MX2013004830A - Metodo para purificar el factor estimulante de colonias de granulocitos humano a partir de e. coli recombinante. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para purificar una gran cantidad de factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos (hG-CSFs) a partir de un E. coli recombinante con alto rendimiento y pureza. De acuerdo con el método de la presente invención, el factor estimulante de colonias de granulocitos humano, idéntico a la forma nativa expresado en el cuerpo humano, se puede purificar fácilmente con alto rendimiento y pureza sin un proceso de activación adicional. En particular, de acuerdo con el método de purificación de la presente invención, las variantes de hG-CSF expresadas en E. coli se remueven eficientemente para obtener hG-CSFs fisiológicamente activos con alta pureza.

Description

MÉTODO PARA PURIFICAR EL FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS HUMANO A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para purificar factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos (hG-CSFs) a partir de un E. coli recombinante . De manera más particular, la presente invención se refiere a un método para purificar factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos (hG-CSFs) a partir de un E. coli recombinante con alta pureza y rendimiento, que comprende las etapas de (a) cultivar un E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un peletizado de células por centrifugación; (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del peletizado de células obtenido en la etapa (a) ; (c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un ácido para separar el precipitado resultante por filtración; (d) aplicar un material filtrado obtenido en la etapa (c) para cromatografía de intercambio catiónico; (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a la cromatografía de interacción hidrofóbica; y (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a la cromatografía de intercambio aniónico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los factores estimulantes de colonias (CSF) se producen por células T, macrófagos, fibroblastos, y células endoteliales, y estas células se distribuyen ampliamente por todo el cuerpo. Los CSFs conocidos incluyen GM-CSF, M-CSF, y G-CSF. Entre ellos, el GM-CSF es un factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos, y actúa sobre las células madre de granulocitos o macrófagos para' inducir su proliferación y diferenciación, estimulando en consecuencia la formación de colonias de granulocitos o macrófagos. El M-CSF (macrófago-CSF) es un factor estimulante de colonias de macrófagos y funciona principalmente para estimular la formación de colonias de macrófagos. El G-CSF ( granulocitos-CSF) es un factor estimulante de colonias de granulocitos, y estimula la formación de colonias de granulocitos e induce la diferenciación final.

Convencionalmente, a fin de aislar y purificar el G-CSF, se cultivan células y las proteínas de G-CSF se aislan del sobrenadante de cultivo. Sin embargo, este método tiene un problema del bajo rendimiento del G-CSF, y de esta manera no es adecuado para la producción en masa. Además, Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd. (Japón) ha desarrollado un método para producir hG-CSF glicosilado en una célula de mamífero al emplear un ADN genómico o cADN que incluye un polinucleótido que codifica hG-CSF (Patentes de Corea NOS . 47178, 53723 y 57582) . Sin embargo, se sabe que la cadena de azúcar del hG-CSF glicosilado no es necesaria para la actividad del hG-CSF y la producción de hG-CSF glicosilado que emplea células de mamífero requiere materiales e instalaciones costosas, y por lo tanto, tal proceso no es económicamente factible.

Ha habido intentos para producir hG-CSF no glicosilado al emplear una célula procariótica . En estos estudios, se producen hG-CSFs que tienen un residuo de metionina unido a la terminal N de los mismos debido al codón de iniciación ATG, pero esta forma es diferente de la forma nativa. Además, el hG-CSF producido en un microorganismo se puede contaminar con impurezas derivadas de células hospedera o materiales de cultivo, y es requerido un proceso "de purificación complicado para la aplicación a la medicina de alta pureza. Adicionalmente, cuando se usa E. coli como una célula hospedera, la mayoría de los hG-CSFs se depositan en las células como cuerpos de inclusión insolubles, y se deben convertir a una forma activa a través de un proceso de replegado, en una pérdida significativa de rendimiento. Durante el proceso, se induce una reducción parcial, formación de disulfuro intramolecular o formación de disulfuro errónea, y de esta manera es necesario un proceso difícil para removerlos y se provoca una pérdida de potencia.

Un residuo de cisteína no participa en la formación del enlace de disulfuro, y de esta manera existe una forma libre, dando por resultado una pérdida adicional de potencia y reducción de estabilidad en una solución de proteina.

Por consiguiente, existe una necesidad por desarrollar un método para la producción en masa de hG-CSFs que no tenga residuos de metionina en su terminal N y de esta manera sea idéntico a la forma nativa aunque use microorganismos .

A fin de resolver los problemas, los presentes inventores han reportado previamente que un nuevo péptido de señal secretor con alta tasa de expresión se prepare al modificar el péptido de señal conocido de la enterotoxina termoresistente II de E. coli (Patente Coreana No. 316347) y se usa para producir hG-CSF nativo. Además, los presentes inventores han preparado un vector de expresión que incluye un gen recombinante que se prepara al enlazar el gen de hG-CSF, en lugar del gen de enterotoxina, junto al péptido de señal modificado de la enterotoxina termoresistente II de E. coli, y han transformado el E. coli con el vector de expresión, expresando en consecuencia los hG-CSFs biológicamente activos en el periplasma al emplear un sistema secretor microbiano (Patente Coreana No. 356140) .

Al usar el sistema microbiano para secretar una proteína en el periplasma, los hG-CSFs nativos que no tienen residuos de metionina en la terminal N se pueden obtener en una forma soluble. Además, las proteínas periplásmicas son normalmente menores que el 10% de la proteína de células totales y de esta manera, se requiere purificación menos costosa de la proteína recombinante que para las proteínas localizadas en el citoplasma. Adicionalmente , no es necesario un procedimiento de alteración célula, y se puede minimizar la contaminación con sacáridos y ácidos nucleicos presentes en el citoplasma. Sin embargo, debido al bajo nivel de expresión en la producción periplásmica , es difícil su industrialización. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un método eficiente para purificar proteínas expresadas con alto rendimiento y pureza.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Problema Técnico Por consiguiente, los presentes inventores se han esforzado en enfrentar los problemas de la técnica previa. Como resultado, descubrieron que los factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos nativos se pueden producir en masa con alta pureza al cultivar E. coli recombinante para obtener proteínas secretoras, y entonces aplicar las proteínas a la precipitación con ácido ? cromatografía de intercambio catiónico ? cromatografía de interacción hidrofóbica -» cromatografía de intercambio aniónico en este orden, completando en consecuencia la presente invención.

