fusión de TRAIL<trímero>-variante de GpA tiene un TRAIL<trímero>N-terminal que incluye un único resto de glicina o serina entre los tres dominios de TRAIL solubles y un enlazador de glicina/serina entre el TRAIL<trímero>y la variante de GpA truncada. Véase, p. ej., SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92.

Una forma estable de TRAIL pretende referirse a una forma de TRAIL que promueve la trimerización. En particular, para promover la trimerización de TRAIL, se ha demostrado que la secuencia FOLDON (GYIPEA<p>R<d>GQAYVRKDGEWVLLSTFL; SEQ ID NO: 85), un dominio de trimerización pequeño, mantiene la estabilidad de TRAIL y la actividad biológica a 37°C durante al menos 48 horas (Kouno, et al. (2013)J. Invest. Dermatol.133(9):2212-2220). Por consiguiente, el péptido FOLDON se insertó entre un marcador His-SUMO y el extremo N de TRAIL para dar como resultado una proteína de fusión His-SUMO-FOLDON-TRAIL. Se expresó la proteína de fusión y se obtuvo un rendimiento > 10 mg/l de la proteína de fusión en el cultivo bacteriano. La proteína era muy estable, mostrando que la inclusión de FOLDON da como resultado una forma estable de TRAIL. Por consiguiente, una forma estable de TRAIL puede coadministrarse y/o combinarse en una composición farmacéutica con una variante de GpA truncada para mejorar la actividad citotóxica de la GpA.

Las variantes de GpA truncadas y las proteínas de fusión descritas en el presente documento se pueden preparar fácilmente mediante técnicas de proteínas recombinantes convencionales, en donde las células hospedantes recombinantes se transforman o transducen con una construcción o vector de expresión que alberga una molécula de ácido nucleico que codifica la variante o la proteína de fusión, las células hospedantes recombinantes se cultivan en condiciones adecuadas para proporcionar la expresión de la variante o la proteína de fusión, y la variante o la proteína de fusión se aísla posteriormente y opcionalmente se purifica. Por consiguiente, esta descripción también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de GpA truncada o una proteína de fusión de la misma, así como un casete de expresión y/o vector de expresión que lo contiene. Idealmente, el casete de expresión y el vector de expresión contienen las secuencias reguladoras necesarias (p. ej., promotor, terminador y similares) para facilitar la expresión en la célula hospedante de interés. Las células hospedantes que incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de GpA truncada o proteína de fusión también se incluyen dentro del alcance de esta invención. Las células hospedantes pueden incluir células eucariotas (p. ej., células de mamífero, fúngicas o de levadura) o células procariotas (p. ej.,E. coli).

Una vez producida y aislada/purificada, la variante de GpA truncada y/o la proteína de fusión de la invención se pueden usar tal cual o formular en una composición farmacéutica que contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden formularse especialmente para administración intravenosa en forma sólida o líquida o para inyección intravenosa. Las composiciones farmacéuticas óptimas las puede determinar un experto en la técnica dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración prevista, el formato de suministro y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (19.a edición, 1995).

La variante de GpA truncada y/o la proteína de fusión se pueden incorporar en una forma farmacéutica sistémica convencional, tal como una formulación inyectable. Las formas farmacéuticas también pueden incluir el material vehículo fisiológicamente aceptable necesario, excipiente, lubricante, tampón, tensioactivo, antibacteriano, agente de carga (tal como manitol), antioxidantes (ácido ascórbico o bisulfito de sodio) y similares.

El vehículo o excipiente primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o excipiente adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, complementados posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral. La solución salina neutra tamponada o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos de ejemplo adicionales. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5; o tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5; que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado de este. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada con el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences,ib.)en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, la variante de GpA truncada o la proteína de fusión de la invención se pueden formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa o glicina.

Las rutas de administración para la variante de GpA truncada, la proteína de fusión o las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen la inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. Las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de forma continua por perfusión, o mediante un dispositivo de implantación. La composición también puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación programada o administración continua.

Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía parenteral. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para usar en esta descripción pueden estar en la forma de una solución acuosa exenta de pirógenos, parenteralmente aceptable, que comprende el compuesto deseado identificado en un método de cribado de la descripción en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula el compuesto identificado en un método de cribado de la descripción como una solución isotónica estéril, apropiadamente conservada. La preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto, que luego se pueden suministrar mediante una inyección de liberación retardada. La formulación con ácido hialurónico tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Los dispositivos de suministro de fármacos implantables pueden usarse para introducir la molécula deseada.

Las composiciones también se pueden formular para inhalación. En estas realizaciones, la variante truncada de GpA o la proteína de fusión se formula como un polvo seco para inhalación, o las soluciones de inhalación también se pueden formular con un propulsor para suministro en aerosol, tal como por nebulización. La administración pulmonar se describe adicionalmente en el documento WO 1994/020069, que describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente.

Las composiciones de la invención se pueden administrar a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia en la técnica. La variante truncada de GpA o proteína de fusión de la invención que se administra de esta manera puede formularse con o sin aquellos vehículos usados habitualmente en la composición de formas farmacéuticas sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Una cápsula puede ser diseñada para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación presistémica se minimiza. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de los péptidos de la invención descritos en el presente documento. También se pueden emplear diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes.

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

La variante de GpA truncada y/o la proteína de fusión de la invención encuentran un uso particular en el tratamiento de una enfermedad o afección tratable por agotamiento de la asparagina. Por consiguiente, esta invención también proporciona la variante de GpA truncada para su uso en métodos para tratar una enfermedad, en particular cáncer, en donde los métodos comprenden la administración a un sujeto que necesita tratamiento y una cantidad eficaz de una variante de GpA truncada o proteína de fusión. Una "cantidad eficaz" se usa en el presente documento para referirse a una cantidad de un ingrediente activo suficiente para lograr el propósito pretendido de (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos del trastorno o trastornos que se están tratando; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos del trastorno o trastornos que se están tratando; (d) limitar o prevenir la recurrencia del trastorno o trastornos en pacientes que han tenido previamente el trastorno o trastornos; (e) limitar o prevenir la recurrencia de los síntomas en pacientes que fueron sintomáticos previamente para el trastorno o trastornos; (f) reducción de la mortalidad después de la aparición de una enfermedad o un trastorno; (g) curación; y (h) profilaxis de una enfermedad. La cantidad eficaz en cada caso individual puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica de acuerdo con los métodos establecidos en la técnica. Como se usa en el contexto de la descripción, "administrar" incluye la administraciónin vivoa un individuo así como la administración directamente a células o tejidosin vitrooex vivo.Una cantidad eficaz de una variante de GpA truncada o proteína de fusión es generalmente la que puede inducir la apoptosis y reducir la L-asparagina en la circulación en células cancerosas o un tumor del sujeto. Un médico puede valorar la dosis o vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.

En ciertas realizaciones, la variante de GpA truncada o proteína de fusión es útil en el tratamiento o la fabricación de un medicamento para usar en el tratamiento de cánceres tales como leucemia linfoblástica aguda (ALL) tanto en adultos como en niños, así como otras afecciones donde se espera que el agotamiento de la asparagina tenga un efecto útil. Tales afecciones incluyen, pero no se limitan a, neoplasias malignas o cánceres, incluyendo, pero no limitado a, neoplasias malignas hematológicas, linfoma no Hodgkin, linfoma NK, cáncer pancreático, cáncer de ovario, enfermedad de Hodgkin, leucemia mielógena aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfosarcoma, reticulosarcoma y melanosarcoma. Las enfermedades hematológicas no malignas representativas que responden al agotamiento de la asparagina incluyen enfermedades de la sangre mediadas por el sistema inmunitario, p. ej., enfermedades infecciosas tales como las causadas por la infección por VIH (es decir, el SIDA). Las enfermedades no hematológicas asociadas con la dependencia de asparagina incluyen enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo artritis reumatoide, SLE, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades vasculares del colágeno, SIDA, etc. Otras enfermedades autoinmunitarias incluyen osteoartritis, síndrome de Issac, psoriasis, diabetes mellitus insulinodependiente, esclerosis múltiple, panencefalitis esclerosante, lupus eritematoso sistémico, fiebre reumática, enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa, glomerulonefritis, miastenia grave, pénfigo vulgar y enfermedad de Graves. En realizaciones particulares, la variante de GpA truncada o proteína de fusión se proporciona para su uso en el tratamiento de linfoma no Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica y leucemia de células pilosas.

