JP2005515779A - アグレカナーゼ分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年1月31日に出願された米国仮特許出願第60/303,680号の優先権の利益によるものであり、これは出典明示に本発明に含まれる。
本発明は、新規アグレカナーゼ(アグレカナーゼ)分子をコードしているヌクレオチド配列、アグレカナーゼタンパク質およびそのフラグメントならびにそれらを産生する方法の知見に関する。本発明はさらに、アグレカナーゼ酵素の阻害剤およびその抗体の同定および開発に関する。これらの阻害剤および抗体は、骨関節症を含む種々のアグレカナーゼ関連症状の治療に有用であり得る。
アグレカンは、関節軟骨の主要な細胞外成分である。それは、軟骨に圧縮性および弾力性というその機能特性を付与する原因たるプロテオグリカンである。アグレカンの喪失は、関節疾患における関節軟骨の崩壊に関与している。骨関節症は、少なくとも三千万人のアメリカ人に影響を及ぼしている衰弱性の疾患である(MacLean et al., J Rheumatol 25:2213-8 (1998))。骨関節症は、関節軟骨の崩壊および結果的に生じる慢性痛のために生活の質をかなり低下させ得る。骨関節症のプロセスの初期の、そして重要な特徴は、細胞外マトリックスからのアグレカンの喪失である(Brandt and Mankin, 骨関節炎の病因(Pathogenesis of Osteoarthritis), in Textbook of Rheumatology, WB Saunders Company, Philadelphia, PA, at 1355-1373 (1993))。アグレカンの大部分のシュガー含有部分がそれにより細胞外マトリックスから喪失され、軟骨の生物力学な特徴の欠損を生じる。
本発明は、アグレカンを切断することができる新規アグレカナーゼタンパク質分子、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、およびアグレカナーゼの産生のためのプロセスを指向する。これらの酵素は、タンパク質分解性アグレカナーゼ活性を有するとして特徴付けられるものとする。本発明は、これらの酵素を含む組成物をさらに含む。
図1Aおよび1Bは、ADAMTS−18(EST18)の全長ヌクレオチド配列を示す(配列番号1)。
本発明がより容易に理解できるように、ある種の用語を最初に定義する。付加的な定義は、詳細な記載全体にわたって説明される。
配列番号2またはそのフラグメントのアミノ酸と、実質的に類似したまたは実質的に同一であるアミノ酸配列;あるいは、配列番号2またはそのフラグメントのアミノ酸と、少なくとも約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%同一であるアミノ酸配列を含む。さらに、「アグレカナーゼ」なる用語は、開示した配列番号1、そのフラグメントおよび変異体の核酸配列によりコードされるタンパク質を含む。一の具体例において、本発明の核酸は、遺伝子をコードする天然のアグレカナーゼの変異体またはそのフラグメント由来のまたはその配列を有するだろう。
一の具体例において、本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列は、配列番号1(図1Aおよび1B)のヌクレオチド#1−ヌクレオチド#3663を含む、配列番号1に記載する。さらに、本発明は、アグレカナーゼ活性を示すタンパク質をコードする、配列番号1に記載の配列ならびにそのフラグメントおよび変異体の、等価縮重コドン配列を含む。本発明の核酸配列は、その天然に生じる配列および変異体および人工的に形成されるものを含む。本発明のアグレカナーゼ分子をコードする全長ヌクレオチド配列は、一の具体例において、例えば配列番号3に記載のヌクレオチド配列を用いることにより得ることができ、標準的な技法を用いるアグレカナーゼヌクレオチド配列のスクリーニング用のプローブを設計する。
