CN101172091A

CN101172091A - 含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途

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Publication number: CN101172091A
Application number: CNA2007100597703A
Authority: CN
Inventors: 富岩; 于在林
Original assignee: United States Fuyuan Group (fortunerock Inc); Tianjin Sino Biotechnology Ltd Fortunerock Inc
Current assignee: Beijing Meifuyuan Biomedical Technology Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2007-09-25
Filing date: 2007-09-25
Publication date: 2008-05-07
Anticipated expiration: 2027-09-25
Also published as: US20140099270A1; WO2009043277A1; US20110027221A1; US9114094B2; CN101172091B; US8603973B2

Abstract

本发明提供了能刺激皮肤相关细胞修复、并具持续作用的含重组融合蛋白产品的组成和制备工艺，用以改善皮肤质量、达到美容、除皱、祛斑、美白作用。特别是，本发明提供了人血清白蛋白(HSA)和一种细胞因子多肽(EGF、FGF、KGF、HGH、HGF、PDGF、GCSF、干扰素、IL－11或IGF)利用基因工程技术重组形成的融合蛋白，单独、或复合组成、或与酵母菌发酵产物、或与人血清白蛋白单独或复合组成，还可有各种乳化剂、增稠剂、保湿剂、防腐剂、酵母酵素等组分一起制作成各种、各式的用于改善皮肤质量的产品。

Description

含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途

技术领域

本发明是中国发明专利ZL021428816，ZL2004100428148和中国专利申请200710057571.9的继续申请。本发明涉及基因重组及表达的人血清白蛋白融合蛋白应用于制备新型基因化妆品的方法，并涉及单一融合蛋白或不同融合蛋白组合使用的配比、融合蛋白和酵母发酵中产生的酵母酵素(多糖和酵母蛋白)的共同使用。特别涉及利用酵母菌表达生产由人血清白蛋白(HSA)与人细胞生长因子(GF)所形成的融合蛋白(HSA/GF)用于制作新型化妆品。化妆品中含有的细胞生长因子融合蛋白包括，但不局限于，人表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)和类胰岛素生长因子(IGF)、TGF、GCSF、干扰素、IL-11等。所制备的化妆品中，除了含有人血清白蛋白融合蛋白外，还含有保湿剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、酵母酵素、或、和动、植物提取物等。利用本发明制备的化妆品有着意想不到的优势和良好效果。

背景技术

皮肤保养品(化妆品)作为现代人类生活中，尤其是女性生活的必需品。各种化妆品从保湿、除皱、美白、祛斑，除痘来改善生活质量和解决皮肤在生活中和在年龄增长中皮肤细胞产生的损坏、退化、功能衰减等具体问题。各种化学品、动植物提取物、人源的组织提取物、和重组的蛋白质多肽陆续用作添加剂和主要功能成分制作化妆品。其中人表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、人血清白蛋白(HSA)等以人源或基因重组表达产物形式，被用于化妆品中，并作为主要功能成分。由于这些细胞因子是蛋白氨基酸多肽，体外寿命短，需要添加各种保护剂，来延长其货架寿命和在应用后的有效作用时间。在于在林等的中国专利申请200710057571.9中，发明了将这些皮肤细胞生长因子与人血清白蛋白基因融合的技术，验证了这些细胞生长因子的寿命大大延长了。

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330451、EP361991和于在林等的中国专利申请CN2004010057313.7中公开。

白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14-20天。综上所述，治疗性蛋白质与白蛋白形成融合蛋白后，融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，还可以较高剂量使用。

人源或重组人血清白蛋白在美容产品中的使用已获得了十分有意义的实际应用。在欧洲专利公开#0180968A3中人血清白蛋白用于抗皱产品的组成，PCT专利申请WO02/49671A1中人血清白蛋白用于皮肤和毛发的清洁剂组成。美国专利申请10/446,562中人血清白蛋白与肉毒杆菌合并使用组成具治疗性和美容性的产品有着具体的描述。PCT专利申请WO01/91713A1描述了来源于转基因动物的人血清白蛋白用于美容目的产品中。美国专利US5,948,609指出，白蛋白的全长或片断或修饰的形式应用于化妆品制备。中国专利申请CN02111695、CN1090753、CN93105601.2、和CN01810411.8中描述了人血清白蛋白作为添加剂、保护剂在化妆品中的使用。中国专利申请CN200610081498.4特别描述了重组人血清白蛋白和酵母酵素混合物的制备工艺和在皮肤保湿、防皱、除皱、美白方面的用途。

在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药。

利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌中表达为融合蛋白，可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性，和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化。该项蛋白药物体内修饰公共技术平台，在于在林、富岩中国授权专利ZL02142881.6和ZL200410042814.8中已公开，在此引为参考文献。人血清白蛋白融合蛋白用于化妆品的制备，改善细胞因子的寿命和为这种新型基因化妆品的实际应用效果带来了意想不到的临床使用最大效果。

含有融合蛋白的化妆品的制备、配方和生产工艺在常规化妆品相关资料和文献中的专业描述相似。化学工业出版社的《化妆品-原理、配方、生产工艺》第二版(王培义编著，2006)，列为本发明化妆品制备的主要参考文献。