Se puede ensayar en las células sospechosas de provocar la enfermedad la dependencia de la asparagina en cualquier ensayo adecuadoin vitrooin vivop. ej., un ensayoin vitroen donde el medio de crecimiento carece de asparagina. Por lo tanto, en un aspecto, la invención está dirigida a la variante de GpA truncada o proteínas de fusión para usar en un método de tratamiento de una enfermedad tratable en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de variante de GpA truncada o proteína de fusión de la invención. En una realización específica, el trastorno o trastorno es ALL. En una realización particular, la variante de GpA truncada o proteína de fusión se proporciona para usar en un método de tratamiento de una enfermedad tratable por agotamiento de asparagina que incluye una variante de GpA truncada de cobaya.

La variante de GpA truncada o proteína de fusión se puede administrar con una pauta que varía de aproximadamente 3 veces por semana a aproximadamente una vez al mes, típicamente una vez por semana o una vez cada dos semanas, como un agente único (p. ej., monoterapia) o como parte de una combinación de fármacos de quimioterapia, que incluyen, pero no se limitan a glucocorticoides, corticosteroides, compuestos antineoplásicos u otros agentes, que incluyen, pero no se limitan a metotrexato, dexametasona, prednisona, prednisolona, vincristina, ciclofosfamida y antraciclina. Como un ejemplo, a los pacientes con ALL se les administrará la variante de GpA truncada o la proteína de fusión de la invención como un componente de quimioterapia de múltiples agentes durante 3 fases de quimioterapia que incluyen inducción, consolidación o intensificación, y mantenimiento. En un ejemplo específico, la variante de GpA truncada o la proteína de fusión no se administra con un inhibidor de asparagina sintetasa (p. ej., véase el documento WO 2007/103290). En otro ejemplo específico, la variante de GpA truncada o proteína de fusión no se administra con un inhibidor de asparagina sintetasa, sino que se administra con otros fármacos de quimioterapia. La variante de GpA truncada o proteína de fusión puede administrarse antes, después o simultáneamente con otros compuestos como parte de un régimen de quimioterapia de múltiples agentes.

En una realización específica, el método implica administrar una variante de GpA truncada o proteína de fusión de la invención en una cantidad de aproximadamente 1 U/kg a aproximadamente 1000 U/kg. En una realización más específica, la variante de GpA truncada o proteína de fusión se administra en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 20, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400, 500 y 600 U/kg. En otra realización específica, la variante de GpA truncada o proteína de fusión se administra en una dosis que varía de aproximadamente 1000 UI/m2 a aproximadamente 20000 UI/m2 (p. ej., 1000 UI/m2, 2000 UI/m2, 3000 UI/m2, 4000 UI/m2, 5000 UI/m2, 6000 UI/m2, 7000 UI/m2, 8000 UI/m2, 9000 UI/m2, 10000 UI/m2, 11000 UI/m2, 12000 UI/m2, 13000 UI/m2, 14000 UI/m2, 15000 UI/m2, 16000 UI/m2, 17000 UI/m2, 18000 UI/m2, 19000 UI/m2 o 20 000 UI/m2). En otra realización específica, la variante de GpA truncada o proteína de fusión se administra en una dosis que reduce la Asn a niveles indetectables durante un período de aproximadamente 3 días a aproximadamente 10 días (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días) para una dosis única. En otra realización, el método implica administrar una variante de GpA truncada o proteína de fusión de la invención que tiene una semivida en la circulaciónin vivomás larga después de una dosis única en comparación con la L-asparaginasa de tipo natural.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar más la presente invención.

Ejemplo 1: Generación de GpA truncada en el extremo C-terminal, activa

Las L-asparaginasas de mamífero tales como L-asparaginasa humana (hASNasa1; entrada en UNIPROT Q86U10; SEQ ID NO: 2) y la L-asparaginasa de cobaya (gpASNasa1 o GpA; entrada en UNIPROT H0W0T5; SEQ ID NO: 1) contienen dos dominios; un dominio N-terminal de ~360 restos donde reside la actividad de L-asparaginasa, y un dominio C-terminal de ~200 restos de función desconocida. En comparación, las L-asparaginasas bacterianas clínicamente relevantes deE. coliyErwinia chrysanthemitienen aproximadamente 350 restos de aminoácidos de longitud y no contienen dicho dominio C-terminal.

Uno de los desafíos de los productos terapéuticos biológicos inyectables proviene de las semividas cortas que dan como resultado una mala biodisponibilidad. El aclaramiento se produce principalmente por proteólisis, filtración renal o neutralización por el sistema inmunitario. Las moléculas más grandes de secuencia extraña tienen más posibilidades de ser detectadas por el sistema inmunitario y ser eliminadas rápidamente del sistema. Se esperaba que la identificación de versiones más cortas pero estables de GpA proporcionara un mejor efecto terapéutico, especialmente en el contexto donde el dominio C-terminal de la proteína de longitud completa era de función desconocida.

Para evaluar la función de los restos C-terminales de GpA, se construyeron variantes de GpA truncadas en el extremo C-terminal y se analizó su estabilidad y actividad de L-asparaginasa completa. Alineamiento de la secuencia de las enzimas hASNasa1, GpA, L-asparaginasa deE. coliy L-asparaginasa deErwiniay análisis de la estructura cristalina (indicaron que el dominio catalítico termina en el resto 359. Se expresó recombinantemente una construcción compuesta por los restos 1-359 de GpA (SEQ ID NO: 3), pero la enzima C-truncada purificada era inestable. Por lo tanto, se prepararon construcciones de GpA truncadas de forma C-terminal adicionales (Tabla 1) fusionadas con un marcador SUMO.

Tabla 1

La sobreexpresión recombinante de estas construcciones de GpA truncadas en el extremo C-terminal indicaba que todas las proteínas se sobreexpresaban bien y purificaban hasta >95% de pureza (medida por SDS-PAGE). Aunque GpA367 precipitó rápidamente en cuestión de minutos después de que se cortara el marcador SUMO de estabilidad, las variantes más largas mostraron una excelente estabilidad y actividad, que era comparable a la proteína de longitud completa. En particular, las construcciones más largas que llevan una Cys388 extra tendieron a formar un enlace disulfuro inespecífico, alterando la forma tetramérica necesaria para la actividad de L-asparaginasa. Aunque una GpA truncada en el extremo C-terminal compuesta por al menos los restos 1-369 produce una enzima GpA estable con actividad de L-asparaginasa, como se demuestra en el presente documento, la estabilidad de una GpA truncada en el extremo C-terminal compuesta por los restos 1-359 o 1-367 puede estabilizarse por fusión con un péptido/proteína heterólogo (p. ej., un marcador SUMO o albúmina) o modificación química (p. ej., PEGilación).

