CN117843763A

CN117843763A - 生物合成人体结构性材料xvii型胶原蛋白的方法

Info

Publication number: CN117843763A
Application number: CN202410026356.6A
Authority: CN
Inventors: 陆路; 朱赟; 杨霞; 姜世勃; 花晨; 王茜; 徐巍; 孙飞; 王建; 王颖
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd; Fudan University; Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd; Fudan University; Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2024-01-08
Filing date: 2024-01-08
Publication date: 2024-04-09

Abstract

提供了生物合成人体结构性材料XVII型胶原蛋白的方法。本申请的胶原蛋白包含以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者该氨基酸序列经过突变后的变体氨基酸序列，该变体氨基酸序列保留以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的功能。本申请的胶原蛋白能够促进细胞黏附，并且具有三螺旋结构。

Description

生物合成人体结构性材料XVII型胶原蛋白的方法

技术领域

本申请涉及蛋白质或多肽领域，具体地涉及胶原蛋白、其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。

天然胶原分子可形成一种特殊的超螺旋结构，这种结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这三个氨基酸残基通常为Gly-X-Y。Gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链使胶原蛋白紧密堆积，能维持皮肤张力和弹性。

近年来随着基因工程技术的广泛应用，研发人员创造出各种类型的重组胶原蛋白，例如可以通过选择来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列来构建重组胶原蛋白，这样构建的重组胶原蛋白具有例如免疫原性低、生物活性高、稳定性好等优点。理论上，这种重组胶原蛋白的氨基酸序列越短，透皮吸收性能越好，但是氨基酸序列不是越短越好。如何设计短氨基酸序列，才能使得构建的重组胶原蛋白具有更好的透皮吸收性能，现有技术中没有任何的理论可以作为指导。

XVII型胶原蛋白(COL17)是一种跨膜蛋白，主要在表皮基底角质形成细胞中表达。表皮-真皮附着需要COL17在表皮基底膜区的半桥粒上表达，因为先天性COL17缺乏导致交界性大疱性表皮松解症。除了促进表皮-真皮附着外，COL17还可作为毛囊干细胞的生态位，调节毛囊间表皮的增殖，并沿着表皮基底角质形成细胞的非半桥粒质膜存在。COL17在维持干细胞中的作用及其与信号通路相关联，它维持真皮和表皮之间的稳定黏附。胶原蛋白的功能和稳定性取决于不同多肽链的三螺旋形成。三螺旋结构的形成被认为取决于特定的三螺旋区域。然而，人们对这些卷曲螺旋结构的生理相关性知之甚少。COL17和膜相关胶原亚家族的其他成员在N端(膜近端)到C端方向经历三螺旋组装。

本领域中需要新的XVII型胶原蛋白以及其制备方法。

发明内容

针对目前的需要，发明人提供了新的XVII型胶原蛋白。本文的XVII型胶原蛋白具有促进细胞黏附的功效并且具有三螺旋结构。本发明还提供了生物合成人体结构性材料XVII型胶原蛋白的方法。

在第一方面，提供了胶原蛋白，其包含多个重复单元，重复单元包含以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸残基的突变的氨基酸序列；重复单元的数目是10-20、12-18或13-16。

在一个实施方案中，重复单元的数目是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在一个实施方案中，各重复单元直接连接或通过一个氨基酸或多个氨基酸残基的接头连接。在一个实施方案中，接头包含2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。

在一个实施方案中，突变是取代、插入、缺失或添加。在一个实施方案中，取代为保守氨基酸取代。

在一个实施方案中，胶原蛋白来源于人。在一个实施方案中，胶原蛋白具有三螺旋结构。在一个实施方案中，胶原蛋白具有细胞黏附功效。在一个实施方案中，胶原蛋白是重组胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白或重组人源化XVII型胶原蛋白。

