CN111320699B - 从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素融合蛋白的方法 - Google Patents
从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素融合蛋白的方法 Download PDFInfo
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- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
本发明提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白‑类胰岛素生长因子‑1融合蛋白(OsrHSA‑IGF‑1)的方法。具体步骤为先从重组人血清白蛋白‑类胰岛素生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有OsrHSA‑IGF‑1的粗提取液，将粗提取液经MMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；将初级产物I经Adhere复合阴离子交换层析或经Cibacron blue F3GA亲和层析，得到纯化的重组人血清白蛋白‑类胰岛素生长因子‑1融合蛋白目标物。本发明提取纯化方法简便高效，成本低，同时所得OsrHSA‑IGF‑1具有纯度高，活性好的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法。
背景技术
胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，简称IGF-1)是一类多功能细胞增殖调控因子，对细胞的分化、增殖和个体的生长发育具有重要的促进作用(LeRoith,1997)。IGF-1，除了由肝脏分泌通过循环系统到达靶组织，作用于靶细胞及靶器官，介导生长激素的生物效应；也能以自分泌或旁分泌的方式由局部组织细胞产生，参与对机体器官生长代谢的调节(Butler and LeRoith,2001)。在临床上，IGF-1已被广泛地用于治疗生长激素受体缺陷、生长激素不敏感综合症，IGF-1基因缺失，以及生长激素信号传导受阻的各类病人(Savageetal.,2004)。此外，由于IGF-1与胰岛素有的50％的同源序列，具有类似胰岛素的代谢作用：促进组织摄取葡萄糖，刺激糖原异生和糖酵解；促进糖原合成，促进蛋白质和脂肪合成，抑制蛋白质和脂肪分解，减少血液游离脂肪酸和氨基酸的浓度，因此，IGF-1也被用于I型和II型糖尿病病人(Clemmons,2007)以及具有严重胰岛素抵抗的胰岛素受体基因突变病人的治疗(De,Kerdanet M,etal.，2017)。
IGF-1在天然状态下的含量极低，直接从动物血液或者奶源中提取IGF-1十分困难。目前主要是通过重组DNA技术进行表达生产，已在包括大肠杆菌，酵母，基因工程植物和动物、细胞系在内的一系列表达体系中成功表达。但在这些表达系统中，大肠杆菌容易形成包涵体，需要变性复性获得具有活性的IGF-1，由于复性困难使得IGF-1活性很低，且回收率极低；采用酵母分泌方式表达的IGF-1取得成功，但因发酵前后形成结构不均一状态；基因工程动物和细胞系表达生产的成本十分高昂；利用叶片表达的基因工程植物生产IGF-1存在提取纯化困难等问题，同时，表达量较低且稳定性较差。
本发明人采用农业生物制药技术，依托稻胚乳细胞生物反应器的高效表达技术平台及重组蛋白纯化技术平台，采用水稻胚乳细胞高效表达重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白(OsrHSA-IGF-1)，表达的OsrHSA-IGF-1具有与天然蛋白类似的均一结构和活性，提取纯化工艺简单成本低廉等优点。
发明内容
本发明目的：提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白(OsrHSA-IGF-1)的方法，包括以下步骤：
1)从重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子融合蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的蛋白粗提取液；
2)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的蛋白粗提取液经Capto MMC或Bestarose Diamond MMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；
3)将初级产物I经Capto Adhere或Bestarose Diamond Adhere复合阴离子交换层析，得到纯化的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物；
或者在另一技术方案中，将初级产物I经Cibacron blue F3GA亲和层析，得到纯化的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物；
进一步的上述方法包含以下步骤：
(1)将基因工程稻谷脱壳，然后抛光成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1:5～1:10(kg/L)的比例混合，于25～60℃提取1～2小时。提取缓冲液的成分为：5～20mM磷酸盐、5～10mM醋酸钠、0～250mM氯化钠、10～30mM硫酸铵、10～20mM辛酸钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH 7.3～7.6。将上述得到的混合物用20％乙酸调节pH至5.4～5.6，放置沉淀2～8小时后，加入2～5％的珍珠岩进行压滤，0.22μm滤膜过滤后即为OsrHSA-IGF-1的粗提取液。
(2)采用Capto MMC或Bestarose Diamond MMC层析介质进行初级分离纯化。采用4～6个柱体积的平衡缓冲液(5～20mM磷酸盐、5～20mM醋酸钠，0～20mM柠檬酸三钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH为5.4～5.6)，以170～240cm/h的线性流速平衡层析柱；以步骤(1)的调配液为层析上样缓冲液，其中上样缓冲液pH为5.4～5.6，上样体积15～25柱体积；上样结束后用平衡缓冲液对层析柱进行再平衡3～5柱体积；用1～3柱体积洗杂缓冲液I(0～25mM磷酸盐、0～20mM柠檬酸三钠，20～40mM醋酸钠、0～15％(V/V)异丙醇，pH为4.8～5.2)，以170～240cm/h的线性流速进行洗杂0～3倍柱体积，再用3～5倍柱体积洗杂缓冲液II(0～25mM磷酸盐、0～20mM柠檬酸三钠，20～40mM醋酸钠、0～15％(V/V)异丙醇，0.9～1.4M氯化钠,pH为4.8～5.2,电导70～89mS/cm)进行再第二次洗杂：最后用洗脱缓冲液(20mM磷酸盐、0～20mM柠檬酸三钠，0～20mM醋酸钠、500mM氯化钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH 6.3～6.6)进行洗脱，收集含有OsrHSA-IGF-1的洗脱液，获得含4～6个柱体积的初级产物I；
(3)采用Capto Adhere或Bestarose Diamond Adhere层析介质进行第二步分离纯化。采用4～6个柱体积的平衡缓冲液I(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.9～7.1)，以120～300cm/h的流速平衡柱子；将步骤2的含OsrHSA-IGF-1的洗脱液中加入约等体积的纯水，并调节pH至6.9～7.1，作为此步层析的上样液，样品电导控制在24-29mS/cm；上样结束后用3～5柱体积的平衡缓冲液对层析柱进行再平衡；用洗杂缓冲液I(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠、10％异丙醇，1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.9～7.1)进行第一次洗杂，洗杂缓冲液体积为4～6个柱体积；然后用平衡缓冲液II(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.9～7.1)，进行第二次再平衡，平衡体积为4～6个柱体积；再用洗杂缓冲液II(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为5.9～6.4)进行第二次洗杂，所用洗杂液为4～6柱体积；最后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为3.5～4.5)进行洗脱，获得纯度95％以上的OsrHSA-IGF-1融合蛋白；
