JP2521413B2 - シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ - Google Patents
シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
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- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Description
【０００１】本出願は、タンパク質を細菌内で製造する
方法に関連するものであり、更に詳しくは、アルカリホ
スファターゼまたはエンテロトキシンのシグナル配列を
コードしているＤＮＡと機能的に結合している、成熟ヒ
ト成長ホルモンをコードしているＤＮＡを提供するもの
である。本発明は、形質転換された細菌のペリプラズム
から、真核性タンパク質を、該タンパク質の分解、並び
に非ペリプラズム性タンパク質による汚染を最少限に止
めて単離する方法、細菌宿主内で成熟真核性タンパク質
を合成する方法、さらに、宿主細胞内で高収率にハイブ
リッドプレタンパク質を発現し、このプレタンパク質か
らシグナル配列を切りとり、成熟真核性タンパク質を宿
主細胞のペリプラズム間隙に分泌せしめる様なベクター
に関する知見を提供するものでもある。
方法に関連するものであり、更に詳しくは、アルカリホ
スファターゼまたはエンテロトキシンのシグナル配列を
コードしているＤＮＡと機能的に結合している、成熟ヒ
ト成長ホルモンをコードしているＤＮＡを提供するもの
である。本発明は、形質転換された細菌のペリプラズム
から、真核性タンパク質を、該タンパク質の分解、並び
に非ペリプラズム性タンパク質による汚染を最少限に止
めて単離する方法、細菌宿主内で成熟真核性タンパク質
を合成する方法、さらに、宿主細胞内で高収率にハイブ
リッドプレタンパク質を発現し、このプレタンパク質か
らシグナル配列を切りとり、成熟真核性タンパク質を宿
主細胞のペリプラズム間隙に分泌せしめる様なベクター
に関する知見を提供するものでもある。
【０００２】本出願に関して参照すべき文献は以下の通
りである: 米国特許第４,３７５,５１４号および第４,
４１１,９９４号; 英国特許出願第２,０９１,２６８Ａ
号(１９８２年公開); Ｉ．パルバ(Ｐalva)ら、ジーン
(Ｇene)２２: ２２９−２３５(１９８３); Ｈ．イノウ
エら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ(Ｊ．Ｂac
t．)１４８(２): ４３４−４３９(１９８３); Ｋ．タル
マツジ(Ｔalmadge)ら、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ、Ｕ
ＳＡ(Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ．ＵＳＡ)７７(７): ３９８８−３９
９２(１９８０); Ｋ．タルマツジら、（Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ．
ＵＳＡ）７７(６): ３３６９−３３７３(１９８０); 欧
州特許出願第１１４,６９５号; Ｒ．ピッケン(Ｐicken)
ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Ｉnfectio
n and Ｉmmunity)４２(１): ２６９−２７５(１９８
３); Ｔ．シルハビィ(Ｓilhavy)ら、マイクロバイオロ
ジカル・レビューズ(Ｍicrobiological Ｒeviews)４７
(３): ３１３−３４４(１９８３年９月); Ｊ．カドナガ
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem)２５９(４): ２１４９−２１５４
(１９８４年２月): 国際ＰＣＴ出願ＷＯ８４／００７７
４(１９８４年３月); Ｏ．ゼメル−ドレーセン(Ｏ．Ｚe
mel−Ｄreasen)ら、ジーン２７: ３１５−３２２(１９
８４): Ｓ．ミハエリス(Ｍichaelis)ら、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジィ１５４(１): ３６６−３７４
(１９８３年４月); ヨーロッパ特許出願第１１４,６９
５号(１９８４年８月１日公開); およびＧ．グレイ(Ｇr
ay)ら、バイオテクノロジィpp１６１−１６５(１９８４
年２月)。
りである: 米国特許第４,３７５,５１４号および第４,
４１１,９９４号; 英国特許出願第２,０９１,２６８Ａ
号(１９８２年公開); Ｉ．パルバ(Ｐalva)ら、ジーン
(Ｇene)２２: ２２９−２３５(１９８３); Ｈ．イノウ
エら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ(Ｊ．Ｂac
t．)１４８(２): ４３４−４３９(１９８３); Ｋ．タル
マツジ(Ｔalmadge)ら、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ、Ｕ
ＳＡ(Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ．ＵＳＡ)７７(７): ３９８８−３９
９２(１９８０); Ｋ．タルマツジら、（Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ．
ＵＳＡ）７７(６): ３３６９−３３７３(１９８０); 欧
州特許出願第１１４,６９５号; Ｒ．ピッケン(Ｐicken)
ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Ｉnfectio
n and Ｉmmunity)４２(１): ２６９−２７５(１９８
３); Ｔ．シルハビィ(Ｓilhavy)ら、マイクロバイオロ
ジカル・レビューズ(Ｍicrobiological Ｒeviews)４７
(３): ３１３−３４４(１９８３年９月); Ｊ．カドナガ
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem)２５９(４): ２１４９−２１５４
(１９８４年２月): 国際ＰＣＴ出願ＷＯ８４／００７７
４(１９８４年３月); Ｏ．ゼメル−ドレーセン(Ｏ．Ｚe
mel−Ｄreasen)ら、ジーン２７: ３１５−３２２(１９
８４): Ｓ．ミハエリス(Ｍichaelis)ら、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジィ１５４(１): ３６６−３７４
(１９８３年４月); ヨーロッパ特許出願第１１４,６９
５号(１９８４年８月１日公開); およびＧ．グレイ(Ｇr
ay)ら、バイオテクノロジィpp１６１−１６５(１９８４
年２月)。
【０００３】大腸菌(Ｅ．coli)の如きグラム陰性菌のペ
リプラズムに成熟真核性タンパク質を分泌させることは
当該技術分野における長年の目標であった。ペリプラズ
ムへの分泌は、生産物が培養細胞の内膜と外層膜との間
の間隙に句切られる(とじこめられる)ことになり、細胞
外媒質の厳しい条件にさらされることがないので、望ま
しい目標である。これらの厳しい条件(例えば、希釈、
好ましくない塩類またはpＨ、およびタンパク分解酵素
類等にさらされること)が、バチルス(Ｂacillus)または
酵母を用いる非ペリプラズム分泌系の商業化を困難にし
てきた。本発明の方法によるペリプラズム内へのとじこ
めによって、所望の成熟真核性タンパク質の精製が単純
化されることになる。
リプラズムに成熟真核性タンパク質を分泌させることは
当該技術分野における長年の目標であった。ペリプラズ
ムへの分泌は、生産物が培養細胞の内膜と外層膜との間
の間隙に句切られる(とじこめられる)ことになり、細胞
外媒質の厳しい条件にさらされることがないので、望ま
しい目標である。これらの厳しい条件(例えば、希釈、
好ましくない塩類またはpＨ、およびタンパク分解酵素
類等にさらされること)が、バチルス(Ｂacillus)または
酵母を用いる非ペリプラズム分泌系の商業化を困難にし
てきた。本発明の方法によるペリプラズム内へのとじこ
めによって、所望の成熟真核性タンパク質の精製が単純
化されることになる。
【０００４】多くの天然に生成される分泌タンパク質ま
たは膜タンパク質は、まず、形成途中のプレタンパク
質、あるいは細胞内プレタンパク質として合成される。
これらは、分泌されたとき、成熟タンパク質のアミノ末
端となるアミノ酸残基に“シグナル"ポリペプチドが結
合した形のタンパク質である。このシグナルポリペプチ
ドは、成熟タンパク質の細胞膜通過を可能にするための
ペプチド配列である。このシグナルペプチドは、細胞膜
を通過する際に、目下研究中の機構により、切り離され
る、即ち“プロセッシング(process)"される。もしも、
このプロセッシングが適正に行なわれたならば、得られ
た成熟タンパク質はアミノ末端に余分なシグナルアミノ
酸残基を有さず、適切なアミノ末端アミノ酸を持つこと
になる。即ち、宿主であるグラム陰性細菌細胞により、
シグナル配列をコードしているＤＮＡを含むヘテロロー
ガス(異質)な遺伝子が発現され、次いで、該宿主によっ
てシグナルが適切に切り離されたならば、付加的なメチ
オニン部分を含まない成熟タンパク質が宿主のペリプラ
ズム間隙(即ち、宿主の内膜または細胞膜と外層膜との
間の間隙)に分泌されることになる。また、シグナルタ
ンパク質と、通常このシグナルに付随している成熟タン
パク質の少くともアミノ末端部分が、ヘテロローガスな
タンパク質と結合したままで発現され、プロセッシング
されることにより、融合タンパク質が分泌される宿主−
ベクター系が知られている。
たは膜タンパク質は、まず、形成途中のプレタンパク
質、あるいは細胞内プレタンパク質として合成される。
これらは、分泌されたとき、成熟タンパク質のアミノ末
端となるアミノ酸残基に“シグナル"ポリペプチドが結
合した形のタンパク質である。このシグナルポリペプチ
ドは、成熟タンパク質の細胞膜通過を可能にするための
ペプチド配列である。このシグナルペプチドは、細胞膜
を通過する際に、目下研究中の機構により、切り離され
る、即ち“プロセッシング(process)"される。もしも、
このプロセッシングが適正に行なわれたならば、得られ
た成熟タンパク質はアミノ末端に余分なシグナルアミノ
酸残基を有さず、適切なアミノ末端アミノ酸を持つこと
になる。即ち、宿主であるグラム陰性細菌細胞により、
シグナル配列をコードしているＤＮＡを含むヘテロロー
ガス(異質)な遺伝子が発現され、次いで、該宿主によっ
てシグナルが適切に切り離されたならば、付加的なメチ
オニン部分を含まない成熟タンパク質が宿主のペリプラ
ズム間隙(即ち、宿主の内膜または細胞膜と外層膜との
間の間隙)に分泌されることになる。また、シグナルタ
ンパク質と、通常このシグナルに付随している成熟タン
パク質の少くともアミノ末端部分が、ヘテロローガスな
タンパク質と結合したままで発現され、プロセッシング
されることにより、融合タンパク質が分泌される宿主−
ベクター系が知られている。
【０００５】大腸菌(Ｅ．coli)の如きグラム陰性菌のペ
リプラズムに成熟真核性タンパク質を分泌させることは
当該技術分野における長年の目標であった。ペリプラズ
ム分泌は、生産物が培養細胞の内膜と外層膜との間の間
隙にとじこめられることになり、細胞外媒質の厳しい条
件にさらされることがないので、望ましい目標である。
これらの厳しい条件(例えば、希釈、好ましくない塩類
またはpＨ、およびタンパク分解酵素類等にさらされる
こと)がバチルス(Ｂacillus)または酵母を用いる非ペリ
プラズム分泌系の商業化を困難にしてきた。本発明の方
法によるペリプラズム内へのとじこめによって、所望の
成熟真核性タンパク質の精製が単純化されることにな
る。
リプラズムに成熟真核性タンパク質を分泌させることは
当該技術分野における長年の目標であった。ペリプラズ
ム分泌は、生産物が培養細胞の内膜と外層膜との間の間
隙にとじこめられることになり、細胞外媒質の厳しい条
件にさらされることがないので、望ましい目標である。
これらの厳しい条件(例えば、希釈、好ましくない塩類
またはpＨ、およびタンパク分解酵素類等にさらされる
こと)がバチルス(Ｂacillus)または酵母を用いる非ペリ
プラズム分泌系の商業化を困難にしてきた。本発明の方
法によるペリプラズム内へのとじこめによって、所望の
成熟真核性タンパク質の精製が単純化されることにな
る。
【０００６】本出願人の知る限り、これまで、グラム陰
性菌におけるペリプラズム分泌のために採用されたベク
ター組立て方法は、すべて、真核性シグナルを完全に形
で、あるいは部分的なハイブリッドの形で用いることを
要件としていた。２個の代表的な部分ハイブリッドをコ
ードしている組立て物を以下に図式化して示す。図中、
分泌時に通常起こる開裂の部位を矢印で示した。
性菌におけるペリプラズム分泌のために採用されたベク
ター組立て方法は、すべて、真核性シグナルを完全に形
で、あるいは部分的なハイブリッドの形で用いることを
要件としていた。２個の代表的な部分ハイブリッドをコ
ードしている組立て物を以下に図式化して示す。図中、
分泌時に通常起こる開裂の部位を矢印で示した。
【０００７】
【化１】
【０００８】式Ａで示される、部分的な細菌タンパク質
−成熟真核性タンパク質の融合物の如き組立て物によっ
て分泌されるのは原核性タンパク質と真核性タンパク質
との融合物である。原核性ＤＮＡにコードされている余
分なアミノ末端アミノ酸を除去することは不都合であ
り、時には不可能である。一方、式Ｂに示した組立て物
によれば、成熟タンパク質が分泌されることになるが、
分泌される成熟タンパク質の収量は希望する量よりも少
い。従って、以下に示す様なハイブリッドベクター、即
ち、原核性シグナルと成熟真核性タンパク質の直結(直
接)ハイブリッドとして発現され、これが宿主によって
プロセッシングされ、ペリプラズムに分泌される様なベ
クターを組立てることが有用である。その様なベクター
を以下に示す。
−成熟真核性タンパク質の融合物の如き組立て物によっ
て分泌されるのは原核性タンパク質と真核性タンパク質
との融合物である。原核性ＤＮＡにコードされている余
分なアミノ末端アミノ酸を除去することは不都合であ
り、時には不可能である。一方、式Ｂに示した組立て物
によれば、成熟タンパク質が分泌されることになるが、
分泌される成熟タンパク質の収量は希望する量よりも少
い。従って、以下に示す様なハイブリッドベクター、即
ち、原核性シグナルと成熟真核性タンパク質の直結(直
接)ハイブリッドとして発現され、これが宿主によって
プロセッシングされ、ペリプラズムに分泌される様なベ
クターを組立てることが有用である。その様なベクター
を以下に示す。
【０００９】
【化２】
【００１０】Ｊ．カドナガら(前掲)は、β−ラクタマー
ゼシグナルがニワトリのトリオース・ホスフェート・イ
ソメラーゼのためのＤＮＡに直接結合している、直結ハ
イブリッド型のベクターを調製した。しかしながら、イ
ソメラーゼは、分泌もプロセッシングもされず、ハイブ
リッドの形で、細胞質内に遊離した状態、並びに内膜の
細胞質側に付着した状態のままで残存している様であっ
た。著者らは、大腸菌の内膜を通過して分泌されるため
には、分泌された細菌性成熟タンパク質の少くともはじ
めの部分のアミノ酸配列が絶対に必要であると結論して
いる。
ゼシグナルがニワトリのトリオース・ホスフェート・イ
ソメラーゼのためのＤＮＡに直接結合している、直結ハ
イブリッド型のベクターを調製した。しかしながら、イ
ソメラーゼは、分泌もプロセッシングもされず、ハイブ
リッドの形で、細胞質内に遊離した状態、並びに内膜の
細胞質側に付着した状態のままで残存している様であっ
た。著者らは、大腸菌の内膜を通過して分泌されるため
には、分泌された細菌性成熟タンパク質の少くともはじ
めの部分のアミノ酸配列が絶対に必要であると結論して
いる。
【００１１】これまで、何故、直接ハイブリッド産物の
分泌を達成することが相当に困難なことであったのかは
分らない。しかしながら、出願人は、分泌およびプロセ
ッシングの機構(組織)は細菌内に保持されているので
(それ故、真核性プレタンパク質がプロセッシングされ
た例がいくつかある)、即ち、該機構は幾分融通性を有
するので(Ａ型の融合物のプロセッシングに認められる
様に)、分泌を特に困難にする障害は、細菌が、発現産
物を完全に人工的な開裂部位(即ち、加水分解の起きる
位置のいずれかの側の約１〜３個の残基については原核
性でも真核性でもない部位)でプロセッシングしなけれ
ばならないという組立て物の構造にあるのではないかと
考えた。この仮説、並びにこれまでの失敗および当該技
術者達の懐疑的態度に反して、本出願人は、ペリプラズ
ム性細菌が、原核性シグナルと成熟真核性タンパク質と
の直結融合物を実際にプロセッシングし、しかもそのこ
とにより、本出願人が以前に真核性プレタンパク質につ
いて得た収率よりも高収率で成熟タンパク質を分泌し得
る、ということを見出した。このことは、特に哺乳類の
成長ホルモンの分泌に関して成功を収めた。
分泌を達成することが相当に困難なことであったのかは
分らない。しかしながら、出願人は、分泌およびプロセ
ッシングの機構(組織)は細菌内に保持されているので
(それ故、真核性プレタンパク質がプロセッシングされ
た例がいくつかある)、即ち、該機構は幾分融通性を有
するので(Ａ型の融合物のプロセッシングに認められる
様に)、分泌を特に困難にする障害は、細菌が、発現産
物を完全に人工的な開裂部位(即ち、加水分解の起きる
位置のいずれかの側の約１〜３個の残基については原核
性でも真核性でもない部位)でプロセッシングしなけれ
ばならないという組立て物の構造にあるのではないかと
