CN1865286A - 双功能表皮生长因子及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

人表皮生长因子，是机体内的一种由53个氨基酸组成的细胞因子，广泛存在于许多组织器官和体液中，可促进上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的生长增殖，可促进皮肤创伤的愈合，在治疗胃肠道溃疡、角膜损伤、鼓膜穿孔、骨折、急性肾小管损伤和癌症等方面具有广阔的应用前景。本发明提供一种双功能表皮生长因子，通过一个由四个氨基酸组成“分子桥”，连接人表皮生长因子和胶原蛋白结合区，形成了具有高生物活性和高专一胶原结合活性的融合蛋白质(Fusion protein)。该双功能表皮生长因子在人类体内及体外创伤修复方面的应用，或应用于化妆品。

Description

双功能表皮生长因子及其制备方法和用途

技术领域

该发明涉及生物化学技术领域中基因工程中的人表皮生长因子，具体的说，通过基因重组技术，获得了具有高生物活性和高专一胶原结合活性的融合蛋白质—双功能表皮生长因子。

背景技术

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor EGF)是在1962年，由美国科学家Cohen首先发现的，Cohen发现小鼠的颌下腺存在一种由53个氨基酸组成的多肽，能够广泛地促进细胞增殖，并定名为表皮生长因子(EGF)，1972年，又分析并确定了小鼠EGF的氨基酸组成和结构特点。1975年，人的EGF首次从尿液中被提取，并发现它可抑制胃酸分泌故又称抑胃素。现已清楚，EGF是一类广泛存在于人和动物体内的、可以促进或抑制多类细胞生长的多肽，由53个氨基酸组成，有个分子内的二硫键，分子量约为6000道尔顿。

由于EGF在体外具有广泛的促进细胞增殖和组织生长的生物学活性，特别是能够促进内皮细胞和表皮细胞的增殖，因而，它可用于眼角膜溃疡，角膜创伤，皮肤烧伤治疗，手术后伤口愈合，胃肠道溃疡的治疗，以及在化妆品上用于皮肤的再生和保护等。此外，EGF作为一种脑肠肽而具有神经递质的作用，并发现它能抑制肿瘤细胞的增殖。从而促进了EGF的临床应用研究。但是，重组的EGF在临床的实际应用中却遇到如下困难：①EGF对损伤的组织没有专一性，因此对烧伤、创伤等伤口愈合的效果不理想；②EGF对胃肠溃疡等损伤的修复性能更差，主要是缺少与创伤组织结合的专一性；③EGF在机体内的半衰期很短，特别是胃肠溃疡应用时，游离的EGF极易被细胞的蛋白水解酶水解。

发明内容：

本发明提供了一种编码双功能表皮生长因子的核酸分子，该因子特征如附图-1所示；

本发明提供了一种制备双功能表皮生长因子的方法，包括如下步骤：1)利用基因工程技术获得高分泌型EGF-CBD菌种；2)利用枯草杆菌表达系统，进行二级发酵，；3)通过盐析和亲和层析，直接分离纯化得到高纯度的EGF-CBD，收率高于85％

一种双功能表皮生长因子，其特征在于该表皮生长因子融合蛋白质中，N-端部分是由表皮生长因子(Epidermal Growth Factor EGF)组成；C-端部分是由VWF(Von Willebrand Factor，VWF)中特定的氨基酸序列组成；在EGF和CBD之间，通过一个“分子桥”(Linker或Bridge)，从而把EGF和CBD联结起来，构成了一个EGF-CBD双功能融合蛋白质；以及该双功能表皮生长因子在医药方面或化妆品方面的用途，

该双功能表皮生长因子，其中的N-端部分是由人的表皮生长因子EGF组成，其氨基酸序列为Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu HisAsp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val GlyTyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg。

该双功能表皮生长因子，其中的C-端部分是由VWF的胶原蛋白CBD的10个氨基酸组成His Met Trp Arg Glu Pro Ser Phe Met Ala Leu Ser Gly Ala Ser。

