CN1563378A - 溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法；涉及血栓溶解物质；具体地说，涉及一种溶栓酶基因及由其表达产生的蛋白质和制备方法；还涉及一种溶栓酶基因的来源菌株和两种含有该基因的重组菌株。通过核苷酸序列和氨基酸序列比较以及功能研究，表明该酶为一种新的纤维蛋白溶解酶，用纤维蛋白平板法测算酶的活力为41000 IU/mg。该酶兼有拮抗机体氧化损伤的功能，对血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的蛋白质氧化有显著的抑制作用。本发明所涉及的溶栓酶Subtilisin QK与目前国内外上市或在研的溶栓药物比较有以下优点：高活性；抗氧化；抗PAI－1抑制作用；纤维蛋白特异性；在血液中的半衰期长，降低了再梗塞的几率；成本低；因此，该酶在心血管疾病治疗中有重要的应用价值。

Description

溶栓酶基因、重组蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及血栓溶解物质；具体地说，涉及一种溶栓酶基因及由其表达产生的蛋白质、制备方法；本发明还涉及一种溶栓酶基因的来源菌株和两种含有该基因的重组菌株。

背景技术

血栓栓塞性疾病的致残率和病死率都很高，严重威胁人类生命和健康，全世界约有病人1500万。目前，由于各种原因引起的血液栓塞疾病，如脑血栓、心肌梗塞、冠心病、肢体血管栓塞等的发病率呈上升趋势，仅我国每年用于防治和康复等方面的费用高达数千亿元人民币，此类疾病严重危害了患者的生存质量，增加了患者家庭及社会的负担。溶栓治疗是治疗血栓疾病的有效手段，因此溶栓和溶栓辅助药物的研制进展迅速。

目前，国内外上市或在研的溶栓药物很多，从原料来源上，可分为3类：

(1)基因重组产品，如重组链激酶、重组水蛭素、t-PA等；

(2)生物工程产品，如葡激酶、纳豆激酶等；

(3)生化药品，如尿激酶、降纤酶、蛇毒溶栓酶、蚓激酶等。

国内外已正式批准临床使用的主要溶栓药物有：链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase-type plasminogen activator，u-PA)、重组组织型溶栓酶原激活剂(Recombinan tissue-type plasminogen activator，rt-PA)、对-甲氧苯甲酰溶栓酶原链激酶激活剂复合物(Anisoylated plasminogenstreptokinase activator complex，APSAC)和重组链激酶(Recombinantstreptokinase，r-SK)。

目前来看，各类溶栓药物疗效可以肯定，但是还存在一些缺陷，阻碍了溶栓疗效的进一步提高。主要问题有以下几方面：

(1)伴随着血栓形成的机体的氧化损伤：蛋白质和脂质的氧化是伴随着心血管疾病而发生的，氧化的蛋白质和脂质使机体的损害加重，至今未见报道现有溶栓药物具有对机体氧化损伤的保护作用。

(2)出血：是最常见的不良反应，与其药理作用和使用的剂量有一定关系。表现为单纯穿刺部位渗血，轻度皮下，呼吸道，泌尿道或消化道出血，颅内出血发生率为0.5％～1％。

(3)再梗塞：急性心肌梗塞治疗后，发生再梗塞是国内外至今未能解决的难题。再梗塞的主要原因是：

①纤溶系统被激活后可活化血小板，使血小板膜糖蛋白受体Gp IIb/IIIa发生构象变化，使纤维蛋白原和Von Willebrand因子聚集于血小板上Gp IIb/IIIa受体，促进血栓形成。同时血小板对溶栓酶的作用不敏感，现有溶栓药物对富含血小板的血栓治疗效果较差。