(4)在另一技术方案中，采用Cibacron blue F3GA亲和层析介质进行第二步分离纯化。采用4～6个柱体积的平衡缓冲液(20mM醋酸钠，pH为5.0～5.8)，以120～300cm/h的流速平衡柱子；将步骤2的含OsrHSA-IGF-1的洗脱液中加入约9倍体积的纯水，并调节pH至5.0～5.8，作为此步层析的上样液；上样结束后用平衡缓冲液对层析柱进行再平衡3～5柱体积；用洗杂缓冲液I(0～20mM柠檬酸三钠，0～20mM醋酸钠，20mM磷酸氢二钠、150～200mM氯化钠，pH为6.9～7.1)进行第一次洗杂，所用洗杂缓冲液为4～6个柱体积；用洗杂缓冲液II(0～20mM柠檬酸三钠，0～20mM醋酸钠，20mM磷酸氢二钠，200～900mM氯化钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，pH为7.5～8.0)，进行第二次洗杂，洗杂为4～6个柱体积；用洗脱缓冲液(0～20mM柠檬酸三钠，0～20mM醋酸钠，20mM磷酸氢二钠，1～2M氯化钠，0～1mM还原型谷胱甘肽，0～20mM辛酸钠，pH为7.5～8.0进行洗脱，洗脱体积大约4～6个柱体积，获得纯度95％以上的OsrHSA-IGF-1融合蛋白。
本发明还提供一种用于制备所述的基因工程水稻种子的植物表达载体，所述表达载体是将表达人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的基因与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。优选的，所述表达人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述质粒载体为pOsPMP02。
本发明提供了一种从基因工程水稻中分离纯化重组血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，通过本方法获得的目标蛋白，纯度超过95％，生物活性较好。同时本发明技术方案经济，高效，适宜于工业应用。
附图说明
图1 pOsPMP02质粒。
图2农杆介导菌质粒pOsPMP76。
图3 pOsPMP135质粒。
图4 7个转基因品系的PCR检测。泳道1：PMP76-13；PMP泳道2：PMP76-19；泳道3：PMP76-34；泳道4：PMP76-39；泳道5：PMP76-40；泳道6：PMP76-75；泳道7：PMP76-277；PC：阳性对照；NC：阴性对照(台北309)。
图5 Gt13a启动子介导重组人HSA-IGF-1融合蛋白的表达。泳道1，76-34；2:76-19；3、76-13；4、76-40；5、76-39；6、76-75；7、76-227；8、阴性对照台北309。M：预染蛋白Marker。
图6不同pH条件酸沉后上清液和沉淀的SDS-PAGE图。
图7不同酸沉时间提取液上清液的SDS-PAGE图。
图8 Macro prep High S与Capto MMC层析纯化后的提取液的SDS-PAGE图。
图9各种阴离子填料层析后提取液的SDS-PAGE图。
图10 phenyl HP(左)与Capto Adhere(右)填料梯度洗脱HSA-IGF-1的SDS-PAGE图。
图11 MMC层析纯化洗脱液的SDS-PAGE图。
图12 HSA-IGF-1的Adhere层析纯化洗脱液SDS-PAGE图。
图13 MMC载量测定分段收集的穿透液SDS-PAGE图。
图14 MMC载量测定分段收集的穿透液western检测结果。
图15 Capto Adhere载量测定分段收集的穿透液的SDS-PAGE图。
图16 MMC-Blue层析串联纯化各步上样液和洗脱液的SDS-PAGE图。
图17 Blue载量测定分段收集的穿透液SDS-PAGE图。
图18 IGF活性测定。
图19 OsrIGF-1样品与rhIGF-1竞品经FDC-P1细胞测试后细胞生长曲线(EC50曲线)。
图20不同IGF-1竞品和样品对培养Day 0-9的FDC-P1细胞生长变化曲线图(OD450)。
图21 OsrIGF-1、Prospec rhIGF-1及10％FBS培养基对FDC-P1细胞传代后细胞生长数量增长图。
图22 OsrIGF-1、Prospec rhIGF-1及10％FBS培养基对FDC-P1细胞再培养3,5,8天后的细胞存活率柱状图。
具体实施方式
以下通过结合附图详细说明本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中使用的Bestarose Diamond MMC(MMC)、Bestarose Diamond Adhere(Adhere)填料，Cibacron blue F3GA填料，生产商是博格隆(上海)生物技术有限公司；Capto MMC、Capto Adhere填料、XK 26/20、XK16/20层析柱，购自通用电气(GE Healthcare)公司；其它材料或试剂如无特殊说明均为常规市售产品；
实施例1制备含重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的基因工程水稻
HSA-IGF-1基因序列(SEQID NO.1)经水稻偏好的遗传密码子优化后由金斯瑞生物科技有限公司合成，采用水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽来介导HSA-IGF-1基因在水稻胚乳细胞中的表达，具体参考公开号为ZL 200510019084.4中的方法来构建本发明的水稻特异性表达重组人HAS-IGF-1载体以及筛选基因工程水稻植株，将其中所述的重组人血清白蛋白换成本发明的重组人HAS-IGF-1。用如图1所示的质粒pOsPMP02来构建水稻胚乳特异性表达盒。将含所述合成的经密码子优化的HSA-IGF-1基因序列用MylI和XhoI酶切后克隆到pOsPMP02中构建成中间载体；然后用HindIII和EcoRI酶切中间载体，将长度为4266bp的含Gt13a启动子及其信号肽序列还有经密码子优化的HAS-IGF-1基因以及Nos终止子的整个表达盒(如SEQ ID NO.2所示)插入到双元表达载体JH2600，构建农杆介导菌质粒，命名为pOsPMP76，具体如图2所示。将所述pOsPMP76质粒和如图3所示的pOsPMP135质粒分别转化根癌农杆菌EHA105(美国Invitrogen公司)，通过根癌农杆菌介导共转化将pOsPMP76和pOsPMP135转化到水稻品种台北309的愈伤再生组织中，经培养、筛选和诱导后形成完整的植株；然后，通过PCR扩增来鉴别阳性转化植株，用起始于Gt13a信号肽的正向引物为(SEQID NO.3:5′-GAGGGTGTGGAGGCTCTTGT-3′)，起始于HSA基因的反向引物序列为(SEQ IDNO.4:5’-GAGGGTGTGGAGGCTCTTG-3’)。鉴别结果表明，通过根癌农杆菌介导转化获得7株独立的重组HAS-IGF-1基因工程水稻(图4-图5)，进一步经过Elisa检测，7个基因工程水稻品系的表达量47-288微克/克之间，其中以品系76-13的表达量最高，达到288微克/克(表1)。
表1、HSA-IGF-1表达水平的ELISA定量结果(微克/克)
| 品系 | 76-13 | 76-19 | 76-34 | 76-39 | 76-40 | 76-277 |
| 微克/克 | 288.86 | 107.50 | 161.62 | 125.29 | 47.82 | 62.36 |
序列表
SEQID NO.1
GACGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTCAAGGACCTCGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTCGTGCTCATCGCCTTCGCCCAGTACCTCCAGCAGTGCCCGTTCGAGGACCACGTGAAGCTCGTGAACGAGGTGACCGAGTTCGCCAAGACCTGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGCGACAAGAGCCTCCACACCCTCTTCGGCGACAAGCTCTGCACCGTGGCCACCCTCCGCGAGACCTACGGCGAGATGGCCGACTGCTGCGCCAAGCAGGAGCCGGAGCGCAACGAGTGCTTCCTCCAGCACAAGGACGACAACCCGAACCTCCCGCGCCTCGTGCGCCCGGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTCCACGACAACGAGGAGACCTTCCTCAAGAAGTACCTCTACGAGATCGCCCGCCGCCACCCGTACTTCTACGCCCCGGAGCTCCTCTTCTTCGCCAAGCGCTACAAGGCCGCCTTCACCGAGTGCTGCCAGGCCGCCGACAAGGCCGCCTGCCTCCTCCCGAAGCTCGACGAGCTCCGCGACGAGGGCAAAGCCTCCAGCGCCAAGCAGCGCCTCAAGTGCGCCAGCCTCCAGAAGTTCGGCGAGCGCGCCTTCAAAGCCTGGGCCGTGGCCCGCCTCAGCCAGCGCTTCCCGAAGGCCGAGTTCGCCGAGGTGTCCAAGCTCGTGACCGACCTCACCAAGGTGCACACCGAGTGCTGCCACGGCGACCTCCTGGAGTGCGCCGACGACCGCGCCGACCTCGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACAGCATCTCCAGCAAGCTCAAGGAGTGCTGCGAGAAGCCGCTCCTGGAGAAGTCCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAACGACGAGATGCCGGCCGACCTCCCGTCCCTCGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGACGTCTTCCTCGGCATGTTCCTCTACGAGTACGCCCGCCGCCACCCGGACTACTCCGTGGTGCTCCTCCTCCGCCTCGCCAAGACCTACGAGACCACCCTGGAGAAGTGCTGCGCCGCCGCCGACCCGCACGAGTGCTACGCCAAGGTGTTCGACGAGTTCAAGCCGCTCGTGGAGGAGCCGCAGAACCTCATCAAGCAGAACTGCGAGCTCTTCGAGCAGCTCGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTCCTCGTGCGCTACACCAAGAAGGTGCCGCAGGTGTCCACCCCGACCCTCGTGGAGGTGTCCCGCAACCTCGGCAAGGTGGGCAGCAAGTGCTGCAAGCACCCGGAGGCCAAGCGCATGCCGTGCGCCGAGGACTACCTCTCCGTGGTGCTCAACCAGCTCTGCGTGCTCCACGAGAAGACCCCGGTGAGCGACCGCGTGACCAAGTGCTGCACCGAGAGCCTCGTGAACCGCCGCCCGTGCTTCTCCGCCCTGGAGGTCGACGAGACCTACGTCCCGAAGGAGTTCAACGCCGAGACCTTCACCTTCCACGCCGACATCTGCACCCTCTCCGAGAAGGAGCGCCAGATCAAGAAGCAGACCGCCCTCGTCGAGCTCGTGAAGCACAAGCCGAAGGCCACCAAGGAGCAGCTCAAGGCCGTGATGGACGACTTCGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGCAAGGCCGACGACAAGGAGACCTGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTCGTGGCCGCCAGCCAGGCCGCCCTCGGCCTCATCGAGGGCAGGGGCCCGGAGACCCTCTGCGGCGCCGAGCTCGTGGACGCCCTCCAGTTCGTGTGCGGCGACCGCGGCTTCTACTTCAACAAGCCGACCGGCTACGGCAGCAGCAGCCGCCGCGCCCCGCAGACCGGCATCGTGGACGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTCCGCCGCCTGGAGATGTACTGCGCCCCGCTCAAGCCCGCCAAGAGCGCCTGA
SEQ ID NO.2
TTTTCTCTTAGGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCCGCGGGTTGTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTCACACCTTATGTAAAGTATTTGTTGCAAGAAAAGTCTAAGATGACAGCAACCTGCTGAGAAGAACAACTGACGATGTCATAAGGAGAGGGAGCTTTTCGATAGGTGCCGTGCAGTTCAAAGAGTTAGTTAGCAGTAGGATGAAGATTTTTGCACATGGCAATGAGAAGTTAATTATGGTGTAGGCAACCCAAATGAAACACCAAAATATGCACAAGACAGTTTGTTGTATTCTGTAGTACAGAATAAACTAAAGTAATGAAAGAAGATGGTGTTAGAAAATGAAACAATATTATGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGACCACGAAATAAAAAAAGAACATTTTTATGAGCAGTGTGTTCTCAATGAGCCTTGAATGTTATCACCCAGGATAAGAAACCCTTAAGCAATGAAACATGCAAGCGTTTAATGTGCAAAGTTGGCATTCTCCACGACATAATGCAAAAGAAGATATAATCTATGACATAGCAAGTCATGCATCATTTCATGCCTCTGTCAACCTATTCATTTCTAGTCATCTAGGTAAGTATCTTAAGCTAAAGTGTTAGAACTTCCCATACATAAGTCATAACTGATGACAATTGGGTGTAACACATGACAAACCAGAGAGTCAAGCAAGATAAAGCAAAAGGATGTGTACATAAAACTACAGAGCTATATGTCATGTTGCGAAAAGAGGAGAGCTTATAAGACAAGCCATGACTCAAAAAAAATTCACATGCCTACTGTGGCCCATATATCATGCAACAATCCAAAAACTCACAGGTCTCGGTGTTGATCGTGTCAACATGTGACCACCCTAAAAACTCTTCACTAAATATTAAAGTATTGCTAGAACAGAGCTTCAAGATATAAGTCATGATCACCAACAACCATGTTCAAAAAGAAATAGAAAGCTATGGCACAGCAACAAAAAGCAAAAGCATGCATGGATATAATCTTTAACATCATCCATGTCATATTGCAAAAGAAAGAAAGAGAGAACAATACAAATGATGTGTCAATTACACATCCATCATTATCCATCCACCTTCCGTGTACCACACTTCATATATCATGAGTCACTTCATGTCTGGACATTAACAAACTCTATCTTAACATTCAAATGCATGAGACTTTATCTCACTATAAATGCACAATGATTTAGCATTGTTTCTCACAAAACCATTCAAGTTCATTAGTACTACAACAACATGGCATCCATAAATCGCCCCATAGTTTTCTTCACAGTTTGCTTGTTCCTCTTGTGCAATGGCTCTCTAGCCGACGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGCTTCAAGGACCTCGGCGAGGAGAACTTCAAGGCCCTCGTGCTCATCGCCTTCGCCCAGTACCTCCAGCAGTGCCCGTTCGAGGACCACGTGAAGCTCGTGAACGAGGTGACCGAGTTCGCCAAGACCTGCGTGGCCGACGAGAGCGCCGAGAACTGCGACAAGAGCCTCCACACCCTCTTCGGCGACAAGCTCTGCACCGTGGCCACCCTCCGCGAGACCTACGGCGAGATGGCCGACTGCTGCGCCAAGCAGGAGCCGGAGCGCAACGAGTGCTTCCTCCAGCACAAGGACGACAACCCGAACCTCCCGCGCCTCGTGCGCCCGGAGGTGGACGTGATGTGCACCGCCTTCCACGACAACGAGGAGACCTTCCTCAAGAAGTACCTCTACGAGATCGCCCGCCGCCACCCGTACTTCTACGCCCCGGAGCTCCTCTTCTTCGCCAAGCGCTACAAGGCCGCCTTCACCGAGTGCTGCCAGGCCGCCGACAAGGCCGCCTGCCTCCTCCCGAAGCTCGACGAGCTCCGCGACGAGGGCAAAGCCTCCAGCGCCAAGCAGCGCCTCAAGTGCGCCAGCCTCCAGAAGTTCGGCGAGCGCGCCTTCAAAGCCTGGGCCGTGGCCCGCCTCAGCCAGCGCTTCCCGAAGGCCGAGTTCGCCGAGGTGTCCAAGCTCGTGACCGACCTCACCAAGGTGCACACCGAGTGCTGCCACGGCGACCTCCTGGAGTGCGCCGACGACCGCGCCGACCTCGCCAAGTACATCTGCGAGAACCAGGACAGCATCTCCAGCAAGCTCAAGGAGTGCTGCGAGAAGCCGCTCCTGGAGAAGTCCCACTGCATCGCCGAGGTGGAGAACGACGAGATGCCGGCCGACCTCCCGTCCCTCGCCGCCGACTTCGTGGAGAGCAAGGACGTGTGCAAGAACTACGCCGAGGCCAAGGACGTCTTCCTCGGCATGTTCCTCTACGAGTACGCCCGCCGCCACCCGGACTACTCCGTGGTGCTCCTCCTCCGCCTCGCCAAGACCTACGAGACCACCCTGGAGAAGTGCTGCGCCGCCGCCGACCCGCACGAGTGCTACGCCAAGGTGTTCGACGAGTTCAAGCCGCTCGTGGAGGAGCCGCAGAACCTCATCAAGCAGAACTGCGAGCTCTTCGAGCAGCTCGGCGAGTACAAGTTCCAGAACGCCCTCCTCGTGCGCTACACCAAGAAGGTGCCGCAGGTGTCCACCCCGACCCTCGTGGAGGTGTCCCGCAACCTCGGCAAGGTGGGCAGCAAGTGCTGCAAGCACCCGGAGGCCAAGCGCATGCCGTGCGCCGAGGACTACCTCTCCGTGGTGCTCAACCAGCTCTGCGTGCTCCACGAGAAGACCCCGGTGAGCGACCGCGTGACCAAGTGCTGCACCGAGAGCCTCGTGAACCGCCGCCCGTGCTTCTCCGCCCTGGAGGTCGACGAGACCTACGTCCCGAAGGAGTTCAACGCCGAGACCTTCACCTTCCACGCCGACATCTGCACCCTCTCCGAGAAGGAGCGCCAGATCAAGAAGCAGACCGCCCTCGTCGAGCTCGTGAAGCACAAGCCGAAGGCCACCAAGGAGCAGCTCAAGGCCGTGATGGACGACTTCGCCGCCTTCGTGGAGAAGTGCTGCAAGGCCGACGACAAGGAGACCTGCTTCGCCGAGGAGGGCAAGAAGCTCGTGGCCGCCAGCCAGGCCGCCCTCGGCCTCATCGAGGGCAGGGGCCCGGAGACCCTCTGCGGCGCCGAGCTCGTGGACGCCCTCCAGTTCGTGTGCGGCGACCGCGGCTTCTACTTCAACAAGCCGACCGGCTACGGCAGCAGCAGCCGCCGCGCCCCGCAGACCGGCATCGTGGACGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTCCGCCGCCTGGAGATGTACTGCGCCCCGCTCAAGCCCGCCAAGAGCGCCTGAAAGCTTGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCCAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCTGCCAC
实施例2从基因工程稻米中提取OsrHSA-IGF-1融合蛋白提取条件确定
通过ZL 200510019084.4专利中的方法进行构建获得OsrHSA-IGF-1基因工程水稻后，根据本体系的特点，结合HAS-IGF-1和储藏蛋白的理化性质，提取采用酸性缓冲液提取，采取中性pH提取后不同pH条件下沉淀研究提取和除杂效果，确定最佳酸沉条件为pH 5.5～5.8(图6)。最优技术方案采取了pH 7.2提取，pH 5.6进行酸沉的提取工艺条件。在此基础上进一步研究了不同酸沉时间的效果，结果表明酸沉控制在3-9小时，提取液上清没有明显变化(图7)。
实施例3层析方法填料筛选和确定
3.1阳离子交换填料的筛选
比较了GE、Bio-Rad、TOSOH、Nano-micro四个厂家共16种阳离子填料筛选，发现在缓冲液为10mMPB,2g/LNaAC,pH5.0的情况下，填料Macro-prep High S、Nuvia Prime、NuviaHR-S，SP FF、SP-HP、Capto MMC以及UniMSP-50M在上样2柱体积的条件下，目的蛋白可完全挂柱。
进一步进行研究发现，复合阳离子填料Capto MMC具有在富集目的蛋白的同时可以除去50kDa杂蛋白的较好效果(图8)，因此确定Capto MMC为第一步层析填料。
3.2阴离子交换填料的筛选
比较了不同厂家共11种阴离子填料，发现在缓冲液为10mM PB，pH 7.0的情况下，Nuvia Q、DEAE FF、Q FF、Q HP、Capto Adhere、PI、Cap Q、Super Q，在上样2柱体积的条件下可完全挂柱。
进一步优选填料，发现各种单纯阴离子模式填料无法达到HSA-IGF-1与其他杂蛋白的有效分离(图9)，但以Capto Adhere填料表现最优的分离效果(图10)。
3.3疏水作用填料的筛选
对不同厂家的疏水填料进行了筛选，发现在缓冲液为1M硫酸铵,pH 7.0的情况下，在Butyl FF、Phenyl FF、Phenyl HP以及Capto MMC在上样2柱体积的条件下目的蛋白可完全挂柱，但对目的蛋白疏水作用较强，目的蛋白只能在CIP(Water)下被洗脱下来，同时仍存在杂带组分无法有效分离，其中以Capto MMC结合Capto Adhere的工艺适合HSA-IGF-1的纯化。
3.4层析工艺确定
3.4.1 MMC层析条件的确定
选用Capto MMC或者Bestarose Diamond MMC填料，通过对上样、洗杂缓冲液、洗脱缓冲液的pH值以及NaCl浓度的组合摸索，最终确定了如下条件：
平衡缓冲液：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH为5.4-5.6；
洗杂缓冲液I：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，10％异丙醇，pH 4.8-5.2；
洗杂缓冲液II：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，10％异丙醇，1.4M NaCl，pH 4.8-5.2；
洗脱缓冲液：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，1mM还原型谷胱甘肽，0.5M氯化钠，pH 6.3-6.6。
3.4.2 Adhere层析条件的确定
选用Capto Adhere或者Bestarose Diamond Adhere填料，通过对上样、洗杂缓冲液、洗脱缓冲液的pH值以及NaCl浓度的组合摸索，最终确定了如下组分：