在一个实施方案中，胶原蛋白包含以下氨基酸序列：

(1)以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；或

(3)以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸残基的突变的氨基酸序列。

在第二方面，提供了核酸，其编码本文所述的胶原蛋白。

在一个实施方案中，核酸具有以SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

在第三方面，提供了载体，其包含根据本文所述的核酸。在一个实施方案中，载体包含编码纯化标签的核苷酸、编码前导物的核苷酸和/或调节元件。

在一个实施方案中，纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。

在一个实施方案中，调节元件选自启动子、终止子和/或增强子。

在第四方面，提供了宿主细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的载体。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，和/或原核细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21。

在第五方面，提供了生产胶原蛋白的方法，其包括：

(1)在合适的培养条件下培养本文所述的宿主细胞；

(2)收获包含胶原蛋白的宿主细胞和/或培养基；和

(3)纯化胶原蛋白，例如包括(1)在Ni亲和层析柱上粗纯胶原蛋白；(2)添加胶原工具酶切；和/或(3)离子交换柱精纯胶原蛋白。

在第六方面，提供了组合物，其包含本文所述的胶原蛋白、核酸、载体和/或宿主细胞。

在一个实施方案中，组合物是药物组合物或化妆品组合物。

在一个实施方案中，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。

在一个实施方案中，组合物包含药学和/或化妆品可接受的载体。

在一个实施方案中，组合物为固体、液体或凝胶组合物。

在一个实施方案中，组合物为口服和/或局部施用的组合物，优选涂抹组合物。

在一个实施方案中，组合物为试剂盒。

在一个实施方案中，组合物为液体配制剂，其包含本文所述的胶原蛋白和药学和/或化妆品可接受的载体。

在一个实施方案中，载体是缓冲剂，例如D-PBS缓冲剂或PBS缓冲剂。

在第七方面，提供了使促进细胞黏附或贴壁的方法，所述方法包括使细胞与本文的胶原蛋白和/或组合物接触。

在第八方面，提供了本文所述的胶原蛋白、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物在生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料或3D打印人造器官生物材料中的用途。

在第九方面，提供了本文所述的胶原蛋白和/或组合物在制备用于促进细胞黏附或贴壁的药物或试剂盒的用途。

本发明的优点包括：本文所述的胶原蛋白是新的人源化XVII型胶原蛋白，其具有促进细胞黏附的功效并且具有三螺旋结构；本文的重组人源化胶原蛋白C17T15具有比牛Ⅰ型胶原蛋白具有更高(2倍以上)的细胞黏附活性，取得了出乎意料的技术效果。

附图说明

图1显示了重组人源化XVII型胶原蛋白C17T15的电泳图

图2显示了重组人源化XVII型胶原蛋白C17T15的质谱图。

图3显示了重组人源化XVII型胶原蛋白C17T15的细胞黏附。

图4显示了重组人源化XVII型胶原蛋白C17T15的圆二色谱。

图5显示了重组人源化XVII型胶原蛋白C17T15在Hela细胞中的细胞活力。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如本文中所用，重组人源化胶原蛋白是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定性别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。在本文中，重组人源化胶原蛋白是重组人源化XVII型胶原蛋白，其是通过肽键连接的多个氨基酸残基的肽或多肽。

如本文中所用，“一个或多个”可以是任何合适的整数。在胶原蛋白突变(例如取代、缺失、插入或添加)的情况下，“一个或多个”是本领域技术人员容易确定的数目，例如1-90以及其间的任何整数和范围，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39等。

如本文中所用，“核酸”是指通过核苷酸间连接的多个核苷酸。核苷酸间连接可以是例如磷酸二酯键。本文中的核酸可以包含编码本发明的多肽的多核苷酸。为了便于多肽后续处理，本发明的核酸还可以包含编码纯化标签，例如His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签的核苷酸，以及当需要时编码前导序列的核苷酸序列。

如本文中所用，术语“载体”是可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体可以包含本发明的核酸以便于导入细胞进行表达。载体可以包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。

如本文中所用，术语“宿主细胞”是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。例如，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。原核细胞可以是大肠杆菌细胞。

