KR20000059787A - 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents

융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자가결합성이 강한 펩타이드를 융합파트너로 포함하는 XG-L-Y형의 융합단백질을 이용하여 재조합 단백질 또는 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
XG: 융합파트너 (사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)
L : 링커 (코돈을 맞추기 위한 배열 또는 펩타이드 절단효소의 인식 배열)
Y : 재조합 단백질 또는 펩타이드
보다 상세하게는, 사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하면 재조합 단백질의 세포내 생산수율과 응집체내의 순도를 극대화할 수 있을 뿐 아니라 분리된 응집체가 변성제 및 환원제 등을 사용하지 않고도 쉽게 수용성화될 수 있다.

Description

융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법{Preparation of Peptides by Use of Human Glucagon Sequence as a Fusion Expression Partner}
본 발명은 자가결합성이 강한 펩타이드를 융합파트너로 포함하는 XG-L-Y형의 융합단백질을 이용하여 재조합 단백질 또는 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
XG: 융합파트너 (사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)
L: 링커 (코돈을 맞추기 위한 배열 또는 펩타이드 절단 효소의 인식 배열)
Y: 재조합 단백질 또는 펩타이드
보다 상세하게는, 본 발명은 사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로하는 융합단백질을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 방법으로 사람 또는 동물장기에서 어렵게 얻어지던 여러 가지 중요한 단백질들을 미생물에서 생산하려면 목적 단백질의 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 배양하여야 한다. 대장균은 다른 생물체에 비하여 그의 유전자와 대사체계에 대한 정보가 가장 많이 알려져 있어 유전자 재조합 기술에 의하여 유용한 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주로 많이 이용되고 있다. 그러나 목적 단백질을 대장균에서 직접 발현시키는 경우, N-말단에 메티오닌(methionine)이 첨가된 형태로 만들어져 이를 천연형 단백질로 전환시키는 단계가 필요한데, 이는 목적단백질의 N-말단에 메티오닌이 첨가된 상태로 인간이나 기타 동물에 적용되는 경우 면역 반응(immunogenecity)이 유발되거나, 구조가 불안정하여 본래의 단백질 기능을 수행하지 못하는 경우가 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 발현되는 단백질이 항세균성 펩타이드 (antibacterial peptide)와 같이 매우 독성이 강한 경우 숙주의 성장을 저해하기도 하고, 분자량 10,000 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 경우 숙주세포에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되어 안정적인 대량생산이 어렵게 된다.
이러한 현상을 해결하기 위한 방법으로 목적 단백질의 N-말단에 적절한 융합파트너을 융합시켜 발현시키는 방법이 이용된다. 구체적으로는, 선택된 숙주에서 안정적으로 생산되는 것으로 알려진 수용성 단백질을 융합파트너로 이용하여 목적하는 폴리펩타이드를 생산하는 것이 그 한 방법이다. 지금까지 대장균에서 안정적으로 대량생산되는 것으로 알려진 수용성 단백질로는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 말토오즈 결합단백질(maltose binding protein, 45 kDa), 글루타치온-에스-전달효소 (glutathione-S-transferase, 26 kDa) 등이 있다. 그러나 상기 단백질을 융합파트너로 이용하는 경우 이들 융합단백질은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 등으로 용이하게 정제될 수 있는 장점이 있는 반면, 융합파트너가 제조하고자 하는 폴리펩타이드에 비해 상대적으로 크기가 커서 융합 부분의 크기에 따라 펩타이드의 수율이 현저히 떨어진다는 단점이 있다. 또한, 발현된 융합단백질이 세포 독성을 그대로 유지하는 경우 효과적인 제조방법으로 이용될 수 없다.
또다른 방법으로는 융합파트너를 이용, 목적 폴리펩타이드를 세포 내에 불용성 응집체 (inclusion bodies)의 형태로 발현시키는 방법이 사용될 수 있다(Ulman, A. 1984, Gene 29, 27-31; Nilsson, B. et al. 1985, EMBO J. 4, 1075-1080; Di Guan et al. 1988, Gene 67, 21-30; La Vallie, E.R. et al. 1993, Bio/Technology 11, 187-193). 이 방법은 목적 재조합 단백질이 초기 분리과정에서 세포 배양액으로부터 용이하게 분리될 수 있다는 장점이 있으나, 응집체 형성 과정 중 발현된 폴리펩타이드(peptide)의 폴딩(folding) 중간체가 분자 상호간의 다이설파이드 결합 (intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 숙주세포의 다른 단백질 불순물들(샤프론(chaperon), 라이보좀(ribosome), 초기인자 등)과 비선택적으로 결합함으로써 목적 폴리펩타이드의 응집체 내 순도가 떨어지는 단점이 있다(Anna Mituraki et al., 1989, Bio/Technol. 7, 690-697).