考えた。この仮説、並びにこれまでの失敗および当該技
術者達の懐疑的態度に反して、本出願人は、ペリプラズ
ム性細菌が、原核性シグナルと成熟真核性タンパク質と
の直結融合物を実際にプロセッシングし、しかもそのこ
とにより、本出願人が以前に真核性プレタンパク質につ
いて得た収率よりも高収率で成熟タンパク質を分泌し得
る、ということを見出した。このことは、特に哺乳類の
成長ホルモンの分泌に関して成功を収めた。
【００１２】哺乳類成長ホルモンは脳下垂体の正常な生
産物である。今日では、哺乳類成長ホルモンは、ある程
度、種間の交差−特意性、似通ったアミノ酸配列の機能
およびコンフォメーションを示すことが知られている。
ヒト成長ホルモン(hＧＨ)は１９１個のアミノ酸からな
り、分子量は約２１,５００である。hＧＨは下垂体機能
減退性小人症の治療に臨床的に用いられている。それは
また、火傷、創傷の治ゆ、発育異常、骨のゆ着、ひ慢性
の胃出血および偽関節の治療にも有効であることが提言
されている。
産物である。今日では、哺乳類成長ホルモンは、ある程
度、種間の交差−特意性、似通ったアミノ酸配列の機能
およびコンフォメーションを示すことが知られている。
ヒト成長ホルモン(hＧＨ)は１９１個のアミノ酸からな
り、分子量は約２１,５００である。hＧＨは下垂体機能
減退性小人症の治療に臨床的に用いられている。それは
また、火傷、創傷の治ゆ、発育異常、骨のゆ着、ひ慢性
の胃出血および偽関節の治療にも有効であることが提言
されている。
【００１３】最近、組換え宿主細胞内でhＧＨが合成さ
れた(例えば、米国特許第４,３４２,８３２号参照)。h
ＧＨは細菌細胞によって著しく破壊されるわけではな
く、適切な位置に開始コドンを含んでいるhＧＨ直接発
現のための遺伝子を適当なプロモーターと結合すれば、
直接、生産させることができる。原核性生物は、生成し
たタンパク質からアミノ末端のメチオニンを除去しない
ことが多いので、米国特許第４,３４２,８３２号の例に
示される如く、細菌性プロモーターの存在下でヘテロロ
ーガスなhＧＨ−ＤＮＡを発現させると、第１番目のア
ミノ酸としてメチオニンを含んでいるhＧＨが得られ
る。この原因は、ＤＮＡのＡＴＧコドン(開始コドン)が
最終的にメチオニンとして発現されることによる。hＧ
Ｈの大腸菌内での生産に関してこれまでに得られた結果
から、この宿主細胞は、hＧＨからメチオニンを開裂す
る細胞内機能をほんの僅かしか持っていない事がわかっ
ており、また、インビトロで上記のことを行うための技
術も限られたものであることが分っている。
れた(例えば、米国特許第４,３４２,８３２号参照)。h
ＧＨは細菌細胞によって著しく破壊されるわけではな
く、適切な位置に開始コドンを含んでいるhＧＨ直接発
現のための遺伝子を適当なプロモーターと結合すれば、
直接、生産させることができる。原核性生物は、生成し
たタンパク質からアミノ末端のメチオニンを除去しない
ことが多いので、米国特許第４,３４２,８３２号の例に
示される如く、細菌性プロモーターの存在下でヘテロロ
ーガスなhＧＨ−ＤＮＡを発現させると、第１番目のア
ミノ酸としてメチオニンを含んでいるhＧＨが得られ
る。この原因は、ＤＮＡのＡＴＧコドン(開始コドン)が
最終的にメチオニンとして発現されることによる。hＧ
Ｈの大腸菌内での生産に関してこれまでに得られた結果
から、この宿主細胞は、hＧＨからメチオニンを開裂す
る細胞内機能をほんの僅かしか持っていない事がわかっ
ており、また、インビトロで上記のことを行うための技
術も限られたものであることが分っている。
【００１４】欧州特許公開第１２７３０５号は、原核性
宿主をプレhＧＨ(通常の、自身の真核性シグナル配列を
有するhＧＨ)で形質転換することにより、該宿主内で成
熟hＧＨを合成し、分泌させることについて開示してい
る。宿主細胞はプレhＧＨを発現し、真核性シグナルを
認識し、さらに、そのプレタンパク質を適切にプロセッ
シングすることができた。次いで、ペリプラズムから成
熟hＧＨを回収した。しかし、その収率は期待される
程、高くなかった。
宿主をプレhＧＨ(通常の、自身の真核性シグナル配列を
有するhＧＨ)で形質転換することにより、該宿主内で成
熟hＧＨを合成し、分泌させることについて開示してい
る。宿主細胞はプレhＧＨを発現し、真核性シグナルを
認識し、さらに、そのプレタンパク質を適切にプロセッ
シングすることができた。次いで、ペリプラズムから成
熟hＧＨを回収した。しかし、その収率は期待される
程、高くなかった。
【００１５】ペリプラズムからタンパク質を回収するの
に、これまでよく用いられてきた方法の１つにスフエロ
プラスト法がある[Ｈ．ノイ(Ｎeu)ら、“バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ(Ｂiochem．Ｂiophy．Ｒes．Ｃomm．)"１７: ２１５
(１９６４)]。この方法では、細胞壁を溶解するのにリ
ゾチームを用いる必要がある。しかし、この方法は、ペ
リプラズム性抽出物中に別の夾雑タンパク質が加わるこ
とを余儀なくさせるばかりか、スフエロプラストが、機
械的にも浸透圧的にももろく壊れ易いことから、特に、
治療用のタンパク質を大規模に回収する目的には不適当
である。その上、リゾチームはかなり高価である。
に、これまでよく用いられてきた方法の１つにスフエロ
プラスト法がある[Ｈ．ノイ(Ｎeu)ら、“バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ(Ｂiochem．Ｂiophy．Ｒes．Ｃomm．)"１７: ２１５
(１９６４)]。この方法では、細胞壁を溶解するのにリ
ゾチームを用いる必要がある。しかし、この方法は、ペ
リプラズム性抽出物中に別の夾雑タンパク質が加わるこ
とを余儀なくさせるばかりか、スフエロプラストが、機
械的にも浸透圧的にももろく壊れ易いことから、特に、
治療用のタンパク質を大規模に回収する目的には不適当
である。その上、リゾチームはかなり高価である。
【００１６】もう一つの方法は浸透性ショック法[Ｈ．
ノイら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リィ)２４０: (９): ３６８５〜３６９２(１９６５)]と
呼ばれるものである。この方法は、まず第一に生菌を高
張液で処理し、次いで、低張性の冷い洗浄水で処理して
ペリプラズムタンパク質を放出させるという２工程を行
う必要があるという理由で不都合な方法である。
ノイら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リィ)２４０: (９): ３６８５〜３６９２(１９６５)]と
呼ばれるものである。この方法は、まず第一に生菌を高
張液で処理し、次いで、低張性の冷い洗浄水で処理して
ペリプラズムタンパク質を放出させるという２工程を行
う必要があるという理由で不都合な方法である。
【００１７】これらの方法は生菌を用いて行われた。し
かし、生菌の使用は、それらのタンパク分解酵素が完全
に活性を有していることから、望ましくない。出願人
が、大腸菌の生きている培養物中から、分泌されたhＧ
Ｈを回収しようとしたところ、起源不明のタンパク分解
的な切断によって、hＧＨの約１０〜２０％から、アミ
ノ末端フェニルアラニンが除去されてしまった。
かし、生菌の使用は、それらのタンパク分解酵素が完全
に活性を有していることから、望ましくない。出願人
が、大腸菌の生きている培養物中から、分泌されたhＧ
Ｈを回収しようとしたところ、起源不明のタンパク分解
的な切断によって、hＧＨの約１０〜２０％から、アミ
ノ末端フェニルアラニンが除去されてしまった。
【００１８】本発明の目的は、ペリプラズムタンパク質
の、改良された回収方法を提供することにある。本発明
の改良法は、回収の際の、タンパク分解酵素によるタン
パク分解的破壊を最少限に止めることができ、また、一
般的にみて、ペリプラズムタンパク質の、細胞内タンパ
ク質による汚染を最少にするという点で、充分に精巧な
ものである。また、本発明によれば、より商業化に適し
た操作法でペリプラズムタンパク質を大量に回収するこ
とができ、従来利用し得た方法よりも大規模な使用が可
能となり、さらに、汚染されたタンパク質製剤を用いる
必要がなくなるのである。
の、改良された回収方法を提供することにある。本発明
の改良法は、回収の際の、タンパク分解酵素によるタン
パク分解的破壊を最少限に止めることができ、また、一
般的にみて、ペリプラズムタンパク質の、細胞内タンパ
ク質による汚染を最少にするという点で、充分に精巧な
ものである。また、本発明によれば、より商業化に適し
た操作法でペリプラズムタンパク質を大量に回収するこ
とができ、従来利用し得た方法よりも大規模な使用が可
能となり、さらに、汚染されたタンパク質製剤を用いる
必要がなくなるのである。
【００１９】また本発明は、細菌性宿主内で、真核性タ
ンパク質を発現させ、ペリプラズムに多量に分泌させる
ことを目的とするものである。
ンパク質を発現させ、ペリプラズムに多量に分泌させる
ことを目的とするものである。
【００２０】さらに本発明は、ペリプラズム内に、成熟
ヒト成長ホルモンを多量に得ることを目的とするもので
ある。
ヒト成長ホルモンを多量に得ることを目的とするもので
ある。
【００２１】さらにまた本発明は、真核性タンパク質の
発現および分泌を容易ならしめる原核性シグナルポリペ
プチドを提供することを目的とするものである。
発現および分泌を容易ならしめる原核性シグナルポリペ
プチドを提供することを目的とするものである。
【００２２】要約 以下に示す方法によって、真核性タンパク質を発現さ
せ、原核性生物のペリプラズム間隙に分泌させた: (a) 分泌され得る直結ハイブリッドを発現するための
ベクターであって、原核性分泌シグナル配列をコードし
ているＤＮＡの３'末端と、成熟タンパク質をコードし
ているＤＮＡの５'末端とが結合した配列を含むベクタ
ーを組立て; (b) (a)のベクターで原核性宿主生物を形質転換し; (c) (b)で形質転換した宿主を培養し; そして、 (d) 宿主のペリプラズムに成熟タンパク質を蓄積させ
る。
せ、原核性生物のペリプラズム間隙に分泌させた: (a) 分泌され得る直結ハイブリッドを発現するための
ベクターであって、原核性分泌シグナル配列をコードし
ているＤＮＡの３'末端と、成熟タンパク質をコードし
ているＤＮＡの５'末端とが結合した配列を含むベクタ
ーを組立て; (b) (a)のベクターで原核性宿主生物を形質転換し; (c) (b)で形質転換した宿主を培養し; そして、 (d) 宿主のペリプラズムに成熟タンパク質を蓄積させ
る。
【００２３】ニワトリのトリオース・ホスフェート・イ
ソメラーゼ以外の成熟真核性タンパク質をコードしてい
るＤＮＡの５'末端にその３'末端が結合している、ペリ
プラズム性細菌の分泌シグナル配列をコードしているＤ
ＮＡ配列が提供される。この点に関し、大腸菌のエンテ
ロトキシン・シグナルをコードしているＤＮＡが特に有
用である。このシグナルＤＮＡは、(a)その３'末端が、
成熟エンテロトキシンをコードしているＤＮＡの５'末
端に、また、(b)その５'末端がエンテロトキシンプロモ
ーターの３'末端にいずれも結合していないという特徴
を有している。この配列は、エンテロトキシンシグナル
含有ベクターの組立てに、１つのカセットとして用いる
のに便利である。好ましいエンテロトキシンはＳＴＩＩ
である。
ソメラーゼ以外の成熟真核性タンパク質をコードしてい
るＤＮＡの５'末端にその３'末端が結合している、ペリ
プラズム性細菌の分泌シグナル配列をコードしているＤ
ＮＡ配列が提供される。この点に関し、大腸菌のエンテ
ロトキシン・シグナルをコードしているＤＮＡが特に有
用である。このシグナルＤＮＡは、(a)その３'末端が、
成熟エンテロトキシンをコードしているＤＮＡの５'末
端に、また、(b)その５'末端がエンテロトキシンプロモ
ーターの３'末端にいずれも結合していないという特徴
を有している。この配列は、エンテロトキシンシグナル
含有ベクターの組立てに、１つのカセットとして用いる
のに便利である。好ましいエンテロトキシンはＳＴＩＩ
である。
【００２４】ＳＴＩＩシャイン−ダルガノ(Ｓhin−Ｄar
gano Ｓ.Ｄ．)配列は、殊に強力なリボゾーム結合部位
であり、このことが収率の向上に寄与する。それは、一
般に、トリプトファン(trp)プロモーターまたはアルカ
リ性ホスファターゼ(ＡＰ)プロモーターの様な、原核性
プロモーターと結合しており、どの様なプロモーター系
とでも用いることができる。
gano Ｓ.Ｄ．)配列は、殊に強力なリボゾーム結合部位
であり、このことが収率の向上に寄与する。それは、一
般に、トリプトファン(trp)プロモーターまたはアルカ
リ性ホスファターゼ(ＡＰ)プロモーターの様な、原核性
プロモーターと結合しており、どの様なプロモーター系
とでも用いることができる。
【００２５】本発明の新規な原核細胞培養は、上記の方
法を用いて宿主細胞を形質転換し、培養することによ
り、生産される。これらの培養物は、(a)成熟真核性タ
ンパク質と、(b)成熟真核性タンパク質と原核性分泌シ
グナル配列との直結ハイブリッド融合タンパク質とを含
む。通常、成熟タンパク質と融合タンパク質との合計重
量の約２５％以上、一般に約９０％までの物質は、細胞
のペリプラズムに存在する成熟タンパク質である。
法を用いて宿主細胞を形質転換し、培養することによ
り、生産される。これらの培養物は、(a)成熟真核性タ
ンパク質と、(b)成熟真核性タンパク質と原核性分泌シ
グナル配列との直結ハイブリッド融合タンパク質とを含
む。通常、成熟タンパク質と融合タンパク質との合計重
量の約２５％以上、一般に約９０％までの物質は、細胞
のペリプラズムに存在する成熟タンパク質である。
【００２６】本発明の一般的な方法は、ヘテロローガス
な、即ち真核性のタンパク質を分泌する様に形質転換さ
れた細胞を生きたまま、または死滅した形で得、タンパ
ク質が外層膜から外へ通過し得る様、凍結と解凍の如き
処理によって外層膜を透過性にし、次いで、分泌された
真核性タンパク質を含むペリプラズムタンパク質を細胞
の残余部分から分離することからなる。ペリプラズムタ
ンパク質の回収を促進する様な変化を細胞膜にもたらす
ために、ホスフェート(りん酸塩)制限条件下で細胞を培
養することが有用である。
な、即ち真核性のタンパク質を分泌する様に形質転換さ
れた細胞を生きたまま、または死滅した形で得、タンパ
ク質が外層膜から外へ通過し得る様、凍結と解凍の如き
処理によって外層膜を透過性にし、次いで、分泌された
真核性タンパク質を含むペリプラズムタンパク質を細胞
の残余部分から分離することからなる。ペリプラズムタ
ンパク質の回収を促進する様な変化を細胞膜にもたらす
ために、ホスフェート(りん酸塩)制限条件下で細胞を培
養することが有用である。
【００２７】また、本発明は、形質転換した細胞をアル
カノールと接触させ、加熱することからなる新規な殺菌
方法を提供するものである。次いで、これらの細胞を、
凍結と解凍からなる冷ショック法で処理すれば、ペリプ
ラズムタンパク質を回収することができる。
カノールと接触させ、加熱することからなる新規な殺菌
方法を提供するものである。次いで、これらの細胞を、
凍結と解凍からなる冷ショック法で処理すれば、ペリプ
ラズムタンパク質を回収することができる。
【００２８】これらの方法は、大腸菌ＳＴＩＩエンテロ
トキシンシグナルと成熟hＧＨとの直結ハイブリッド融
合物を発現し得るグラム陰性菌から、hＧＨを回収する
に際し、特に便利な方法である。
トキシンシグナルと成熟hＧＨとの直結ハイブリッド融
合物を発現し得るグラム陰性菌から、hＧＨを回収する
に際し、特に便利な方法である。
【００２９】図面の説明 図１は、ＳＴII遺伝子、並びにその翻訳および非翻訳領
域のヌクレオチド配列を示す模式図である。そのＳ.Ｄ.
配列中、基本的な部分はヌクレオチド１５５−１６１の
オーバーラインを付した部分である。ＳＴIIシグナルの
推定のアミノ酸配列は残基−２３〜−１、成熟ＳＴIIエ
ンテロトキシンのそれは残基１〜４８に示されている。
図１にはまた、ＳＴIIのプロセッシングサイト(“開裂
部位”と称する)並びに様々な制限酵素の作用部位が示
されている。星印は、ＳＴIIプロモーターがオーバーラ
インを付した８４−８９位および１０８−１１４位の構
造を含むとしたときの、mＲＮＡ合成開始点と思われる
部位を示している。図２−図７は、trpプロモーターの
コントロール下において分泌可能なＳＴII−hＧＨ融合
タンパク質をコードすると共に、ＳＴIIＳ.Ｄ.配列を含
有しているベクター(ptrp−ＳＴII−hＧＨ)の組立て模
式図である。図９はプラスミドtrp−ＳＴII−hＧＨの詳
細な構造を示す模式図である。図８はptrp−ＳＴII−h
ＧＨのtrpプロモーター領域、ＳＴIIシグナルおよびhＧ
Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。図１
０−図１４は、ＡＰプロモーターのコントロール下にお
いて分泌可能なＡＰ−hＧＨおよびＳＴII−hＧＨ融合タ
ンパク質をコードしているベクターであるpＡＰ−１お
よびpＡＰ−ＳＴII−hＧＨ(ただし後者のベクターは、
ＳＴIIＳ.Ｄ.配列をもコードしている)の組立て模式図
である。図１５および図１６はpＡＰ−ＳＴII−hＧＨの
ＡＰプロモーター領域、ＳＴIIシグナルおよびhＧＨ遺
伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。図１７お
よび図１８はpＡＰ−１のＡＰプロモーター領域、ＡＰ
シグナルおよびhＧＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す
模式図である。
域のヌクレオチド配列を示す模式図である。そのＳ.Ｄ.
