CN118184757A - 一种仿生重组蜗牛粘液蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿生重组蜗牛粘液蛋白及其制备方法和应用，重组蜗牛粘液蛋白的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列。重组蜗牛粘液蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。重组蜗牛粘液蛋白的表达载体，包括上述的核苷酸序列。本发明提供的重组蜗牛粘液蛋白，能够有效促进细胞生长，具有良好的保湿性能，良好的皮肤渗透性。该重组蜗牛粘液蛋白的生物合成经济，可持续，对自然环境友好。

Description

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种仿生重组蜗牛粘液蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

蜗牛会分泌出一种黏稠的液体，即蜗牛粘液。这种粘液在蜗牛身体表面形成一层保护膜，有助于维持其身体湿润，防止脱水以及抵御外界环境的侵害。蜗牛粘液的成分主要包含水分、粘液蛋白和黏液酸，具有黏附性和保湿性。此外，蜗牛粘液还被认为具备修复和再生肌肤的功效，因此被应用于某些美容和护肤产品中。最新的研究表明，蜗牛粘液可以作为天然生物粘合剂用于伤口修复。蜗牛粘液中除了水之外的主要成分是粘液蛋白，它是一种高度糖基化修饰的糖蛋白，具有润滑、细胞信号传导和化学屏障的功能。粘液蛋白有助于形成粘液屏障，从而对感染起到保护作用。

蜗牛粘液的提取通常使用酸性液体刺激蜗牛大量分泌粘液，然后收集粘液经过滤后获得。然而，通过凯氏定氮法检测粘液蛋白含量约为0.45％，提取的蜗牛粘液蛋白中可能存在一些未知的有害病菌以及蜗牛身体产生的有毒性代谢废物，其中含有一定的蛋白酶很容易引起皮肤过敏，因此，将蜗牛粘液蛋白用于化妆品或药品中存在未知的风险。为了获得更安全且成分单一的蜗牛粘液蛋白成分，通过合成生物学技术有望实现蜗牛粘液蛋白的体外绿色低成本合成，替代传统提取技术，减少蜗牛宰杀，从而获得安全且功能与天然蜗牛粘液相近的仿生材料，实现更大的经济效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：蜗牛粘液蛋白由蜗牛粘液中提取获得，可能存在一些未知的有害病菌以及蜗牛身体产生的有毒性代谢废物，若用于化妆品或药品中存在未知的风险，本发明提供了解决上述问题的一种仿生重组蜗牛粘液蛋白及其制备方法和应用。

本发明通过下述技术方案实现：

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列。

进一步可选地，所述氨基酸序列是基于棕色花园蜗牛的氨基酸序列进行改造，或者基于棕色花园蜗牛的氨基酸序列与皮肤渗透肽氨基酸序列重组获得。

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.5所示的核苷酸序列。

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达载体，包括上述的核苷酸序列。

进一步可选地，表达载体是在毕赤酵母载体pPIC9K或pPICza基础上构建获得。

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达工程菌，包括酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或哺乳动物表达系统中的至少一种。

由于粘液蛋白是一种高度糖基化修饰的蛋白，可以采用真核细胞表达系统进行合成，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastris)或酿酒酵母作为单细胞真核生物，具有简单的翻译后修饰系统，能对其表达的蛋白进行N-糖基化和O-糖基化修饰。尽管其他的表达系统，如昆虫表达系统，植物表达系统或哺乳动物表达系统都可以实现蛋白的糖基化修饰，但从经济效益上来看，使用酵母菌表达糖基化的仿生蜗牛蛋白是更优的选择。

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达载体的构建方法，包括步骤：

基于重组蜗牛粘液蛋白的氨基酸序列，按照工程菌母密码子偏好性设计对应的核苷酸序列；

将该核苷酸序列在5’端添加Xho I限制性内切酶酶切位点CTCGAG，在3’端添加终止密码子和Not I限制性内切酶酶切位点GCGGCCGC；

将设计完成的核苷酸序列进行全基因合成；

将合成的核苷酸序列经Xho I和Not I双酶切连接到载体中，获得重组蜗牛粘液蛋白表达载体。

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达方法，包括步骤：

构建重组蜗牛粘液蛋白的表达载体；

将表达载体转入宿主细胞，构建基因工程菌；

将基因工程菌进行发酵处理，后经包括纯化处理获得重组蜗牛粘液蛋白。

进一步可选地，发酵过程包括：

控制以无机盐BSM培养基作为基础；

和/或控制pH5.0、温度28.0℃，溶氧控制在30％；当发酵罐(100L)内菌体湿重达200～220mg/mL时开始甲醇诱导，发酵诱导40～50小时后将发酵液放罐，完成发酵生产。

