CN1035192C

CN1035192C - 一种重组葡激酶的制备方法

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Publication number: CN1035192C
Application number: CN94112105A
Authority: CN
Inventors: 宋后燕
Original assignee: Shanghai Medical University
Current assignee: Shanghai Medical University
Priority date: 1994-04-04
Filing date: 1994-04-04
Publication date: 1997-06-18
Anticipated expiration: 2014-04-04
Also published as: CN1096325A; WO1995027048A1

Abstract

一种重组葡激酶的制备方法，现有技术中重组质粒表达水平低，纯度低，而且得率也很低。本发明通过PCR扩增葡激酶基因，与原核表达载体如PLY-4质粒重组，形成pSTE-SAK-1表达质粒，pSTE-SAK-1转化大肠杆菌，用温度诱导基因表达。工程菌经发酵扩增，压榨破碎细菌，用离子交换和凝胶过滤二步法从上清液纯化r-SAK，本方法得到的葡激酶产品纯度和得率都很高，成本低。

Description

一种重组葡激酶的制备方法

本发明属生物技术方法。

葡激酶(Staphylokinasa，SaK)为金黄色葡萄球菌溶源性噬菌体合成的一种蛋白水解酶。自1948年Lack C.H.发现金黄色葡萄球菌合成的SaK能激活血浆蛋白酶以来，由于种种原因，如金黄色葡萄球菌合成和分泌SaK水平很低，纯化SaK时很难去除内毒素等杂质，以致SaK结构，功能及其临床应用价值的研究进展缓慢。随着重组DNA技术的发展，Sako-T等从金黄色葡萄球菌中分离到含有SaK基因的噬菌体，从噬菌体基因组中切下SaK基因及其启动子等调控序列，与PBR322载体重组，构建了含有r-SaK基因的克隆，并实现了在大肠杆菌中的表达。Behnke-D等则用酵母表达SaK基因。1993年D.Collen等用Sako.T类似方法分离SaK基因，与PUC19重组后在大肠杆菌中进行表达，表达产物存在于培液，周围膜间隙和菌体内，经离子交换、亲和层析和凝胶过滤后得纯品＜6mg/L培养物。上述各家实验室建立的基因构建和产物纯化方法复杂，产率很低。

本发明的目的是提供一种新的制备重组葡激酶的方法。其中用PCR构建基因，基因表达水平极高，r-SK以可溶性，活性状态存在于菌体内，纯化方法简单，产物纯度高和产量高，成本低。

本发明采用下述技术方案：

(1)从人体分离溶血性金黄葡萄球菌，选择纤溶性最高者大量培养，从培养液提纯葡激酶，测定其N和C端5个氨基酸顺序作设计引物的参考，以该菌株大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增葡激酶基因，与PUC19质粒载体重组后，经核苷酸顺序分析肯定基因结构。

(2)r-SaK基因与原核表达质粒(如含PL，PR启动子，CIt857基因，5SRNA终止信号等调控元件的载体)重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，用温度诱导r-SaK基因的表达；表达产物r-SaK以可溶性，活性状态存在于细胞浆中，占菌体蛋白40％以上。工程菌命名PSTE-SAK-1。

(3)发酵技术：用低营养液基础培养PSTE-SAK-1，温度诱导前后用LB，葡萄糖，稀有元素溶液补料，发酵时温度以30-42℃合宜，D0＝50-80％，PH＝6-8，搅拌速度随D0升高而减少。

(4)工程菌用高压破碎，离心后，经离子交换、凝胶过滤二步法从上清液纯化r-SaK。

纯品r-SaK中加入人血清白蛋白、谷氨酸钠、磷酸盐等稳定剂后，微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成白色粉状成品。成品用注射用水溶解后供注射用，以治疗心肌梗塞，肺、脑、周围血管栓性栓塞，血液透析通路和血液中血凝块，防治介入治疗时动脉插管阻塞，显微外科吻合口血栓，以及眼内积血和渗出等疾患。

基因结构和内切酶图谱见图1，图2。

葡激酶分子量约为15.5KD，激活纤溶酶原(plasminogen，plg)的过程类似于链激酶，首先SaK和plg结合形成1∶1的复合物，然后该复合物激活另一分子plg，形成纤溶酶，后者催化纤维蛋白水解，溶解血栓，恢复血液循环。在血浆中，SaK和plg形成复合物SaK-plg后，如果没有纤维蛋白存在，则该复合物很快被a₂-抗纤溶酶中和，然后被巨噬细胞吞噬；在有纤维蛋白存在时，SaK-plg复合物中plg分子上的赖氨酸结合位点和纤维蛋白结合，丧失了与a₂-抗纤溶酶的结合位点，不受其抑制，因此不仅能高效激活血栓中plg，特异地溶解血栓，而且不易诱发系统性纤溶状态。动物溶血栓模型亦证明，SaK在溶解血栓的同时，没有引起纤维蛋白原的明显降低。此外SaK尚有以下突出优点：分子量小，穿透性能好，对富含血小板的血栓，尤其是脑动脉血栓和肢体动静脉血栓的溶解作用比其他溶栓药物强，具有更好的疗效，本发明构建的SaK基因，用大肠杆菌高效表达r-SaK，不仅产品得率高，每升发酵液可得纯品400-500mg，而且纯度达97-99％，与D.Collen等方法每升发酵液6mg得率相比，本发明的效果显著提高，其成本则低廉得多：