配列中、基本的な部分はヌクレオチド１５５−１６１の
オーバーラインを付した部分である。ＳＴIIシグナルの
推定のアミノ酸配列は残基−２３〜−１、成熟ＳＴIIエ
ンテロトキシンのそれは残基１〜４８に示されている。
図１にはまた、ＳＴIIのプロセッシングサイト(“開裂
部位”と称する)並びに様々な制限酵素の作用部位が示
されている。星印は、ＳＴIIプロモーターがオーバーラ
インを付した８４−８９位および１０８−１１４位の構
造を含むとしたときの、mＲＮＡ合成開始点と思われる
部位を示している。図２−図７は、trpプロモーターの
コントロール下において分泌可能なＳＴII−hＧＨ融合
タンパク質をコードすると共に、ＳＴIIＳ.Ｄ.配列を含
有しているベクター(ptrp−ＳＴII−hＧＨ)の組立て模
式図である。図９はプラスミドtrp−ＳＴII−hＧＨの詳
細な構造を示す模式図である。図８はptrp−ＳＴII−h
ＧＨのtrpプロモーター領域、ＳＴIIシグナルおよびhＧ
Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。図１
０−図１４は、ＡＰプロモーターのコントロール下にお
いて分泌可能なＡＰ−hＧＨおよびＳＴII−hＧＨ融合タ
ンパク質をコードしているベクターであるpＡＰ−１お
よびpＡＰ−ＳＴII−hＧＨ(ただし後者のベクターは、
ＳＴIIＳ.Ｄ.配列をもコードしている)の組立て模式図
である。図１５および図１６はpＡＰ−ＳＴII−hＧＨの
ＡＰプロモーター領域、ＳＴIIシグナルおよびhＧＨ遺
伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。図１７お
よび図１８はpＡＰ−１のＡＰプロモーター領域、ＡＰ
シグナルおよびhＧＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す
模式図である。
【００３０】詳しい記述 ヘテロローガスなタンパク質とは、通常は、細菌性細胞
が分泌しないタンパク質を指す。このヘテロローガスな
タンパク質は、該ヘテロローガスなタンパク質を分泌す
るように処理された形質転換細胞にとって正常な細胞内
タンパク質であってもよく、あるいは他の微生物由来の
ＤＮＡにコードされているタンパク質であっいもよい
が、通常は、それは真核性タンパク質、そのフラグメン
ト、あるいは真核性タンパク質と原核性タンパク質また
はそのフラグメントとの融合物である。好ましいペリプ
ラズムタンパク質は成熟真核性タンパク質、例えばhＧ
Ｈのごときホルモン、インターフェロンまたはリンホカ
インである。
が分泌しないタンパク質を指す。このヘテロローガスな
タンパク質は、該ヘテロローガスなタンパク質を分泌す
るように処理された形質転換細胞にとって正常な細胞内
タンパク質であってもよく、あるいは他の微生物由来の
ＤＮＡにコードされているタンパク質であっいもよい
が、通常は、それは真核性タンパク質、そのフラグメン
ト、あるいは真核性タンパク質と原核性タンパク質また
はそのフラグメントとの融合物である。好ましいペリプ
ラズムタンパク質は成熟真核性タンパク質、例えばhＧ
Ｈのごときホルモン、インターフェロンまたはリンホカ
インである。
【００３１】本発明において処理される細胞は、通常の
培地あるいは、ベクターまたはヘテロローガスなタンパ
ク質を分泌させるのに使用される突然変異宿主形質転換
体のために調整された培地で、増殖させた形質転換細菌
の培養物から得られる。
培地あるいは、ベクターまたはヘテロローガスなタンパ
ク質を分泌させるのに使用される突然変異宿主形質転換
体のために調整された培地で、増殖させた形質転換細菌
の培養物から得られる。
【００３２】本出願人らは、宿主ベクター系が、プレタ
ンパク質の合成レベルおよび分泌レベルに関して複雑で
あるにもかかわらず、原核性シグナルと所望の真核性タ
ンパク質との直結ハイブリッド融合物を分泌させること
に成功した。種々の直接結合した原核性シグナル配列と
真核性タンパク質配列を用い、trpまたはＡＰプロモー
ターを用いてプラスミドを組立てた。これらのプラスミ
ドの各々を用いて適当な宿主を形質転換し、ペリプラズ
ムと細胞質とにおける生成物の量および分布状況を調べ
た。これらの実験の結果、直結ハイブリッド融合タンパ
ク質により、生物のペリプラズム間隙へ成熟真核性タン
パク質が分泌され、適切にプロセッシングされているこ
とが証明された。この成功した実験結果を以下の表１に
示す。通常のhＧＨ真核性シグナルを用いて得られた結
果を比較のために示した。
ンパク質の合成レベルおよび分泌レベルに関して複雑で
あるにもかかわらず、原核性シグナルと所望の真核性タ
ンパク質との直結ハイブリッド融合物を分泌させること
に成功した。種々の直接結合した原核性シグナル配列と
真核性タンパク質配列を用い、trpまたはＡＰプロモー
ターを用いてプラスミドを組立てた。これらのプラスミ
ドの各々を用いて適当な宿主を形質転換し、ペリプラズ
ムと細胞質とにおける生成物の量および分布状況を調べ
た。これらの実験の結果、直結ハイブリッド融合タンパ
ク質により、生物のペリプラズム間隙へ成熟真核性タン
パク質が分泌され、適切にプロセッシングされているこ
とが証明された。この成功した実験結果を以下の表１に
示す。通常のhＧＨ真核性シグナルを用いて得られた結
果を比較のために示した。
【００３３】
【表１】 真核性タンパク質の発現と分泌に及ぼすプロモーターおよびシグナルペプチド の影響 プロモ 所在地／ プロセッ ーター シグナル 遺伝子 宿主 レベル3 シング4 培地 trp ＳＴII hＧＨ 294または 90％ペリプ 適正 特定培地 Ｗ3110 8 ラズム;１g またはＬＢ ＡＰ ＳＴII hＧＨ Ｗ3110 50％ペリプ 適正 特定培地 ラズム;0.5g −pi1 ＡＰ ＡＰ hＧＨ 294 2 90％ペリプ 適正 ＬＢ／pi ラズム;0.1g trp hＧＨ hＧＨ 294または 90％ペリプ 適正 特定培地 Ｗ3110 ラズム;50mg ／ＬＢ trp ＳＴII hLIF−A6 294 50％ペリプ 適正 ＬＢ ラズム;1.9mg trp ＳＴII mIgG−K7 294 60％ペリプ ＮＤ5 ＬＢ ラズム;ＮＤ １．無機リン酸塩を含有しない培地。 ２．大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６。 ３．実験結果相互の間に、通常、変動が認められた。関
係のあるパラメーターには、培養物の密度、分泌された
タンパク質が回収された時期、その他の変動値が含まれ
る。成熟および融合真核性タンパク質の総量は、ペリプ
ラズムにおける割合(％)と同じく、概略値と考えるべき
である。レベルは、g／５５０nmにおけるＯＤ＝５０と
同等の培養物／lとして求めた。培養物は、振盪フラス
コを用い、１０mlまたは２０mlの量で培養した。 ４．適正なプロセッシングとは、分泌されたタンパク質
が、天然起源のものから単離された場合に見られるもの
と同じアミノ末端を有していることを意味する。 ５．ＮＤとは、実施しなかったことを意味する。 ６．ヒト白血球インターフェロン−Ａ。 ７．ネズミモノクローナル抗−ＣＥＡイムノグロブリン
の軽鎖。 ８．大腸菌ＡＴＣＣ２７３２５。
係のあるパラメーターには、培養物の密度、分泌された
タンパク質が回収された時期、その他の変動値が含まれ
る。成熟および融合真核性タンパク質の総量は、ペリプ
ラズムにおける割合(％)と同じく、概略値と考えるべき
である。レベルは、g／５５０nmにおけるＯＤ＝５０と
同等の培養物／lとして求めた。培養物は、振盪フラス
コを用い、１０mlまたは２０mlの量で培養した。 ４．適正なプロセッシングとは、分泌されたタンパク質
が、天然起源のものから単離された場合に見られるもの
と同じアミノ末端を有していることを意味する。 ５．ＮＤとは、実施しなかったことを意味する。 ６．ヒト白血球インターフェロン−Ａ。 ７．ネズミモノクローナル抗−ＣＥＡイムノグロブリン
の軽鎖。 ８．大腸菌ＡＴＣＣ２７３２５。
【００３４】出願人は、当初、前記の構造式中の原核性
シグナルを用いていくつかの成熟真核性タンパク質を分
泌させることを試みた。その結果、ある例ではタンパク
質が合成されず、また他の例では発現しても分泌が伴わ
なかった。ネズミ−イムノグロブリン重鎖(ＳＴIIシグ
ナルを利用)、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(Ａ
Ｐプロモーターおよびシグナルを利用)またはウシ−プ
ロレニン(大腸菌宿主中、trpプロモーターおよびＳＴII
シグナルを利用)、あるいはhＧＨ[シュードモーナスア
エルギノーサ(Ｐseudomonas aeruginosa)エンテロトキ
シンＡシグナルを利用]のためのベクターを用いて形質
転換した培養物は、プレタンパク質または分泌された成
熟タンパク質を極めて少量、あるいは検出不可能な量、
合成していることが分かった。その他の形質転換培養物
では、ウシ−ガンマーインターフェロン、プロレラキシ
ン、インターロイキン−２あるいはウシ−プロレニンと
ＳＴIIシグナルとの融合物をプロセッシングしなかっ
た。これらの結果は、限定的かつ予備的な実験により、
得られたものである。
シグナルを用いていくつかの成熟真核性タンパク質を分
泌させることを試みた。その結果、ある例ではタンパク
質が合成されず、また他の例では発現しても分泌が伴わ
なかった。ネズミ−イムノグロブリン重鎖(ＳＴIIシグ
ナルを利用)、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(Ａ
Ｐプロモーターおよびシグナルを利用)またはウシ−プ
ロレニン(大腸菌宿主中、trpプロモーターおよびＳＴII
シグナルを利用)、あるいはhＧＨ[シュードモーナスア
エルギノーサ(Ｐseudomonas aeruginosa)エンテロトキ
シンＡシグナルを利用]のためのベクターを用いて形質
転換した培養物は、プレタンパク質または分泌された成
熟タンパク質を極めて少量、あるいは検出不可能な量、
合成していることが分かった。その他の形質転換培養物
では、ウシ−ガンマーインターフェロン、プロレラキシ
ン、インターロイキン−２あるいはウシ−プロレニンと
ＳＴIIシグナルとの融合物をプロセッシングしなかっ
た。これらの結果は、限定的かつ予備的な実験により、
得られたものである。
【００３５】その研究から、原核性シグナルと成熟真核
性タンパク質との直結ハイブリッド融合物は、細菌細胞
によって認識される(即ち、プロセッシングされ、ペリ
プラズムに移行する)ということが明らかになった。こ
のような知見を得、本発明者らは、機能的な構造(組立
て物)を決定するために努力を重ねた。
性タンパク質との直結ハイブリッド融合物は、細菌細胞
によって認識される(即ち、プロセッシングされ、ペリ
プラズムに移行する)ということが明らかになった。こ
のような知見を得、本発明者らは、機能的な構造(組立
て物)を決定するために努力を重ねた。
【００３６】上記の努力は、まず第１に、様々なペリプ
ラズム性細菌タンパク質(例えば酵素やエンテロトキシ
ン)から得たシグナルとの直接(直結)ハイブリッド融合
物をコードしているベクターをスクリーニングすること
に向けて払われた。もしも、そのような組立て物で大腸
菌を形質転換し、培養しても成熟真核性タンパク質が分
泌されなかったならば、他の属のグラム陰性菌につい
て、成熟タンパク質を分泌する能力を有するか否かをス
クリーンしなければならない。最終的には、シグナルペ
プチドのプロセッシングに関する性質を強化したり、改
良したりするために、シグナルペプチドに突然変異を誘
発することもできる。
ラズム性細菌タンパク質(例えば酵素やエンテロトキシ
ン)から得たシグナルとの直接(直結)ハイブリッド融合
物をコードしているベクターをスクリーニングすること
に向けて払われた。もしも、そのような組立て物で大腸
菌を形質転換し、培養しても成熟真核性タンパク質が分
泌されなかったならば、他の属のグラム陰性菌につい
て、成熟タンパク質を分泌する能力を有するか否かをス
クリーンしなければならない。最終的には、シグナルペ
プチドのプロセッシングに関する性質を強化したり、改
良したりするために、シグナルペプチドに突然変異を誘
発することもできる。
【００３７】本発明方法は、グラム陰性菌がＳＴIIエン
テロトキシンシグナルペプチドとの直接(直結)融合物を
認識し得ることを見出した結果、可能となった。さらに
また本発明は、ＳＴII Ｓ.Ｄ.配列の使用によって収率
を高めることができるという発見に基づくものでもあ
る。
テロトキシンシグナルペプチドとの直接(直結)融合物を
認識し得ることを見出した結果、可能となった。さらに
また本発明は、ＳＴII Ｓ.Ｄ.配列の使用によって収率
を高めることができるという発見に基づくものでもあ
る。
【００３８】hＧＨおよびＳＴIIエンテロトキシンプレ
タンパク質の部分的なアミノ酸配列を以下に示す。式
中、それぞれの、成熟タンパク質の開始アミノ酸には下
線を施した。 hＧＨ …leu gln glu gly ser ala phe pro ala met se
r leu… ＳＴII…ala thr asn ala tyr ala ser thr gln ser as
n lys… 上の式から分かるように、これらの２個の配列の、シグ
ナル開裂部位の近辺には事実上、ホモロジイが認められ
ない。従って、宿主細胞がＳＴII−hＧＨハイブリッド
結合部位を認識し、ＳＴII−hＧＨプレタンパク質を正
しくプロセッシングしてhＧＨを分泌し得る、というこ
とは驚くべきことである。
タンパク質の部分的なアミノ酸配列を以下に示す。式
中、それぞれの、成熟タンパク質の開始アミノ酸には下
線を施した。 hＧＨ …leu gln glu gly ser ala phe pro ala met se
r leu… ＳＴII…ala thr asn ala tyr ala ser thr gln ser as
n lys… 上の式から分かるように、これらの２個の配列の、シグ
ナル開裂部位の近辺には事実上、ホモロジイが認められ
ない。従って、宿主細胞がＳＴII−hＧＨハイブリッド
結合部位を認識し、ＳＴII−hＧＨプレタンパク質を正
しくプロセッシングしてhＧＨを分泌し得る、というこ
とは驚くべきことである。
【００３９】本発明に用いられる原核性シグナル配列
は、細菌性の、分泌タンパク質または細胞膜タンパク
質、あるいはそれらの突然変異体からのシグナル配列で
ある。適当なシグナルの例には、ハイドロラーゼ、ホス
ファターゼ、タンパク分解酵素(プロテアーゼ)、抗生物
質耐性酵素類(例、β−ラクタマーゼ)、Ｍal Ｅ(マルト
ース結合タンパク質)のごとき結合タンパク質、並びに
エンテロトキシンに付随するシグナルを挙げることがで
きる。β−ラクタマーゼシグナルは好ましくない。好ま
しいものは、大腸菌の熱安定性(ＳＴ)および熱不安定性
(ＬＴ)エンテロトキシン類に見出される。ＳＴエンテロ
トキシンの内、ＳＴIIが最も好ましい。
は、細菌性の、分泌タンパク質または細胞膜タンパク
質、あるいはそれらの突然変異体からのシグナル配列で
ある。適当なシグナルの例には、ハイドロラーゼ、ホス
ファターゼ、タンパク分解酵素(プロテアーゼ)、抗生物
質耐性酵素類(例、β−ラクタマーゼ)、Ｍal Ｅ(マルト
ース結合タンパク質)のごとき結合タンパク質、並びに
エンテロトキシンに付随するシグナルを挙げることがで
きる。β−ラクタマーゼシグナルは好ましくない。好ま
しいものは、大腸菌の熱安定性(ＳＴ)および熱不安定性
(ＬＴ)エンテロトキシン類に見出される。ＳＴエンテロ
トキシンの内、ＳＴIIが最も好ましい。
【００４０】ピッケンら(前掲)によると、ＳＴIIシグナ
ルポリペプチドのアミノ酸配列は、 ＮＨ2−met lys lys asn ile ala phe leu leu ala ser
met phe val phe ser ile ala thr asn ala か、あるいは上記配列のカルボキシ末端に tyr ala が
付加したものである。実際、大腸菌は、このシグナルを
tyr ala の後方で切断する。従って、本明細書中、以
後に述べるベクターに用いられるＳＴIIシグナルＤＮＡ
は、別に tyr alaをコードしているものも含む。
ルポリペプチドのアミノ酸配列は、 ＮＨ2−met lys lys asn ile ala phe leu leu ala ser
met phe val phe ser ile ala thr asn ala か、あるいは上記配列のカルボキシ末端に tyr ala が
付加したものである。実際、大腸菌は、このシグナルを
tyr ala の後方で切断する。従って、本明細書中、以
後に述べるベクターに用いられるＳＴIIシグナルＤＮＡ
は、別に tyr alaをコードしているものも含む。
【００４１】分泌される真核性タンパク質の割合を増加
させるために原核性シグナルに突然変異を誘発してもよ
い。一般に、シグナルの疎水性核以外の位置のアミノ酸
(例えば、残基−１、−２または−３)をコードしている
コドンに突然変異をもたらすと、シグナルの開裂につい
てより顕著な効果を発揮するようである。突然変異した
ＤＮＡは、突然変異の起きた位置に、野性型のシグナル
とは異なるアミノ酸を発現させる。特定の位置で、各々
異なるアミノ酸をコードしている複数個のコドンを置換
するのが最も便利である。このことは、当業者既知の方
法で行うことができる。例えば、アルカリ性ホスファタ
ーゼに関して行ったＳ．ミハエリスの報告がある(前
掲)。次いで、個々の組立て物を、発現ベクター内にお
いて成熟ヒトタンパク質をコードしているＤＮＡとライ
ゲートし、このベクターを用いて宿主を形質転換し、得
られた形質転換体を培養し、後に詳述するように、各突
然変異体毎に分泌レベルを測定する。最適なレベル(濃
度)の所望のタンパク質を分泌した形質転換体を同定
し、それに関与している組立て物を選出する。ＳＴIIシ
グナルに関する限り、疎水性領域(図１において、残基
−５から−１７まで)におけるアミノ酸の置換は、置換
されたアミノ酸が電荷をもたず、さらに好ましくは疎水
性であれば、シグナルの効力に不利な影響を及ぼさない
と予測される。また、この領域内での１または２個程度
の欠失あるいは挿入も容認し得る。リーダー中、最も感
受性の高い領域は、残基−１および−２１から−２２の
領域である(図１)。これらの残基における突然変異(挿
入または欠失を含む)は、一般に破壊的であるが、時に
は、収率または分泌に関して好結果を与えることもあ
る。本明細書で定義している原核性シグナル突然変異
は、発現されたシグナルが所望のタンパク質、またはそ
の他の真核性タンパク質に通常付随している真核性シグ
ナルに変わってしまう、という程、広範囲に及ぶもので
はない。
させるために原核性シグナルに突然変異を誘発してもよ
い。一般に、シグナルの疎水性核以外の位置のアミノ酸
(例えば、残基−１、−２または−３)をコードしている
コドンに突然変異をもたらすと、シグナルの開裂につい
てより顕著な効果を発揮するようである。突然変異した
ＤＮＡは、突然変異の起きた位置に、野性型のシグナル
とは異なるアミノ酸を発現させる。特定の位置で、各々
異なるアミノ酸をコードしている複数個のコドンを置換
するのが最も便利である。このことは、当業者既知の方
法で行うことができる。例えば、アルカリ性ホスファタ
ーゼに関して行ったＳ．ミハエリスの報告がある(前
掲)。次いで、個々の組立て物を、発現ベクター内にお
いて成熟ヒトタンパク質をコードしているＤＮＡとライ
ゲートし、このベクターを用いて宿主を形質転換し、得
られた形質転換体を培養し、後に詳述するように、各突
然変異体毎に分泌レベルを測定する。最適なレベル(濃
度)の所望のタンパク質を分泌した形質転換体を同定
し、それに関与している組立て物を選出する。ＳＴIIシ
グナルに関する限り、疎水性領域(図１において、残基
−５から−１７まで)におけるアミノ酸の置換は、置換
されたアミノ酸が電荷をもたず、さらに好ましくは疎水
性であれば、シグナルの効力に不利な影響を及ぼさない
と予測される。また、この領域内での１または２個程度
の欠失あるいは挿入も容認し得る。リーダー中、最も感
受性の高い領域は、残基−１および−２１から−２２の
領域である(図１)。これらの残基における突然変異(挿