②rt-PA，rscu-PA等溶栓药物半衰期很短，在血循环中被肝脏快速清除。

③溶栓治疗后残留血栓表面吸附有大量凝血酶，溶栓治疗后启动凝血过程，导致血栓再次形成。

(4)由于有一些被批准的溶栓药物成本很高，因而治疗费用也不菲，给患者和社会增加了负担。

为克服现有溶栓药物的上述局限性，有许多新型溶栓药物正在研制开发中。增强纤维蛋白选择性，延长半衰期，抗PAI-1抑制作用，寻找低成本的溶栓药物等是主要的研究目标。

发明内容

在我们的研究中，用水稻叶包裹大豆发酵和纤维蛋白平板测定纤溶活性的方法获得了一株能高效分泌溶栓酶的枯草杆菌。经中国典型培养物保藏中心鉴定，该菌株为一种新的枯草杆菌，命名为Bacillus subtilis QK02。随后扩增了QK蛋白酶的基因qk，并制备了含该基因的重组质粒和重组菌株，利用重组表达菌株表达了重组QK蛋白酶。用纤维蛋白平板法测得重组QK蛋白酶的纤溶活力达到41000IU/mg，后来我们详细地研究了该酶的基本酶学性质，值得一提的是，我们的实验表明，该酶还具有抗氧化的功能。由于该酶是首次发现的兼具氧化功能的候选溶栓剂，对血栓栓塞性疾病的预防、治疗、诊断是一次具有重大意义的突破。

本发明的目的是提供蛋白酶QK的基因、重组蛋白及其制备方法。

本发明提供的溶栓酶基因最初来源于枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株。在本发明中，发明者取湖北武汉地区的水稻叶85℃热处理10分钟，用其包裹灭过菌的大豆，42℃培养24小时后用培养液浸泡培养过的大豆，再将培养液作适当稀释后涂布营养琼脂平板，从营养平板上获得的菌落接种到5ml培养液中37℃培养24小时，离心后用纤维蛋白平板法测定上清液的溶栓酶活性，选取酶活性最高的菌株，再重复筛选过程而获得枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株，保藏号CCTCC M203078。

本发明是基于发明人的下述发现而完成的：通过检测降解纤维蛋白能力的方法筛选到了枯草杆菌Bacillus subtilisQK02菌株，进而发现培养该菌能够产生大量的溶栓酶QK，纤维蛋白平板实验表明该酶具有很高的溶解纤维蛋白的能力。除此之外，发明人还发现该酶在体内外及血管内皮细胞中具有拮抗由血红素、NaNO₂和H₂O₂带来的氧化损伤的能力。

本发明通过检测纤维蛋白降解的方法筛选到了株枯草杆菌Bacillussubtilis QK02，它经中国典型培养物保藏中心鉴定并保存，保存序号为CCTCCNo：M203078。

从该菌中利用PCR的方法得到编码溶栓酶QK的基因qk，它是一个828bp的DNA分子，其DNA序列即蛋白酶QK的基因qk的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

SEQ ID NO：1

GCG CAA TCT GTT CCT TAC GGC ATT TCT CAA ATT AAA GCG  39

CCG GCT CTT CAC TCT CAA GGC TAC ACA GGC TCT AAC GTA  78

AAA GTA GCT GTT ATC GAC AGC GGA ATT GAC TCT TCT CAT 117

CCT GAC TTA AAC GTC AGA GGC GGA GCA AGC TTC GTA CCT 156

TCT GAA ACA AAC CCA TAC CAG GAC GGC AGT TCT CAC GGC 195

ACA CAC GTA GCC GGT ACG ATT GCC GCT CTT AAT AAC ACA 234

ATC GGT GTT CTG GGC GTA GCG CCA AAC GCA TCG TTA TAT 273

GCA GTA AAA GTT CTT GAC TCA ACA GGA AGC GGC CAA TAC 312

AGC TGG ATT ATT AAC GGC ATT GAG TGG GCT ATT TCC AAC 351

AAT ATG GAT GTT ATC AAC ATG AGC CTT GGC GGA CCT TCT 390

GGA TCT ACA GCT CTG AAA ACA GTC GTT GAT AAA GCA GTT 429

TCC AGC GGT ATC GTC GTT GCT GCC GCT GCC GGA AAC GAA 468

GGT TCA TCG GGC AGC ACA AGC ACA GTC GGC TAC CCT GCA 507

AAA TAT CCT TCT ACC ATT GCG GTA GGT GCG GTA AAC AGC 546

AGC AAC CAA AGA GCT TCA TTC TCA AGC GCA GGT TCT GAG 585

CTT GAT GTA ATG GCT CCT GGC GTG TCC ATC CAA AGC ACA 624

CTT CCT GGA GGC ACT TAC GGT GCT TAC AAC GGA ACG TCA 663

ATG GCG ACT CCT CAC GTT GCC GGA GCA GCA GCG CTA ATT 702

CTT TCT AAG CAT CCG ACT TGG ACA AAC GCG CAA GTC CGT 741

GAT CGT TTA GAA AGC ACT GCA ACA TAT CTG GAA ACG TTT 780

CTA CTA TGG AAA AGG GTT AAT CAA CGT CAA GCA GCT GCA 819

CAA TAA TAG 3′                                     828

编码一个由274个氨基酸组成的纤溶蛋白酶，其氨基酸序列即蛋白酶QK的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：2

AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHP   40

DLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNTIG   80

VLGVAPNASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMD  120

VINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSG  160

STSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSAGSELDVMA  200

PGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPT  240

WTNAQVRDRLESTATYLETFLLWKRVNQRQAAAQ * *    274

通过常规的分子生物学基因克隆的方法获得了含有该基因的重组表达质粒，转化大肠杆菌使重组菌表达溶栓酶QK。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过基因工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶的基因克隆到其它载体，由其它菌株在其它培养条件下产生本发明涉及的溶栓酶QK。本发明涉及的溶栓酶QK特别适合用来溶解血栓中的纤维蛋白，同时还可以化解机体的氧化危机。使血栓栓塞性疾病和机体氧化损伤的治疗成为可能。

本发明涉及的QK蛋白酶的基因及其蛋白的制备方法包括下述步骤：

(1)从枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株中提取总DNA，并利用PCR方法扩增得到DNA片断(即qk基因)。

(2)将qk基因克隆到pBlueScript M13 KS(-)载体上获得重组克隆质粒pBS-qk，以重组质粒pBS-qk转化大肠杆菌TG1获得重组大肠杆菌菌株TG1PBSqk。

(3)从重组克隆质粒pBS-qk中分离出溶栓酶QK的基因qk，再将其连接到pRSET A载体上获得重组表达质粒pRA-qk，以重组质粒pRA-qk转化大肠杆菌BL21获得重组大肠杆菌菌株BL21PRAqk。

(4)培养重组大肠杆菌BL21PRAqk使其表达QK蛋白，然后离心获得菌体。

(5)破碎菌体后利用His亲和层析树脂将重组QK蛋白酶分离出来。

本发明所涉及的溶栓酶QK与目前国内外上市或在研的溶栓药物比较有以下几个优点：

(1)高活性。该酶具有更高的纤溶活性，达到41000IU/mg，比纳豆激酶的溶栓能力高出3倍以上。

(2)抗氧化。我们通过实验发现它除有纤溶作用以外还兼有保护由血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的人血管内皮细胞氧化损伤的功能。

(3)抗PAI-1抑制作用。由于该酶通过直接水解血栓中的纤维蛋白来溶栓，因而避免了PAI-1对t-PA等溶栓药物的抑制作用。

(4)纤维蛋白特异性。该酶只水解纤维蛋白，而对纤维蛋白原没有作用，因此在一定程度上避免了出血现象的发生。

(5)在血液中的半衰期长，降低了再梗塞的几率。

(6)成本低。该酶来源于枯草杆菌，可以通过较为廉价的发酵方法大量生产，降低了成本。这些都充分说明该酶具有广阔的应用前景。

附图说明

中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)：

分类命名Bacillus subtilis QK02

保藏日期2003年11月17日

保藏单位 中国.武汉.武汉大学 邮编 430072

保藏编号CCTCC NO：M 203078

图1—蛋白酶QK的基因qk的重组克隆质粒pBS-qk的构建流程图；

图2—蛋白酶QK的基因qk的重组表达质粒pRA-qk的构建流程图；

图3—蛋白酶QK基因qk在大肠杆菌中的表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；

图4A—纤维蛋白平板上测定在不同表达时间下蛋白酶QK的纤溶活性图；

图4B—纤维蛋白平板上测定纯化的重组蛋白酶QK的纤溶活性图；

图5—蛋白酶QK的在体内各种器官组织中抗蛋白质的氧化作用测定图；

图6—蛋白酶QK的在体外抗牛血清白蛋白中酪氨酸氧化作用的荧光光谱图(295nm荧光激发)；

图7—枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株的显微照片图；

图8—枯草杆菌Bacillus Subtilis QK02菌株的生理生化特性。

其中：

3.1—蛋白质分子量标准；

3.2—含重组质粒pRA-qk的大肠杆菌在表达2个小时以后全细胞蛋白；

3.3—含重组质粒pRA-qk的大肠杆菌在表达4个小时以后全细胞蛋白；

3.4—含重组质粒pRA-qk的大肠杆菌在表达6个小时以后全细胞蛋白，箭头所指为QK蛋白(分子量约33.8KD)；

3.5—含空载体质粒pRSETA的大肠杆菌在表达6个小时以后全细胞蛋白。

6.1-6.4—含空载体质粒pRSETA的大肠杆菌BL21表达2，4，6，8个小时以后细胞裂解液(作为对照)；

6.5-6.8—含重组表达质粒pRA-qk的大肠杆菌BL21PRAqk表达2，4，6，8个小时以后细胞裂解液；

6.9—尿激酶(5000IU/ml)；

6.10—纯化的Subtilisin QK(10μg)