アグレカナーゼをコードするか、あるいは、アグレカナーゼ活性を有する関連タンパク質をコードするさらなるヒト配列が存在すること、および他の種がヒトアグレカナーゼ酵素の変異体であるタンパク質をコードするDNA配列を有することが期待される。したがって、本発明は、アグレカナーゼタンパク質をコードするDNA配列およびその変異体を得る方法、該方法により得られるDNA配列およびDNA配列によりコードされるタンパク質またはポリペプチドを含む。一のかかる方法は、本発明のヌクレオチド配列またはその部分を用いて、他の種からの対応するヌクレオチド配列またはそのコーディング配列もしくはフラグメントに関するライブラリーを標準的な方法を用いてスクリーニングするためのプローブを設計することを含む。かくして、本発明は、アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ−様ポリペプチドまたはその部分をコードし、ヒトアグレカナーゼヌクレオチド配列を用いて得ることができる種からのDNA配列を含んでいてもよい。また、本発明は、アグレカナーゼタンパク質の機能的フラグメント、およびかかる機能的フラグメントをコードするDNA配列ならびにアグレカナーゼまたはアグレカナーゼ−様活性を有する関連タンパク質の機能的フラグメントを含んでいてもよい。かかるフラグメントのアグレカナーゼのように機能する能力は、ポリペプチドまたはタンパク質を用いて、アグレカナーゼタンパク質の活性を測定することに関して記載された多くの生物学的アッセイの1つにより測定する。
本発明の範囲内の核酸配列は、記載した天然のアグレカナーゼDNA配列と、中程度から高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする単離DNAおよびRNA配列を含む。ストリンジェント条件または高度にストリンジェントな条件は、一般的には、高温および低塩濃度を用いるハイブリダイゼーションおよび洗浄を意味する。また、加えて、ホルムアミドの含有もストリンジェンシーを増加させる。例えば、ホルムアミド非存在下50〜65℃のハイブリダイゼーション条件または50%のホルムアミドと42℃のハイブリダイゼーション条件は、両方とも高度なストリンジェンシー条件である。
本発明の他の態様により、新規アグレカナーゼタンパク質を産生するための方法を提供する。一の具体例において、本発明の方法は、公知の調節配列の制御下で、配列番号1に示される配列で形質転換し、配列番号2に示される本発明のアグレカナーゼタンパク質中にDNAを翻訳する、適当な細胞株を培養することを含む。形質転換した宿主細胞を培養し、アグレカナーゼタンパク質を、培地から回収して、単離した。単離発現タンパク質は、同時に産生される他のタンパク質ならびに他の混入物質から実質的に分離している。回収した単離タンパク質は、アグレカンを切断すると考えられるタンパク質分解アグレカナーゼ活性を示す。かくして、本発明のタンパク質は、アグレカン変性分子の存在を測定するアッセイにおけるアグレカナーゼタンパク質分解活性を示す能力により、さらに特徴づけることができる。これらのアッセイまたはその開発は、当業者の知識の範囲内にある。かかるアッセイは、アグレカン基質をアグレカナーゼ分子と接触させ、アグレカンフラグメントの産出をモニターすることを含みうる(例えば、Hughes et al., Biochem J 305: 799-804 (1995); Mercuri et al., J Biol. Chem 274:32387-32395 (1999)を参照)。適当な細胞または細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞であってもよい。適当な哺乳類宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の産生および精製方法は、当該分野で公知である(例えば、Gething and Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981); Kaufman et al., Mol Cell Biol, 5(7):1750-1759 (1985); Howley et al., U.S. Patent 4,419,446.)を参照)。本明細書中の実施例に記載する他の適当な哺乳類細胞株は、サルの腎臓COS−1細胞株である。哺乳類細胞CV−1も用いることができる。
本発明の単離タンパク質を用いて、アグレカナーゼおよび/または他のアグレカナーゼ関連タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナルいずれかの抗体を、当該分野で一般的に知られている抗体産生方法を用いて産生することができる。かくして、本発明は、アグレカナーゼまたは他の関連タンパク質に対する抗体も含む。抗体は、アグレカナーゼ活性を遮断する抗体および遮断しない抗体の両方を含む。抗体は、アグレカナーゼまたは関連タンパク質の検出および/または精製に有用であり、またはアグレカナーゼの作用を阻害または予防するのに有用であり得る。本発明のアグレカナーゼまたはその部分は、アグレカナーゼに特異的に結合する抗体を調製するのに利用することができる。