Solución al Problema Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para purificar factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos (hG-CSFs) a partir de un E. coli recombinante con alta pureza y rendimiento, que comprende las etapas de: (a) cultivar un E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un peletizado de células por centrifugación; (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del peletizado de células obtenido en la etapa (a) ; (c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un ácido para separar el precipitado resultante por filtración; (d) aplicar un material filtrado obtenido en la etapa (c) a la cromatografía de intercambio catiónico; (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a la cromatografía de interacción hidrofóbica; y (f) aplicar un eluato contenido en la etapa (e) a la cromatografía de intercambio aniónico.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar hG-CSFs sin variantes, fisiológicamente activos con alta pureza que se aislen y purifiquen a partir del E. coli recombinante por el método anterior.

Efectos Ventajosos de la Invención De acuerdo con el método de la presente invención, el factor estimulante de colonias de granulocitos humano, idéntico a la forma nativa expresada en el cuerpo humano, se puede purificar fácilmente con alto rendimiento y pureza si un proceso de activación adicional. En particular, de acuerdo con el método de la presente invención, las variantes de hG-CSF expresadas en el E. coli se remueven eficientemente para obtener hG-CSFs fisiológicamente activos con alta pureza.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra los resultados del SDS-PAGE de cada solución obtenida de las etapas de extracción osmótica, precipitación con ácido, cromatografía de intercambio catiónico, y cromatografía de interacción hidrofóbica de los hG-CSFs que se purifican del periplasma del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación de la presente invención, en el cual Carril 1: Estándar Carril 2: Sobrenadante de la centrifugación primaria de la etapa (b) Carril 3: Sobrenadante de centrifugación secundaria de la etapa (b) Carril 4: Sobrenadante obtenido por precipitación con ácido de la etapa (c) Carril 5: Material filtrado obtenido por filtración de la etapa (c) Carril 6: Flujo de columna de la columna SP-sefarosa de la etapa (d) Carril 7: Flujo de eluato 1 de columna de la columna de SP-sefarosa de la etapa (d) Carril 8: Flujo de eluato 2 de columna de la columna de SP-sefarosa de la etapa (d) Carril 9: Flujo de eluato 2 de columna de la columna de butil-sefarosa de la etapa (e) Carril 10: Flujo de eluato 2 de columna de la columna de butil-sefarosa de la etapa (e) ; la FIGURA 2 muestra el resultado del SDS-PAGE del eluato de columna que se obtiene por cromatografía de intercambio aniónico del método de purificación de la presente invención; la FIGURA 3 muestra el resultado de la cromatografía de alta presión de fase inversa del eluato de columna que se obtiene por cromatografía de intercambio aniónico del método de purificación de la presente invención; y la FIGURA 4 muestra el resultado de la cromatografía de alta presión de exclusión de tamaño del eluato de columna que se obtiene por cromatografía de intercambio del método de purificación de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para purificar de manera sencilla una gran cantidad de factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos (hG-CSFs) con alta pureza a partir de un E. coli recombinante sin un proceso de activación adicional.

Específicamente, el método de purificación de acuerdo con la presente invención puede incluir las etapas de: (a) cultivar un E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un peletizado de células E. coli recombinante por centrifugación; (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del peletizado de células obtenido en la etapa (a) ; (c) tratar el sobrenadante obtenido en la (b) con un ácido para separar el precipitado resultante por filtración; (d) aplicar un material filtrado obtenido en la etapa (c) a la cromatografía de intercambio catiónico; (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a la cromatografía de interacción hidrofóbica; y (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a la cromatografía de intercambio aniónico.

El método de purificación de acuerdo con la presente invención se caracteriza en que después de la precipitación con ácido, los hG-CSFs obtenidos del E. coli recombinante se aplican a una serie de etapas de cromatografía (cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de intercambio aniónico) , aislando en consecuencia los hG-CSFs altamente puros adecuados para uso farmacéutico.

A partir de ahora, cada etapa del método de purificación de acuerdo con la presente invención se describirá con detalle.

La etapa (a) es una etapa para cultivar un E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un peletizado de células por centrifugación. El E. coli recombinante usado en esta etapa es cualquiera que exprese hG-CSF, de manera preferente cualquiera que exprese hG-CSF en el periplasma, sin limitación. De manera más preferente, los hG-CSFs de la presente invención, son hG-CSFs solubles expresados en E. coli. En la presente invención, el E. coli recombinante que expresa hG-CSFs en el periplasma es un E. coli recombinante que se transforma con un vector de expresión que incluye un gen de fusión que codifica una proteina de fusión de secuencia señal secretora y hG-CSF. Ejemplos representativos del E. coli recombinante incluyen HM10310, HM10311 (KCCM-10154), HM10409, HM10410 (KCCM-10151) , HM10411 (KCC -10152) , HM10413, HM10414, HM10415, HM10510 (KCCM-10153) , HM10511, y HM10512 dados a conocer en la Patente Coreana No. 356140 de los presentes inventores, en los cuales el E. coli recombinante se transforma con un vector de expresión preparado por fusión de un péptido de señal modificado de enterotoxina termoresistente II de E. coli y hG-CSF, pero no se limitan a los mismos.