入または欠失を含む)は、一般に破壊的であるが、時に
は、収率または分泌に関して好結果を与えることもあ
る。本明細書で定義している原核性シグナル突然変異
は、発現されたシグナルが所望のタンパク質、またはそ
の他の真核性タンパク質に通常付随している真核性シグ
ナルに変わってしまう、という程、広範囲に及ぶもので
はない。
【００４２】突然変異による適正化は、実質上同じシグ
ナルを含むベクターを用い、宿主をある宿主から他の宿
主に切り換える場合に特に望ましい。その理由は、シグ
ナル−真核性タンパク質融合物の開裂および成熟タンパ
ク質の移送に関与している細菌酵素系におけるアレル変
異体は、適切に修飾された原核性シグナルを、より容易
に認識し得ると思われるからである。
ナルを含むベクターを用い、宿主をある宿主から他の宿
主に切り換える場合に特に望ましい。その理由は、シグ
ナル−真核性タンパク質融合物の開裂および成熟タンパ
ク質の移送に関与している細菌酵素系におけるアレル変
異体は、適切に修飾された原核性シグナルを、より容易
に認識し得ると思われるからである。
【００４３】本発明によれば、適当なグラム陰性宿主と
シグナルとが選択されたなら、どのような真核性タンパ
ク質、突然変異体または誘導体をも分泌させることがで
きる(勿論、そのタンパク質自体がグラム陰性菌内で発
現され得ることを条件とする)。そのような真核性タン
パク質には、リンホカイン、イムノグロブリンおよびホ
ルモンが含まれる。本明細書中に用いる真核性タンパク
質は通常、ウシ、ブタおよびヒト起源の哺乳類タンパク
質である。ヒト成長ホルモンのような成長ホルモンに関
して、特に優れた結果が得られる。
シグナルとが選択されたなら、どのような真核性タンパ
ク質、突然変異体または誘導体をも分泌させることがで
きる(勿論、そのタンパク質自体がグラム陰性菌内で発
現され得ることを条件とする)。そのような真核性タン
パク質には、リンホカイン、イムノグロブリンおよびホ
ルモンが含まれる。本明細書中に用いる真核性タンパク
質は通常、ウシ、ブタおよびヒト起源の哺乳類タンパク
質である。ヒト成長ホルモンのような成長ホルモンに関
して、特に優れた結果が得られる。
【００４４】直結ハイブリッド融合物を発現させるため
に、宿主の形質転換に用いられるベクターは、当業者に
一般的に知られている常法によって組立てられる。それ
らのベクター内で、原核性シグナルをコードしているＤ
ＮＡは所望のタンパク質をコードしているＤＮＡと、直
接結合している。このことは、正常な細菌性開裂部位の
直ぐ上流のアミノ酸をコードしているシグナルＤＮＡ
と、所望の成熟真核性タンパク質の最初のアミノ酸をコ
ードしているＤＮＡとが直結しており、その間には、成
熟原核性タンパク質または正常な真核性プレ配列に由来
する介在残基配列が全く存在していないことを意味す
る。そのような直接結合は、実施例中に示したＭ１３欠
失性突然変異誘発法等の既知の手法で行うことができ
る。別法として、シグナルおよび開裂部位の領域をコー
ドしているＤＮＡを化学合成することもできる。このＤ
ＮＡを、残りの真核性タンパク質をコードしているＤＮ
Ａと、平滑末端ライゲーションにより、あるいは適宜な
制限酵素部位を介してライゲートする。
に、宿主の形質転換に用いられるベクターは、当業者に
一般的に知られている常法によって組立てられる。それ
らのベクター内で、原核性シグナルをコードしているＤ
ＮＡは所望のタンパク質をコードしているＤＮＡと、直
接結合している。このことは、正常な細菌性開裂部位の
直ぐ上流のアミノ酸をコードしているシグナルＤＮＡ
と、所望の成熟真核性タンパク質の最初のアミノ酸をコ
ードしているＤＮＡとが直結しており、その間には、成
熟原核性タンパク質または正常な真核性プレ配列に由来
する介在残基配列が全く存在していないことを意味す
る。そのような直接結合は、実施例中に示したＭ１３欠
失性突然変異誘発法等の既知の手法で行うことができ
る。別法として、シグナルおよび開裂部位の領域をコー
ドしているＤＮＡを化学合成することもできる。このＤ
ＮＡを、残りの真核性タンパク質をコードしているＤＮ
Ａと、平滑末端ライゲーションにより、あるいは適宜な
制限酵素部位を介してライゲートする。
【００４５】アルカリ性ホスファターゼシグナルまたは
ＳＴIIシグナルをコードしているＤＮＡは、所望の成熟
真核性タンパク質をコードしているＤＮＡと、以下に示
すいずれかの形で直接的に結合する。真核性タンパク質
が成長ホルモンである場合、５'側の最初の２個のコド
ンとして、少なくとも、hＧＨのアミノ末端の最初の２
個のアミノ酸(即ち、ＮＨ2−phe pro)をコードしている
コドン、さらに好ましくは、hＧＨの最初の１５アミノ
末端アミノ酸をコードしているコドンを含有しているＤ
ＮＡに、シグナルを結合する。この配列は、一般に、h
ＧＨ、ウシ成長ホルモン(アミノ末端配列 pro ala met
ser leu を有する)またはブタ成長ホルモン(アミノ末端
配列 phe pro ala met pro leu を有する)等の成長ホル
モン、並びにそのアレル変異体をコードしているＤＮＡ
配列の一部を構成している。
ＳＴIIシグナルをコードしているＤＮＡは、所望の成熟
真核性タンパク質をコードしているＤＮＡと、以下に示
すいずれかの形で直接的に結合する。真核性タンパク質
が成長ホルモンである場合、５'側の最初の２個のコド
ンとして、少なくとも、hＧＨのアミノ末端の最初の２
個のアミノ酸(即ち、ＮＨ2−phe pro)をコードしている
コドン、さらに好ましくは、hＧＨの最初の１５アミノ
末端アミノ酸をコードしているコドンを含有しているＤ
ＮＡに、シグナルを結合する。この配列は、一般に、h
ＧＨ、ウシ成長ホルモン(アミノ末端配列 pro ala met
ser leu を有する)またはブタ成長ホルモン(アミノ末端
配列 phe pro ala met pro leu を有する)等の成長ホル
モン、並びにそのアレル変異体をコードしているＤＮＡ
配列の一部を構成している。
【００４６】本発明に用いるのに適したベクターは、直
結ハイブリッド融合物のＤＮＡを、複製および翻訳を行
わせる配列と、機能的(operably)に結合させることによ
り、組立てられる。mＲＮＡの翻訳を有効ならしめる配
列には、原核性シグナルの上流に位置するＳ.Ｄ.配列が
含まれる。本発明に用いるには、そのＳ.Ｄ.配列がＳＴ
II由来のものであって、ＳＴII遺伝子中に存在する天然
の介在配列(ＴＴＴＴ)により、原核性シグナルの開始コ
ドンと隔てられていることが好ましい。このような構造
物は、以下に述べるように、Ｓ.Ｄ.配列と、ＳＴII遺伝
子起源の正常な介在配列とを完備しているＳＴIIシグナ
ルを単離することにより、最も容易に得ることができ
る。しかしながら、ＳＴII遺伝子のこの部分の長さは８
０bpにしかすぎないので、既知の化学的手法でその必要
な配列を単純に合成することも実際的な方法である。こ
の方法は、広範な変異をシグナルにもたらそうと計画し
ている場合には特に好ましい。図８に示した組立て物
は、２個のＳ.Ｄ.配列を含有しており、１つは上流にあ
ってtrpプロモーターから与えられたＳ.Ｄ.配列であ
り、もう１つは、ＳＴIIシグナルＤＮＡと正常な関係に
あるＳＴII Ｓ.Ｄ.である。出願人は、上流の非−ＳＴI
I Ｓ.Ｄ.配列は不要であると考えている。ＡＰシグナル
のごときその他の原核性シグナル配列も、長さが１００
bpより短い傾向があるので、化学的に合成することがで
きる。
結ハイブリッド融合物のＤＮＡを、複製および翻訳を行
わせる配列と、機能的(operably)に結合させることによ
り、組立てられる。mＲＮＡの翻訳を有効ならしめる配
列には、原核性シグナルの上流に位置するＳ.Ｄ.配列が
含まれる。本発明に用いるには、そのＳ.Ｄ.配列がＳＴ
II由来のものであって、ＳＴII遺伝子中に存在する天然
の介在配列(ＴＴＴＴ)により、原核性シグナルの開始コ
ドンと隔てられていることが好ましい。このような構造
物は、以下に述べるように、Ｓ.Ｄ.配列と、ＳＴII遺伝
子起源の正常な介在配列とを完備しているＳＴIIシグナ
ルを単離することにより、最も容易に得ることができ
る。しかしながら、ＳＴII遺伝子のこの部分の長さは８
０bpにしかすぎないので、既知の化学的手法でその必要
な配列を単純に合成することも実際的な方法である。こ
の方法は、広範な変異をシグナルにもたらそうと計画し
ている場合には特に好ましい。図８に示した組立て物
は、２個のＳ.Ｄ.配列を含有しており、１つは上流にあ
ってtrpプロモーターから与えられたＳ.Ｄ.配列であ
り、もう１つは、ＳＴIIシグナルＤＮＡと正常な関係に
あるＳＴII Ｓ.Ｄ.である。出願人は、上流の非−ＳＴI
I Ｓ.Ｄ.配列は不要であると考えている。ＡＰシグナル
のごときその他の原核性シグナル配列も、長さが１００
bpより短い傾向があるので、化学的に合成することがで
きる。
【００４７】前記のＳ.Ｄ.−シグナル−タンパク質配列
はプロモーターのコントロール下で転写される。そのプ
ロモーターは、選択された原核性シグナルに通常伴って
いるプロモーター以外の、原核性プロモーターであるこ
とが好ましい。具体的に好ましいのはＡＰプロモーター
であるが、tac、trpまたはラクトース[Ｄ．ゲッデル(Ｇ
oeddel)ら、ネイチャー(Ｎature)２８１: ５４４(１９
７９)]プロモーターのような他のプロモーターでもよ
い。これらが最も普通に用いられるプロモーターである
が、その他の微生物プロモーターも発見されて使用され
ており、それらの詳しいヌクレオチド配列に関する報告
もあるので、当業者はそれらをプラスミドベクターと機
能的にライゲートすることができる[シーベンリスト(Ｓ
iebenlist)ら、セル(Ｃell)２０:２６９(１９８０)]。
プロモーターは、分泌される真核性タンパク質の割合に
は影響を及ぼさないようである。しかしながら、プロモ
ーターとシグナル配列の両要素の相互作用が発現レベル
に影響するので、発現に最適なこれら両要素の組合せを
スクリーンすることが望ましい。例えば、表１におい
て、ＡＰプロモーターとの組合せにおいて、ＡＰシグナ
ルをＳＴIIシグナルで置換した場合の結果を比較された
い。
はプロモーターのコントロール下で転写される。そのプ
ロモーターは、選択された原核性シグナルに通常伴って
いるプロモーター以外の、原核性プロモーターであるこ
とが好ましい。具体的に好ましいのはＡＰプロモーター
であるが、tac、trpまたはラクトース[Ｄ．ゲッデル(Ｇ
oeddel)ら、ネイチャー(Ｎature)２８１: ５４４(１９
７９)]プロモーターのような他のプロモーターでもよ
い。これらが最も普通に用いられるプロモーターである
が、その他の微生物プロモーターも発見されて使用され
ており、それらの詳しいヌクレオチド配列に関する報告
もあるので、当業者はそれらをプラスミドベクターと機
能的にライゲートすることができる[シーベンリスト(Ｓ
iebenlist)ら、セル(Ｃell)２０:２６９(１９８０)]。
プロモーターは、分泌される真核性タンパク質の割合に
は影響を及ぼさないようである。しかしながら、プロモ
ーターとシグナル配列の両要素の相互作用が発現レベル
に影響するので、発現に最適なこれら両要素の組合せを
スクリーンすることが望ましい。例えば、表１におい
て、ＡＰプロモーターとの組合せにおいて、ＡＰシグナ
ルをＳＴIIシグナルで置換した場合の結果を比較された
い。
【００４８】プロモーター−Ｓ.Ｄ.−シグナル配列は、
宿主細胞に適合し得るレプリコン配列を含有しているベ
クター内に存在している。このベクターは、通常、ファ
ージではなく、プラスミドである。ベクターは、複製部
位と共に、形質転換された細胞の同定を容易ならしめる
ために、表現型標識配列を含んでいる。例えば、大腸菌
は一般に、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に
係る遺伝子を含有しているプラスミドであるpＢＲ３２
２[ボリバー(Ｂolivar)ら、ジーン、２:９５(１９７
７)]誘導体によって形質転換される。
宿主細胞に適合し得るレプリコン配列を含有しているベ
クター内に存在している。このベクターは、通常、ファ
ージではなく、プラスミドである。ベクターは、複製部
位と共に、形質転換された細胞の同定を容易ならしめる
ために、表現型標識配列を含んでいる。例えば、大腸菌
は一般に、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に
係る遺伝子を含有しているプラスミドであるpＢＲ３２
２[ボリバー(Ｂolivar)ら、ジーン、２:９５(１９７
７)]誘導体によって形質転換される。
【００４９】ＤＮＡ配列が他の配列に “機能的に、ま
たは操作可能にライゲートまたは結合している” とい
うことは、特定のＤＮＡが他のＤＮＡ配列に影響を及ぼ
すことを意味する。このことは、一般に、第１のＤＮＡ
が、そのものが機能的にライゲートしているＤＮＡの転
写または最終的な翻訳をコントロールしているか、ある
いは、翻訳されたタンパク質のプロセッシングに影響し
ていることを意味する。例えば、プロモーターは、それ
が、プレタンパク質mＲＮＡの翻訳速度に影響を及ぼし
ている場合には、該プレタンパク質をコードしているＤ
ＮＡを機能的にライゲートしていることになる。また、
シグナルポリペプチドは、それが、所望のタンパク質を
コードしているＤＮＡと解読相内にあり、かつ該ＤＮＡ
と直接ライゲートしている場合には、該タンパク質をコ
ードしているＤＮＡと機能的にライゲートしていること
になる。ある組成物について、“ライゲートしている”
という語句は、その組成物がライゲーションによって製
造され得るという意味においてのみ定義されると解釈す
べきでない。そうではなく、プラスミド内で機能的にラ
イゲートしている要素を、一体のものとして化学的に合
成することができる。
たは操作可能にライゲートまたは結合している” とい
うことは、特定のＤＮＡが他のＤＮＡ配列に影響を及ぼ
すことを意味する。このことは、一般に、第１のＤＮＡ
が、そのものが機能的にライゲートしているＤＮＡの転
写または最終的な翻訳をコントロールしているか、ある
いは、翻訳されたタンパク質のプロセッシングに影響し
ていることを意味する。例えば、プロモーターは、それ
が、プレタンパク質mＲＮＡの翻訳速度に影響を及ぼし
ている場合には、該プレタンパク質をコードしているＤ
ＮＡを機能的にライゲートしていることになる。また、
シグナルポリペプチドは、それが、所望のタンパク質を
コードしているＤＮＡと解読相内にあり、かつ該ＤＮＡ
と直接ライゲートしている場合には、該タンパク質をコ
ードしているＤＮＡと機能的にライゲートしていること
になる。ある組成物について、“ライゲートしている”
という語句は、その組成物がライゲーションによって製
造され得るという意味においてのみ定義されると解釈す
べきでない。そうではなく、プラスミド内で機能的にラ
イゲートしている要素を、一体のものとして化学的に合
成することができる。
【００５０】前記のベクターによって形質転換される宿
主細胞は、(a)２つの細胞膜の間にペリプラズム間隙を
有し、(b)細胞内部でベクターが複製可能であり、さら
に(c)細胞内部でプレタンパク質が発現されると共に、
プロセッシングされ得る細菌である。本発明に係る宿主
は通常グラム陰性の生物、とりわけ、腸内細菌(Ｅntero
bacteriaceae)またはシュードモナス(Ｐseudomonas)に
属する生物またはその突然変異体である。宿主ベクター
系(ベクターで形質転換された宿主)として好ましいの
は、ハイブリッド融合物の発現をコントロールするプロ
モーターが構成的に活性化され、あるいは抑制されるよ
うな系である。組織的な突然変異体とは、特定のタンパ
ク質(本明細書においては、プロモート(促進)された直
接ハイブリッド融合物であり、ある場合には、通常の状
態でプロモートされるタンパク質)を、プロモーターの
抑制または活性化を想定した、誘導その他培養条件の変
化をもたらすことなしに分泌させ得るような突然変異を
指す。宿主−ベクター系が組織的にプロモートされるよ
う、宿主および／またはプロモーターに突然変異を誘発
させることができる。ベクター内に使用するプロモータ
ーに、それが、もはやリプレッサータンパク質によって
抑制され得ないような突然変異をもたらすことができ
る。そのような突然変異は知られている。別法として、
宿主細胞に、それが野性型または突然変異を起こしてい
ないプロモーターのコントロール下で組織的なものとな
るような突然変異を誘発することができる。そのような
宿主は、突然変異体アレルを含む、一般に入手可能な菌
株から、形質導入を介して都合良く調製することができ
る。pho Ｔまたはpho Ｒ突然変異体アレルを担っている
ＡＰプロモーター含有ベクターで宿主細胞を形質転換す
ることが好ましい。前者は、リン酸イオン輸送タンパク
質の暗号遺伝子における、不能化突然変異体と思われて
いる。また、pho Ｒ突然変異体は、リプレッサータンパ
ク質の暗号遺伝子における、不能化突然変異体である。
これらの突然変異体アレルは当該技術分野で広く知られ
ており、入手することができ、既知の技術によって宿主
内に導入することができる。驚くべきことに、組織的な
宿主は、ホスフェート欠失法によって誘導された野性型
の宿主よりも高い比率(％)で発現産物をプロセッシング
した。
主細胞は、(a)２つの細胞膜の間にペリプラズム間隙を
有し、(b)細胞内部でベクターが複製可能であり、さら
に(c)細胞内部でプレタンパク質が発現されると共に、
プロセッシングされ得る細菌である。本発明に係る宿主
は通常グラム陰性の生物、とりわけ、腸内細菌(Ｅntero
bacteriaceae)またはシュードモナス(Ｐseudomonas)に
属する生物またはその突然変異体である。宿主ベクター
系(ベクターで形質転換された宿主)として好ましいの
は、ハイブリッド融合物の発現をコントロールするプロ
モーターが構成的に活性化され、あるいは抑制されるよ
うな系である。組織的な突然変異体とは、特定のタンパ
ク質(本明細書においては、プロモート(促進)された直
接ハイブリッド融合物であり、ある場合には、通常の状
態でプロモートされるタンパク質)を、プロモーターの
抑制または活性化を想定した、誘導その他培養条件の変
化をもたらすことなしに分泌させ得るような突然変異を
指す。宿主−ベクター系が組織的にプロモートされるよ
う、宿主および／またはプロモーターに突然変異を誘発
させることができる。ベクター内に使用するプロモータ
ーに、それが、もはやリプレッサータンパク質によって
抑制され得ないような突然変異をもたらすことができ
る。そのような突然変異は知られている。別法として、
宿主細胞に、それが野性型または突然変異を起こしてい
ないプロモーターのコントロール下で組織的なものとな
るような突然変異を誘発することができる。そのような
宿主は、突然変異体アレルを含む、一般に入手可能な菌
株から、形質導入を介して都合良く調製することができ
る。pho Ｔまたはpho Ｒ突然変異体アレルを担っている
ＡＰプロモーター含有ベクターで宿主細胞を形質転換す
ることが好ましい。前者は、リン酸イオン輸送タンパク
質の暗号遺伝子における、不能化突然変異体と思われて
いる。また、pho Ｒ突然変異体は、リプレッサータンパ
ク質の暗号遺伝子における、不能化突然変異体である。
これらの突然変異体アレルは当該技術分野で広く知られ
ており、入手することができ、既知の技術によって宿主
内に導入することができる。驚くべきことに、組織的な
宿主は、ホスフェート欠失法によって誘導された野性型
の宿主よりも高い比率(％)で発現産物をプロセッシング
した。
【００５１】宿主細胞は、直結ハイブリッド融合物のＤ
ＮＡの転写をコントロールするために用いたプロモータ
ーによって正常にプロモートされた宿主タンパク質を発
現する(必ずしも構成的である必要はない)。例えば、大
腸菌pho Ａ欠失突然変異体(これは活性なＡＰを発現し
得ない)またはＡＰ−合成細胞を宿主として用いること
ができる; 細胞からのＡＰの活性な分泌は、必ずしも真
核性タンパク質の分泌を妨げない。通常、宿主細菌はシ
グナルの起源である菌と同じ種のものを用いる。
ＮＡの転写をコントロールするために用いたプロモータ