단백질이 불용성 응집체로 생산될 경우 이로부터 활성형 단백질을 순수 분리해내기 위해서는 일반적으로 구아니딘-하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride), 요소(urea) 등의 변성제 (denaturant)를 사용하여 용해시킨 후 희석을 통한 리폴딩 (refolding)과정을 거쳐야 한다. 다이설파이드 결합에 의해 생성된 응집체의 경우는 용해를 위해 환원제(reducing agent)까지 함께 사용하여 처리해야 할 뿐 아니라 리폴딩 공정에 아직까지 많은 문제점이 있어 생산수율을 감소시키는 주요 원인이 되기도 한다(Marston, F. A. O. 1986, Biochem. J. 240, 1-12; Mitraki, A. and King, J. 1989, Bio/Technology 7, 690-697).
사람 글루카곤(glucagon)은 췌장의 랑겔한스 알파 세포 (α-cells of the islets of Langerhans)로부터 분비되어 인슐린과의 길항작용에 의해 혈액 내의 포도당 농도를 조절하는 호르몬으로, 저혈당 치료제 또는 내시경 및 X 선 진단보조제로 미국, 일본 등지에서 이미 상업화되어 있는 펩타이드 호르몬이다. 또한 글루카곤은 29개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 대장균 내에서 융합단백질의 형태로 높은 발현율을 가지고 안정적으로 생산되는 것으로 알려져 있다 (Shin et al. 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 364-370). 이처럼 글루카곤은 작은 펩타이드(3.5 kDa) 임에도 불구하고 X-ray 분석 결과 알파-나선구조 (α helix)를 이루고 있으며 안정한 상태를 유지하기 위하여 분자간의 강한 소수성 결합에 의해 스스로 올리고머 (oligomer)를 형성하고 있다(Sasaki, K. et al. 1975 Nature 257, 751-757). 따라서 소수성 자가결합성(hydrophobic self-association)이 강하면서도 작은 크기의 펩타이드인 글루카곤은 세포내 생산수율을 향상시키는 동시에 목적 단백질이 고순도로 포함된 응집체를 생산하기위한 융합파트너로서 매우 효과적으로 이용될 수 있다.
이에 본 발명자들은 재조합 대장균으로부터 외래 단백질을 불용성 응집체의 형태로 안정적으로 대량 생산하기 위해 자가결합성이 강한 사람 글루카곤 또는 그 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 N-말단의 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질의 세포내 생산수율과 응집체내 순도를 극대화하는 제조방법을 개발함은 물론 분리된 응집체가 변성제 및 환원제 등을 전혀 사용하지 않고도 알칼리용액에서 쉽게 수용성화된다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 재조합 대장균으로부터 목적 단백질을 불용성 응집체의 형태로 생산하는데 있어, 배양액 내 생산 수율 및 응집체 내 목적 단백질의 순도를 높이며 생성된 불용성 응집체를 변성제나 환원제를 사용하지 않고도 활성단백질로 분리해 내는, 융합단백질의 형태로 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.
도 1 은 발현 벡터 pT7IL-2의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 2 는 발현 벡터 pT1GIL-2의 제조과정을 나타낸 것이며,
도 3 은 발현 벡터 pT2GIL-2의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 4 는 발현 벡터 pG1IL-2의 제조과정을 나타낸 것이며,
도 5 는 발현 벡터 pG2IL-2의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 6 은 발현 벡터 pG3IL-2의 제조과정을 나타낸 것이며,
도 7 은 각 발현 벡터로 형질전환된 대장균에서 생산되는 재조합 단백질의 세포내 발현율 (expression level, %)을 나타낸 것이고,
도 8 은 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 불용성 침전체내에 포함된 재조합 단백질의 함량 (순도, %)을 나타낸 것이며,
도 9 는 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 융합단백질 침전체의 알칼리 용액에서의 용해도 (%)를 나타낸 것이고,
도 10 은 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 융합단백질 침전체를 비환원성 SDS-PAGE로 분리한 뒤, 웨스턴 블럿(Western blot)을 수행한 결과를 나타낸 것이며,
A)레인 1: 분자량 크기 마커
레인 2: 발현 벡터 pT7IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체
B)레인 1: 분자량 크기 마커
레인 2: 발현 벡터 pT1GIL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체
레인 3: 발현 벡터 pT2GIL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체
레인 4: 발현 벡터 pG1IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체
레인 5: 발현 벡터 pG2IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체
레인 6: 발현 벡터 pG3IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체
도 11 은 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 융합단백질 침전체를 비환원성 SDS-PAGE로 분리한 뒤 수행한 웨스턴 블럿(Western blot) 분석결과로부터 동일 재조합 단백질 분자 간의 결합체가 차지하는 비율을 분석하여 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자가결합성이 강한 사람 글루카곤 또는 그 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질을 대장균으로부터 고순도, 고수율로 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 사람 글루카곤과 사람 종양괴사인자(human tumor necrosis factor) 유래의 이종(異種)의 펩타이드로 이루어진 혼성 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하거나, 사람 글루카곤의 아미노산 서열만이 1∼3 번 반복되는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 고순도의 불용성 응집체(inclusion body)의 형태로 대량생산하는 제조방법을 제공한다.