发明内容

本发明者通过实施例验证含有人血清白蛋白与人皮肤细胞生长因子融合蛋白所构成的各种化妆品，具有比仅含有细胞生长因子单体、或仅含有人血清白蛋白的化妆品，有更好的使用效果。融合后的细胞因子在体内和体外具有更长的长半衰期和更好的持续作用效果。当复合使用由HSA和不同生长因子形成的融合蛋白(HSA/GF)组合构成的化妆品，可具有同时刺激多种皮肤细胞的修复和具协同增效作用。这种新型的化妆品在保健、美容、除皱、祛斑、增白、和在美容手术(Cosmetic plastic surgery)中的创伤、或烧伤治疗的用途，由此完成了本发明。

本发明所涉及的人血清白蛋白与细胞生长因子(GF)的融合蛋白包括，但不局限于，人血清白蛋白与表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF：aFGF、bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF-2)类胰岛素细胞生长因子(IGF)、或人白介素-11(IL-11)或粒白细胞刺激生长因子(GCSF)的融合蛋白的全长、或片断或经修饰后用于在构成化妆品中的应用。

融合蛋白可以单独或复合使用，可以和白蛋白单体或白蛋白融合蛋白单独或复合使用，可以与构成化妆品的赋型剂、增稠剂、乳化剂、保湿剂等中的单独一种或几种共同组合使用，构成化妆品，并用以皮肤细胞修复、更新以达美容或美容手术创伤治疗的目的。

融合蛋白可用于制备的各种剂型的化妆品包括，但不局限于，各种水剂，如润肤水、化妆水、柔肤水、洗发水、营养头水、祛臭水、含漱水；各种霜、膏，如面霜、眼霜、护手霜、润肤霜、防晒霜；雪花膏、洗发膏、牙膏、防裂膏；各种乳化剂，如油包水，水包油剂型；栓剂，如用于阴道、肠道的栓剂；膜，如用于成形膜(棉质膜、纸质膜、无纺布、胶原)、膏状膜、浆膜等。含有本发明中所指的融合蛋白构成的化妆品中，可以再含有其它具有特殊功能的组分，包括，但不局限于，奶、珍珠粉、蜂蜜、中草药、植物提取物(芦荟、人参)、动物提取物(蜗牛、胎盘)等。也可以与抗生素组合使用于祛痘产品。本发明中的融合蛋白可用于制备特殊功能的化妆品，包括，但不局限于，洁面、去死皮、营养、按摩、祛粉刺、祛雀斑、祛痘、美白、祛黑头、抗皱、补水、洗发、染发、减肥、丰乳、美体以及美容化妆等。

新型基因化妆品构成中的融合蛋白的生产，可以由酵母菌表达菌种经大规模发酵后，从发酵液上清中经过一定纯化手段处理后所获得的纯度达95％左右的融合蛋白组成；也可直接将酵母菌发酵后的上清液经过简便的脱色、除盐、浓缩，保留融合蛋白和酵母菌分泌物(多糖和酵母蛋白)直接用于新型化妆品的制备。

因此，本发明涉及如下几个方面：

1)HSA/GF融合蛋白用于化妆品的技术问题解决

本发明提供一种用基因工程方法生产的人血清白蛋白(HSA)和细胞生长因子(GF)融合蛋白用于化妆品的制备工艺和组方。这些融合蛋白是具刺激皮肤细胞的分化、增生或修复作用，在本发明所指的化妆品中添加、或起主要作用的含有融合蛋白的产品，并被用于美容、美白、祛斑、除皱生长因子GF最典型的一个例子是细胞生长因子(GF)在临床上的应用，如hEGF和hKGF已分别被批准用于创伤和溃疡的临床治疗的个例。

本发明的GF可以是下列蛋白质类别中的任何一员，包括但不局限于，表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经细胞生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样细胞生长因子(IGF)、干细胞生长因子(SGF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、血小板衍生细胞生长因子(PDGF)、促生长释放因子(GHRF或GHRH)等。

GF可以直接以N末端与HSA的C-末端相连以构成融合蛋白，也可以以C末端与HSA的N末端直接相连以构成融合蛋白；或可在HSA和GF之间增加一个连接肽(Linker)，以构成融合蛋白：HSA/L/GF或GF/L/HSA(L＝连接肽)。连接肽长度可为2-100，常用的是10-50个氨基酸，优选的是14-30个氨基酸。连接短肽可以使HSA和GF之间有更大的变化空间并有更好的柔韧性或刚性，或因更大的变化空间使GF与受体的结合更容易些。连接肽的结构可为(G₄S)3-4。连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是没有连接肽。

融合蛋白可以是分泌型的，其可与特异识别的抗人血清白蛋白抗体相结合。融合蛋白也可与特异识别的GF的抗体相结合。融合蛋白的分泌肽可使用人血清白蛋白的分泌肽或其自然界中存在的多肽或是人工合成的具有将融合蛋白分泌到宿主细胞外功能的多肽。

HSA/hEGF融合蛋白表达重组酵母菌，已保藏在中国科学院微生物所中国微生物菌种保藏管理委员会获得保藏号：CGMCC No.2072，作为本发明中的HSA/GF融合蛋白用于新型化妆品制备的代表作。

