CN114369173B - 一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法 - Google Patents

一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法。所述方法包括将经密码子优化的SUMO基因与人颗粒溶素基因及动物NK lysin基因融合表达的步骤。申请通过筛选SUMO标签以及优化linker序列，实现在毕赤酵母中高效表达人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin的融合蛋白。

Description

一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕 赤酵母中表达的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法。
背景技术
自然杀伤细胞（Natural Killer cells，NKC）和细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic TLymphocytes，CTLs）是细胞免疫的主要效应细胞。这些细胞在受到刺激时释放一系列引起靶细胞凋亡和杀伤的效应因子，其中一种即为颗粒溶素或NK lysin。一般在人体细胞中称为颗粒溶素（granulysin, GNLY），动物来源的称为NK lysin。
GNLY及NK lysin都属于鞘脂激活蛋白saposin（sphingolipid activatorprotein）样蛋白SAPLIP（saposin-like protein）家族成员，它们彼此间同源性很高，结构与功能相似。它们都富含碱性氨基酸，并都含有6个半胱氨酸形成3对二硫键，具有广谱抗病原菌、真菌和寄生虫的效应，但对绵羊红细胞没有溶血作用，因此，GNLY及NK lysin在人体及动物抗感染疾病的防治中具有良好的应用前景。
目前研究中使用的人颗粒溶素大多来源于大肠杆菌表达系统，由于颗粒溶素的蛋白序列中存在较多的二硫键，不易于正确折叠，蛋白在表达过程中易于形成包涵体，可溶性表达低。现有技术公开了人颗粒溶素在毕赤酵母中的表达和制备方法，但表达量仍有待提高。有文献报道了猪来源NK lysin在毕赤酵母中的表达，表达量低。到目前为止，未见鸡、牛来源NK lysin的重组表达。综上所述，目前人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin的来源仍然非常有限，开发新的能提高此类蛋白的表达策略非常必要。
为了通过基因工程手段高表达重组人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin，尝试在毕赤酵母中表达重组人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin，但是发酵液中未检测到重组人颗粒溶素和动物NK lysin的表达。
发明内容
为了解决上述问题，提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法。
根据本发明的利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，包括以下步骤：
将经密码子优化的SUMO基因与人颗粒溶素基因及动物NK lysin基因融合表达，其中，
在所述经密码子优化的SUMO基因与所述人颗粒溶素基因及动物NK lysin基因之间包含linker序列和蛋白酶位点，
所述经密码子优化的SUMO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，
所述linker的长度为3个氨基酸。
根据本发明的利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，其中，所述linker序列为如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
根据本发明的利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，其中，所述蛋白酶位点的序列为TEV或kex2蛋白酶酶切位点。
根据本发明的利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，其中，对人颗粒溶素基因进行了优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
根据本发明的利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，其中，所述动物NK lysin基因为经优化的猪源NK lysin基因、经优化的牛源NKlysin基因或经优化的鸡源NK lysin基因，其中，所述经优化的猪源NK lysin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述经优化的牛源NK lysin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述经优化的鸡源NK lysin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