A fin de expresar el hG-CSF en el periplasma del E. coli recombinante, el E. coli recombinante se puede cultivar mediante cultivo alimentado por lotes en un termentador que contiene un medio LB complementado con 1 a 300 g/L de glucosa como una fuente de carbono, 2 a 15 g/L de KH2P04, 0.5 a 3 g/L de (NH4)2HP04, 2 a 10 g/L de NaCl y 0.5 a 10 g/L de MgCl2 como minerales, una variedad de elementos residuales, extracto de levadura y triptona. Esta composición de medio es adecuada para cultivo de alta densidad de E. coli recombinante y alta expresión de hG-CSF en el periplasma del E. coli. En una modalidad preferida de la presente invención, el E. coli recombinante HM10411 (KCCM-10152) se usó para llevar a cabo un experimento, y como resultado, la composición del medio se descubrió que incrementa en gran medida la densidad celular del E. coli recombinante, el nivel de expresión del hG-CSF en E. coli, y la velocidad de secreción del hG-CSF en el periplasma. El caldo de cultivo obtenido del E. coli recombinante se centrifuga para obtener un peletizado de células .

La etapa (b) es una etapa para separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del peletizado de células obtenido en la etapa (a) . En una modalidad preferida de la presente invención, cuando el E. coli recombinante que expresa hG-CSFs en el periplasma se usa, las proteínas periplásmicas que incluyen hG-CSFs se pueden separar de las células por extracción osmótica. En este aspecto, la etapa (b) puede incluir las etapas de agregar una solución amortiguadora que contiene sacarosa al peletizado de células para obtener un peletizado de células por centrifugación; y agregar agua destilada al peletizado de células para obtener un sobrenadante que contiene proteínas periplásmicas por centrifugación. En ésta etapa, las proteínas periplásmicas que incluyen hG-CSFs se extraen por presión osmótica. Primero, cuando las peletizados de células se tratan con la solución amortiguadora que contiene sacarosa, por ejemplo, 10% a 30% de una solución amortiguadora que contiene sacarosa, las células se contraen. Entonces, cuando el peletizado de células se trata con agua destilada nuevamente, las células contraidas se expanden y la pared celular se afloja. Por lo tanto, la pared celular no se altera, sino que las proteínas periplásmicas que incluyen hG-CSFs presentes entre la membrana celular y la pared celular se extraen a través de la pared celular aflojada. En la extracción osmótica de la etapa (b) , se pueden usar sacarosa, glucosa, MgC12, cloruro de sodio o similares. De manera preferente, se usa la solución amortiguadora de sacarosa. El extracto se centrifugó para obtener un sobrenadante que ¦ contiene proteínas periplásmicas.

La etapa (c) es una etapa de precipitación con ácido para tratar el sobrenadante que contiene hG-CSF obtenido en la etapa (b) con un ácido para separar el precipitado resultante por filtración. En una modalidad preferida de la presente invención, cuando el E. coli recombinante que expresa hG-CSFs en el periplasma se usa, un sobrenadante que contiene hG-CSF soluble se puede separar del sobrenadante que incluye proteínas periplásmicas por precipitación con ácido. Específicamente, cuando el sobrenadante obtenido en la etapa (b) se trata con un ácido para ajusfar el pH del sobrenadante de 5.0 a 5.8, de manera preferente de 5.3 a 5.5, se precipitan los materiales insolubles que incluyen proteínas periplásmicas en el sobrenadante, y este precipitado se remueve por filtración para obtener un sobrenadante que contiene hG-CSF soluble. Los ejemplos del ácido adecuado para la precipitación con ácido de la etapa (c) incluyen ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico o similares, y de manera preferente ácido acético. La filtración se puede llevar a cabo usando un filtro apropiado, y de manera preferente un filtro de 0.45 a 3 µp?. Puesto que el E. coli recombinante que secreta hG-CSFs en el periplasma se usa en la presente invención, no hay necesidad de alterar el E. coli, y la fracción del periplasma se puede obtener fácilmente del caldo de cultivo para extraer los hG-CSFs.

La etapa (d) es una etapa para aplicar un material filtrado que contiene hG-CSF soluble obtenido en la etapa (c) a la cromatografía de intercambio catiónico. A través de esta etapa, se puede remover una gran cantidad de impurezas derivadas de las células hospederas o materiales de cultivo para mejorar la eficiencia de purificación.

Un grupo funcional de columna de la cromatografía de intercambio catiónico usada en la presente invención puede incluir cationes débiles tales como carboximetilo- (CM-) y carboxi- (C-) y cationes potentes tales como sulfo- (S-) , sulfometilo- (SM-) , sulfoetilo- (SE-) , sulfopropilo- (SP-), y fosfo- (P-) . Se puede usar una variedad de resinas de columna, incluyendo sefarosa, sefadex, agarosa, sefacel, poliestireno, poliacrilato, celulosa, y toyopearl. En una modalidad preferida de la presente invención, el método de purificación se puede llevar a cabo por cromatografía de intercambio catiónico usando una columna de SP-sefarosa.

En la presente invención, la cromatografía de intercambio catiónico se lleva a cabo usando una solución amortiguadora que contiene ácido acético como un eluyente dentro del pH que varía de pH 4.0 a 6.0, de manera preferente pH 5.0 a 6.0 en una concentración de sal de 500 mM o menos, de manera preferente 200 a 500 mM. La columna de intercambio catiónico que se usa se puede equilibrar con una solución amortiguadora antes de cargar el eluato. El equilibrio de la columna de intercambio catiónico se puede llevar a cabo usando una solución amortiguadora acuosa de pH 5.0 a 6.0, que se selecciona apropiadamente de acuerdo con las condiciones. En una modalidad preferida de la presente invención, la columna de intercambio catiónico se equilibra con una solución amortiguadora que contiene acetato de sodio 10 mM (pH 5.4) con anticipación. Después de que el material filtrado que contiene hG-CSF se carga y se adsorbe sobre la columna de intercambio catiónico equilibrada, la columna se lava con la solución amortiguadora y de equilibrio para remover las proteínas e impurezas que no se adsorben sobre la columna. Subsecuentemente, una solución amortiguadora de elución preparada por la adición de cloruro de sodio a la solución amortiguadora de equilibrio se aplica a la columna de intercambio catiónico, para eluir los hG-CSFs que adsorben sobre la columna. En este aspecto, se aplican de manera preferente 3 a 7 volúmenes de columna de la solución amortiguadora de elución. En una modalidad preferida, de la presente invención, 4 a 6 volúmenes de columna de una solución amor iguadora (pH 5.2 a 5.6) que contiene acetato de sodio 5 a 20 mM y NaCl 300 a 400 mM se aplican a la columna para eluir los hG-CSFs que se adsorben sobre la columna.

