CN115491328A - 一种大肠杆菌表达蛋白及其表达纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌表达蛋白及其表达纯化方法。该方法包括以下步骤：(1)L‑阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达，其中，在诱导表达阶段，用果糖、麦芽糖和甘油作为碳源；(2)收获菌体洗涤与匀质破碎；(3)表达蛋白的粗提取；(4)三步法柱层纯化蛋白，在阳离子交换层析纯化中引入表面活性剂TritonX‑114。本发明中，L‑阿拉伯糖诱导阶段，用果糖和麦芽糖等碳源替代葡萄糖，可以提高蛋白表达效率，L‑阿拉伯糖对于后期蛋白产品的安全性高于传统的IPTG；连续发酵连续收获的发酵方法，提高了最终收获的菌体量和产物量；采取超滤法粗提蛋白产物，有效缓解多次离心所带来的污染风险，柱层纯化引入表面活性剂Triton X‑114，可以提高蛋白纯度且有效降低内毒素含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及了一种大肠杆菌表达蛋白及其表达纯化方法。
背景技术
现有大肠杆菌表达质粒制备蛋白的方法中常采用IPTG诱导的方式，如中国发明专利CN110862945A公开一种大肠杆菌诱导蛋白表达的发酵方法，属于生物技术领域。该发酵方法包括以下步骤：将待发酵的种子液接种于发酵培养液中，并置于0.05~0.1MPa的压力条件下进行恒温发酵培养6~10h后，得到发酵底液；往上述发酵底液中添加诱导剂；所述诱导剂在所述发酵底液中质量浓度为0.1~1.5mmol/L；往上述加有诱导剂的发酵底液中添加补料液，并继续进行恒温发酵培养20~48h，得到发酵产物；所述补料液与所述加有诱导剂的发酵底液的体积比为(0.5~2):1。其中，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、乳糖、L-Arabinose和Tetracycline中的一种。又如中国发明专利CN111117933A公开了一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法，本培养基可提高大肠杆菌在细胞质内表达可溶性重组蛋白的成功率和产量。所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达。所述高效培养基用于表达重组蛋白，特别是大肠杆菌表达可溶性重组蛋白。
但是上述技术方案在具体实施时，存在如下缺陷：IPTG有一定的细胞毒性，收获的后期产品可能存在残留，对于纯度要求高的医药类产品有潜在安全风险。而且大肠杆菌在发酵后期受到培养体系等因素的限制，质粒容易开环，菌体容易发生自溶的情况，不利于产物的积累。后段一般色谱层析方法，细菌内毒素含量很难控制，并且有机溶剂等的引入导致产品有残留有害有机物的风险。一般的柱层析过柱后，内毒素的残余量也不太稳定，并不能高效去除，单独使用除内毒素的柱层析，成本高，且对于目的蛋白的产量有一定的影响。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种大肠杆菌表达蛋白及其表达纯化方法。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其包括以下步骤：
（1）L-阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达，其中，在诱导表达阶段，用果糖、麦芽糖和甘油作为碳源，接着采用连续发酵连续收获的灌流法进行培养；
（2）收获菌体洗涤与匀质破碎；
（3）表达蛋白的粗提取：采用超滤浓缩方式对蛋白产物进行粗提和置换；
（4）三步法柱层纯化蛋白，在阳离子交换层析纯化中引入表面活性剂TritonX-114。
在本发明中，所述L-阿拉伯糖诱导终浓度0.3-2mg/ml。
在本发明中，所述步骤（1）具体是指：采用灌流培养及连续收获的方式，在上罐培养到大肠杆菌达到对数期后，采用含L-阿拉伯糖灌流液进行灌流培养。
在本发明中，所述连续培养中收获出液量流速控制每分钟100-300ml，收集流出菌体。
在本发明中，上罐培养中，葡萄糖浓度为0.2%-2%（W/V）；所述灌流液中果糖浓度20%-40%（W/V），麦芽糖浓度10%-30%（W/V）和甘油5%-10%（W/V）。
在本发明中，所述三步法柱层纯化是指分别采用阴离子交换层析柱，疏水及阴离子复合层析柱，阳离子交换层析柱进行精纯。
在本发明中，阴离子交换层析DEAE Sepharose FF纯化中，层析柱平衡缓冲液溶液A的硼酸钠浓度为10-50mM和硼酸浓度为10-50mM；溶液B，与所述溶液A相同的硼酸钠和硼酸浓度，再加入0.2-0.5M NaCl，pH在8-10。