융합파트너를 이루는 글루카곤은 전체 또는 일부의 아미노산 서열이 이용될 수 있으며, 나아가 일부분이 변형된 유사체를 사용하여도 동일한 효과를 거둘 수 있다.
글루카곤과 함께 융합파트너를 이루는 사람 종양괴사인자 또는 그 뮤테인은 전체 아미노산 서열 또는 그 일부분이 포함될 수 있으며, 이에 더하여 재조합 단백질의 분리를 용이하게 하기 위하여 폴리히스티딘 서열이 융합파트너에 포함될 수 있다.
또한 상기의 융합파트너 단백질에는 엔테로키나아제 절단부위가 포함된 펩타이드가 링커로 이용될 수 있다.
한편 본 발명은 상기 융합파트너를 포함하는 재조합 플라스미드를 이용하여 미생물에서 사람의 단백질 또는 그의 유사체를 얻는 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 상기와 같은 방법으로 대량생산한 재조합 단백질의 불용성 응집체를 알칼리 용액으로 용해한 다음 pH를 다시 중성으로 복원함으로써 간단히 재조합 단백질을 재활성화하여 정제하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 분자량 3.5 kDa의 펩타이드 호르몬이며 대장균 내에서 가용성 단백질로서 안정적으로 발현되는 사람 글루카곤을 이용하여 재조합 단백질을 융합단백질의 형태로 생산한다.
글루카곤은 29개의 아미노산으로 구성된 알파-나선구조를 가지고 있는 펩타이드로서 대장균 내에서 안정적으로 발현되는 펩타이드 호르몬이다. 더욱이 글루카곤은 특유의 알파-나선구조를 안정하게 유지하기 위해 소수성 결합에 의해 스스로 올리고머를 형성하는 자가결합성향이 강하므로 융합파트너로서 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명은 서열목록 1의 아미노산 서열을 갖는 사람 글루카곤의 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 생산한다.
더욱 상세하게는 본 발명은 아래와 같이 서열목록 1의 글루카곤 아미노산 서열 (G 펩타이드)을 포함하는 다양한 펩타이드/폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 제조방법을 제공한다.
1) N-말단으로부터, [사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 1번째에서 57번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 (T1 펩타이드)]-[G-펩타이드]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 폴리펩타이드 (융합파트너 T1G)
2) N-말단으로부터, [사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 8번째에서 12번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 (T2 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열 (His10)]-[G 펩타이드]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 T2G)
3) N-말단으로부터, [G 펩타이드]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 G1)
4) N-말단으로부터, [G 펩타이드가 연속 2번 반복된 펩타이드 (G2 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 G2)
5) N-말단으로부터, [G 펩타이드가 연속 3번 반복된 펩타이드 (G3 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 G3)
상기의 폴리히스티딘 서열은 금속 친화성 및 낮은 pH에서 히스티딘이 양전하를 띄는 성질을 이용하여 금속 킬레이트 수지 (metal chelating resin), 양이온 교환수지 등을 이용하여 융합단백질이 용이하게 정제되도록 한다.