En la etapa anterior, los péptidos derivados de células hospederas o los componentes en el medio de cultivo se hacen pasar a través de la columna o se remueven durante una etapa de lavado, para remover efectivamente una gran cantidad de impurezas.

La etapa (e) es una etapa de (e) aplicar un eluato obtenido de la cromatografía de intercambio catiónico en la etapa (d) a la cromatografía de interacción hidrofóbica y la etapa de mejorar la pureza al remover adicionalmente las impurezas que se incluyen en el eluato obtenido de la cromatografía de intercambio catiónico de la etapa anterior.

La cromatografía de interacción hidrofóbica usada en la presente invención se puede llevar a cabo sobre geles con ligandos hidrofóbicos, adecuadamente alifáticos o aromáticos, sin carga, unidos a varias matrices comercialmente disponibles. Los ligandos se pueden acoplar a la matriz mediante técnicas de acoplamiento convencionales, que proporcionan ligandos sin carga. Ejemplos de tal técnica incluyen un método para usar un acoplamiento de glicidilo-éter; un método para activar una matriz de agarosa con glicidoxipropiltrimetoxi-silano en agua y entonces inmovilizar el ligando en alcohol; un método para activar una matriz de agarosa con bis-epóxido, tal como éter 1,4-butanodiol-diglicidílico y luego acoplar a los ligandos tal como aminoalquilo o alquil-mercaptano; un método de activación de 1 , 1-carbonildiimidazol ; y un método de activación de di-vinilsulfona . Los genes que resultan de las técnicas descritas en lo anterior están sin carga dentro del intervalo completo de pH. Los ejemplos de ligando alifático pueden incluir alquilos rectos tales como propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, y alquilo ramificados tal como iso- o neo-alquilo, y oligoetilenglicol . El ligando aromático es de manera preferente fenilo. La matriz se puede seleccionar apropiadamente a partir de varias matrices hidrofílicas potentes, por ejemplo, una matriz de agarosa tal como sefarosa, una matriz de polímero orgánico tal como TSK-GEL, y una matriz de polímero orgánico altamente porosa. La matriz preferida es una matriz de agarosa. Una matriz de agarosa adecuada es sefarosa (Amersham Biosciences) , Bio-Gel A (Bio-Rad Laboratories), Minileak (Kem-En-Tec Diagnostics A/S) o similares. En una modalidad preferida de la presente invención, la cromatografía de interacción hidrofóbica de la presente invención se lleva a cabo en un gel de butilo-sefarosa .

En la presente invención la cromatografía de interacción hidrofóbica se lleva a cabo usando una solución amortiguadora dentro del pH que varía de pH 7.0 a 8.5, de manera preferente de pH 7.5 a 8.0, teniendo una concentración de sal de 100 mM o menos, de manera preferente de 0 a 50 mM como un eluyente. La columna de interacción hidrofóbica que se usa se puede equilibrar con una solución amortiguadora antes de cargar el eluato. El equilibrio de la columna de interacción hidrofóbica se puede llevar a cabo usando una solución amortiguadora acuosa de pH 6.8 a 8.5, que se selecciona apropiadamente de acuerdo con las condiciones. En una modalidad preferida de la presente invención, la columna de interacción hidrofóbica se equilibra con una solución amortiguadora (pH 7.5) que contiene sulfato de amonio 300 mM y Tris 10 mM con anticipación. Después de que el eluato obtenido en la etapa previa se carga sobre la columna de interacción hidrofóbica equilibrada para adsorber los hG-CSFs a la misma, la columna se lava con la solución amortiguadora de equilibrio para remover las proteínas e impurezas que no se adsorben sobre la columna. Subsecuentemente, una solución amortiguadora de elución preparada al remover el sulfato de amonio de la solución amortiguadora de equilibrio se aplica a la columna de interacción hidrofóbica, para eluir los hG-CSFs que se adsorben sobre la columna. En este aspecto, 1 a 4 volúmenes de columna de la solución amortiguadora de elución se aplican de manera preferente. En una modalidad preferida de la presente invención, 1.2 a 2.5 volúmenes de columna de una solución amortiguadora (pH 7.0 a 8.0) que contiene Tris 5 a 20 mM se aplican a la columna para eluir los hG-CSFs que se adsorben sobre la columna.

En general, antes de llevar a cabo la cromatografía de interacción hidrofóbica, se puede agregar una sal a una fracción a . fin de incrementar la conductividad de la fracción. Después, se lleva a cabo la elución de la matriz usando una solución amortiguadora potente iónica baja. De manera preferente, en la cromatografía de interacción hidrofóbica de la presente invención, se agrega sulfato de amonio al eluato obtenido en la etapa, para incrementar su conductividad, similar a aquella de la solución amortiguadora de equilibrio. Entonces, el eluato se carga a la columna de interacción hidrofóbica equilibrada. En la cromatografía de interacción hidrofóbica de la presente invención, el eluato obtenido de la cromatografía de intercambio catiónico de la-etapa previa también se puede cargar sin pretratamiento, y los hG-CSFs se adsorben sobre la columna. Las impurezas se hacen pasar a través de la columna o se remueven durante una etapa de lavado, para mejorar adicionalmente la eficiencia de la purificación.

La etapa (f) es una etapa para aplicar un eluato obtenido de la cromatografía de interacción hidrofóbica en la etapa (e) a la cromatografía de intercambio aniónico, y una etapa de remover completamente las impurezas que se incluyen en el eluato obtenido de la cromatografía de interacción hidrofóbica de la etapa previa.