平衡缓冲液I：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，200mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH 6.9-7.1；
洗杂缓冲液I：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，200mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，10％IPA，pH 6.9-7.1；
平衡缓冲液II：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，200mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH 6.9-7.1；
洗杂缓冲液II：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH 5.9-6.4；
洗脱缓冲液：20mM柠檬酸三钠，20mM十二水合磷酸氢二钠，600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH 3.5-4.5。
3.4.3纯化结果
图11显示了第一步MMC层析的结果。图12显示了第二步Adhere层析工艺用于纯化HSA-IGF-1的结果，由图可知，在2个洗杂步骤能有效地去除了低于HSA-IGF-1分子量的杂蛋白。
经过两步层析，以投料800g米粉计，第一步MMC层析后取洗脱液的2/3(500ml)上样第二步阴离子层析，折算成533g米粉的产出，最终可获得14.6mg的HSA-IGF-1，纯度大于95％，内毒素小于1EU/ug，(表2)。
表2 HSA-IGF-1各步骤纯化结果表
3.5各步层析载量确定：
3.5.1第一步层析(Capto MMC)载量确定
以100g米粉1:5(W/V)提取，获得约400ml蛋白提取液,按照3-5cm/min流速上样，分段收集穿透液进行PAGE和WB检测，判断MMC载量。
结果显示：在8ml的MMC填料最多上样体积至120ml，即第一步层析的载量为15ml蛋白提取液(图13、图14)。
3.5.2第二步层析(Capto Adhere)载量确定
以Capto MMC洗脱液，按照确定上样条件进行上样，分段收集穿透液进行PAGE和WB检测，测定结果显示Capto Adhere的载量约为6ml MMC洗脱液/ml Adhere填料(图15)。
3.6 Cibacron blue F3GA亲和层析
3.6.1 Cibacron blue F3GA层析条件确定
考虑到HSA-IGF-1融合蛋白第二步Adhere层析工艺较为繁琐，且回收率偏低，开发了基于Blue(Cibacron blue F3GA)亲和层析的方法。在pH 5.5的上样pH下，以纯化的白蛋白模拟了不同盐浓度0，50mM，250mM NaCl下的上样情况，结果发现50mM更适合作为上样盐浓度；进一步测试了辛酸钠和NaCl作为洗杂液成分的效果，确定最适合的pH为7.0，含有20mM磷酸盐，150mM NaCl的缓冲液作为第一次洗脱杂蛋白的缓冲液；进一步通过线性梯度洗脱方式确定了第二步洗脱杂蛋白的缓冲液成份为：20mM磷酸盐，900mM NaCl，pH 7.7；Cibacron blue F3GA亲和层析的洗脱的缓冲液成份条件为：20mM磷酸盐，1.45M NaCl，20mM辛酸钠，1mM还原型谷胱甘肽，pH 7.7。经过Cibacron blue F3GA亲和层析最终获得图16所示层析纯化结果。
3.6.2 Cibacron blue F3GA层析载量
为探讨Blue的载量，将MMC洗脱液用pH 5.8的20Mm NaAc缓冲液脱盐并浓缩一倍后，上Blue层析柱测试载量，结果显示载量约为14ml洗脱液/ml柱体积(图17)。
3.6.3 MMC-Blue层析回收率
以MMC-Blue层析连续进行三批纯化实验，提取纯化所得目标蛋白为0.13mg～0.18mg HSA–IGF-1融合蛋白/g米粉,最终总蛋白回收率在31.5％～38.7％(表3)。
表3 MMC-Blue层析纯化HSA-IGF-1融合蛋白收率表
实施例4 HSA-IGF-1融合蛋白生物学活性
4.1活性测定
采用FDC-P1细胞对HSA-IGF-1进行细胞生物学活性检测，结果表明：
1)随着OsrIGF-1(HSA-IGF-1)随浓度升高，细胞数量有所提高；细胞形态清晰，折光性好，状态好，部分聚集成团；死细胞数量减少，细胞存活率提高；
2)OsrIGF-1样品EC50值在1.0-10.0ng/ml之间(见图18)。
4.2与竞品的比较
通过研究不同竞品和样品HSA-IGF-1(OsrIGF-1)连续培养FDC-P1细胞，结果表明：OsrIGF-1(HSA-IGF-1)生物学活性EC50，以及对FDC-P1细胞生长增殖、稳定性以及细胞存活率方面与其他rhIGF-1竞品(Prospec，Gibco，Sigma)的效果相当。
4.2.1 EC50比较
图19显示OsrIGF-1样品与rhIGF-1竞品经FDC-P1细胞测试后细胞生长曲线(EC50曲线)。
4.2.2对细胞增殖影响的比较
图20显示不同IGF-1竞品和样品对培养Day 0-9的FDC-P1细胞生长的影响，样品和竞品的作用相当。
4.2.3传代稳定性影响比较
图21显示OsrIGF-1、Prospec rhIGF-1及10％FBS培养基对FDC-P1细胞传代后细胞生长数量增长的影响，由图可知，OsrIGF-1和竞品Prospec rhIGF-1对细胞传代稳定性的影响相当。
4.2.4传代细胞存活率的比较
图22的数据显示OsrIGF-1、Prospec rhIGF-1及10％FBS培养基对FDC-P1细胞传代培养3,5,8天后细胞存活率的比较，OsrIGF-1和竞品Prospec rhIGF-1的作用相当。
本发明通过提取和酸沉方式结合，在层析纯化前去掉了大量杂蛋白，有效提高了层析纯化的填料使用效率，同时采用复合阳离子MMC层析，有效去掉了水稻中大部分杂蛋白提高了OsrHSA-IGF-1纯度，并通过结合Adhere或Cibacron blue F3GA层析实现了一种从水稻种子中纯化OsrHSA-IGF-1的高效方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉禾元生物科技股份有限公司
<120> 从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素融合蛋白的方
法
<130> WH1190-18P122187
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1980
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 密码子优化的HSA-IGF-1基因序列
<400> 1
gacgcccaca agagcgaggt ggcccaccgc ttcaaggacc tcggcgagga gaacttcaag 60
gccctcgtgc tcatcgcctt cgcccagtac ctccagcagt gcccgttcga ggaccacgtg 120
aagctcgtga acgaggtgac cgagttcgcc aagacctgcg tggccgacga gagcgccgag 180
aactgcgaca agagcctcca caccctcttc ggcgacaagc tctgcaccgt ggccaccctc 240
cgcgagacct acggcgagat ggccgactgc tgcgccaagc aggagccgga gcgcaacgag 300
tgcttcctcc agcacaagga cgacaacccg aacctcccgc gcctcgtgcg cccggaggtg 360
gacgtgatgt gcaccgcctt ccacgacaac gaggagacct tcctcaagaa gtacctctac 420
gagatcgccc gccgccaccc gtacttctac gccccggagc tcctcttctt cgccaagcgc 480
tacaaggccg ccttcaccga gtgctgccag gccgccgaca aggccgcctg cctcctcccg 540