Ejemplo 2: Variantes de GpA humanizadas producidas por evolución dirigida

Descripción general. La evolución dirigida, o el procedimiento para imitar los procesos evolutivos naturales en el laboratorio, se usa ampliamente para mejorar las propiedades enzimáticas. Véase, p. ej., Dalby (2011)Curr. Opin. Struct. Biol.21:473-480; Goldsmith y Tawfik (2012)Curr. Opin. Struct. Biol.22:406-412; Labrou (2010)Curr. Protein Pept. Sci.11:91-100; Wang y Zhao (2012)Bioresour. Technol.115:117-125. Dados los avances en la generación de bibliotecas, las técnicas de cribado y, sobre todo, una mejor comprensión de los mecanismos de la evolución natural de las proteínas, se han obtenido grandes mejoras en la actividad catalítica evolucionada (en relación con el punto de partida, y en valores absolutos de k<cat>/K<m>) (Fasan, et al. (2008)J. Mol. Biol.383:1069-80; Bar-Even, et al. (2011)Biochemistry(Mosc.) 50:4402-10).

Para superar la inmunogenicidad, se generó una L-asparaginasa de tipo humano con propiedades cinéticas similares a las de la L-asparaginasa deE. colide tipo II mediante un enfoque de evolución dirigida. Usando el barajado de la familia de ADN, se identificaron varios clones con alta identidad de secuencia con hASNasa1 pero con las propiedades de K<m>baja de la gpASNasa1.

Cepas. Las deleciones de genes cromosómicos se realizaron usando el sistema de recombinasa de A-red (Datsenko y Wanner (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.97:6640-6645). El gen de la tirosina aminotransferasatyrB,el gen de la aspartato aminotransferasaaspCy los genes de L-asparaginasaansA, ansB, iaaAse eliminaron del cromosoma de E.coliBW25113 F-, DE(araD-araB)567, lacZ4787(del)::rrnB-3, LAM-, rph-1, DE(rhaD-rhaB)568, hsdR514 dando como resultadoE. coliBW5A. En resumen, se usó un par de cebadores para amplificar el gen reemplazado por el casete de resistencia a kanamicina de la cepa de keio apropiada de acuerdo con métodos conocidos (Datsenko y Wanner (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.97:6640-6645). Posteriormente, el producto de PCR lineal se usó para reemplazar todo el marco de lectura abierto del gen diana en el cromosoma BW25113. Las colonias que contenían las deleciones de genes correctas se transformaron con el plásmido de recombinasa FLP pCP20 para eliminar el marcador de resistencia a kanamicina, y el pCP20 se curó después de la cepa resultante. La cepa deE. coliBW2A se obtuvo siguiendo el mismo procedimiento y después de la deleción de los genesansAyansB.

Clonación de hASNasa1 y gpASNasa1 en BW2A y BGV5A. El gen que codifica la secuencia optimizada en codones de la hASNasa1 se amplificó usando los cebadores NdeI-hA_F1 y hA-BamHI_R573 y la secuencia optimizada en codones de la gpASNasa1 con los cebadores NdeI-gpA_F1 y gpA-BamHI_R565 (Tabla 2). Después de una digestión conBamHI/Ndel,los productos de PCR se insertaron en el vector pBAD. Los vectores resultantes se usaron posteriormente para transformar las cepas BW5A y BW2A, dando como resultado las cepas BW5A pBAD_hASNasa1, bW5A pBAD_gpASNasa1, BW2A pBAD_hASNasa1 y BW2A pBAD_gpASNasa1. BW5A y BW2A también se transformaron con el vector pBAD vacío para servir como controles.

Tabla 2

Experimentos de medios y crecimiento. El medio completo M9 se preparó a partir de sal mínima M9 (Sigma) suplementada con glicerol al 0,4%, tiamina 2 jM , MgSÜ41 mM, CaCb 0,1 mM y ampicilina 100 ug/ml. Para las placas M9 completas, se añadieron 15 g/l de agar. Para los experimentos con la cepa BW2A, se preparó medio M9 sin NH4Cl. Cuando se requirió, se añadió L-asparaginasa al medio M9 en diferentes concentraciones. Para inducir la expresión de hASNasa1 y gpASNasa1 clonadas en el vector pBAD, se añadió arabinosa al 0,02% al medio M9. Para los experimentos de crecimiento en M9 completo en placas de agar, las cepas se cultivaron primero en LB durante la noche a 37°C, se centrifugaron y se lavaron en medio M9. Una dilución apropiada de esta suspensión se extendió entonces sobre las placas M9 para obtener el mismo número de colonias para cada cepa. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 a 96 horas

Barajado de ADN. Se llevó a cabo el barajado de ADN como se ha descrito (Meyer, et al. (2014) Curr.Protoc. Mol. Biol.,Ausubel (ed) 105:Unit-15.12) con ligeros ajustes. En resumen, se digirió una mezcla equimolar de los genes de hASNasa1 y GpA con 0,5 U de DNasa (NEB) durante 2 minutos y 30 segundos. Los fragmentos entre 100 pb y 200 pb se extrajeron usando el kit de extracción en gel QIAQUICK (Qiagen), se volvieron a ensamblar por PCR y después se amplificaron usando ya sea los cebadores específicos para el gen de GpA o el específico para el gen de hASNasa1. Los fragmentos barajados obtenidos se clonaron en un vector pBAD usando el método Megawhop (Miyazaki (2003)Methods Mol. Biol.231:23-28). En resumen, se usaron de 100 a 300 ng de fragmentos barajados como megacebadores para realizar una PCR de plásmido completo usando pBAD_hASNasa1 o pBAD_gpASNasa1 como molde. Después de la digestión del molde conDpnl,se usaron de 20 a 40 ng de plásmidos recién sintetizados que contenían las secuencias barajadas para transformar células BW5A electrocompetentes. Después del pulso, las células se resuspendieron en 1 ml de medio SOC y se incubaron con agitación a 37°C durante una hora. Las células después se centrifugaron a 4000 x g durante 4 minutos y se resuspendieron suavemente en 200 j l de medio M9. Se sembraron 100 j l en placa M9 suplementado con Asn 0,2 mM o Asn 2 mM. Después de 4 días de incubación de las placas a 37°C, las colonias de la placa de Asn 2 mM se aislaron y se combinaron en 200 j l de medio M9 nuevo. Se llevaron a cabo dos diluciones sucesivamente y se usaron para sembrar placas M9 de Asn 0,2 mM nuevas. Los clones capaces de crecer en la placa de Asn 0,2 mM después de 4 días de incubación a 37°C y tres días adicionales a temperatura ambiente se aislaron y se sembraron en rayas en placas LB.

Intercambio de dominio C-terminal. Para construir el clon hN-gC, la secuencia correspondiente al dominio N-terminal de hASNasa1 (hN, restos 1-361) se amplificó usando los cebadores NdeI-hA_F1 y gpA360-367_R y la secuencia correspondiente al dominio C-terminal de gpASNasa1 (gC, restos 360-565) se amplificó usando los cebadores hA354-361_F y gpA-BamHI_R565. Para construir el clon gN-hC, la secuencia correspondiente al dominio N-terminal de gpASNasa1 (gN, restos 1-359) se amplificó usando los cebadores NdeI-gpA_F1 y hA362-369_R y la secuencia correspondiente al dominio C-terminal de hASNasa1 (hC, restos 362-573) se amplificó usando los cebadores gpA352-359_F y hA_BamHI_R573. Los cebadores se enumeran en la Tabla 2. La quimera se construyó entonces mediante fusión por PCR del fragmento hN y gC o gN y hC usando los cebadores apropiados y luego se clonó posteriormente en los vectores pBAD y pET.

Clonación y expresión de los clones seleccionados. Los clones aislados se cultivaron; el plásmido se extrajo y se secuenció. Los genes correspondientes se transfirieron a un vector pET (pET14b modificado para incluir un marcador His-SUMO, utilizando los mismos cebadores que se utilizan para la clonación en el vector pBAD) para permitir la expresión de la proteína marcada con His en células C41 (DE3). El cultivo se llevó a cabo en 1 L de medio 2YT suplementado con ampicilina 100 pg/ml. La expresión se indujo con IPTG 0,1 mM y las células se cultivaron durante la noche a 18°C. Las células se recogieron, lisaron y purificaron como se describió previamente para la gpASNasal de tipo natural (Schalk, et al. (2014)J. Biol. Chem.289:33175-86). La proteína se eluyó en un tampón Tris-HCl 25 mM a pH 7,5, KCl 200 mM, imidazol 500 mM y se dializó contra el mismo tampón que no contenía imidazol sino DTT 1 mM. La expresión y purificación de la enzimaansBdeE. colise ha descrito previamente (Schalk, et al. (2014)J. Biol. Chem.289:33175-86).