La cromatografía de intercambio aniónico de la presente invención se lleva a cabo típicamente usando una matriz que contiene un soporte e partícula insoluble derivado con un grupo amina terciario o cuaternario (por ejemplo, dietilaminoetilo, trietilaminoetilo, bencil-dietilaminoetilo) . El soporte adecuado incluye cuentas de celulosa, agarosa, dextrano y poliestireno . De manera preferente, el soporte se deriva con el grupo trietilaminoetilo. Los ejemplos de la matriz de intercambio aniónico adecuada incluye Q-sefarosa (Amersham Biosciences) , Macro-Prep Q (Bio-Rad Laboratories) , Q-HyperD (BioSepra, Inc.), Fractogel EMD-TMAE 650 (iierck) o similares. En una modalidad preferida de la presente invención, la cromatografía de intercambio aniónico de la presente invención se lleva a cabo usando una columna de Q-sefarosa.

En la presente invención, la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo usando una solución amortiguadora dentro del pH que varía de pH 6.8 a 8.5, de manera preferente pH 7.0 a 8.0 que tiene una concentración de sal de 300 m o menos, de manera preferente de 100 a 250 mM como un eluyente. La columna de int.ercambio aniónico que se usa puede equilibrar con una solución amortiguadora antes de cargar el eluato. El equilibrio de una columna de intercambio aniónico se puede llevar a cabo usando una solución amortiguadora acuosa de pH 6.8 a 8.5, que se selecciona apropiadamente de acuerdo con las condiciones. En una modalidad preferida de la presente invención, la columna de intercambio aniónico se equilibra con una solución amortiguadora (pH 7.5) que contiene Tris 10 mM y urea 100 mM anticipadamente. Después de que el eluato obtenido en la etapa previa se carga en la columna de intercambio aniónico equilibrada para adsorber los hG-CSFs en la misma, la columna se lava con la solución amortiguadora de equilibrio para remover las proteínas e impurezas que no se adsorben sobre la columna. Subsecuentemente, una solución amortiguadora de elución preparada mediante la adición de cloruro de sodio a la solución amortiguadora de equilibrio se aplica a la columna de intercambio aniónico, para eluir los hG-CSFs que se adsorben sobre la columna. Sobre este aspecto, 1.5 a 5 volúmenes dé columna de la solución amortiguadora de elución se aplican de manera preferente. En una modalidad preferida de la presente invención, de 2 a 4 volúmenes de columna de una solución amortiguadora (pH 7.0 a 8.0) que contiene Tris 5 a 20 mM, urea 50 a 200 mM, y NaCl 150 a 250 mM se aplican a la columna para eluir los hG-CSFs que se adsorben sobre la columna .

Como se describe en lo anterior, los hG-CSFs se purifican por la precipitación con ácido y una serie de cromatografías de acuerdo con la presente invención, y los hG-CSFs purificados se someten a cromatografía de alto desempeño de fase inversa y la cromatografía de exclusión de tamaño. Como resultado, la hG-CSF con pureza de 99% o mayor se obtuvo en un alto rendimiento. Específicamente, el resultado del análisis de secuencia terminal N mostró que el hG-CSF purificado de acuerdo con el método de la presente invención tiene una secuencia idéntica a aquella del hG-CSF nativo, y el hG-CSF purificado contiene las proteínas derivadas de células hospederas de 100 ng/mg o menos, los ADNs derivados de células hospederas de 100 pg/mg o menos, y enterotoxina de 10 EU/IU de hG-CSF o menos, y muestra excelente actividad fisiológica. Estos resultados sugieren que, cuando los hG-CSFs secretados en el periplasma del E. coli recombinante se purifican de acuerdo con el método de purificación de la presente invención, los hG-CSFs con .alta actividad y pureza fisiológica se pueden obtener en un alto rendimiento, y la pérdida de potencia y la selección limitada de las columnas también se puede superar.

Por lo tanto, los hG-CSFs purificados de acuerdo con el método de purificación de la presente invención y una composición farmacéutica que comprende los hG-CSFs como un ingrediente activo también se incluyen en el alcance de la presente invención.

La preparación de la composición farmacéutica y efectos de la misma son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo, y de esta manera se omitirá una descripción detallada de los mismos.

Además, el método de purificación de acuerdo con la presente invención se caracteriza en que los hG-CSFs se pueden purificar con alto rendimiento y pureza de una gran cantidad de caldo de cultivo del E. coli recombinante. Como se usa en este documento, el término "una gran cantidad de caldo de cultivo" significa un caldo de cultivo obtenido al cultivar el E. coli recombinante en un nivel de fermentación en un medio de 50 L o más, manera preferente 80 L o más, y more de manera preferente 100 L o más. En una modalidad preferida de la presente invención, el E. coli recombinante se inocula en 1 L de medio esterilizado para obtener un caldo de cultivo de semilla primaria, y este caldo de cultivo de semilla se inocula en 14 L de medio de esterilizado para obtener un caldo de cultivo de semillas secundaria. Finalmente, el caldo de cultivo de semillas secundarias se inocula en 120 L de medio esterilizado, seguido por fermentación. Se usa un medio adicional para llevar a cabo el cultivo alimentado por lotes, obteniendo en consecuencia 180 L de caldo de cultivo de E. coli recombinante. Cuando los hG-CSFs se aislan y se purifican a partir de una gran cantidad de caldo de cultivo del E. coli recombinante de acuerdo con el método descrito en la Patente Coreana No. 356140, solamente 70 mg de hG-CSFs por 1 L se producen. Es decir, el método convencional tiene una limitación en que es difícil de producir la proteína deseada con alta pureza y rendimiento. Sin embargo, de acuerdo con el método de purificación de la presente invención, aunque el volumen del caldo de cultivo se eleva a 100 L o más, los hG-CSFs con pureza de 99% o mayor se pueden obtener en un alto rendimiento de 110 mg o más por 1 L a través de la precipitación con ácido y una serie de cromatografías. Por 'lo tanto, el método de purificación de acuerdo con la presente invención se puede aplicar efectivamente para aislamiento y purificación de los hG-CSFs a partir de una gran cantidad de caldo de cultivo del E. coli recombinante . De esta manera, se puede lograr una productividad mayor mediante la aplicación industrial de la misma .

Modo para la Invención A partir de ahora, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son para propósitos ilustrativos solamente, y la invención no se propone para ser limitada por estos ejemplos.