aagctcgacg agctccgcga cgagggcaaa gcctccagcg ccaagcagcg cctcaagtgc 600
gccagcctcc agaagttcgg cgagcgcgcc ttcaaagcct gggccgtggc ccgcctcagc 660
cagcgcttcc cgaaggccga gttcgccgag gtgtccaagc tcgtgaccga cctcaccaag 720
gtgcacaccg agtgctgcca cggcgacctc ctggagtgcg ccgacgaccg cgccgacctc 780
gccaagtaca tctgcgagaa ccaggacagc atctccagca agctcaagga gtgctgcgag 840
aagccgctcc tggagaagtc ccactgcatc gccgaggtgg agaacgacga gatgccggcc 900
gacctcccgt ccctcgccgc cgacttcgtg gagagcaagg acgtgtgcaa gaactacgcc 960
gaggccaagg acgtcttcct cggcatgttc ctctacgagt acgcccgccg ccacccggac 1020
tactccgtgg tgctcctcct ccgcctcgcc aagacctacg agaccaccct ggagaagtgc 1080
tgcgccgccg ccgacccgca cgagtgctac gccaaggtgt tcgacgagtt caagccgctc 1140
gtggaggagc cgcagaacct catcaagcag aactgcgagc tcttcgagca gctcggcgag 1200
tacaagttcc agaacgccct cctcgtgcgc tacaccaaga aggtgccgca ggtgtccacc 1260
ccgaccctcg tggaggtgtc ccgcaacctc ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac 1320
ccggaggcca agcgcatgcc gtgcgccgag gactacctct ccgtggtgct caaccagctc 1380
tgcgtgctcc acgagaagac cccggtgagc gaccgcgtga ccaagtgctg caccgagagc 1440
ctcgtgaacc gccgcccgtg cttctccgcc ctggaggtcg acgagaccta cgtcccgaag 1500
gagttcaacg ccgagacctt caccttccac gccgacatct gcaccctctc cgagaaggag 1560
cgccagatca agaagcagac cgccctcgtc gagctcgtga agcacaagcc gaaggccacc 1620
aaggagcagc tcaaggccgt gatggacgac ttcgccgcct tcgtggagaa gtgctgcaag 1680
gccgacgaca aggagacctg cttcgccgag gagggcaaga agctcgtggc cgccagccag 1740
gccgccctcg gcctcatcga gggcaggggc ccggagaccc tctgcggcgc cgagctcgtg 1800
gacgccctcc agttcgtgtg cggcgaccgc ggcttctact tcaacaagcc gaccggctac 1860
ggcagcagca gccgccgcgc cccgcagacc ggcatcgtgg acgagtgctg cttccgcagc 1920
tgcgacctcc gccgcctgga gatgtactgc gccccgctca agcccgccaa gagcgcctga 1980
<210> 2
<211> 4266
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 含Gt13a启动子、信号肽序列、经密码子优化的HAS-IGF-1基因以及Nos终止
子的整个表达盒
<400> 2
ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg 60
cgggaaacga caatctgatc atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc 120
gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc 180
cactcagccg cgggttgtgg agctccaccg cggtggcggc cgctctagaa ctagtggatc 240
ccccctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 300
ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tcacacctta tgtaaagtat ttgttgcaag 360
aaaagtctaa gatgacagca acctgctgag aagaacaact gacgatgtca taaggagagg 420
gagcttttcg ataggtgccg tgcagttcaa agagttagtt agcagtagga tgaagatttt 480
tgcacatggc aatgagaagt taattatggt gtaggcaacc caaatgaaac accaaaatat 540
gcacaagaca gtttgttgta ttctgtagta cagaataaac taaagtaatg aaagaagatg 600
gtgttagaaa atgaaacaat attatgagta atgtgtgagc attatgggac cacgaaataa 660
aaaaagaaca tttttatgag cagtgtgttc tcaatgagcc ttgaatgtta tcacccagga 720
taagaaaccc ttaagcaatg aaacatgcaa gcgtttaatg tgcaaagttg gcattctcca 780
cgacataatg caaaagaaga tataatctat gacatagcaa gtcatgcatc atttcatgcc 840
tctgtcaacc tattcatttc tagtcatcta ggtaagtatc ttaagctaaa gtgttagaac 900
ttcccataca taagtcataa ctgatgacaa ttgggtgtaa cacatgacaa accagagagt 960
caagcaagat aaagcaaaag gatgtgtaca taaaactaca gagctatatg tcatgttgcg 1020
aaaagaggag agcttataag acaagccatg actcaaaaaa aattcacatg cctactgtgg 1080
cccatatatc atgcaacaat ccaaaaactc acaggtctcg gtgttgatcg tgtcaacatg 1140
tgaccaccct aaaaactctt cactaaatat taaagtattg ctagaacaga gcttcaagat 1200
ataagtcatg atcaccaaca accatgttca aaaagaaata gaaagctatg gcacagcaac 1260
aaaaagcaaa agcatgcatg gatataatct ttaacatcat ccatgtcata ttgcaaaaga 1320
aagaaagaga gaacaataca aatgatgtgt caattacaca tccatcatta tccatccacc 1380
ttccgtgtac cacacttcat atatcatgag tcacttcatg tctggacatt aacaaactct 1440
atcttaacat tcaaatgcat gagactttat ctcactataa atgcacaatg atttagcatt 1500