Ensayos cinéticos. La actividad catalítica de los clones se determinó usando un ensayo acoplado a enzima dependiente de NADH espectroscópico (Fernandez, et al. (2013)Int. J. Clin. Exp. Med.6:478-487; Hejazi, et al. (2002)Biochem. J.364:129-136), que mide la producción de ácido L-aspártico (Asp) a través de la oxidación 1:1 de NADH reducido. La conversión de NADH en NAD se midió espectrofotométricamente como una disminución en la absorbancia a 340 nm a 37°C. Todas las mediciones se tomaron por triplicado en un tampón que contenía Tris 100 mM a pH 7,5, a-cetoglutarato 0,4 mM y NADH 0,4 mM con enzima (hASNasa1, hN-gC) 50 nM; (gpASNasa1, gN-hC, 63-hC, 64-hC, 65-hC, SA-hC) 10 nM o(ansB)3 nM. La transaminasa glutámicooxalacética (Sigma) y la deshidrogenasa málica (Sigma) eran enzimas auxiliares para las reacciones enzimáticas acopladas; se usaron 5 y 1 unidad, respectivamente. Los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten usando SigmaPlot (Systat Software Inc). Debido a la naturaleza cooperativa de la hASNasa1, esta enzima se analizó usando la ecuación de Hill.

Cultivo celular. Las líneas celulares LOUCY (Ben-Bassat, et al. (1990)Cancer Genet. Citogenet.49(2):241-8) y SUP-B15 (ATCC CRL-1929) se describen en la técnica. Todas las líneas celulares se analizaron por STR (repeticiones cortas en tándem, por sus siglas en inglésShort Tandem Repeat)y se confirmó que coincidían 100% con los datos de perfil de STR correspondientes del Global Bioresource Center ATCC. Se verificó que todas las líneas celulares estaban libres de micoplasma. Las líneas LOUCY y SUP-B15 se cultivaron en una atmósfera húmeda (CO<2>al 5%, 37°C) usando medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% (Hyclone) y 1x solución de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). Se añadió L-glutamina directamente a los cultivos celulares hasta una concentración final de 2 mM. Se cultivaron partes alícuotas de 90 pl de suspensión celular (5x10<5>células por ml) por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo en presencia de 10 pl de DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, Mediatech) o diferentes L-asparaginasas hasta una concentración final que variaba de 0,00001 a 0,1 Ul/ml. Después de incubar las placas durante 4 días a 37°C en aire humidificado que contenía CO<2>al 5%, se añadieron 11 pl de Alamar Blue (Invitrogen) a una concentración final de 10% (v/v) y las placas se incubaron durante dos horas adicionales, seguido de lectura de la señal de fluorescencia. La viabilidad de células leucémicas se calculó como porcentaje de recuentos de fluorescencia en presencia de L-asparaginasa frente a la del control de DPBS.

Desarrollo de los sistemas de selección. Para crear un sistema de selección para la actividad de la L-asparaginasa, se requería una cepa bacteriana cuyo crecimiento dependa de cualquier producto de la reacción enzimática. Puesto que la L-asparaginasa cataliza la hidrólisis de Asn en Asp y amoniaco, se desarrollaron y ensayaron dos sistemas de selección: uno que emplea una cepa bacteriana dependiente del producto de reacción amonio como única fuente de nitrógeno y el otro usa una cepa auxótrofa para Asp.

Cepa BW2A: Dependencia de la reacción de L-asparaginasa por la fuente de nitrógeno. Todas las formas de vida requieren una fuente de nitrógeno. ParaE. colicultivada en un medio mínimo tal como M9, la fuente de nitrógeno se obtiene normalmente en forma de sal de NH<4>CL Sin embargo, en ausencia de NH<4>Cl, se verificó que la cepa BW deE. coliusada en este estudio podría crecer usando Asn 2 mM en el medio. Esto demuestra queE. colipuede usar Asn como una fuente de nitrógeno a través de la actividad de sus L-asparaginasas endógenas. Para hacer la cepa BW deE. colidependiente de NH<4>Cl producido por la actividad de la L-asparaginasa exógena, se eliminaron dos genes endógenos de la L-asparaginasa(ansAyansB)de la cepa parental BW deE. coli,que se denominó entonces BW2A. En particular, la tercera L-asparaginasa endógena(iiiA)no se eliminó, ya que tiene un valor de K<m>muy alto para Asn. Efectivamente, en las condiciones experimentales, incluso con Asn 2 mM en el medio, el crecimiento de la cepa BW2A estaba muy deteriorado.

Cepa BW5A: Dependencia de la reacción de L-asparaginasa por el aspartato.E. colipuede generar Asp hidrolizando Asn (la reacción de L-asparaginasa) o mediante una reacción de aminotransferasa. De hecho, la cepa BW parental crece bien en medios M9 independientemente y sin efecto por suplementación con Asp. Para crear una cepa deE. coliauxótrofa para Asp, se eliminaron los tres genes endógenos de L-asparaginasa(ansA,ansB yiiiA),así como los dos genes relevantes de aminotransferasa(aspCytyrB).La cepa con estos cinco genes suprimidos se denominó cepa BW5A. Para asegurar que la cepa BW5A adquiriera auxotrofía para Asp, se ensayó el crecimiento en medio mínimo M9 con y sin suplementación de Asp. Se observó que sin suplementar el medio con Asp, BW5A no podía crecer. Sin embargo, se observó crecimiento en las condiciones suplementadas con Asp.

Uso de las cepas BW2A y BW5A para seleccionar clones que expresan L-asparaginasa. Para investigar si estas cepas bacterianas se pueden usar como sistemas de selección para actividades de L-asparaginasa y principalmente si permitieran la diferenciación entre L-asparaginasas basada en su propiedad Km, se analizó el crecimiento de las cepas BW2A y BW5A que expresan ya sea una L-asparaginasa con una Km baja o una L-asparaginasa con una Km alta. La L-asparaginasa humana tipo I (hASNasal), la proteína diana que se va a desarrollar, se caracteriza por una Km para Asn en el intervalo milimolar (Karamitros y Konrad (2014)J. Biol. Chem.289:12962-75; Schalk, et al. (2014)J. Biol. Chem.289:33175-86) y así se usó como la L-asparaginasa de Km alta. La L-asparaginasa I de cobaya (gpASNasal) se caracterizó por tener una Km para la Asn en el intervalo micromolar (Schalk, et al. (2014)J. Biol. Chem.289:33175-86) y por lo tanto se usó como la L-asparaginasa de Km baja. Ambos genes que codifican la L-asparaginasa respectiva se clonaron en el vector pBAD con el fin de tener una expresión de proteína bien controlada.

En el primer sistema de cribado, que se basa en la reacción de L-asparaginasa que suministra la única fuente de nitrógeno, BW2A se transformó con pBAD (vector de control), pBAD_hASNasa1 (enzima de Km alta) o pBAD_gpASNasa1 (enzima de Km baja). Las células transformadas se cultivaron en medio M9 que carecía de NH4Cl pero se suplementaron con una concentración creciente de Asn. La expectativa era que una baja concentración de Asn promovería preferentemente el crecimiento de las bacterias portadoras del plásmido pBAD_gpASNasa1, que codifica la enzima de Km baja. Los resultados muestran que el crecimiento de BW2A tanto pBAD_hASNasa1 como pBAD_gpASNasa1 dependía de hecho de la concentración de Asn (es decir, conduciendo la concentración aumentada de Asn a mejor crecimiento). Sin embargo, según la concentración de Asn, no hubo una diferencia significativa de crecimiento entre BW2A pBAD_hASNasa1 y pBAD_gpASNasa1, p. ej., con Asn 0,2 mM, las bacterias BW2A que expresan la enzima gpASNasa1 de Km baja no formaron significativamente más colonias o más grandes que las bacterias que expresan la enzima hASNasa1 de Km alta. En resumen, se encontró que este sistema de cribado no era adecuado para discriminar entre L-asparaginasas que difieren en su valor de Km para Asn.