HSA/GF融合后，细胞因子有较高的半衰期并在使用中在作用部位停留较长的时间，在制成产品时贮存条件和运输的要求降低，可以降低成本，同时较长半衰期也可减少GF的使用剂量和使用次数。

相同的策略也可用于研发具有美容作用功效的稳定的含有融合蛋白的产品。例如皮肤的美容、保湿、除皱、防皱、美白。产品的组合中可含有一种融合蛋白或两种以上融合蛋白，或其它组分(如HSA)作为主剂，还可有增绸剂、保湿剂、乳化剂、防腐剂等。

2)HSA/GF融合蛋白表达的大规模制备工艺

本发明中的HSA/GF融合蛋白是利用重组克隆技术引入酵母菌宿主细胞，以使融合蛋白得以表达。优选的用于表达HSA/GF的酵母属宿主包括，但不局限于，酿酒酵母属(Saccharomyces)、毕氏酵母属(Phichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉森酵母(Hancenula)、孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属(Schizosaromyces)等。更优选地，宿主系统可为毕氏酵母属巴斯德菌种。

根据选用不同的宿主来表达HSA/GF融合蛋白。本发明中表达的蛋白多肽可以是糖基化或非糖基化的。优选地，当在宿主系统中得到表达时，HSA/GF在脊椎动物细胞如中国仓鼠(CHO)中得到表达的蛋白为糖基化蛋白，其也可用于化妆品的制备。

如上所述，利用酵母菌表达HSA/GF的优势在于，酵母菌体系可以产生高质量成熟的融合蛋白，并可以分泌到培养液中而便于纯化。同时酵母菌在生长中产生酵母分泌物，其中含有大量的酵母多糖和酵母蛋白。融合蛋白和酵母分泌物可以利用公知的技术和特异分离技术分离，分别作为制备化妆品的添加剂和组分。

优选实例为应用巴斯德酵母菌系统来表达本发明中提及的HSA/GF融合蛋白。其优于利用其它表达系统。毕氏酵母菌具有许多高等真核细胞表达系统所具有的优点，例如蛋白质的加工、折迭、转录后的修饰以及如同培养细菌或酿酒酵母一样的易于大规模培养，与其它系统如杆状病毒、脊椎动物细胞培养相比更具有简捷、快速的表达，产量更高。毕氏酵母还有另外一个优势是具有10-100倍高的表达水平。这些特性使得毕氏酵母变成十分有力的蛋白表达系统。

表达用于化妆品制备的融合蛋白酵母菌的发酵工艺是以于在林在CN200410057313.7为基础。在此引为参考文献。在30℃或20℃的条件下，酵母菌经过诱导将融合蛋白分泌到发酵液中，优选地是，20℃低温发酵。

本发明所述的融合蛋白经培养的酵母菌表达后，以能维持蛋白活性和细胞因子的功效的蛋白提纯方法来加以分离纯化。获得的发酵液经离心方法将酵母菌与含有融合蛋白、融合蛋白片断(降解物)、酵母蛋白和酵母多糖的水相分离。水相直接加入0.4-10％(W/V)活性炭或硅藻土作用去处发酵液的颜色，优选地是2％的活性炭。经过G25脱盐后，发酵液变成蛋清样、无色、无味。再用20K透析浓缩膜包进行10-20倍浓缩。浓缩后的样品直接作为配制化妆品的主要原料，也可分装经冷冻干燥用于化妆品的制备。

在此还需提及的是，其它表达生产系统也可用于本发明的含有HSA/GF融合蛋白的化妆品制备，包括，但不局限于，细菌、枯草杆菌(B.Subtitis)、酿酒酵母、克鲁维酵母菌属、汉森酵母、念珠菌属、孢圆酵母属、裂殖酵母属、固囊酵母属(Citeromyces)、Pachysoler，德巴利酵母属(Debaromyces)、梅奇酵母属(Metschumikowia)、红冬孢属(Rhodosporidium)、无色担子孢子属(Leucosporiduum)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁掷酵母属(Sporidiobolcus)、拟内孢霉属(Endomyucopsis)、动物、植物和昆虫细胞等。

3)HSA/GF融合蛋白组合应用于制备化妆品

本发明还提供了一种不同HSA/GF融合蛋白的组合在化妆品制备中的应用。

这种独特的融合蛋白的组合可以提供使用者皮肤多种细胞的同时增生、分化成熟、或具有对某一特定类细胞具有协同增效作用。特别地，本发明中的HSA和不同细胞生长因子形成的不同融合蛋白，共同组合使用的结果是同时刺激多种细胞的增生和成熟。应用HSA/GF的定向作用于不同类型的细胞的信号转导途径或多种细胞的产生途径，可以在只需一次使用于使用者身上后，使诸如表皮细胞、角质细胞和肌细胞、成纤维细胞等都得到明显的修复和增生。