酵母菌在合成蛋白的过程中在细菌体内会自发对蛋白进行糖基化修饰。

一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的应用，用于制备化妆品、药品。

本发明具有如下的优点和有益效果：

本发明首次利用基因工程构建蜗牛粘液蛋白的分子骨架，利用微生物合成中的糖基化修饰实现重组蜗牛粘液蛋白的合成(酵母菌在合成蛋白的过程中在细菌体内会自发对蛋白进行糖基化修饰)，经过分离提取后获得具有模拟蜗牛粘液特定作用的仿生生物材料。

本发明提供的重组蜗牛粘液蛋白，能够有效促进细胞生长，具有良好的保湿性能，良好的皮肤渗透性。重组蜗牛粘液蛋白的生物合成经济，可持续，对自然环境友好。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为pPIC9K-rSP重组质粒图谱。

图2为SDS-PAGE电泳图。

图3为重组蜗牛粘液蛋白和市售蜗牛粘液溶解状态图。

图4为重组蜗牛粘液蛋白在不同温度下的热稳定性测试结果图。

图5为重组蜗牛粘液蛋白对细胞增殖的影响测试结果图。

图6为各样品在不同测试时间段的MMV曲线图。

图7为重组蜗牛粘液蛋白的皮肤渗透性研究结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

本实施例提供了一种用于重组蜗牛粘液蛋白表达载体，具体构建方法如下所示：

1.序列结构

重组蜗牛粘液蛋白(命名为Recombinant Snailpro，简写rSP)的氨基酸序列来自棕色花园蜗牛的氨基酸序列(GenBank：QEG59314.1，SEQ.ID.NO.2)。

2.重组蜗牛粘液蛋白表达载体构建

根据上述重组蜗牛粘液蛋白的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.2)，并按照毕赤酵母密码子偏好性设计对应的核苷酸序列(即Snailpro的编码序列)，同时为了后续的分子操作，该核苷酸序列在5’端添加Xho I限制性内切酶酶切位点CTCGAG，在3’端添加终止密码子和NotI限制性内切酶酶切位点GCGGCCGC；将设计完成的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)进行全基因合成。

将此合成的序列经Xho I和Not I双酶切连接到毕赤酵母载体pPIC9K(Invitrogen,V17520)中，获得重组蜗牛粘液蛋白表达载体，命名为pPIC9K-Snailpro，质粒图谱见图1。

根据图1所示，重组蜗牛粘液蛋白表达载体中具有融合基因序列(即Snailpro的编码序列)表达盒，该表达盒具体包含AOX1启动子、α-factor、Snailpro的编码序列、终止密码子和TT。

实施例2

本实施例提供了一种用于重组蜗牛粘液蛋白表达载体，具体构建方法如下所示：

1.序列结构

重组蜗牛粘液蛋白(命名为Recombinant Transdermal Snailpro，简写rTSP)的氨基酸序列来自棕色花园蜗牛的氨基酸序列(GenBank：QEG59314.1，SEQ.ID.NO.2)和皮肤渗透肽(SEQ.ID.NO.4)通过GGGGS氨基酸序列连接组成，rTSP的氨基酸序列具体参见SEQ.ID.NO.6。

2.重组蜗牛粘液蛋白表达载体构建

根据上述重组蜗牛粘液蛋白的氨基酸序列，并按照毕赤酵母密码子偏好性设计对应的核苷酸序列(即Snailpro的编码序列)，同时为了后续的分子操作，该核苷酸序列在5’端添加Xho I限制性内切酶酶切位点CTCGAG，在3’端添加终止密码子和Not I限制性内切酶酶切位点GCGGCCGC；将设计完成的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.5)进行全基因合成。