ーによって正常にプロモートされた宿主タンパク質を発
現する(必ずしも構成的である必要はない)。例えば、大
腸菌pho Ａ欠失突然変異体(これは活性なＡＰを発現し
得ない)またはＡＰ−合成細胞を宿主として用いること
ができる; 細胞からのＡＰの活性な分泌は、必ずしも真
核性タンパク質の分泌を妨げない。通常、宿主細菌はシ
グナルの起源である菌と同じ種のものを用いる。
【００５２】宿主細胞の培養に通常用いられるあらゆる
培地が形質転換体の培養に適するが、野性型の宿主(Ｗ
３１１０pho Ａ、pho Ｔまたはpho Ａ、pho Ｒ以外)に
よる真核性タンパク質の分泌には、宿主培地の組成が強
い影響を及ぼす。酵母エキス含有培地は、トリプトン
(カゼインのトリプシン消化物)または１９アミノ酸の合
成混合物を含む培地に比べて分泌を改善させた。酵母エ
キスの１またはそれ以上の成分が分泌の活性化に役立つ
ように思われる。
培地が形質転換体の培養に適するが、野性型の宿主(Ｗ
３１１０pho Ａ、pho Ｔまたはpho Ａ、pho Ｒ以外)に
よる真核性タンパク質の分泌には、宿主培地の組成が強
い影響を及ぼす。酵母エキス含有培地は、トリプトン
(カゼインのトリプシン消化物)または１９アミノ酸の合
成混合物を含む培地に比べて分泌を改善させた。酵母エ
キスの１またはそれ以上の成分が分泌の活性化に役立つ
ように思われる。
【００５３】好ましい態様では、細胞を培地から収穫す
る前にホスフェート制限条件下で培養するべきである。
このことは、その生物が、ホスフェートのプロセッシン
グに係るタンパク質のためのプロモーターのコントロー
ル下にある真核性タンパク質をコードしているベクター
で形質転換されたか否か、あるいは、その細胞がリン酸
栄養物の輸送または異化作用に関する能力を欠いている
かどうかに関係なく言える。驚くべきことに、発酵の最
終段階において、細胞を収穫する前にホスフェート制限
培地を用いることにより、形質転換されたグラム陰性生
物の機械的特性が大きく改良される。このような特性の
改良は、下記の冷ショック抽出法の効果を増進する。例
えば、培地からホスフェートを沈澱させるか、培養物中
に制限された投与速度でホスフェートを加えるか、ある
いは、予定の細胞密度以上に培養物を増殖させるのに適
する量よりも少量のホスフェートを最初に加えておく、
等の方法により、培地をホスフェート制限状態にする。
最初の供給量は、発酵の初期の細胞増殖を最適に行わせ
る(例えば指数増殖を行わせる、あるいはＯＤ550を約４
５にする)のに充分な量とする。ホスフェートの量は、
培養物中に用いた他の栄養物や菌株に応じて修正され
る。通常、大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)に用
いられる培地には２．５g／lの割合でリン酸カリウム／
ナトリウム塩を使用するが、pho Ｔ突然変異体のごとき
ホスフェート代謝欠損株の場合にはより多量(約４．０g
／l)を用いる。この値は、非制限的な場合のホスフェー
ト量(約９．０g／l)と対照的である。培養物がホスフェ
ート制限状態に至った時点での、制限培地中のリン酸イ
オン濃度は約１mＭ以下である。一般に、このような制
限状態において、収穫前約１時間、細胞を培養する。
る前にホスフェート制限条件下で培養するべきである。
このことは、その生物が、ホスフェートのプロセッシン
グに係るタンパク質のためのプロモーターのコントロー
ル下にある真核性タンパク質をコードしているベクター
で形質転換されたか否か、あるいは、その細胞がリン酸
栄養物の輸送または異化作用に関する能力を欠いている
かどうかに関係なく言える。驚くべきことに、発酵の最
終段階において、細胞を収穫する前にホスフェート制限
培地を用いることにより、形質転換されたグラム陰性生
物の機械的特性が大きく改良される。このような特性の
改良は、下記の冷ショック抽出法の効果を増進する。例
えば、培地からホスフェートを沈澱させるか、培養物中
に制限された投与速度でホスフェートを加えるか、ある
いは、予定の細胞密度以上に培養物を増殖させるのに適
する量よりも少量のホスフェートを最初に加えておく、
等の方法により、培地をホスフェート制限状態にする。
最初の供給量は、発酵の初期の細胞増殖を最適に行わせ
る(例えば指数増殖を行わせる、あるいはＯＤ550を約４
５にする)のに充分な量とする。ホスフェートの量は、
培養物中に用いた他の栄養物や菌株に応じて修正され
る。通常、大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)に用
いられる培地には２．５g／lの割合でリン酸カリウム／
ナトリウム塩を使用するが、pho Ｔ突然変異体のごとき
ホスフェート代謝欠損株の場合にはより多量(約４．０g
／l)を用いる。この値は、非制限的な場合のホスフェー
ト量(約９．０g／l)と対照的である。培養物がホスフェ
ート制限状態に至った時点での、制限培地中のリン酸イ
オン濃度は約１mＭ以下である。一般に、このような制
限状態において、収穫前約１時間、細胞を培養する。
【００５４】好ましくは、以下に示す処理を開始する前
に、通常、指数増殖期に続く増殖期間中に、細胞がペリ
ズム性のヘテロローガスなタンパク質を最高のレベルに
まで蓄積するようにしておく。この時点に達するや否
や、あるいはその直後に、細胞を殺すべきである。“殺
す”という語句は、少なくとも、細胞が複製し得ない状
態にあることを意味する。しかしながら、以下に示すア
ルカノールおよび熱により処理によっては、複製とは直
接関係のない代謝機能が差し止めされる、または破壊さ
れるように思われる。しかしながら、ペリプラズム内に
あるhＧＨに対して有害な、大腸菌のタンパク分解活性
が消失されることの外に、代謝機能がどのような影響を
受けたかは不明である。殺菌方法は、それによって宿主
生物の細胞内膜が破裂、溶解または弱体化するものであ
ってはならない。
に、通常、指数増殖期に続く増殖期間中に、細胞がペリ
ズム性のヘテロローガスなタンパク質を最高のレベルに
まで蓄積するようにしておく。この時点に達するや否
や、あるいはその直後に、細胞を殺すべきである。“殺
す”という語句は、少なくとも、細胞が複製し得ない状
態にあることを意味する。しかしながら、以下に示すア
ルカノールおよび熱により処理によっては、複製とは直
接関係のない代謝機能が差し止めされる、または破壊さ
れるように思われる。しかしながら、ペリプラズム内に
あるhＧＨに対して有害な、大腸菌のタンパク分解活性
が消失されることの外に、代謝機能がどのような影響を
受けたかは不明である。殺菌方法は、それによって宿主
生物の細胞内膜が破裂、溶解または弱体化するものであ
ってはならない。
【００５５】細胞が所望の増殖時点に達したら、即座
に、細胞をアルカノールと接触させ、加熱して殺すこと
が好ましい。用いるアルカノールは、例えば、１−オク
タノールのような、細胞膜溶解性のものであってはなら
ない。一般に、適当なアルカノール類には、１−ブタノ
ールやエタノールのごとき低級(Ｃ2〜Ｃ4)モノヒドロキ
シアルカノール類が含まれ、中でも１−ブタノールが好
ましい。アルコールと細胞との接触は、アルカノールを
連続的に撹拌しながら発酵培養物中に加えることによ
り、行われる。
に、細胞をアルカノールと接触させ、加熱して殺すこと
が好ましい。用いるアルカノールは、例えば、１−オク
タノールのような、細胞膜溶解性のものであってはなら
ない。一般に、適当なアルカノール類には、１−ブタノ
ールやエタノールのごとき低級(Ｃ2〜Ｃ4)モノヒドロキ
シアルカノール類が含まれ、中でも１−ブタノールが好
ましい。アルコールと細胞との接触は、アルカノールを
連続的に撹拌しながら発酵培養物中に加えることによ
り、行われる。
【００５６】加えるアルコールの量は、培養物中のアル
カノール濃度が０．５％〜１０％(v／v)になるような量
であり、１−ブタノールを約１．５％(v／v)用いること
が好ましい。ブタノールは、約０．５％という低濃度で
も使用できる点で、好ましい; プロパノールまたはエタ
ノールを用いて同等の不活化を行うためには、もっと高
濃度にしなければならない。
カノール濃度が０．５％〜１０％(v／v)になるような量
であり、１−ブタノールを約１．５％(v／v)用いること
が好ましい。ブタノールは、約０．５％という低濃度で
も使用できる点で、好ましい; プロパノールまたはエタ
ノールを用いて同等の不活化を行うためには、もっと高
濃度にしなければならない。
【００５７】細胞培養へのアルカノールの添加と同時
に、あるいはその後に、アルカノールの作用に共同して
細胞を殺すのに充分な高さまで培養物の温度を上げ、そ
の温度に保つ。この処理は、通常、約５５℃〜３５℃の
温度で約０．５〜２０分間行うが、温度が高くなる程、
作用時間を短くする。アルカノールの添加により、それ
がない場合に必要とされる加熱温度よりも低い温度で操
作することができるので、回収すべきタンパク質の活性
の保存に有益である。
に、あるいはその後に、アルカノールの作用に共同して
細胞を殺すのに充分な高さまで培養物の温度を上げ、そ
の温度に保つ。この処理は、通常、約５５℃〜３５℃の
温度で約０．５〜２０分間行うが、温度が高くなる程、
作用時間を短くする。アルカノールの添加により、それ
がない場合に必要とされる加熱温度よりも低い温度で操
作することができるので、回収すべきタンパク質の活性
の保存に有益である。
【００５８】細胞を殺すことは臨界的な要件ではない。
もしも、細胞を素早く処理することができ、組換え細胞
の取扱いにおける調整上必要な点が、他の方法でも容認
し得るならば、生産物の破壊を防止または遅延させるの
に有用であるため、細胞を殺す操作をなしにすませるこ
ともできる。しかしながら、生産物の回収量は、回収さ
れた上清中の生成物タンパク質の純度を減少することな
く、約２倍に達することが分かった。
もしも、細胞を素早く処理することができ、組換え細胞
の取扱いにおける調整上必要な点が、他の方法でも容認
し得るならば、生産物の破壊を防止または遅延させるの
に有用であるため、細胞を殺す操作をなしにすませるこ
ともできる。しかしながら、生産物の回収量は、回収さ
れた上清中の生成物タンパク質の純度を減少することな
く、約２倍に達することが分かった。
【００５９】細胞を培養した後、そして／または殺した
後、ペリプラズムタンパク質を回収する。この方法に
は、一般に、細胞ペーストを形成し、細胞を凍結し、細
胞を解凍し、それをバッファーに懸濁し、細胞片からペ
リプラズムタンパク質を分離する(例えば、低速遠心に
より)工程が必要である。分泌された真核性タンパク質
をも含めて、ペリプラズムタンパク質は上清に存在して
いる。この方法によれば、真核性ペリプラズムタンパク
質の比活性(即ち、純度)は、浸透圧ショック法によって
達成される値よりも高い。従って、２０％シュクロース
等の高張性物質による処理は必要でないが、ペリプラズ
ムタンパク質に関して細胞の外層膜を透過性にするよう
な、あらゆる方法を、殺した細胞に適用することができ
る。
後、ペリプラズムタンパク質を回収する。この方法に
は、一般に、細胞ペーストを形成し、細胞を凍結し、細
胞を解凍し、それをバッファーに懸濁し、細胞片からペ
リプラズムタンパク質を分離する(例えば、低速遠心に
より)工程が必要である。分泌された真核性タンパク質
をも含めて、ペリプラズムタンパク質は上清に存在して
いる。この方法によれば、真核性ペリプラズムタンパク
質の比活性(即ち、純度)は、浸透圧ショック法によって
達成される値よりも高い。従って、２０％シュクロース
等の高張性物質による処理は必要でないが、ペリプラズ
ムタンパク質に関して細胞の外層膜を透過性にするよう
な、あらゆる方法を、殺した細胞に適用することができ
る。
【００６０】凍結用の細胞ペーストは、細胞培養を遠心
または濾過して細胞塊を回収することにより調製され
る。このペーストには、普通、残存量の発酵培地、例え
ばＬＢ[ルリア・ブロス(Ｌuria Ｂroth)]培地が含まれ
ている; 次の工程に進む前に、細胞を凍結用の溶媒で洗
う必要はない。本発明における冷ショック抽出法で形成
されたペーストが細胞の濃度と殆んど関係がない、とい
うことは大きい問題ではない。しかしながら、大量の物
質の凍結と解凍における経済性から、ペースト容量が小
さい方が好ましい。
または濾過して細胞塊を回収することにより調製され
る。このペーストには、普通、残存量の発酵培地、例え
ばＬＢ[ルリア・ブロス(Ｌuria Ｂroth)]培地が含まれ
ている; 次の工程に進む前に、細胞を凍結用の溶媒で洗
う必要はない。本発明における冷ショック抽出法で形成
されたペーストが細胞の濃度と殆んど関係がない、とい
うことは大きい問題ではない。しかしながら、大量の物
質の凍結と解凍における経済性から、ペースト容量が小
さい方が好ましい。
【００６１】細胞凍結は、可能な限り早く行うべきであ
る。一般に、室温のペーストを、−２０℃のフリーザー
内で凍結させ、次いで、以後の処理が必要となるまで、
−８０℃で保存する。
る。一般に、室温のペーストを、−２０℃のフリーザー
内で凍結させ、次いで、以後の処理が必要となるまで、
−８０℃で保存する。
【００６２】凍結したペーストを解凍し、数倍の容量の
水または水性バッフアー(約３倍またはそれ以上の容量
の１０mＭトリス−ＨＣlバッフアー、pＨ８が好ましい)
によって希釈する。このバッフアーは、宿主生物の細胞
内液に比べて低張性である。以下の工程は約４℃で行
う。希釈に用いるバッフアーの種類、濃度およびpＨは
回収すべきペリプラズムタンパク質によって変動する
が、バッフアーで約３倍に希釈して行う。
水または水性バッフアー(約３倍またはそれ以上の容量
の１０mＭトリス−ＨＣlバッフアー、pＨ８が好ましい)
によって希釈する。このバッフアーは、宿主生物の細胞
内液に比べて低張性である。以下の工程は約４℃で行
う。希釈に用いるバッフアーの種類、濃度およびpＨは
回収すべきペリプラズムタンパク質によって変動する
が、バッフアーで約３倍に希釈して行う。
【００６３】細胞をバッフアーに、完全に懸濁する。こ
の工程は、ホモジナイザー装置を用い、実質的な溶菌が
起こらない様なスピードで、細胞を懸濁させることによ
り、簡単に行える。
の工程は、ホモジナイザー装置を用い、実質的な溶菌が
起こらない様なスピードで、細胞を懸濁させることによ
り、簡単に行える。
【００６４】懸濁した細胞を約１０分〜６０分間、通常
は約３０分間、静かに撹拌する。次いで、遠心(一般
に、１２,０００×gで３０分間)または濾過することに
より、細胞片と細胞(細胞質タンパク質を含有)を除く。
上清には、ペリプラズムタンパク質、可溶化された外層
膜タンパク質、残存性培地および細胞外タンパク質、並
びに少量の可溶性細胞内タンパク質が含まれている。所
望の真核性タンパク質は、以後の方法に従って、上清か
ら望み通り、精製することができる。
は約３０分間、静かに撹拌する。次いで、遠心(一般
に、１２,０００×gで３０分間)または濾過することに
より、細胞片と細胞(細胞質タンパク質を含有)を除く。
上清には、ペリプラズムタンパク質、可溶化された外層
膜タンパク質、残存性培地および細胞外タンパク質、並
びに少量の可溶性細胞内タンパク質が含まれている。所
望の真核性タンパク質は、以後の方法に従って、上清か
ら望み通り、精製することができる。
【００６５】上記の凍結−解凍抽出法は、殺したまま
の、あるいは殺していない生の形質転換体のいずれの場
合でも、バッフアーだけで抽出する方法に比べて、収量
並びに、驚ろくべきことに純度において、相当に優れて
いる。凍結した、殺していない細胞からは、凍結されて
いず、かつ殺されていない細胞のバッフアー抽出に比べ
て約５〜２６倍多量のhＧＨが回収された。殺され、凍
結された細胞の上清中の全タンパク質の１９重量％がh
ＧＨであったが、殺されたままの細胞に関しては、約１
６％しかhＧＨは含まれていなかった。
の、あるいは殺していない生の形質転換体のいずれの場
合でも、バッフアーだけで抽出する方法に比べて、収量
並びに、驚ろくべきことに純度において、相当に優れて
いる。凍結した、殺していない細胞からは、凍結されて
いず、かつ殺されていない細胞のバッフアー抽出に比べ
て約５〜２６倍多量のhＧＨが回収された。殺され、凍
結された細胞の上清中の全タンパク質の１９重量％がh
ＧＨであったが、殺されたままの細胞に関しては、約１
６％しかhＧＨは含まれていなかった。
【００６６】上記の方法を、以下の実施例において、大
腸菌熱安定性エンテロトキシンＳＴＩＩシグナルペプチ
ドとの直接ハイブリッド融合物として、成熟hＧＨを発
現させるベクターで形質転換された大腸菌からhＧＨを
回収するのに用いた。しかしながら、本明細書に示した
回収方法は、形質転換された細菌細胞からペリプラズム
タンパク質を分離するのに、一般的に適用することがで
きる[米国特許第４,４１１,９９４号および第４,３７
５,５１４号;Ｋ．タルマツジ(Ｋ．Ｔalmadge)ら(前掲);
Ｏ．ゼメルードレーセン(Ｏ．Ｚemel−Ｄreasen)ら(前
掲)並びにＧ．グレイ(Ｇ．Ｇray)ら(前掲)]。
腸菌熱安定性エンテロトキシンＳＴＩＩシグナルペプチ
ドとの直接ハイブリッド融合物として、成熟hＧＨを発
現させるベクターで形質転換された大腸菌からhＧＨを
回収するのに用いた。しかしながら、本明細書に示した
回収方法は、形質転換された細菌細胞からペリプラズム
タンパク質を分離するのに、一般的に適用することがで
きる[米国特許第４,４１１,９９４号および第４,３７
５,５１４号;Ｋ．タルマツジ(Ｋ．Ｔalmadge)ら(前掲);
Ｏ．ゼメルードレーセン(Ｏ．Ｚemel−Ｄreasen)ら(前
掲)並びにＧ．グレイ(Ｇ．Ｇray)ら(前掲)]。
【００６７】実施例を簡単にするため、組換え法による
組立てに関し、しばしば現われ、また用いられるいくつ
かの事柄を短い語句または記号で表わす。
組立てに関し、しばしば現われ、また用いられるいくつ
かの事柄を短い語句または記号で表わす。
【００６８】プラスミドは、小文字のpで始まり、つい
で／または大文字、そして／または数字を続けて表わ
す。本発明に用いる出発物質のプラスミドまたはＤＮＡ
供給源は市販品から入手できるか、あるいは、何ら制限
のない施設から誰でも入手することができ、または、公
開された方法に従い、入手したプラスミドまたはポリヌ
クレオチドから組立てることができる。加えて、一般
に、プラスミドはプレタンパク質のための複製ビビクル
およびそのコントロール配列として、あるいは、中間体
組立てにおける要素としてのみ機能するのであるから、
その他の等価なプラスミドも当業界で知られており、通
常の技術者にとっては自明である。
で／または大文字、そして／または数字を続けて表わ
す。本発明に用いる出発物質のプラスミドまたはＤＮＡ
供給源は市販品から入手できるか、あるいは、何ら制限
のない施設から誰でも入手することができ、または、公
開された方法に従い、入手したプラスミドまたはポリヌ
クレオチドから組立てることができる。加えて、一般
に、プラスミドはプレタンパク質のための複製ビビクル
およびそのコントロール配列として、あるいは、中間体
組立てにおける要素としてのみ機能するのであるから、
その他の等価なプラスミドも当業界で知られており、通
常の技術者にとっては自明である。
【００６９】ＤＮＡの“消化”とは、ＤＮＡのある位置
にのみ作用する酵素で該ＤＮＡを触媒的に開裂すること
を意味する。その様な酵素は、制限酵素と呼ばれてお
り、酵素にとって、各酵素に特異的な部位を制限部位と
称する。“部分”消化とは、制限酵素による不完全消
化、即ち、あるＤＮＡ基質中の、特定の制限エンドヌク
レアーゼの作用部位の全てではなく、いくつかが開裂さ
れる様な条件を選んで行う消化を指す。
にのみ作用する酵素で該ＤＮＡを触媒的に開裂すること
を意味する。その様な酵素は、制限酵素と呼ばれてお
り、酵素にとって、各酵素に特異的な部位を制限部位と
称する。“部分”消化とは、制限酵素による不完全消
化、即ち、あるＤＮＡ基質中の、特定の制限エンドヌク
レアーゼの作用部位の全てではなく、いくつかが開裂さ
れる様な条件を選んで行う消化を指す。
【００７０】本発明に用いる様々な制限酵素類は市販品
から入手可能であり、その反応条件、コファクター類お