gtttctcaca aaaccattca agttcattag tactacaaca acatggcatc cataaatcgc 1560
cccatagttt tcttcacagt ttgcttgttc ctcttgtgca atggctctct agccgacgcc 1620
cacaagagcg aggtggccca ccgcttcaag gacctcggcg aggagaactt caaggccctc 1680
gtgctcatcg ccttcgccca gtacctccag cagtgcccgt tcgaggacca cgtgaagctc 1740
gtgaacgagg tgaccgagtt cgccaagacc tgcgtggccg acgagagcgc cgagaactgc 1800
gacaagagcc tccacaccct cttcggcgac aagctctgca ccgtggccac cctccgcgag 1860
acctacggcg agatggccga ctgctgcgcc aagcaggagc cggagcgcaa cgagtgcttc 1920
ctccagcaca aggacgacaa cccgaacctc ccgcgcctcg tgcgcccgga ggtggacgtg 1980
atgtgcaccg ccttccacga caacgaggag accttcctca agaagtacct ctacgagatc 2040
gcccgccgcc acccgtactt ctacgccccg gagctcctct tcttcgccaa gcgctacaag 2100
gccgccttca ccgagtgctg ccaggccgcc gacaaggccg cctgcctcct cccgaagctc 2160
gacgagctcc gcgacgaggg caaagcctcc agcgccaagc agcgcctcaa gtgcgccagc 2220
ctccagaagt tcggcgagcg cgccttcaaa gcctgggccg tggcccgcct cagccagcgc 2280
ttcccgaagg ccgagttcgc cgaggtgtcc aagctcgtga ccgacctcac caaggtgcac 2340
accgagtgct gccacggcga cctcctggag tgcgccgacg accgcgccga cctcgccaag 2400
tacatctgcg agaaccagga cagcatctcc agcaagctca aggagtgctg cgagaagccg 2460
ctcctggaga agtcccactg catcgccgag gtggagaacg acgagatgcc ggccgacctc 2520
ccgtccctcg ccgccgactt cgtggagagc aaggacgtgt gcaagaacta cgccgaggcc 2580
aaggacgtct tcctcggcat gttcctctac gagtacgccc gccgccaccc ggactactcc 2640
gtggtgctcc tcctccgcct cgccaagacc tacgagacca ccctggagaa gtgctgcgcc 2700
gccgccgacc cgcacgagtg ctacgccaag gtgttcgacg agttcaagcc gctcgtggag 2760
gagccgcaga acctcatcaa gcagaactgc gagctcttcg agcagctcgg cgagtacaag 2820
ttccagaacg ccctcctcgt gcgctacacc aagaaggtgc cgcaggtgtc caccccgacc 2880
ctcgtggagg tgtcccgcaa cctcggcaag gtgggcagca agtgctgcaa gcacccggag 2940
gccaagcgca tgccgtgcgc cgaggactac ctctccgtgg tgctcaacca gctctgcgtg 3000
ctccacgaga agaccccggt gagcgaccgc gtgaccaagt gctgcaccga gagcctcgtg 3060
aaccgccgcc cgtgcttctc cgccctggag gtcgacgaga cctacgtccc gaaggagttc 3120
aacgccgaga ccttcacctt ccacgccgac atctgcaccc tctccgagaa ggagcgccag 3180
atcaagaagc agaccgccct cgtcgagctc gtgaagcaca agccgaaggc caccaaggag 3240
cagctcaagg ccgtgatgga cgacttcgcc gccttcgtgg agaagtgctg caaggccgac 3300
gacaaggaga cctgcttcgc cgaggagggc aagaagctcg tggccgccag ccaggccgcc 3360
ctcggcctca tcgagggcag gggcccggag accctctgcg gcgccgagct cgtggacgcc 3420
ctccagttcg tgtgcggcga ccgcggcttc tacttcaaca agccgaccgg ctacggcagc 3480
agcagccgcc gcgccccgca gaccggcatc gtggacgagt gctgcttccg cagctgcgac 3540
ctccgccgcc tggagatgta ctgcgccccg ctcaagcccg ccaagagcgc ctgaaagctt 3600
gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 3660
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 3720
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgcc cgctcctttc gctttcttcc 3780
cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 3840
tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg 3900
gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 3960
cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcgggct 4020
attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggaacc accatcaaac aggattttcg 4080
cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa 4140
gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccccag tacattaaaa 4200
acgtccgcaa tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc 4260
tgccac 4266
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 3
gagggtgtgg aggctcttgt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 4
gagggtgtgg aggctcttg 19
Claims (5)
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的基因工程水稻种子与pH为7.0-7.6，含有5-20mM磷酸盐、5-10mM醋酸钠、0-250mM氯化钠、10-30mM硫酸铵、10-20mM辛酸钠、0-1mM还原型谷胱甘肽的提取缓冲液混合并静置提取后，在pH 5.4-5.6条件下酸沉，得到含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的粗提取液；