将此合成的序列经Xho I和Not I双酶切连接到毕赤酵母载体pPIC9K中，获得重组蜗牛粘液蛋白表达载体。

实施例3

本实施例提供了一种重组蜗牛粘液蛋白表达及纯化方法，具体如下所示：

1.基因工程菌构建

重组蜗牛粘液蛋白表达菌株构建，将实施例1和实施例2构建的表达载体pPIC9K-Snailpro利用Sal I内切酶线性化后经电转化分别导入毕赤酵母宿主菌GS115感受态细胞中，G418抗生素筛选转化正确的阳性菌株，摇瓶鉴定阳性菌株的表达情况，选择出最优的菌株。

摇瓶鉴定表达情况，选择出最优的高表达重组菌株作为重组蜗牛粘液蛋白基因工程菌，该工程菌的表达产物SDS-PAGE电泳结果见图2。rSP的理论分子量为15.3KDa，rTSP理论分子量为16.49KDa，从图2中可见，目的蛋白条带显色位置处于Marker 15-16KDa，为了进一步验证序列的准确性，通过GC/MS质谱鉴定，其蛋白序列与理论蛋白序列相符。符合理论预期。

2.重组蜗牛粘液蛋白的发酵

将实施例3获得的重组蜗牛粘液蛋白rTSP基因工程菌进行发酵，以无机盐BSM培养基作为基础，控制pH5.0、温度28.0℃，溶氧控制在30％，当发酵罐(100L)内菌体湿重达200～220mg/mL时开始甲醇诱导，发酵诱导40～50小时后将发酵液放罐，完成发酵生产，所形成的重组蜗牛粘液蛋白的产量约为2g/L。利用生物合成法制备蜗牛蛋白周期短，产量高，具有相当可观的经济效益。利用相同的发酵条件获得rSP的产量约为1.8～2g/L，与rTSP产量相近。

3.重组蜗牛粘液蛋白的纯化及内毒素的去除

对上述的发酵液进行离心，收取发酵上清液；然后对发酵上清液用截留分子量为3.0KD的中空纤维超滤系统进行超滤脱盐浓缩，收集截留液；然后，用DEAE离子交换层析柱对截留液中的重组蜗牛粘液蛋白进行挂柱梯度洗脱纯化。其中，上样缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH7.5)，洗脱相采用20mM磷酸缓冲液含1M NaCl，pH7.5，由仪器在0.1～1.0M范围内自动调节梯度洗脱中的NaCl浓度。

收集含有重组蜗牛粘液蛋白的洗脱液，将洗脱液盐离子浓度调制150mM，利用Q型强阴离子交换层析柱去除内毒素(截留液直接上柱，内毒素结合于层析柱，蛋白流穿)；之后，对该流穿液采用截留分子量为3.0KD的中空纤维超滤系统进行脱盐浓缩，收集截留液；最后，将该截留液进行冷冻干燥，即可获得纯度≥95％、内毒素＜0.5EU/mg。

基于生物合成获得的蜗牛粘液成分单一，纯度高，安全性高，因此，能更好的用于科学研究以及各种场景的应用。

实施例4

本实施例主要探究实施例3获得的重组蜗牛粘液蛋白rTSP的溶解性和热稳定性，由于rSP与rTSP的理化性质相似，本实施例只呈现rTSP实验结果。

1.溶解性

将冻干的重组粘液蛋白粉末用PBS(pH7.4)分别配制成0.1％，1％和10％三种浓度。

图3显示重组蜗牛粘液蛋白的水溶性较好，均呈现透明溶液，10％浓度具有很高的粘稠度，溶解较慢，流动性低。市售的蜗牛粘液蛋白呈半透明粘稠状，高浓度时有较深的色素，随着浓度的增加透明度越低。

2.热稳定性

制备500ug/ml的重组蜗牛粘液蛋白存放于密封的10ml西林瓶中，并分别放置于不同的温度环境中。并于不同的时间观察溶液的澄清度。将待测样品用0.45μm滤膜过滤后通过BCA蛋白定量测定蛋白浓度。本实施例设定的五个温度分别为4℃，25℃，37℃，55℃，70℃，每组3个平行样。本实施例设定的实验的取样检测时间为：1h，3h，9h，24h，48h。