変形性関節症のような種々の症状が、アグレカンの分解により特徴付けられることは公知のことである。したがって、アグレカンを切断する本発明のアグレカナーゼタンパク質は、アグレカナーゼの阻害剤を開発するのに有用であり得る。したがって、本発明は、アグレカナーゼ阻害剤を含有する組成物を提供する。該阻害剤は、後でアグレカンに暴露する、アグレカナーゼ活性の阻害剤を含むアグレカン基質の混合物が関与するクリーニングアッセイにおいて、アグレカナーゼ分子を用いて開発することができる。該阻害剤は、高速処理を用いて、例えば阻害剤のライブラリーをスクリーニングすることによりスクリーニングすることができる。また、該阻害剤は、三次元構造分析および/またはコンピュータ薬剤設計を用いて作成することもできる。該方法は、アグレカナーゼおよびアグレカンの三次元構造に基づく阻害剤の結合部位を決定すること、およびアグレカナーゼまたはアグレカンの結合部位に対して反応性である分子を開発することを含みうる。候補分子を阻害活性に関してアッセイする。アグレカナーゼ分子の阻害剤を開発するためのさらなる標準的な方法は、当業者に公知のものである。阻害剤に関するアッセイは、アグレカンおよび阻害剤の混合物をアグレカナーゼ分子と接触させ、ついで、アグレカナーゼ感受性部位での切断により産生されるアグレカンフラグメントを検出および測定することにより、アグレカナーゼ阻害の測定を行うことを含む。阻害剤は、タンパク質または小分子であってもよい。
アグレカナーゼ活性の阻害剤は、下記疾患の治療に用いることができる。また、阻害剤は、上記アッセイおよび検出方法においても用いることができる。本発明のアグレカナーゼの阻害剤を用いることにより治療することができると考えられる種々の疾患は、限定するものではないが、変形性関節症、癌、炎症性関節疾患、関節リウマチ、敗血症性関節炎、歯周病、角膜潰瘍、タンパク尿、動脈硬化性プラーク破裂からの冠状動脈血栓症、動脈瘤性大動脈疾患、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸窮迫症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、脳および造血器悪性腫瘍、骨粗鬆症、パーキンソン病、偏頭痛、鬱病、末梢神経障害、ハンチントン病、多発性硬化症、眼の血管新生、黄斑変性症、大動脈瘤、心筋梗塞、自己免疫疾患、外傷性関節傷害後の変性軟骨損失、頭部外傷、ジストロフィー性表皮水疱症、脊髄損傷、急性および慢性神経変性疾患、骨骨膜炎、側頭骨顎関節疾患、神経系の脱髄性疾患、臓器移植毒性および拒絶反応、悪液質、アレルギー、組織性潰瘍、再狭窄およびアグレカナーゼ活性またはアグレカナーゼレベルの変化により特徴付けられる他の疾患を含む。
本発明の他の態様により、医薬上許容されるビヒクル中に治療的に有効な量の少なくとも1つのアグレカナーゼ抗体および阻害剤を含有する医薬組成物を提供する。軟骨細胞におけるアグレカンのアグレカナーゼ介在分解は、骨関節症および他の炎症性疾患に関与している。したがって、本発明のこれらの組成物は、アグレカンの分解および/またはアグレカナーゼ活性またはアグレカナーゼのレベルのアップレギュレーションにより特徴づけられる疾患の治療に用いることができる。
本発明の阻害剤および抗体は、サンプル中のアグレカナーゼの存在または不在を測定するための、またはそれを定量するためのアッセイおよび検出方法に用いることができる。本発明の阻害剤および抗体を用いて、インビボまたはインビトロでアグレカナーゼタンパク質を検出することができる。これらのタンパク質の存在またはレベルを疾患と関連づけることにより、当業者は、関連する疾患を診断し、その重篤度を決定することができる。開示される阻害剤および抗体により診断され得る疾患は上記した。
実施例1:DNAの単離
潜在的な新規アグレカナーゼファミリーメンバーを、データベーススクリーニング法を用いて同定した。アグレカナーゼ−1(Science 284:1664-1666 (1999))は、少なくとも6つのドメイン:シグナル、プロペプチド、触媒ドメイン、ディスインテグリン、tsp(トロンボスポンジン)およびc−末端を有する。触媒ドメインは、亜鉛結合特性領域、TAAHELGHVKF(配列番号6)および「METターン」を含み、これらがプロテアーゼ活性の原因である。多くの位置における亜鉛結合領域内での置換により、プロテアーゼ活性が許容されるが、ヒスチジン(H)およびグルタミン酸(E)残基は存在しなければならない。また、アグレカナーゼ−1のトロンボスポンジンドメインは、基質の認識および切断に重要なドメインである。これら2つのドメインは、新規アグレカナーゼファミリーメンバーの分類を決定する。アグレカナーゼ−1DNA配列のコーディング領域を用いて、ヒトESTに関してGeneBank ESTに、TBLASTNを用いて問い合わせた。得られた配列は、潜在的なファミリーメンバーの配列を同定する試みにおける開始点であった。本発明のアグレカナーゼの特定のヌクレオチド配列を、ADAMTS−18またはEST18と呼ばれ、図1Aおよび1B(配列番号1)に示す。