该双功能表皮生长因子，其中的N-端部分和C-端部分是通过一个由四个氨基酸组成“分子桥”，从而把EGF和CBD联结起来。

该双功能表皮生长因子在人类体内及体外创伤修复方面的应用，或应用于化妆品。

为了解决以上技术问题，我们研制开发了EGF-CBD双功能表皮生长因子。

双功能表皮生长因子(Bi-function Epidermal Growth Factor，Bi-EGF)是利用枯草杆菌工程菌生产的一种具有高生物活性和高专一胶原结合活性的融合蛋白质(Fusion protein)。在双功能的表皮生长因子融合蛋白质中，它的N-端部分是由人EGF结构基因编码的53氨基酸组成；它的C-端部分是由VWF(VonWillebrand Factor，VWF)的胶原蛋白结合区(Collagen Binding Domain，CBD)的10个氨基酸组成。在EGF和CBD之间，是一个“分子桥”(Linker或Bridge)，有四个氨基酸组成，从而把EGF和CBD联结起来，构成了一个EGF-CBD双功能融合蛋白质。

我们选用了食品级的，对人体安全的枯草杆菌分泌表达系统作为表达宿主，经过一系列的克隆和筛选，得到了能够高效分泌表达和生产EGF-CBD双功能融合蛋白质。经体内、体外及一系列动物实验表明：EGF-CBD是一个双功能分子。她既具有天然EGF的生物活性也具有CBD的高专一性的胶原结合活性。正是由于CBD能够高效、专一的与创伤的“靶”部位的结合，从而提高了EGF的作用专一性、高效性和长效性。为EGF在临床治疗医学上的应用开辟了新的途径。

EGF-CBD双功能融合蛋白是目前世界上第一个经生物分子工程改造的新型的EGF药物。在EGF-CBD分子中，在CBD的导向作用下，EGF-CBD分子能够高效地、专一地作用于创伤组织部位。这就使得“靶”部位的EGF浓度提高多倍，减少了EGF的扩散作用；此外，在CBD分子的定向作用下，EGF-CBD与创伤组织的专一性结合，也极大地提高了EGF的作用半衰期，特别是提高了胃肠溃疡时EGF的应用范围；因此EGF-CBD双功能蛋白，完全克服了EGF自身的缺点。提高了EGF的治疗效果及治疗范围，为EGF的广泛应用开辟了新的途径。

EGF-CBD是经由基因分子工程技术而构建的一种双功能的EGF分子。在EGF-CBD分子中，由于CBD能够高效地、专一地识别EGF-CBD所要作用的“病灶”部位，并与所识别的“病灶”部位高效结合，从而使EGF-CBD能够集中地作用于“病灶”部位，提高了EGF-CBD的局部浓度，从而提高了EGF-CBD的治疗效果；其二，由于“游离”的EGF在用于治疗时，体内的半衰期很短。而在EGF-CBD分子中，由于CBD能与“病灶”部位高效结合，使得EGF被“稳定”在一个大的“基底”分子上，减少了EGF的“弥散”和“扩散”作用，从而降低了细胞蛋白酶对EGF-CBD的降解作用，提高了EGF-CBD在“病灶”部位的作用时间(半衰期)，提高了治疗效果。

双功能表皮生长因子的制备由以下步骤完成(1)基因工程菌种的筛选；(2)发酵制备；(3)分离纯化。

(1)基因工程菌种的筛选

我们所构建的生产“EGF-CBD”的工程菌是枯草杆菌系统。该系统的优点可概括为：优秀的外源蛋白分泌能力，它可以在信号肽的作用下，把表达的EGF-CBD大量地分泌到培养介质中，并具有正确的构象和活性，该菌种不分泌任何蛋白水解酶到细胞外，因此，表达分泌到胞外培养液中的EGF-CBD不受到任何蛋白酶降解，保证了产品的完整性与稳定性。

(2)、发酵工艺

我们的枯草杆菌表达系统，发酵过程简单，只需二级发酵。外源蛋白质(EGF-CBD)的表达是自发性的，不需要诱导剂的诱导。发酵过程中，除补充少量的碳原外，不需要特殊的补料。发酵工艺成熟，成本低。