图4结果显示，重组蜗牛粘液蛋白具有优秀的热稳定性，在4℃和25℃环境中放置48h后几乎没有任何蛋白损失，在更高的加速温度55℃和70℃环境下放置48h蛋白损失率低于10％。

实施例5

本实施例主要探究实施例3获得的重组蜗牛粘液蛋白rTSP鉴定其促进细胞增殖/细胞毒性方面的生物活性，由于rSP的生物学性质与rTSP相同，因此本实施例进展示rTSP研究结果。

取对数生长期BALB/C 3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)(购自中国科学院上海细胞库)，以1×10⁵个/mL密度接种于96孔板，每孔100μL，分为对照组和实验组。置于二氧化碳细胞培养箱，37℃、5％ CO₂常规培养24h。

用无血清培养液(购自GIBICO)配制三种浓度的重组蜗牛粘液蛋白样品rTSp1、rTSp2、rTSp3，溶液浓度分别为1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL。

用PBS配制三种浓度的市售蜗牛粘液(提取的天然蜗牛粘液，购自漳州叶氏生物科技有限公司)，使用BCA法测定浓度分别为1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL，分别命名为市售蜗牛粘液1、市售蜗牛粘液2、市售蜗牛粘液3，并将溶液用0.22μm滤膜过滤除菌。

BALB/C 3T3细胞常规培养24h后，弃去旧培养液，加入100μL无血清培养液或100μL重组蜗牛粘液蛋白样品溶液，对照组为加入等量无血清培养液，实验组为加入100μL三种重组蜗牛粘液蛋白样品溶液，每组3个平行样。继续培养24h后，弃去培养液，每孔加入100μL用无血清培养液稀释10倍的CCK-8(购自生工生物工程(上海)股份有限公司中)，放入细胞培养箱中继续孵育2h。采用CCK-8法检测细胞相对增殖率，于450nm波长处用酶标仪测定吸光度。计算细胞相对增殖率(RGR)％＝实验组吸光度值/正常对照组吸光度值×100％。

三种浓度的市售蜗牛粘液的培养方法同上。

如图5所示，本实施例中，重组蜗牛粘液蛋白样品rTSp1、rTSp2、rTSp3和市售蜗牛粘液分别作用于BALB/C3T3细胞24h，其中rTSp2、rTSp3、市售蜗牛粘液2和市售蜗牛粘液3的促细胞相对增值率均显著高于对照组，分别提高了19.3％、35.5％、16.5％以及22.8％。此外，rTSp3的促细胞相对增值率显著高于市售蜗牛粘液3，rTSp1的促细胞增殖能力与对照组无显著性差异。

实施例6

本实施例主要探究实施例3获得的重组蜗牛粘液蛋白rTSP与市面常见保湿产品对人体皮肤保湿度的评测，测试样品包含了PBS缓冲溶液、甘油、市售蜗牛粘液、血清白蛋白、透明质酸钠、胶原蛋白和重组蜗牛粘液蛋白，将这些保湿成分配制成浓度1％的水溶液，重组蜗牛粘液蛋白rTSP-0.1浓度为0.1％，rTSP-1.0浓度为1.0％，按照以下方法进行评测。

本实施例采用皮肤水分含量MMV测试方法，此方法采用电容法测试人体皮肤角质层的水分含量，它的原理是基于水和其他物质的介电常数差异显著，按照皮肤含水量不同，测得皮肤的电容值不同，其观测参数可代表皮肤水分值。测试设备使用德国CK公司多功能皮肤测试仪，型号CUTOMETER DUAL MPA580。

测试环境条件：测试环境温度为22±1℃，湿度为50±5％，并且进行实时动态检测。

志愿者要求：有效志愿者至少30人，年龄在16～65岁之间：前臂测试区域电容法皮肤水分测定意义的基础值在15-100之间。

测试步骤，实验中左右手臂内侧标记3×3cm²试验区域，同一手臂可以标记多个区域，区域间隔1cm。测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。使用电容法皮肤测定仪进行受试区域和对照区域的测量。每个区域依照平行测定15次。先测量各测试区域的空白纸，然后按2.0±0.1mg样品/cm²的用量，使用乳胶指套将试验均匀涂布于试验区内。涂抹分别测量0.5小时、1小时、2小时，受试区域和空白对照区域的皮肤含水量(验证时按此时间测定)，同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。