は、3つの保存システイン残基およびフリン部位を含有する。触媒ドメインは、典型的な亜鉛結合モチーフにより特徴付けられる。亜鉛結合配列のアップストリームに5つの保存システイン残基および亜鉛結合配列のダウンストリームに3つの残基を含有する。また、亜鉛結合配列のダウンストリームに保存メチオニン「Met−turn」を含有する。ディスインテグリン−様ドメインは、8つのシステイン残基を含有する。TSPモジュールは、ヘパリン結合ドメイン(WXXWXXW);CD36−結合モチーフ(CSRTCGG)(配列番号15);および6つの保存システイン残基を含有する。システインに富むドメインは、10の保存システインを含有することにより特徴付けられる。このスペーサードメインは、2つ半がクローン化されている、TSP−リピートにより特徴付けられる。アグレカナーゼのN−末端部位は、上記の配列を用いてクローン化することができる。TSPサブ−モチーフは、シグニチャーWXXXXWにより開始され、6つのシステインを含有する。図4の第3のモチーフは、4つのシステインを有する。
Clontechヒトマルチプル組織発現アレイMTETM(Clontechカタログ番号:7776−1)を、評者の指示に従って、533塩基対α−32PdCTP−標識cDNAプローブで精査した。プローブ標識化およびハイブリダイゼーションは、下記のように行った:5μgのA18FSプラスミド(下記する)を、業者の説明に従って、その適当な緩衝液中EcoRI酵素で消化した。制限消化物を、1%のアガロースゲル上に分画し、配列番号2のアミノ酸#1(メチオニン)〜アミノ酸#174(アスパラギン)を含むEST18タンパク質配列をコードする533塩基対フラグメントを、上記したようにアガロースゲルから回収した。α−32P dCTP−標識化プローブを、Amersham PharmaciaのReady−To−Go kit(カタログ番号:27−9240−01、Pharmacia)を利用して作成した。簡単には、30ngの心臓変性DNAを37℃で15分間、50μCiのα−32P dCTPおよび一の標識ビーズとインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を、予備平衡化したPharmacia NICKカラム(カタログ番号:17−0855−02)に付して、組み込まれていないα−32P dCTPを標識プローブから除去した。脱塩したプローブをアッセイし、15×106cpmを、5mlの予備加熱した発現Hybに加えた。ついで、ハイブリダイゼーション混合物を、予備ハイブリダイゼーション化MTEに移した。ハイブリダイゼーションを、65℃で一晩撹拌して進行させた。
EST18ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の切断形態を、融合タンパク質として発現した。一のかかる切断タンパク質、A18FSは、EST18ヌクレオチド配列によりコードされる最初の650のアミノ酸、アミノ酸#1(メチオニン)〜アミノ酸#650(フェニルアラニン)を意味する。発現の構成は2工程からなる。最初に、EST18ヌクレオチド配列の5’末端を、5’RACEにより同定される付加的なコーディングヌクレオチド配列を含むように修飾する。第2に、構成にはフェニルアラニンのコドンで停止するようにオープンリーディングフレームがある。ストレプトアビジンタグ配列を、組み換えタンパク質の精製を補助するために加えた。
5' AATTCCCACCATGGAGTGCGCCCTCCTGCTCGCGTGTGCCT 3'(配列番号21);
5' CCCACCATGGAGTGCGCCCTCCTGCTCGCGTGTGCCTTCCCGGCTGCG 3'(配列番号22);
5' TCCCGGCTGCGGGTTCGGGCCCGCCGAGGGGCCTGGCGGGACTGGGGCGCGTGGCCAAG 3'(配列番号23);
5' GGTTCGGGCCCGCCGAGGGGCCTGGCGGGACTGGGGCGCGTGGCCAAGGCGCTCCAGCT 3'(配列番号24);
5' GCGCTCCAGCTGTGCTGCCTCTGCTGTGCGTCGGTCGCCGC 3'(配列番号25);および
5' GTGCTGCCTCTGCTGTGCGTCGGTCGCC 3'(配列番号26)。