본 발명에서는 사람 인터루킨-2(interleukine-2)를 모델단백질로 하여 상기 5가지 융합파트너들을 이용, 사람 인터루킨-2를 융합단백질의 형태로 고수율로 발현시키며 고순도의 단백질 응집체를 생산한다. 융합단백질을 생산하는 재조합 발현벡터의 제조방법을 구체적으로 살펴보면,
1) 먼저, 사람 인터루킨-2를 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 증폭하고,
2) 준비된 DNA를 T7 프로모터를 포함하는 pT7-7 벡터에 삽입하여 상기 인터루킨-2를 생산할 수 있는 발현벡터 pT7IL-2를 제조하며,
3) 다음, 상기 5가지 융합파트너 (T1G, T2G, G1, G2, G3) 각각의 C-말단 부분에 엔테로키나제(enterokinase) 절단 부위인 Asp Asp Asp Asp Lys(DDDDK, 이하 D4K라 한다)가 첨가된 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 PCR로 증폭한 다음,
4) 상기 증폭된 DNA단편을 발현벡터 pT7IL-2내에 있는 인터루킨-2 유전자의 5'-말단 부분에 삽입하여 인터루킨-2가 상기 D4K 서열을 포함하는 융합단백질로 발현된 후 분리정제 과정에서 엔테로키나제에 의한 절단으로 인터루킨-2 만이 분리되어 생산될 수 있는 벡터를 제조한다 (pT1GIL-2, pT2GIL-2, pGIL-2, pG2IL-2, pG3IL-2).
이외에도 상기 융합파트너들 각각의 C-말단에 엔테로키나제 절단부위가 첨가된 폴리펩타이드 유전자를 코우딩하는 DNA를, lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40, λ(pL/pR) 등의 적당한 프로모터를 갖는 벡터에 직접 삽입하거나, 또는 이들 프로모터와 리보좀 결합부위를 갖는 DNA를 상기 폴리펩타이드(융합파트너-D4K) DNA와 결합시킨 후, 다양한 플라스미드에 삽입하여 벡터 시스템을 구축할 수 있다.
이 벡터 DNA의 3' 말단쪽에 원하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 DNA를 삽입하여 발현벡터 시스템을 구축한 후, 그 발현벡터를 적당한 숙주에 도입하여 만들어진 형질전환체를 배양하여 융합단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에서는 상기 인터루킨-2 융합단백질을 생산하는 발현 벡터들을 적당한 숙주에 하나한 (Hanahan, D. 1985, DNA Cloning 1, 109-135, IRS press)의 방법으로 도입하여 형질전환체를 제조하였다.
구체적으로 상기 발현벡터 pT1GIL-2, pT2GIL-2, pG1IL-2, pG2IL-2, pG3IL-2 등을 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 11월 13일자로 기탁하였다 (수탁번호: 순서대로 KCTC 0555BP, KCTC 0556BP, KCTC 0552BP, KCTC 0553BP, KCTC 0554BP).
상기 형질전환된 재조합 대장균을 적당한 배양 조건에서 배양하여 인터루킨-2를 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있다. 배양된 세포들은 라이소자임 소화(lysozyme digestion), 동결융해, 초음파 파쇄, 또는 프렌치 프래스 (French press) 등으로 처리한 후, 원심분리나 여과를 통해 상기 융합단백질을 함유하는 추출물을 얻는다. 상기 융합단백질은 추출물의 용해, 초여과, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과, 전기영동 그리고 친화성 크로마토그래피 등의 일반적인 정제방법을 통해 분리될 수 있다. 분리된 융합단백질을 적당량의 엔테로키나제로 처리하면 이로부터 인터루킨-2만을 얻을 수 있다.
본 발명의 사람 글루카곤을 포함하는 융합파트너를 이용하여 인터루킨-2를 발현시키면 인터루킨-2 만을 직접 발현시킬 때 보다 발현율이 크게 향상되며 (대장균내 전체 단백질 총량의 50∼60%) 외래단백질이 훨씬 고순도 (응집체 구성 단백질 총량의 약 80%)로 포함된 불용성 응집체를 얻을 수 있다. 이 불용성 응집체는 일반적인 불용성 응집체와는 달리 알칼리성 용액에서 많은 양이 쉽게 용해되는데, 일반적인 불용성 응집체의 경우 변성제나 환원제에 녹인 다음 리폴딩(refolding)과정을 거쳐야 하는 것과는 달리 본 발명의 융합된 재조합 단백질은 알칼리 용해만으로 공정이 끝나기 때문에 리폴딩의 난점을 극복할 수 있다.
이와 같은 특이한 현상은 N-말단의 융합파트너의 역할로 인해 응집체를 이루는 고순도의 재조합 단백질 대부분이 동일 분자들간의 소수성 상호작용에 의해 결합되어 있기 때문이다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인터루킨-2를 직접 발현시키는 pT7IL-2 플라스미드의 제조
인터루킨-2 유전자 및 인터루킨-2 융합단백질의 유전자들을 T7 프로모터 발현 시스템을 이용하여 대장균에서 대량 발현시키기 위해 유전자은행에서 얻은 인터루킨-2 생산균주 (KCTC 8258P)를 이용하였다. 이 균주에 들어있는 플라스미드 pNKM21은 천연형 인터루킨-2의 125번째 아미노산인 시스테인(Cysteine)이 세린(Serine)으로 치환되어있는 변형된 인터루킨-2 유전자를 가지고 있으며 이 유전자는 PL 프로모터에 의해 조절되고있다. 이 플라스미드에 들어있는 인터루킨-2 유전자를 주형으로 하여 133개의 아미노산 서열을 암호하는 인터루킨-2 유전자를 아래와 같은 시발체(primer)를 이용하여 PCR로 증폭하였다.