(3)、分离纯化工艺

我们的基因工程菌在发酵过程中，直接把“EGF-CBD”分泌到细胞外的培养基中(而E.coli则是胞内表达，需破碎细胞)，所以，发酵后只需除去细菌细胞，就可用盐析和亲和层析两步把“EGF-CBD”纯化出来。此外，重要的一点是，我们的工程菌分泌表达的是可溶性的EGF-CBD(E.coli则产生包涵体)，具有正确的构象和生物活性(而E.coli产生的包涵体需经变性和复性处理，并且复性比例只占总表达量的一半，收率很低)，所以可直接分离纯化得到高纯度的EGF-CBD，收率高于85％。简单的、短周期的纯化过程降低了总的生产成本。

总之，利用我们的工程菌生产制备的EGF-CBD，生产工艺简单、成熟、经济；经大白鼠和小鼠的体内外动物试验证明，药效明确，无不良副反应发生。特别是为特殊的病患，如糖尿病患者，外伤、术后治疗，组织和器官移植后的修复等提供了无可替代的治疗效果。

实施例1：PSL-CBD-EGF重组质粒的构建

1、利用附图-1所示的引物P1和P2，L的cDNA作为模板，使用高保真TaqPCR酶合成EGF PCR。

反应系统的组成为

序号	名称	规格	单位	数量
					1	10×缓冲液		微升	10
2	硫酸镁	50mmol/L	微升	4
					3	P1引物	5mm	微升	2
4	P2引物	5mm	微升	2
					5	cDNA	100ng	微升	1
6	Taq酶	5u/ul	微升	1
					7	无菌水		微升	72
8	DNTP(10mm)		微升	8

于冰浴上配制上述反应体系后，离心1分钟(3000转)，以混匀体系中各组分，之后，将样品置于PCR合成仪中，合成反应的条件如下：

上述PCR反应结束后，使用QIAgen PCR纯化试剂盒，纯化EGF PCR产物，然后，测定PCR产物浓度，备用。

2、利用图-1所示的引物P3和P4，VWF cDNA作模板，使用高保真Taq酶合成CBD和Linker片段，PCR反应系统的组成如下：

序号	名称	规格	单位	数量
					1	10×缓冲液		微升	10
2	硫酸镁	50mmol/L	微升	4
					3	dNTP	10mmol/L	微升	8
4	P3引物	5mm	微升	2
					5	P4引物	5mm	微升	2
6	DNA模板	100ng	微升	1
					7	Taq酶	5u/ul	微升	1
8	无菌水		微升	72

于冰浴上配制上述反应体系后，离心1分钟(3000rpm)，以混匀体系中的各组分，之后，将样品置于PCR合成仪中，合成反应条件如下：

当PCR反应结束后，利用QIAgen PCR纯化试剂盒纯化CBD-Linker产物，然后，于260nm测定CBD-Liner浓度。

3、构建PSL-CBD-EGF质粒：

(1)：

10μl    (10μg EGF，由a中PCR合成并纯化)

5μl     10×缓冲液(H)(New EngLanel Lab，NEB)

1μl     Pst I(10u)(NEB)

1μl     EcoR I(10u)(NEB)

33μl    无菌水(NEB)

50μl

混匀上述组分，于37℃酶解过夜。

(2)：

10μl    (20μg，CBD-Linker，由b中PCR所得)

5μl     10×Buffez(B)(NEB)

1μl     EcoR I(10u，NEB)

1μl     Hind III(10u，NEB)

33μl    无菌水

50μl

混匀上述组分，于37℃酶解过夜。

(3)：

10μl    (6μg of PSL DNA载体)

3μl     10×缓冲液(H，NEB)

1μl     pst I(10u，NEB)

1μl     Hind III(10μl，NEB)

15μl    无菌水

30μl

混匀上述组分，于37℃酶解过夜。

(4)：

将上述(1)、(2)和(3)的酶解后反应物用1.8％琼脂糖凝胶分离后，切割出EGF组分带，CBD-Linker组分带和载体PSL组分带，将三个组分带放到同一个试管中，用QIAger Gel纯化试剂盒纯化出DNA组分，并溶解于10μl去离子无菌水中，加入1.5μl的T₄ DNA连接酶缓冲液和1μl(3u/μl)的T₄ DNA连接酶于16℃连接过夜。