本发明提供了成套的使用HSA/GF组合用于化妆品的制备的描述与实践，成套组合包括第一个HSA/GF和与第一个GF相同或不同的第二个HSA/GF。例如，第一个HSA/GF中GF可以是KGF，第二个GF是EGF；或第一个GF是KGF-2，第二个GF是bFGF，第三个GF是EGF；或第一个GF是IGF-1，第二个GF可以是FGF等。HSA单体也可以作为第一个或第二个蛋白组分构成制剂，用于组合制剂。在本发明中，白蛋白融合蛋白可以单独使用作为一种化妆品的组分。融合蛋白可以是纯度为95％以上的单体或是含有融合蛋白的发酵液经去处色素、脱盐、除味、浓缩后，作为主要作用成分用于制作各种化妆品。也可以是两种或两种以上的融合蛋白的酵母菌发酵液混合(如，HSA/hEGF和HSA/bFGF的共同使用，或HSA/hEGF、HSA/bFGF和HSA/hKGF-2的共同使用)或经组合使用在化妆品制作中，可以获得更好的使用效果。

根据本发明，血清白蛋白融合蛋白可与各种化妆品的基本组成组分共同使用以获得可用的各种化妆品，包括，但不局限于，水溶液形式、乳化形式、霜、膏形式、栓剂形式或膜形式等。融合蛋白纯化单体或经处理的含有融合蛋白的发酵液可以与本领域技术人员公知的适当比例的保湿剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂或可作膜的材料一起组合使用。加入的的材料不影响融合蛋白的稳定性和功能。可作保湿剂的有，包括，但不局限于，各种醇类、丙二醇、丁二醇、丙三醇(甘油)、维生素(VC、VA、VE)、脂肪酸、胆固醇透明质酸盐、神经酰胺等；可作乳化剂的有，包括，但不局限于，吐温或Span(20、40、60或80)、SDS、SLS、卵磷脂、胆淄醇等；可作增稠剂的有，包括，但不局限于，各种酯、脂肪、油、蜡，包括羊毛脂、脂肪醇、凡士林、矿物油、卡波姆、泊络沙姆等；可作防腐剂的有，包括，但不局限于，尼泊金甲、乙、或丁酯，硫柳汞、等；可作膜材料有，包括，但不局限于，棉、纺、纱布、木浆、生物纤维等载体材料。融合蛋白与抗生素混合使用也可制成用于痘、疮的治疗和皮肤修复功能的水剂和膏剂。

各种容器可以用来装储和释放含有融合蛋白的产品。这些容器要符合化妆品的行业要求。

已知，贮存“裸露”的细胞因子是相当不稳定的，并且在储存中寿命极短。十分清楚地是，细胞因子具有的如此脆弱的稳定性在体外是相当不便的，对使用者来讲是十分昂贵和不便的。事实上白蛋白也常作为添加剂与细胞因子在一起，来保证含有细胞因子的产品具有较长的货架储存寿命、和运输保藏中的产品稳定，以此达到细胞因子的有效作用强度。在中国专利申请CN200610081498.4中描述了人血清白蛋白与hEGF混合使用于化妆品中，使得hEGF获得较长的寿命。本发明实施例证明应用基因融合技术，融合蛋白基因比EGF单体或EGF与HSA混合使用时，在同一条件下，获得意想不到的长效性和持续作用，至少3倍于细胞因子与HSA被混合使用和至少10倍于细胞因子被单体使用。

本发明使得HSA/GF融合蛋白在化妆品中的作用半衰期大大延长，稳定性增加。复合型的HSA/GFs即HSA与hEGF、HSA与hKGF、HSA与hIGF或HSA与hPDGF可单独或共同作用来达到刺激皮肤中多种细胞的修复和分化。

具体地，HSA/hEGF融合蛋白可以和HSA/hKGF融合蛋白形成复合组成化妆品，其结果人的表皮细胞和角质细胞等分化增生，结果使皮肤快速修复和美容。

可替代的，根据制作者的需要，一种HSA/GF可以与另一种或多种HSA/GF以同时或先后的方式配制化妆品。这种组合使用的剂量是达到有明显美容目的剂量，并且效果是具有协同增效作用的有效剂量。

进一步地，人血清白蛋白，或其片断或其经修饰后的分子，可以与白蛋白融合蛋白作为组分一起组成化妆品。融合蛋白或不同的融合蛋白复合使用后、或与酵母发酵自身代谢的产物制备化妆品具有比单独使用人血清白蛋白或单独使用细胞生长因子更好的优势和益处外，更进一步地具有了作用时效更长的细胞因子作用功能、皮肤美容功能和功效。

附图说明

附图1.人血清白蛋白与不同细胞生长因子基因融合后，在酵母菌中的表达、纯化后获得的融合蛋白。A)HSA；B)HSA/KGF-2；C)HSA/bFGF；D)标准分子量；E)HSA/hEGF；F)HSA/hEGF；G)HSA/hIGF；H)HSA/hIGF。

附图2.30L发酵罐生产融合蛋白的发酵时间与融合蛋白表达产量电泳结果。人血清白蛋白与人细胞生长因子的融合蛋白代表菌种：HSA/hEGF(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心：CGMCC No.2072)在30L发酵罐使用无机盐培养基高密度发酵时，发酵不同阶段时融合蛋白的表达水平。将不同时段所获得的发酵液，经离心，取上清液20微升直接作10％的SDS-PAGE胶分析。A)分子量标准；B)生长阶段；C)甘油流加；D)甲醇24hr诱导；E)甲醇48hr诱导；F)甲醇72hr诱导。结果表明：72hr的甲醇诱导融合蛋白(HSA/hEGF)的表达产量为0.5-1.2g/L。