1) GCA CAT ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT (pNIL)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (pHIL)
PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25mM dNTPs; 50mM KCl; 10mM (NH4)2SO4; 20mM Tris-HCl(pH8.8); 2mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100ng, 각각의 시발체 50pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 95℃/30sec (denaturation), 52℃/30sec (annealing), 72℃/60sec (elongation)로 총 30회 수행하였다(이하 기술되는 모든 PCR은 특별한 언급이 없는한 상기의 조건을 따른 것으로 한다). PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤(agarose gel)을 이용하여 분석하였다. 증폭된 DNA를 퀴아젠 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제한 다음 제한효소 NdeI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현 플라스미드인 pT7-7의 NdeI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7IL-2라고 명명하였다 (도 1 참조).
실시예 2. 사람 글루카곤 유전자를 융합파트너로 이용하는 인터루킨-2 발현 벡터의 제조
가. pT1GIL-2 플라스미드의 제조
U937 세포주로부터 만들어진 사람 단핵세포 cDNA 라이브러리 (Clontech에서 구입)를 주형으로하여 PCR을 이용하여 T1 펩타이드(사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 1번째에서 57번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드)의 DNA를 증폭한 뒤 퀴아젠 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 NdeI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하여 pT7-7 벡터의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7-T1 이라고 명명하였다.
DNA 합성기(DNA synthesizer)로 제조된 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 아래와 같은 시발체를 이용하여 PCR로 단편 1(fragment-1)을 증폭하였다.
1) GCA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAA CAC TCT CAG GGT (BGD4K)
2) TTT GTC GTC GTC GTC CTC GAG AGT GTT CAT CAG CCA (XGD4K)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제하였다.
또한, 플라스미드 pT7IL-2에 들어있는 인터루킨-2 유전자를 주형으로 하여 아래와 같은 시발체를 이용하여 PCR로 단편 2(fragment-2)를 증폭하였다.
1) GAC GAC GAC GAC AAA GCA CCT ACT TCA AGT TCT (XID4K)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제하였다.
단편 1과 단편 2를 각각 주형으로 하여 아래와 같은 시발체를 이용하여 두 번째 PCR을 수행하였다.
1) GCA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAA CAC TCT CAG GGT (BGD4K)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 pT7-T1 벡터의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7-T1GIL-2라고 명명하였다.
플라스미드 pT7-T1GIL-2를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR방법으로 XH6IL-2 단편을 증폭하였다.
1) GCA CTC GAG CAT CAT CAT CAT CAT CAT AGC AGC GAC GAC GAC GAC AAA GCA (XH6)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 XhoI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록하여 pT7-T1GIL-2 벡터의 XhoI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT1GIL-2라고 명명하였다 (도 2 참조).
나. pT2GIL-2 플라스미드의 제조
아미노산 서열 Pro-Ser-Asp-Lys-Pro(사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 8번째에서 12번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드)의 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 폴리히스티딘 서열 (His10) 및 BamHI 제한효소 부위를 첨가한 뒤 pT7-7 벡터의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7-T2 이라고 명명하였다.
플라스미드 pT7-T1GIL-2에 들어있는 글루카곤이 융합된 인터루킨-2 융합단백질의 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 GIL-2(BH) 단편을 증폭하였다.
1) GCA GGA TCC CAC TCT CAG GGT ACT TTC (GBAM)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 pT7-T2 벡터의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT2GIL-2 라고 명명하였다 (도 3 참조).
다. pG1IL-2 플라스미드의 제조
플라스미드 pT1GIL-2에 들어있는 글루카곤이 융합된 인터루킨-2 융합단백질의 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 GH6IL-2(NH) 단편을 증폭하였다.
1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현벡터인 pT7-7의 NdeI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG1IL-2 라고 명명하였다 (도 4 참조).
라. pG2IL-2 플라스미드의 제조
플라스미드 pGIL-2에 들어있는 글루카곤이 융합된 인터루킨-2 융합단백질 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 GH6IL-2(BH) 단편을 증폭하였다.