Ejemplo de Referencia 1: Cultivo del E. coli recombinante que expresa hG-CSFs en el periplasma Se inoculó E. coli HM10411 (KCCM-10152, Patente Coreana No. 356140) transformado con un vector de expresión T017SG que tiene una fusión de un péptido de señal modificado de enterotoxina termoresistente II de E. coli y hG-CSF en un recipiente de cultivo de vidrio que contiene 1 L de un medio LB (triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L) ) para llevar a cabo un cultivo de semillas primarias. El medio de cultivo se cultivó a 37°C durante 11 a 13 horas bajo agitación vigorosa y ventilación, y entonces se inoculó en un recipiente de cultivo que contiene 14 L de medio LB esterilizado para llevar a cabo un cultivo de semillas secundarias durante 2 a 3 horas. El caldo de cultivo obtenido se usó como una semilla para fermentación, y se inoculó en 120 L de medio esterilizado complementado con 1.4 g/L de glucosa como una fuente de carbono, 10 g/L de ??2?04, 2.5 g/L de (NH4)2HP04 5 g/L de NaCl y 1.2 g/L de gCl2 como minerales, una variedad de elementos residuales, extracto de levadura y triptona. Durante la fermentación, se agregaron extracto de glucosa y levadura adicionales para llevar a cabo un cultivo alimentado por lotes durante 25 horas o más prolongado, y el cultivo se completó para proporcionar 180 L de caldo de cultivo. Después de la terminación de la fermentación, el caldo fermentado se centrifugó a 7,0 rpm, y el peletizado de células obtenidas se almacenó a -70°C.

Ejemplo 1 : Purificación de los hG-CSFs del caldo de cultivo de E . coli recombinante <!-!> Extracción osmótica de proteínas periplásmicas El peletizado de E. coli obtenido en el Ejemplo de Referencia se suspendió en 170 L de solución amortiguadora de sacarosa (20% de sacarosa, EDTA 1 mM, Tris 30 mM, pH 7.5), y se secó durante 90 minutos, seguido por centrifugación primaria 7,000 rpm, y de esta manera se separó un peletizado. 170 L de agua · destilada a 4°C se agregaron al peletizado separada, y se llevó a cabo una centrifugación secundaria a 7,000 rpm para remover un peletizado y para aislar un sobrenadante que contiene proteínas periplásmicas . Durante este procedimiento, se extrajeron proteínas presentes en el periplasma del E. coli.' Los sobrenadantes obtenidos en los procedimientos de centrifugación primarios y secundarios se analizaron por SDS-PAGE (Carriles 2 y 3 de la FIGURA 1) . <l-2> Precipitación con ácido Se agregó 1% de ácido acético al sobrenadante que contiene proteínas periplásmicas obtenida en el Ejemplo <1-1> para ajustar el pH de 5.6 a 5.7. En este momento, los materiales insolubles incluidos en el sobrenadante se precipitaron por el tratamiento con ácido, y la filtración se llevó a cabo para removerlos, para obtener una sobrenadante que contiene hG-CSF. El sobrenadante obtenido por el tratamiento con ácido y el material filtrado obtenido por la filtración se analizaron por SDS-PAGE (Carriles 4 y 5 de la FIGURA 1) . <l-3> Cromatografía de intercambio catiónico Se llevó a cabo un a cromatografía de intercambio catiónico del material filtrado obtenido en el Ejemplo <l-2> usando una columna de SP-sefarosa como sigue. El material filtrado se cargó y se adsorbió sobre la columna de SP-sefarosa equilibrada con una solución amortiguadora 1 (acetato de sodio 10 mM, pH 5.4) en una velocidad de flujo de 40 cm/hr, y entonces las proteínas que no se adsorbieron sobre la columna se removieron al lavarlas con solución amortiguadora igual. Subsecuentemente, 5 volúmenes de columna de la solución amortiguadora 1 (acetato de sodio 10 mM, pH 5.4) que contiene cloruro de sodio 300 mM se aplica a la columna para eluir los hG-CSFs de la columna. El flujo y el eluato obtenidos por la cromatografía de intercambio catiónico se analizaron por SDS-PAGE (Carriles 6 a 8 de FIGURA 1) . <l-4> Cromatografía de interacción hidrofóbica El eluato obtenido en el Ejemplo <l-3> se diluyó mediante la adición de sulfato de amonio a una concentración final de 300 mM, y se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica usando una columna de butil-sefarosa como sigue. El eluato se cargó y se adsorbió sobre la columna de butil-sefarosa equilibrada con una solución amortiguadora 2 (sulfato de amonio 300 mM, Tris 10 mM, pH 7.5) en una velocidad de flujo de 80 cm/hr, y entonces las proteínas que no se adsorbieron sobre la columna se removieron al lavarlas con solución amortiguadora igual. Subsecuentemente, 1.5 volúmenes de columna de la solución 2 (Tris 10 mM, pH 7.5) que excluyen sulfato de amonio se aplican a la columna para eluir los hG-CSFs de la columna. El flujo y el eluato obtenidos por la cromatografía de interacción hidrofóbica se analizaron por SDS-PAGE (Carriles 9 a 10 de la FIGURA 1) . <l-5> Cromatografía de intercambio aniónico El eluato obtenido en el Ejemplo <l-4> se diluyó por la adición de urea a una concentración final de 50 mM, y la cromatografía de intercambio aniónico se llevó a cabo usando una columna de Q-sefarosa como sigue. El eluato se cargó y se adsorbió sobre la columna de Q-sefarosa equilibrada con una solución amortiguadora 3 (Tris 10 mM, pH 7.5, urea 100 mM) en una velocidad de flujo de 60 cm/hr, y entonces las proteínas que no se adsorbieron sobre la columna se removieron al lavarlas con solución amortiguadora igual. Subsecuentemente, 3 volúmenes de columna de la .solución amortiguadora 3 (Tris 10 mM, pH 7.5, urea 100 mM) que contienen cloruro de sodio 250 mM se aplican a la columna para eluir los hG-CSFs de la columna. El eluato obtenido por la cromatografía de intercambio aniónico se analizó por SDS-PAGE (Carril 2 de la FIGURA 2) .