6.11—纯化的Subtilisin QK(5μg)

6.12—尿激酶(5000IU/ml)

7.1—天然BSA；

7.2—QK(2μg)存在下BSA的氧化；

7.3—QK(1μg)存在下BSA的氧化；

7.4—QK不存在下BSA的氧化。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述。

为达到本发明的目的，制备本发明涉及的蛋白酶QK及其重组质粒和菌株的方法包括如下步骤：

(1)从枯草杆菌Bacillus subtilis QK02中提取基因组DNA，并利用PCR扩增得到DNA片断称为qk，将其连接到pBlueScript M13 KS(-)载体上并转化大肠杆菌TG1获得含qk片断的重组质粒pBS-qk及重组大肠杆菌菌株TG1PBSqk；

(2)重组质粒pBS-qk经PstI和EcoRI双酶切得到qk片断，再将其连接到表达质粒pRSET A上并转化大肠杆菌BL21，获得含qk片断的重组表达质粒pRA-qk及重组大肠杆菌菌株BL21PRAqk。

(3)在可使上述qk基因表达的条件下培养该重组大肠杆菌BL21PRAqk，然后离心获得菌体，破碎菌体后利用His亲和层析树脂将重组QK蛋白酶分离出来。

在含有50mg/ml纤维蛋白的平板上打孔并加入上述纯化得到的重组QK蛋白酶，置37℃，15小时后在孔的周围形成了透明的纤维蛋白溶解圈，经过与已知的尿激酶标准品比较计算该酶的纤维蛋白溶解活性达到每毫克41000IU，说明该酶有强的降解纤维蛋白的能力，可用于血栓块的溶解。而且实验表明该酶的最适PH8.5，最适温度55℃。

溶栓酶QK的体外抗氧化作用实验步骤如下：在溶栓酶QK存在或不存在(作为对照)的条件下用荧光光谱仪[LS-55luminescence spectrometer(PerkinElmerLife Sciences，Shelton，CT)]检测牛血清白蛋白BSA氧化过程中酪氨酸的荧光变化。检测条件为激发光谱295nm，记录光谱300-420nm，狭缝宽度(emissionslits)10nm和6nm，扫描速度100nm min^-1。反应液是由1μM的BSA、50μg的血红素、100μM的NaNO₂、100μM的H₂O₂、1或2μg的QK蛋白组成的。结果见图5，从图中可以看出QK蛋白在体外条件下可以抑制由血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的蛋白质氧化。

溶栓酶QK在体内的抗氧化作用实验步骤如下：每个实验组由10只昆明鼠组成，对照组是没有任何药物注射的，氧化组用0.5ml氧化剂(NaNO₂ 5mM，H₂O₂ 5mM，血红素25μM)肌肉注射，抗氧化组用氧化剂和溶栓酶QK(1600IU，40μg)各0.5ml肌肉注射。2小时后处死动物，按常规方法制作各器官组织的抽提液，然后利用鼠抗NO₂-酪氨酸的单克隆抗体、羊抗鼠IgG-AP标记二抗的标准ELISA方法检测各种器官组织的抽提液中NO₂-酪氨酸的含量。结果见本说明附图6，从图中可以看出在多种组织和器官中QK蛋白均可以拮抗由血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的蛋白质氧化。

本发明涉及的溶栓酶QK是一种新的丝氨酸蛋白酶。根据氨基酸的相似性比较分析发现，本发明涉及的酶与以前发现的纳豆激酶等枯草杆菌中的蛋白酶有比较高的同源性，与纳豆激酶的同源性高达96.8％。通过酶学性质研究表明该酶属于Subtilisin家族。虽然有如此高的同源性，但本发明涉及的溶栓酶QK除比纳豆激酶的纤溶活性高以外，还具有自己的特性，比如它有抗蛋白质氧化的功能，这是目前的溶栓酶(NK、SK等)所不具备的。