1) GCA GGA TCC CAC TCT CAG GGT ACT TTC (GBAM)
2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현벡터인 pT7-7의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pGIL-2(BH)라고 명명하였다.
DNA 합성기로 제조된 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 G(NB) 단편을 증폭하였다.
1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)
2) GCA GGA TCC AGT GTT CAT CAG CCA (GBAM-3)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하여 상기 pGIL-2(BH) 벡터의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG2IL-2라고 명명하였다 (도 5 참조).
마. pG3IL-2 플라스미드의 제조
플라스미드 pGIL-2에 들어있는 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 G(EB) 단편을 증폭하였다.
1) GCA GAA TTC CAC TCT CAG GGT ACT (GECO)
2) GCA GGA TCC AGT GTT CAT CAG CCA (GBAM-3)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 EcoRI과 BamHI으로 각각 처리하여 5' 말단에 EcoRI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하여 상기 pGIL-2(BH) 벡터의 EcoRI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG2IL-2(EH)라고 명명하였다.
또한 플라스미드 pGIL-2에 들어있는 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 G(NE) 단편을 증폭하였다.
1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)
2) GCA GAA TTC AGT GTT CAT CAG CCA (GECO-3)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 EcoRI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 EcoRI 제한효소 부위를 갖도록 하여 pG2IL-2(EH) 벡터의 NdeI과 EcoRI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG3IL-2라고 명명하였다 (도 6 참조).
실시예 3. 대장균 형질전환체의 제조
하나한이 기술한 방법에 의해 (Hanahan D. 1985, DNA Cloning 1, 109-135, IRS press) 상기 발현벡터 pT7IL-2, pT1GIL-2, pT2GIL-2, pG1IL-2, pG2IL-2, pG3IL-2 등으로 대장균 BL21(DE3) (Studier, F. A. and Moffatt, B. A. 1986, 189, 113-130)을 형질전환시킨 다음, 앰피실린(amphicillin)에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다.
상기의 선별된 재조합 대장균을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 11년 23일자로 기탁하였다 (수탁번호 : pT7IL-2는 KCTC 0555BP,pT2GIL-2는 KCTC 0556BP, pG1IL-2는 KCTC 0552BP, pG2IL-2는 KCTC 0553BP, pG3IL는 KCTC 0554BP).
실시예 4. 대장균 형질전환체의 배양 및 융합단백질의 생산
하루종일 배양된 종균 배양액의 일부를 본 배양 배지(LB 배지, +100mg/L 앰피실린)에 접종(1%)한 다음 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600가 0.4에 이르렀을 때에 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가 (0.5 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양하였다.
실시예 5. 고생산성 대장균 형질전환체의 선별
상기 각 발현 벡터로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시킨 다음 각각의 플레이트(plate)로부터 10개의 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 종균배양한 후 이것의 일부를 LB 배지 (+100mg/L 앰피실린) 2ml에 접종(1%)한 다음 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600가 0.4에 이르렀을 때에 IPTG를 첨가(0.5mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도한 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양하였다. 세포배양액을 6000rpm에서 원심분리하여 균체 침전물을 회수하였고, 회수된 균체 침전물을 증류수로 현탁한 다음 초음파 파쇄기(Branson Sonifier)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄액 내의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) (14% Tris-Glycine gel)로 분리한 뒤, 농도계(Densitometer, Bio-Rad)를 이용하여 각 재조합 단백질의 발현율을 분석하였다. 분석결과 최대의 발현율을 보이는 콜로니를 LB 배지에서 접종하여 배양한 후 15% 글리세롤을 첨가하여 -70。C에서 보관하였다. 각 단백질의 발현율을 분석한 결과 모든 융합단백질의 발현율이 인터루킨-2를 직접 발현시킨 경우보다 월등히 높았으며, 특히 융합파트너 T2G와 G3을 이용한 경우가 높았는데 G3을 이용한 경우 발현율이 대장균 내 전체 단백질 총량의 60%를 상회하였다(도 7 참조).
실시예 6 세포배양액으로부터 불용성 응집체의 분리
세포배양액을 6000rpm에서 원심분리하여 균체침전물을 회수하고 대장균체 침전물을 증류수로 현탁한 다음 초음파 파쇄기(Branson Sonifier)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄액을 5000g에서 10분간 원심분리한 후 상등액과 침전물을 각각 SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel)로 분석하여 회수여부를 확인하였다. 단백질 응집체는 0.5% TritonX-100으로 2회 세척한 후 필요한 분석을 수행하였다.