实施例(一)：

1.从人体鼻咽部分离60株金黄色葡萄球菌，分别接种于LB培养液中生长过液，离心收集细菌，上清用纤维蛋白板测SaK活性，有8株能分泌SaK，其中№4活性最高，在纤维蛋白板中用牛纤溶酶原代替人纤溶酶原作鉴别试验，证明№4分泌的是SaK。

大量培养№4金黄色葡萄球菌，经离子交换和分子筛纯化15KD蛋白质，并用反转纤维蛋白板等方法证明此15KD蛋白具有纤溶活性，然后进行N-末端和C-末端氨基酸顺序分析，用于设计PCR引物。

国外文献或专利文献报道的均从噬菌体基因组中分离SaK基因及其调控序列，本发明直接以金黄色葡萄球菌大分子DNA作模板通过PCR扩增和制备SaK基因。

2.用PCR扩增葡激酶基因

培养№.4金黄色葡萄球菌，按Frederick M.Ananbel et al方法制备菌体高分子DNA

挑单个菌落接种于LB培液(37℃过夜培养)，5000rpm离心10分钟，取菌块悬于缓冲液，加SDS和ProteinseK后，50℃保温4小时。用等体积氯仿/异戊醇抽提，再离心分层，上层液再用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，上层液加入0.6Vol异丙醇，离心沉淀，用75％酒精洗涤两次，抽干后溶于TE缓冲液，紫外分光检测证明A260/A280大于2.0

N、C末端氨基酸顺序测定结果设计PCR引物，并用固相磷酸三酯法藉DNA合成仪合成，纯化后用于扩增葡激酶基因，两个PCR引物的5′末端分别含有限制性内切酶识别位点。

PCR反应总体积100μl，含：

模板DNA 0.5μg

引物I 50.0pmoles

引物II 50.0pmoles

dNTP 2.0mmol/L

10×PCR缓冲液

ddH₂O

TaqDNA聚合酶 2.5U

PCR反应时92℃变性90秒，70℃延伸60秒，52℃退火60秒。

15个循环后再加2.5UTaqDNA聚合酶，再进行15个循环，反应结束后取2μl作琼脂糖凝胶电泳，用紫外灯检测，在400～500bp之间出现一条十分明亮的条带，其中所含核酸片段的长度符合完整葡激酶基因长度。

3、葡激酶基因克隆的构建和鉴定

PCR产物用限制性内切酶水解后，加入经相应的酶完全水解后的PUC19质粒载体和T4DNA连接酶反应体系，室温放置1小时后，转化大肠杆菌JM83，用氨苄青霉素-LB平板在37℃温箱中筛选培养。

挑取单个菌落按Sambrook方法制备质粒，用酶切鉴定，呈现特征性条带者命名pST-Sak-1。

质粒pST-SaK-1经核苷酸顺序分析证明pST-SaK-1质粒中SaK基因的核苷酸顺序和阅读框架。

4、葡激酶基因克隆在大肠杆菌中的表达

表达质粒的构建——pST-SaK质粒经双酶解后，用琼脂糖凝胶电泳分离，回收400～500bpSaK基因，并与原核表达载体如pLY-4(含PL，PR启动子，CIt857基因，55RNA终止信号等调控元件)重组，反应物转化大肠杆菌K802，用氨苄青霉素-LB平板筛选培养。

挑取单个菌落，制备质粒，用酶解鉴定，含SaK基因特征性片段者，称表达质粒为pSTE-SaK-1，工程菌为PSTE-SAK-1。

葡激酶基因诱导表达和表达产物的鉴定——挑取PSTE-SaK单个菌落，在LB培液中30℃振荡培养过夜，次日用低营养培液按1∶100稀释后，在摇瓶中30℃培养至A₆₀₀～0.6(约4～5小时)，然后进行诱导培养3小时，5000r.p.m.离心收集细菌，用PBS(pH7.4)洗涤二次，保存于-20℃或立即作表达产物的分离。