附图3.不同浓度活性炭或硅藻土处理融合蛋白发酵液(30L)后的SDS-PAGE胶电泳图谱。A)、HSA/GCSF融合蛋白30L发酵液经不同浓度0％、0.4％、1％、2％、5％、7％、10％的活性炭处理前后总蛋白的试验结果；B)、发酵液经0％、0.4％、1％、2％、5％、7％和10％的硅藻土处理前后的总蛋白的试验结果。不同的人血清白蛋白与各种细胞因子、细胞刺激因子或多肽获得了极为相似的试验结果。

附图4.发酵液经不同百分比活性炭处理前后总蛋白、总糖含量和A350/280比值测定表。

附图5.酵母菌表达融合蛋白单体含量的Superdex200层析柱测定结果。A：重组HSA(65Kd)；B：重组HSA/hEGF(72Kd)；C：重组HSA/hGCSF(85Kd)；重组HSA/IFNa。

附图6.六种含有融合蛋白的化妆品制剂。A)制剂1-水剂；B)制剂2-水凝胶；C)制剂3-乳化剂；D)制剂4-膏、霜剂；E)制剂5-带色和可祛痘的膏剂(含有抗生素：柳氮璜吡啶)；F)含有制剂1的面膜。

具体实施方式

实施例1：HSA融合蛋白重组酵母菌的发酵工艺

将数个含有待表达人血清白蛋白基因、人血清白蛋白与KGF融合基因、人血清白蛋白与bFGF融合基因、或人血清白蛋白与hEGF融合基因(中国普通微生物菌种保藏委员会CGMCC No.2072)或人血清白蛋白与hIGF融合基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度在控温摇床上培养至菌体密度达到OD₆₀₀＝2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5％甲醇，继续培养，细胞密度达到OD₆₀₀＝1.0。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％。48hr后分别收集培养上清液。取20ul的发酵液作7.5％的SDS-PAGE电泳，不同重组酵母菌的融合蛋白表达试验结果见附图l。结果表明发酵液中70-80％是目的蛋白，他们的分子量与预测的分子量相近。

将摇床试验验证表达的菌种，利用无机盐培养基在5L和30L发酵罐中进行生产中试放大，方法见于在林等中国专利申请CN200410057313.7的描述。菌种生长在在30℃条件下，甲醇诱导在30℃或20℃的条件下进行，优选地是，20℃条件下表达融合蛋白。融合蛋白分泌到发酵上清液中，并获得积累。菌种发酵表达目的蛋白时间在48-120hr。附图2是30L发酵罐生产融合蛋白的时间与融合蛋白表达产量电泳结果。人血清白蛋白与人细胞生长因子的融合蛋白代表菌种：HSA/hEGF(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心：CGMCC No.2072)在30L发酵罐使用无机盐培养基高密度发酵时，发酵不同阶段时融合蛋白的表达水平。将不同时段所获得的发酵液，经离心，取上清液20微升直接作10％的SDS-PAGE胶分析。A)分子量标准；B)生长阶段；C)甘油流加；D)甲醇24hr诱导；E)甲醇48hr诱导；F)甲醇72hr诱导。结果表明：72hr的甲醇诱导融合蛋白(HSA/hEGF)的表达产量为0.5-1.2g/L。目的蛋白有聚合体产生时，将提高温度和减少甲醇诱导时间。发酵完毕后，应用连续流离心机将菌体和上清液分开。

使用CHO细胞表达融合蛋白以HSA/hEPO和HSA/hEGF为例见于在林中国专利ZL02142881.6和CN200710057571.9的描述。人血清白蛋白融合蛋白可以在细菌、病毒、多种动物细胞、转基因动物和植物中获得表达生产，并用于化妆品的制备。

实施例2：HSA融合蛋白的分离和纯化技术

重组的酵母菌细胞(ZY-HSA/GF)或CHO哺乳动物细胞表达的培养上清液中含有分泌出的血清白蛋白的融合蛋白HSA/GF。离心分离菌体后，上清液经0.4-1％活性炭处理，收集、浓缩并降低盐浓度后，调整PH至7.5左右，浓缩液通过Bio-Rad公司制造的Affi-Gel Blue-Gel层析柱。HSA或HSA/GF则与层析柱上的功能集团结合而挂在柱体上。经过洗涤，HSA或HSA/GF则可经由1-5M NaCl梯度洗脱，得到具有75-85％纯的蛋白制剂。如有需要则进一步通过分子筛层析柱，可得纯度提高至95-99％或更纯的蛋白制剂。用于动物试验的样品则将可能的热源如内毒素，借助Affi-Preppolymyxin Support层析柱(Bio-Rad)来去除，以符合体内试验需要。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Bio-Rad生产的蛋白质浓度测定试剂盒。纯化的融合蛋白可保存在5％甘露醇和PB缓冲液中。最后纯化的蛋白质通过0.2uM滤膜以达无菌要求。融合蛋白和GX组分的生物活性测定采用于在林、富岩的中国专利申请CN200710057571.9实施例8描述的方法进行