本发明涉及的枯草杆菌Bacillus Subtilis QK02菌株具有如下特征：

(1)在NA平板上生长24h，菌落近似圆形、扁平、呈凹形、边缘不整齐；培养时间稍长，在平板上可见部分菌落边缘出现毛发状，菌苔较厚，表面呈乳白色，基质未见明显的水溶性色素分泌。

(2)革兰氏阳性，菌体为杆状，细胞两端钝圆，多以单个形式出现(见图7)；培养8h以上可见明显的内生孢子形成，内生孢子为端生或次端生，孢囊不膨大；培养时间稍长，可见大量的芽孢脱落，芽孢为卵圆形。

(3)接酶试验为阴性，其生理生化特性见图8。

而本发明涉及的QK蛋白酶具有如下特征：

(1)由枯草杆菌Bacillus Subtilis QK02或其衍生菌产生，衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株。

(2)由具有如SEQ ID NO：1所示的DNA序列编码。

(3)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

(4)其特性包括：具有纤维蛋白溶解酶活性(40000IU/mg以上)；最适PH8.5；最适温度55℃；分子量(天然蛋白30，306道尔顿、重组蛋白33，800道尔顿)。

(5)可以在体内外及细胞中拮抗由血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的氧化损伤。

进一步地，本发明涉及一个DNA分子，该DNA分子编码本发明所涉及的溶栓酶QK，该DNA分子的核苷酸序列：

(1)由SEQ ID NO：1所示的DNA序列可编码部分组成；

(2)编码一个蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明，应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

实施例1  枯草杆菌Bacillus Subtilis QK02的制备过程

(1)取水稻叶85℃热处理10分钟，用其包裹灭过菌的大豆，42℃培养24小时，后用培养液(大豆抽出液当中含有0.5％食盐、0.5％Na₂HPO₄、2％液化淀粉)浸泡培养过的大豆，将浸泡过大豆的培养液作10^-2-10^-6稀释，涂布营养琼脂平板，37℃倒置培养后在平板上长出菌落。

(2)所获的菌落分别接种在5ml培养液中37℃、250rpm培养24小时后，6000rpm离心5min。取20μl上清液在纤维蛋白平板上测定溶栓酶活性，然后选酶活性最高的菌株。

实施例2编码溶栓酶QK的基因qk的PCR扩增和克隆及序列测定

(1)枯草杆菌Bacillus Subtilis QK02的基因组DNA提取按照常规的方法(Saito，H.et al，1963，Biochim.Biophys.Acta 72：619-629)来进行。

(2)PCR扩增用的引物根据溶栓酶QK的N末端20个氨基酸(AQSVPYGISQIKAPALHSQG，在湖南师范大学测序)和枯草杆菌aprN基因的C末端序列设计而成。扩增出片段的大小为828bp。

引物P8：5’CGC CTG CAG ATG GCG CAA TCT GTT CCT TAT GGC ATT

引物P9：5’GCG GAA TTC TTA CTA TTA TTG TGC AGC TGC TTG

上述引物由上海基康生物工程公司合成。PCR扩增反应50μl体系中：9μl枯草杆菌基因组DNA作为模板；引物总浓度各0.8pmol/μl；dNTP 1mM；10×PCR缓冲液5μl；Taq polymerase 2.5U。反应程序为：94变性1min，，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环。扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳检测。

(3)扩增产物和pBluescript M13载体都经PstI和EcoRI双酶切，回收后连接，用连接产物转化CaCl₂法制备的E.coli TG1感受态细胞，转化产物涂布在含有氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板上筛选重组子，37℃培养，挑选菌落，快速法提取质粒，用双酶切法鉴定重组子。具体过程见图1。

(4)重组质粒pBS-qk插入片段的核苷酸序列由上海博亚生物技术有限公司以T7和T3启动子序列为引物测定。

实施例3编码溶栓酶QK的基因qk的重组表达质粒的构建和表达

(1)用PstI和EcoRI从pBS-qk质粒上切下并回收qk基因，并将该基因与经过PstI/EcoRI双酶切并回收的pRSET A质粒DNA加T₄DNA连接酶于18℃连接10小时，连接产物转化CaCl₂法制备的E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板以筛选重组子，快速法提取质粒，进一步用PstI/EcoRI双酶切鉴定阳性重组子。具体过程见图2。

(2)表达载体pRSET受T7启动子控制，用该载体构建的表达质粒在37℃或室温下加IPTG诱导表达。挑单个阳性菌落接种于2ml LB培养基中，置摇床37℃过夜活化，然后以1∶50的比例稀释到新鲜LB培养基中，37℃培养至A₆₀₀＝0.8～1.0立即添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导2、4、6、8小时后，离心收集菌体，用1×SDS裂解液裂解，采用SDS-PAGE法鉴定表达产物。结果见图3。