为了提高人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin的重组表达能力，本发明在毕赤酵母中通过融合蛋白促进目的蛋白的表达。根据现有技术的教导，在蛋清溶菌酶（HEWL）或生长抑素（somatostatin）的N端融合木聚糖酶，可以在毕赤酵母中提高目的蛋白的表达量，然而本申请发现将人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin与木聚糖酶融合后不能检测到融合蛋白的表达，本申请经筛选后选用融合SUMO标签,很好地实现了目的蛋白的表达。
本申请发现SUMO标签与人颗粒溶素及不同动物来源NK lysin的融合蛋白的表达量很低，最终通过优化linker序列提高了融合蛋白的表达量。不同的linker连接序列对融合蛋白的表达有很大的影响，常规的柔性linker不能实现目的蛋白的表达，但本申请的短linker能使目的蛋白很好地分泌表达。
附图说明
图1为人源颗粒溶素或动物来源NK lysin 表达载体的结构示意图；
图2为人源颗粒溶素及不同动物来源NK lysin表达的Western blot印迹图， 其中，A 为SUMO融合蛋白，B为XynCDBF融合蛋白；
图3 为SUMO与人源颗粒溶素通过不同linker融合蛋白小管诱导表达的SDS-PAGE胶图，其中A为短linker连接，B为长linker连接；
图4 为人源颗粒溶素纯化SDS-PAGE胶图；
图5为人源颗粒溶素抑菌实验图。
具体实施方式
下面将本发明中所需材料和方法作进一步说明，如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
1．材料：
菌株与质粒: P．pastoris菌株GS115、毕赤酵母pPIC9K表达载体质粒；大肠杆菌CVCC3367购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
试剂： Yeast nitrogen base（YNB）：酵母抽提物和蛋白胨；BCA蛋白检测试剂盒：d-Sorbitol、d-biotin、质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、DNA聚合酶、T4DNA链接酶、限制性内切酶、蛋白 marker和PAGE配制相关试剂；G418；EZ-ECL化学发光检测试剂盒：抗His-tag mouse mAb及二抗anti-mouse lgG-HRP。
培养基：
（1）LB(Luria-Bertani)液体培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH调至7.0，121℃高温灭菌20分钟；
（2）LB固体培养基：在上述(4)培养基中再加入琼脂粉15 g/L，pH调至7.0，121℃高温灭菌20分钟；
（3）MD(Minimal Dextrose)培养基：琼脂糖15 g/L，葡萄糖20 g/L，经115℃高温灭菌30分钟后加入YNB 1.34 g/L，生物素4×10-4 g/L；
（4）YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，115℃高温灭菌30分钟；
（5）BMGY(Buffered Glycerol-complex)培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10mL/L，经121℃高温灭菌20分钟后加入YNB 1.34 g/L，生物素4×10-4 g/L；
（6）BMMY(Buffered Methanol-complex)培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，经121℃高温灭菌20分钟后加入YNB 1.34 g/L，生物素4×10-4 g/L，以及甲醇5mL/L。
2.仪器：冷冻离心机；PCR仪、凝胶成像系统和基因电转设备；酶标仪；蛋白纯化仪。
实施例1
1. 基因序列优化
为了提高基因在毕赤酵母中的表达量，对基因的核苷酸序列进行毕赤酵母细胞偏好的密码子优化，通过基因合成公司合成密码子优化的SUMO基因、木聚糖酶基因XynCDBF、人颗粒溶素基因、猪NK lysin基因、牛NK lysin基因、鸡NK lysin基因，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1、7、3、4、5、6。
2.构建融合表达载体。
“表达盒”是指包含有表达目的蛋白所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码蛋白的基因序列、终止子，此外还包括信号肽编码序列、linker序列、蛋白酶酶切位点序列等，这些元件是操作性相连的。
在本实施例中构建的表达盒包括以下操作性连接的元件：AOX 1启动子、酿酒酵母a-Factor 信号肽编码基因、SUMO基因序列、人源颗粒溶素基因或动物源NK lysin基因序列、终止子，其中，在酿酒酵母 a-Factor 信号肽编码基因与SUMO基因序列之间还包括蛋白酶酶切位点，用于后续将信号肽与表达产物分离；在SUMO基因与目标蛋白之间有linker序列，以便SUMO基因和目标蛋白都得到很好的表达和折叠；在linker序列之后包含有商业化的或酵母内源的蛋白酶酶切位点，便于体内或体外SUMO蛋白与目标蛋白的分离，所述的蛋白酶酶切位点是TEV或kex2蛋白酶酶切位点；或在目标蛋白基因与终止子之间，还包括蛋白纯化标签的编码基因，从而有利于后续的纯化操作，所述的蛋白纯化标签是6xHis， 表达载体的构建策略参见图1。