よびその他必要なものは酵素供給者により確立された指
示に従った。一般に、制限酵素類は、各制限酵素の最初
の供給源である微生物を表わす大文字、次いで他の文
字、さらに、通常数字の順に、略語で示される。一般
に、約２０μlのバッフアー中で、プラスミドまたはＤ
ＮＡフラグメント約１μgと酵素約１単位とを用いる。
特定の制限酵素にとって適当なバッフアーおよび基質の
量は製造者によって規定されている。通常、３７℃で１
時間インキュベーションするが、供給者の指示によって
変動し得る。インキュベーションの後、フェノールおよ
びクロロホルムで抽出してタンパク質を除去し、水性フ
ラクションからエタノール沈澱によって消化された核酸
を回収する。時たま、制限酵素による消化の後、５'末
端のホスフェートを細菌性アルカリホスファターゼで加
水分解することがある。これはＤＮＡフラグメントの２
つの制限的開裂末端がライゲーション(後述)に際して
“閉環(サーキュライディング)”したり、閉じたループ
を形成することにより、該制限部位に他のＤＮＡフラグ
メントが挿入されにくくなるのを防止するためである。
しかし明示しない限り、プラスミドの消化の後、５'末
端の脱りん酸反応は行なわないものとする。脱りん酸の
方法および試薬は常法に従う[Ｔ．マニアテイス(Ｔ．Ｍ
aniatis)ら、１９８２、モレキュラー・クローニング
(Ｍolecular Ｃloning)pp．１３３−１３４]。
から入手可能であり、その反応条件、コファクター類お
よびその他必要なものは酵素供給者により確立された指
示に従った。一般に、制限酵素類は、各制限酵素の最初
の供給源である微生物を表わす大文字、次いで他の文
字、さらに、通常数字の順に、略語で示される。一般
に、約２０μlのバッフアー中で、プラスミドまたはＤ
ＮＡフラグメント約１μgと酵素約１単位とを用いる。
特定の制限酵素にとって適当なバッフアーおよび基質の
量は製造者によって規定されている。通常、３７℃で１
時間インキュベーションするが、供給者の指示によって
変動し得る。インキュベーションの後、フェノールおよ
びクロロホルムで抽出してタンパク質を除去し、水性フ
ラクションからエタノール沈澱によって消化された核酸
を回収する。時たま、制限酵素による消化の後、５'末
端のホスフェートを細菌性アルカリホスファターゼで加
水分解することがある。これはＤＮＡフラグメントの２
つの制限的開裂末端がライゲーション(後述)に際して
“閉環(サーキュライディング)”したり、閉じたループ
を形成することにより、該制限部位に他のＤＮＡフラグ
メントが挿入されにくくなるのを防止するためである。
しかし明示しない限り、プラスミドの消化の後、５'末
端の脱りん酸反応は行なわないものとする。脱りん酸の
方法および試薬は常法に従う[Ｔ．マニアテイス(Ｔ．Ｍ
aniatis)ら、１９８２、モレキュラー・クローニング
(Ｍolecular Ｃloning)pp．１３３−１３４]。
【００７１】制限酵素による消化によって得られたＤＮ
Ａフラグメントの“回収”または“単離”とは、この消
化物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離
し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮ
Ａフラグメントのそれと比較して所望のフラグメントを
同定し、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、
該ゲルから通常、電気溶離法でＤＮＡを分離することを
意味する。この方法は一般的に知られている。例、Ｒ．
ローン(Ｒ．Ｌawn)ら、１９８１、“ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ”９:６１０３−６１１４およびＤ．
ゲッデル(Ｄ．Ｇoeddel)ら、１９８０“ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ”８:４０５７参照。
Ａフラグメントの“回収”または“単離”とは、この消
化物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離
し、フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮ
Ａフラグメントのそれと比較して所望のフラグメントを
同定し、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、
該ゲルから通常、電気溶離法でＤＮＡを分離することを
意味する。この方法は一般的に知られている。例、Ｒ．
ローン(Ｒ．Ｌawn)ら、１９８１、“ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ”９:６１０３−６１１４およびＤ．
ゲッデル(Ｄ．Ｇoeddel)ら、１９８０“ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ”８:４０５７参照。
【００７２】“サザーン分析”とは、消化物またはＤＮ
Ａ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識し
たオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハ
イブリダイゼーションによって確認する方法である。本
明細書中では、特に断らない限り、サザーン分析という
時は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)、１９７５“ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ(Ｊ．Ｍo
l．Ｂiol．)”９８:５０３−５１７、の方法に従って、
消化物を１％アガロース上で分離し、変性し、そしてニ
トロセルロース上に移し、Ｔ．マニアテイスらの方法
(１９７８、“セル”１５:６８７−７０１)に従ってハ
イブリダイゼーションを行なうことを意味する。
Ａ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識し
たオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハ
イブリダイゼーションによって確認する方法である。本
明細書中では、特に断らない限り、サザーン分析という
時は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)、１９７５“ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ(Ｊ．Ｍo
l．Ｂiol．)”９８:５０３−５１７、の方法に従って、
消化物を１％アガロース上で分離し、変性し、そしてニ
トロセルロース上に移し、Ｔ．マニアテイスらの方法
(１９７８、“セル”１５:６８７−７０１)に従ってハ
イブリダイゼーションを行なうことを意味する。
【００７３】“形質転換”とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl2法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキューラー・バイオロ
ジイ”５３:１５４)を採用する。
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl2法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキューラー・バイオロ
ジイ”５３:１５４)を採用する。
【００７４】“ライゲーション(結合)”とは、２個の二
重鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ．マニアテイスら、前掲p１４
６)。特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩
衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤ
ＮＡフラグメント０．５μg当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ
(“リガーゼ”)１０単位を用いて行う。
重鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ．マニアテイスら、前掲p１４
６)。特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩
衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤ
ＮＡフラグメント０．５μg当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ
(“リガーゼ”)１０単位を用いて行う。
【００７５】形質転換体からＤＮＡを“調製する”と
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアテイスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上p．９０)を採用する。
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアテイスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上p．９０)を採用する。
【００７６】“オリゴヌクレオチド”とは、短かい一本
鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既
知方法によって化学的に合成され、次いでポリアクリル
アミドゲル上で精製されたものである。引用した文献は
全て参照例として示した。
鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既
知方法によって化学的に合成され、次いでポリアクリル
アミドゲル上で精製されたものである。引用した文献は
全て参照例として示した。
【００７７】実施例１ 大腸菌熱安定性エンテロトキシ
ン(ＳＴＩＩ)遺伝子シグナルペプチド配列をコードして
いるプラスミドの組立て 以下の組立ては図２および図３に示されている。プラス
ミドpＷＭ５０１(ピッケンら、前掲)は熱安定性エンテ
ロトキシン(ＳＴＩＩ)遺伝子を含有している。以下の工
程により、pＷＭ５０１(１)からＳＴＩＩ遺伝子をコー
ドしているＤＮＡの部分(図２および図３中、点描法で
示した部分)を回収した。pＷＭ５０１をＲsaＩで消化
し、５５０bp ＤＮＡフラグメント(２)を単離した。こ
の遺伝子フラグメントを、予めＳmaＩ消化されたファー
ジＭ１３mp８[Ｊ．メッシング(Ｊ．Ｍessing)ら、サー
ド・クリーブランド・シンポジウム・オン・マクロモレ
キュールス:リコンビナント・ＤＮＡ(Ｔhird Ｃlevela
nd Ｓymposium on Ｍacromolecules:Ｒecombinant
ＤＮＡ)Ａ．ウオルトン編、エルセビエ(Ｅlsevier)、ア
ムステルダム(Ａmsterdam)(１９８１)pp１４３−１５
３]にライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを用い
て、Ｍ１３ファージ用に市販されている菌株である大腸
菌ＪＭ１０１を形質転換した。澄明なプラークを回収し
た。標準的な方法(Ｊ．メッシングら、前掲)を用いて、
このファージに感染した大腸菌ＪＭ１０１から二本鎖Ｍ
１３mp８ ＳＴＩＩＲsa誘導体(３)を単離した。上で述
べたＭ１３mp８サブクローニング法を用いて、ＳＴＩＩ
リーダー遺伝子を含有している約５５０bpフラグメント
(２)を、ファージから提供される一連の異る制限エンド
ヌクレアーゼ部位で囲む。次いで、Ｍ１３mp８ＳＴＩＩ
Ｒsa誘導体(３)をＥcoＲ１とＰstＩで消化し、フラグメ
ント(２)よりやや大きいＤＮＡフラグメント(４)を単離
した。
ン(ＳＴＩＩ)遺伝子シグナルペプチド配列をコードして
いるプラスミドの組立て 以下の組立ては図２および図３に示されている。プラス
ミドpＷＭ５０１(ピッケンら、前掲)は熱安定性エンテ
ロトキシン(ＳＴＩＩ)遺伝子を含有している。以下の工
程により、pＷＭ５０１(１)からＳＴＩＩ遺伝子をコー
ドしているＤＮＡの部分(図２および図３中、点描法で
示した部分)を回収した。pＷＭ５０１をＲsaＩで消化
し、５５０bp ＤＮＡフラグメント(２)を単離した。こ
の遺伝子フラグメントを、予めＳmaＩ消化されたファー
ジＭ１３mp８[Ｊ．メッシング(Ｊ．Ｍessing)ら、サー
ド・クリーブランド・シンポジウム・オン・マクロモレ
キュールス:リコンビナント・ＤＮＡ(Ｔhird Ｃlevela
nd Ｓymposium on Ｍacromolecules:Ｒecombinant
ＤＮＡ)Ａ．ウオルトン編、エルセビエ(Ｅlsevier)、ア
ムステルダム(Ａmsterdam)(１９８１)pp１４３−１５
３]にライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを用い
て、Ｍ１３ファージ用に市販されている菌株である大腸
菌ＪＭ１０１を形質転換した。澄明なプラークを回収し
た。標準的な方法(Ｊ．メッシングら、前掲)を用いて、
このファージに感染した大腸菌ＪＭ１０１から二本鎖Ｍ
１３mp８ ＳＴＩＩＲsa誘導体(３)を単離した。上で述
べたＭ１３mp８サブクローニング法を用いて、ＳＴＩＩ
リーダー遺伝子を含有している約５５０bpフラグメント
(２)を、ファージから提供される一連の異る制限エンド
ヌクレアーゼ部位で囲む。次いで、Ｍ１３mp８ＳＴＩＩ
Ｒsa誘導体(３)をＥcoＲ１とＰstＩで消化し、フラグメ
ント(２)よりやや大きいＤＮＡフラグメント(４)を単離
した。
【００７８】ＥcoＲ１−ＰstＩフラグメント(４)をpＢ
Ｒ３２２にサブクローンした。これは、pＢＲ３２２を
ＥcoＲ１とＰstＩで消化し、ベクター(５)を単離するこ
とにより、行った。こうして単離したベクター(５)とＥ
coＲ１−ＰstＩ ＤＮＡフラグメント(４)とをライゲー
トした。このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌２９４を形質
転換し、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。耐
性大腸菌コロニーからプラスミド(６)を単離し、これを
ＰstＩＩ部分(ＰstＩＩpartial)と命名した。
Ｒ３２２にサブクローンした。これは、pＢＲ３２２を
ＥcoＲ１とＰstＩで消化し、ベクター(５)を単離するこ
とにより、行った。こうして単離したベクター(５)とＥ
coＲ１−ＰstＩ ＤＮＡフラグメント(４)とをライゲー
トした。このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌２９４を形質
転換し、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。耐
性大腸菌コロニーからプラスミド(６)を単離し、これを
ＰstＩＩ部分(ＰstＩＩpartial)と命名した。
【００７９】実施例２ Ｔrpプロモーターのコントロー
ル下にある、ＳＴＩＩシグナルペプチドをコードしてい
るプラスミドの組立て この組立て方法は図４に示されている。実施例１で得た
pＳＴＩＩ部分をＭnlＩとＢamＨＩで消化し、ＳＴＩＩ
Ｓ．Ｄ．配列、ＳＴＩＩシグナル配列、および成熟ＳＴ
ＩＩ遺伝子の最初の３０コドンを含有する１８０bpフラ
グメント(７)を単離した。このＤＮＡフラグメント(７)
をtrpプロモーター含有プラスミドにライゲートした。
その様なプラスミドの１つであるプラスミドpＨＧＨ２
０７−１(８)は既に報告されている[Ｈ．ド・ボエー
(Ｈ．de Ｂoer)ら、１９８２、プロモーターズ:ストラ
クチュアー・アンド・ファンクション、Ｒ．ロドレゲツ
ツ(Ｒ．Ｒodreguez)ら編、チャンバーリン、プレーガー
(Ｃhamberlin,Ｐraeger)出版、ニューヨーク、ＮＹ、pp
４６２−４８１]。このプラスミドの誘導体であるpＨＧ
Ｈ２０７−１＊[trpプローモーター側の５'側ＥcoＲ１
部位をＤＮＡポリメラーゼＩ(ＤＮＡ polＩ)で埋め(fi
llin)、次いで、得られた平滑末端をライゲーションす
ることにより、ＥcoＲ１＊に変換したもの。Ｓ．キャビ
リイ(Ｓ．Ｃabilly)ら、１９８４、プロシーデイングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ、ＵＳＡ、８１:３２７３−３２７７]を、この実
施例では用いた。このtrpプロモーター含有プラスミド
をＸbaＩで消化し、ＤＮＡpulＩと４種のdＮＴＰ全てを
用いて突出した配列を埋める様、処理した。このＤＮＡ
調製物をＢamＨＩで消化し、フラグメント(９)を含むベ
クターを単離した。次いで、ベクターフラグメント(９)
を、上で単離した１８０bpＳＴＩＩシグナル含有ＤＮＡ
フラグメント(７)にライゲートした。このライゲーショ
ン混合物を用いて、大腸菌２９４をアンピシリン耐性に
形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから、プラス
ミドを単離し、ＳＴＩＩリーダー(１０)と命名した。こ
のプラスミドは、trpプロモーターのコントロール下に
ある、ＳＴＩＩシグナル配列と成熟ＳＴＩＩの暗号遺伝
子の一部とを含有している。以下の実施例では、trp−
ＳＴＩＩシグナル配列の下流に、成熟hＧＨをコードし
ているＤＮＡ配列を機能的にライゲートした。
ル下にある、ＳＴＩＩシグナルペプチドをコードしてい
るプラスミドの組立て この組立て方法は図４に示されている。実施例１で得た
pＳＴＩＩ部分をＭnlＩとＢamＨＩで消化し、ＳＴＩＩ
Ｓ．Ｄ．配列、ＳＴＩＩシグナル配列、および成熟ＳＴ
ＩＩ遺伝子の最初の３０コドンを含有する１８０bpフラ
グメント(７)を単離した。このＤＮＡフラグメント(７)
をtrpプロモーター含有プラスミドにライゲートした。
その様なプラスミドの１つであるプラスミドpＨＧＨ２
０７−１(８)は既に報告されている[Ｈ．ド・ボエー
(Ｈ．de Ｂoer)ら、１９８２、プロモーターズ:ストラ
クチュアー・アンド・ファンクション、Ｒ．ロドレゲツ
ツ(Ｒ．Ｒodreguez)ら編、チャンバーリン、プレーガー
(Ｃhamberlin,Ｐraeger)出版、ニューヨーク、ＮＹ、pp
４６２−４８１]。このプラスミドの誘導体であるpＨＧ
Ｈ２０７−１＊[trpプローモーター側の５'側ＥcoＲ１
部位をＤＮＡポリメラーゼＩ(ＤＮＡ polＩ)で埋め(fi
llin)、次いで、得られた平滑末端をライゲーションす
ることにより、ＥcoＲ１＊に変換したもの。Ｓ．キャビ
リイ(Ｓ．Ｃabilly)ら、１９８４、プロシーデイングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン
スイズ、ＵＳＡ、８１:３２７３−３２７７]を、この実
施例では用いた。このtrpプロモーター含有プラスミド
をＸbaＩで消化し、ＤＮＡpulＩと４種のdＮＴＰ全てを
用いて突出した配列を埋める様、処理した。このＤＮＡ
調製物をＢamＨＩで消化し、フラグメント(９)を含むベ
クターを単離した。次いで、ベクターフラグメント(９)
を、上で単離した１８０bpＳＴＩＩシグナル含有ＤＮＡ
フラグメント(７)にライゲートした。このライゲーショ
ン混合物を用いて、大腸菌２９４をアンピシリン耐性に
形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから、プラス
ミドを単離し、ＳＴＩＩリーダー(１０)と命名した。こ
のプラスミドは、trpプロモーターのコントロール下に
ある、ＳＴＩＩシグナル配列と成熟ＳＴＩＩの暗号遺伝
子の一部とを含有している。以下の実施例では、trp−
ＳＴＩＩシグナル配列の下流に、成熟hＧＨをコードし
ているＤＮＡ配列を機能的にライゲートした。
【００８０】実施例３ hＧＨのための、発現および分
泌プラスミドの組立て この組立て方法については、図５−図７を参照された