在本发明中，疏水及阴离子复合层析Capto adhere ImpRes纯化中，平衡缓冲液为20-50mM磷酸缓冲液pH（6.5-7.2），洗脱缓冲液0.05-0.15M 醋酸。
在本发明中，阳离子交换层析CM Sepharose Fast Flow纯化中的平衡缓冲液含0.05-0.15M醋酸溶液、20mM Na2HPO4溶液和0.2%-2% Trinton X-114，10-50mM Na2HPO4溶液洗10-20柱体积，10-50mM Na2HPO4溶液置换，10-50mM Na2HPO4溶液洗，pH值最终约为7.5。
一种大肠杆菌表达蛋白，其通过上述大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法纯化获得。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，L-阿拉伯糖诱导阶段，用果糖和乙酸等碳源替代葡萄糖，可以提高蛋白表达效率，同时灌流培养连续收获对于大肠杆菌活性状态，最终收获菌体量和表达蛋白产物的总量有明显提高，且L-阿拉伯糖对于后期蛋白产品的安全性高于传统的IPTG。同时，采取超滤法粗提蛋白产物，有效缓解多次离心所带来的污染风险。方法中采取的三步蛋白层析法过程中缓冲液中引入表面活性剂Triton X-114，可以提高蛋白纯度且有效降低内毒素含量。
附图说明
图1示出本发明大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法的流程示意图；
图2示出本发明诱导不同时间目的蛋白的表达情况，1号泳道为标准品，2号为诱导前样品，3-6号泳道为诱导1、2、3、4小时后所收样品。
图3示出本发明每次柱层析后蛋白的纯化情况，1号泳道为柱纯化前样品，2号泳道为第一次柱层析收获液，3号泳道为第二步柱层析收到的主峰样品，4号泳道为第二步柱层析收到的第二峰的样品，5号泳道为第三步柱层析后收到的样品，6号泳道为标准品。
具体实施方式
如背景技术描述的，现有大肠杆菌表达质粒制备蛋白的方法中常采用IPTG诱导的方式，但是IPTG有一定的细胞毒性，收获的后期产品可能存在残留，对于纯度要求高的医药类产品有潜在安全风险。而且后段一般色谱层析方法，细菌内毒素含量很难控制，并且有机溶剂等的引入导致产品有残留有害有机物的风险。一般的柱层析过柱后，内毒素的残余量也不太稳定，并不能高效去除，单独使用除内毒素的柱层析，成本高，且对于目的蛋白的产量有一定的影响。
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其包括以下步骤：
（1）L-阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达，其中，在诱导表达阶段，用果糖、麦芽糖和甘油作为碳源，接着采用连续发酵连续收获的灌流法进行培养，增加收获菌体总量；
（2）收获菌体洗涤与匀质破碎；
（3）表达蛋白的粗提取：采用超滤浓缩方式对蛋白产物进行粗提和置换；
（4）三步法柱层纯化蛋白，在阳离子交换层析纯化中引入表面活性剂TritonX-114。
所述L-阿拉伯糖诱导终浓度0.3-2mg/ml。在本发明中，所述L-阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达具体是指：采用灌流培养及连续收获的方式，在上罐培养到大肠杆菌达到对数期后，采用含L-阿拉伯糖灌流液灌流培养方式进行培养。上罐培养中，葡萄糖浓度为0.2%-2%（W/V）；所述灌流液中果糖浓度20%-40%（W/V），麦芽糖浓度10%-30%（W/V）和甘油5%-10%（W/V）。
具体地，在大肠杆菌表达体系中引入以L-阿拉伯糖诱导表达的载体体系，该体系蛋白溢漏表达量低，减少蛋白溢漏表达对菌体扩增的影响，诱导表达期利用适当比例的果糖，麦芽糖和甘油三阶碳源替代葡萄糖作为碳源，可以提高诱导效率；采用连续培养及连续收获的培养方式进行发酵，还可以有效提高宿主菌收获量及蛋白产量，且后期收获蛋白中不含具有细胞毒性的物质。菌体均质机破碎后，采用超滤浓缩进行粗提置换，后期经过三步柱层析纯化的方式，在最后一步阳离子交换层析体系内引入Triton X-144可以有效去除内毒素，收获高质量表达产物。
对于工业化生产大肠杆菌表达蛋白过程中，利用L-阿拉伯糖诱导体系代替IPTG诱导体系，降低IPTG残留对于产品安全性的影响。果糖、乙酸替代型碳源诱导体系配合连续发酵并连续收获的灌流发酵体系，提高大肠杆菌目的蛋白诱导表达量，和收获的菌量，最终进一步提高目的蛋白产量。超滤浓缩的粗提方式，避免了多次离心的污染。进行三步纯化DEAESepharose FF、Capto adhere ImpRes、CM Sepharose Fast Flow收获蛋白，在最终Na2HPO4溶液中引入中性表面活性剂Triton X-114，提高内毒素去除效率，最终使蛋白纯度可达95%以上，细菌内毒素含量可控制在低于1-5EU/mg。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以发酵生产类生物活性干扰素为例，发酵罐容量为100L，以L-阿拉伯糖诱导外源蛋白在大肠杆菌中的表达，并纯化蛋白产物。