A fin de examinar la pureza de los hG-CSFs purificados del E. coli recombinante por los procedimientos de los Ejemplos <1-1> a <l-5>, se llevaron a cabo SDS-PAGE, análisis de secuencia de terminal N, cromatografía de alta presión de fase inversa, y cromatografía de alta presión de exclusión de tamaño.

Ejemplo Experimental 1: Análisis de SDS-PAGE Primero, el sobrenadante, el flujo de columna, y el eluato de columna obtenidos en cada procedimiento de los Ejemplos <1-1> a <l-5>, y un G-CSF estándar (NIBSC, No. de Código 88/502) se analizaron por SDS-PAGE de acuerdo con un método típico. Los resultados del SDS-PAGE se muestran en las FIGURAS 1 y 2. En la FIGURA 1, el Carril 1 es un G-CSF estándar, el Carril 2 es el sobrenadante de la centrifugación primaria obtenida por extracción osmótica del Ejemplo <1-1>, el Carril 3 es el sobrenadante de la centrifugación secundaria obtenida por la extracción osmótica del Ejemplo <1-1>, el Carril 4 es el sobrenadante obtenido por el tratamiento con ácido en la etapa de precipitación en ácido del Ejemplo <l-2>, el Carril 5 es el material filtrado obtenido por la filtración en la etapa de precipitación con ácido del Ejemplo <l-2>, el Carril 6 es el flujo de columna obtenido de la cromatografía de columna SP-sefarosa del Ejemplo <l-3>, las Carriles 7 y 8 son el eluato de columna 1 y 2 obtenidos de la cromatografía de columna SP-sefarosa del Ejemplo <l-3>, el Carril 9 es el flujo de columna obtenido de la cromatografía de columna de butil-sefarosa del Ejemplo <1-4>, y el Carril 10 es el eluato de columna obtenido de la cromatografía de columna de butil-sefarosa del Ejemplo <l-4>. En la FIGURA 2, el Carril 1 es un Met-hG-CSF estándar, y el Carril 2 es el eluato de columna obtenido de la cromatografía de columna Q-sefarosa del Ejemplo <l-5>.

Los resultados del análisis SDS-PAGE mostraron que los hG-CSFs aislados y purificados del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación de la presente invención tienen un peso molecular igual a aquel de la forma nativa .

Ejemplo Experimental 2 : Análisis de secuencia de terminal N Los hG-CSFs purificados por los procedimientos de los Ejemplos <l-> a <l-5> se sometieron a electroforesis sobre un gel de SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana PVDF. La membrana transferida se tiñó usando una solución de Ponceau S, y entonces la secuencia terminal N (15 aminoácidos) se analizó en Korea Basic Science Institute (filial de Seúl) .

Como resultado, la secuencia terminal N del hG-CSF aislado y purificado del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación de la presente invención se descubrió .que es idéntico a aquel de la forma nativa, y contiene las proteínas derivadas de hospedero de 100 hg/mg o menos, los ADNs derivados de hospedero de .100 pg/mg o menos, y enterotoxina de 10 EU/IU hG-CSF o menos.

Ejemplo Experimental 3: Cromatografía de alta presión de fase inversa El eluato obtenido en el Ejemplo <l-5> se aplicó a una columna de sílice de butilsililo, y entonces se agregaron TFA al 0.1%/agua y TFA al 0.1%/acetonitrilo como fase móvil a la columna para llevar 'a cabo una cromatografía de alta presión de fase inversa. El cromatograma resultante se muestra en la FIGURA 3.

Como se muestra en la FIGURA 3, los hG-CSFs aislados y purificados del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación de la presente invención se descubrieron que tienen una pureza muy alta mediante la remoción efectiva de microvariantes que tienen características similares.

Ejemplo Experimental 4 : Cromatografía de alta presión de exclusión de tamaño El eluato obtenido en el Ejemplo <l-5> se aplicó a una columna de gel de sílice hidrofílica (peso molecular de 20,000 a 200,000), y entonces se agregaron fosfato de potasio 20 mM (pH 6.0) /cloruro de sodio 200 mM como fase móvil a la columna para llevar a cabo la cromatografía de alta presión de exclusión de tamaño. El cromatograma resultante se muestra en la FIGURA 4.

Como se muestra en la FIGURA 4, los hG-CSFs aislados y purificados del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación de la presente invención se descubrió que tienen una pureza muy alta por la remoción efectiva de péptidos que tienen características similares.

En los Ejemplos Experimentales 1 a 4, se confirmó que los hG-CSFs nativos con pureza de 99% o mayor se pueden obtener en un rendimiento de 110 mg por 1 L de caldo de cultivo del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación de la presente invención. Como grupo de comparación, los hG-CSFs se purificaron a partir del E. coli recombinante de acuerdo con el método de purificación dado a conocer en la Patente Coreana No. 356140 (resina de intercambio iónico, columna de adsorción y filtración en gel o cromatografía de columna de anticuerpos) , y los hG-CSFs con pureza de 99% o mayor se obtuvieron en un rendimiento de 70 mg por 1 L de caldo de cultivo. Este resultado indica que los hG-CSFs con pureza de 99% o mayor se pueden obtener en un 50% o más de rendimiento mejorado por el método de purificación de la presente invención, comparado con el método dado a conocer en la Patente Coreana No. 356140.