い。ＳＴＩＩリーダー(１０)をＢglＩＩで消化し、次い
で、polＩと４種のＮＴＰ全てを用いて突出した末端を
埋め、ＢamＨＩ消化に付した。ベクター含有フラグメン
ト(１１)を単離した。実施例２で得たプラスミドpＨＧ
Ｈ２０７−１をＥcoＲ１で消化し、ＤＮＡpolＩと４種
のＮＴＰ全てを用いて突出した末端を埋め、次いで、Ｂ
amＨＩ消化に付した。このＢamＨＩ消化により、約９２
０bpのhＧＨ遺伝子含有フラグメント(１２)を単離し
た。これらの２個のフラグメントをライゲートし、得ら
れたＤＮＡ混合物を用いて大腸菌２９４をテトラサイク
リン耐性に形質転換した。耐性を示す大腸菌コロニーか
らプラスミドを単離し、ptrpＳＴＩＩ−ＨＧＨ−融合
(１３)と命名した。このプラスミドはまだ、ＳＴＩＩリ
ーダーペプチド配列とhＧＨ構造遺伝子との間にＳＴＩ
Ｉ成熟タンパク質の一部をコードしている余分なヌクレ
オチドを含有している。これらのヌクレオチドを、Ｍ１
３部位特異的突然変異誘発法で欠失させた[Ｊ．Ｐ．ア
デルマン(Ｊ．Ｐ．Ａdelman)ら、１９８３、ＤＮＡ、
２:１８３−１９３]。
泌プラスミドの組立て この組立て方法については、図５−図７を参照された
い。ＳＴＩＩリーダー(１０)をＢglＩＩで消化し、次い
で、polＩと４種のＮＴＰ全てを用いて突出した末端を
埋め、ＢamＨＩ消化に付した。ベクター含有フラグメン
ト(１１)を単離した。実施例２で得たプラスミドpＨＧ
Ｈ２０７−１をＥcoＲ１で消化し、ＤＮＡpolＩと４種
のＮＴＰ全てを用いて突出した末端を埋め、次いで、Ｂ
amＨＩ消化に付した。このＢamＨＩ消化により、約９２
０bpのhＧＨ遺伝子含有フラグメント(１２)を単離し
た。これらの２個のフラグメントをライゲートし、得ら
れたＤＮＡ混合物を用いて大腸菌２９４をテトラサイク
リン耐性に形質転換した。耐性を示す大腸菌コロニーか
らプラスミドを単離し、ptrpＳＴＩＩ−ＨＧＨ−融合
(１３)と命名した。このプラスミドはまだ、ＳＴＩＩリ
ーダーペプチド配列とhＧＨ構造遺伝子との間にＳＴＩ
Ｉ成熟タンパク質の一部をコードしている余分なヌクレ
オチドを含有している。これらのヌクレオチドを、Ｍ１
３部位特異的突然変異誘発法で欠失させた[Ｊ．Ｐ．ア
デルマン(Ｊ．Ｐ．Ａdelman)ら、１９８３、ＤＮＡ、
２:１８３−１９３]。
【００８１】ptrpＳＴＩＩ ＨＧＨ融合(１３)から得た
遺伝子を一本鎖ファージＭ１３mp１０に挿入した(Ｊ．
メッシングらおよびＪ．アデルマンら、共に前掲)。Ｍ
１３突然変異誘発ファージおよび大腸菌株は市販品から
入手可能である。突然変異の誘発には、まずプラスミド
(１３)をＸbaＩとＢamＨＩで消化し、フラグメント(１
４)を回収した。また、Ｍ１３mp１０はＸbaＩとＢamＨ
Ｉで消化し、ファージフラグメント(図示せず)を単離し
た。フラグメント(１４)をファージフラグメントにライ
ゲートし、得られたライゲーション混合物を用いてＪＭ
１０１を形質転換した。形質転換された培養物をプレー
ト(平板培養)し、インキュベートした。フラグメント
(１４)を有するファージは、大腸菌色素原インジケータ
ーローン中で、青色のプラークでなく、澄明なプラーク
として同定された。それに相当するファージを大腸菌Ｊ
Ｍ１０１上で増殖させ、培養物を遠心した。一本鎖ファ
ージ(１５)は上清中に存在していた。一本鎖ファージ
(１５)ＤＮＡを調製し、合成オリゴヌクレオチドプライ
マー５'pＣＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡ
ＣＴＡＴＡＣＣ−ＯＨ３'とアニールし、ＤＮＡ Ｄol
Ｉと４種のＮＴＰとを用いてプライマーを延長して二本
鎖ＤＮＡ(これらの鎖の内、一本は、欠失を有している)
を得、Ｔ４リガーゼ処理に付し、抽出して大腸菌ＪＭ１
０１の形質転換に用いた(Ｊ．アデルマン、前掲)。上記
プライマーの前方の１４ヌクレオチドはＳＴＩＩシグナ
ルの３'末端の暗号配列であり、後方の１４ヌクレオチ
ドは成熟hＧＨ遺伝子の５'末端の暗号配列であることに
注目されたい。形質転換されたＪＭ１０１の細胞内容物
から二本鎖ファージを得、平板培養した大腸菌ＪＭ１０
１に形質導入し、転移フィルター印象を平板からとり、
プライマーと同じＤＮＡ配列を有する５'−３２Ｐ−標
識オリゴヌクレオチドを用いたサザーン分析法により、
フィルター上で、欠失を含んでいる二本鎖ファージを同
定した。二本鎖ＤＮＡ(１７)は、欠失のある遺伝子を含
有しているＭ１３mp１０により感染させた大腸菌から調
製した。このＤＮＡをＸbaＩとＢamＨＩで消化し、ＤＮ
Ａフラグメント(１７)を単離した。これを、pＨＧＨ２
０７−１を同様に消化し、単離したフラグメント(１８)
の存在下でライゲートした。このライゲーション混合物
を用いて大腸菌２９４をテトラサイクリン耐性に形質転
換した。プラスミドptrpＳＴＩＩ−ＨＧＨ(１９)を回収
し、そのヌクレオチド配列を決定した。このプラスミド
の詳しい制限地図を図８および図９に示す。このプラス
ミドのhＧＨ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を図８に示す。
遺伝子を一本鎖ファージＭ１３mp１０に挿入した(Ｊ．
メッシングらおよびＪ．アデルマンら、共に前掲)。Ｍ
１３突然変異誘発ファージおよび大腸菌株は市販品から
入手可能である。突然変異の誘発には、まずプラスミド
(１３)をＸbaＩとＢamＨＩで消化し、フラグメント(１
４)を回収した。また、Ｍ１３mp１０はＸbaＩとＢamＨ
Ｉで消化し、ファージフラグメント(図示せず)を単離し
た。フラグメント(１４)をファージフラグメントにライ
ゲートし、得られたライゲーション混合物を用いてＪＭ
１０１を形質転換した。形質転換された培養物をプレー
ト(平板培養)し、インキュベートした。フラグメント
(１４)を有するファージは、大腸菌色素原インジケータ
ーローン中で、青色のプラークでなく、澄明なプラーク
として同定された。それに相当するファージを大腸菌Ｊ
Ｍ１０１上で増殖させ、培養物を遠心した。一本鎖ファ
ージ(１５)は上清中に存在していた。一本鎖ファージ
(１５)ＤＮＡを調製し、合成オリゴヌクレオチドプライ
マー５'pＣＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡ
ＣＴＡＴＡＣＣ−ＯＨ３'とアニールし、ＤＮＡ Ｄol
Ｉと４種のＮＴＰとを用いてプライマーを延長して二本
鎖ＤＮＡ(これらの鎖の内、一本は、欠失を有している)
を得、Ｔ４リガーゼ処理に付し、抽出して大腸菌ＪＭ１
０１の形質転換に用いた(Ｊ．アデルマン、前掲)。上記
プライマーの前方の１４ヌクレオチドはＳＴＩＩシグナ
ルの３'末端の暗号配列であり、後方の１４ヌクレオチ
ドは成熟hＧＨ遺伝子の５'末端の暗号配列であることに
注目されたい。形質転換されたＪＭ１０１の細胞内容物
から二本鎖ファージを得、平板培養した大腸菌ＪＭ１０
１に形質導入し、転移フィルター印象を平板からとり、
プライマーと同じＤＮＡ配列を有する５'−３２Ｐ−標
識オリゴヌクレオチドを用いたサザーン分析法により、
フィルター上で、欠失を含んでいる二本鎖ファージを同
定した。二本鎖ＤＮＡ(１７)は、欠失のある遺伝子を含
有しているＭ１３mp１０により感染させた大腸菌から調
製した。このＤＮＡをＸbaＩとＢamＨＩで消化し、ＤＮ
Ａフラグメント(１７)を単離した。これを、pＨＧＨ２
０７−１を同様に消化し、単離したフラグメント(１８)
の存在下でライゲートした。このライゲーション混合物
を用いて大腸菌２９４をテトラサイクリン耐性に形質転
換した。プラスミドptrpＳＴＩＩ−ＨＧＨ(１９)を回収
し、そのヌクレオチド配列を決定した。このプラスミド
の詳しい制限地図を図８および図９に示す。このプラス
ミドのhＧＨ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を図８に示す。
【００８２】実施例４ hＧＨの発現と分泌 実施例３で得たプラスミド(１９)を用い、振盪培養法で
hＧＨを合成した。プラスミド(１９)で大腸菌２９４を
形質転換し、５０または１２５mlの振盪フラスコ内に入
れたテトラサイクリン５μg／ml含有ＬＢ培地１０−２
０mlに接種した。このフラスコを、それ以上培地を加え
ることなく、３７℃で１２−２４時間培養し、次いで、
遠心して細胞を回収した。超音波処理した細胞のラジオ
イムノアッセイにより、全細胞中のhＧＨを測定した。
分泌されたhＧＨを浸透圧ショック法によって回収し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ−末端アミノ酸の末端配列決
定に基づいて、これが成熟hＧＨであることを確認し
た。回収量は、trpプロモーターのコントロール下にあ
るヒトhＧＨシグナルを用いて発現させた場合の約１０
倍であった。
hＧＨを合成した。プラスミド(１９)で大腸菌２９４を
形質転換し、５０または１２５mlの振盪フラスコ内に入
れたテトラサイクリン５μg／ml含有ＬＢ培地１０−２
０mlに接種した。このフラスコを、それ以上培地を加え
ることなく、３７℃で１２−２４時間培養し、次いで、
遠心して細胞を回収した。超音波処理した細胞のラジオ
イムノアッセイにより、全細胞中のhＧＨを測定した。
分泌されたhＧＨを浸透圧ショック法によって回収し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ−末端アミノ酸の末端配列決
定に基づいて、これが成熟hＧＨであることを確認し
た。回収量は、trpプロモーターのコントロール下にあ
るヒトhＧＨシグナルを用いて発現させた場合の約１０
倍であった。
【００８３】実施例５ ＡＰプロモーターおよびシグナ
ル配列のコントロール下でヒト成長ホルモン(hＧＨ)を
発現、分泌するためのプラスミドpＡＰ−１の組立て この組立て方法は図１０−図１４に示されている。ＡＰ
遺伝子の一部を含有しているＤＮＡフラグメントをプラ
スミドpＨＩ−１(２０)から単離した[イノウエ,Ｈ．
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ、１４６:６
６８−６７５(１９８１)]。これは、ＡＰ遺伝子および
プロモーター配列の５'側にＥcoＲＩ部位を導入するた
めの数段階の工程を用いて行った。プラスミド(２０)を
ＨpaＩで消化した後、２個のＥcoＲＩ部位を直列に含ん
でいるリンカー分子にライゲートした。リガーゼ酵素を
熱的に不活化した後、ＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、１２
００bpのフラグメントを単離した。次いで、このＤＮＡ
フラグメントをＨpaＩＩで処理し、４６４bpフラグメン
ト(２１)を単離した。ヒト成長ホルモンmＲＮＡから調
製されたcＤＮＡを含有しているプラスミド(２２)の組
立ては、マーシャルら[Ｍartial et al．、サイエン
ス２０５:６０２−６０６(１９７９)]およびロスケムら
[Ｒoskem et al．、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、７:３０５−３２０(１９７９)]の方法によった(欧
州特許公開第１２７３０５号をも参照)。プラスミド(２
２)をＨpaＩＩで消化し、４６１bpフラグメントを単離
した。この４６１bpフラグメントをさらにＰstＩで消化
し、次いで、hＧＨ遺伝子の一部を含有している２００b
pフラグメント(２３)を単離した。ＤＮＡフラグメント
(２１)とＤＮＡフラグメント(２３)とを、pＢＲ３２２
のＥcoＲＩおよびＰstＩ消化により単離した３６０９bp
ＤＮＡフラグメントにライゲートした。このＤＮＡライ
ゲーション混合物を用いて大腸菌２９４をテトラサイク
リン耐性に形質転換した。形質転換体コロニーからプラ
スミド(２４)を単離し、pcＨＧＨppsと命名した。
ル配列のコントロール下でヒト成長ホルモン(hＧＨ)を
発現、分泌するためのプラスミドpＡＰ−１の組立て この組立て方法は図１０−図１４に示されている。ＡＰ
遺伝子の一部を含有しているＤＮＡフラグメントをプラ
スミドpＨＩ−１(２０)から単離した[イノウエ,Ｈ．
ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ、１４６:６
６８−６７５(１９８１)]。これは、ＡＰ遺伝子および
プロモーター配列の５'側にＥcoＲＩ部位を導入するた
めの数段階の工程を用いて行った。プラスミド(２０)を
ＨpaＩで消化した後、２個のＥcoＲＩ部位を直列に含ん
でいるリンカー分子にライゲートした。リガーゼ酵素を
熱的に不活化した後、ＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、１２
００bpのフラグメントを単離した。次いで、このＤＮＡ
フラグメントをＨpaＩＩで処理し、４６４bpフラグメン
ト(２１)を単離した。ヒト成長ホルモンmＲＮＡから調
製されたcＤＮＡを含有しているプラスミド(２２)の組
立ては、マーシャルら[Ｍartial et al．、サイエン
ス２０５:６０２−６０６(１９７９)]およびロスケムら
[Ｒoskem et al．、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、７:３０５−３２０(１９７９)]の方法によった(欧
州特許公開第１２７３０５号をも参照)。プラスミド(２
２)をＨpaＩＩで消化し、４６１bpフラグメントを単離
した。この４６１bpフラグメントをさらにＰstＩで消化
し、次いで、hＧＨ遺伝子の一部を含有している２００b
pフラグメント(２３)を単離した。ＤＮＡフラグメント
(２１)とＤＮＡフラグメント(２３)とを、pＢＲ３２２
のＥcoＲＩおよびＰstＩ消化により単離した３６０９bp
ＤＮＡフラグメントにライゲートした。このＤＮＡライ
ゲーション混合物を用いて大腸菌２９４をテトラサイク
リン耐性に形質転換した。形質転換体コロニーからプラ
スミド(２４)を単離し、pcＨＧＨppsと命名した。
【００８４】プラスミド(２４)内では、ＡＰプロモータ
ーの暗号遺伝子と、pcＨＧＨpps内のシグナル配列とが
同じ解読フレーム内で、hＧＨに結合している。しかし
ながら、シグナル配列と成熟hＧＨ遺伝子の開始位置と
の間には多数の余分なヌクレオチドが存在している。こ
の余分なヌクレオチド配列を、突然変異誘発により、欠
失させた。即ち、pcＨＧＨppsをＥcoＲＩおよびＰstＩ
消化に付し、６６３bpフラグメント(２５)を単離した。
フラグメント(２５)を、ＰstＩおよびＥcoＲＩで消化し
ておいたＭ１３mp９に導入した。これをライゲートし、
大腸菌ＪＭ１０１の形質転換に用いた。澄明なプラーク
を選択し、誘導体ファージ(２６)、Ｍ１３mp９−cＨＧ
Ｈppsを同定し、単離した。ファージ(２６)を合成オリ
ゴヌクレオチドプライマー５'ＰＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡ
ＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣ−ＯＨ３'にア
ニーリングした。このプライマーの最初の１４ヌクレオ
チドはＡＰシグナルペプチドの３'末端の配列に対応
し、後方の１４ヌクレオチドは成熟hＧＨ暗号配列の５'
末端に対応している。実施例３で示した如くにして
(Ｊ．アデルマンら、前掲をも参照)、部位特異的、欠失
性突然変異誘発を行った。所望の欠失を含むプラーク
を、この実施例に示した５'−３２Ｐ−標識オリゴヌク
レオチドプライマーを用いたサザーン分析法により、検
出した。所望の遺伝型のための強化をすることなしに、
スクリーンしたプラークの９％が標識プライマーとハイ
ブリダイズした。陽性なプラークの１つ、ファージＭ１
３mp９−ＡＰ−１(２７)は、ジデオキシ鎖末端ヌクレオ
チド配列決定法に基づき、予測される配列を有している
ことが確認された。次いで、ＡＰプロモーターおよびシ
グナル遺伝子と正しく融合している部分的hＧＨ遺伝子
を、pＨＧＨ２０７(２８)(Ｈ．ド・ボエアら、前掲)に
導入した。即ち、pＨＧＨ２０７をＰstＩおよびＮdeＩ
消化に付し、次いで、２７５０bpフラグメントを単離し
た。もう一つのpＨＧＨ２０７標本をＮdeＩおよびＥco
ＲＩ消化に付し、２０６４bpフラグメントを単離した。
Ｍ１３mp９−ＡＰ−１ファージをＥcoＲＩおよびＰstＩ
で消化し、６０２bpＡＰhＧＨ部分遺伝子(２９)を単離
した。上記の２７５０bpフラグメントと２０６４bpフラ
グメントとを、フラグメント(２９)との３成分ライゲー
ションでライゲートし、得られたライゲーション混合物
を用いて大腸菌２９４をアンピシリン耐性に形質転換し
た。耐性コロニーからpＡＰ−１を単離し、制限酵素マ
ッピング法およびヌクレオチド配列決定法によって特性
化した。
ーの暗号遺伝子と、pcＨＧＨpps内のシグナル配列とが
同じ解読フレーム内で、hＧＨに結合している。しかし
ながら、シグナル配列と成熟hＧＨ遺伝子の開始位置と
の間には多数の余分なヌクレオチドが存在している。こ
の余分なヌクレオチド配列を、突然変異誘発により、欠
失させた。即ち、pcＨＧＨppsをＥcoＲＩおよびＰstＩ
消化に付し、６６３bpフラグメント(２５)を単離した。
フラグメント(２５)を、ＰstＩおよびＥcoＲＩで消化し
ておいたＭ１３mp９に導入した。これをライゲートし、
大腸菌ＪＭ１０１の形質転換に用いた。澄明なプラーク
を選択し、誘導体ファージ(２６)、Ｍ１３mp９−cＨＧ
Ｈppsを同定し、単離した。ファージ(２６)を合成オリ
ゴヌクレオチドプライマー５'ＰＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡ
ＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣ−ＯＨ３'にア
ニーリングした。このプライマーの最初の１４ヌクレオ
チドはＡＰシグナルペプチドの３'末端の配列に対応
し、後方の１４ヌクレオチドは成熟hＧＨ暗号配列の５'
末端に対応している。実施例３で示した如くにして
(Ｊ．アデルマンら、前掲をも参照)、部位特異的、欠失
性突然変異誘発を行った。所望の欠失を含むプラーク
を、この実施例に示した５'−３２Ｐ−標識オリゴヌク
レオチドプライマーを用いたサザーン分析法により、検
出した。所望の遺伝型のための強化をすることなしに、
スクリーンしたプラークの９％が標識プライマーとハイ
ブリダイズした。陽性なプラークの１つ、ファージＭ１
３mp９−ＡＰ−１(２７)は、ジデオキシ鎖末端ヌクレオ
チド配列決定法に基づき、予測される配列を有している
ことが確認された。次いで、ＡＰプロモーターおよびシ
グナル遺伝子と正しく融合している部分的hＧＨ遺伝子
を、pＨＧＨ２０７(２８)(Ｈ．ド・ボエアら、前掲)に
導入した。即ち、pＨＧＨ２０７をＰstＩおよびＮdeＩ
消化に付し、次いで、２７５０bpフラグメントを単離し
た。もう一つのpＨＧＨ２０７標本をＮdeＩおよびＥco
ＲＩ消化に付し、２０６４bpフラグメントを単離した。
Ｍ１３mp９−ＡＰ−１ファージをＥcoＲＩおよびＰstＩ
で消化し、６０２bpＡＰhＧＨ部分遺伝子(２９)を単離
した。上記の２７５０bpフラグメントと２０６４bpフラ
グメントとを、フラグメント(２９)との３成分ライゲー
ションでライゲートし、得られたライゲーション混合物
を用いて大腸菌２９４をアンピシリン耐性に形質転換し
た。耐性コロニーからpＡＰ−１を単離し、制限酵素マ
ッピング法およびヌクレオチド配列決定法によって特性
化した。
【００８５】実施例６ ＡＰプロモーターのコントロー
ル下でhＧＨを発現、分泌させるためのプラスミド(pＡ
Ｐ−ＳＴＩＩ−hＧＨ)の組立て ptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨ(実施例３で調製)をＨpaＩおよ
びＥcoＲＩ消化に付し、ベクターフラグメント(３１)を
単離した。プラスミドpＡＰ−１をＥcoＲＩ消化し、Ｒs
aＩで部分消化して４２０bpのＡＰプロモーターフラグ
メント(３２)を単離した。フラグメント(３１)と(３２)
をライゲートし、これを用いて大腸菌２９４をアンピシ