En el segundo sistema de cribado, que se basa en la auxotrofía para Asp, BW5A se transformó de manera similar con pBAD, pBAD_hASNasa1 o pBAD_gpASNasa1. Las células transformadas se cultivaron en medio M9 completo suplementado con concentración creciente de Asn. Se encontró que el crecimiento de BW5A pBAD_hASNasa1 y pBAD_gpASNasa1 dependía de la concentración de Asn. Es interesante que, con Asn 2 mM, que representa una concentración a la que la enzima de cobaya está saturada con sustrato (Km = 50 j M) y la enzima humana está solo parcialmente saturada (Km = 3.500<j>M), las cepas BW5A transformadas con hASNasa1 y gpASNasa1 muestran un crecimiento similar. En otras palabras, a esta concentración de Asn relativamente alta, la cepa BW5A no puede usarse para distinguir entre aquellas bacterias que expresan una L-asparaginasa de Km baja y aquellas que expresan una enzima de Km alta. Por el contrario, a concentraciones más bajas del sustrato Asn, solo BW5A pBAD_gpASNasa1 es capaz de crecer. De hecho, con Asn 0,2 mM, una concentración de Asn muy por debajo de la Km de hASNasa1 pero por encima de la Km de gpASNasa1, se desarrollaron colonias de BW5A pBAD_gpASNasa1 mientras que BW5a pBAD_hASNasa1 no pudo crecer. Cabe destacar que esta diferencia de crecimiento se encontró que era independiente del nivel de expresión de la enzima ya que no se observó ningún cambio en el crecimiento cuando se usó arabinosa (el inductor para la expresión de proteínas) en el intervalo de 0,0002% - 0,2%. Considerados juntos, los resultados sugieren que la diferencia en el crecimiento observada entre BW5A que expresa hASNasa1 y BW5A que expresa gpASNasa1 en placas de medio mínimo refleja directamente la Km de la L-asparaginasa expresada respectivamente.

La conclusión de este conjunto inicial de experimentos es que el cribado basado en la reacción de L-asparaginasa que suministra el nitrógeno (usando la cepa BW2A) no diferencia suficientemente bien entre enzimas de Km alta y baja, mientras que el cribado basado en la reacción de L-asparaginasa que suministra el aminoácido Asp (usando la cepa BW5A) discrimina de hecho entre enzimas con afinidades diferentes para la Asn, a baja concentración de Asn, solo las bacterias que expresan la L-asparaginasa de Km baja forman colonias. Por lo tanto, todo el trabajo de selección adicional dirigido a descubrir una variante de L-asparaginasa humana que haya adquirido una Km baja se realizó con la cepa BW5A deE. coli.

Barajado de la Familia de ADN. El barajado de la familia de ADN es un método alternativo para generar diversidad genética. Las secuencias de proteínas de hASNasa1 y gpASNasa1 contienen 573 y 565 aminoácidos, respectivamente, y son 69,8% idénticas a nivel de aminoácidos (difiriendo en 170 aminoácidos). Al trabajar con versiones sintéticas optimizadas en codones de hASNasa1 (SEQ ID NO: 35) y gpASNasa1 (SEQ iD NO: 36), los genes que codifican hASNasa1 y gpASNasa1 muestran 75% de identidad a nivel de ADN. Como se menciona en el presente documento, la hASNasa1 tiene una Km de 3,5 mM para Asn, mientras que se determinó que la Km de la enzima de cobaya era 50 j M (Tabla 3). El método de barajado de ADN se utilizó para recombinar las dos L-asparaginasas con el fin de obtener una quimera que presente la Km baja de la cobaya pero una homología de aminoácidos tan alta como sea posible con la enzima humana. Los fragmentos barajados se clonaron entonces en el vector pBAD. La biblioteca quimérica resultante se utilizó para transformar la cepa BW5A. Se descubrió la presencia de mutantes que poseían una Km baja usando el protocolo de selección como se ha descrito anteriormente. Se aislaron cuatro clones (n.° 63, n.° 64, n.° 65 y n.° SA) de placas M9 con una concentración de Asn de 0,2 mM. Los análisis de secuencia de estos clones pusieron de manifiesto un patrón de barajado con sucesos de recombinación que se producen predominantemente en el dominio N-terminal (es decir, catalítico); uno de los clones seleccionados (n.° SA) llevaba una mutación que introducía un codón de parada prematura (STOP) que estaba más allá del dominio catalítico (Figura 1).

Intercambio del dominio C-terminal. Para minimizar la inmunogenicidad contra GpA, se buscó una enzima que fuera tan idéntica como fuera posible a la L-asparaginasa humana pero que tuviera la propiedad de K<m>baja de las enzimas tipo II de cobaya/E.coli.Los experimentos de barajado sugirieron que una quimera que tenía el dominio de L-asparaginasa de cobaya seguido por el dominio C-terminal humano seguiría reteniendo las propiedades cinéticas favorables de la gpASNasal pero tendría una mayor identidad de secuencia con la enzima humana.

Por consiguiente, se generaron dos quimeras; una, que se denominó h<N>-g<c>e incluía el dominio N-terminal humano fusionado con el dominio C-terminal de cobaya, y la segunda, que se denominó g<N>-h<c>e incluía el dominio N-terminal de cobaya fusionado con el dominio C-terminal humano (Fig. 1, Tabla 3). La caracterización cinéticain vitrode estas quimeras validó la predicción, presentando h<N>-g<C>propiedades cinéticas similares a hASNasa1 y g<N>-h<C>propiedades cinéticas similares a gpASNasa1 (Tabla 4).

Este resultado demuestra que el dominio C-terminal de GpA no influye en la actividad catalítica de la L-asparaginasa y lo que es más importante no afecta negativamente a la K<m>. Puesto que el objetivo era identificar un clon con propiedades cinéticas de gpASNasa1 pero con la mayor homología de secuencia con hASNasa1, los cuatro clones, n.° 63, n.° 64, n.° 65 y n.° SA, se diseñaron reemplazando su dominio C-terminal barajado con la secuencia exacta del dominio C-terminal humano (Fig. 1). Los clones modificados genéticamente, en concreto 63<N>-h<c>, 64<N>-h<c>, 65<N>-h<c>y SA<N>-h<c>, presentaban respectivamente 85,7%, 91,1%, 87,1% y 91,6% de identidad con la secuencia de hASNasa1 de tipo natural (Tabla 3 y Fig. 2A-2B).