测试数据，按实验的设计分贝测得各时间段的MMV值。

计算公式为：

W％＝(W1-W0)/W0×100％；注：w％＝皮肤水分含量增长百分比(MMV)。

W0＝皮肤使用样品前水分含量。

W1＝皮肤使用样品后水分含量。

表1各样品在各测试时间段的MMV值

结果如表1和图6。

结果显示，本发明开发的重组蜗牛粘液蛋白能够显著增加皮肤及时水分含量达皮肤及时水分含量增加136.02％，2h还能保持皮肤水分含量97.47％增长。其降低皮肤水分散失TEWL的能力大大提升，有利于肌肤的充分保湿。与几种常见的保湿成分相比，重组蜗牛粘液蛋白提高水分含量效果方面皆表现出优秀的效果，是一款优秀的保湿成分。

实施例7

本实施例通过将重组蜗牛粘液蛋白施用于皮肤后将其从皮肤表面洗去后检测皮肤的含水量，从而判断重组蜗牛粘液蛋白的皮肤渗透性。

采用实施例6的实验操作将rTSP1.0，市售蜗牛粘液以及不含皮肤渗透肽的rSP1.0，分别涂抹于皮肤后，保持2小时，待分子渗透至皮肤后，将皮肤表面的残留物清洗干净，并将皮肤表面擦拭干净。在环境中稳定10分钟后使用皮肤测试仪检测皮肤含水量。

结果如图7所示，显示2小时后，在皮肤表面无残留的情况下，重组的蜗牛粘液蛋白具有更好的皮肤锁水能力，结果显著优于市售蜗牛粘液，这是因为重组的蜗牛粘液蛋白分子量要比天然来源的蜗牛粘液分子更小。而含有皮肤渗透肽的重组蜗牛粘液蛋白其皮肤锁水显著优于不含皮肤渗透肽的重组蜗牛粘液蛋白，在皮肤渗透肽的作用下，蜗牛蛋白更好的渗透进入皮肤角质层，为皮肤提供长时间的锁水保湿能力。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种仿生重组蜗牛粘液蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列是基于棕色花园蜗牛的氨基酸序列进行改造，或者基于棕色花园蜗牛的氨基酸序列与皮肤渗透肽氨基酸序列重组获得。

3.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.5所示的核苷酸序列。

4.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达载体，其特征在于，包括权利要求3所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达载体，其特征在于，表达载体是在毕赤酵母载体pPIC9K或pPICza基础上构建获得。

6.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达工程菌，其特征在于，包括酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或哺乳动物表达系统中的至少一种。

7.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：

基于重组蜗牛粘液蛋白的氨基酸序列，按照工程菌母密码子偏好性设计对应的核苷酸序列；

将该核苷酸序列在5’端添加Xho I限制性内切酶酶切位点CTCGAG，在3’端添加终止密码子和Not I限制性内切酶酶切位点GCGGCCGC；

将设计完成的核苷酸序列进行全基因合成；

将合成的核苷酸序列经Xho I和Not I双酶切连接到载体中，获得重组蜗牛粘液蛋白表达载体。

8.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达方法，其特征在于，包括步骤：

构建重组蜗牛粘液蛋白的表达载体；

将表达载体转入宿主细胞，构建基因工程菌；

将基因工程菌进行发酵处理，后经包括纯化处理获得重组蜗牛粘液蛋白。

9.根据权利要求8所述的一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的表达方法，其特征在于，发酵过程包括：

控制以无机盐BSM培养基作为基础；

和/或控制pH5.0、温度28.0℃，溶氧控制在30％；当发酵罐(100L)内菌体湿重达200～220mg/mL时开始甲醇诱导，发酵诱导40～50小时后将发酵液放罐，完成发酵生产。

10.一种仿生重组蜗牛粘液蛋白的应用，其特征在于，用于制备化妆品、医用材料、药品。