实施例3：HSA融合蛋白的发酵液有效组分的制备技术

如果发酵上清液经处理后，直接用于化妆品制备时，使用0.1％-10％的活性炭或硅藻土处理。活性炭或硅藻土的使用剂量，根据发酵液中的酵母色素(A350/280吸光值)来决定。优选地是，0.4％、更优选地是2％的活性炭。发酵液脱色后，使用20K浓缩包进行浓缩至发酵液原体积的10％。再按30-50％的柱体积比上G25进行脱盐和换液为PB缓冲液，由此获得可作为化妆品制备的功效组分(GX组分)。GX组分中含有大量的融合蛋白、酵母蛋白、融合蛋白片断、酵母多糖等，共同构成一种具特殊功效的，能增强皮肤的免疫功能和细胞修复功能、去除皮肤色素、死皮细胞、增加皮肤弹性。GX组分中的总蛋白含量测定采用Bradford法、总多糖含量采用硫酸-苯酚法、色素含量测定采用紫外和可见光比值法(A350/280)。经活性炭处理表达不同人血清白蛋白与各种细胞因子、细胞刺激因子形成的融合蛋白或蛋白多肽时，对酵母菌发酵液的处理结果均获得了极为相似的试验结果。我们制备的一个典型的GX组分中含有的总蛋白量为20mg/ml、总多糖含量在50mg/ml，紫外比值在0.075左右。附图3是不同浓度活性炭或硅藻土处理融合蛋白发酵液(30L)后的SDS-PAGE胶电泳图谱。A)、HSA/GCSF融合蛋白30L发酵液经不同浓度0％、0.4％、1％、2％、5％、7％、10％的活性炭处理前后总蛋白的试验结果；B)、发酵液经0％、0.4％、1％、2％、5％、7％和10％的硅藻土处理前后的总蛋白的试验结果。不同的人血清白蛋白与各种细胞因子、细胞刺激因子或多肽获得了极为相似的试验结果。硅藻土的使用没有明显总蛋白、总多糖和色素的吸附(数值减少)。附图4是发酵液在处理前后和不同活性炭剂量下总蛋白、总糖含量和A350/280比值测定表(附图3-A)。结果显示活性炭在脱色效果上表现不错，而硅藻土在脱色方面的功效不明显。附图5是采用GE公司的Superdex200层析柱测定含不同融合蛋白发酵液中融合蛋白的单体含量。其中A：重组HSA/hIFN-alpha-2a(87.5Kd；峰尖12.7ml)；B：重组HSA/hGCSF(85Kd；峰尖12.9ml)；C：重组HSA(65Kd；峰尖13.9ml)；D：重组HSA/hEGF(72Kd；峰尖13.7ml)。

GX组分细胞水平的生物活性测定方法与纯化的融合蛋白活性测定方法相似。

GX组分和经纯化的融合蛋白可以加入甘露醇至终浓度5％，吐温80至万分之四，在pH4-7的条件下，经冷冻干燥保存在安培瓶中。在使用时再与水剂混合后施用至皮肤作用部位。

实施例4：含HSA融合蛋白的水剂形式化妆品制备

先将化妆品水剂的主要组成成分(W/V)为：1-5％甘油；2-8％丙二醇；卡泊姆1342作为增稠剂；0.5-2％吐温；和0.1防腐剂如尼泊金乙脂(对羟基苯甲酸乙酯)与60ml水溶合，再加入5-50mg纯化的融合蛋白(细胞生物活性比活10^6-8IU/mg)，或加入经脱色、除盐和浓缩处理后的50-500mg GX组分，混合后补水至100ml终体积。制好的溶液经0.45微米或0.22微米膜过滤除菌和不溶物，从而完成了水剂形式的含有融合蛋白化妆品的制备流程。

具体的一个水剂配方组成(制剂1)如下：

3ml甘油+4ml丙二醇+0.01ml卡泊姆1342+0.1g尼泊金乙脂+60ml无离子水混合溶解后，加入5-10mg含有HSA/hEGF的GX组分或1-5mg纯度在95％左右的HSA/hEGF融合蛋白，以无离子水定溶至100ml。然后，通过0.45uM膜除菌和不溶物，而获得含有融合蛋白的水剂化妆品产品(见附图6：A-制剂1)。

多种具刺激细胞生成。细胞修复和更新功能的人血清白蛋白融合蛋白组分与不同剂量的保湿剂、乳化剂、增稠剂和防腐剂，或它们以不同的比例加入来获得本实施例中所公开的化妆品制备方法。

将制成的含有融合蛋白的水剂，可以作为喷雾剂、洗发水、露；润肤水、柔肤水、爽肤水、化妆水等，可以喷、涂的方法，用于面部、颈部、皮肤外部或全身，可将融合蛋白带入作用部位，融合蛋白获得吸收，而起到美容、美白、保湿作用，加速皮肤的更新和修复作用和效果。