(5)：

(4)中连接反应物，经70℃恒温10分钟，以灭活T₄ DNA连接酶，然后，置于冰上2分钟，加入Dh5α感受态细胞100ul，并置于冰上45分钟后，42℃热休克2分钟，置于冰上2分钟，加入500μl的SOC培养液，于37℃振荡(150转)保温60分钟，然后，涂于LB/Amp+培养板，37℃恒温培养16小时，挑选出阳性菌落作DNA抽提，纯化出质粒DNA，即，PSL-CBD-EGF DNA，该DNA用于转化枯草杆菌宿主。

4、枯草杆菌转化

挑选一个单一菌落，接种于5ml的2YT培养液中，于30℃生长过夜，然后，取100μl生产过夜的枯草杆菌培养液接种于10ml的2YT培养液(用250ml培养液瓶)，于30℃培养6小时，此时OD_600nm≈1.5。然后，取出培养液，置于冰上5分钟，2000转4℃离心5分钟收集菌体，用1M Sorbitol溶液洗涤菌体2次，每次2000转，4℃离心5分钟，最后，将菌体悬浮于pH＝7.0的Hepes缓冲液中，该缓冲液组成为：

将菌体悬浮于500μl该缓冲液后，置于冰上。取200μl该菌液(已是感受态细胞)，转移到一个电转移用的杯子中(2mm)，放于冰上，加入5μg PSL-CBD-EGF DNA，用Bio-Rad电转移仪，转化DNA进入枯草杆菌细胞条件是：

1.5Kv

25μF

800Ω

然后，加入1ml 2YT培养液，培养2-3小时，于30℃。将上述转化菌液，涂于2YT/红霉素培养板上，于30℃恒温培养24小时，挑选菌落，抽提DNA，确定阳性克隆的阳性克隆，亦即含有PSL-CBD-EGF的重组菌确定后，制备该重组菌的种子，储存于-80℃冰柜中。

5、PSL-CBD-EGF发酵表达

接种重组的枯草杆菌于2YT/红霉素琼脂板上，于30℃培养过夜，然后，接种一个单一菌落于25ml 2YT/红霉素液体培养基中(250ml烧瓶)，于30℃，250rpm恒温振荡培养36小时，然后，将该菌液转移到750ml的2YT/红霉素液体培养基中(用一个3升培养瓶)，置于30℃，恒温振荡(250rpm)培养48小时，然后，离心收集上清，离心条件是先用5000转4℃离心10分钟，去掉大量菌体，回收上清，该上清液再用12000转，4℃离心15分钟，回收棕色透明的上清液。

6、CBD-EGF纯化

上一步离心收获的培养上清液通过Amicon公司的PM30超过滤浓缩，然后将该浓缩的样品用DEAE-52样层析DEAE-52纤维素柱层析，先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)平衡该层析柱，然后将CBD-EGF浓缩液通过该平衡的层析柱，流速为1ml/min，待样品上完后，用2个床体积的50mM Tris-HCl缓冲液洗该柱，之后用50mM Tris-HCL(pH＝8.0)含有NaCl的缓冲液洗脱，NaCl的梯速为：0→1M，收集含有EGF-CBD的组分进行SDS-PAGE电泳，此步可使EGF-CBD纯度达90％，进一步纯化用gelatin-Sepharose 4B柱层析，方法是：gelatin-Sepharose 4B层析柱，用50mM Tris-HCl pH8.0缓冲液平衡，然后将EGF-CBD样品液以每分钟流速为0.8-1ml的速度通过该柱，然后用50mM Tris-HCl pH8.0洗涤去掉杂蛋白，用0→1M NaCl梯度洗脱CBD-EGF，并作SDS-PAGE电泳，此步纯化的CBD-EGF可达99％纯度，最后，收集的CBD-EGF经超滤浓缩后，对10mM Tris-HCl或生理盐水透析，冷冻干燥后分装。

图-2，表示枯草杆菌表达和纯化的EGF-CBD的量。

实施例2：在EGF-CBD中，CBD结合活性的评价

在图-3的4组试验中，培养皿都是用胶原蛋白包被好的，然后，加入试验试剂：

A.培养基

B.培养基+CBD

C.培养基+EGF

D.培养基+EGF-CBD

在37℃保温24小时，然后，弃掉各盘中培养液，用缓冲液(PBS)洗培养皿四次，然后，用EGF抗体检测，结果表明：D组中，EGF-CBD中的CBD能够有效的结合到胶原蛋白分子上，同时，用A.B.C.D四组试验处理的培养皿去培养“NRK49F”细胞，当接种相同数量的细胞后，于37℃培养48小时，镜检可见，EGF-CBD能非常有效地促进细胞增长。