如本文中所用，“生物敷料”是一种新型的医疗敷料，可以用于创口的修复和治疗。它是由专业制作人员用生物材料制成，并与药物或其他治疗物质结合而成的一种特殊的医用材料。生物敷料中的胶原蛋白会在创面上形成一层保护层，促进细胞增生和再生，加速伤口愈合。

如本文中所用，“仿生材料”是指模仿生物的各种特点或特性而研制开发的材料。通常把仿照生命系统的运行模式和生物材料的结构规律而设计制造的人工材料称为仿生材料。“人体仿生材料”是指模仿人体的各种特点或特性而研制开发的材料。通常把仿照生命系统的运行模式和生物材料的结构规律而设计制造的人工材料称为仿生材料。

如本文中所用，“类器官培养材料”是指用于培养和构建具有类器官功能的人工材料以解决器官移植和替代的需求。

如本文中所用，“生物材料”是指能与生命体组织相容的材料,它通常被用于制造人造器官或替代组织。“3D打印人造器官生物材料”是指在3D打印人造器官中采用的生物材料。

如本文中所用，两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

在本发明的上下文中，保守氨基酸取代或保守取代可由在一个或多个下表中反映的氨基酸类别内的取代定义：

保守类别的氨基酸残基：

酸性残基	D和E
		碱性残基	K、R,和H
亲水的不带电残基	S、T、N和Q
		脂族不带电残基	G、A、V、L和I
非极性不带电残基	C、M和P
		芳族残基	F、Y和W

备选的氨基酸残基的物理和功能分类：

含醇基残基	S和T
		脂族残基	I、L、V和M
环烯基相关残基	F、H、W和Y
		疏水的残基	A,C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y
带负电残基	D和E
		极性残基	C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T
带正电残基	H、K和R
		小残基	A、C、D、G,N、P、S、T和V
极小残基	A、G和S
		参与转角形成的残基	A.C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T
柔性残基	Q、T、K、S、G、P、D、E和R

重组人源化XVII型胶原蛋白

在本文中，本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白可以存在一定的突变。例如，这些部分中的一个或多个的氨基酸序列可以存在氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入。也就是说，本发明可以使用变体，只要变体保留促进细胞黏附和/或增殖的活性。具体而言，变体可以与指定的序列具备一定的百分比同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。指定的序列可以是本发明的任何序列，例如SEQ ID NO:1或2，但是优选的是这些变体保留本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白的功能。本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白可以具有良好的细胞黏附功效并且具有三螺旋结构。

本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白可以通过任何合适的方式进行制备，例如可以通过合成制备。优选地，本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白可以通过重组方式制备。

本发明的胶原蛋白可以具有三螺旋结构区，即三螺旋结构形式的胶原蛋白，即具有三条相同的胶原蛋白链。例如，胶原蛋白具有柔性三螺旋结构区。本发明的胶原蛋白可以形成三螺旋结构。经过测定，本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白C17T15可以形成三螺旋结构。胶原蛋白的三螺旋结构是由三个多肽链相互缠绕而成的。每个多肽链由许多氨基酸相连而成，其中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等氨基酸在胶原蛋白的结构中尤为重要。这些氨基酸中的每一种都能够形成氢键，这种氢键可以将三个多肽链相联结结合成三个螺旋结构。在这个过程中，每个多肽链都按照同样的方式与另外两个多肽链相交织。研究表明，胶原蛋白的三螺旋结构对其热稳定性起着至关重要的作用。多肽链通过氢键相互缠绕时形成的三维结构是非常稳定的。大量的实验结果表明，要破坏胶原蛋白的三螺旋结构需要很高的温度或者酸碱度。在生物体内，胶原蛋白的热稳定性能够带来许多好处。例如，由于热稳定性较高，胶原蛋白能够在人体中长期保持稳定性并发挥自身的作用。这种稳定性也为胶原蛋白提供了耐受力，能够经受住日常的身体运动和机体代谢过程中产生的压力而不出现断裂或分解的情况。