实施例1
一种大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，如图1所示，包括以下步骤：
（1）L-阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达
以56L发酵培养基为例，
发酵液 A 液配制方法如下：称量硫酸镁七水合物 60.0g，葡萄糖500g，溶于 900ml 纯化水，定容至1L。贴上标签，115℃灭菌15min；
发酵液B配置方法如下：含有蛋白胨1100g，酵母提取物550g，十二水磷酸氢二钠610.5g，磷酸二氢钠125.4 g，硫酸铵110g，加入适量纯化水溶解，补加纯化水至55L。
1L发酵液A灭菌后冷却入发酵罐与55L发酵液B混合；菌种种子液复苏后两级激活，然后按照2%的菌浓度加入二级扩增菌种，发酵温度为37℃，pH值6.5-7，培养至2-4小时，OD600值约为0.8-1.2时，开始流加补料液（20g L-阿拉伯糖，5g硫酸镁七水合物，100g蛋白胨，50g酵母提取物，400g果糖，100g麦芽糖，50g甘油，配制到1L体积，即为补料液，配液量6L左右，灭菌），流速1-2L/小时，诱导发酵培养3-4小时，蛋白表达情况如附图2所示，3-4小时蛋白表达量未再明显升高，此时开始改为边流加边收获的灌流培养模式（灌流液配方与补料液相似，只将阿拉伯糖用量改为每1L灌流液2g）。进液量约每分钟100-200ml，出液量约每分钟100-300ml，连续培养收获5小时。
（2）收获菌体洗涤与匀质破碎
将步骤（1）收获的总菌通过离心和洗涤，用裂解溶液（20mM Tris，1mM EDTA，150mMNaCl，过滤灭菌，pH 值7.90-8.10）1:10W/V重悬，高压均质机破碎。
（3）表达蛋白的粗提取：采用超滤浓缩方式对蛋白产物进行粗提和置换
均质机破碎后离心，检测蛋白主要在上清还是沉淀，如在上清，可根据蛋白大小选择合适孔径的超滤膜，超滤浓缩，进行粗提和缓冲液置换。本实验中所得蛋白为包涵体（在沉淀），所以对蛋白进行清洗和变复性处理，将稀释复性后的蛋白溶液放置固定式层析冷柜过夜。超滤膜过滤浓缩蛋白。
（4）三步法柱层纯化蛋白
（4.1）阴离子交换层析DEAE Sepharose FF层析，用平衡缓冲液溶液A（硼酸钠浓度为10mM，硼酸浓度为10mM，pH在8-9）预处理5-10个柱体积后上样，溶液A洗样品管道，之后缓冲溶液B（与所述A溶液相同的硼酸钠和硼酸浓度，加入0.5M NaCl，pH在8-10）进行洗脱，待UV280 超过 50mAu 后开始收集洗脱峰，待 UV280 低于 50mAu后停止收集洗脱峰1；
（4.2）多模式强阴离子交换层析Capto adhere ImpRes层析，将洗脱峰1液采用含20mM磷酸缓冲液pH（6.5-7.2）的平衡缓冲液稀释5倍，并用HCl将pH调节至6.5-7.2。用此平衡缓冲液平衡层析柱3个柱体积后进行上样。上样结束并冲平后，采用0.15M 醋酸的洗脱缓冲液进行洗脱，待 UV280 超过 50mAu 后开始收集洗脱峰，待 UV280 低于50mAu后停止收集洗脱峰2；
（4.3）阳离子交换层析CM Sepharose Fast Flow层析，洗脱峰2采用含0.15M醋酸、20mM Na2HPO4和1% Trinton X-114的平衡缓冲液稀释3倍，并用此平衡缓冲液平衡5个柱体积后，上样，上样结束并冲平后，采用20mM Na2HPO4溶液洗20柱体积，待流出端pH值在3.0左右后，采用20mM Na2HPO4溶液进行洗脱，并收集洗脱峰，即为纯化后产品，pH值最终约为7.5。
经三步柱层析纯化后得到的蛋白以SDS-PAGE凝胶电泳检测（如图3），纯度约为95%，内毒素含量低于5EU/mg。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：一次性加入200ml过滤灭菌的含60g阿拉伯糖的无菌LB培养基后，加入不含阿拉伯糖的补料液（配方：5g硫酸镁七水合物，100g蛋白胨，50g酵母提取物，300g果糖，200g麦芽糖，50g甘油，配制到1L体积，用量约6-8L），灌流液配方与补料液相似，只将阿拉伯糖用量改为1g每1L灌流液