リン耐性に形質転換した。プラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ
−hＧＨを単離し、制限酵素マッピング法およびヌクレ
オチド配列決定法によって特性化した。ＡＰ−ＳＴＩＩ
−hＧＨ組立て物のヌクレオチド配列および翻訳された
アミノ酸配列を図１５および図１６に示す。
ル下でhＧＨを発現、分泌させるためのプラスミド(pＡ
Ｐ−ＳＴＩＩ−hＧＨ)の組立て ptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨ(実施例３で調製)をＨpaＩおよ
びＥcoＲＩ消化に付し、ベクターフラグメント(３１)を
単離した。プラスミドpＡＰ−１をＥcoＲＩ消化し、Ｒs
aＩで部分消化して４２０bpのＡＰプロモーターフラグ
メント(３２)を単離した。フラグメント(３１)と(３２)
をライゲートし、これを用いて大腸菌２９４をアンピシ
リン耐性に形質転換した。プラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ
−hＧＨを単離し、制限酵素マッピング法およびヌクレ
オチド配列決定法によって特性化した。ＡＰ−ＳＴＩＩ
−hＧＨ組立て物のヌクレオチド配列および翻訳された
アミノ酸配列を図１５および図１６に示す。
【００８６】実施例７ プラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ−h
ＧＨを含有している大腸菌からのhＧＨの回収 大腸菌Ｗ３１１０および２９４を、それぞれ、pＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨまたはpＡＰ−１で形質転換し、りん酸
欠損培地を用いる外は実施例４と同様にして培養した。
実施例４に記載した如くにして、hＧＨの合成量、並び
にプロセシングされたhＧＨとされていないhＧＨの分布
状況を決定した。結果は表１に示した通りである。表１
から分る様に、容量が少い場合には、ptrp−ＳＴＩＩ−
hＧＨの方が良好な結果をもたらすが、培養容量が１０l
の場合には、trpでプロモートされた生物よりも、ＡＰ
でプロモートされた細胞の方が高密度に増殖し得るの
で、プラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧＨの方が好まし
い。
ＧＨを含有している大腸菌からのhＧＨの回収 大腸菌Ｗ３１１０および２９４を、それぞれ、pＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨまたはpＡＰ−１で形質転換し、りん酸
欠損培地を用いる外は実施例４と同様にして培養した。
実施例４に記載した如くにして、hＧＨの合成量、並び
にプロセシングされたhＧＨとされていないhＧＨの分布
状況を決定した。結果は表１に示した通りである。表１
から分る様に、容量が少い場合には、ptrp−ＳＴＩＩ−
hＧＨの方が良好な結果をもたらすが、培養容量が１０l
の場合には、trpでプロモートされた生物よりも、ＡＰ
でプロモートされた細胞の方が高密度に増殖し得るの
で、プラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧＨの方が好まし
い。
【００８７】実施例８ 大規模発酵およびhＧＨの回収 １０lでの発酵の開始８時間前に５００mlの接種培養を
増殖させる。pＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧＨを含有している大
腸菌Ｗ３１１０形質転換体(tonＡ、phoＡ、phoＴ、実施
例９で調製)を、滅菌した２lのフラスコに入れた、テト
ラサイクリン０．５μg／mlを含むＬＢ培地５００mlに
接種した。この培養物をロータリー・シェーカー内で３
７℃において８時間インキュベートした。以下の成分を
含有する滅菌した１０lの発酵培地を調製した:Ｋ2ＨＰ
Ｏ4２６g、ＮaＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ１３g、ＫＣl１５g、
(ＮＨ4)2ＳＯ4５０g、クエン酸ナトリウム１０g、５０
％グルコース５０ml、１０％ＮＺ−アミンＹＴ１０００
ml、１ＭＭgＳＯ4１００ml、２．７％ＦeＣl3５ml、微
量金属５ml、５mg／mlテトラサイクリン１ml、消泡剤５
mlおよび水６．５l。培地の開始pＨを、Ｈ2ＳＯ4を滴下
して加えることにより７．５に調節し、１０lの発酵装
置(ファーメンター)に接種培養物５００mlを播き、実験
作業を開始した。実験中、温度を３７℃に維持し、通気
下で培養物を撹拌した。外部装置から、流速０．５ml／
分で、細胞にグルコース(５０％)を与えた。ＯＤ５５０
が１０−２５に達したら、pＨ＝７．５、残留グルコー
スレベル＜１／４(％)になる様、グルコースの投与速度
を調節した。ＯＤ５５０が２５に達したならば、グルコ
ース投与速度を調節してdo2レベルを３０％にし、それ
以後は、do2レベルを３０％に維持する様、グルコース
の投与速度を定期的に調節した。発酵開始から３６時間
後に細胞を殺し、収穫した。グルコースの供給と通気は
止めたが、撹拌(速度６５０rpm)は維持した。ファーメ
ンターに、直ぐに１−ブタノールを加えて終濃度を１．
５％にし、即座に、ファーメンタージャケット内へ蒸気
を導き入れ、タンク内の温度を素早く５０℃に昇温し
た。温度が５０℃に達したら、この温度のまま、１０分
間維持した。次いで、ファーメンターを２０℃以下に急
冷し、ファーメンター内の細胞内容物を遠心して収穫し
た。まず、細胞ペーストを−２０℃で冷凍してから、−
８０℃のフリーザーに移した。
増殖させる。pＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧＨを含有している大
腸菌Ｗ３１１０形質転換体(tonＡ、phoＡ、phoＴ、実施
例９で調製)を、滅菌した２lのフラスコに入れた、テト
ラサイクリン０．５μg／mlを含むＬＢ培地５００mlに
接種した。この培養物をロータリー・シェーカー内で３
７℃において８時間インキュベートした。以下の成分を
含有する滅菌した１０lの発酵培地を調製した:Ｋ2ＨＰ
Ｏ4２６g、ＮaＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ１３g、ＫＣl１５g、
(ＮＨ4)2ＳＯ4５０g、クエン酸ナトリウム１０g、５０
％グルコース５０ml、１０％ＮＺ−アミンＹＴ１０００
ml、１ＭＭgＳＯ4１００ml、２．７％ＦeＣl3５ml、微
量金属５ml、５mg／mlテトラサイクリン１ml、消泡剤５
mlおよび水６．５l。培地の開始pＨを、Ｈ2ＳＯ4を滴下
して加えることにより７．５に調節し、１０lの発酵装
置(ファーメンター)に接種培養物５００mlを播き、実験
作業を開始した。実験中、温度を３７℃に維持し、通気
下で培養物を撹拌した。外部装置から、流速０．５ml／
分で、細胞にグルコース(５０％)を与えた。ＯＤ５５０
が１０−２５に達したら、pＨ＝７．５、残留グルコー
スレベル＜１／４(％)になる様、グルコースの投与速度
を調節した。ＯＤ５５０が２５に達したならば、グルコ
ース投与速度を調節してdo2レベルを３０％にし、それ
以後は、do2レベルを３０％に維持する様、グルコース
の投与速度を定期的に調節した。発酵開始から３６時間
後に細胞を殺し、収穫した。グルコースの供給と通気は
止めたが、撹拌(速度６５０rpm)は維持した。ファーメ
ンターに、直ぐに１−ブタノールを加えて終濃度を１．
５％にし、即座に、ファーメンタージャケット内へ蒸気
を導き入れ、タンク内の温度を素早く５０℃に昇温し
た。温度が５０℃に達したら、この温度のまま、１０分
間維持した。次いで、ファーメンターを２０℃以下に急
冷し、ファーメンター内の細胞内容物を遠心して収穫し
た。まず、細胞ペーストを−２０℃で冷凍してから、−
８０℃のフリーザーに移した。
【００８８】−８０℃で凍結されている細胞ペースト
を、４℃で一夜解凍し、以後の工程を４℃で行った。こ
のペーストを４倍量の１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝８．
０)と混合し、ウルトラ−タレックス(Ｕltra−Ｔurrex)
ホモジナイザー中で３０秒間、懸濁した。この懸濁液を
３０秒間撹拌した後、１２,０００×gで３０分間遠心す
ることにより、細胞を除去した。上清中のペリプラズム
タンパク質は、０．５〜１g／l／１００(ＯＤ５５０)の
成熟hＧＨを含んでおり、全hＧＨの約９５％がプロセシ
ングされてペリプラズムに含有されていた(ペルオキシ
ダーゼ結合抗hＧＨを用いたイムノプロット(免疫ブロッ
ティング法)により見積った。全細胞性hＧＨの約５０−
６０％を上清中に回収した。この上清に含まれるタンパ
ク質重量の約２０％はhＧＨであった。
を、４℃で一夜解凍し、以後の工程を４℃で行った。こ
のペーストを４倍量の１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ＝８．
０)と混合し、ウルトラ−タレックス(Ｕltra−Ｔurrex)
ホモジナイザー中で３０秒間、懸濁した。この懸濁液を
３０秒間撹拌した後、１２,０００×gで３０分間遠心す
ることにより、細胞を除去した。上清中のペリプラズム
タンパク質は、０．５〜１g／l／１００(ＯＤ５５０)の
成熟hＧＨを含んでおり、全hＧＨの約９５％がプロセシ
ングされてペリプラズムに含有されていた(ペルオキシ
ダーゼ結合抗hＧＨを用いたイムノプロット(免疫ブロッ
ティング法)により見積った。全細胞性hＧＨの約５０−
６０％を上清中に回収した。この上清に含まれるタンパ
ク質重量の約２０％はhＧＨであった。
【００８９】実施例９ 宿主生物Ｗ３１１０tonＡ、pho
Ａ、phoＴの組立て 発酵のための宿主生物は、Ｐ１から導かれたファージを
用いた、形質導入を含む標準的な手法により、いくつか
の工程で組立てた[Ｊ．ミラー(Ｊ．Ｍiller)、エクスペ
リメンツ・イン・モレキュラー・ジェネテックス(Ｅxpe
riments inＭolecular Ｇenetics)]、phoＴおよびpho
Ａ突然変異を、遺伝的に結合した抗生物質耐性トランス
ポゾンを利用して、順次、大腸菌からＷ３１１０tonＡ
株に、共形質導入(コトランスジュース)した。最初に導
入されたphoＴ突然変異の存在は、これらの形質導入体
が高ホスフェート、ホスホクロモゲン−含有プレート
(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ホスフェ
ート)上で青色のコロニーを形成することにより、確認
された。phoＡ突然変異の導入は、その形質導入体が、
低ホスフェート、ホスホクロモゲン上で白色のコロニー
を形成することにより確認された。このphoＴ突然変異
体、または同様にして組立てられたphoＲ突然変異体をp
ＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧＨで形質転換すると、それらは、
発酵の全過程を通じて、全hＧＨの９０％以上をペリプ
ラズム間隙に分泌する。他方、Ｗ３１１０の様な、非組
織的な細菌は、ペリプラズムに約５０％のhＧＨしか分
泌せず、また、いくつかの例では全hＧＨの発現レベル
も幾分低かった。phoＡ突然変異体の存在または不存在
は、ヘテロローガスなタンパク質の収量に、殆んど、ま
たは全く変化をもたらさなかった。しかしながら、pho
Ａ突然変異体はＡＰを分泌しないので、phoＡ突然変異
体からペリプラズム性hＧＨを精製する工程において、
ＡＰの分離が必要でない。
Ａ、phoＴの組立て 発酵のための宿主生物は、Ｐ１から導かれたファージを
用いた、形質導入を含む標準的な手法により、いくつか
の工程で組立てた[Ｊ．ミラー(Ｊ．Ｍiller)、エクスペ
リメンツ・イン・モレキュラー・ジェネテックス(Ｅxpe
riments inＭolecular Ｇenetics)]、phoＴおよびpho
Ａ突然変異を、遺伝的に結合した抗生物質耐性トランス
ポゾンを利用して、順次、大腸菌からＷ３１１０tonＡ
株に、共形質導入(コトランスジュース)した。最初に導
入されたphoＴ突然変異の存在は、これらの形質導入体
が高ホスフェート、ホスホクロモゲン−含有プレート
(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ホスフェ
ート)上で青色のコロニーを形成することにより、確認
された。phoＡ突然変異の導入は、その形質導入体が、
低ホスフェート、ホスホクロモゲン上で白色のコロニー
を形成することにより確認された。このphoＴ突然変異
体、または同様にして組立てられたphoＲ突然変異体をp
ＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧＨで形質転換すると、それらは、
発酵の全過程を通じて、全hＧＨの９０％以上をペリプ
ラズム間隙に分泌する。他方、Ｗ３１１０の様な、非組
織的な細菌は、ペリプラズムに約５０％のhＧＨしか分
泌せず、また、いくつかの例では全hＧＨの発現レベル
も幾分低かった。phoＡ突然変異体の存在または不存在
は、ヘテロローガスなタンパク質の収量に、殆んど、ま
たは全く変化をもたらさなかった。しかしながら、pho
Ａ突然変異体はＡＰを分泌しないので、phoＡ突然変異
体からペリプラズム性hＧＨを精製する工程において、
ＡＰの分離が必要でない。
【図１】 図１はＳＴＩＩ遺伝子の翻訳および非翻訳領
域を含めたヌクレオチド配列および、推定のアミノ酸配
列の模式図である。
域を含めたヌクレオチド配列および、推定のアミノ酸配
列の模式図である。
【図２】 図２はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
組立て工程の１部を示す模式図である。
組立て工程の１部を示す模式図である。
【図３】 図３はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
組立て工程の１部を示す模式図である。
組立て工程の１部を示す模式図である。
【図４】 図４はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
組立て工程の１部を示す模式図である。
組立て工程の１部を示す模式図である。
【図５】 図５はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
組立て工程の１部を示す模式図である。
組立て工程の１部を示す模式図である。
【図６】 図６はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
組立て工程の１部を示す模式図である。
組立て工程の１部を示す模式図である。
【図７】 図７はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
組立て工程の１部を示す模式図である。
組立て工程の１部を示す模式図である。
【図８】 図８はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨのh
ＧＨ遺伝子の近辺のヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。
ＧＨ遺伝子の近辺のヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。
【図９】 図９はプラスミドptrp−ＳＴＩＩ−hＧＨの
制限サイトおよび機能地図の模式図である。
制限サイトおよび機能地図の模式図である。
【図１０】 図１０はプラスミドpＡＰ１およびpＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
【図１１】 図１１はプラスミドpＡＰ１およびpＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
【図１２】 図１２はプラスミドpＡＰ１およびpＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
【図１３】 図１３はプラスミドpＡＰ１およびpＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
【図１４】 図１４はプラスミドpＡＰ１およびpＡＰ−
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
ＳＴＩＩ−hＧＨの組立て工程の１部を示す模式図であ
る。
【図１５】 図１５はプラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧ
Ｈの、ＡＰプロモーター領域、ＳＴＩＩシグナルおよび
hＧＨ遺伝子部分のヌクレオチド配列の前半部を示す模
式図である。
Ｈの、ＡＰプロモーター領域、ＳＴＩＩシグナルおよび
hＧＨ遺伝子部分のヌクレオチド配列の前半部を示す模
式図である。
【図１６】 図１６はプラスミドpＡＰ−ＳＴＩＩ−hＧ
Ｈの、ＡＰプロモーター領域、ＳＴＩＩシグナルおよび
hＧＨ遺伝子部分のヌクレオチド配列の後半部を示す模
式図である。
Ｈの、ＡＰプロモーター領域、ＳＴＩＩシグナルおよび
hＧＨ遺伝子部分のヌクレオチド配列の後半部を示す模
式図である。
【図１７】 図１７はpＡＰ−１のＡＰプロモーター領
域、ＡＰシグナルおよびhＧＨ遺伝子部分のヌクレオチ
ド配列の前半部を示す模式図である。
域、ＡＰシグナルおよびhＧＨ遺伝子部分のヌクレオチ
ド配列の前半部を示す模式図である。
【図１８】 図１８はpＡＰ−１のＡＰプロモーター領
域、ＡＰシグナルおよびhＧＨ遺伝子部分のヌクレオチ
ド配列の後半部を示す模式図である。
域、ＡＰシグナルおよびhＧＨ遺伝子部分のヌクレオチ
ド配列の後半部を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 グレゴリー・ローレンス・グレイ アメリカ合衆国カリフォルニア94080、 サウス・サン・フンシスコ、エルム・コ ート530番 (72)発明者 ヘルベルト・ルイス・ハイネカー アメリカ合衆国カリフォルニア94010、 ヒルズボロウ、ローハンプトン・ロード 501番 (72)発明者 ナンシー・シャドウィック・マクファー ランド アメリカ合衆国カリフォルニア94070、 サン・カーロス、ホワイトオーク・ウェ イ2019番 (72)発明者 ケネス・チャールズ・オルソン アメリカ合衆国カリフォルニア94010、 バーリンゲイム、ヒルサイド・ドライブ 3036番 (72)発明者 ロン−チャン・ペイ アメリカ合衆国カリフォルニア94404、 フォスター・シティ、ブライス・ストリ ート1136番 (72)発明者 マイケル・ウイラード・レイ アメリカ合衆国カリフォルニア94403、 サン・マテオ、エイ・プロスペクト・ロ ウ611番
Claims (1)
- 【請求項１】 成熟ヒト成長ホルモンの配列を有するタ
ンパク質をコードしているＤＮＡであって、ヒト成長ホ
ルモンのアミノ末端をコードしているＤＮＡ領域でアル
カリホスファターゼまたはエンテロトキシンのシグナル
配列をコードしているＤＮＡと直接結合しているＤＮ
Ａ。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65809584A | 1984-10-05 | 1984-10-05 | |
| US06/658,342 US4963495A (en) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | Secretion of heterologous proteins |
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| US6027919A (en) | 1993-12-07 | 2000-02-22 | Genetics Institute, Inc. | BMP-12 and BMP-13 proteins and DNA encoding them |
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