实施例3：EGF-CBD与EGF活性比较

1组：培养基

2组：培养基+CBD

3组：培养基+EGF

4组：培养基+EGF-CBD

图-4表示各组接种同样数量的细胞(NRK49F)。37℃培养48小时，细胞的增长速度是：EGF-CBD＞EGF＞CBD≥Medium这说明EGF-CBD能像EGF一样有效地促进细胞增长。

实施例4：EGF-CBD的体内生物活性

如图-5.1：在4组试验中，正常鼠伤口愈合的促进作用，伤口分别用PBS，CBD，EGF和EGF-CBD处理，6天后，EGF-CBD处理的伤口基本痊愈，皮肤光滑；EGF处理的伤口，9天后痊愈；而PBS和CBD处理的伤口在第六天时，仍处于刚开始愈合阶段。经处理第六天时的镜检结果表明：伤口愈合速度EGF-CBD(6)＞EGF(9)＞PBS和CB(12)

如图-5.2：试验中，对患糖尿病鼠的伤口愈合的促进作用，第十天的镜检结果表明，经EGF-CBD处理的已近于痊愈；而EGF、CBD和PBS处理的要慢的多。

糖尿病鼠的伤口经处理后，愈合所需的天数

EGF-CBD：11～12天

EGF：15～16天

CBD：18～19天

PBS：19～20天

实施例5：EGF-CBD对裸鼠结肠炎的治疗作用

如图-6：患有结肠炎的裸鼠经过CBD，EGF和EGF-CBD灌注处理后，经过3天，取组织镜检，对照处理前后的镜检结果表明：

CBD处理的未见好转，略有化脓，炎症；

EGF处理的有见好转，略有新组织长出；

EGF-CBD处理的已近痊愈，新组织已长满。

实施例6：对EGF-CBD的机体内生物学功能评估

我们以商用的标准的EGF作为标准，用正常的和患有糖尿病的试验大白鼠进行了动物试验，以检验EGF-CBD在促进伤口愈合方面的功效。

第一组试验是用正常的有外伤的大白鼠进行的，选用350-400克重的大白鼠，每只鼠的背部有八处刀伤，刀伤面积为六平方毫米，伤口间的距离为1.5厘米。这12只大白鼠被分成四个小组，每组三只，分别用如下试剂或药物处理：

第1小组(三只鼠)，每天用生理盐水缓冲液，擦洗伤口一次，12天后伤口愈合；

第2小组(三只鼠)，每天用生理盐水缓冲液溶解的胶原蛋白(1μg/ml)擦洗伤口一次，12天后伤口愈合；

第3小组(三只鼠)，每天用生理盐水缓冲液溶解的标准EGF(1μg/ml)擦洗伤口一次，9天后伤口愈合；

第4小组(三只鼠)，每天用生理盐水缓冲液溶解的EGF-CBD(1μg/ml)擦洗伤口一次，6天后伤口愈合。

第二组试验是用患有糖尿病的有外伤的大白鼠进行的，所用的12只大白鼠除患有糖尿病外，其他条件和处理与第一组试验条件完全相同。试验的结果表明：

第1小组，经生理盐水缓冲液处理，伤口19天后愈合；

第2小组，经生理盐水缓冲液溶解的胶原蛋白处理，伤口18天后愈合；

第3小组，经生理盐水缓冲液溶解的EGF处理，伤口16天后愈合；

第4小组，经生理盐水缓冲液溶解的EGF-CBD处理，伤口12天后愈合。

上述的动物试验清楚地表明：EGF能够促进动物体外伤的伤口愈合。因此，EGF-CBD对于治疗各种外伤如机械创伤、烧伤、烫伤、术后恢复、器官移植等方面具有十分重要的医疗应用价值，特别是对患有特殊病患如糖尿病人的外伤和术后伤口复原提供了重要的治疗手段。