组合物

本发明的重组人源化XVII型胶原蛋白可以制备为组合物。组合物可以包含本文所述的重组人源化XVII型胶原蛋白、核酸、载体和/或宿主细胞。组合物还可以包含药学和/或化妆品可接受的载体或溶剂。组合物可以是药物组合物或化妆品组合物，用于药品和/或化妆品的目的。例如，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。

化妆品组合物应用的部分没有特别限制，可以是脸部、手部、腿部、躯干等。组合物的形式没有特别限制，只要可以实现预期的功能。例如，组合物为固体、液体或凝胶组合物。

组合物可以以任何合适的方式应用，例如为口服和/或局部施用的组合物。组合物也可以制备为试剂盒。试剂盒可以包含另外的成分，例如辅助成分，如缓冲剂，并且包含使用说明书。特别地，组合物可以配制成合适的配制剂，如液体配制剂。配制剂可以包含缓冲剂，例如D-PBS缓冲剂或PBS缓冲剂。

方法和用途

本文提供了使细胞黏附或贴壁的方法，所述方法包括使细胞与本文所述的重组人源化XVII型胶原蛋白、组合物和/或液体配制剂接触。本发明的方法可以在体外进行，以增加细胞对培养容器的黏附。或者，本发明的方法也可以在体内进行。本发明还提供了文所述的重组人源化XVII型胶原蛋白、组合物和/或液体配制剂在制备药物和/或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于增加细胞黏附。除了本文所述的胶原蛋白外，试剂盒还可以包含合适的载体、稀释剂或赋形剂等，以及包含使用胶原蛋白的用法说明。

实施例

提供以下实施例来阐述本发明。领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性的，而非限制性的。本发明仅仅由所附权利要求书的范围限定。

实施例1：人源化XVII型胶原蛋白片段的构建、表达和筛选

1.进行大规模功能区筛选，得到以下人源化XVII型胶原蛋白的目的基因功能区。

C17T15氨基酸序列：ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdqghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdqghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq ghkgekgdkgdq(SEQ ID NO:2；重复单元为ghkgekgdkgdq，SEQ ID NO:1)。

发明人针对C17T15氨基酸序列设计出C17T15核苷酸序列。

C17T15核苷酸序列：

GGATCCGAGAACCTGTATTTTCAGGGTCATAAAGGTGAGAAAGGCGAC

AAAGGTGACCAGGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGATAAAGGCGATCA

GGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGATAAAGGTGACCAGGGTCATAAAG

GTGAAAAAGGTGATAAAGGCGATCAGGGTCATAAAGGTGAAAAAGGT

GATAAAGGCGATCAGGGCCATAAAGGTGAAAAAGGTGATAAAGGTGA

CCAGGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGATAAAGGCGATCAGGGTCATAA

AGGCGAAAAAGGTGATAAAGGCGATCAGGGTCATAAAGGTGAAAAAG

GTGATAAAGGCGATCAGGGCCATAAAGGTGAAAAAGGTGATAAAGGT

GATCAGGGCCATAAAGGTGAAAAAGGCGATAAAGGTGACCAGGGTCA

TAAAGGCGAAAAAGGTGATAAAGGTGATCAGGGTCATAAAGGCGAAA

AAGGTGATAAAGGTGATCAGGGTCATAAAGGCGAAAAAGGTGATAAA

GGCGATCAGGGTCATAAAGGCGAAAAAGGTGATAAAGGTGATCAGTAACTCGAG(SEQ ID NO:3)。

2.大肠杆菌基因工程菌的构建

将C17T15核苷酸序列克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。

具体而言，根据C17T15的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，优化选择其大肠杆菌偏好的密码子基因SEQ ID NO:3。合成SEQ ID NO:3的核苷酸序列。将C17T15基因片段通过Kpn I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入pET-32a表达载体(北京六合华大基因科技有限公司)，构建得到pET-32a-C17T15表达载体，将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。以上操作委托北京六合华大基因科技有限公司进行。

3.大肠杆菌基因工程菌的发酵培养

将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。具体过程为：

(1).在超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)置于冰上，取2μl待转化的质粒加入感受态细胞BL21(DE3)中，稍微混匀2-3次。