5、表达产物的鉴定

SDS凝胶电泳——按Laemmli方法进行。

样品溶解液：含0.0625M Tris-HCl(pH6.7)，2％SDS，10％甘油，5％巯基乙醇，0.001％溴酚兰样品处理和点样：1ml诱导培养菌液，离心后，沉淀悬于100μl样品溶

解液，置沸水浴中5分钟，使沉淀溶解。对照细菌

或诱导前细菌用同样方法培养，用同样条件处理样

品。点样量为10μl，并使所含蛋白量基本相等。

凝胶染色：考马斯亮兰或银染色。

凝胶中蛋白带扫描：岛津CS-910双波长扫描仪作透射扫描，计

算机处理，打印各蛋白条带所占百分比。

诱导培养细菌裂解液在分子量相当于15KD处有非常浓集的条带，诱导前细菌的裂解液或培液在相同部位几乎不见此带。

表达产物纤溶活性的鉴定—上述凝胶依次用2.5％TritonX-100溶液和蒸馏水充分洗涤，覆盖于含纤维蛋白原、人纤溶酶原及凝血酶的琼脂糖凝胶板上，37℃保温2hr后，15KD处出现十分明现的透亮区，即此部位纤维蛋白已经溶解，显示表达产物具有纤溶活性。

表达产物在菌体内存在状态—细菌用高压匀浆器压碎后，35000rpm(约100000g)超速离心60分钟后，沉淀和上清分别进行SDS-PAGE和纤溶活性鉴定，结果显示15Kd含有纤溶活性的条带，分布在上清中，沉淀部分几乎不见此条带，说明表达产物重组葡激酶(Recombinant Staphylokinase，r-Sak)以可溶性，有活性状态存在于菌体内，未形成包涵体。此特性与D.Collen等报导不同。

表达水平的检测—用岛津CS-010光密度计对SDS-PAGE。考马斯亮兰染色的凝胶行扫描，结果显示表达菌中r-SaK占菌体总蛋白的40％以上

6.葡激酶活性的测定

用lowry法测定蛋白质含量。

r-SaK活性测定——鉴于目前尚无SaK活性单位及其标准，我们用纤维蛋白凝块溶解法测定r-SaK活性。并对活性规定如下：在1ml反应体系中，含有牛纤维蛋白原2mg，纤溶酶原100ug，凝血酶0.4NIH单位，使纤维蛋白凝块在10分钟内完全溶解的r-Sak的量为1HU。

活性测定：

标准曲线的制备(体积单位均为ul)

管号 1 2 3 4 5 6

标准r-Sak

(100u/ml) 100 80 60 40 20 0

人纤溶酶原

(1mg/ml) 100 100 100 100 100 100

PBS-0.01％Tween20

(PH7.4 ) 590 610 630 350 670 690

摇匀 37℃ 5min

人凝血酶 10 10 10 10 10 10

人纤维蛋白原

(10mg/ml) 200 200 200 200 200 200

摇匀 37℃保温

通常经1-2分钟时形成凝块，按下秒表，凝块完全溶解时，再按下秒表，每管需要一只秒表，记录形成凝块到凝块完全溶解的时间(分)

以10×1gT和1gSak活性(U)作图。

样品的测定：1mg/ml样品稀释10⁴-10⁵倍后按上述方

法测定凝块溶解所需的时间(分)，从标准

曲线查知并计算样品中Sak的活性。

比活性：单位体积溶液内r-SaK活性单位数/单位体积溶液中蛋白质含量(mg)实施例(二)：基因工程葡激酶(r-SaK)的大规模制备：

工程菌的发酵——

摇瓶发酵：PSTE-SAK-1单个菌落接种于LB-Amp培液，30℃培养过夜，次日用基础培养液1∶100稀释，充分振摇培养至A_aoo0.6-0.8后诱导培养3-4小时，菌液用已知空重的离心管，5000r.p.m.，4℃离心10分种，弃上清，沉淀菌块用PBS(pH7.4)洗涤一次，称重，计算菌块重量。

5L NBS Bio FIII罐发酵：PSTE-SAK-1单个菌落在100ml LB-培液中30℃培养过夜，测A₆₀₀，作为种子液，供发酵用。

发酵罐内换入基础培液，设定温度30℃，pH6-8，溶氧量50-80％，搅拌速度600次/分(搅拌速度随氧含量而变速)，各项参数稳定后，按1∶100(菌种液∶培液)体积比，接种PSTE-SAK-1菌液。

A₆₀₀达1.0左右时，在维持上述参数的条件下诱导发酵3-4小时，

菌体收集方法同摇瓶培养。菌块可保存于-20℃备用。

r-SaK的纯化——

1、细菌的破碎

湿菌用1000ml PBS(pH7.4)洗涤3次，悬浮于PBS中(10gm/100ml)，高压匀浆泵压榨，15000r.p.m.离心10分钟，收集上清。

2、离子交换

S-Sepharose柱经缓冲液平衡，加上述样品，用缓冲液洗脱杂蛋白(3倍床体积)，PH梯度和盐梯度缓冲液洗脱γ-SAK，合并含SaK活性的各管溶液进行超滤浓缩。