Ejemplo Experimental 5: Prueba de potencia ex vivo A fin de examinar la actividad fisiológica de los hG-CSFs obtenidos de acuerdo con el método de purificación de la presente invención, los hG-CSFs purificados en el Ejemplo <l-5> y el estándar internacional (NIBSC) se sometieron a una prueba de potencia ex vivo en células de la médula ósea derivadas de ratón. Específicamente, se diseccionaron fémures de ratones de 4 a 6 semanas de edad y se recolectaron a células de la médula ósea, y entonces se cultivaron a una densidad apropiada. Los hG-CSFs purificados y la muestra estándar internacional se mezclaron con las células de la médula ósea cultivadas al variar la concentración (100.00, 33.33, 11.11, 3.70, 1.23, 0.41, 0.14, 0.05, 0.02, 0.01 ng/ml), u se cultivaron durante 2 a 3 días. Se agregó timidina [Metil-H2] al medio de cultivo, y las células se cultivaron durante 10 a 20 horas adicionales. Entonces, las células se aislaron y el CPM se midió usando un contador beta. Como resultado, se descubrió que los hG-CSFs aislados y purificados de acuerdo con el método de purificación de la presente invención satisfacen el estándar internacional de 0.6 a 1.4xl08 IU/rag.

Aplicabilidad Industrial El método de la presente invención se puede purificar fácilmente el factor estimulante de colonias de granulocitos humano, idéntico a la forma nativa expresada en el cuerpo humano, con alto rendimiento y pureza sin un proceso de activación adicional. En particular, de acuerdo con el método de la presente invención, las variantes de hG-CSJT expresadas en E. coli se remueven eficientemente para obtener hG-CSFs fisiológicamente activos con alta pureza.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar factores estimulantes de colonias de granulocitos humanos (hG-CSFs) a partir de un E. coli recombinante en un alto rendimiento, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) cultivar un E. coli recombinante que expresa hG-CSF para obtener un peletizado de células por centrifugación; (b) separar un sobrenadante que contiene hG-CSF del peletizado de células obtenido en la etapa (a) ; (c) tratar el sobrenadante obtenido en la etapa (b) con un ácido para separar el precipitado resultante por filtración; (d) aplicar un material filtrado obtenido en¦ la etapa (c) a cromatografía de intercambio catiónico; (e) aplicar un eluato obtenido en la etapa (d) a la cromatografía de interacción hidrofóbica; y (f) aplicar un eluato obtenido en la etapa (e) a la cromatografía de intercambio aniónico.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (a) , los hG-CSFs se expresan en el periplasma del E. coli recombinante.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el E. coli recombinante es uno o más seleccionado del grupo que consiste de E. coli BL21 (DE3) /pT14SSlSG(HM10310) , E. coli BL21 ( DE3 ) /pT1 SS1S17SEG (HM 10311; No. de Acceso KC.CM- 0154), E. coli BL21 (DE3)/pT01 SG (HM 10409), E. coli BL21 (DE3)/pTO 1S17SG (HM 10410; No. de Acceso CCM-10151), E. coli BL21 (DE3) /pT017SG (HM 10411; No. de Acceso KCCM- 10152), E. coli BL21 (DE3) /pT017TG (HM 10413), E. coli BL21 (DE3) /pTO 17AG (HM 10414), E. coli BL21 (DE3)/pTO 17GG (HM 10415), E . coli BL21 (DE3) /pBAD2M3VG ' (HM 10510; No. de Acceso KCC -10153), E. coli BL21 (DE3) /pBAD 17SG (HM 10511) y E. coli BL21 (DE3) /pBAD2M3Vl7SG (HM 10512).

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (b) , el sobrenadante que contiene hG-CSF se separa del peletizado de células por extracción osmótica.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la extracción osmótica se lleva a cabo al tratar el peletizado de células con 10% a 30% de solución amortiguadora que contiene sacarosa para obtener un peletizado de células por centrifugación, agregar agua destilada al peletizado de células, y entonces llevar a cabo la centrifugación.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (c) , el pH del sobrenadante se ajusta de 5.0 a 5.8 por tratamiento con ácido.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido de la etapa (c) se selecciona del grupo que consiste de ácido acético, ácido fosfórico y ácido cítrico.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque -la cromatoqrafía de intercambio catiónico de la etapa (d) se lleva a cabo usando una columna seleccionada del grupo que consiste de sefarosa, sefadex, agarosa, sefacel, poliestireno, poliacrilato, celulosa, y toyoperl.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cromatografía de intercambio catiónico de la (d) se lleva a cabo usando una columna de SP-sefarosa .

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de intercambio catiónico de la etapa (d) se lleva a cabo usando una solución amortiguadora que contiene ácido acético dentro del pH que varía de pH 4.0 a 6.0 que tiene una concentración de sal de 200 a 500 mM.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la cromatografía de intercambio catiónico de la etapa (d) se lleva a cabo usando una solución amortiguadora que contiene cloruro de sodio de 200 a 500 mM y acetato de sodio de 5 a 20 mM en pH 5.0 a 6.0.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica de la etapa (e) se lleva a cabo usando una columna de sefarosa, Bio-Gel A o Minileak que tiene un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo y octilo, isoalquilo, neoalquilo, y oligoetilenglicol .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica de la etapa (e) se lleva a cabo usando una columna de butil-sefarosa .

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica de la etapa (e) se lleva a cabo usando una solución amortiguadora dentro del pH que varía de pH 7.0 a 8.5 que tiene una concentración de sal de 0 a 100 mM.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cromatografía de interacción hidrofóbica de la etapa (e) se lleva a cabo usando una solución amortiguadora que contiene Tris 5 a 20 mM en pH 7.0 a 8.0.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (f) se lleva a cabo usando una columna seleccionada del grupo que consiste de Q-sefarosa, Macro-Prep Q, Q-HyperD, y Fractogel EMD-TMAE 650.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (f) se lleva a cabo usando una columna Q-sefarosa .

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cromatografía de intercambio aniónico la etapa (f) se lleva a cabo usando una solución amortiguadora dentro del pH que varía de pH 6.5 a 8.5 que tiene una concentración de sal de 100 a 300 mM.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la cromatografía de intercambio aniónico de la etapa (f) se lleva a cabo usando una solución amortiguadora que contiene cloruro de sodio 100 a 300 mM, Tris 5 a 20 mM, y urea 50 a 200 mM en pH 7.0 a 8.0.

20. Un factor estimulante de colonia de granulocitos humano (hG-CSF) con alta pureza, caracterizado porque se aisla y se purifica a partir de un E. coli recombinante de acuerdo con el método de la reivindicación 1.