ライゲーション混合物のアリコートを、Gibco Life Technologies ElectroMax DH10B細胞に形質転換し、組み換えプラスミドの配列を配列決定により確認した。
A18FS切断およびストレプトアビジンタグ化:A18FSを、下記のプライマー対:
フォワードプライマー5' CTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCG 3'(配列番号27)および
リバースプライマー5'CCCTTGCAATGAAAATAGCTTGGATTTTGGAAGCGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAAGGCGGCCGCCGCAAA 3'(配列番号28)、
およびテンプレートとしてEST18ヌクレオチド配列を用いてPCR増幅した。フォワードプライマーは、独自の制限部位BglIIを含有し、リバースプライマーは、独自の制限部位NotIを含有し、予備消化発現ベクターに直接クローニングが可能であった。また、リバースプライマーは、エピトープタグとして機能する得られたタンパク質配列GSAWSHPQFEK(配列番号29)を含む。
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳類アグレカナーゼ−関連タンパク質を産生するために、アグレカナーゼタンパク質をコードするDNAを、適当な発現ベクターにクローン化し、哺乳類細胞または昆虫細胞培養系を含む他の好ましい真核細胞もしくは原核細胞宿主に、慣用的な遺伝子工学法を用いて導入した。生物学的に活性な組み換えヒトアグレカナーゼの発現系は、安定に形質転換された哺乳類、昆虫、酵母または細菌細胞を含むことを意図する。
5' CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG 3' (配列番号31)
PstI Eco RI XhoI
5 CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT
TaqI
GAAAAACACGATTGC 3' (配列番号 32)
XhoI
を有する5’TaqI突出末端および3’XhoI突出末端を用いて合成する。
発現したアグレカナーゼ関連タンパク質、例えば、上記実施例4で得たタンパク質の生物学的活性を測定するために、タンパク質を細胞培養物から回収し、ついでアグレカナーゼ関連タンパク質を、同時産生される他のタンパク質物質ならびに他の混入物質から単離することにより精製した。精製は、当業者に公知の標準的な方法を用いて行う。単離タンパク質は、以下のアッセイに従ってアッセイすることができる。
ウシ関節軟骨を、単離ADAMTS−18と一緒に16時間37℃で、100mMのNaClおよび5mMのCaCl2を含有する、50mMのTris(pH7.3)中でインキュベートした。消化産物を、2時間37℃で、コンドロイチナーゼABC(Seikagaku America, Falmouth, MA;1mU/μgのアグレカン)、ケラチナーゼ(Seikagaku, 1mU/μgのアグレカン)およびケラチナーゼII(Seikagaku;0.02mU/μgのアグレカン)の存在下、インキュベートすることにより脱グリコシル化した。SDS−PAGEにより分離した後、消化産物を、ニトロセルロースに移し、アグレカンのG1およびG2ドメインの間に位置するアグレカナーゼ−感受性E373−A374ペプチド結合を開裂することにより産生されるC末端ネオエピトープ配列−NITEGE373(配列番号33)を認識する、ネオエピトープ(モノクローナル)抗体AGG−C1で、ウェスタン免疫ブロッティングにより検出した(図10)。
新規アグレカナーゼ分子に対する抗体を調製する。アグレカナーゼ活性を阻害することができる抗体を開発するために、マウスの1群を、最初の2回の免疫化のためにはフロイント完全アジュバントに、およびその後は不完全フロイントアジュバント中に混合した新規アグリカナーゼタンパク質で、2週間ごとに免疫化する。免疫期間を通じて、血液をサンプル化し、循環抗体の存在に関して試験する。9週目に、循環抗体を有する動物を選択し、その後3日間免疫化し、ついで屠殺する。脾臓を取り出し、細胞中に均質化した。脾臓細胞を骨髄腫融合パートナー(細胞株P3−x63−Ag8.653)と、50%のPEG1500を用いる確立された方法を用いて(Oi & Herzenberg, 細胞免疫学における選択された方法(Selected Methods in Cellular Immunology), W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, at 351 (1980))融合する。融合細胞を96−ウェルのマイクロタイタープレートに、2×105細胞/ウェルの密度で蒔く。24時間後、細胞をHAT選択に供し(Littlefield, Science, 145: 709 (1964))、効果的にあらゆる非融合性および非増殖性融合骨髄腫細胞を殺滅する。