실시예 7. 사람 글루카곤 유사 유전자를 융합파트너로 이용하는 인터루킨-2 발현벡터의 제조 및 형질전환체에 의한 융합단백질 발현
글루카곤 서열의 일부(6Phe-〉6Lys;10Tyr-〉10Lys;13Tyr-〉13Lys)를 변형시킴으로써 글루카곤 유사체가 IL-2의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 글루카곤 유사체가 융합된 IL-2 재조합체(GK3IL-2)의 제조 방법은 다음과 같다. 각각 서열목록 2와 서열목록 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 GK3-1과 GK3-2를 주형으로 프라이머 GNDE와 GXHO를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다.
1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)
2) GAC CTC GAG AGT GTT CAT CAG CCA (GXHO)
PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 2% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 퀴아젠 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 XhoI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현 벡터인 pIL-2(NX)의 NdeI과 XhoI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pGK3IL-2 라고 명명하였다. pIL-2(NX)벡터는 pG3IL-2 벡터를 NdeI과 XhoI로 처리하여 G3 서열을 제거한 벡터이다.
유사 글루카곤이 융합된 IL-2 재조합체 (GK3IL-2)의 발현 수준을 상기 실시예와 동일한 방법을 이용, 조사하여 그 발현 수준을 G1IL-2의 경우와 비교하였다. 그 결과는 표 1에 나타낸 바와 같이 특정 유사 글루카곤이 융합된 경우에도 높은 발현수준을 보이고 있다.
GIL-2 GK3IL-2
발현 수준 (%) 25.02 32.89
실험예 1. 발현된 재조합단백질의 순도
상기 실시예 5에서 선별된 고생산성 대장균주를 각각 종균배양을 거쳐 100ml의 LB 배지 (+100 mg/l 앰피실린)에서 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.4에 이르렀을 때에 IPTG를 첨가 (0.5mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도한 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양하였다. 상기 실시예 6의 방법으로 세포 배양액으로부터 생산된 불용성 단백질 응집체를 회수하였다. 회수된 각 응집체를 0.5% 트리톤X-100(TritonX-100)으로 2회 세척한 후 SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel)로 분석하고 농도계(Bio-Rad)를 이용하여 각 응집체 내 재조합 단백질의 순도를 분석하였다.
그 결과 융합파트너 없이 인터루킨-2가 직접 발현된 경우는 응집체 내 순도가 약 40%에 불과했으나 상기 5 가지 융합파트너와 함께 발현된 경우는 응집체 내 재조합 단백질의 순도가 월등히 증가하였다 (도 8 참조). 특히 융합파트너 G3를 이용한 경우는 순도가 약 80% 가까이 증가했음을 확인하였다.
실험예 2. 응집체의 용해 (solubilization) 특성
각 재조합 균주로부터 얻은 불용성 단백질을 동결건조 방법으로 건조하고 각각의 불용성 단백질을 pH 12의 알칼리성 용액에 농도가 50 mg/ml 되도록 현탁한 다음, 같은 pH 12 용액을 이용하여 순차적으로 2배씩 희석하면서 각 불용성 단백질의 용해도를 조사하였다. 각 단계마다 원심분리 (5000 g, 10분)를 통하여 시료를 상등액과 침전물로 분리한 다음 각각을 브래드포드(Bradford) 정량 방법을 이용하여 정량하고 아래와 같은 수식에 의해 용해도를 판정하였다. 침전물은 정량을 위하여 다량의 pH 12 용액에 다시 녹인 다음 정량하였다.
도 9에서 보듯이 인터루킨-2를 직접 발현시켜 얻은 단백질 응집체에 비해 상기 융합파트너와 함께 발현시켜 얻은 단백질 응집체는 그 용해도가 훨씬 향상되었음을 알 수 있다. 특히 융합파트너 G3를 이용한 경우는 8 g/L 이상의 응집체 농도에서도 100%에 가까운 용해도를 보였다. 이와같이 변성제 또는 환원제를 전혀 이용하지 않고 단순히 pH 변화만으로 많은 양의 불용성 단백질 응집체를 용해시킬 수 있는 것은 본 발명에서 확인한 특이한 현상으로 분리정제과정에서 유용하게 이용될 수 있다. 또한 pH 12의 알칼리성 용액에서 쉽게 용해된 재조합 단백질은 용액의 pH를 약 8까지 다시 내림으로 재활성화될 수 있다.