Tabla 3

Propiedades catalíticas de las variantes. Para determinar las propiedades cinéticas precisas de 63<N>-h<C>, 64<N>-h<c>, 65<N>-h<c>y SA<N>-h<c>, los genes que codifican estas enzimas se subclonaron en un vector de expresión pET14b y se expresaron en células deE. coliC41. Se ensayó en los clones purificados su actividad de L-asparaginasa (Tabla 4). La L-asparaginasa ansB deE. colitambién se incluyó con el fin de comparar los clones con una L-asparaginasa aprobada para terapia del cáncer. Se observó que los cuatro clones seleccionados por evolución dirigida y que portaban el dominio C-terminal de hASNasa1 mostraban alta identidad de secuencia con hASNasa1 (>85%) pero propiedades cinéticas similares a gpASNasa1 con una K<m>en el intervalo micromolar. El clon 63<N>-h<c>(identidad de 85,7% con la secuencia hASNasa1) mostró la K<m>más baja de 47 pM. El clon SA<N>-h<c>tenía la identidad de secuencia más alta con hASNasa1 (identidad de 91,6%), pero este clon tenía una K<m>para Asn algo más alta de 165 pM. Se compararon las velocidades de hidrólisis de Asn observadas de las enzimas con Asn 50 pM (k<obs-a50pM>), ya que se trata de una concentración de Asn en sangre relevante (Ollenschlager (1988)Eur. J. Clin. Invest.18:512-6). Se encontró que la k<obs-a50pM>de ansB deE. coliera 41±0,3 s<_1>y que la de gpASNasa1 natural era 20 s<-1>. Es importante destacar que los valores de k<obs-a50pM>para los clones humanizados también estaban en este intervalo, siendo 17 s<-1>, 10 s<-1>, 17 s<_1>y 6 s<_1>para los clones 63<n>-h<c>, 64<N>-h<c>, 65<N>-h<c>y SA<N>-h<c>, respectivamente.

Tabla 4

Evaluación en cultivo celular de los clones de L-asparaginasa humanizados. Para determinar si la enzima GpA presentaba actividad anti-ALL, las líneas celulares LOUCY T-ALL y SUP-B15 B-ALL humanas se expusieron a concentraciones crecientes de gpASNasa1. Los resultados de este análisis indicaron que la gpASNasa1 presentaba una IC<50>de 0,00015 UI/ml y 0,00036 UI/ml para las líneas celulares LOUCY y SUP-B15, respectivamente (Tabla 5). En particular, estos valores de IC<50>son comparables a los de la enzima tipo II deE. coli.

En las quimeras de hASNasa1 y gpASNasa1 también se evaluó su potencia anti-ALL. Los clones g<N>-h<o>, 63<n>-hC y 65<N>-hC se seleccionaron para estos experimentos ya que estos clones tienen la menor K<m>para Asn (35, 47 y 74|jM, respectivamente) y por lo tanto tienen actividades más similares a la de la gpASNasal (50|jM). Debido al valor de K<m>más alto de 65<N>-hC, este clon tenía el valor de IC<50>más alto en comparación con las otras enzimas, pero todavía era muy eficaz para matar tanto las células de T-ALL como B-ALL (IC<50>en el intervalo de mUI/ml; Tabla 5). Los clones g<N>-h<o>y 63<N>-h<c>demostraron ser muy similares en su poder de destrucción celular en comparación con gpASNasal. Esto es especialmente notable para el clon 63<N>-h<c>, ya que este clon aumentó el porcentaje de identidad respecto a hASNasal de 69,8% como está presente en gpASNasa1 a 85,7%.

Tabla 5

En resumen, este análisis identificó variantes humanizadas de GpA que tenían la propiedad de Km baja requerida. Dos de los clones identificados, 63N-hC y 65N-hC, compartían respectivamente 85,7% y 87,1% de identidad de secuencia de aminoácidos con hA-FL pero tenían una Km similar a GpA de longitud completa. Estos clones poseen una eficiencia catalítica mejorada de 100 a 140 veces en comparación con la hASNasa1 de longitud completa. En particular, estas L-asparaginasas altamente similares a las humanas mantienen su potencial de destrucciónin vitrode la ALL.

Ejemplo 3: Variantes de GpA humanizadas producidas mediante un enfoque basado en estructura

Como una alternativa al barajado de ADN y el intercambio de dominios, se adoptó un enfoque basado en la estructura para humanizar la enzima GpA y reducir la inmunogenicidad de la misma. Para este enfoque, se modificó la variante truncada GpA369 (SEQ ID NO: 5). Se examinó la estructura cristalina de GpA y se hicieron predicciones sobre qué restos en la superficie de la enzima se podrían mutar a los aminoácidos correspondientes en hASNasa1, y cuya presencia no sería perjudicial para la actividad o estabilidad de la enzima. Los restos de la superficie candidatos se dividieron en tres grupos basándose en la probabilidad de tener un posible impacto en la actividad o estabilidad de GpA (Grupo 1, sin impacto; Grupo 2, probablemente sin impacto; y Grupo 3, posible impacto) (Tabla 6).

Tabla 6

Se preparó una variante de GpA que contenía todas las mutaciones del Grupo 1, la combinación de mutaciones de los Grupos 1 y 2, y la combinación de mutaciones de los Grupos 1, 2 y 3 (Tabla 7). Las variantes de GpA se expresaron recombinantemente y se encontró que retenían 100% de la actividad y estabilidad del tipo natural.

Los datos de estabilidadin vivosugerían una posible escisión de uno de los bucles expuestos en la superficie presentes en la enzima GpA. En particular, los datos sugerían diferentes estabilidades entre proteínas que tienen la secuencia del bucle 1 como está presente en hASNasa1 (bucle1hum, restos 57-62: SEDTLV (SEQ ID NO: 43)) respecto a proteínas que tienen la secuencia como está presente en GpA (bucle1gp, restos 57-62: PDHALA (SEQ ID NO: 44)). Por consiguiente, las variantes de GpA que contenían combinaciones de mutaciones del Grupo 1,2 y 3 se mutaron adicionalmente para incluir la secuencia de bucle1hum (Tabla 7). De nuevo, las variantes de GpA se expresaron recombinantemente y se encontró que retenían 100% de la actividad y estabilidad del tipo natural.

Tabla 7

Ejemplo 4: Mutación de restos de cisteína de superficie para PEGilación

Se sabe que la PEGilación aumenta el tiempo de circulaciónin vivo.Las moléculas de PEG pueden conjugarse fácilmente con restos de cisteína de una proteína de interés mediante química de PEGilación basada en maleimida. Las variantes GpA369 y GpA369 humanizada contienen cinco restos de cisteína intrínsecos, Cys79, Cys173, Cys198, Cys296 y Cys299. Basándose en el análisis de la estructura cristalina, Cys173 y Cys296 están enterradas y, por lo tanto, se predice que no afectarán a la PEGilación. Se consideró que la Cys299 era menos accesible que la Cys198 y contribuía a la estabilización del tetrámero. Los intentos de intercambiar la Cys299 a Ala o Ser para evitar la PEGilación en este sitio dieron como resultado proteínas inestables. Por el contrario, la mutación del resto de cisteína en la posición 198 a una alanina (GpA369-C198A, SEQ ID NO: 51), serina (GpA369-C198S, SEQ ID NO: 52) o valina (GpA369-C198V, SEQ ID NO: 53) produjo proteínas igualmente estables y activas en comparación con la enzima de referencia GpA369. Además, la maleimida-PEGilación de las proteínas GpA369-C198A, GpA369-C198S y GpA369-C198V, que ahora contienen solo una cisteína de superficie reactiva única (Cys79), dio como resultado un producto homogéneo.

El grado de protección biológica mediante PEGilación depende de la estructura y la complejidad del agente PEG, pero en la mayoría de los casos, la PEGilación de un solo sitio no es suficiente para cubrir toda la macromolécula. Por lo tanto, se generaron variantes de GpA adicionales, que contenían entre uno y cinco restos de cisteína de superficie. En relación con esto, se analizó la estructura de GpA con el fin de identificar regiones de restos que podrían mutar a cisteínas para productos PEGilados en múltiples sitios. Las regiones útiles deben estar en la superficie, deben estar distantes de las interfases de oligomerización (GpA es un tetrámero, por lo que PEGilar un resto cerca de una interfase podría ser perjudicial para la actividad de la enzima), e incluir restos que apuntan hacia fuera. Las regiones de GpA que cumplen estos criterios se enumeran en la Tabla 8.