(2).将混合物置于冰上冰浴30min，然后于42℃水浴热激45-90s，取出后置于冰上冰浴2min。

(3).转移至生物安全柜中，并加入700μl液体LB培养基，然后于37℃、220rpm条件下培养60min。

(4).取200μl的菌液均匀涂布在含有氨苄西林钠LB平板上。

(5).将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。

(6).从转化好的LB平板中挑取5-6个单菌落于含有抗生素储液的LB培养基的摇瓶中，在220rpm，37℃恒温摇床中7h。再将培养后的摇瓶降温至16℃，添加IPTG诱导表达一段时间后，将菌液分装于离心瓶中，于8000rpm、4℃离心10min，收集菌体，并记录菌体重量，取样进行电泳检测。

(7).将收集的菌体用平衡工作液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质，高压均质两次，完成后收集菌液。将均质后的菌液分装至离心瓶中，于17000rpm、4℃离心30min，收集上清液，取上清液和沉淀进行电泳检测。

(8).将C17T15进行纯化和酶切，具体过程是：(1)粗纯：a.水洗柱材(Ni6FF，Cytiva)，5个CV。b.平衡液(200mM氯化钠、25mM Tris、20mM咪唑，pH8.0)平衡柱材，5个CV。c.上样：将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完后，取流穿进行电泳检验。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)至液体流完，并取洗杂流穿进行电泳检验。e.收集目的蛋白：添加20mL洗脱液(200mM氯化钠、25mM Tris、250mM咪唑，pH8.0)，并收集流穿液，检测蛋白浓度计算蛋白量，并进行电泳检测。f.用1M咪唑工作液清洗柱材。g.纯化水清洗柱材。(2)酶切：按蛋白总量与TEV酶总量比为50：1，添加TEV酶，16℃酶切4h，取样进行电泳检测。将酶切后的蛋白液放入透析袋，于4℃透析2h，再转移至新的透析液中4℃过夜透析。(3)精纯：a.平衡柱材(Ni6FF，Cytiva)：使用A液(20mM Tris，20mM氯化钠，pH8.0)将柱材平衡，流速为10ml/min。b.上样：流速为5ml/min，上样并收集流穿，并进行电泳检测。c.梯度洗脱：分别设置0-15％ B液(20mM Tris，1M氯化钠，pH8.0)2min然后保持3个CV、15-30％ B液2min然后保持3个CV、30-50％ B液2min然后保持3个CV、50-100％ B液2min然后保持3个CV，出峰收集并进行电泳检测(为精纯蛋白)。d.清洗柱材。将蛋白储存在4℃环境中。

浓度检测精确量取适量样品，用洗脱液稀释10-50倍，用玻璃棒充分搅拌均匀。使用紫外可见分光光度计在280nm处测定吸光度，根据公式C(mg/ml)＝A280×吸光系数×稀释倍数，计算蛋白浓度(注：吸光度值需在0.1-1)。

电泳检测具体过程为：取样品液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。实验结果，见图1，左一泳道为酶切后得到的目的蛋白，左二为酶切下的剩余载体蛋白，最右为marker，如图可见目的蛋白条带单一无杂蛋白条带。

质谱检测具体过程为：

A.将纯化蛋白经超纯水透析去除盐成分后，真空冷冻干燥成蛋白质干粉。

B.以超纯水或者基质缓冲液，含50％乙腈、0.1％三氟乙酸，溶解蛋白质干粉并稀释至0.1-10pmol/μl。

C.将蛋白样品液与饱和基质液以1:1的比例混合均匀。

D.取上述混合液1μl加于样品靶上，空气干燥。

E.将含有蛋白标准品和样品蛋白的样品靶放入MALDI-TOF-MS质谱仪，离子源：ESI。检测方式：正离子。母离子扫描范围：500-4000m/z。比较所测得的目的蛋白分子的精确分子量与根据蛋白质氨基酸序列推导的相对分子量的差异。