例如，当增稠剂卡泊姆1342由0.01％提高到0.5％时就可形成透明或半透明状水凝胶形式，从而构成油乳剂、洗发露、洗液等，见附图6，B-制剂2。

融合蛋白或GX组分也可以使用冷冻干燥的方法单独或混合后与适当的冷冻干燥成型制剂混合，然后在冷冻干燥机上冷冻，待使用者临用前再与水剂混合使用。本发明经试验证明，当将融合蛋白或GX组分与5％的甘露醇和PB缓冲液共同混合溶解后进行冷冻干燥，结果可以获得很好的成型要求的产品。这样融合蛋白和GX组分在室温下可获得更长的储藏期。有利于解决由于化妆品的生产和销售周期长和不确定因素，导致功能组分的作用效果不稳定的现象。

实施例5：含HSA融合蛋白的乳剂形式化妆品制备

乳化形式的化妆品制备可有水包油或油包水的不同的方法。例如：制剂3-类白色乳液的制备可有如下组成制剂作为实施例。10％甘油、2％的吐温80、3％胆固醇、5％卵磷脂、0.1％尼泊金乙酯与60ml水混合加热高速搅拌然后在45℃下加入融合蛋白或GX组分(同实施例4)，补水至100ml体积，高速搅拌成型为白色乳化剂，见附图6，C-制剂3。含有融合蛋白或GX组分的乳化剂可以制作面乳、洗手乳、洗发乳、润肤乳等产品。。

实施例6：含HSA融合蛋白的膏、霜剂形式化妆品制备

类白色霜(膏、霜)的制备可有如下组成制剂作为实施例。例如：5％甘油、10％凡士林、2％羊毛脂、1％SLS、1％吐温、5％聚乙二醇400、2％甘油单硬脂酸脂、0.1尼泊金乙酯作为防腐剂和50％去离子水，加热混合搅拌后降温，加入融合蛋白或GX组分(同实施例4)和补去离子水至100％，继续搅拌成形。见附图4：D-制剂4。这一制剂可用于面霜、眼霜、防晒霜、雪花膏、面膏、眼膏、唇膏、牙膏的制备。为美白可加入曲酸、熊果苷、VC、VE等。

实施例7：HSA融合蛋白和抗生素的组合和使用效果

将实施例6的化妆品配方组成组分中增加0.2％柳氮磺吡啶抗生素(市售维柳芬，0.25g，上海三维制药)而制备成祛痘功能的化妆品(附图6，E-制剂5)。其局部用于面部痘，可以明显减轻局部感染症状。其它可用于抑制和改善皮肤感染症状的抗生素，如庆大霉素、新霉素、土霉素、莫匹罗星、阿米卡星、夫西地酸、金霉素、四环素、、或甲硝唑等，可以用于祛痘、疮为目的的治疗性或功能性化妆品。与干扰素合用可抗感染、抗病毒。加入抗真菌、或抗过敏的药物，可用于治疗感染性疾病、或抑制皮肤病的药妆产品。

实施例8：含HSA融合蛋白的膜形式制备

将实施例4获得的水剂与商品面膜相互浸泡而获得可用于面部保湿和作用的成型面膜(附图4：F-面膜)。其它织物棉、纺、纱布、木浆、生物纤维等载体材料也可以用于制备成型面膜、颈模、眼膜、体膜等。剥离状面膜、膏状面膜、粉状面膜、浆泥状面膜，在使用前需要加水溶解混合搅拌而成。因此，均可在商品化的这类产品中用含有融合蛋白或含有酵母蛋白和多糖的水剂制剂混合(减少水的添加量)即可。

实施例9：含HSA融合蛋白的化妆品使用效果

志愿者18人次，年龄在24-55，男女随机，分成3人1组分别试用水剂、面膜、面霜、洗澡液(乳剂)、眼霜和祛痘组剂。在双盲状态下，每组1人使用基本配方化妆品；1人使用在基本配方化妆品中含有纯化的HSA/hEGF融合蛋白产品；1人使用在基本配方化妆品中含有GX组分的产品。每人均被告知可能使用的是含有融合蛋白功能组分或是不含有融合蛋白功能组分的产品。这样每10天，经自我感觉评价，给出结论。连续30天。结果表明10天时确定符合率为67％(18人中12人正确)、20天符合率接近83％(18人中15人正确)、30天符合率接近100％(18人中18人正确)。较好和明显的美容效果要来自全方位的对含有融合蛋白的各种化妆品的使用。例如，在使用含有融合蛋白功能组分的水剂化妆品之前，应先作去处死皮和全面清洁作用部位的处理，喷涂水剂后应涂抹均匀和让融合蛋白获得充分吸收，作用10分钟以上。最后再涂抹含有或不含有融合蛋白的美白、防晒、紧致功能霜等的复合化妆品应用，优选地是，含有融合蛋白，来获得最大美容效果。

实施例10：含有复合HSA融合蛋白的化妆品制备

复合HSA融合蛋白是在制成的含有融合蛋白的化妆品中，含有一种以上的人血清白蛋白融合蛋白。例如：将HSA/hEGF、HSA/bFGF和HSA/KGF-2以融合蛋白纯度在80％以上等比例混合加入实施例4制成的水剂；或将含有上述融合蛋白的发酵液GX组分，按总蛋白量和含糖量计算等比例加入水剂后，经志愿者试用20天，初步结果显示，效果较使用上述融合蛋白单体有较明显的皮肤光润效果(20天符合率90％)。