Tabla 8

Entre los posibles restos que se podrían mutar (Tabla 8), E49 de la Región 1, K225 de la Región 2, Q257 de la Región 3 y E340 de la Región 4 se identificaron como buenos candidatos para la mutación a una cisteína. Se generaron variantes de GpA369-C198 y GpA369(hum)-Grupo1+2+3-C198, que incluían una o más de las mutaciones K225C, E340C, E49C y Q257C (Tabla 9).

Tabla 9

Cada una de las variantes enumeradas en la Tabla 9 se expresaron recombinantemente, se purificaron y se PEGilaron con uno o más de mPEG-10K, mPEG-20K y mPEG-40K (Tabla 10). Como se determinó mediante análisis de SDS-PAGE, el tamaño de las enzimas PEGiladas aumentó con un aumento en el número de cisteínas activas. Por ejemplo, usando maleimida-PEG10K, GpA369(hum)-C198A migró a un peso molecular más alto después de la PEGilación (debido a los 10K Da extra suministrados por el PEG), y GpA369(hum)-C198A+R52C migró a un peso molecular aparente incluso más alto ya que esta variante puede reaccionar con dos moléculas de PEG (para un total de 20K Da extra suministrados por dos moléculas de 10K unidas a la enzima). Cabe destacar que el mutante GpA369-C198A-K225C-E340C-E49C-Q257C se preparó, expresó, purificó y PEGiló con mPEG-10K. Sin embargo, la PEGilación de esta variante con mPEG-10K dio como resultado un producto de múltiples especies. La chaperona de 60KDa estaba presente con una relación 1:1 con esta proteína, lo que sugiere que el mutante GpA369-C198A-K225C-E340C-E49C-Q257C no estaba bien plegado.

Tabla 10

Para evaluar adicionalmente la PEGilación de las variantes, se usaron diferentes relaciones PEG:proteína. Para este análisis, se usaron 2 mg/ml de GpA369-C198A junto con un exceso de 2, 10 y 20 veces de m-PEG10K lineal. Además, se llevó a cabo un análisis para determinar el efecto de añadir beta-mercaptoetanol 5 mM después de que se completaron las reacciones de PEGilación, e incluir aditivos tales como glicina 10 mM o 100 mM o ácido aspártico 10 mM durante la reacción de PEGilación. Este análisis indicó que se necesitaba una relación molar de 20:1 de maleimida-PEG:proteína para asegurar la PEGilación completa de las variantes de GpA369. Además, se encontró que la adición de beta-mercaptoetanol proporcionaba un producto homogéneo, mientras que la glicina o el ácido aspártico deberían excluirse en la reacción de PEGilación.

Además de la maleimida-PEG10K lineal, las variantes de GpA369 se PEGilaron con maleimida-PEG20K lineal, maleimida-PEG40K lineal maleimida-PEG20K de dos ramificaciones, maleimida-PEG10K de cuatro brazos, y maleimida-PEG40K en forma de Y. Se observó PEGilación con cada uno de estos diferentes tipos de PEG. En particular, las variantes PEGiladas mostraron un aumento significativo en la actividad de L-asparaginasa en comparación con las variantes desnudas de GpA369 (Tabla 10).

Ejemplo 5: Mutación de restos de lisina de superficie para PEGilación

La mayoría de los productos bioterapéuticos convencionales están PEGilados en restos de lisina, donde el grupo amino épsilon de la cadena lateral de lisina reacciona con la molécula de PEG. La lisina es un aminoácido común presente en la superficie de las proteínas. Por lo tanto, la PEGilación usando esta estrategia a menudo da como resultado un producto de baja homogeneidad, con un número variable de moléculas de PEG unidas a la proteína.

Para aumentar la homogeneidad, los restos de lisina de GpA que están muy próximos a otro resto de lisina se reemplazaron por un resto que no reaccionara con PEG. Además, los restos que tienen un posible impacto negativo en la integridad estructural y, por lo tanto, la actividad enzimática de la L-asparaginasa tetramérica se reemplazaron por restos de lisina de superficie con el fin de tener la superficie de la enzima entera completa y uniformemente protegida.

Usando esta estrategia, se consideró que las variantes de GpA truncadas que tienen las mutaciones enumeradas en la Tabla 11 eran útiles en esta invención.

Tabla 11

Para demostrar la actividad, estabilidad y PEGilación a través de restos de lisina, se generó la variante GpA369(hum)-Grupo1+2+3-C198A-R54K+A91K+K223D+S311K, se expresó recombinantemente, se purificó y se PEGiló usando diferentes relaciones PEG:proteína. Este análisis mostró que se necesitaba una relación molar de más de 20:1 de amina-PEG frente a proteína para asegurar la PEGilación completa de la variante de GpA369. También se observó que los aditivos tales como DTT y glicerol deberían excluirse en la reacción de PEGilación. Se ensayaron diferentes tamaños y tipos de enlazadores, incluyendo carbonato de metoxi-PEG-succinimidilo 10K (mPEG-SC-10K), éster de succinimidilo de carboximetil-mPEG 5K (mPEG-SCM-5K) y éster de succinimidilo de mPEG-succinamida 5K (mPEG-SAS-5K). En particular, ninguno de los productos PEGilados presentó ninguna pérdida en la actividad de L-asparaginasa en comparación con la versión desnuda (Tabla 12).

Tabla 12

Ejemplo 6: Marcadores para aumentar la semividain vivo.

La eficacia de la L-asparaginasa está relacionada con la semividain vivodel fármaco; cuanto más larga es la semivida, más tiempo actúa la enzima para hidrolizar la asparagina en sangre. Por consiguiente, para aumentar la semividain vivode las variantes de L-asparaginasa descritas en el presente documento, los marcadores se fusionan con el extremo N-terminal de la L-asparaginasa. Dichos marcadores incluyen un marcador de histidina, un marcador SUMO de levadura; un marcador SUMO humano; un marcador His<6>-SUMO humano donde el marcador SUMO puede ser uno de los cuatro dominios de SUMO homólogos presentes en seres humanos (SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 o SUMO-4); y un marcador de péptido de unión a albúmina. Cada uno de los marcadores puede aumentar el tiempo en la circulación de la enzima L-asparaginasa. Además, se pueden usar combinaciones de marcadores. En particular, los marcadores SA21 y SUMO pueden combinarse para obtener variantes con una semivida todavía más prolongada.

El marcador de histidina. La secuencia de ADN que especifica una cadena de seis a nueve restos de histidina se usa frecuentemente en vectores para la producción de proteínas recombinantes. El resultado es la expresión de una proteína recombinante con un marcador de 6xHis o poli-His fusionado a su extremo N o C.

Las proteínas marcadas con His expresadas pueden purificarse y detectarse fácilmente, proporcionando así un medio para purificar o detectar específicamente la proteína recombinante sin un anticuerpo o sonda específica de proteína. Los kits están disponibles comercialmente para las proteínas con marcador de His.

Modificación con SUMO. Se ha encontrado que SUMO como pareja de fusión N-terminal potencia la producción de proteínas funcionales en sistemas de expresión procariotas y eucariotas, basándose en la estabilidad y solubilidad de las proteínas significativamente mejoradas.

Después de la expresión y purificación de la proteína de fusión, el marcador SUMO puede escindirse mediante proteasas específicas (SUMO) a través de su actividad de endopeptidasain vitropara generar el extremo N deseado de la pareja de proteína liberada. Los sistemas de expresión del marcador SUMO están disponibles comercialmente. En algunas realizaciones, el marcador SUMO es un marcador SUMO de levadura (p. ej., Smt3 (SEQ ID NO: 66)). En otras realizaciones, el marcador SUMO es un marcador SUMO humano (p. ej., SUMO-1 (SEQ ID NO: 67), SUMO-2 (SEQ ID NO: 68), SUMO-3 (SEQ ID NO: 69) o SUMO-4 (SEQ ID NO: 70)).