上記した本発明に従って調製される抗−アグレカナーゼ抗体を用いて、サンプル中のアグレカナーゼのレベルを検出することができる。抗体をELISAで用いて、例えば、サンプル中のアグレカナーゼの存在または不在を同定すること、またはその量を定量することができる。抗体は、蛍光タグで標識することができる。一般的には、サンプル中のアグレカナーゼのレベルは、上記したアッセイのいずれかを用いて測定することができる。
上記した方法に従って開発した抗体は、アグレカンの欠損またはアグレカナーゼ活性の増加に関連する疾患または障害を患っている患者に投与することができる。患者は、その疾患または障害の症状および徴候が改善するまで、一度、または一日一回というように間隔をあけて組成物を摂取する必要があり得る。例えば、本発明の組成物を患者に投与した後、アグレカンの欠損が減少するか、またはなくなり、関節軟骨の崩壊が減少するか、またはなくなる。骨関節症の症状が低下するかまたは排除されることが期待される。これにより、本発明の組成物が、アグレカンの欠損またはアグレカナーゼのレベルおよび/または活性の増加に関連する疾患または障害の治療に有用であることが示されるだろう。また、抗体は、該疾患のファミリーヒストリーまたはマーカーを有するが、その作用は未だ被り始めていない人など、骨関節症に感受性のある患者に用いることもできる。下記の結果は、患者の治療を期待させるだろう。
Claims (17)
- a)配列番号1のヌクレオチド#1〜#3663の配列;
b)配列番号1のフラグメント;
c)配列番号1の変異体;
d)ストリンジェント条件下で配列番号1とハイブリダイゼーションする配列;および
e)(a)〜(d)の天然に生じるヒト対立遺伝子配列および同等の縮重コドン配列:
から選択されるDNA配列を含む単離DNA分子。 - その発現制御配列と作用的に結合している請求項1記載のDNA分子を含むベクター。
- 請求項1のDNA配列で形質転換された宿主細胞。
- 請求項2のDNA配列で形質転換された宿主細胞。
- 単離ヒトアグリカナーゼタンパク質を産生する方法であって、
a)請求項1記載のDNA分子で形質転換された宿主細胞を培養すること;および
b)培地からのDNA分子によりコードされた該アグリカナーゼタンパク質を回収し、精製すること;
を含む方法。 - 該宿主細胞が昆虫細胞である、請求項5記載の方法。
- a)配列番号2のアミノ酸#1〜#1221のアミノ酸配列;
b)配列番号2のフラグメント;
c)(a)〜(b)の配列の付加、置換および欠失変異体から成るアグリカナーゼタンパク質の変異体;
から選択されるアミノ酸配列を含む単離アグレカナーゼタンパク質。 - 下記工程:
a)請求項1記載のDNA分子で形質転換した細胞を培養すること;および
b)配列番号2から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を、該培地から回収し、精製すること;
により産生される単離アグレカナーゼタンパク質。 - 請求項7記載の単離アグレカナーゼタンパク質に結合する抗体。
- 抗体がアグレカナーゼ活性を阻害する、請求項9記載の抗体。
- a)配列番号2から選択されたアグレカナーゼタンパク質またはそのフラグメントを得ること;
b)アグレカナーゼタンパク質を潜在的な阻害剤と組み合わせること;および
c)潜在的な阻害剤がアグレカナーゼ活性を阻害するかどうかを評価すること、
を含む、アグレカナーゼの阻害剤の同定方法。 - 潜在的な阻害剤と組み合わせる前に、三次元構造分析においてアグレカナーゼタンパク質を評価することを含む、請求項11記載の方法。
- 潜在的な阻害剤と組み合わせる前に、コンピュータを用いる薬剤設計プログラムでアグレカナーゼタンパク質を評価することを含む、請求項11記載の方法。
- 請求項9記載の抗体および医薬担体を含む、アグレカナーゼのタンパク質分解活性を阻害する医薬組成物。
- 哺乳類におけるアグレカナーゼの阻害方法であって、該哺乳類にアグレカナーゼ活性を阻害するのに有効な量の、請求項14記載の組成物を投与することを含む方法。
- 組成物を、静脈内、皮下または筋肉内投与する、請求項15記載の方法。
- 組成物を約500μg/kg〜約1mg/kgの投与量で投与する、請求項15記載の方法。
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