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：灌流液配方修改为：2g阿拉伯糖，5g硫酸镁七水合物，100g蛋白胨，50g酵母提取物，200g果糖，200g麦芽糖，50g甘油，配制到1L体积。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本申请引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)L-阿拉伯糖诱导大肠杆菌蛋白表达，其中，在诱导表达阶段，用果糖、麦芽糖和甘油作为碳源，接着采用连续发酵连续收获的灌流法进行培养；
(2)收获菌体洗涤与均质破碎；
(3)表达蛋白的粗提取：采用超滤浓缩方式对蛋白产物进行粗提；
(4)三步柱层析法纯化蛋白：分别采用阴离子交换层析柱，疏水及阴离子复合层析柱，阳离子交换层析柱进行精纯。在阳离子交换层析纯化中引入表面活性剂TritonX-114。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，所述L-阿拉伯糖诱导终浓度0.3-2mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)具体是指：采用灌流培养及连续收获的方式，在上罐培养到大肠杆菌达到对数期后诱导蛋白表达，之后采用含L-阿拉伯糖灌流液进行灌流培养。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，所述连续培养中收获出液量流速控制每分钟100-300ml，收集流出菌体。
5.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，诱导前发酵培养基葡萄糖终浓度为0.2％-2％(W/V)；所述灌流液中果糖浓度20％-40％(W/V)，麦芽糖浓度10％-30％(W/V)和甘油5％-10％(W/V)。
6.根据权利要求1、2或5所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，所述三步法柱层析纯化是指：阴离子交换层析柱是指：DEAE Sepharose FF、Q sepharose FF、capto Q、Capto Q Impres层析等，优选的阴离子交换层析柱为DEAE sepharose FF层析纯化。疏水及阴离子复合层析柱是指：Capto adhere ImpRes，Capto adhere，NM90 AgaroseTMHCM层析等，优选Capto adhere ImpRes层析纯化。阳离子交换层析柱是指：CM SepharoseFast Flow，CM Sepharose High Performance，Capto S ImpAct，SP Sepharose FF层析等。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，阴离子交换层析纯化方法为：采用含10-50mM的硼酸钠硼酸缓冲液，pH 8.5-9.5平衡5-10个柱体积后上样，上样结束后，采用上述硼酸缓冲液继续冲洗阴离子交换柱5-10个柱体积，并用含有0.2-0.5M Nacl的硼酸钠-硼酸缓冲液(pH8.5-9.5)进行洗脱，收集洗脱峰1，并用于下一步层析。
8.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，疏水及阴离子复合层析柱纯化方法为：权利要求7中所得洗脱峰1液采用含20-50mM磷酸缓冲液pH(6.5-7.2)的平衡缓冲液稀释2-5倍，并用6M的盐酸将pH调节至6.5-7.2。用此平衡缓冲液平衡层析柱3-5个柱体积后进行上样。上样结束并冲平后，采用0.05-0.15M醋酸的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰2。
9.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法，其特征在于，阳离子交换层析纯化方法为：权利要求8中所得洗脱峰2采用含0.05-0.15M醋酸、10-50mM Na2HPO4和0.2％-2％Trinton X-114的平衡缓冲液稀释1-3倍，并用此平衡缓冲液平衡5-10个柱体积后，上样，上样结束并冲平后，采用10-50mM Na2HPO4溶液洗10-20柱体积，待流出端pH值在2.0-3.0范围内后，采用10-50mM Na2HPO4溶液进行洗脱，并收集洗脱峰，即为纯化后产品，pH值最终约为7.0-8.0。
10.一种大肠杆菌表达蛋白，其特征在于，其通过如权利要求1-9任一所述的大肠杆菌表达蛋白的表达纯化方法纯化获得。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20221220 |