실험예 3. 응집체를 구성하는 단백질 분자 상호간의 결합특성
생성된 응집체 내 구성 단백질 간의 (같은 재조합 단백질 분자 간 또는 재조합 단백질과 다른 숙주 단백질 분자 간의) 결합특성을 알아보기 위하여 다음과 같은 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 수행하였다. 우선, 각 응집체 내 단백질들을 비환원성 SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel)로 분리한 뒤 웨스턴 블럿을 수행하였다. 1차 항체는 쥐에서 유래한 항인터루킨-2 단일항체 IgG1을 이용하였고, 2차 항체로는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 효소가 부착된 염소 유래의 항마우스 항체 IgG가 사용되었다. 도 10에서 보듯이, 인터루킨-2의 직접 발현 (direct expression)에 의해 생성된 단백질 응집체에서는 인터루킨-2가 주로 다른 숙주 단백질들과의 다이설파이드 결합에 의해 다양한 크기의 다량체 (multimer)를 형성하고 있으나 인터루킨-2 융합단백질의 경우는 대부분 재조합 단백질 동일 분자들 간의 소수성 상호작용에 의해 결합되어 있음을 알 수 있다.
농도계(Bio-Rad)를 이용하여 각 단백질 응집체에서 동일 재조합 단백질 분자 결합체 (hydrophobically-bound homologous multimer)가 차지하는 비율을 분석하여 도 11에 나타내었다. 그 결과 인터루킨만을 생산하는 경우에는 동일 재조합 단백질간의 결합체가 약 32%에 불과하였으나, 본 발명의 융합단백질의 형태로 생산된 경우 동일 단백질간의 소수성 결합이 60%이상에서 많게는 90%이상에 달함을 알 수 있었다. 이와같이 동일 단백질 간의 소수성 결합에 의해 생성된 응집체는 상기와 같이 정제과정에서 간단하게 해리될 수 있어 매우 유리하다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 사람 글루카곤의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용함으로써 재조합 단백질을 대장균 내에서 고수율로 발현시킬 수 있고, 동시에 생성된 불용성 응집체 내에서 재조합 단백질의 순도를 크게 향상시킬 수 있다.
또한, 융합된 재조합 단백질 발현과 함께 생성된 응집체는 알칼리성 용액에서 많은 양이 쉽게 용해되어, 일반적으로 변성제나 환원제에 녹인 다음 리폴딩 과정을 거쳐야 되는 불용성 응집체와는 달리 알칼리 용해만으로 공정이 끝나기 때문에 리폴딩의 난점을 극복할 수 있다.

Claims (13)

  1. 형질전환 미생물을 배양하여 폴리펩타이드를 제조함에 있어, 자가 결합성이 강한 펩타이드를 융합파트너로 포함하는 XG-L-Y 형의 융합단백질을 이용한 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
    XG: 융합파트너 (소수성 자가 결합력이 강한 사람 글루카곤 펩타이드 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)
    L: 링커 (코돈을 맞추기 위한 배열 또는 펩타이드 절단효소의 인식 배열)
    Y: 재조합 단백질 또는 펩타이드
  2. 제 1항에 있어서, 서열목록 1에 나타난 사람 글루카곤의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 서열목록 2 또는 서열목록 3에 나타난 변형된 사람 글루카곤의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 사람 종양괴사인자 또는 그 뮤테인의 전체 아미노산 서열 또는 그 일부분이 융합파트너에 포함되는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, Asp Asp Asp Asp Lys (DDDDK, D4K) 아미노산 서열을 갖는 엔테로키나제 절단 부위가 포함된 펩타이드를 링커로 이용하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 폴리히스티딘 서열이 융합파트너에 포함되는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
  7. 제 1항의 방법에 따라 미생물에서 사람 인터루킨-2 또는 그의 유사체를 얻는 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 융합파트너와 결합한 사람 인터루킨-2 또는 그 유사체를 생산하는 대장균 형질전환체를 배양하여 세포를 파쇄하고 단백질 침전체를 얻어 알칼리 용액으로 용해한 다음 pH를 다시 중성조건으로 복원함으로써 재조합 단백질을 재활성화하여 정제하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 정제과정 중 분리된 융합단백질을 엔테로키나제로 절단하여 사람 인터루킨-2 또는 그 유사체를 정제하는 제조방법.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 융합파트너 및 링커의 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제 10항의 발현 벡터에 사람 인터루킨-2 또는 그 유사체를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현 벡터.
  12. pT1GIL-2, pT2GIL-2, pGIL-2, pG2IL-2, pG3IL-2 또는 pGK3IL-2인 발현 벡터.
  13. 제 12항의 발현 벡터로 형질전환된 미생물(수탁번호 : KCTC 0555BP, KCTC 0556BP, KCTC 0552BP, KCTC 0553BP, KCTC 0554BP 또는 KCTC 0582BP).
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