实施例11：含有融合蛋白的化妆品的稳定性测定

以HSA/bFGF、HSA/hEGF、HSA/KGF-2为例，对HSA/GF融合蛋白的水剂化妆品在室温℃和40℃条件下，在不同时间内，对HSA/GF的稳定性进行了测定。水剂的配方与实施例4相同。对照为10000单位的细菌表达的人重组EGF和不含有融合蛋白的水剂配方组成。含有10000单位HSA/hEGF(系列2)或纯化的10000单位HSA/hKGF-2(系列3)或10000单位HSA/bFGF或2个融合蛋白HSA/hEGF(5000单位)和HSA/hbFGF(5000单位)或3个融合蛋白HSA/EGF、HSA/KGF-2、HSA/bFGF组合(各3300单位)的水剂形式的化妆品和与上述组成相似但使用相应的GX组分的水剂形式化妆品，置于试管中在室温下或37℃温箱里存放。每7天采集200ul样品，立即放在-80℃冰箱中保存。待全部样品收集后，以这些样品对BalBC3T3细胞进行生物活性测定。试验同时设置标准对照。结果显示

A、GF单体与GF和HSA形成融合分子相比，在各种保藏条件下细胞因子融合蛋白形式比细胞因子单体形式有更长的半衰期(单体：1周(37℃)或2周(室温)；融合蛋白：12周(37℃)或24周(室温)。在室温下24周后纯化的HSA/GF仍保存其原有的大部生物活性。而在37℃下12周时纯化融合蛋白仍维持有较好的生物活性。而EGF单体在室温2周内即完全丧失生物活性。

B、融合蛋白单体或是制备成GX组分的融合蛋白相比GX组分中的融合蛋白生物活性较之纯化的融合蛋白单体有至少更长一倍的半衰期。

C、试验还显示在有化妆品制剂的保护下(水剂配方)各种蛋白质组分，如：GF单体、融合蛋白单体或GX组分均比这些蛋白质组分保存在磷酸盐缓冲液对这些蛋白具有更好的保护作用。

D、复合形式的融合蛋白与融合蛋白单体在等摩尔条件下，在各种制剂或缓冲液中，生物活性在保藏(货架寿命)中无明显不同。

细胞生长因子(GF)与血清白蛋白融合后，使之保存，储存的寿命时间均大大延长，对环境就有更强的抗性及生物稳定性，从而可以获得更好的应用效果。

具此推测，其它形式的化妆品，如乳剂、霜和膏剂等制剂形式的，也应该对融合蛋白具有相类似的保护作用。

Claims

1.制备含有人血清白蛋白(HSA)和细胞生长因子(GF)融合蛋白的化妆品，其特征在于，在化妆品的组成中含有由人血清白蛋白和细胞生长因子相连构成的融合蛋白组分。

2.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子形成的融合蛋白化妆品，其特征在于，该化妆品可用于皮肤的美容、保湿、除皱、防皱、美白和皮肤细胞的修复、更新。

3.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子的融合蛋白的化妆品，其特征在于，化妆品可以是水剂、膏剂、栓剂、霜剂、面膜等形式的护肤、保肤产品。

4.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子融合蛋白的化妆品，其特征在于，可以含有各种赋型剂、保湿剂、防腐剂、增白剂、增稠剂、或/和乳化剂。

5.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子的融合蛋白的化妆品，其特征在于，所含有的融合蛋白是经过柱层析纯化工艺流程获得的。

6.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子融合蛋白的化妆品，其特征在于，由获得的发酵液经离心、脱色、除盐、浓缩、加入赋型剂直接冷冻干燥成可作为原料，用于各种含融合蛋白的化妆品的制备。

7.如权利要求6所述化妆品的制备的工艺，其特征在于，这种工艺保留了酵母菌发酵中产生的酵母多糖和酵母蛋白，以及人血清白蛋白和细胞生长因子的融合蛋白和融合蛋白的片断等。

8.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子的融合蛋白的化妆品，其特征在于，可以含有一种或两种以上的人血清白蛋白分别与不同细胞生长因子融合形成的融合蛋白共同作为化妆品的组成成分，获得多种功效或协同增效作用。

9.如权利要求1所述的含人血清白蛋白和细胞生长因子的融合蛋白的化妆品，其特征在于，还可以与抗生素、抗病毒、抗感染的药物组合，用于祛痘、抑制病毒感染的功能。

10.一种产品的制备，其组分组成中含有至少一种如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述的至少一种HSA/GF，或两种不同的融合蛋白是HSA/hEGF融合蛋白和HSA/KGF融合蛋白的组合，HSA/IGF融合蛋白和HSA/PDGF融合蛋白的组合，或是HSA、HSA/IGF、HSA/FGF、HSA/EGF、HSA/PDGF、HSA/KGF、HSA/GCSF、HSA/IFN、或/和HSA/IL之间的相互组合，用于美容护肤、创伤、烧伤、疾病的治疗和应用。