Modificación con His-SUMO. La combinación de un marcador de histidina (p. ej., 1x-6xHis) y la modificación con SUMO proporciona una purificación eficiente, expresión y solubilidad aumentadas, así como una mayor semivida de L-asparaginasas. Los sistemas de expresión para proporcionar la modificación con His-SUMO a una proteína de interés están disponibles comercialmente. Véase, p. ej., el sistema de expresión de la proteína CHAMPION pET SUMO (Invitrogen).

Dominio de unión a albúmina. Usando la presentación en fagos, se han identificado una serie de péptidos que se unen a la albúmina sérica de múltiples especies (Dennis, at al. (2002)J. Biol. Chem.277(38):35035-35043; US 2016/0185874; y US 2004/0001827). Se encontró que uno de estos péptidos, denominado SA21, tenía una semivida en suero prolongada. Los péptidos de unión a albúmina de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, SA20 (QRLIEDICLPRWGCLWEDDF; SEQ ID NO: 71), SA21 (RLIEDICLPRWGCLWEDD; SEQ ID NO: 72), y SA31 (RLIEDICLPRWGCLW; SEQ ID NO: 73). Mediante la fusión de dichos dominios con la enzima L-asparaginasa descrita en el presente documento, se esperan mejoras farmacocinéticas a través de la asociación no covalente con albúmina. Véase Dennis, et al. (2002)J. Biol. Chem.277(38):35035-35043; US 2016/0185874; y US 2004/0001827.

En la Tabla 13 se proporcionan variantes de GpA truncadas con varios marcadores de ejemplo.

Tabla 13

Ejemplo 7: Proteína de fusión TRAIL-GpA

TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF) es una proteína que induce la muerte celular por apoptosis. Por consiguiente, se crea una proteína de fusión TRAIL-asparaginasa para combinar la actividad de estas dos proteínas. Usando esta proteína de fusión, el componente L-asparaginasa indica a la célula que experimente apoptosis, y el componente TRAIL induce la muerte celular. A modo de ilustración, se fusionan tres dominios solubles en tándem de TRAIL (TRAIL<trímero>), en el marco, con una L-asparaginasa de cobaya truncada y humanizada tal como GpA369(hum)-Grupo1+2+3 (SEQ ID NO: 47) o GpA369(hum)-Grupo1+2+3-bucle1<hum>(SEQ ID NO: 50) para generar proteínas de fusión de TRAIL<trímero>-GpA o GpA-TRAIL<trímero>.

La eficacia de una proteína de fusión se evalúa cultivando células MV4;11 de leucemia mieloide aguda humana en presencia de la proteína de fusión hasta una concentración final que varía de 0,0001 a 2,5 UI/ml. Después de incubar las placas durante 4 días a 37°C en aire humidificado que contenía CO<2>al 5%, se añade Alamar Blue (Invitrogen) a una concentración final de 10% en v/v y las placas se incuban durante 4 horas adicionales, seguido de lectura de la señal de fluorescencia. La viabilidad de células leucémicas se calculó como porcentaje de recuentos de fluorescencia en presencia de L-asparaginasa frente a la del control de DPBS. Este análisis demostrará que la proteína de fusión activa posee una actividad de destrucción notablemente mejor contra la línea celular MV4;11 en comparación con la L-asparaginasa de cobaya truncada y humanizada sola.

La eficaciain vivode una proteína de fusión para matar células leucémicas se evalúa inyectando a 4-10 ratones inmunodeficientes y diabéticos no obesos (NSG)/graves combinados (The Jackson Laboratory) a las 6 semanas de edad 150 pl de DPBS que contiene 5x106 células MV4;11 positivas para luciferasa. En puntos de tiempo regulares, se mide la bioluminiscencia usando el sistema de formación de imágenes IVIS Lumina II (PerkinElmer). Después del injerto (Día 0), los ratones se tratan cada día durante una semana con una inyección i.p. de 15 UI/ratón de la proteína de fusión. La señal de bioluminiscencia se mide el día 0 y el día 7. Los resultados de este análisis demostrarán un notable efecto de destrucción de las células MV4;11 por la proteína de fusión.

También se determina la eficacia de la proteína de fusión contra cánceres sólidos, tales como cánceres de páncreas y ovario. Las líneas celulares de cáncer de páncreas tales como Panc-1 y MiaPaca2 y las líneas celulares de cáncer de ovario tales como OVCAR3 y OVCAR4 se tratan con la proteína de fusión o GpA sola hasta una concentración final que varía de 0,0001 a 2,5 UI/ml, o TRAIL<trímero>a una concentración que corresponde a la utilizada para la proteína de fusión. Después de incubar las placas durante 4 días a 37°C en aire humidificado que contenía CO<2>al 5%, se añade Alamar Blue (Invitrogen) a una concentración final de 10% en v/v y las placas se incuban durante 4 horas adicionales, seguido de lectura de la señal de fluorescencia. La viabilidad de células de cáncer se calculó como porcentaje de recuentos de fluorescencia en presencia de la proteína de fusión frente a la del control de DPBS. Este análisis demostrará que la proteína de fusión activa posee una actividad de destrucción notablemente mejor contra las líneas celulares de cáncer en comparación con el TRAIL<trímero>o GpA solos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de L-asparaginasa de cobaya (GpA) truncada en el extremo C-terminal que comparte al menos 85% de identidad de secuencia con los restos 1 a 359 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante de GpA truncada comprende al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, en donde la al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 es H10R, Q23R, K25E, K48E, Q52R, Q54R, P57S, D58E, H59D, A60T, A62V, D91A, D92E, K98Q, E101K, Q108H, S121F, G122A, H134Q, R147H, K193R, C198A, C198S, C198V, D217E, N233S, H236Q, S250A, Q288E, R301Q, E344D, L360P, T362S, A363V, D364E, L365E, H366R, Q367R o S368P, o una combinación de las mismas; y/o

en donde la al menos una sustitución de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 comprende:

(a) un resto cisteína en la posición 49, 52, 225, 257, 281 o 340, o una combinación de los mismos; o (b) un resto lisina en la posición 7, 53, 54, 57, 58, 98, 106, 233, 250, 257, 281, 311 o 340, o una combinación de los mismos;

y

en donde el truncamiento C-terminal está en una posición entre 359 y 396 de la SEQ ID NO: 1.

2. La variante de GpA truncada de la reivindicación 1, en donde el truncamiento C-terminal está en la posición 369 de la SEQ ID NO: 1.

3. La variante de GpA truncada de cualquier reivindicación precedente, en donde la variante tiene una actividad catalítica igual o mayor que la GpA de tipo natural, en donde la actividad catalítica se determina utilizando un ensayo espectroscópico acoplado a enzima dependiente de NADH que mide la producción de ácido L-aspártico (Asp) por medio de la oxidación 1:1 de NADH reducido.

4. La variante de GpA truncada de cualquier reivindicación precedente, que comprende además un marcador de histidina, un marcador SUMO, un dominio de unión a albúmina, o una combinación de los mismos; o que comprende además tres dominios solubles en tándem de TRAIL;

en donde, opcionalmente, los dominios solubles de TRAIL comprenden restos 115-281 de TRAIL humano.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica la variante de GpA truncada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula hospedante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

8. Una composición farmacéutica que comprende la variante de GpA truncada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, que comprende además una forma estable de TRAIL; en donde, opcionalmente, la forma estable de TRAIL comprende la secuencia de FOLDON GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 85).

10. La variante de GpA truncada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el uso administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de la variante de GpA truncada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, tratando así el cáncer del sujeto.

11. La variante de GpA truncada para el uso de la reivindicación 10, en donde el cáncer se selecciona de linfoma no Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, linfoma de células B, linfoma de Burkitt, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica y leucemia de células pilosas.

12. La variante de GpA truncada para el uso de la reivindicación 11, que comprende además administrar una forma estable de TRAIL.