3、凝胶过滤

凝胶柱用PBS.PH7.4平衡，加上步超滤浓缩液用PBSPH7.4洗脱收集并合并含SaK活性各管溶液。用0.22μ微孔滤膜过滤后无菌分装，冻干为半成品。0.22μ微孔滤膜过滤后，加人血清白蛋白等稳定剂后无菌分装冻干为成品。

68g湿菌经压榨破菌后，用Lowry法测得总蛋白为8.21g，用纤维蛋白凝块溶解法测得总活性为2.96×10⁸HU，比活性0.36×10⁵HU/mg。压榨物上清液总蛋白为7.16g，总活性2.93×10⁸HU，比活性为0.41×10⁵HU/mg。

r-SaK粗制品用S-Sepharose分离后，得r-Sak 2.0g，活性1.8×10⁸HU。比活性0.9×10⁵HU/mg。

上述r-Sak样品用凝胶过滤脱盐后，得r-Sak 1.6g，活性1.6×10⁸HU，比活性为10⁵HU/mg，r-Sak纯度达99％。

以上各步纯化过程中蛋白含量，活性以及比活性总结如表。

蛋白质含量总活性比活性纯化倍数

(g) (×10⁸HU) (×10⁵HU/mg)全菌(68g湿菌) 8.21 2.96 0.36上清 7.1 2.93 0.41 1.2S-Sepharose 2.0 1.8 0.9 2.5凝胶过滤 1.6 1.6 1.0 2.78

应用本发明所制备的r-SAK经动物实验证明具有良好的溶血栓功能，如：

(1)r-SaK治疗实验性狗股动脉血栓，用动脉造影显示，治疗前股动脉中断以下不显影，静脉注射r-Sak 0.1mg/Kg，60分钟后再造影，股动脉充盈完全，循环恢复，而对照动物未见股动脉充盈。共做狗8只(治疗组5只、对照3只)。

(2)-SAk对实验性家兔眼前房渗出的治疗作用：眼内注射r-SAK10-20μg，2-4小时后渗出物消失。对照组在48小时内几乎无变化。共做实验组6只眼，对照组4只眼。

(3)r-Sak对实验性家兔眼前房积血的治疗作用：眼内注射r-SAK10-20μg，4小时后可见前房血凝块溶解，红细胞沉降后与房水形成一界面，至24小时，眼内积血已被清除。对照兔眼前房积血明显未见变化。共做实验组6只眼，对照组4只眼。

附图说明：

图一是表达质粒pSTE-SAK构建图

图二是葡激酶基因的核苷酸顺序

Claims

1、一种重组葡激酶的制备方法，包括葡激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达、工程菌的发酵，表达产物的分离纯化，其特征在于：(1)从人体分离溶血性金黄色葡萄球菌，选择纤溶活性最高者大量培养，从培养液中提纯葡激酶，测定其N末端和C末端5个氨基酸顺序作设计引物的参考，以该菌株大分子DNA做模板，通过PCR直接扩增葡激酶基因，与质粒载体重组后，经核苷酸顺序分析基因结构；(2)重组葡激酶基因与含PL、PR启动子、CIT857基因、5SRNA终止信号等调控元件的原核表达载体PLY-4质粒重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌K802(ATCC 33526)，用温度诱导r-SK基因的表达，表达产物以可溶性、活性状态存在于细胞浆中，占菌体总蛋白的40％以上；(3)发酵技术用低营养基础培养工程菌，用温度诱导基因表达，发酵时温度为30℃-42℃，氧溶量为50％-80％，pH＝6-8；(4)用离子交换和凝胶过滤二步法纯化重组葡激酶。(5)构建的葡激酶基因的核苷酸顺序如下：

ATG CTC AAA AGA AGT TTA TTA TTT TTA ACT GTT TTA TTG TTA TTA TTC TCA TTT

Met Leu Lys Arg Ser Leu Leu Phe Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Ser PheTCT TCA ATT ACT AAT GAG GTA AGT GCA TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TAT AAA AAASer Ser Ile Thr Asn Glu Val Ser Ala Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys LysGGC GAT GAC GCG AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGAGly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Thr Leu Met Val Asn Val Thr GlyGTT GAT GGT AAA AGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTVal Asp Gly Lys Arg Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACAGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp Ala ThrGCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATC GAA GTC ACT TATAla Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr TyrTAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTTyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly PheGTT GTC CCA GAT ATA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCT GGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTTVal Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys ValGTT ATA GAA AAG AAA TAAVal Ile Glu Lys Lys