试验结果见附件(图-5)。

实施例7：EGF-CBD体内生物活性评估

我们用患有结肠炎(经实验诱导产生的)的无胸腺(不能产生内源性EGF)变异裸鼠进行了体内试验。

受试的十二只小鼠被分成四组，每组三只，分别用生理盐水，胶原蛋白(10μg/ml)，标准EGF(10μg/ml)和EGF-CBD(10μg/ml)灌注，连续三天，每天灌注一次。第四天，提取出结肠，结PBS清液后，用10％的福尔马林固定，然后做成组织切片，并经组织染色后，在光学显微镜下检查组织的肿胀程度，出血程度，炎症状况以及新组织再生情况(结疤程度)。

镜检的结果表明：用生理盐水和胶原蛋白质灌注的结肠炎小鼠，其组织切片显示了最大的溃疡面积，出血严重，肿胀并伴有急性炎症；而用标准的EGF灌注的结肠炎小鼠，其炎症部位已经缩小，新组织已经开始再生，伤口成愈合趋势；重要的是经EGF-CBD灌注的小鼠，其结肠炎部位已显示完全的新的再生组织，伤口几近愈合。这一结果首次揭示并证明：双功能EGF-CBD能够在体内极大地改善并加速结肠炎伤口愈合的速度和降低炎症的发生。因此，EGF经过基因工程技术改造后，在与CBD融合后显示了对胶原蛋白质高度的亲和性和专一性，提高了EGF在“病灶”靶部位的相对浓度并降低了蛋白水解酶的作用几率，从而延长了体内作用的半衰期，可以确信，双功能EGF在胃肠炎和胃肠溃疡治疗方面，具有很高的医疗应用价值。试验结果见附件(图-6)

附图说明：

图-1：

EGF-CBD表达质粒示意图。

Signal peotide：表达载体上的信号肽；

EGF Sequences：人EGF53氨基酸残基序列；

Linker：由4个氨基酸残基构成的一个“分子桥”

CBO：VWF分子中胶原基白结合中心的10个氨基酸序列；

Stopcodon：翻译终止密码子。

图-2：

由枯草杆菌表达和纯化的EGF-CBD聚丙烯酰凝胶电泳

A：Lane 1. 10μl表达上清(表达20小时)

Lane 2. 10μl表达上清(表达20小时)

Lane 3. 10μl表达上清(表达40小时)

Lane 4. 表化上清(表达60小时)

Lane 5. 纯化的EGF-CBD

B：Lane 1.上清

Lane 2.经streamLine层析后的上清液

Lane 3.经亲和层析后的上清液

Lane 4.超过滤后的，纯化的EGF-CBD(不同批次)

Lane 5.超过滤后的，纯化的EGF-CBD

Lane 6.标准的EGF

图-3：

纯化的EGF-CBD胶原蛋白结合性能

图-4：

纯化的EGF-CBD体外生物活性

图-5：

EGF-CBD体内活性，动物试验结果-1：

A.对正常鼠外伤愈合的促进作用；

B.对患糖尿病鼠外伤愈合的促进作用。

图-6：

EGF-CBD体内活性，动物试验结果-2：患结肠炎小鼠的结肠炎治疗效果。

Claims (5)

1、一种双功能表皮生长因子，其特征在于该表皮生长因子融合蛋白质中，N-端部分是由表皮生长因子(Epidermal Growth Factor EGF)组成；C-端部分是由VWF(Von Willebrand Factor，VWF)中特定的氨基酸序列组成；在EGF和CBD之间，通过一个“分子桥”(Linker或Bridge)，从而把EGF和CBD联结起来，构成了一个EGF-CBD双功能融合蛋白质；以及该双功能表皮生长因子在医药方面或化妆品方面的用途。

2、如权利要求1，该双功能表皮生长因子，其中的N-端部分是由人的表皮生长因子EGF组成，其氨基酸序列为Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp GlyTyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys AsnCys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu LeuArg。

3、如权利要求1，该双功能表皮生长因子，其中的C-端部分是由VWF的胶原蛋白CBD的10个氨基酸组成His Met Trp Arg Glu Pro Ser Phe Met Ala Leu SerGly Ala Ser。

4、如权利要求1，该双功能表皮生长因子，其中的N-端部分和C-端部分是通过一个由四个氨基酸组成“分子桥”，从而把EGF和CBD联结起来。

5、根据权利要求1，该双功能表皮生长因子在人类体内及体外创伤修复方面的应用，或应用于化妆品。

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