2)将含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的粗提取液经Capto MMC或Bestarose Diamond MMC复合阳离子交换层析，得到初级产物I；
其中所述复合阳离子交换层析方法为：采用pH为5.4-5.6的含有5-20mM磷酸盐、5-20mM醋酸钠、0-20mM柠檬酸三钠、0-1mM还原型谷胱甘肽的平衡缓冲液，以170-240cm/h的流速平衡层析柱；
以步骤1)的粗提取液为层析上样液，上样结束后用所述平衡缓冲液对层析柱进行再平衡；用含有0-25mM磷酸盐、0-20mM柠檬酸三钠、20-40mM醋酸钠、0-15％(V/V)异丙醇，pH为4.8-5.2的洗杂液I，以170-240cm/h的流速进行洗脱杂蛋白；
用含有0-25mM磷酸盐、0-20mM柠檬酸三钠，20-40mM醋酸钠、0-15％(V/V)异丙醇，0.9-1.4M氯化钠的pH为4.8-5.2，电导为70-89mS/cm的洗杂液II进行第二次洗杂；
以含有20mM磷酸盐、0-20mM柠檬酸三钠、0-20mM醋酸钠、500mM氯化钠、0-1mM还原型谷胱甘肽，pH为6.3-6.6的洗脱液进行洗脱，收集含有重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的洗脱液，获得初级产物I；
3)将步骤2)的初级产物I进行进一步经Capto Adhere或Bestarose Diamond Adhere复合阴离子交换层析或Cibacron blue F3GA亲和层析纯化，得到纯度大于95％的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白目标物；
其中所述复合阴离子交换层析的层析方法为：采用Adhere复合阴离子层析填料，采用pH为6.9-7.1的含有20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽的缓冲液作为平衡缓冲液I，以120-300cm/h的流速平衡柱子；
将步骤2)的含重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的初级产物I中加入约等体积的纯水，并调节pH至6.9-7.1，作为此步层析的上样液，电导为24-29mS/cm；上样结束后用所述平衡缓冲液I对层析柱进行再平衡；
用pH为6.9-7.1的含有20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠、10％(V/V)异丙醇，1mM还原型谷胱甘肽的缓冲液作为洗杂液I进行第一次洗杂；
用pH为6.9-7.1，含有20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、200mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽的缓冲液作为平衡缓冲液II进行第二次再平衡；
用pH为5.9-6.4的含有20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽的缓冲液作为洗杂液II进行第二次洗杂；
用pH为3.5-4.5的含有20mM柠檬酸三钠、20mM磷酸氢二钠、600mM氯化钠，1mM还原型谷胱甘肽的缓冲液作为洗脱液进行洗脱，获得纯度95％以上的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白；或者
所述亲和层析的层析方法为：
采用Cibacron blue F3GA亲和层析填料，用pH为5.0-5.8的20mM醋酸钠作为平衡缓冲液，以120-300cm/h的流速平衡柱子；
将步骤2)的含重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白的初级产物I中加入约9倍体积的纯水，并调节pH至5.0-5.8，作为此步层析的上样液，上样结束后用所述平衡缓冲液对层析柱进行再平衡；
用pH为6.9-7.1的含有0-20mM柠檬酸三钠、0-20mM醋酸钠、20mM磷酸氢二钠、150-200mM氯化钠的缓冲液作为洗杂液I进行第一次洗杂；
用pH为7.5-8.0，含有0-20mM柠檬酸三钠、0-20mM醋酸钠、20mM磷酸氢二钠、200-900mM氯化钠、0-1mM还原型谷胱甘肽的缓冲液作为洗杂液II进行第二次洗杂；
用pH为7.5-8.0，含有0-20mM柠檬酸三钠、0-20mM醋酸钠、20mM磷酸氢二钠、1-2M氯化钠、0-1mM还原型谷胱甘肽、0-20mM辛酸钠的缓冲液作为洗脱液洗脱目标蛋白，获得纯度95％以上的重组人血清白蛋白-类胰岛素生长因子-1融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的提取方法为：将基因工程稻谷脱壳研磨后与提取缓冲液以1:5-1:10(kg/L)的比例混合，于25-60℃提取1-2小时；所述提取缓冲液含有5-20mM磷酸盐、5-10mM醋酸钠、100mM氯化钠、10-30mM硫酸铵、10-20mM辛酸钠、0-1mM还原型谷胱甘肽，pH为7.0-7.6；
将上述得到的混合物调节pH至5.4-5.6，放置沉淀2-8小时进行酸沉，过滤后上清液即为OsrHSA-IGF-1的粗提取液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的复合阳离子交换层析的层析条件为：
平衡液：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH 5.4-5.6；
洗杂液I：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、1mM还原型谷胱甘肽、10％(V/V)异丙醇，pH 4.8-5.2；
洗杂液II：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、1mM还原型谷胱甘肽、10％(V/V)异丙醇、1.4M氯化钠，pH 4.8-5.2；
洗脱液：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、1mM还原型谷胱甘肽、0.5M氯化钠，pH 6.3-6.6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述复合阴离子交换层析的层析条件为：
平衡缓冲液I：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、200mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH 6.9-7.1；
洗杂液I：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、200mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽、10％(V/V)异丙醇，pH 6.9-7.1；
平衡缓冲液II：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、200mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH 6.9-7.1；
洗杂液II：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、600mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH 5.9-6.4；
洗脱液：20mM柠檬酸三钠、20mM十二水合磷酸氢二钠、600mM氯化钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH 3.5-4.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)所述亲和层析的层析条件为，
洗杂液I：20mM磷酸氢二钠、150mM氯化钠，pH 6.9-7.1；
洗杂液II：20mM磷酸氢二钠、200-900mM氯化钠，pH 7.5-8.0；
洗脱液：20mM磷酸氢二钠、1-2M氯化钠、20mM辛酸钠、1mM还原型谷胱甘肽，pH为7.5-8.0。
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