重组人源化胶原蛋白C17T15精纯蛋白的质谱检测结果显示于图2。如图2所示，本发明的胶原蛋白C17T15的理论分子量为18577.43，质谱上最高的峰显示实际分子量为18577.1kDa，与理论分子量一致。

实施例2：重组人源化胶原蛋白的生物活性检测

重组人源化胶原蛋白的黏附活性检测方法可以参考文献Juming Yao,SatoshiYanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derivedfrom Native Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：

(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括牛Ⅰ型胶原蛋白(中国食品药品检定研究院，编号：380002)、本发明提供的重组人源化胶原蛋白C17T15。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是：测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为Walker JM.The Protein Protocols Handbook,secondedition.HumanaPress.43-45)。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/mL。

(2)向96孔板中加入100μL各种蛋白溶液(牛Ⅰ型胶原蛋白或重组人源化胶原蛋白C17T15)或D-PBS溶液(空白对照组)。

(3)每孔中加入10⁵个培养状态良好的3T3细胞，37℃孵育60min。

(4)每孔用PBS清洗4次。

(5)用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测OD492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下

式中：

P：相对细胞粘附性比值；

OD₁：测试胶原蛋白样品各复孔在OD492nm处的吸光度平均值；

OD₂：对照胶原蛋白样品各复孔在OD492nm处的吸光度平均值；

OD₀：空白对照组各复孔在OD492nm处的吸光度平均值。

细胞的贴壁率即可以反映各蛋白的黏附活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。

结果如图3所示，从对比中可知，相比于牛Ⅰ型胶原蛋白(PC组，0.5mg/ml)，本发明的重组胶原蛋白C17T15具有更加优秀的生物黏附活性。图3描述了重组人源化胶原蛋白C17T15相对于牛Ⅰ型胶原蛋白的相对细胞黏附活性，表明重组人源化胶原蛋白C17T15具有比牛Ⅰ型胶原蛋白具有更高(2倍以上)的细胞黏附活性。重组人源化胶原蛋白C17T15具有如此高的细胞黏附活性是出乎意料的。

实施例3：重组人源化胶原蛋白C17T15的圆二色谱

1)样品制备

配制磷酸盐缓冲溶液(PBS)1X(在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2gKCl、3.62gNa2HPO4.12H2O和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高压灭菌后，保存于室温，如保存时间大于1周，如需使用需经0.45滤膜过滤)。

样品溶解：PBS溶解冻干絮状样品——每瓶含重组人源化胶原蛋白C17T15蛋白4mg,注射器吸取2mL PBS注射入西林瓶中(注意西林瓶中负压，需注射器准确吸取2mL PBS)终浓度为2mg/mL，4℃，过夜(配制时间2021年11月22日23:37样品生产日期为2021年8月14日)。

注意：蛋白类样品尽量选取A低于2(A：紫外吸收值)的样品测试，HT(仪器检测电压)控制在170-700之间，＞700时测试结果不够准确，可使用降低样品浓度，使用短波长比色皿，更换溶剂等办法。推荐浓度为1-0.5mg/mL为最高浓度，建议根据仪器灵敏度设置。

样品检测：

梯度稀释样品配置：1，用冰盒制冰机取冰，将4摄氏度过夜样品进行两倍梯度稀释(注意换枪头)，取500μl过夜样品，PBS稀释浓度分别为1.0、0.5、0.25、0.125mg/mL

2)仪器(圆二色光谱仪，JASCO J-815；JASCO公司)参数设定

条带宽度(Band width)：1.0nm

Step：1.0nm

测量范围(Measurement range)：190-260nm

每个点的时间(Time-per-point)：1s

扫描速度(Scanning speed)50nm/min

重复(Repeats)：3次

测量温度(Measurement temperature)：4℃

3)标准品CD扫描

设定扫描波长190-260nm空白缓冲液基线测试，采集样品溶液PBS在190-260nm范围的圆二色吸收。

4)扫描图谱处理。

图4显示了重组人源化胶原蛋白C17T15的圆二色谱。重组人源化胶原蛋白C17T15在195nm附近具有负峰，在221nm附近具有正峰，提示在该条件下，蛋白具有三螺旋结构。