按照上述构建策略利用同源重组方法将所需元件构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K EcoRI与NotI之间，得到重组质粒pPIC9K-SUMO-GNLY、pPIC9K-SUMO-NK lysin(pig)、pPIC9K-SUMO-NK lysin (bovine)、pPIC9K-SUMO-NK lysin (chicken)。将其转化到E .coli. DH5α菌株中，得到E .coli.重组菌株，从重组菌株中提取重组质粒。
3. 转化毕赤酵母
将重组质粒线性化后转化毕赤酵母，培养转化有所述表达载体的重组毕赤酵母，从而表达带有融合标签SUMO(或XynCDBF基因)和人颗粒溶素及不同动物来源（猪、牛、鸡）NKlysin。具体操作步骤为：
将所述的表达重组质粒用BglII酶切进行线性化，然后将线性化的重组质粒DNA片段采用电击转化的方法转入新鲜的毕赤酵母GS115感受态细胞中，将孵育后的转化细胞的电击混合液涂布于MD平板，晾干后在30℃培养箱倒置培养。
4.筛选高表达的重组菌株
转化子通过高浓度G418抗性平板筛选、透明圈平板高通量筛选和小管发酵实验筛选，得到高表达的重组菌株。具体操作如下。
挑取MD平板长出的克隆子进行小管诱导表达检测，从培养箱中取出长有克隆子的MD培养板，用无菌的牙签挑取克隆子。然后将该牙签放入酵母培养管中，每支酵母培养管中装有3 mL BMGY培养基。在30℃，220 rpm条件下培养48小时；将酵母培养管中培养的菌液在4,500 rpm条件下离心5分钟，弃去上清，再向酵母培养管中加入1 mL新鲜的BMMY诱导培养基；在30℃，220 rpm条件下诱导培养48小时，以上操作均为无菌环境；将诱导48小时后的酵母培养液倒入2 mL的离心管中，12,000 rpm离心2分钟；取发酵上清液制样进行蛋白SDS-PAGE电泳分析或Western blot分析（图2、图3）。
本申请在研发过程中遇到了重组人颗粒溶素和动物NK lysin不能在毕赤酵母中表达的难题。本申请通过以下技术改进解决了上述问题。
首先，XynCDBF为耐热的碱性木聚糖酶基因， 木聚糖是降解木聚糖最为关键的水解酶，它主要以内切方式作用于木聚糖分子中的 β-1,4木糖苷键，将木聚糖降解为低聚木糖和木糖。 它在毕赤酵母系统中已经得到非常高效的表达，利用它的这个优势，已经成功通过在N端融合XynCDBF促进了蛋清溶菌酶（HEWL）及生长抑素（somatostatin）在毕赤酵母中的表达，并且表达的蛋白具有正常生物活性。本申请也尝试XynCDBF与人颗粒溶素及不同动物来源（猪、牛、鸡）NK lysin融合表达，但如图2所示，并没有检测到XynCDBF与人颗粒溶素及不同动物来源（猪、牛、鸡）NK lysin融合表达（图2中的B图）。 最终筛选使用SUMO标签与人颗粒溶素及不同动物来源（猪、牛、鸡）NK lysin融合表达。 结果发现，SUMO融合的人源颗粒溶素及猪、牛、鸡NK lysin蛋白都得到了很好的表达，尤其是SUMO与人源颗粒溶素的融合蛋白得到了非常高的表达（图2中的A图）。
其次，即使使用SUMO标签，也会发生融合蛋白不表达的现象，本申请最终确定融合蛋白间不同linker对表达量有显著影响。如图3所示，如果使用常规的15个氨基酸长度的柔性linker (GGGGS)3，融合蛋白仅检测到SUMO蛋白的表达，未检测到人颗粒溶素的表达，而短linker（RSG）连接的融合蛋白检测到了SUMO蛋白及人颗粒溶素蛋白的表达。
有文献报道，人颗粒溶素在毕赤酵母中得到表达，但表达量并不高，在摇瓶发酵上清用SDS-PAGE 检测不到表达，用western blot扩大信号可以检测到并不高的表达水平。也有文献报导了猪源NK lysin在毕赤酵母中的表达，表达水平也很低，通过His标签亲和层析浓缩后才检测到了表达。牛源及鸡源NK lysin未见有毕赤酵母中的表达的研究发表。而在本发明中，通过融合SUMO标签及选择合适的linker序列实现了人颗粒溶素及猪、牛、鸡NKlysin在毕赤酵母的表达，用western blot可以明显检测到它们在摇瓶发酵上清中的表达，特别是人源颗粒溶素及牛源NK lysin表达量达到了很高水平（图2中的A图）。 因此本发明通过融合蛋白策略，提高了人源颗粒溶素及动物来源NK lysin在毕赤酵母中的表达水平。
小管诱导表达得到阳性克隆子后，对阳性克隆子进行摇瓶表达检测。将表达菌株接种于新鲜的YPD液体培养基(30 mL)中进行活化培养，在30℃，220 rpm条件下培养48小时；将活化好的菌液，以1%的接种量转接于BMGY液体 (400 mL) 培养基中，在30℃，220 rpm条件下培养48小时；然后收集菌体，4,500 rpm，4℃离心5分钟，弃去上清，再加入BMMY培养基(提前加入5‰的甲醇)，继续在30℃，220 rpm诱导摇瓶培养48–72小时，并且每隔12小时补加一次甲醇，比例为5‰；将诱导培养液12,000 rpm，4℃离心10分钟，收集培养上清液，用于SDS-PAGE蛋白电泳分析及后续蛋白纯化。