(3)采用纤维蛋白平板法测定枯草杆菌溶栓酶活性。将2ml纤维蛋白原溶液(50mg/ml)加入40ml琼脂糖溶液(0.75％)中，混匀后取8ml加到装有40μl凝血酶溶液(100NIH/ml)的塑料平板里，然后立刻混匀并放置30分钟后即制成纤维蛋白平板。用合适孔径的吸管在纤维蛋白平板上打孔，以不同浓度的尿激酶作为标准品，各取20μl加到打好的孔中，IPTG诱导表达的菌液0.5ml经超声波破碎后取20μl加到孔中，37℃温箱中放置15h后取出测定纤维蛋白溶解面积，测定结果见本说明附图4A。

实施例4重组溶栓酶QK的纯化及其纤溶活性的测定

重组菌E.coli BL21PRAqk的菌体悬于10mM甘氨酸缓冲液(PH9.6)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组QK蛋白酶的粗酶液。此上清液经His-Bond镍亲和层析后，得到的蛋白酶在SDS-PAGE上显示一条带。纯化后的溶栓酶QK的溶纤活性按照本说明实施例3中(3)的方法进行。测定结果见图4B。

实施例5溶栓酶QK的体外抗氧化作用实验

在溶栓酶QK存在或不存在(作为对照)的条件下用荧光光谱仪(LS-55luminescence spectrometer)检测牛血清白蛋白BSA氧化过程中酪氨酸和色氨酸的荧光变化。检测条件为激发光谱295nm，记录光谱300-420nm，狭缝宽度(emission slits)10nm和6nm，扫描速度100nm min^-1。反应液是由1μM的BSA、50μg的血红素、100μM的NaNO₂、100μM的H₂O₂、1或2μg的QK蛋白组成的。结果见图5，从图中可以看出QK蛋白在体外条件下可以抑制由血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的蛋白质氧化。

实施例6溶栓酶QK的体内抗氧化作用实验

每个实验组由10只昆明鼠组成，对照组是没有任何药物注射的，氧化组用0.5ml氧化剂(NaNO₂ 5mM，H₂O₂ 5mM，血红素25μM)肌肉注射，抗氧化组用氧化剂和溶栓酶QK(1600IU，40μg)各0.5ml肌肉注射。2小时后处死动物，按常规方法制作各器官组织的抽提液，然后利用鼠抗NO₂-酪氨酸的单克隆抗体、羊抗鼠IgG-AP标记二抗的标准ELISA方法检测各种器官组织的抽提液中NO₂-酪氨酸的含量。结果见图6，从图中可以看出在多种组织和器官中QK蛋白均可以拮抗由血红素、NaNO₂和H₂O₂引起的氧化损伤。

Claims (6)

1、一种具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的溶栓酶基因。

2、一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的溶栓酶蛋白。

3、含有SEQ ID NO：1所示核酸序列的重组质粒，其特征是：或为重组克隆质粒pBS-qk，或为重组表达质粒pRA-qk。

4、一种含有SEQ ID NO：1所示核酸序列的溶栓酶基因的枯草杆菌菌株Bacillus subtilis QK02，其特征是：该菌株为CCTCC M203078。

5、含有权利要求3所述的重组质粒的重组菌株，其特征是：或为大肠杆菌TG1菌株TG1PBSqk，或为大肠杆菌BL21菌株BL21PRAqk。

6、一种制备具有溶栓酶活性的重组QK蛋白的方法，其特征是有下列步骤：

(1)从枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌株中提取总DNA，并利用PCR方法扩增得到DNA片断，将其克隆到pBlueScript M13 KS(-)载体上获得重组克隆质粒pBS-qk，以该重组质粒转化大肠杆菌TG1获得重组大肠杆菌菌株TG1PBSqk；

(2)从重组克隆质粒pBS-qk中分离出溶栓酶QK的基因qk，再将其连接到pRSET A载体上获得重组表达质粒pRA-qk，以该重组质粒转化大肠杆菌BL21获得重组大肠杆菌菌株BL21PRAqk；

(3)培养重组大肠杆菌BL21PRAqk使其表达QK蛋白。然后离心获得菌体，破碎菌体后利用His亲和层析树脂将重组QK蛋白酶分离出来。

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