实施例4：CCK8测定法

1.对前一天培养好的Hela细胞消化、离心、计数。

2.在96孔板上接种100μL 3-7k/孔的Hela细胞，在37℃、5％ CO₂、90％湿度条件下培养24小时。

3.在显微镜下观察细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。

4.配制不同浓度梯度的C17T15样本溶液。每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5％ CO₂、90％湿度条件下培养24小时。

5.在每孔中加入50μL按试剂盒(同仁化学研究所；Cell counting KIT-8，YZ-CK04)说明书稀释好的CCK-8溶液。

6.在37℃、5％ CO2、90％湿度条件下培养0.5小时。

7.酶标仪测450nm处测量吸光度。

8.用Graphpad Prism处理并分析结果。

结果如图5显示：所构建的重组十七型人源化胶原蛋白对人宫颈癌细胞Hela细胞在250μg/mL浓度以下未见明显细胞毒性，可对人体安全使用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.胶原蛋白，其包含多个重复单元，重复单元包含以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸残基的突变的氨基酸序列；重复单元的数目是10-20、12-18或13-16；各重复单元直接连接或通过一个氨基酸或多个氨基酸的接头连接；

优选地，突变是取代、插入、缺失或添加；优选地，取代为保守氨基酸取代；

优选地，所述胶原蛋白来源于人；

优选地，所述胶原蛋白具有三螺旋结构或是三螺旋结构形式的胶原蛋白；

优选地，所述胶原蛋白具有细胞黏附功效

优选地，所述胶原蛋白是重组胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白或重组人源化XVII型胶原蛋白。

2.根据权利要求1的胶原蛋白，其包含以下氨基酸序列：

(1)以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(3)以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中进行了一个或多个氨基酸残基的突变的氨基酸序列；优选地，突变是取代、插入、缺失或添加；优选地，取代为保守氨基酸取代。

3.核酸，其编码根据权利要求1或2所述的胶原蛋白；优选地，其中所述核酸具有以SEQID NO:3所示的核苷酸序列。

4.载体，其包含根据权利要求3所述的核酸，任选地，所述载体包含编码纯化标签的核苷酸、编码前导物的核苷酸和/或调节元件；

优选地，纯化标签选自His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签；

优选地，调节元件选自启动子、终止子和/或增强子。

5.宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸或根据权利要求4所述的载体；其中优选地，宿主细胞是真核细胞或原核细胞；其中优选地，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞，和/或原核细胞是大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌BL21。

6.生产胶原蛋白的方法，其包括：

(1)在合适的培养条件下培养根据权利要求5所述的宿主细胞；

(2)收获包含胶原蛋白的宿主细胞和/或培养基；和

7.组合物，其包含根据权利要求1或2所述的胶原蛋白、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求4所述的载体和/或根据权利要求5所述的宿主细胞；

优选地，组合物是药物组合物、食品组合物或化妆品组合物，

优选地，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种；

优选地，组合物包含药学和/或化妆品可接受的载体；

优选地，组合物为固体、液体或凝胶组合物；

优选地，组合物为口服和/或局部施用的组合物，优选涂抹组合物；

优选地，组合物为试剂盒；

优选地，组合物为液体配制剂，其包含根据权利要求1或2所述的胶原蛋白和药学和/或化妆品可接受的载体；优选地，载体是缓冲剂，例如D-PBS缓冲剂或PBS缓冲剂。

8.促进细胞黏附或贴壁的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求1或2所述的胶原蛋白和/或根据权利要求7的组合物接触。

9.根据权利要求1或2所述的胶原蛋白、根据权利要求3所述的核酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞和/或根据权利要求7的组合物在生物敷料、人体仿生材料、涂层材料、类器官培养材料或3D打印人造器官生物材料中的用途，或者在整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料或血管修复再生材料中的用途。

10.根据权利要求1或2所述的胶原蛋白和/或根据权利要求7的组合物在制备用于促进细胞黏附或贴壁的药物或试剂盒的用途。