在摇瓶发酵培养结束后，从发酵培养基中进行人源颗粒溶素的分离及纯化。分离机纯化方法包括但不限于：硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤法纯化；采用亲和层析纯化。然而，为了提高纯化的效率，本发明还进行了纯化工艺的优化以提高纯化的效率。因在人源颗粒溶素蛋白的氨基酸序列中，富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸，等电点比较高，因此该蛋白带有很强的正电荷，为了减少纯化步骤带来的损失，直接将发酵上清液用0.22 uM滤膜过滤后，采用阳离子交换柱HiTrap进行纯化。大致纯化步骤如下: 在AKTA purifier 25 中，将HiTrap阳离子柱用10 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液平衡；用0–1 mol/L 的NaCl进行梯度洗脱。此时A液为10 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，B液为10 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，1mol/L 的NaCl；对色谱峰收集的蛋白样品进行SDS-PAGE分析。
由图4可知，经过阳离子交换柱纯化后，SUMO蛋白与人源颗粒溶素蛋白得到了很好的分离，纯度可达95%以上。从阳离子交换柱纯化收集的样品经过超滤管换缓存液浓缩至低盐缓冲液（10mM Na3PO4，pH7.4）中。
5. 抑菌活性实验
用上述纯化的人源颗粒溶素进行抑菌活性实验，步骤如下：从长有革兰氏阴性菌E.coli. CVCC3367的平板中挑出菌落，接种于5ml LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养；将过夜新鲜菌液按1-2%转接于20ml LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养，至OD600为0.5，浓度大约为5×107/ml；将菌液用磷酸缓冲液（10mM Na3PO4，0.03% LB）稀释至2×105/ml；取已稀释好的菌液25μl与用保存在磷酸缓冲液中的颗粒溶素蛋白溶液25μl混合，置于37°C培养箱中作用3h；作用完后，混合物用预冷的磷酸缓冲液稀释100倍，涂布菌液于LB培养板上；培养板于37°C培养箱中培养过夜，第二天观察克隆生长情况。图5结果显示，纯化的人源颗粒溶素对E.coli. CVCC3367具有强的抑制作用，证明了它具有生物活性。
以上为本申请的实施例，仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240
gatttcaaac ttgtcaaaca aaatagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300
ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360
ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420
tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480
caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540
tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600
ggtgaagccg gtaacgttaa cggtggtgcc agtggtaccg ctgatttccc gtacgcaaag 660
gtttacattg gtgat 675

Claims (2)

1.一种利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将经密码子优化的SUMO基因分别与人颗粒溶素基因或动物NK lysin基因融合表达，其中，
在所述经密码子优化的SUMO基因与所述人颗粒溶素基因或动物NK lysin基因之间包含linker序列和蛋白酶位点，其中，所述蛋白酶位点的序列为TEV或kex2蛋白酶酶切位点，所述linker的氨基酸序列为RSG；
所述经密码子优化的SUMO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述人颗粒溶素基因为优化的人颗粒溶素基因，所述优化的人颗粒溶素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述动物NK lysin基因为优化的猪源NK lysin基因、优化的牛源NK lysin基因或优化的鸡源NK lysin基因，其中，所述优化的猪源NK lysin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述优化的牛源NK lysin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述优化的鸡源NKlysin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的利用融合蛋白标签促进人颗粒溶素及动物NK lysin在毕赤酵母中表达的方法，其特征在于，所述linker由核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列编码。
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